JP2018508215A

JP2018508215A - Ｃｄ１９結合ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ｃａｒ）

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Publication number: JP2018508215A
Application number: JP2017546104A
Authority: JP
Inventors: マーティンプーレ，; レイラメッカオウイ，; パーシスアムロリア，; サラゴラシアン，; アンクレイマー，; ゴードンチェン，
Original assignee: ユーシーエルビジネスピーエルシー
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2018-03-29
Anticipated expiration: 2036-03-04
Also published as: WO2016139487A1; US10457730B2; US11578126B2; EP3265490B1; JP6574848B2; US20180044417A1; US20200140544A1; CA2978381C; TR201909647T4; EP3265490A1; HUE044298T2; CA2978381A1; ES2732067T3; PL3265490T3; PT3265490T; US20230220077A1; CN107406517B; GB201503742D0; AU2016227498A1; CN107406517A

Abstract

ａ）以下の配列：ＣＤＲ１−ＧＹＡＦＳＳＳ（配列番号１）；ＣＤＲ２−ＹＰＧＤＥＤ（配列番号２）ＣＤＲ３−ＳＬＬＹＧＤＹＬＤＹ（配列番号３）を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、およびｂ）以下の配列：ＣＤＲ１−ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号４）；ＣＤＲ２−ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）ＣＤＲ３−ＱＱＷＮＩＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ１９結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。そのようなＣＡＲを含む細胞、およびがん、具体的にはＢ細胞悪性腫瘍の処置におけるそのような細胞の使用も提供される。

Description

本発明は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９（表面抗原分類１９）を結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。そのようなＣＡＲを発現しているＴ細胞は、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫などのがん性疾患の処置において有用である。

キメラ抗原受容体
慣例的に、抗原特異的Ｔ細胞は、標的抗原に対して天然で特異的な末梢血液Ｔ細胞の選択的拡大によって生成されている。しかし大抵のがん抗原に対して特異的な多くのＴ細胞を選択および拡大させることは困難であり、不可能であることも多い。組み込みベクターでの遺伝子治療は、この問題への解決策を提供している：キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現は、任意の表面抗原に特異的な多くのＴ細胞が末梢血液Ｔ細胞の混合集団のｅｘｖｉｖｏウイルスベクター形質導入によって容易に生成できるようにする。

これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体由来の１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）がスペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された融合体である。そのような分子は、ｓｃＦｖによるその同族標的の認識に応答してＴ細胞の活性化を生じる。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現すると、それらは、標的抗原を発現している標的細胞を認識し、死滅させる。いくつかのＣＡＲは腫瘍関連抗原に対して開発され、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入手法は種々のがんの処置のために現在臨床試験中である。しかし今日までＣＡＲ治療の主な臨床調査および応用可能性は、Ｂ細胞悪性腫瘍のための処置としてのものである。

ＣＤ１９に対して向けられたＣＡＲ
ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化の最初期に発現されるＢ細胞抗原であり、プラズマ細胞への最終Ｂ細胞分化でだけ失われる。それによりＣＤ１９は多発性骨髄腫を除くすべてのＢ細胞腫瘍において発現されている。それは、他の造血集団または非造血細胞では発現されず、したがってこの抗原を標的化することは、骨髄または非造血性器官に毒性をもたらさないはずである。有効なＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞治療はＢ細胞無形成を生じるが、結果として生じる低ガンマグロブリン血症はプールした免疫グロブリンで処置できることから、正常なＢ細胞コンパートメントの喪失はリンパ系悪性腫瘍を処置する場合には許容可能な毒性と考えられている。

したがってＣＤ１９は、魅力的なＣＡＲ標的である。今日までＣＡＲ分野の主な臨床的注目点は、表１に要約のとおり、難治性Ｂ細胞がんにおいてＣＤ１９を標的化する研究である。

表１に概説のとおりさまざまな設計のＣＡＲが、さまざまな施設においてＣＤ１９に対して検査された：

大部分の研究は、ハイブリドーマｆｍｃ６３由来のｓｃＦｖに基づくＣＤ１９ＣＡＲを検査した。最も有望なのは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置においてであった。

ＣＤ１９に対するＣＡＲでの臨床経験
ＣＤ１９指向性ＣＡＲ治療は、ＡＬＬにおいて最も有効であると考えられている。ＡＬＬにおける最初の研究は、ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎｅＫｅｔｔｅｒｉｎｇ（Brentjensら（２０１３年）Leukemia. Sci. Transl. Med. ５巻、１７７ｒａ３８）およびペンシルベニア大学のグループによって２０１３年春に発表された。近年の研究の最新報告が最近行われた（Maudeら（２０１４年）N. Engl. J. Med. ３７１巻、１５０７〜１５１７頁）。ここで２５歳未満の患者２５名およびこの年齢を超える５名が処置された。９０％が１ヵ月で完全奏効を達成し、２８名の内２２名の評価可能例がＭＲＤ陰性状態を達成し、６ヵ月の無症候生存率は６７％であった。患者１５名は、研究後さらなる治療を受けなかった。

Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら（上記）は、成人設定で、ＡＬＬ患者５名（難治性再発２名、ＭＲＤ陽性疾患２名およびＭＲＤ陰性１名であった）をＳＪ２５Ｃ１ハイブリドーマ由来のｓｃＦｖおよびＣＤ２８共刺激ドメインを組み込んだＣＤ１９ＣＡＲを発現するようにレトロウイルスで形質導入した自己Ｔ細胞で処置した。これら全員がディープ分子的寛解を達成し、これらの患者の内４名が同種ＳＣＴを受けられるようにした。これは応答の持続性の評価を妨げるが、ＣＡＲＴ細胞は注入３〜８週間後についてだけ血液または骨髄において検出可能であった。移植されなかった患者は、ＣＤ１９＋疾患を９０日で再発した。次いで、Davilaら（（２０１４年）. Sci. Transl. Med. ６巻、２２４ｒａ２５）は、このコホートを更新した。１６名の成人患者の内１４名は、救援化学療法およびシクロホスファミド前処置（conditioning）にもかかわらず、ＣＡＲＴ細胞注入の時点で検出可能な疾患を有した。救援化学療法後に検出可能な残存疾患の形態学的証拠を有する患者９名の内７名の患者を含んで、１６名の内１４名は、数値の回復を伴ってまたは伴わずに完全寛解を達成した。患者１６名の内１２名はＭＲＤ陰性を達成し、これにより、発表の時期までに７名が同種移植を受けることが可能になった。非移植患者８名の内４名を含む一部の患者において応答は持続性であり最長２４ヵ月の追跡調査で形態学的寛解を継続したが、このコホートについての生存率曲線はまだ安定していない。

主にＡＬＬを有する小児および若年成人患者のコホートでの近年公表された研究は、その結果の最初の全例解析を提供している。これは、予定用量のＣＡＲＴ細胞を受けていない患者を排除することによって内在するバイアスを除くことに役立ち得る（Leeら（２０１４年）Lancet. doi:10.1016/S0140-6736（１４巻）６１４０３〜３頁）。患者２１名は、ＣＤ２８ドメイン含有第２世代ＣＡＲで処置された。２名を除くすべての患者は、予定用量のＴ細胞を受けており、難治性または複数回再発ＡＬＬを有する者にこの処置を送達する実行可能性を強調している。この研究は、以下の有効性：ＡＬＬを有する者の６７％が完全寛解達成および６０％がＭＲＤ陰性状態を達成していることを示している。

ＣＤ１９ＣＡＲ治療の免疫毒性
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、軽度から低血圧および呼吸不全を伴う多臓器不全までの範囲の一連の炎症性症状を包含する。ある程度のＣＲＳは、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞で処置された患者において一般的に生じる。近年のコホートにおいて処置された患者のおよそ３０％（２１／７３）は、ある程度のＣＲＳを示した（Daviliaら（２０１４年）上記；Leeら（２０１４年）上記；Kochenderfer（２０１４年）J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol.. doi:10.1200/JCO.2014.56.2025）。ＣＲＳは、ブリナツモマブ、ＣＤ１９およびＣＤ３の両方を認識する二重特異性組換え１本鎖抗体で処置された患者においても見られた。ＣＲＳは、典型的にはＣＡＲＴ細胞注入の５〜２１日後に生じる。

ＣＲＳは、生命を危うくする場合があり、集中治療環境での処置を必要とする。ＣＲＳは、血清サイトカインレベルの上昇と関連する。最も顕著に上昇するサイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）である。重度のＣＲＳの臨床所見（発熱、肝脾腫、凝固障害および高フェリチン血症）は、例えばＴ細胞に先天性欠損を有する患者において見出されるマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）に類似している。これは、共通の免疫病理学的プロセスが関与していることを示唆している。現在、どの細胞型（ＣＡＲＴ細胞、死腫瘍細胞または局所活性化マクロファージ）が重要なサイトカイン、具体的にはＩＬ−６の産生に関与しているのかは明らかでない。しかし、ＭＡＳにおける重要な開始因子は大量のインターフェロンガンマの放出である（Lopez-Alvarezら（２００９年）. Clin. Vaccine Immunol. CVI １６巻、１４２〜１４５頁）。

神経毒性
施設にわたるＣＤ１９ＣＡＲ研究における多数の患者は、失語症から鈍麻、せん妄および発作の多様な重症度で一過性の神経毒性を発症した（Daviliaら（２０１４年）上記）。これは、ＡＬＬを有する患者に限定されていると考えられ、同様の症候群がブリナツモマブ治療後に確認された。脳画像は正常であると考えられる。神経毒性は、高レベルの全身性サイトカインが血液脳関門を通過することを反映し得る。

持続性、再発およびＴ細胞疲弊
持続的応答は、循環ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のさらに高いピークレベル、およびＢ細胞無形成の持続期間と相関すると考えられる。ＣＤ１９疾患を再発した患者を除いて、再発は一般に循環ＣＡＲＴ細胞の喪失および正常Ｂ細胞の回復と関連した。

Ｔ細胞疲弊は、多くの慢性感染症およびがんの間に生じるＴ細胞機能障害の状態である。それは、不十分なエフェクター機能、抑制性受容体の発現の持続および機能性エフェクターまたはメモリーＴ細胞のものとは異なる転写状態によって定義される。疲弊は、感染および腫瘍の最適な管理を妨げる。近年、疲弊Ｔ細胞の機能的および表現型プロファイルのさらに明確な臨床像が、抑制性受容体プログラム死１（ＰＤ−１；ＰＤＣＤ１としても公知）、重要な特性である活性化Ｔ細胞の負の制御因子、の発現と共に明らかになった（Dayら（２００６年）Nature ４４３巻、３５０〜３５４頁）。

ＣＤ１９ＣＡＲ研究での応答は、長期間の高レベルでのＴ細胞の持続が持続的応答をもたらすために重要であると考えられることを示唆している。Ｔ細胞疲弊を低減するＣＤ１９ＣＡＲは、臨床応答の改善を生じ得る。
したがって、上記の不利益と関連しない、ＣＤ１９に対して向けられた代替的ＣＡＲに対する必要がある。

Brentjensら（２０１３年）Leukemia. Sci. Transl. Med. ５巻、１７７ｒａ３８ Maudeら（２０１４年）N. Engl. J. Med. ３７１巻、１５０７〜１５１７頁 Davilaら（（２０１４年）. Sci. Transl. Med. ６巻、２２４ｒａ２５） Leeら（２０１４年）Lancet. doi:10.1016/S0140-6736（１４巻）６１４０３〜３頁 Kochenderfer（２０１４年）J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol.. doi:10.1200/JCO.2014.56.2025 Lopez-Alvarezら（２００９年）. Clin. Vaccine Immunol. CVI １６巻、１４２〜１４５頁 Dayら（２００６年）Nature ４４３巻、３５０〜３５４頁

注釈を付け、番号付けした（ａ）ＣＡＴ１９ＶＨ配列、（ｂ）ＣＡＴ１９ＶＬ配列。ＶＨおよびＶＬの配列はＣｈｏｔｈｉａ番号付けを使用して番号付けられている。フレームワーク領域およびＣＤＲ領域は示されている。挿入も示されている。注釈を付け、番号付けした（ａ）ＣＡＴ１９ＶＨ配列、（ｂ）ＣＡＴ１９ＶＬ配列。ＶＨおよびＶＬの配列はＣｈｏｔｈｉａ番号付けを使用して番号付けられている。フレームワーク領域およびＣＤＲ領域は示されている。挿入も示されている。

ＣＤ１９陽性細胞の組換えＣＡＴ１９での染色。ＳｕｐＴ１細胞は、通常ＣＤ１９を発現しないが、この研究では発現するように操作した。ＣＡＴ１９ＶＨ配列およびＶＬ配列を、マウスＩｇＧ２ａ重鎖フォーマットおよびマウスカッパ軽鎖フォーマット、両方とも哺乳動物発現プラスミド中に、クローニングした。２９３Ｔ細胞は、重鎖および軽鎖の両方を同時にトランスフェクトされ、生じた抗体をプロテインＡで精製した。ＳｕｐＴ１細胞およびＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞を、この組換え抗体（または単なる２９３Ｔ上清）で染色し、蛍光コンジュゲート抗マウス二次抗体でさらに染色した。組換えＣＡＴ１９抗体の結合は、フローサイトメトリーによって容易に検出し得る。

ＣＡＴ１９ｓｃＦｖでのＣＤ１９陽性細胞の染色。ＣＡＴ１９のＶＨおよびＶＬを、それらがｓｃＦｖを形成し、それによりＶＨおよびＶＬが（ＳＧＧＧＧＳ）_３リンカーによって分けられるようにクローニングした。ＣＡＴｓｃＦｖをＶＨ−ＶＬ方向およびＶＬ−ＶＨ方向の両方で用いて、２種のｓｃＦｖを生成させた。さらに、抗ＣＤ１９抗体ｆｍｃ６３および４ｇ７から、いずれかの方向でｓｃＦｖが生成された。（ａ）ｓｃＦｖ表示フォーマット：これは、レトロウイルスベクターであり、それによりｓｃＦｖは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８エンドドメインの最初の１２残基を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃスペーサーにクローニングされている。これは順にＦＭＤ−２ＡペプチドＴａＶおよび切断型ヒトＣＤ３４とインフレームである。このようにｓｃＦｖを、細胞の表面上に表示させ、導入遺伝子発現を、ＣＤ３４を別々に検出することによって調節できる。６個の異なるｓｃＦｖフォーマットのいずれかを発現するＳｕｐＴ１細胞が生成され、これらの細胞を組換えヒト切断型ＣＤ１９−マウスＩｇＧ２ａＦｃ融合体および抗ＣＤ３４で染色した；（ｂ）ｆｍｃ６３ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨフォーマットでの染色；（ｃ）４ｇ７ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨフォーマットでの染色；ならびに（ｄ）ＣＡＴ１９ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨフォ−マットでの染色。驚くべきことにＣＡＴ１９ＶＨ−ＶＬｓｃＦｖは良好に結合し、一方ＶＬ−ＶＨｓｃＦｖは検出可能な結合が有意に少なかった。ＣＡＴ１９ｓｃＦｖでのＣＤ１９陽性細胞の染色。ＣＡＴ１９のＶＨおよびＶＬを、それらがｓｃＦｖを形成し、それによりＶＨおよびＶＬが（ＳＧＧＧＧＳ）_３リンカーによって分けられるようにクローニングした。ＣＡＴｓｃＦｖをＶＨ−ＶＬ方向およびＶＬ−ＶＨ方向の両方で用いて、２種のｓｃＦｖを生成させた。さらに、抗ＣＤ１９抗体ｆｍｃ６３および４ｇ７から、いずれかの方向でｓｃＦｖが生成された。（ａ）ｓｃＦｖ表示フォーマット：これは、レトロウイルスベクターであり、それによりｓｃＦｖは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８エンドドメインの最初の１２残基を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃスペーサーにクローニングされている。これは順にＦＭＤ−２ＡペプチドＴａＶおよび切断型ヒトＣＤ３４とインフレームである。このようにｓｃＦｖを、細胞の表面上に表示させ、導入遺伝子発現を、ＣＤ３４を別々に検出することによって調節できる。６個の異なるｓｃＦｖフォーマットのいずれかを発現するＳｕｐＴ１細胞が生成され、これらの細胞を組換えヒト切断型ＣＤ１９−マウスＩｇＧ２ａＦｃ融合体および抗ＣＤ３４で染色した；（ｂ）ｆｍｃ６３ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨフォーマットでの染色；（ｃ）４ｇ７ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨフォーマットでの染色；ならびに（ｄ）ＣＡＴ１９ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨフォ−マットでの染色。驚くべきことにＣＡＴ１９ＶＨ−ＶＬｓｃＦｖは良好に結合し、一方ＶＬ−ＶＨｓｃＦｖは検出可能な結合が有意に少なかった。

検査したさまざまな世代のＣＡＲおよび出発ＣＡＲ。（ａ）抗原結合ドメイン（最も一般的にはｓｃＦｖ）、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび１つまたはいくつかのシグナル伝達ドメインを含む典型的ＣＡＲフォーマット。（ｂ）第１世代ＣＡＲは活性化シグナルを伝達し、それらのエンドドメインはＦｃガンマ受容体エンドドメインまたはＣＤ３ゼータエンドドメインのいずれか由来である。（ｃ）第２世代受容体は２種のシグナルを伝達し、それらのエンドドメインはＣＤ３ゼータのエンドドメインに連結された共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、通常、ＣＤ２８のエンドドメイン、ＯＸ４０のエンドドメインまたは４１ＢＢのエンドドメインのいずれかである。（ｄ）第３世代受容体は３種のシグナルを伝達し、それらのエンドドメインはＣＤ２８エンドドメインと４１ＢＢエンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインとの、またはＣＤ２８エンドドメインとＯＸ４０エンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインとの融合体を含む。（ｅ）ＶＨ−ＶＬ方向でｓｃＦｖ、ＣＤ８ストークスペーサーおよび４１ＢＢゼータから構成される第２世代エンドドメインを含む、最初に検査したＣＡＴ１９に基づくＣＡＲ（カンパナ（Ｃａｍｐａｎａ）ＣＡＲフォーマット）。検査したさまざまな世代のＣＡＲおよび出発ＣＡＲ。（ａ）抗原結合ドメイン（最も一般的にはｓｃＦｖ）、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび１つまたはいくつかのシグナル伝達ドメインを含む典型的ＣＡＲフォーマット。（ｂ）第１世代ＣＡＲは活性化シグナルを伝達し、それらのエンドドメインはＦｃガンマ受容体エンドドメインまたはＣＤ３ゼータエンドドメインのいずれか由来である。（ｃ）第２世代受容体は２種のシグナルを伝達し、それらのエンドドメインはＣＤ３ゼータのエンドドメインに連結された共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、通常、ＣＤ２８のエンドドメイン、ＯＸ４０のエンドドメインまたは４１ＢＢのエンドドメインのいずれかである。（ｄ）第３世代受容体は３種のシグナルを伝達し、それらのエンドドメインはＣＤ２８エンドドメインと４１ＢＢエンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインとの、またはＣＤ２８エンドドメインとＯＸ４０エンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインとの融合体を含む。（ｅ）ＶＨ−ＶＬ方向でｓｃＦｖ、ＣＤ８ストークスペーサーおよび４１ＢＢゼータから構成される第２世代エンドドメインを含む、最初に検査したＣＡＴ１９に基づくＣＡＲ（カンパナ（Ｃａｍｐａｎａ）ＣＡＲフォーマット）。

ｆｍｃ３６ＣＡＲに対するＣＡＴ１９ＣＡＲ機能のｉｎｖｉｔｒｏ比較。５名の異なるドナー由来の初代ヒトＴ細胞をカンパナフォーマットでのＣＡＴ１９ＣＡＲまたはカンパナＣＡＲ自体をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。これらのＴ細胞を次いで種々のアッセイにおいて使用した。（ａ）クロム放出アッセイをＳｕｐＴ１細胞に対して実施した。これらの細胞はＣＤ１９陰性である。いずれのＣＡＲＴ細胞もこの細胞株に対して応答しなかった（点線）。クロム放出アッセイをＳｕｐＴ１．ＣＤ９に対して実施した。両方のＣＡＲは、この細胞株に対して同様に実施した（実線）。次に脱顆粒アッセイをＮＴＴ細胞、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞のいずれかを使用してＳｕｐＴ１またはＳｕｐＴ１．ＣＤ１９のいずれかに対して実施した。（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞および（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞でゲーティングしたデータが示されている。脱顆粒はＣＡＲ１９ＣＡＲＴ細胞で増加した。（ｄ）増殖は、トリチウム化チミジン取り込みを使用して概算した。ＮＴ、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞を、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９に対して検査した。この実験では無関係なＣＡＲ標的化ＧＤ２も検査した。ＣＡＲ１９ＣＡＲＴ細胞で増殖が増加する傾向があった。（ｅ）ＳｕｐＴ１またはＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞に対するチャレンジ２４時間後のＮＴＴ細胞、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞またはＧＤ２ＣＡＲＴ細胞のいずれかからのインターフェロンガンマ放出。ＣＤ１９＋標的でチャレンジした場合、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞は、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞よりも有意に少ないＩＦ−Ｇを産生した。

ＣＡＴ１９有効性のｉｎｖｉｖｏモデル。（ａ）ｉｎｖｉｖｏモデルについての実験設定の概要。ＮＳＧマウスに尾静脈注射を介してＲａｊｉ．ＦＬｕｃ細胞２．５ｘ１０^５個を注射した。２４時間後、ＮＴ初代ヒトＴ細胞またはｆｍｃ６３ＣＡＲで形質導入したＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲで形質導入したＴ細胞のいずれかの４ｘ１０^６個を、尾静脈を介して投与した。腫瘍応答を生物発光画像化によって順次測定した。尾静脈血を生着および血清サイトカインのために４日目にサンプリングした。動物を１１日目に選別し、ＣＡＲＴ細胞の持続性および腫瘍負荷について組織を研究した。（ｂ）さまざまなマウスコホートの１０日目の生物発光画像化。広範囲の疾患がＮＴＴ細胞で処置されたマウスの骨盤、脊椎、肋骨、頭蓋および脾臓において見られた一方で、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞またはｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞のいずれかを受けたマウスにおいてはわずかなシグナルが明らかである。（ｃ）さまざまなマウスコホートからの経時的な平均化された定量的生物発光シグナル。Ｙ軸は対数目盛りであり、明白な差異がＮＴＴ細胞を受けたマウスとＣＡＲＴ細胞を受けたマウスとの間のシグナル蓄積において見られる。シグナル蓄積の差異は、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞を受けたマウスにおいては見られない。（ｄ）実験終了時のマウス由来骨髄においてフローサイトメトリーで決定された腫瘍負荷。実質的にｆｍｃ６３またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞のいずれかを受けたマウスの骨髄においてＲａｊｉ細胞は検出できなかった。ＣＡＴ１９有効性のｉｎｖｉｖｏモデル。（ａ）ｉｎｖｉｖｏモデルについての実験設定の概要。ＮＳＧマウスに尾静脈注射を介してＲａｊｉ．ＦＬｕｃ細胞２．５ｘ１０^５個を注射した。２４時間後、ＮＴ初代ヒトＴ細胞またはｆｍｃ６３ＣＡＲで形質導入したＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲで形質導入したＴ細胞のいずれかの４ｘ１０^６個を、尾静脈を介して投与した。腫瘍応答を生物発光画像化によって順次測定した。尾静脈血を生着および血清サイトカインのために４日目にサンプリングした。動物を１１日目に選別し、ＣＡＲＴ細胞の持続性および腫瘍負荷について組織を研究した。（ｂ）さまざまなマウスコホートの１０日目の生物発光画像化。広範囲の疾患がＮＴＴ細胞で処置されたマウスの骨盤、脊椎、肋骨、頭蓋および脾臓において見られた一方で、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞またはｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞のいずれかを受けたマウスにおいてはわずかなシグナルが明らかである。（ｃ）さまざまなマウスコホートからの経時的な平均化された定量的生物発光シグナル。Ｙ軸は対数目盛りであり、明白な差異がＮＴＴ細胞を受けたマウスとＣＡＲＴ細胞を受けたマウスとの間のシグナル蓄積において見られる。シグナル蓄積の差異は、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞を受けたマウスにおいては見られない。（ｄ）実験終了時のマウス由来骨髄においてフローサイトメトリーで決定された腫瘍負荷。実質的にｆｍｃ６３またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞のいずれかを受けたマウスの骨髄においてＲａｊｉ細胞は検出できなかった。

ｉｎｖｉｖｏ持続性ＣＡＲＴ細胞の特徴付け。（ａ）上に概説したモデルにおいて、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞で処置したマウスからのマウス脾臓におけるＣＡＲＴ細胞の絶対数。これは、両方において同じ数が存在することを示している。（ｂ）ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞で処置したマウス骨髄におけるＣＡＲＴ細胞の絶対数。これは、両方において同じ数の細胞が存在することを示している。ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞のいずれかで処置したマウスの（ｃ）脾臓および（ｄ）骨髄におけるＰＤ１発現ＣＡＲＴ細胞の絶対数。ＣＡＴ１９Ｔ細胞のほんの少数が、両コンパートメントにおいてＰＤ１＋である。

本発明者らは、以前記載されたことがない、ＣＤＲを有する新規ＣＤ１９特異的ＣＡＲを開発した。それは、ＵＰＥＮＮ研究において使用されたｆｍｃ６３に基づくＣＡＲと同等の効力を有するが、毒性の低減およびＴ細胞疲弊の低減をもたらす。

したがって本発明の第１の態様では、ａ）以下の配列：
を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および
ｂ）以下の配列：
を含むＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含むＣＤ１９結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７として示される配列を有するＶＨドメインおよび／もしくは（and/or or）配列番号８として示される配列を有するＶＬドメインまたは少なくとも９５％の配列同一性を有するそのバリアントを含んでよい。

ＣＤ１９結合ドメインは、ｓｃＦｖをＶＨ−ＶＬ方向で含んでよい。

ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号９として示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含んでよい。

ＣＤ１９結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークにグラフトされた請求項１に定義された６個のＣＤＲを含んでよい。

ＣＤ１９結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、以下：ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークの１つを含んでよいスペーサーによって連結されてよい。スペーサーはＣＤ８ストークを含んでよい。

ＣＡＲは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むまたはそれと会合してよい。

細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインの１つまたは複数を含んでよい。

具体的にはＣＡＲは、ＣＤ８ストークスペーサーならびに、４１ＢＢエンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含んでよい。

具体的にはＣＡＲは、ＣＤ８ストークスペーサーならびにＯＸ４０エンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含んでよい。

代替的実施形態では細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン；ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインのすべてを含んでよい。

ＣＡＲは、配列番号１０から１５のいずれかとして示される配列を含むか、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＣＤ１９に結合し、ｉｉ）Ｔ細胞シグナル伝達を誘導する能力を保持するそのバリアントを含んでよい。ＣＡＲは、ＵＰＥＮＮ研究において使用されたｆｍｃ６３に基づくＣＡＲと比較して有利な特性を有し得る。例えばＴ細胞によって発現され、ＣＤ１９発現細胞を標的とするために使用される場合、ＣＡＲは：ａ）以下の配列：ＣＤＲ１−ＧＶＳＬＰＤＹ（配列番号１６）；ＣＤＲ２−ＷＧＳＥＴ（配列番号１７）；ＣＤＲ３−ＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹ（配列番号１８）を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、およびｂ）以下の配列：ＣＤＲ１−ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（配列番号１９）；ＣＤＲ２−ＨＴＳＲＬＨＳ（配列番号２０）ＣＤＲ３−ＱＱＧＮＴＬＰＹＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲを発現しているＴ細胞によって引き起こされるＩＦＮγ放出よりも、低いＩＦＮγ放出がＣＤ１９発現標的細胞によって引き起こされ得る。ＣＤＲは、ヒトまたはヒト化フレームワークにグラフトされてよい。

第２の態様では本発明は、本発明の第１の態様によるＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。

第３の態様では、本発明の第２の態様による核酸配列を含むベクターが提供される。

第３の態様では、本発明の第１の態様によるＣＡＲを含む細胞が提供される。

細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞溶解性免疫細胞であってよい。

第４の態様では、本発明の第３の態様による複数の細胞を含む細胞組成物が提供される。

第５の態様では、本発明の第３の態様によるベクターで細胞を形質導入するか、またはベクターを細胞にトランスフェクトするステップを含む、本発明の第３の態様による細胞を作製するための方法が提供される。

第６の態様では、本発明の第３の態様によるベクターでｅｘｖｉｖｏで被験体由来の細胞の試料を形質導入するか、またはベクターを上記試料にトランスフェクトするステップを含む、本発明の第４の態様による細胞組成物を作製するための方法が提供される。

細胞の試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料などの例えば血液試料またはその派生物であってよい。

第７の態様では、本発明の第１の態様による細胞、または本発明の第４の態様による細胞組成物を、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物が提供される。

第８の態様では、本発明の第１の態様による細胞、本発明の第４の態様による細胞組成物または本発明の第７の態様による医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置するための方法が提供される。

方法は、被験体由来の細胞を、本発明の第３の態様によるベクターでｅｘｖｉｖｏで形質導入するか、またはベクターを上記細胞にトランスフェクトし、次いでトランスフェクトした細胞またはその一部を（the, or some of the, transfected cells）被験体に戻し投与するステップを含んでよい。

がんを処置することにおける使用のための本発明の第７の態様による医薬組成物も提供される。

がんを処置するための医薬組成物の製造における本発明の第３の態様による細胞の使用も提供される。

がんは、例えばＢ細胞悪性腫瘍であってよい。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体およびキメラ免疫受容体としても公知であり、免疫エフェクター細胞に任意の特異性をグラフトする操作された受容体である。古典的ＣＡＲでは、モノクローナル抗体の特異性がＴ細胞にグラフトされる。ＣＡＲコード核酸は、例えばレトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に移入され得る。このように多数のがん特異的Ｔ細胞は養子細胞移入のために生成され得る。この手法の第Ｉ相臨床研究は有効性を示している。

ＣＡＲの標的抗原結合ドメインは、一般にスペーサーおよび膜貫通ドメインを介してエンドドメインに融合されている。エンドドメインは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むまたはそれと会合してよい。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これは、それが発現されているＴ細胞への活性化シグナルの伝達を生じる。

本発明のＣＡＲは、マウス抗ＣＤ１９モノクローナル抗体に基づくＣＤ１９結合ドメインを含む。

本発明のＣＡＲは、
ａ）以下の配列：
を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および
ｂ）以下の配列：
を含むＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含むＣＤ１９結合ドメインを含む。

ＣＤ１９結合活性に悪影響を与えることなく各ＣＤＲに１つまたは複数の変異（置換、付加または欠失）を導入することが可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば１個、２個または３個のアミノ酸変異を有してよい。

ＣＤＲは、１０から約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のフォーマットであってよい。ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ方向であってよい、すなわちＶＨがＣＡＲ分子のアミノ末端にあり、ＶＬドメインがスペーサーならびに次に膜貫通ドメインおよびエンドドメインにつながれている。

ＣＤＲは、ヒト抗体またはｓｃＦｖのフレームワークにグラフトされ得る。例えば本発明のＣＡＲは、以下の配列の１つからなるまたは以下の配列の１つを含むＣＤ１９結合ドメインを含んでよい。

本発明のＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含んでよい：
配列番号７−ネズミモノクローナル抗体由来ＶＨ配列

本発明のＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含んでよい：
配列番号８−ネズミモノクローナル抗体由来ＶＬ配列

本発明のＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含んでよい：
配列番号９−ネズミモノクローナル抗体由来ＶＨ−ＶＬｓｃＦｖ配列

ＣＡＲは、以下の配列の１つからなるまたは以下の配列の１つを含んでよい：
配列番号１０−「カンパナ」構造を使用するＣＡＴ１９ＣＡＲ（実施例を参照されたい）
配列番号１１−ＯＸ４０ゼータエンドドメインを含むＣＡＴ１９ＣＡＲ
配列番号１２−ＣＤ２８ゼータエンドドメインを含むＣＡＴ１９ＣＡＲ
配列番号１３−第３世代ＣＤ１９ＣＡＲ
配列番号１４−ＩｇＧ１ヒンジスペーサーを含むＣＤ１９ＣＡＲ
配列番号１５−ＦｃＲ結合部位が変異により外されたヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２−ＣＨ３を含むＣＤ１９ＣＡＲ

本発明のＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５として示される配列のバリアントを、バリアント配列がＣＤ１９に結合する能力を保持する限り（適切な場合は、相補性ＶＬまたはＶＨドメインと合わせて）含んでよい。

２個のポリペプチド配列間の同一性百分率は、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.において自由に入手可能であるＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定され得る。

膜貫通ドメイン
本発明のＣＡＲは、膜に広がる膜貫通ドメインも含んでよい。それは、疎水性アルファヘリックスを含んでよい。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８由来であってよく、良好な受容体安定性をもたらす。

膜貫通ドメインは、配列番号２２として示される配列を含んでよい。
配列番号２２

細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナルの伝達部分である。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、シグナルは細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン構成成分は、３個のＩＴＡＭを含有するＣＤ３ゼータのものである。これは、抗原が結合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３ゼータは、完全に適格性の活性化シグナルは提供し得ず、追加的共刺激シグナル伝達が必要な場合がある。例えばＣＤ２８またはＯＸ４０もしくは４１ＢＢ由来のエンドドメインは、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３ゼータと共に使用される場合がある、あるいは３種すべてが一緒に使用されてよい。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのいずれかのγ鎖の細胞内部分由来のエンドドメインを有していた。結果としてこれらの第１世代受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、それはＴ細胞による同族標的細胞の殺滅を引き起こすために十分であったがＴ細胞を完全に活性化して増殖および生存させることはできなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインが構築された。Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分のＣＤ３ζの細胞内部分への融合は、活性化および共刺激シグナルを抗原認識後に同時に伝達できる第２世代受容体をもたらした。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものであった。これは、Ｔ細胞増殖を引き起こす最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、一部の受容体は、生存シグナルを伝達するＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメインを含むものが記載された。最終的に活性化、増殖および生存シグナルを伝達できるエンドドメインを有するさらに強力な第３世代ＣＡＲが記載された。ＣＡＲおよびそのさまざまな世代は、図４に要約されている。

本発明のＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、４１ＢＢエンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメインまたはＣＤ２８エンドドメインの１つまたは複数の組合せを含んでよい。

本発明のＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含んでよい。
配列番号２３（ＣＤ３ゼータエンドドメイン）
配列番号２４（４１ＢＢエンドドメイン）
配列番号２５（ＯＸ４０エンドドメイン）
配列番号２６（ＣＤ２８エンドドメイン）

そのようなエンドドメインの組合せの例は４１ＢＢ−Ｚ、ＯＸ４０−Ｚ、ＣＤ２８−ＺおよびＣＤ２８−ＯＸ４０ゼータを含む。
配列番号２７（４１ＢＢ−Ｚエンドドメイン融合体）
配列番号２８（ＯＸ４０−Ｚエンドドメイン融合体）
配列番号２９（ＣＤ２８Ｚエンドドメイン融合体）
配列番号３０（ＣＤ２８ＯＸＺ）

バリアント配列は、配列が有効な膜貫通ドメイン／細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供する限り、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０に有してよい。

シグナルペプチド
本発明のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞内で発現されたときに、新生タンパク質が小胞体に、次いでそれが発現される細胞表面に向けられるようなシグナルペプチドを含んでもよい。

シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含有してよい。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチで始まってよく、トランスロケーションの間にポリペプチドの適切なトポロジーを強化することに役立つ。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成するようにトランスロケーションの間または完了後のいずれかに切断できる。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによって消化される。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあってよい。
本発明のＣＡＲは一般式：
シグナルペプチド−ＣＤ１９結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン／細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を有してよい。

シグナルペプチドは、配列番号３１または、シグナルペプチドがＣＡＲの細胞表面発現を生じるように依然として機能する限り５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換もしくは付加）を有するそのバリアントを含んでよい。

配列番号３１のシグナルペプチドは、コンパクトで高効率である。シグナルペプダーゼにより末端グリシンの後ろで約９５％が切断されて、効率的な除去をもたらすことが予測される

スペーサー
本発明のＣＡＲは、ＣＤ１９結合ドメインを膜貫通ドメインに連結し、ＣＤ１９結合ドメインをエンドドメインから空間的に離すスペーサー配列を含んでよい。可動性スペーサーは、ＣＤ１９結合を可能にするようにＣＤ１９結合ドメインをさまざまな方向に方向付けることを可能にする。

スペーサー配列は、例えばＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストークまたはこれらの組合せを含んでよい。スペーサーは、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと同様の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的配列を代替的に含んでよい。

ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除くように変更されてよい。
これらのスペーサーについてのアミノ酸配列の例は下に示されている：
配列番号３２（ヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２ＣＨ３）
配列番号３３（ヒトＣＤ８ストーク）：
配列番号３４（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）：
配列番号３５（ＩｇＧ１ヒンジＦｃ）
配列番号３６（Ｆｃ受容体認識モチーフを除くように修飾されたＩｇＧ１ヒンジＦｃ）
修飾残基に下線を引く；^＊は欠失を示す。

インターフェロン放出およびＣＡＲＴ細胞疲弊
本発明者らは、ＣＡＴ１９ｓｃＦｖに基づくＣＤ１９ＣＡＲが、さらに低い毒性およびさらに良好な有効性を生じることができる特性を有することを見出した。

ＣＤ１９ＣＡＲ治療での主な経験がｆｍｃ６３ｓｃＦｖに基づくＣＡＲによるものであったこと、ならびに最も古く、最も長くおよび恐らく最も重要な臨床データセットがｆｍｃ６３に基づくカンパナＣＡＲによるものであることを考慮して、本発明者らは、このカンパナＣＡＲを「至適基準」として用いた。したがって比較は、ｆｍｃ６３−カンパナＣＡＲと、ｆｍｃ６３の代わりにＣＡＴ１９ｓｃＦｖを有する類似するＣＡＲとの間で行った。驚くべきことに、本発明者らは、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞がＣＤ１９を発現している標的細胞の死滅をもたらし、ＣＤ１９を発現する標的への応答で増殖する一方で、インターフェロン−ガンマ放出は少なかったことを見出した。さらに高悪性度Ｂ細胞リンパ腫の小動物モデルは、ｆｍｃ６３に基づくＣＡＲとＣＡＴ１９に基づくＣＡＲとの間で同等の有効性および同等の生着を示したが、驚くべきことに、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞よりも少ないＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞が疲弊した。

本発明のＣＡＲは、ＣＡＲＴ細胞を標的細胞と接触させることを含む比較アッセイにおいて２５、５０、７０または９０％低いＩＦＮγ放出を生じ得る。

本発明のＣＡＲは、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞よりも少ない割合のＣＡＲＴ細胞の疲弊をもたらし得る。Ｔ細胞疲弊は、ＰＤ−１発現の分析などの当技術分野において公知の方法を使用して評価され得る。本発明のＣＡＲは、ＣＡＲＴ細胞を標的細胞と接触させることを含む比較アッセイにおいてｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞よりも（that）２０、３０、４０、５０、６０または（of）７０％少ないＣＡＲＴ細胞にＰＤ−１を発現させ得る。

核酸配列
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のＣＡＲをコードする核酸配列に関する。

核酸配列は、配列番号１０〜１５のいずれかとして示されるアミノ酸配列を有するＣＡＲをコードすることが可能であり得る。

ベクター
本発明は、本発明による核酸配列を含むベクターも提供する。そのようなベクターは、核酸配列を宿主細胞に導入するために使用されてよく、それにより本発明の第１の態様による分子を発現および産生する。

ベクターは、例えばプラスミドまたは、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであってよい。

ベクターは、Ｔ細胞などの細胞にトランスフェクトすることが可能、または細胞を形質導入することが可能であり得る。

細胞
本発明は、本発明による核酸を含む細胞も提供する。本発明は、本発明の第１の態様によるＣＡＲを細胞表面に発現する細胞を提供する。

本発明によるＣＡＲを発現できる細胞は、ＣＡＲコード核酸で細胞を形質導入するか、またはＣＡＲコード核酸を細胞にトランスフェクトすることによって作製され得る。

本発明のＣＡＲ発現細胞は、ｅｘｖｉｖｏで生成されてよい。細胞は、患者またはドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料などの細胞試料由来であってよい。細胞は、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって、ＣＡＲコード核酸で形質導入される前に活性化および／または拡大されてよい。

医薬組成物
本発明は、本発明の１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞を薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤ならびに任意選択で１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物と共に含有する医薬組成物にも関する。そのような製剤は、例えば静脈内注入のために好適な形態であってよい。

処置方法
本発明のＣＡＲ発現細胞は、Ｂ細胞リンパ腫細胞などのがん細胞を死滅させることが可能であり得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞などのＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血液から（第１のパーティー）、またはドナー末梢血液からの造血幹細胞移植の設定において（第２のパーティー）、または無関係のドナー由来の末梢血液から（第３のパーティー）のいずれかでｅｘｖｉｖｏで作製されてよい。代替的にＣＡＲ発現細胞は、誘導可能前駆細胞または胚性前駆細胞からＴ細胞などの細胞へのｅｘｖｉｖｏ分化由来であってよい。これらの場合ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡをウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションを含む多数の手段の１つによって導入することによって生成される。

本発明のＣＡＲ分子を発現するＴまたはＮＫ細胞は、がん性疾患、具体的にはＣＤ１９発現に関連するがん性疾患の処置のために使用できる。

疾患の処置のための方法は、本発明の細胞または細胞集団の治療的使用に関する。これに関して細胞は、既存の疾患または状態を有する被験体に、疾患に関連する少なくとも１つの症状を和らげる、低減するもしくは改善するためにおよび／または疾患の進行を遅らせる、低減するもしくは遮断するために投与されてよい。本発明の方法は、Ｂ細胞などのＣＤ１９発現細胞の細胞媒介性死滅を生じるまたは促進できる。

本発明は、実施例によってここにさらに記載され、それは本発明を実施することにおいて当業者を支援するために役立つことを意味し、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。

（実施例１）
ＶＨおよびＶＬのクローニングならびにＣＤ１９結合の実証
ＶＨおよびＶＬをマウス抗ＣＤ１９モノクローナル抗体からクローニングし、ヒトカッパ定常領域およびヒトＩｇＧ１定常領域にインフレームで融合した。これらのキメラ重鎖および軽鎖を発現ベクターにクローニングし、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトするために使用した。次に産生された抗体をＳｕｐＴ１細胞（ＣＤ１９陰性であるＴ細胞株）および、ＣＤ１９陽性になるように操作されたＳｕｐＴ１細胞を染色するために使用した。この染色は、ＣＤ１９の特異的結合を示している（図２）。

（実施例２）
ＶＨ／ＶＬがＣＤ１９を結合するｓｃＦｖを形成できることの実証
次いで、クローニングされたＶＨおよびＶＬがｓｃＦｖフォーマットにおいてＣＤ１９を結合できるかどうかを調査した。ＶＨおよびＶＬをｓｃＦｖとして２方向：ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨでクローニングし、ここで２個の可変領域は、（ＳＧＧＧＧ）４からなるリンカーによって分けられた。これらのｓｃＦｖを図３ａに示すとおり切断型ＣＤ３４と共発現される非シグナル伝達ＣＡＲにクローニングした。簡潔にはこれは、シグナルペプチド、ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２−ＣＨ３、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ８エンドドメインの最初の１２残基、ＦＭＤ−２ＡペプチドＴｅＶ、切断型ヒトＣＤ３４を含む。比較できるようにするために、ｆｍｃ６３由来ｓｃＦｖおよび別の抗ＣＤ１９ハイブリドーマ４ｇ７由来ｓｃＦｖを、ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨの両方向で同じフォーマットにクローニングした。

このようにいくつかのパラメーターを研究できる：（１）シグナル伝達による受容体の内部移行によって妨げられなくなった、ネズミＦｃに融合した組換え同族標的抗原の使用による標的抗原のＣＡＲへの結合；（２）受容体の安定性はポリクローナル抗Ｆｃを使用して決定できる；（３）カセットの発現レベルはＣＤ３４についての共染色によって調節できる。

これらの構築物をＳｕｐＴ１細胞に形質導入した。組換えＣＤ１９マウスＩｇＧ２ａＦｃ融合体を生成した。ＳｕｐＴ１細胞をマウス−Ｆｃ、ヒト−Ｆｃおよび抗ＣＤ３４についてさまざまなフルオロフォアにコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーによって安定性／結合を調べた。

使用したさまざまなｓｃＦｖの配列を下に詳述する：
＞ｓｃＦｖ＿ｆｍｃ６３＿ＶＨ−ＶＬ（配列番号３７）
＞ｓｃＦｖ＿ｆｍｃ６３＿ＶＬ−ＶＨ（配列番号３８）
＞ｓｃＦｖ＿４ｇ７＿ＶＨ−ＶＬ（配列番号３９）
＞ｓｃＦｖ＿４ｇ７＿ＶＬ−ＶＨ（配列番号４０）
＞ｓｃＦｖ＿ＣＡＴ＿ＶＨ−ＶＬ（配列番号９）
＞ｓｃＦｖ＿ＣＡＴ＿ＶＬ−ＶＨ（配列番号４１）

使用した構築物および染色結果を図３に要約する。驚くべきことに、ＶＨ−ＶＬ方向でｓｃＦｖを有するＣＡＴＣＡＲはＣＤ１９を結合する一方、ＶＬ−ＶＨ方向でｓｃＦｖを有するＣＡＴ１９ＣＡＲはわずかなＣＤ１９結合を生じた。これは、ＨＬおよびＬＨの両方向でＣＤ１９を結合するｆｍｃ６３ＣＡＲおよび４ｇ７ＣＡＲとは対照的であった。ＨＬＣＡＴＣＡＲの結合および安定性は、ｆｍｃ６３のものと同程度であると考えられた。

（実施例３）
ｆｍｃ３６ＣＡＲに対するＣＡＴ１９ＣＡＲ機能のｉｎｖｉｔｒｏ比較
ＣＡＴｓｃＦｖをＨＬ方向で、Ｃａｍｐａｎａ（Imaiら（２００４年）Leuk. Off. J. Leuk. Soc, Am. Leuk, Res. Fund. UK １８巻：６７６〜６８４頁）によって設計されたＣＡＲスキャホールドにクローニングした。実際にｆｍｃ６３ｓｃＦｖをＣＡＴｓｃＦｖで置き換え、元のｆｍｃ６３に基づくＣＡＲと比較した。このＣＡＲは、シグナルペプチド、ｓｃＦｖ、ＣＤ８ストークスペーサーならびに膜貫通および４１ＢＢおよびゼータエンドドメインを含む。ＣＡＴＣＡＲおよびｆｍｃ６３ＣＡＲのアミノ酸配列を下に示す：
＞ＣＡＴ１９＿ＣＡＲ（配列番号１０）
＞Ｆｍｃ６３＿ＣＡＲ、Imaiら（２００４年）上記によって記載のとおり（配列番号４２）

５名の異なるドナー由来の初代ヒトＴ細胞をカンパナフォーマットでＣＡＴ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでまたはｆｍｃ６３カンパナＣＡＲ自体で形質導入した。これらのＴ細胞を次いで種々のアッセイにおいて使用した。クロム放出アッセイをＳｕｐＴ１細胞に対して実施した。これらの細胞は、ＣＤ１９陰性である。いずれのＣＡＲＴ細胞もこの細胞株に対して応答せず、ＣＡＲ１９ＣＡＲがＣＤ１９陰性細胞に対して非特異的殺滅活性を有さないことを実証している［図５（ａ）］。（ｂ）クロム放出アッセイはまたＣＤ１９を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞に対して実施した。両方のＣＡＲはこの細胞株に対してこのアッセイにおいて同様の高レベルの殺滅を示した［図５（ｂ）］。次に脱顆粒アッセイを標的細胞との共培養後にエフェクター細胞の表面上のＣＤ１０７についての染色によって実施した。ここでＮＴＴ細胞、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞のいずれかをエフェクターとして使用し、ＳｕｐＴ１またはＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞のいずれかを標的として使用した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の脱顆粒の示差測定を可能にするフローサイトメトリーによって表面ＣＤ１０７を検出した［それぞれ図５（ｃ）および（ｄ）］。脱顆粒は、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞と比較してＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞で増加していた。増殖は、トリチウム化チミジレート（thymidilate）取り込みを使用して概算した。ここでＮＴ、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ１９を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞と共培養した。チミジン（thymidiIn）の取り込み、この実験では無関係なＣＡＲ標的化ＧＤ２も検査した。ＣＡＲ１９ＣＡＲＴ細胞で増殖が増加する傾向があった［図４（ｅ）］。次に、ＮＴＴ細胞、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞またはＧＤ２ＣＡＲＴ細胞のいずれかからのインターフェロンガンマ放出をＳｕｐＴ１またはＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞に対するチャレンジの２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。ＣＤ１９＋標的でチャレンジした場合、ＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞は、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞よりも有意に少ないインターフェロンガンマを産生した。

（実施例４）
ＣＡＴ１９ＣＡＲ治療のｉｎｖｉｖｏ有効性の実証
このｉｎｖｉｖｏモデルについての実験設定の概要を図６（ａ）に示す。簡潔にはＮＳＧ（ＮＯＤｓｃｉｄｇａｍｍａ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ）マウスは十分に免疫無防備状態であり、ヒト細胞株および初代ヒトＴ細胞の生着に許容的である。Ｒａｊｉ細胞はバーキットリンパ腫由来のＢ細胞株である。これらの細胞は、ＮＳＧマウスの骨髄内に容易に生着し、高悪性度白血病様症候群を生じる。生物発光画像化（ＢＬＩ）を使用した非侵襲性トラッキングを可能にするホタルルシフェラーゼを発現するようにＲａｊｉ細胞を操作した。マウスに尾静脈注射を介してＲａｊｉ．ＦＬｕｃ細胞２．５ｘ１０^５個を注射した。２４時間後、ＮＴ初代ヒトＴ細胞またはｆｍｃ６３ＣＡＲで形質導入したＴ細胞または、ＣＡＴ１９ＣＡＲで形質導入したＴ細胞のいずれかの４ｘ１０^６個を、尾静脈を介して投与した。腫瘍応答をＢＬＩによって順次測定した。尾静脈血液を生着および血清サイトカインのために４日目に採取した。動物を１１日目に選別し、ＣＡＲＴ細胞の持続性および腫瘍負荷について組織を研究した。さまざまなマウスコホートの１０日目のＢＬＩ画像化を図６（ｂ）に示す。広範囲の疾患がＮＴＴ細胞で処置したマウスの骨盤、脊椎、肋骨、頭蓋および脾臓において見られた一方で、わずかなシグナルがＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞またはｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞のいずれかを受けたマウスにおいて明らかである。さまざまなマウスコホートから経時的に平均化された定量的生物発光シグナルを対数目盛で図６（ｃ）に示す。明白な差異がＮＴＴ細胞を受けたマウスとＣＡＲＴ細胞を受けたマウスとの間のシグナル蓄積において見られる。シグナル蓄積の差異は、ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞を受けたマウスにおいては見られない。最終的に屠殺後に各マウス由来骨髄のフローサイトメトリー分析を、腫瘍負荷を直接決定するために実施した。Ｒａｊｉ細胞は、それらがヒトＢ細胞マーカーを発現することから、マウス造血細胞からおよび養子移入Ｔ細胞から容易に識別できる。わずかなＲａｊｉ細胞がｆｍｃ６３またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞のいずれかを受けたマウスの骨髄において検出できた。

（実施例５）
ｉｎｖｉｖｏ持続性ＣＡＲＴ細胞の特徴付け
上の動物モデルから、本発明者らは、両方の型のＣＡＲＴ細胞がこれらのＮＳＧマウスの骨髄および脾臓に生着したかを決定することを試みた。カウンティングビーズを用いた骨髄および脾臓のフローサイトメトリー分析は、ＣＡＲＴ細胞の絶対数の決定を可能にした。このデータを図７（ａ）および（ｂ）に示す。ｆｍｃ６３ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＴ１９ＣＡＲＴ細胞で処置したマウス由来のマウスの脾臓におけるＣＡＲＴ細胞の絶対数は同様であった。次に本発明者らは、これらのさまざまな組織中の疲弊Ｔ細胞の数に差異があるかどうかを決定することに進んだ。上の試料におけるＰＤ１発現について共染色することによって、疲弊Ｔ細胞の数を決定できた。このデータを図７（ｃ）および（ｄ）に示す。驚くべきことに、ｆｍｃ６３ＣＡＲよりもＣＡＴ１９ＣＡＲを用いた両方の組織コンパートメントにおいて、より少ない疲弊Ｔ細胞が存在した。

上の明細書に述べるすべての刊行物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の記載された方法および系の種々の改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際に、分子生物学、ＣＡＲ技術または関連分野の当業者に明らかである本発明を実行するために記載された様式の種々の改変は続く特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims

ａ）以下の配列：
を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および
ｂ）以下の配列：
を含むＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含むＣＤ１９結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
前記ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号７として示される配列を有するＶＨドメインおよび／もしくは配列番号８として示される配列を有するＶＬドメインまたは少なくとも９５％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
前記ＣＤ１９結合ドメインが、ｓｃＦｖをＶＨ−ＶＬ方向で含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
前記ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号９として示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
前記ＣＤ１９結合ドメインが、ヒト抗体フレームワークにグラフトされた請求項１に定義された６個のＣＤＲを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
ＣＤ１９結合ドメインおよび膜貫通ドメインが、スペーサーによって連結されている、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲ。
前記スペーサーが、以下：ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークの１つを含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
前記スペーサーが、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインも含む、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲ。
前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインの１つまたは複数を含む、請求項９に記載のＣＡＲ。
前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、前記４１ＢＢエンドドメインおよび前記ＣＤ３ゼータエンドドメインを含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、前記ＯＸ４０エンドドメインおよび前記ＣＤ３ゼータエンドドメインを含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインのすべてを含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
配列番号１０から１５のいずれかとして示される配列を含むか、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＣＤ１９を結合し、ｉｉ）Ｔ細胞シグナル伝達を誘導する能力を保持するそのバリアントを含む、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲ。
Ｔ細胞によって発現され、ＣＤ１９発現細胞を標的とするために使用される場合、
ａ）以下の配列：
を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および
ｂ）以下の配列：
を含むＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含むＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲを発現しているＴ細胞によって生じるＩＦＮγ放出よりも低いＣＤ１９発現標的細胞によるＩＦＮγ放出をもたらす、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲ。
ヒトまたはヒト化フレームワークにグラフトされている、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲ。
前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
請求項１７に記載の核酸配列を含むベクター。
請求項１から請求項１６のいずれかに記載のＣＡＲを含む細胞。
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１９に記載の細胞。
請求項１９または請求項２０に記載の複数の細胞を含む細胞組成物。
請求項１８に記載のベクターで細胞を形質導入するか、または請求項１８に記載のベクターを細胞にトランスフェクトするステップを含む、請求項１９または請求項２０に記載の細胞を作製するための方法。
請求項１８に記載のベクターで被験体由来の細胞の試料をｅｘｖｉｖｏで形質導入するか、または請求項１８に記載のベクターを被験体由来の細胞の試料にトランスフェクトするステップを含む、請求項２１に記載の細胞組成物を作製するための方法。
請求項１９もしくは２０に記載の細胞または請求項２１に記載の細胞組成物を、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
請求項１９もしくは請求項２０に記載の細胞、請求項２１に記載の細胞組成物または請求項２４に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置するための方法。
前記被験体由来の細胞を、請求項１８に記載のベクターでｅｘｖｉｖｏで形質導入するか、または請求項１８に記載のベクターを該被験体由来の細胞にトランスフェクトし、次いでトランスフェクトした細胞を該被験体に戻し投与するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
前記がんが、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
がんを処置することにおける使用のための請求項２４に記載の医薬組成物。
がんを処置するための医薬組成物の製造における請求項２０または請求項２１に記載の細胞の使用。