ES2219759T3 - Alto nivel de expresion de la ingap. - Google Patents
Alto nivel de expresion de la ingap.Info
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Abstract
Una construcción recombinante para la expresión de una proteína INGAP que induce la proliferación de célula ductal que comprende: una primera secuencia de nucleótidos que codifica los amino ácidos 27 a 175 de la proteína INGAP seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEC ID NO:4, ligada de forma operable a un sitio de iniciación de la transcripción y a un sitio de iniciación de la traducción, en donde una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una señal peptídica, tal como se muestra en la SEC ID NO: 1, no está presente de forma inmediata a 5¿ de dicha primera secuencia de nucleótidos.
Description
Alto nivel de expresión de la INGAP.
Esta invención se refiere a los métodos y
construcciones para conseguir un alto nivel de expresión de la
INGAP, una proteína implicada en la neogénesis de las células de
los islotes.
Los islotes pancreáticos de Langerhans son
los únicos órganos de producción de insulina por las células
\beta en el cuerpo. Sin embargo, tienen una capacidad limitada de
regeneración. Esta capacidad limitada de regeneración predispone a
los mamíferos a desarrollar diabetes mellitus. Por ello hay una
necesidad en el estado de la técnica de la endocrinología de
productos que puedan estimular la regeneración de los islotes de
Langerhans para prevenir o mejorar los síntomas de la
diabetes mellitus.
Hay muchos factores que regulan la masa de las
células \beta pancreáticas. (Vinik y col., Diabetes Reviews
4: 235-263, 1996). Un extracto pancreático
llamado Ilotropina induce la regeneración de las células \beta y
revierte la diabetes. (Rosenberg y col. (1996) Diabetologia
39: 256-262. Se ha identificado y aislado un
gen que codifica una proteína en la Ilotropina; la proteína es
responsable de la estimulación de la regeneración de las células de
los islotes. (R. Rafaeloff, Abst. 1995, Diabetes 44: 75A).
Esta proteína es conocida como INGAP, y está descrita por ejemplo
en la solicitud de patente WO 9626215. La descripción de estás
solicitudes está expresamente incorporada en el presente documento.
A pesar del conocimiento de la secuencia de nucleótidos completa
del gen de la INGAP, la expresión de la proteína ha sido limitada.
Por ello hay una necesidad en el estado de la técnica de métodos de
expresión y de aislamiento de grandes cantidades de la proteína
INGAP.
Constituye un objeto de la presente invención el
proporcionar un método de producción biológica de la proteína INGAP
activa a partir de una célula huésped recombinante.
Constituye otro objeto de la presente invención
el proporcionar una célula huésped que exprese grandes cantidades
de la proteína INGAP.
Constituye un objeto de la presente invención el
proporcionar una construcción recombinante para la expresión de la
proteína INGAP biológicamente activa.
Otro objeto de la invención es el proporcionar un
método para el aislamiento de la proteína INGAP a partir de una
célula huésped recombinante.
Estos y otros objetos de la invención se
consiguen proporcionando la técnica con una construcción
recombinante para la expresión de la proteína INGAP biológicamente
activa que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos que codifica
los amino ácidos 27 a 175 unidos de forma operable a un sitio de
iniciación de la transcripción y a un sitio de iniciación de la
traducción, en donde una segunda secuencia de nucleótidos que
codifica una señal peptídica no está presente de forma inmediata a
5' de dicha primera secuencia de nucleótidos.
En otra realización de la invención se
proporciona un método de producir la actividad de la INGAP a partir
de una célula huésped recombinante. El método comprende las etapas
de:
cultivar una célula huésped que comprende una
construcción recombinante que comprende una primera secuencia de
nucleótidos que codifica los amino ácidos 27 a 175 unidos de forma
operable a un sitio de iniciación de la transcripción y a un sitio
de iniciación de la traducción, en donde una segunda secuencia de
nucleótidos que codifica una señal peptídica no está presente de
forma inmediata a 5' de dicha primera secuencia de nucleótidos;
recuperación de la proteína de dicha célula
huésped cultivada.
En todavía otra realización de la invención se
proporciona una célula huésped. La célula huésped comprende una
construcción recombinante que comprende una primera secuencia de
nucleótidos que codifica los amino ácidos 27 a 175 unidos de forma
operable a un sitio de iniciación de la transcripción y a un sitio
de iniciación de la traducción, en donde una segunda secuencia de
nucleótidos que codifica una señal peptídica no está presente de
forma inmediata a 5' de dicha primera secuencia de nucleótidos.
Estas y otras realizaciones de la invención que se harán aparentes
a los expertos en la materia proporcionan una fuente práctica de la
proteína INGAP en cantidades adecuadas para uso en situaciones
preclínicas y clínicas.
Figura 1. Gel SDS-PAGE de los
productos de la transfección bacteriana. Lisado bacteriano sin
transfección (CBL), lisado bacteriano con transfección (TBL),
fracciones de la cromatografía Ni-NTA (eluidas a pH
6,3 (6,3); pH 5,9 (5,9); y pH 4,5 (4,5) y estándares (Std).
Figura 2. Película ECL de las manchas del método
Western utilizando el anticuerpo de la INGAP 945-2.
Las líneas son tal como se han identificado en la descripción de la
Figura 1.
Constituye un descubrimiento de los presentes
inventores que la expresión bacteriana de la INGAP puede ser
conseguida a niveles elevados por eliminación de la secuencia de
codificación de la secuencia de señal de la INGAP. Aunque no se
quiere estar ligado a ninguna teoría o mecanismo de acción en
particular, los solicitantes creen que la secuencia señal es tóxica
para los huéspedes bacterianos. La secuencia de señal comprende los
amino ácidos 1 a 26 tal como se muestran en la SEC. ID NO:1. En las
construcciones ensayadas, la región no traducida 5' que comprende
los nucleótidos 1-16 también ha sido eliminada. Esta
eliminación también puede contribuir al incremento observado en la
expresión.
Otro aspecto de las construcciones que los
solicitantes han encontrado como extremadamente útil es un iniciador
de transcripción inducible. Los iniciadores de transcripción
inducibles adecuados incluyen aquellos inducibles por
tiogalactósido de isopropilo (IPTG), tales como el promotor/operador
de laca, así como otros que son conocidos en el estado de la
técnica.
De acuerdo con todavía otro aspecto de las
construcciones que han desarrollado los solicitantes, puede
construirse un marcador de la histidina para que esté en la
proteína. El marcador de histidina puede simplificar el proceso y la
purificación. Un marcador de histidina es una extensión de los
residuos de histidina que son añadidos a una proteína, normalmente
por ingeniería genética. Preferiblemente el marcador comprende
entre 3 y 12 residuos de histidina. Estos pueden ser contiguos o
estar interrumpidos por otros residuos. El marcador de histidina
puede estar unido al final del N-terminal o del
C-terminal de la proteína para minimizar la rotura
de la función proteína. Los métodos para hacer y utilizar
marcadores de histidina son conocidos en el estado de la técnica.
Puede utilizarse la oligohistidina como una mitad de afinidad que
utiliza un quelato de metal, tal como el NTA de níquel (ácido
N-(5-amino-1-carboxipentil)-iminoacético
como la otra pareja de afinidad.
Una construcción recombinante de acuerdo con la
invención, es cualquier molécula de DNA que ha sido construida de
modo que dos segmentos de DNA sean adyacentes a cada uno de los
otros que no son adyacentes entre sí en la naturaleza.
Preferiblemente dichas construcciones se llevan a cabo in
vitro, aunque también puede llevarse a cabo la construcción
in vivo. La construcción puede ser un plásmido, fago, virus,
elemento transponible, minicromosoma, u otro elemento, de modo que
sea adecuado para la aplicación deseada.
La secuencia de codificación de los residuos de
amino ácidos 27-175 de la proteína INGAP está
incluida en las construcciones. Preferiblemente se elimina la
secuencia de la señal entera. Sin embargo, es posible que sólo deba
eliminarse una parte de la secuencia de la señal para obtener una
expresión excelente. De este modo alguna parte de la secuencia de
la señal puede ser retenida en las construcciones.
También es deseable la eliminación de la región
no traducida 5', los nucleótidos 1-16. Sin embargo,
no se conoce si esto es necesario para conseguir una expresión
excelente. De este modo la región no traducida 5' puede ser retenida
en algunas construcciones.
Una célula huésped de acuerdo con la invención
puede ser transfectada o transformada con una construcción
recombinante de acuerdo con la presente invención. El huésped puede
ser una célula de una bacteria, levadura, insecto o mamífero. La
selección de promotores adecuados y de iniciadores de traducción
para uso en la célula huésped apropiada está también dentro del
saber de los expertos en la materia. Las células huésped pueden ser
transformadas, transfectadas, acopladas o infectadas con la célula
huésped recombinante de la presente invención. El cultivo de las
células huésped puede ser llevado a cabo utilizando técnicas y
medios que son bien conocidos en el estado de la técnica. De nuevo,
puede seleccionarse un medio y una técnica adecuada por el experto
ordinario en la materia.
La descripción anterior describe de forma general
la presente invención. Puede obtenerse un conocimiento más completo
por referencia a los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan en el presente documento con el objetivo sólo de
ilustración.
Este ejemplo describe el diseño experimental
utilizado.
Generamos un nuevo INGAP cDNA por PCR que
excluyó la región 5' UTR (nucleótidos 1-16 en la SEC
ID: 1) y la señal peptídica (nucleótidos 17-94) y
creamos dos nuevos sitios de reconocimiento de la enzima de
restricción que permiten la inserción de la nueva construcción en
un nuevo vector de expresión pQE-31. Se transformó
esta nueva construcción ligada en las células competentes TOP10F'
(cepa huésped E. coli de Invitrogen). Se identificaron los
clones positivos, verificados por la digestión de la enzima de
restricción y el DNA aislado. El DNA fue transformado en una cepa
diferente de E. coli competente, M15(pREP4) y se
indujo la expresión de la proteína por IPTG
(isopropil-beta, D-tiogalactopiranósido) que
inhibe el represor, facilitando la expresión de la proteína a
partir del promotor/operador M15. El motivo para la transformación
intermedia del material ligado en el TOP10F' es que estas células
son altamente competentes incrementando la desigualdad de tener
colonias positivas insertas. Las células M15(pREP4) que se
utilizaron para la expresión de la proteína no alcanzan niveles de
competencia suficientemente altos para garantizar la transformación
de los productos de ligamiento. El DNA plásmido obtenido de la
transformación del TOP10F' fue suficiente para incrementar la
transformación de las células M15(pREP4). Se aisló la
proteína marcada en la His por purificación por afinidad a la
agarosa Ni^{2+}.
Se utilizó una aproximación de la PCR para
generar un nuevo INGAP cDNA que excluye la región 5' UTR
(nucleótidos 1-16 en la SEC ID NO:1) y la señal
peptídica.
La secuencia (SEC ID NO:1) que ha sido excluida
es la siguiente:
(el área en negrita representa la secuencia de la
señal peptídica)
Este ejemplo describe el uso de la reacción de la
cadena de polimerasa para sintetizar la INGMAT (construcción que le
falta la secuencia de la señal peptídica, es decir, que
codifica la proteína madura).
Se diseñaron los oligonucleóticos para la PCR
para incorporar la restricción de los sitios de reconocimiento de
enzimas en sus respectivos finales 5'. El oligonucleótido diseñado
para el final 5' del gen incorpora un sitio Bam HI seguido por 20
nucleótidos correspondientes a los N-terminales de
la proteína madura. El oligonucleótido diseñado para el final 3'
incorpora un sitio Xho I seguido por 20 nucleótidos no traducidos.
El producto de la PCR generado a partir de estas imprimaciones
contiene la secuencia de la INGAP madura y el codón de la
terminación de la proteína de origen.
Se utilizó la siguiente secuencia de
oligonucleótidos:
5'-CCGCGGATCCCGAAGAATCTCAAAAGAAACT-3'
5'-GACCGGCTCGAGTGCTCTTCCTGAGTGAATCC-3'
\newpage
| Plantilla: (50 ng de cDNA original de la INGAP separado de pCDNA3) | 5 \mul |
| MgCl_{2}: | 4 \mul |
| Tampón 10 X PCR | 5 \mul |
| dATP | 1 \mul |
| dCTP | 1 \mul |
| dGTP | 1 \mul |
| dTTP | 1 \mul |
| imprimación 5' | 1 \mul |
| imprimación 3' | 1 \mul |
| H_{2}O | 29 \mul |
| Polimerasa Taq | 1 \mul |
| \hskip8cm Volumen total = | 50 \mul |
A) 2 min a 95ºC
B) 30 ciclos de (1 min a 95ºC, 1 min a 55ºC, 1
min a 72ºC)
C) 7 min a 72ºC
D) 4ºC hasta separación del ciclo térmico.
A continuación los productos de la PCR fueron
sometidos a electroforesis sobre una PAGE al 5% en TBE. Los
productos de la PCR teñidos con bromuro de etidio correspondientes
al tamaño esperado para la construcción fueron cortados del gel.
Los fragmentos del gel fueron electro-eluídos en 0,5
ml del TBE, precipitados con 50 \mul de acetato sódico 3 M y 1 ml
de isopropanol a -80ºC durante 20 min, centrifugados, lavados una
vez con 1 ml de isopropanol, lavados una vez con 1 ml de etanol al
70%, y a continuación secados a vacío. El pellet (gránulo) seco fue
suspendido de nuevo en 50 \mul de H_{2}O y cuantificado. Al
final de esta etapa la secuencia del producto de la PCR que contiene
tanto los sitios de restricción menos la secuencia de señal y la
UTR 5' fue la siguiente (SEC ID NO: 4):
\bullet Las áreas en negrita representan los
prímeros.
Este ejemplo describe la creación de un plásmido
que contiene la construcción de expresión.
Se llevaron a cabo dos reacciones de digestión de
la enzima de restricción en paralelo utilizando 2,5 \mug tanto del
producto de la PCR de la INGMAT como del vector
pQE-31. La INGMAT se digirió con Bam HI y Xho I de
forma simultánea en un volumen de 30 \mul. El
PQE-31 se digirió con Bam HI y Sal I de forma
simultánea en un volumen de 30 \mul. Ambas reacciones de digestión
se llevaron a cabo a 37ºC durante un periodo de 4 horas. Después de
que las reacciones fueran completas, se sometieron a electroforesis
400 ng de cada en un gel de agarosa al 1,5% y se tiñeron con
bromuro de etidio para asegurar la digestión completa. El resto
(2,1 \mug) de ambas reacciones de digestión se pasó sobre una
G-50 de sefarosa para eliminar los pequeños
fragmentos de DNA seguido de dos extracciones con fenol del mismo
volumen. A continuación se precipitó el DNA extraído con 2
volúmenes de etanol y 1/10 volumen de acetato sódico 3 M a -80ºC
durante 20 minutos, se centrifugó, se lavó dos veces con etanol del
70% y se secó al vacío. Los gránulos se volvieron a suspender en 25
\mul de H_{2}O y se cuantificaron.
El sistema de expresión pQE-31
fue obtenido de QIAGEN Inc. Chatsworth, CA.
La INGMAT (Bam HI/Xho I) y el
pQE-31 (Bam HI/Sal I) tiene terminaciones
compatibles adecuados para el ligamiento. Como resultado del
ligamiento se eliminó el sitio de restricción Sal I en el
vector.
Condiciones de ligamiento utilizando un vector
2:1 para insertar relación molar.
| pQE31 (vector) 517 ng | 9,0 \mul |
| INGMAT (inserto) 165 ng | 2,5 \mul |
| 10 X tampón de ligamiento | 5,0 \mul |
| rATP 10 mM | 5,0 \mul |
| T4 Ligasa 4u | 1,0 \mul |
| H_{2}O | 27,5 \mul |
| \hskip4cm Volumen final = | 50,0 \mul |
Las reacciones de ligamiento se incubaron a 4ºC
durante 16 horas.
Se trasladaron 5 \mul de la reacción de
ligamiento en 100 \mul de células TOP10F' competentes, (las
células TOP10F' se obtuvieron de Invitrogen, San Diego, CA) con 0,5
\mul de \beta-mercaptoetanol 500 mM y se
incubaron en hielo durante 30 minutos, se trataron con calor
durante 45 segundos a 42ºC, y se introdujeron de nuevo en hielo
durante 2 minutos. A continuación se añadió 1 ml de los medios
precalentados a 8ºC y se incubaron a 37ºC con agitación a 225 rpm
durante 1 hora seguido por preparación de placas con toda la
reacción de transformación en placas de agar con caldo LB
conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina.
Se transportaron las placas que contenían las
colonias en membranas Nytran. Las colonias fueron lisadas con NaOH
0,5 M, neutralizadas, y el DNA resultante unido a la membrana por
calefacción a 80ºC durante 1 hora. A continuación las membranas
fueron hibridadas en formaldehído al 50%, 5 X SSPE a 50ºC durante 16
horas con 3 x 10^{6} cpm/ml de cDNA de INGAP marcado al azar con
P^{32}. Se lavaron las membranas con gran rigor y se expusieron a
una película de rayos X. Las colonias positivas se detectaron en la
película de rayos X y se hicieron crecer en 3 mls de LB con
ampicilina.
Se aisló el DNA de los cultivos pequeños
utilizando lisis alcalina, extracción con fenol, precipitación,
secado y nueva suspensión en 50 \mul de H_{2}O. Se digirió una
pequeña alícuota de cada uno de los DNA aislados con Bam HI y Hind
III para liberar los insertos. Se sometieron a electroforesis los
DNAs digeridos en agarosa al 1,5% y se tiñeron con bromuro de
etidio y los insertos positivos se identificaron en el intervalo de
tamaño de 510 bp. Se tomaron cuatro de los insertos que contenían
los plásmidos y se incubaron en presencia de RNAsa para eliminar
cualquier RNA bacteriano residual.
Se eliminaron 5 \mul del DNA limpio aislado en
la sección IIE limpio y se transfirieron en 100 \mul de células
competentes de M15(pREP4). Se incubó la mezcla en hielo
durante 30 minutos, se trató con calor durante 45 segundos a 42ºC,
y se volvió a poner en hielo durante 2 minutos. Se añadió 1 ml del
medio SOC precalentado y se incubó a 37ºC con agitación a 225 rpm
durante 90 minutos. Se colocó toda la reacción de transformación en
placas con placas de agar de caldo LB conteniendo 100 \mug/ml de
ampicilina y 25 \mug/ml de kanamicina.
Se seleccionaron ocho colonias y se hicieron
crecer en LB con ampicilina. Se aisló el DNA de los cultivos
pequeños utilizando procedimientos de extracción de lisis alcalina,
extracción con fenol, precipitación, secado, y nueva suspensión en
50 \mul de H_{2}O. Se digirió una pequeña alícuota de cada uno
de los DNA aislados con BAM HI y HIND III para liberar los
insertos. El DNA digerido se hizo correr en gel de agarosa al 1,5%
y se visualizó por tinción con bromuro de etidio. Se almacenaron
varios de los transformantes, que demostraron el plásmido con
insertos del tamaño correcto así como la presencia del plásmido
pREP4, en glicerol al 50% a -80ºC para ser utilizados para la
producción de proteína.
Este ejemplo describe el aislamiento por
cromatografía de proteína de afinidad por metal desnaturalizante de
la proteína INGAP marcada en la his sin la señal peptídica.
(Procedimiento para un cultivo de 250 ml de M15(pREP4)
transformado por pINGMATHIS. pINGMATHIS es la construcción
INGMATHIS ligada en el vector pQE-31).
Se hicieron crecer 25 ml durante la noche en LB
con 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml del antibiótico
kanamicina. Se iniciaron 250 ml de LB y 100 \mug/ml de ampicilina
y 25 \mug/ml del cultivo de kanamicina con 5 ml del de la noche
(1:50).
Crecimiento hasta ABS600 = 0,75 hasta 0,9 (actual
OD = 0,866). Se añadieron 5 ml de IPTG 100 mM (2 mM final) para
inducir la producción de la proteína. Se continuó el crecimiento
durante 4 horas en el caso de la INGAP. Se recogieron las
bacterias y s hicieron girar a 6000 rpm durante 20 minutos,
separando el sobrenadante. El pellet se congeló hasta el momento
del uso a -70ºC.
Se prepara tanto como se vaya a necesitar.
(Utilizar 10 ml al 50% del Ni^{+2} NTA para cada gránulo
bacteriano derivado de 250 ml). Colocar 16 ml de la suspensión al
50% en un tubo de centrífuga de 50 ml desechable. Centrifugar
durante 2 minutos a 800 x g y separar el sobrenadante. Añadir 42 ml
de agua estéril, resuspender la resina. Centrifugar durante 2
minutos a 800 x G y separar el sobrenadante. Añadir 42 ml de agua
estéril, suspender de nuevo la resina. Centrifugar durante 2
minutos a 800 x G y separar el sobrenadante. Añadir 42 ml de tampón
A de ligamiento/lisis (Guanidina HCL 6 M, fosfato sódico 0,1 M,
Tris 0,01 M, pH 8,0) y suspender de nuevo la resina. Centrifugar
durante 2 minutos a 800 x G y separar el sobrenadante. Añadir 42 ml
de tampón A de ligamiento/lisis (Guanidina HCl 6 M, fosfato sódico
0,1 M, Tris 0,01 M, pH 8,0) y suspender de nuevo la resina.
Centrifugar durante 2 minutos a 800 x G y separar el sobrenadante.
Llevar el volumen total hasta 10 ml con tampón A. La suspensión
está ahora lista para la aplicación de la bacteria lisada.
Descongelar el gránulo de la bacteria durante 15
minutos a temperatura ambiente. Suspender de nuevo el gránulo en
12,5 ml de tampón A de lisis. (Guanidina HCl 6 M, fosfato sódico
0,1 M, Tris 0,01 M, pH 8,0). Se transfiere la nueva suspensión a un
tubo de centrífuga de 50 ml. Se congela el producto de
resuspensión/lisado a -70ºC hasta que sea sólido. Descongelar a
temperatura ambiente. Colocar el lisado en un rotatorio durante 60
minutos a temperatura ambiente. Centrifugar el lisado durante 15
minutos a 10.000 X G. Separar el sobrenadante y añadir 10 ml de
Ni^{2+} NTA preparado. Rotar durante 45 minutos. Cargar la
suspensión en una columna de 1,6 cm de diámetro y dejar que fluya
por gravedad.
Dejar fluir 50 ml de tampón A. (No es preciso
recoger). Dejar fluir 40 ml de tampón B (Urea 8 M, fosfato sódico
0,1 M, Tris 0,01 M, pH 8,0). (No es preciso recoger) pero la
A_{280} debe estar a, o cerca de, cero antes de continuarr, y en
caso contrario lavar continuación con más. Lavar con 40 ml de
tampón C, igual con B pero a pH 6,3. Recoger fracciones de 3 ml.
Lavar con 40 ml de tampón D, igual con B pero a pH 5,9. Recoger
fracciones de 3 ml.
Lavar con 40 ml de tampón E, igual con B pero a
pH 4,5. Recoger fracciones de 3 ml. En este punto la proteína debe
estar en una de las fracciones recogidas. Leer la absorbancia a 280
de todas las fracciones para discernir en cual está la proteína.
Reunir, reducir y electroforesis en página con SDS.
Con el fin de purificar la proteína expresada, se
cambió la solución soporte de la fracción extraída de níquel/NTA a
pH 4,5 a tampón Tris utilizando diálisis. Se preparó los tubos de
diálisis con un corte de peso molecular de 3000 en EDTA 5
mM/bicarbonato sódico 200 mM durante 5 minutos. Se enjuagaron los
tubos de forma breve en agua desionizada y se hirvieron otros 5
minutos en la solución de bicarbonato. Se volvió el entubado a agua
desionizada, se cubrieron con papel de aluminio y se trataron en el
autoclave durante 10 min en un ciclo líquido. Se manejó el entubado
con guantes de latex durante todo el procedimiento.
Se dializó un ml de la solución de la proteína de
la columna de níquel/NTA en guanidina HCl 6 M frente 4 litros de
tampón de Tris 25 mM a pH 8,5 durante 12 horas. Después de la
diálisis, había 2 mls de solución de proteína con una concentración
de proteína de 800 \mug/ml.
Este ejemplo describe las técnicas analíticas que
confirman la identidad del producto.
Con el fin de analizar la sobreexpresión de la
proteína INGAP, se llevó a cabo la electroforesis sobre gel de
poliacrilamida con desnaturalización en discontinuo en la solución
utilizando el aparato Hoefer SE250 Mighty Small II. Se preparó el
gel separante con acrilamida al 15%, bis-acrilamida
al 1,35% en tampón de Tris 375 mM a pH 8,8 con dodecilsulfato de
sodio al 0,05%. Se indujo la polimerización por adición de
persulfato amónico al 0,05% y 20 \mul de TEMED/15 ml de solución.
Se colocó la solución en el aparato de placa con el gel para la
polimerización. Se colocó el gel apilado con la misma solución,
excepto que el tampón de Tris fue 125 mM a pH 6,8, y la
concentración de acrilamida fue del 4%. Se diluyeron las muestras de
proteína 1:1 con muestra de tampón (125 mM de
Tris-Cl, pH 6,8, 4% de SDS, 20% de glicerol, y 10%
de mercaptoetanol).
Los tampones de la capa superior e inferior del
tanque fueron idénticos, conteniendo 25 mM de Tris, 192 mM de
glicina y 0,1% de SDS a pH 8,3. Se cargaron dos geles con 20 \mul
cada uno del lisado bacteriano sin transfección (CBL, 368
\mug/ml), del lisado bacteriano con transfección (TBL, 341
\mug/ml), las fracciones de la cromatografía
Ni-NTA (eluída a pH 6,3, 110 \mug/ml; pH 5,9, 100
\mug/ml; y pH 4,5, 800 \mug/ml) y los estándares (Rainbow
Markers, Amersham y Dalton Mark-VII, Sigma). Se
llevó a cabo la electroforesis a una corriente constante de 20 mA
hasta que el frente del colorante entró en el gel de separación, y
a una corriente constante de 60 mA hasta que el frente de colorante
alcanzó los 0,5 cm de la parte inferior. A continuación se
eliminaron los geles y se fijó uno con metanol al 45%/ácido acético
al 10% durante una hora, y el otro se colocó en un tampón de
transferencia (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 20% de metanol, pH
8,3) durante 20-30 minutos.
Se equilibró el gel fijado con 2 cambios de
etanol 10%/ácido acético 5% durante 30 minutos cada uno. A
continuación se expuso el gel a una solución de HNO_{3} 0,0032
N/K_{2}Cr_{2}O_{7} durante 5 minutos. Se lavó el gel en agua
desionizada 3 veces durante 10 minutos cada vez. Se impregnó el gel
con plata utilizando 0,1 g de AgNO_{3}/50 ml de H_{2}O durante
30 minutos. Se separó por lavado la solución de plata del gel en
agua desionizada durante 5 minutos. A continuación se expuso el gel
a una solución de desarrollo (29,7 g de Na_{2}CO_{3} anhidro en
1 litro de H_{2}O con 0,5 ml de formalina) en intervalos de 5
minutos entre los cambios hasta que se alcanzó la densidad deseada.
Se detuvo el desarrollo con ácido acético al 10%, y se almacenó el
gel en H_{2}O.
El gel mostró una banda de proteína a
aproximadamente 19 kD que fue prominente en el lisado bacteriano de
las células transfectadas y en la fracción de elución de pH 4,5 en
níquel/NTA (Figura 1). Esta proteína no estuvo representada en
ninguna de las otras muestras. Esto es consistente con el tamaño de
la proteína INGAP y con la interacción de la región marcada con la
histidina insertada con la matriz de la columna de níquel/NTA.
Se humedeció una membrana de PVDF
Immobilon-P con metanol al 100%, y se equilibró con
tampón de transferencia durante 10 minutos. Se eliminó el gel del
tampón de transferencia y se colocó en la membrana de PVDF. Se
eliminaron todas las burbujas entre la membrana y el gel. Se colocó
la combinación entre el papel de filtro de 3 mm Whatmann humedecido
con tampón de transferencia y se colocó el "sandwich" completo
en el cassette de un tanque de transferencia Hoefer. Se colocó el
cassette en el tanque de transferencia lleno con el tampón de
transferencia con el gel hacia el cátodo. Se llevó a cabo la
transferencia a un voltaje constante de 12 V durante 18 horas.
Después de la transferencia, se colocó la
membrana en un tampón de bloqueo de 0,5 M de Tris, 2 M de NaCl y un
1% de polietilen glicol con un 5% de albúmina de suero de bovino un
10% de suero de cabra a temperatura ambiente durante 1 hora. A
continuación se colocó la membrana en 20 ml de tampón de bloqueo que
contiene anticuerpos 945-2 de INGAP a una
disolución 1:5000 y se incubó a temperatura ambiente durante 1
hora. A continuación se lavó la membrana 3 veces durante 15 minutos
cada vez con 50 ml de tampón de lavado (0,4% de
Tween-20 en solución salina tamponada de fosfato
(PBS) a pH 7,4). A continuación se incubó la membrana durante 1
hora a temperatura ambiente en un tampón de lavado conteniendo IgG
anti-conejo (molécula entera, Sigma Cat #
A-0545) conjugado de peroxidasa a una dilución de
1:160.000. Se lavó la membrana 3 veces durante 5 minutos en 50 ml de
Tween-20 al 0,2% en PBS, seguido por 3 lavados de 5
minutos cada uno con Tween-20 al 0,1% en PBS. Se
revelaron las manchas utilizando el equipo de quimioluminiscencia
de enzima de Amersham Corp., Arlington, IL de acuerdo con las
instrucciones. Se expuso la mancha en ECL a una película de rayos X
Kodak X-Omat AR-5 durante 20
minutos.
El ECL de la mancha reveló un fuerte
reconocimiento de la proteína de las proteínas de 19 kD
sobreexpresadas en el lisado completo de las bacterias
transfectadas (TBL) y de la fracción de pH 4,5 que se visualizaron
en los geles de la SDS-PAGE (Figura 2). Además,
hubo una banda de proteína reconocida en ambos lisados bacterianos
a 40 kD, implicando que esta proteína era débilmente reconocida y
es una proteína más que un producto de transfección. Finalmente,
hubo una ligera banda a 14 kD que se reconoció por el anticuerpo en
ambos lisados bacterianos transfectados y en la fracción de pH 4,5.
Esto tanto puede ser otra proteína como una fracción lítica de la
proteína INGAP. Dada la construcción realizada para producir la
proteína INGAP es más probable una fracción lítica de la INGAP.
En resumen, hemos sido capaces de expresar la
proteína INGAP en un sistema procariótico por exclusión de 5'UTR y
de la señal peptídica e inserción de la nueva construcción en un
nuevo vector. La proteína resultante es del tamaño molecular
predicho del monómero INGAP y reacciona con el anticuerpo para la
INGAP en un análisis Western. La proteína comparte con el péptido
INGAP la capacidad para inducir proliferación de célula ductal.
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Trp Met Leu Leu Ser}
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Claims (8)
1. Una construcción recombinante para la
expresión de una proteína INGAP que induce la proliferación de
célula ductal que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos que codifica
los amino ácidos 27 a 175 de la proteína INGAP seleccionada entre
las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEC ID NO:4,
ligada de forma operable a un sitio de iniciación de la
transcripción y a un sitio de iniciación de la traducción, en donde
una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una señal
peptídica, tal como se muestra en la SEC ID NO: 1, no está presente
de forma inmediata a 5' de dicha primera secuencia de
nucleótidos.
2. La construcción de la reivindicación 1 que
comprende además una tercera secuencia de nucleótidos que codifica
un marcador de histidina.
3. La construcción de la reivindicación 2 donde
la tercera secuencia de nucleótidos está de forma inmediata a 5' o
3' de dicha primera secuencia de nucelótidos.
4. La construcción de la reivindicación 1 donde
el sitio de iniciación de la transcripción es inducible.
5. La construcción de la reivindicación 1 donde
el sitio de iniciación de la traducción es laca de
promotor/operador.
6. Un método de producir en una célula huésped
recombinante, la proteína INGAP biológicamente activa capaz de
inducir la proliferación de célula ductal, que comprende las etapas
de:
cultivar una célula huésped que comprende una
construcción recombinante de acuerdo con la reivindicación 1;
recuperar la proteína de dicha célula huésped
cultivada.
7. El método de la reivindicación 6 donde la
construcción comprende además una tercera secuencia de nucleótidos
que codifica un marcador de histidina, y se purifica la proteína
INGAP utilizando una matriz de afinidad de níquel.
8. Una célula huésped que comprende una
construcción recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.
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|---|---|---|---|
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