DE69729010T2

DE69729010T2 - Produktion des proteins ingap mit hoher expressionsrate

Info

Publication number: DE69729010T2
Application number: DE69729010T
Authority: DE
Inventors: I. Aaron VINIK; I. Gary PITTENGER; Ronit Rafaeloff; W. Scott BARLOW
Original assignee: Eastern Virginia Medical School
Current assignee: Eastern Virginia Medical School
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-30
Publication date: 2005-04-28
Anticipated expiration: 2017-10-31
Also published as: ES2219759T3; CA2270412A1; DK1007647T3; HK1028789A1; WO1998018913A1; USRE39351E1; EP1007647A4; EP1007647A1; DE69729010D1; JP2001502916A; AU727237B2; US5804421A; AU5000797A; PT1007647E; ATE266094T1; EP1007647B1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Methoden und Konstrukte zur Erzielung einer Produktion mit hoher Expressionsrate von INGAP, einem Protein, das an der Neogenese von Inselzellen beteiligt ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse sind die einzigen Organe der Insulin-Produktion durch β-Zellen im Körper. Jedoch haben sie eine limitierte Regenerationskapazität. Diese limitierte Regenerationskapazität prädisponiert Säuger, Diabetes mellitus zu entwickeln. Somit besteht auf dem Fachgebiet der Endokrinologie ein Bedarf an Produkten, welche die Regeneration von Langerhans-Inseln stimulieren können, um die Symptome von Diabetes mellitus zu vermeiden oder zu verbessern.
Es gibt viele Faktoren, welche die β-Zellmasse der Bauchspeicheldrüse regulieren (Vinik et al., Diabetes Review 4: 235–263, 1996). Ein Bauchspeicheldrüsenextrakt, genannt Ilotropin, induziert β-Zellregeneration und macht Diabetes rückgängig (Rosenberg et al. (1996) Diabetologia 39: 256–262). Ein Gen, codierend für ein Protein zugehörig zu Ilotropin, wurde identifiziert und isoliert; das Protein ist verantwortlich für die Stimulierung der Inselzellregeneration (Rafaeloff, R. Abst. 1995, Diabetes 44:75A). Dieses Protein wird INGAP genannt und wird offengelegt beispielsweise in WO 96/26215. Die Offenlegung dieser Anmeldungen ist hierin ausdrücklich eingeschlossen. Trotz der Kenntnis der gesamten Nukleotidsequenz des INGAP-Gens war die Expression des Proteins limitiert. Somit besteht ein Bedarf auf dem Fachgebiet für Verfahren zur Expression und Isolierung großer Quantitäten des Proteins INGAP.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, biologisch aktives INGAP-Protein von einer rekombinanten Wirtszelle herzustellen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Wirtszelle bereitzustellen, die große Mengen des Proteins INGAP exprimiert.
Es ist Ziel der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes Konstrukt zur Expression von biologisch aktivem INGAP-Protein bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren bereitzustellen zur Isolierung des Proteins INGAP von einer rekombinanten Wirtszelle.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden erreicht durch Bereitstellung der Technik mit einem rekombinanten Konstrukt zur Expression von biologisch aktivem INGAP-Protein, umfassend:
Eine erste Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuren 27 bis 175 codiert, funktionell verknüpft mit einer Transkriptions-Initiationsstelle und einer Translations-Initiationsstelle, wobei eine zweite Nukleotidsequenz, die für ein Signalpeptid codiert, nicht unmittelbar 5' von der ersten Nukleotidsequenz vorhanden ist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion der INGAP-Aktivität von einer rekombinanten Wirtszelle bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte:
Kultivieren einer Wirtszelle, umfassend ein rekombinantes Konstrukt, umfassend eine erste Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuren 27 bis 175 codiert, funktionell verknüpft mit einer Transkriptions-Initiationsstelle und einer Translations-Initiationsstelle, wobei eine zweite Nukleotidsequenz, die für ein Signalpeptid codiert, nicht unmittelbar 5' von der ersten Nukleotidsequenz vorhanden ist; Gewinnen des Proteins aus der kultivierten Wirtszelle.
In einer weiteren anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt. Die Wirtszelle umfasst ein rekombinantes Konstrukt umfassend eine erste Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuren 27 bis 175 codiert, funktionell verknüpft mit einer Transkriptions-Initiationsstelle und einer Translations-Initiationsstelle, wobei eine zweite Nukleotidsequenz, die für ein Signalpeptid codiert, nicht unmittelbar 5' von der ersten Nukleotidsequenz vorhanden ist. Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung, welche für Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich sein werden, stellen eine praktische Quelle bereit für das Protein INGAP in Mengen, die geeignet sind zur Verwendung in vorklinischen und klinischen Bereichen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1: SDS-PAGE-Gel der Produkte bakterieller Transfektion. Bakterienlysate ohne Transfektion (CBL), Bakterienlysate mit Transfektion (TBL), Fraktionen von Ni-NTA-Chromatographie (eluiert bei pH 6,3 (6,3); bei pH 5,9 (5,9) und bei pH 4,5(4,5)) und Standards (Std)).
2: ECL-Film eines Western-Blots unter Verwendung des INGAP-Antikörpers 945-2. Die Bahnen sind wie bei der Beschreibung von 1 ausgewiesen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Es ist eine Entdeckung dieser Erfinder, dass eine Bakterienexpression von INGAP mit hoher Rate erzielt werden kann durch Deletion der codierenden Sequenz für die Signalsequenz von INGAP. Ohne auf irgendeine besondere Theorie oder einen Wirkmechanismus festgelegt werden zu wollen, glauben die Anmelder, dass die Signalsequenz toxisch für Bakterienwirte ist. Die Signalsequenz umfasst die Aminosäuren 1 bis 26, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt. Bei den untersuchten Konstrukten ist die 5'-untranslatierte Region, umfassend die Nukleotide 1–16 auch deletiert. Diese Deletion kann ebenfalls zum Anstieg der Expression, der beobachtet worden ist, beitragen.
Ein anderer Aspekt der Konstruktionen, den die Anmelder als äußerst nützlich erachteten, ist ein induzierbarer Transkriptionsinitiator. Geeignete induzierbare Transkriptionsinitiatoren schließen solche ein, die durch Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induzierbar sind, so wie den lac-Promotor/Operator, ebenso wie andere, die in diesem Fachgebiet bekannt sind.
Gemäß eines weiteren anderen Aspektes der Konstruktionen, welche die Anmelder entwickelt haben, kann eine Histidin-Markierung am Protein technisch angebracht werden. Die Histidin-Markierung kann die Weiterverarbeitung und Reinigung vereinfachen. Eine Histidin-Markierung ist eine Abfolge von Histidin-Resten, die an ein Protein angehängt werden, üblicherweise durch Gentechnik. Vorzugsweise umfasst die Markierung zwischen 3 und 12 Histidinreste. Sie können zusammenhängend oder durch andere Reste unterbrochen sein. Die Histidin-Markierung kann an das N-terminale oder an das C-terminale Ende des Proteins angehängt sein, um die Störung der Proteinfunktion zu minimieren. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Histidin-Markierungen sind in diesem Fachgebiet bekannt. Das Oligohistidin kann verwendet werden als eine Affinitätshälfte bei Verwendung eines Metallchelates, so wie Nickel-NTA (N-(5-Amino-1-carboxypentyl)-iminodiessigsäure) als dem anderen Affinitätspartner.
Ein rekombinantes Konstrukt gemäß der Erfindung ist jedes DNS-Molekül, welches technisch so verändert worden ist, dass zwei DNS-Segmente benachbart liegen, die in der Natur nicht zueinander benachbart liegen. Vorzugsweise wird eine solche Manipulation in vitro durchgeführt, obwohl eine Manipulation auch in vivo durchgeführt werden kann. Das Konstrukt kann ein Plasmid, Phage, Virus, transponierbares Element, Minichromosom oder ein anderes Element sein, wie es für die gewünschte Anwendung geeignet ist.
Die codierende Sequenz der Aminosäurereste 27–175 des Proteins INGAP ist bei den Konstrukten eingeschlossen. Vorzugsweise ist die gesamte Signalsequenz deletiert. Jedoch ist es möglich, dass nur ein Anteil der Signalsequenz deletiert werden muss, um eine ausgezeichnete Expression zu erhalten. Somit könnte ein Anteil der Signalsequenz bei den Konstrukten zurückbehalten worden sein.
Deletion der 5'-untranslatierten Region, Nukleotide 1–16, ist ebenfalls wünschenswert. Jedoch ist nicht bekannt, ob dies notwendig ist, um ausgezeichnete Expression zu erzielen. Somit kann die 5'-untranslatierte Region in einigen Konstrukten zurückbehalten worden sein.
Eine Wirtszelle gemäß der Erfindung kann transfiziert oder transformiert sein mit einem rekombinanten Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung. Der Wirt kann eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle sein. Selektion geeigneter Promotoren und Translationsinitiatoren zur Verwendung bei der geeigneten Wirtszelle liegt gut innerhalb des Kenntnisbereichs der Fachleute auf diesem Gebiet. Wirtszellen können transformiert, transfiziert, verschmolzen oder infiziert sein mit der rekombinanten Wirtszelle der vorliegenden Erfindung. Kultivieren der Wirtszellen kann durchgeführt werden unter Verwendung von Techniken und Medien, die gut bekannt sind in diesem Fachgebiet. Wiederum kann ein geeignetes Medium und eine geeignete Technik ausgewählt werden von dem normalen Fachmann.
Die obige Offenlegung beschreibt allgemein die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann erhalten werden unter Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele, die hierbei nur zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt werden.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt die verwendete Versuchsanordnung
Wir erzeugten eine neue INGAP-cDNS durch PCR, welche die 5'-UTR-Region (Nukleotide 1-16 in SEQ ID NO:1) und das Signalpeptid (Nukleotide 17–94) ausschloss, und schafften zwei neue Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, welche die Insertion des neuen Konstrukts in einen neuen Expressionsvektor pQE-31 ermöglichten. Dieses neu verknüpfte Konstrukt wurde transformiert in kompetente TOP10F'-Zellen (E. coli-Wirtsstamm von Invitrogen). Die positiven Klone wurden identifiziert, verifiziert durch Restriktionsenzym-Verdau und die DNS isoliert. Die DNS wurde nun in einen anderen kompetenten E. coli-Stamm, M15(pREP4) transformiert und Proteinexpression wurde induziert durch IPTG (Isopropyl-beta-D-Thiogalaktopyranosid), das den Repressor inhibiert und die Expression des Proteins vom M15-Promotor/Operator erleichtert. Der Grund für die vorübergehende Transformation des ligierten Materials in TOP10F' ist, dass diese Zellen hoch kompetent sind zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit Insert-positive Kolonien zu erhalten. Die M15(pREP4)-Zellen, die zur Proteinexpression verwendet wurden, erreichten nicht solche Kompetenzniveaus, die hoch genug waren, um Transformation der Ligationsprodukte zu garantieren. Die resultierende Plasmid-DNS, erhalten von der Transformation der TOP10F', war ausreichend, um die Transformation der M15(pREP4)-Zellen zu erhöhen. Das His-markierte Protein wurde isoliert durch Affinitätsreinigung an Ni^2+–Agarose.
Wir verwendeten eine PCR-Methode, um neue INGAP-cDNS zu erzeugen, welche die 5'UTR-Region (Nukleotide 1-16 in SEQ ID NO: 1) ausschließt und das Signalpeptid.
Die Sequenz (SEQ ID NO: 1), die ausgeschlossen worden ist, lautet folgendermaßen: (der fettgedruckte Bereich stellt die Sequenz des Signalpeptids dar)
BEISPIEL 2
Diese Beispiel beschreibt die Verwendung der Polymerasekettenreaktion zur Synthese von INGMAT (Konstrukt, dem die Signalpeptid-Sequenz fehlt, d.h. das für das reife Protein codiert).
ENTWURF VON OLIGONUKLEOTIDEN
Oligonukleotide zur PCR wurden so entworfen, dass sie an ihren jeweiligen 5'-Enden Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einschließen. Das Oligonukleotid, welches für das 5'-Ende des Gens entworfen wurde, nimmt eine BamHI-Stelle auf gefolgt von 20 Nukleotiden entsprechend dem N-Terminus des reifen Proteins. Das für das 3'-Ende entworfene Oligonukleotid nimmt eine XhoI-Stelle auf gefolgt von 20 untranslatierten Nukleotiden. Das von diesen Primern erzeugte PCR-Produkt enthält die Sequenz des reifen INGAP und das Terminationscodon des nativen Proteins.
Es folgt die Sequenz der verwendeten Oligonukleotide:
5' von INGAP (SEQ ID NO: 2)
3' von INGAP (SEQ ID NO: 3)
PCR VON INGMAT
Reaktionsbedingungen
ZYKLUS-PARAMETER

A) 2 Min. bei 95°C
B) 30 Zyklen von (1 Min. 95°C, 1 Min. 55°C, 1 Min. 72°C)
C) 7 Min. bei 72°C
D) 4°C bis zur Entfernung aus dem Thermozykler.

Die PCR-Produkte wurden dann elektrophoretisch getrennt auf 5%iger PAGE in TBE. Ethidiumbromid-gefärbte PCR-Produkte, die der erwarteten Größe für das Konstrukt entsprachen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die Gelfragmente wurden elektroeluiert in 0,5 ml TBE, präzipitiert mit 50 μl 3M Natriumacetat und 1 ml Isopropanol bei –80°C für 20 Min., zentrifugiert, einmal mit 1 ml Isopropanol gewaschen, einmal mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet. Der getrocknete Zentrifugationsniederschlag wurde resuspendiert in 50 μl H₂O und quantifiziert. Am Ende dieses Arbeitsschrittes lag die Sequenz des PCR-Produktes, das beide Restriktionsstellen aber nicht die Signalsequenz und 5'-UTR enthält, wie folgt vor (SEQ ID NO: 4):
Die fettgedruckten Bereiche stellen die Primer dar.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung eines Plasmids, welches das Expressionskonstrukt enthält.
RESTRIKTIONSENZYM-VERDAU DES INGMAT-PCR-PRODUKTES UND DES pQE-31-VEKTORS
Wir führten parallel zwei Verdauungsreaktionen mit Restriktionsenzym durch unter Verwendung von 2,5 μg sowohl vom INGMAT-PCR-Produkt als auch vom pQE-31-Vektor. INGMAT wurde mit BamHI und XhoI simultan verdaut in 30 μl Volumen. pQE-31 wurde mit BamHI und SalI simultan verdaut in 30 μl Volumen. Beide Verdauungsreaktionen wurden ausgeführt bei 37°C für eine Zeitdauer von 4 Stunden. Nachdem die Reaktionen abgeschlossen waren wurden 400 ng von jedem auf einem 1,5 %-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt, um den vollständigen Verdau abzusichern. Die Rückstände (∼ 2,1 μg) von beiden Verdauungsreaktionen wurden über eine Sepharose G-50 gegeben, um kleine DNS-Fragmente zu entfernen, gefolgt von zwei Phenolextraktionen gleichen Volumens. Die extrahierte DNS wurde dann präzipitiert mit 2 Volumina Ethanol und 1/10 Volumen 3M Natriumacetat bei –80°C für 20 Minuten, zentrifugiert, zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Zentrifugationsniederschläge wurden in 25 μl H₂O resuspendiert und quantifiziert.
Das Expressionssystem pQE-31 wurde bei Qiagen Inc. Chatsworth, CA, bezogen.
LIGATION VON INGMAT IN pQE-31
INGMAT (BamHI/XhoI) und pQE-31 (BamHI/SalI) haben kompatible Enden geeignet zur Ligation. Als ein Ergebnis der Ligation wird die SalI-Restriktionsstelle im Vektor entfernt worden sein.
Ligationsbedingungen unter Verwendung eines Molverhältnisses 2:1 von Vektor zu Insert:
Die Ligationsreaktionsansätze wurden bei 4°C für 16 Stunden inkubiert.
TRANSFORMATION DER LIGATIONSREAKTIONSPRODUKTE IN KOMPETENTE E. coli-ZELLEN TOP 10F'
Wir überführten 5 μl der Ligationreaktion in 100 μl kompetenter TOP10F'-Zellen (TOP10F'-Zellen wurden bezogen von Invitrogen, San Diego, CA) mit 0,5 μl 500 mM β-Mercaptoethanol und inkubierten für 30 Minuten auf Eis, unterwarfen für 45 Sekunden bei 42°C einem Hitzeschock, und ließen für 2 Minuten auf Eis stehen. Dann fügten wir 1 ml vorgewärmtes SOC-Medium zu und inkubierten bei 37°C unter Schütteln von 225 rpm für 1 Stunde, gefolgt vom Ausplattieren des gesamten Transformationsreaktionsansatzes auf LB-Broth-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten.
SELEKTION VON TRANSFORMANTEN
Kolonietragende Platten wurden auf Nytran-Membranen übertragen. Die Kolonien wurden lysiert mit 0,5 M NaOH, neutralisiert und die resultierenden DNS an die Membran gebunden durch Backen bei 80°C für 1 Stunde. Die Membranen wurden dann hybridisiert in 50% Formaldehyd, 5 x SSPE-Puffer bei 50°C für 16 Stunden mit 3 × 10⁶ cpm/ml ³²P-„random primed"-INGAP-cDNS. Die Membranen wurden bei hoher Stringenz gewaschen und auf einem Röntgen-Film exponiert. Positive Kolonien wurden in Übereinstimmung mit dem Röntgenfilm ermittelt und in 3 ml LB mit Ampicillin kultiviert.
DNS-ISOLIERUNG VON POSITIVEN TRANSFORMANTEN
DNS wurde von den kleinen Kulturen isoliert unter Verwendung von alkalischer Lyse, Phenolextraktion, Präzipitation, Trocknung und Resuspension in 50 μl H₂O. Ein kleines Aliquot jeder der isolierten DNS wurde verdaut mit BamHI und HindIII, um die Inserts freizusetzen. Die verdauten DNS wurden elektrophoretisch aufgetrennt auf 1,5% Agarose und gefärbt mit Ethidiumbromid und positive Inserts bei einem Größenbereich von näherungsweise 510 bp identifiziert. Wir nahmen vier der Plasmide, die Inserts enthielten, und inkubierten sie in der Gegenwart von RNAse, um jede bakterielle Rest-RNS zu entfernen.
TRANSFORMATION DER LIGATIONSPRODUKTE IN KOMPETENTE E. coli-ZELLEN M15(pREP4)
Wir entnahmen 5 μl gereinigte DNS, isoliert in Sektion IIE, und transferierten sie in 100μl kompetente M15(pREP4)-Zellen. Die Mischung wurde auf Eis inkubiert für 30 Minuten, Hitzeschock ausgesetzt für 45 Sekunden bei 42°C und für 2 Minuten auf Eis gelassen. 1ml vorgewärmtes SOC-Medium wurde zugesetzt und bei 37°C unter Schütteln bei 225 rpm für 90 Minuten inkubiert. Der gesamte Transformationsreaktionsansatz wurde ausplattiert auf LB-Broth-Agarplatten, die 100μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin enthalten.
SELEKTION VON TRANSFORMANTEN ZUR INGMATHIS (INGMAT PLUS EINER MARKIERUNG MIT SECHS HISTIDIN)-PROTEIN-PRODUKTION
Acht Kolonien wurden ausgewählt und in LB mit Ampicillin kultiviert. DNS wurde aus den kleinen Kulturen isoliert unter Verwendung von Extraktionsverfahren der alkalischen Lyse, Phenolextraktion, Präzipitation, Trocknung und Resuspension in 50 μl H₂O. Ein kleines Aliquot von jeder der isolierten DNS wurde verdaut mit BamHI und HindIII, um die Inserts freizusetzen. Die verdaute DNS wurde auf 1,5%igem Agarosegel aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Einige der Transformanten, die das Plasmid mit Inserts der richtigen Größe zeigten ebenso wie die Gegenwart des pREP4-Plasmids, wurden in 50%igem Glyzerin bei –80°C gelagert, um zur Proteinproduktion verwendet zu werden.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung des His-markierten INGAP-Proteins ohne Signalpeptid durch denaturierende Metall-Affinitätschromatographie von Proteinen.
(Verfahren für eine 250ml Kultur von pINGMATHIS-transformierten M15(pREP4). pINGMATHIS ist das INGMATHIS-Konstrukt,welches in den pQE-31-Vektor ligiert worden ist.)
BAKTERIENANZUCHT UND PROTEIN-INDUKTION
Wir kultivierten eine 25ml Übernachtkultur in LB mit 100 μg/ml Ampicillin und 25μg/ml des Antibiotikums Kanamycin. Wir beimpften eine Kultur von 250 ml LB plus 100μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin mit 5 ml der Übernachtkultur (1:50).
Anzucht bis Abs600 = 0,75 bis 0,9 (tatsächliche OD=0,866). Zusatz von 5ml 100mM IPTG (Endkonzentration 2mM), um die Produktion des Proteins zu induzieren. Fortsetzen der Anzucht für 4 Stunden im Falle von INGAP. Ernten der Bakterien und Zentrifugation bei 6000 rpm für 20 Minuten, Verwerfen des Überstands. Der Zentrifugationsniederschlag wurde bis zur Verwendung bei –70°C eingefroren.
Ni²⁺- NTA-AGAROSE-PRÄPARATION
Zubereitung der benötigten Menge. (Verwendung von 10 ml der 50%igen Ni²⁺NTA für jeden Zentrifugationsniederschlag von Bakterien, der sich aus 250 ml ergibt). Gabe von 16 ml der 50%igen Aufschlämmung in ein 50 ml-Zentrifugengefäß zum einmaligen Gebrauch. Zentrifugation für 2 Minuten bei 800 x g und Verwerfen des Überstandes. Zusatz von 42 ml sterilem Wasser, Resuspension des Harzes. Zentrifugation für 2 Minuten bei 800 × g und Verwerfen des Überstandes. Zusatz von 42 ml sterilem Wasser, Resuspension des Harzes. Zentrifugation für 2 Minuten bei 800 × g und Verwerfen des Überstandes. Zusatz von 42 ml Binde/Lyse-Puffer A (6M GuanidinHCl, 0,1M Natriumphosphat, 0,01M Tris, pH 8,0) und Resuspension des Harzes. Zentrifugation für 2 Minuten bei 800 × g und Verwerfen des Überstandes. Zusatz von 42 ml Binde/Lyse-Puffer A (6M GuanidinHCl, 0,1M Natriumphosphat, 0,01M Tris, pH 8,0) und Resuspension des Harzes. Zentrifugation für 2 Minuten bei 800 × g und Verwerfen des Überstandes. Zusatz von 42 ml Binde/Lyse-Puffer A (6M GuanidinHCl, 0,1M Natriumphosphat, 0,01M Tris, pH 8,0) und Resuspension des Harzes. Zentrifugation für 2 Minuten bei 800 × g und Verwerfen des Überstandes. Auffüllen des Gesamtvolumens auf 10 ml mit Puffer A. Die Aufschlämmung ist nun fertig zur Anwendung für die lysierten Bakterien.
BAKTERIENLYSE UND PROTEINISOLIERUNG
Auftauen des Zentrifugationsniederschlages der Bakterien für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspension des Zentrifugationsniederschlages in 12,5 ml Lyse-Puffer A (6M GuanidinHCL, 0,1M Natriumphosphat, 0,01 Tris, pH 8,0). Überführen der Resuspension in ein 50 ml-Zentrifugengefäß.
Einfrieren der Resuspension/des Lysates bei –70°C bis zur Verfestigung. Auftauen bei Raumtemperatur.
Das Lysat auf einen Rotator stellen für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugation des Lysates für 15 Minuten bei 10.000 × g. Sammeln des Überstandes und Zusatz der vorbereiteten 10 ml Ni⁺²NTA. Rotation für 45 Minuten. Füllen der Aufschlämmung in eine Säule von 1,6 cm Durchmesser und Durchfluss infolge der Schwerkraft.
WASCHEN DES HARZES
Durchfluss von 50 ml Puffer A (kein Sammeln nötig). Durchfluss von 40 ml Puffer B (8M Harnstoff, 0,1M Natriumphosphat, 0,01M Tris, pH 8,0) (kein Sammeln nötig), doch bevor fortgefahren wird, sollte A₂₈₀ bei oder nahe Null sein, falls nicht, sollte mehr gewaschen werden. Durchspülen mit 40 ml Puffer C, dem gleichen wie Puffer B aber mit pH 6,3. Sammeln von 3 ml-Fraktionen. Durchspülen mit 40 ml Puffer D, dem gleichen wie Puffer B, aber mit pH 5,9. Sammeln von 3 ml-Fraktionen.
Durchspülen mit 40 ml Puffer E, dem gleichen wie Puffer B, aber mit pH 4,5. Sammeln von 3 ml-Fraktionen. An dieser Stelle sollte das Protein in einer der gesammelten Fraktionen sein. Bestimmung der optischen Dichte bei 280 von allen Fraktionen, um zu erkennen, wo das Protein ist. Nach Bedarf Vereinigen, Einengen und SDS-PAGE-Elektrophorese.
DIALYSE
Zur Reinigung des exprimierten Proteins wechselten wir die Trägerlösung der Fraktion, die vom Nickel/NTA bei pH 4,5 extrahiert wurde, auf Tris-Puffer unter Verwendung von Dialyse. Ein Dialysebehältnis mit einem Rückhaltevermögen für ein Molekulargewicht von 3.000 wurde vorbereitet durch Kochen in 5mM EDTA/200mM Natriumbicarbonat für 5 Minuten. Das Behältnis wurde kurz in deionisiertem Wasser gespült und für weitere 5 Minuten in der Bicarbonatlösung gekocht. Das Behältnis wurde in deionisiertes Wasser zurückgelegt, mit Aluminiumfolie abgedeckt und für 10 Minuten in einem Flüssigkeits-Zyklus autoklaviert. Das Behältnis wurde während des gesamten Verfahrens mit Latexhandschuhe behandelt.
Ein ml der Proteinlösung von der Nickel/NTA-Säule in 6M GuanidinHCl wurde gegen 4 Liter 25mM Tris-Puffer bei pH 8,5 für 12 Stunden dialysiert. Nach der Dialyse lagen 2 ml Proteinlösung mit einer Proteinkonzentration von 800 μg/ml vor.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel beschreibt analytische Techniken, welche die Identität des Produktes bestätigen.
SDS-PAGE
Um die Überexpression des INGAP-Proteins zu untersuchen wurde eine diskontinuierliche denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt von der dialysierten Proteinlösung unter Verwendung der Hoefer-Apparatur SE250 Mighty Small II. Das Trenngel wurde bereitet mit 15% Acrylamid, 1,35% Bisacrylamid in 375mM Tris-Puffer bei pH 8,8 mit 0,05% Natriumdodecylsulfat.
Polymerisation wurde induziert durch Zusatz von 0,05% Ammoniumpersulfat und 20μl TEMED/15 ml Lösung. Die Lösung wurde in die Gelplattenapparatur gefüllt zur Polymerisation. Das Sammelgel wurde gegossen mit der gleichen Lösung außer, dass der Tris-Puffer 125mM bei pH 6,8 war, und die Acrylamidkonzentration 4% betrug. Die Proteinproben wurden verdünnt 1:1 mit Probenpuffer (125mM Tris-Cl, pH 6,8, 4% SDS, 20% Glyzerin und 10% 2-Mercaptoethanol).
Die Puffer des oberen und des unteren Tanks waren identisch mit 25mM Tris, 192mM Glycin und 0,1% SDS bei pH 8,3. Zwei Gele wurden beladen mit 20 μl jeweils vom Bakterienlysat ohne Transfektion (CBL, 368 μg/ml), Bakterienlysat mit Transfektion (TBL, 341 μg/ml), den Fraktionen von der Ni-NTA-Chromatographie (eluiert bei pH 6,3, 110 μg/ml; pH 5,9, 100 μg/ml und pH 4,5, 800 μg/ml) sowie Standards (Rainbow-Marker, Amersham und DaltonMark-VII, Sigma). Elektrophorese wurde durchgeführt bei 20 mA Konstantstrom bis die Farbfront das Trenngel erreichte, und bei 60 mA Konstantstrom bis die Farbfront 0,5 cm vom Ende entfernt war. Die Gele wurden dann entnommen und eines wurde mit 45% Methanol/10% Essigsäue für eine Stunde fixiert, und das andere wurde in Transfer-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol, pH 8,3) für 20–30 Minuten gelegt.
SILBERFÄRBUNG
Das fixierte Gel wurde äquilibriert mit 2 Wechseln von 10% Ethanol/5% Essigsäure für jeweils 30 Minuten. Das Gel wurde dann einer 0,0032N HNO₃/K₂Cr₂O- Lösung für 5 Minuten ausgesetzt. Das Gel wurde 3 mal für jeweils 10 Minuten in deionisiertem Wasser gewaschen. Das Gel wurde imprägniert mit Silber unter Verwendung von 0,1 g AgNO₃/50 ml H₂O für 30 Minuten. Die Silberlösung wurde vom Gel gewaschen in deionisiertem Wasser für 5 Minuten. Das Gel wurde dann einer Entwicklerlösung ausgesetzt (29,7 g Na₂CO₃ wasserfrei in 1 Liter H₂O mit 0,5 ml Formalin) in 5-Minuten-Intervallen zwischen den Wechseln bis die erwünschte Dichte erreicht war. Die Entwicklung wurde mit 10% Essigsäure gestoppt und das Gel in H₂O gelagert.
Das Gel zeigte eine Proteinbande von annähernd 19 kD, die beim Bakterienlysat von transfizierten Zellen und bei der Elutionsfraktion von pH 4,5 auf Nickel/NTA hervortrat (1). Dieses Protein war nicht in irgendeiner der anderen Proben vertreten. Diese stimmt überein mit der Größe des Proteins INGAP und mit der Interaktion des insertierten Histidinmarkierungs-Bereiches mit der Matrix der Nickel/NTA-Säule.
WESTERN BLOT
Eine Immobilon-P-PVDF-Membran wurde mit 100% Methanol benetzt und für 10 Minuten mit Transfer-Puffer äquilibriert. Das Gel wurde dem Transfer-Puffer entnommen und auf die PVDF-Membran gelegt. Alle Luftblasen zwischen der Membran und dem Gel wurden entfernt. Die Kombination wurde zwischen Whatmann-Filterpapier 3mm gelegt, das mit Transfer-Puffer benetzt war, und das gesamte „Sandwich" wurde in die Kassette eines Hoefer-Transferbehälters gelegt. Die Kassette wurde in den Transferbehälter, der mit Transferpuffer gefüllt war, gelegt wobei das Gel zur Kathode gerichtet war. Der Transfer wurde bei konstanter Spannung von 12V für 18 Stunden durchgeführt.
Nach dem Transfer wurde die Membran in einen Blocking-Puffer von 0,5M Tris, 2M NaCl und 1% Polyethylenglykol mit 5% Rinderserumalbumin und 10% Ziegenserum gelegt bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Die Membran wurde dann in 20 ml Blocking-Puffer gelegt mit INGAP-Antikörper 945-2 in einer Verdünnung 1:5000 und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Die Membran wurde dann 3- mal gewaschen für 15 Minuten jeweils mit 50 ml Waschpuffer (0,4% Tween20 in phosphatgepufferter Saline (PBS) bei pH 7,4). Die Membran wurde dann inkubiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Waschpuffer mit anti-Rabbit-IgG (Gesamtmolekül, Sigmakatalog Nr. A-0545)-Peroxidasekonjugat in einer Verdünnung 1:160.000. Die Membran wurde 3-mal für 5 Minuten gewaschen mit 0,2% Tween20 in PBS, gefolgt von 3 Waschungen jeweils für 5 Minuten mit 0,1% Tween20 in PBS. Der Blot wurde ausgewertet unter Verwendung des Enzym-Chemilumineszenz-Satzes von Amersham Corp., Arlington IL gemäß den Anweisungen. Der ECL-Blot wurde auf einem Kodak Röntgenfilm X-Omat AR-5 für 20 Minuten exponiert.
ECL-Auswertung des Blots offenbarte eine starke Protein-Erkennung der überexprimierten 19-kD-Proteine in dem Gesamtlysat von transfizierten Bakterien (TBL) und in der pH 4,5-Fraktion, die auf den Gelen der SDS-PAGE sichtbar gemacht wurden (2). Zusätzlich wurde eine Proteinbande in beiden Bakterienlysaten erkannt bei 40 kD, was implizierte, dass dieses Protein schwach erkannt wird und eher ein bakterielles Protein als ein Produkt der Transfektion ist. Schließlich gab es eine schwache Bande bei 14 kD, die vom Antikörper sowohl im Lysat transfizierter Bakterien als auch in der pH-4,5-Fraktion erkannt wurde. Dies kann entweder ein anderes Protein oder ein lytisches Bruchstück vom Protein INGAP sein. Unter den Gegebenheiten der verwendeten Technik zur Produktion des Proteins INGAP ist es wahrscheinlicher ein lytisches Bruchstück von INGAP.
Zusammengefasst waren wir in der Lage, das Protein INGAP in einem prokaryotischen System zu exprimieren durch Ausschluss der 5'UTR und des Signalpeptids und durch Insertion des neuen Konstrukts in einen neuen Vektor. Das resultierende Protein hat die vorhergesagte Molekulargröße des INGAP-Monomers und reagiert mit dem Antikörper gegen INGAP in einer Western-Analyse. Das Protein teilt mit dem Peptid INGAP die Fähigkeit, die Proliferation von Gangzellen zu induzieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein rekombinantes Konstrukt zur Expression des Proteins INGAP, welches die Proliferation von Gangzellen induziert, umfassend: eine erste Nukleotidsequenz, welche für die Aminosäuren 27 bis 175 des Proteins INGAP codiert, ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt werden, funktionell verknüpft mit einer Transkriptions-Initiationsstelle und einer Translations-Initiationsstelle, wobei eine zweite Nukleotidsequenz, die für ein Signalpeptid codiert, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, nicht unmittelbar 5' von der ersten Nukleotidsequenz vorhanden ist.
Das Konstrukt nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine dritte Nukleotidsequenz, die für eine Histidin-Markierung („Histidin-Tag") codiert.
Das Konstrukt nach Anspruch 2, wobei die dritte Nukleotidsequenz unmittelbar 5' oder 3' zur ersten Nukleotidsequenz vorliegt.
Das Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Transkriptions-Initiationsstelle induzierbar ist.
Das Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Transkriptions-Initiationsstelle der lac-Promotor/Operator ist.
Ein Verfahren zur Produktion von biologisch aktivem Protein INGAP, befähigt zur Induzierung der Proliferation von Gangzellen, in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend die Schritte: Kultivieren einer Wirtszelle umfassend ein rekombinantes Konstrukt nach Anspruch 1; Gewinnen des Proteins von der kultivierten Wirtszelle.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Konstrukt weiterhin eine dritte Nukleotidsequenz umfasst, welche für eine Histidin-Markierung codiert, und das Protein INGAP gereinigt wird unter Verwendung einer Nickel-Affinitäts-Matrix.
Eine Wirtszelle umfassend ein rekombinantes Konstrukt nach Anspruch 1.