JP2012211203A - 毒素原性大腸菌に対する免疫原性組成物に基づく付着因子−腸毒素キメラ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】免疫応答を惹起するための付着因子/毒素融合組成物を利用する。
【選択図】図1
Description
本発明のこれらおよび他の目的は、免疫を誘導するためのワクチン成分として大腸菌付着因子ポリペプチドを利用することによって達成される。
本発明は、構造的に安定な、従って免疫活性の付着因子ポリペプチドの投与により抗付着性免疫応答を誘導するための方法および生物学的組成物に関する。本発明の組成物において考えられる付着因子としては、クラス5線毛からのもの、およびCS3からのもの(すなわち、CstH)が挙げられるが、これらに限定されない。付着因子(毒素原性大腸菌線毛および微細線維の遠位分子成分)は、宿主細胞への細菌付着のための有望なエフェクターである(文献65)。従って、付着因子は、細菌の定着および病原性にとって重要である。
[文献67]Peltola,H., A.Siitonen,H.Kyronseppa,I.Simula,L.Mattila,P.Oksanen,MJ.Kataja,and M.Cadoz.1991.Prevention of traveller’S diarrhoea by oral B−subunit/whole−cel I cholera vaccine.Lancet 338:1285−1289.
本発明をさらに十分に例証するために、CfaE、CFA/Iの小サブユニット、を含有する抗ETEC組成物の例を説明する。図1(A)を参照して、CfaEのコーディング配列の3’末端にヘアピンリンカーを遺伝子的に連結させることにより、構造的に安定なCfaEを構築した。リンカーのアミノ酸配列は、配列番号1、2および3によって記載する。その後、CfaBからのアミノ酸ドナー鎖(配列番号4に記載する)をそのリンカーの3’末端で連結させ、最後に、ヘキサヒスチジンタグをそのCfaBドナー鎖の3’末端で連結させた。その後、その構築物をpET24プラスミドに挿入し、大腸菌において発現させた。得られたポリペプチド(dscCfaEと呼ぶ)をニッケルまたはコバルト親和性およびカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。その組換えポリペプチドは、可溶性であり、安定していた。ゲル濾過に基づき、そのdscCfaEポリペプチドは単量体として存在し、CDスペクトル分析により、主としてβ鎖分子の存在と一致する結果を得た。
[文献70]Li,X.,J.L.Erbe,CV.Lockatell,D.E.Johnson,M.G.Jobling,R.K.Holmes,and H.L.Mobley.2004.Use of translational fusion of the MrpH fimrial adhesin−binding domain with the cholera toxin A2 domain,coexpressed with the cholera toxin B subunit,as an intranasal vaccine to prevent experimental urinary tract infection by Proteus mirabilis.Infect.Immun.72:7306−7310.
構築物を機能的に試験した。図1Aまたは図1Bにおける構築物を3μmラテックスビーズに吸着させ、ヒトまたはウシ赤血球に添加し、結果としてMRHAを誘導した。この観察は、CfaEがETECにおける付着因子である明瞭な証拠をもたらす。
易熱性腸毒素の活性の防止も防御に寄与しうるが、付着因子が下痢原性大腸菌に対する免疫の誘導に最も重要な成分である可能性は高い。線毛付着因子は本質的には不安定であり、隣接するサブユニットへのそれらの非共有結合的連結が無ければ分解されるため、本発明は、構造安定性を付与することにより付着因子の免疫原性の素質を有意に改善する。加えて、構造安定性付着因子の免疫原的有効度は、効力ある免疫原性とアジュバント活性の両方を有する腸毒素成分をキメラとして付着因子構築物に備えさせることにより、有意に改善される可能性が高い。
本発明の構築物は、下痢原性大腸菌に対する免疫応答および/または抗毒素免疫を誘導するためのワクチン成分として有用であると予想される。免疫の誘導方法は、次の段階を含む:
妥当な量の付着因子/毒素キメラを生産するために、生産および精製計画の開発を開示する。好ましい生産および精製手順の一例を提示するが、安定な免疫原性付着因子/毒素キメラ生成物を最終的に生じさせることができる他の方法を利用してもよい。
毒素Aサブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
[付記2]
前記付着因子ポリペプチドが、前記付着因子のC末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Aサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのC末端で前記毒素Aサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのC末端で動作可能に連結されている、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記3]
前記融合タンパク質が、毒素Bサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記4]
前記毒素Aサブユニットが、コレラ毒素A、コレラ毒素A2サブユニット、大腸菌易熱性毒素A、大腸菌易熱性毒素A2から構成される群より選択される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記5]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、クラス5線毛またはCS3線毛に由来する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記6]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、定着因子抗原I、CS4、CS14、CS1、PCF071、CS19、CS2およびCS3から構成される群より選択される大腸菌線毛に由来する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記7]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記8]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、CfaE、CsfD、CsuD、CooD、CosD、CsdD、CsbD、CotDおよびCstHから構成される群より選択される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記9]
前記リンカーが、配列番号1、配列番号2および配列番号3から構成される群より選択されるアミノ酸配列から構成される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記10]
前記ドナー鎖が、配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記11]
前記ドナー鎖が、CfaB、CsfA、CsuA1、CsuA2、CooA、CosA、CsbA、CsdA、CotAおよびCstHから構成される群より選択される大腸菌線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの8から20アミノ酸配列である、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記12]
前記融合タンパク質が、前記リンカーのC末端および前記毒素のN末端先端に動作可能に連結されたヒスチニンタグを含有する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記13]
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号6;配列番号7;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号15;配列番号16および配列番号30から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記14]
前記毒素Aサブユニットが、配列番号18、配列番号19、配列番号31、配列番号32、配列番号34および配列番号35から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記15]
前記融合タンパク質または前記毒素Bサブユニットが、それらのN末端先端でシグナル配列に動作可能に接続されている、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記16]
前記毒素Bサブユニットが、コレラ毒素Bまたは大腸菌易熱性毒素Bである、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記17]
前記融合タンパク質および前記毒素Bサブユニットが、単一の発現ベクターから発現される、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記18]
前記毒素Bサブユニットが、配列番号20;配列番号21および配列番号33から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記19]
前記毒素AサブユニットのN末端が、配列番号25および配列番号26で示される配列を含有する、付記14に記載の免疫原性組成物。
[付記20]
前記シグナル配列が、配列番号24のLTIIb毒素シグナル配列である、付記15に記載の免疫原性組成物。
[付記21]
a.付記1に記載の組成物の1つ以上の構築物を含む免疫原の初回抗原刺激用量を投与する段階と、
b.免疫応答を惹起する、緩衝水溶液中の前記免疫原の50μgから1mgの単位用量範囲での初回抗原刺激用量の少なくとも1週間後に、第一用量での追加抗原刺激用量を投与する段階と、
を含む、免疫応答を誘導する方法。
[付記22]
前記融合タンパク質が、毒素Bサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記21に記載の方法。
[付記23]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、CfaE、CsfD、CsuD、CooD、CosD、CsdD、CsbD、CotDおよびCstHから構成される群より選択される、付記21に記載の方法。
[付記24]
前記付着因子のポリペプチドが、前記付着因子のC末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Aサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのC末端で前記毒素Aサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのC末端で動作可能に連結されている、付記21に記載の方法。
[付記25]
前記大腸菌付着因子のポリペプチドが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記21に記載の方法。
[付記26]
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号6;配列番号7;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号15;配列番号16および配列番号30から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記21に記載の方法。
[付記27]
前記毒素Aサブユニットが、コレラ毒素A、コレラ毒素A2および大腸菌易熱性毒素A、大腸菌易熱性毒素A2から構成される群より選択される、付記21に記載の方法。
[付記28]
前記毒素Aサブユニットが、配列番号18、配列番号19、配列番号31、配列番号32、配列番号34および配列番号35から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記21に記載の方法。
[付記29]
前記毒素AサブユニットのN末端が、配列番号25および配列番号26で示される配列を含有する、付記28に記載の方法。
[付記30]
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記21に記載の方法。
[付記31]
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記21に記載の方法。
[付記32]
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記21に記載の方法。
[付記33]
前記免疫原が、DNA発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記21に記載の方法。
[付記34]
前記毒素Bサブユニットが、配列番号20;配列番号21および配列番号33から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記22に記載の方法。
[付記35]
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記22に記載の方法。
[付記36]
前記免疫原が、DNA発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記22に記載の方法。
[付記37]
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記22に記載の方法。
[付記38]
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記22に記載の方法。
[付記39]
前記ドナー鎖が、CfaB、CsfA、CsuA1、CsuA2、CooA、CosA、CsbA、CsdA、CotAおよびCstHから構成される群より選択される大腸菌主構造線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの8から20アミノ酸配列である、付記24に記載の方法。
[付記40]
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記32に記載の方法。
[付記41]
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記32に記載の方法。
[付記42]
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバー、およびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記33に記載の方法。
[付記43]
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記35に記載の方法。
[付記44]
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバーおよびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記36に記載の方法。
[付記45]
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記35に記載の方法。
Claims (1)
- 毒素Aサブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
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