JP2018515517A - 尿路病原性大腸菌感染病の処置と予防のための組成物および方法 - Google Patents
尿路病原性大腸菌感染病の処置と予防のための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
例えば、尿路病原性大腸菌(E.coli)、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエ(肺炎桿菌)の腸内細菌の線毛アドヘシンFimHの結合ポケットからマンノースを移動させる方法と抗体組成物を用いて、細菌の単層がマンノース被覆表面に付着することを妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムが形成されるのを妨害もしくは防止することができる。このように、本発明の抗体組成物を諸方法で用いて、数ある用途の中でも、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止する、もしくは元に戻すことが可能であり、例えば尿路病原性大腸菌などの細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するもしくは防止することが可能であり、それを必要とする対象において細菌感染症を処置することが可能であり、炎症性腸疾患(IBD)を処置するもしくは防止することが可能である。【選択図】図12
Description
本出願は、2015年5月13日出願の米国特許仮出願第62/160,852号および2015年8月24日出願の米国特許仮出願第62/208,913号の利益を主張し、それぞれの全内容は参照により本出願に組み込まれる。
政府支援の承認
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第R21AI103846の下、米国政府支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第R21AI103846の下、米国政府支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
EFS−Webを介して提出されたシーケンスリストへの参照
ファイルサイズ15kbの「UW59WOU2_SL」と名付けられたシーケンスリストのASCIIテキストファイルの内容は、2016年5月12日に作成され、本出願とともにEFS−Webを介して電子提出された。シーケンスリストは、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
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本発明は、尿路病原性大腸菌(E.coli)、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエ(肺炎桿菌)を含む腸内細菌の線毛アドヘシンFimHの結合ポケットからマンノースを移動させる方法と抗体組成物とに関する。本方法および抗体組成物を用いて、細菌の単層がマンノース被覆表面に付着することを妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムが形成されるのを妨害もしくは防止することができる。このように、本発明の抗体組成物を諸方法で用いて、数ある用途の中でも、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止する、もしくは元に戻すことが可能であり、例えば尿路病原性大腸菌などの細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するもしくは防止することが可能であり、それを必要とする対象において細菌感染症を処置することが可能であり、炎症性腸疾患(IBD)を処置するもしくは防止することが可能である。
受容体−リガンドの相互作用は、細胞シグナリング、細胞接着および病原体付着に関与する最も基本的な生物学的現象の1つである。これらの相互作用の抗体系阻害物質または低分子系阻害物質は、種々の予防的意味あいおよび治療的意味あい、例えば予防ワクチンの開発にとって非常に重要である。現在まで2種類の一般的な型の阻害機構が記載されている。オルソステリック阻害物質は、リガンドと結合ポケットを直接競合し、したがってそれらの受容体−阻害活性は競合性がある(Swinney、2004)。対照的に、アロステリック阻害物質は、リガンド結合ポケットから離れた部位との相互作用を介してそれらの効果を発揮し、非競合的に阻害を達成する(Christopoulos、2002)。非競合阻害は内因性リガンドに対して感受性が低く、したがって一般に薬理学的により効果的である(Swinney、2006)。
FimHは、大腸菌や腸内細菌の1型線毛と呼ばれる毛状構造の表面の先端に組み込まれる、30kDaのレクチン様タンパク質である(Jonesら、1995)。FimHは、末端が露出しているマンノースを保有する糖タンパク質に特異性を示し、大腸菌の尿路病原性菌株の毒性にとって重要である(Chenら、2009;Connellら、1996;Kisieiusら、1989;Krogfeltら、1990;Martinezら、2000)。FimHには、線毛ロッドにアドヘジンを固定するC末端ピリンドメインと、マンノース結合に関与するN末端レクチンドメインの2つのドメインがある(Choudhuryr、1999)。レクチンドメイン内の結合ポケットは、それぞれマンノースに対して低親和性(KD=298μM)と高親和性(KD=1.2μM)のオープン構造からタイト構造の間をシフトする(Aprikianら、2007;Le Trongら、2010;Tchesnokovaら、2008)。レクチンドメインの低親和性(不活性の)状態は、結合ドメインのβ−シート内でフィンガートラップ様ねじれを維持するピリンドメインとのレクチンドメインの相互作用によってアロステリックに安定する(Le Trongら、2010)。高親和性(活性の)状態は、リガンド結合および/またはレクチンドメインの分離によって誘導され、分離は、流動条件下で細菌接着中の力によって促進される。FimH様力活性化接着は、異なる細菌種ならびに真核細胞のいくつかの他の接着システムに記載されている。例えば、インテグリン(Chenら、2012)またはP/Lセレクチン(Phanら、2006)の様なタンパク質は、剪断力下で不活性構造と活性構造との間をシフトする。
FimHのマンノース−結合ポケットには2つのオルタナティブ構造が存在し、受容体−リガンド相互作用の生物学において広範な現象、例えば基質および生成物への酵素結合に反映される。実際に、100年の歴史がある「鍵と鍵穴」モデルの相互作用機構は、現在、受容体タンパク質と酵素の大多数ではないにしても多数にとって柔軟性がなさすぎると考えられている。リガンド結合ポケットは一般的に可動性ループ上に残基で構成され、リガンドに対してそれぞれ比較的高親和性と低親和性(測定不能なことが多い)で、活性構造から不活性構造に動的にシフトすることがわかっている(Avlaniら、2007;Kimら、2013;Maら、2014;Melcherら、2009;Soonyaarachchiら、2010)。一般に、リガンド結合活性ポケットは、リガンドを含まない不活性ポケットよりも収縮した形状が想定され、したがって対応する受容体コンフォーマーは一般的にオープン状態対閉鎖(またはタイト)状態と呼ばれる(Carlsonら、1997;Lebonら、2011;Melcherら、2009;WagnerおよびCzajkowski、2001)。そのようなポケットダイナミクスによる受容体が十分に研究された例の一部としては、マルトース結合タンパク質などのアロステリックタンパク質(Duanら、2001;Quiochoら、1997;Spurlinoら、1991)およびGタンパク質共役受容体(GPCR)が挙げられる(Lebonら、2011;Rasmussenら、2011;WagnerおよびCzajkowski、2001)。
2つの一般的モデルは、受容体結合ポケットの構造上でリガンドの影響を述べるために提案されている。「誘導適合」モデルにおいて、リガンドが不活性状態に結合した後だけに該ポケットの活性状態が想定されるが、「構造選択」モデルにおいて、リガンドがない場合、不活性状態と活性状態が共存するが、活性状態はリガンド結合によって安定する(Csermelyら、2010;Gianniら、2014;Hatzakis、2014)。これらの2つのモデルを統合するより複雑なモデルのリガンド−受容体認識も考えられる(Silvaら、2011)。すべてのモデルは、リガンドと結合ポケットの不活性状態との初期の弱い相互作用を可能にし、この弱い相互作用は、強い結合活性状態においてリガンドと相互作用する受容体残基のサブセットだけを必要とすることが繰り返し示されている(Carlsonら、1997;Lebonら、2011;Melcherら、2009;Silvaら、2011)。
リガンドと結合ポケットとの部分的な相互作用は、残りの残基を放置し、該残基は、ポケットが活性状態にあるとき、リガンドと相互作用するだけであり、理論上、追加の化合物に自由に結合できる。そのような化合物は、活性状態へのポケットの切り換えを妨害することによって阻害物質として潜在的に作用する可能性がある。そのような阻害物質は、リガンドと同時に結合することができないオルソステリック阻害物質または結合ポケットから離れて結合しなければならないアロステリック阻害物質のいずれの容認されている定義にも適合しない。その代わりに、そのような阻害物質がリガンドの隣に結合するので、該阻害物質はパラステリック阻害物質として分類されることが可能である。
バイオフィルム形成を妨害するため、病原性感染症を処置するため、ならびに汚染された生物医学装置による感染を予防するために、FimH活性を阻害する有効手段の必要性が依然として存在する。
本発明は、FimH活性を驚くべき程度の効力で阻害する方法および組成物を提供することによってこれらの必要性およびその他を満たす。知られている2つの阻害物質のカテゴリーのいずれにも分類されない、大腸菌のマンノース結合アドヘシンFimHに対する阻害性モノクローナル抗体の一種を本明細書に記載する。アロステリック阻害物質のように、この抗体は非競合阻害を発揮するが、オルソステリック阻害物質のようにリガンド結合ポケット内に結合する。しかし、後者の阻害物質とは異なり、ポケットがリガンドマンノースによって占有されているときでも、この抗体は結合ポケットをオープンの不活性構造に転換させる。
一実施形態において、本発明は、尿路原性大腸菌(E.coli)の線毛アドヘシンFimHを特異的に認識し、結合する抗体を含み、尿路病原性大腸菌によって表面のコロニー形成を防止することができる組成物を提供する。一実施形態において、この抗体は軽鎖可変領域を含み、任意選択で重鎖可変領域、またはこれをコードするポリヌクレオチド(複数可)を含む。一般的な一実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号1、配列番号3およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は、3つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2、CDR3のうちの1つ、2つまたは3つを含む。CDR1配列は、QNVSN(配列番号1の残基27〜31)またはQNIVHNNGNTY(配列番号3の残基27〜37)を含む。CDR2配列は、SAS(配列番号1の残基49〜51)またはKVS(配列番号3の残基55〜57)を含む。CDR3配列は、QQNSSFPFT(配列番号1の残基88〜96)またはFQGSHVPFT(配列番号3の残基94〜102)を含む。一般的な一実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号2、配列番号4およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。重鎖可変領域は、3つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2、CDR3のうちの1つ、2つまたは3つを含む。CDR1配列は、GYAFSSYW(配列番号2の残基26〜33)またはGYTSTNYW(配列番号4の残基26〜33)を含む。CDR2配列は、IYPRDGDT(配列番号2の残基51〜58)またはINPTSGYT(配列番号4の残基51〜58)を含む。CDR3配列は、EVGRGFYGMDY(配列番号2の残基97〜107)またはARGVIRDF(配列番号4の残基97〜107)を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域は、CDR1(QNIVHNNGNTY、配列番号3の残基27〜37)、CDR2(KVS、配列番号3の残基55〜57)およびCDR3(FQGSHVPFT、配列番号3の残基94〜102)を含み、重鎖可変領域は、CDR1(GYTSTNYW、配列番号4の残基26〜33)、CDR2(INPTSGYT、配列番号4の残基51〜58)およびCDR3(ARGVIRDF、配列番号4の残基97〜107)を含む。
一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1または3と少なくとも95%の同一性を有する。軽鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号1、3、5および7からなる群が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3である。
一部の実施形態において、重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、配列番号2または4と少なくとも95%の同一性を有する。重鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号2、4、6、8からなる群が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号4である。
一実施形態において、抗体は尿路病原性大腸菌FimHのマンノース結合ポケット内で結合する。一般的な一実施形態において、抗体は、配列番号14に示すFimHアミノ酸配列のアミノ酸残基133〜142内で結合する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号14のI52、N135、N136、Y137、N138、D140および配列番号14のF1、N46、I52、D54、Q133、N135およびN136から選択される高次構造エピトープに結合する。一実施形態において、抗体は約15nM未満のIC50で、細菌接着を阻害する。別の実施形態において、抗体は1nM未満のIC50で、細菌接着を阻害する。特定の一実施形態において、抗体は約14nMのIC50で、細菌接着を阻害する。別の特定の実施形態において、抗体は約0.4nMのIC50で、細菌接着を阻害する。
特定の一実施形態において、抗体はFimHのマンノース結合ポケット内で結合し、それによってFimHへの結合をマンノースと競合する。別の特定の実施形態において、抗体はFimHのマンノース結合ポケット内で結合し、それによって非競合的にポケットに結合したマンノースを、例えばポケットの側面に結合することによって放出する。これらの様式において、抗体は、マンノース被覆表面への細菌の付着と、マンノース被覆表面にすでに付着している細菌の解離の両方を防止することができる。抗体を用いて、マンノース被覆表面への細菌の単層の付着を妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムの形成を妨害もしくは防止することができる。本発明は、尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカもしくはクレブシエラ・ニューモニエおよび他の1型線毛発現細菌などの腸内細菌の線毛アドヘシンFimHの結合ポケットからマンノースを移動させる方法を提供する。一般的な一実施形態において、この方法は、結合ポケットを本発明の組成物と接触させることを含む。
一部の実施形態において、抗体は異種配列をさらに含む。異種配列の例としては、ポリペプチド、抗体、エピトープのすべてもしくは一部をコードする配列、または自然条件下で、記載された配列に隣接して発見されない他の部分のすべてもしくは一部をコードする配列が挙げられるがこれらに限定されない。そのような異種部分は、記載された配列または分子の溶解度、送達、免疫原性、有効性、検出または同定を改善するために役立つことがある。一部の実施形態において、異種配列は不活性配列または無関係な配列である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体誘導体、ベニヤ抗体、二重特異性抗体、抗体誘導体、組換えヒト抗体、キメラ抗体または抗体フラグメントの1つまたは複数であり得る。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。このように、一部の実施形態において、本発明の抗体組成物は、記載された抗体をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態において、1つの核酸分子が抗体全体またはその機能的フラグメントをコードするが、他の実施形態において、抗体の複数の部分、領域および/またはフラグメントをコードする別々の核酸分子が提供される。
一部の実施形態において、本発明の組成物は、キャリアをさらに含む。キャリアは、薬学的に許容されるキャリアまたは抗体組成物の使用を容易にする他のキャリアであり得る。本発明はさらに、バイアル、チューブなどの1つまたは複数の容器を収容するように区画化されているパッケージまたは容器を含み、各容器(複数可)は上記方法で使用される別々のエレメント(例えば抗体、キャリア)の1つを含むキットを提供する。
一実施形態において、本発明は、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止するまたは元に戻す方法を提供する。腸内細菌の例としては、大腸菌(E.coli)、K.ニューモニエ(肺炎桿菌)、K.オキシトカ(クレブシエラ・オキシトカ)、シゲラ(赤痢菌)、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラが挙げられるがこれらに限定されるものではない。表面は、生体表面または非生体表面であり得る。腸内細菌によるコロニー形成が可能な生体表面の例としては、粘膜上皮表面が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腸内細菌によるコロニー形成が可能な非生体表面の例としては、カテーテルおよび挿管器具が挙げられるが、これらに限定されるものではない。方法は、一般的に、表面を本発明の抗体を含む組成物と接触させることを含む。
一実施形態において、本発明は、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌による細胞の感染を阻害するまたは防止する方法を提供する。本方法は、腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌、K.ニューモニエ、K.オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラに感染した組織に投与することを含む。本方法は、細胞を本発明の組成物の有効量と接触させ、それによって細胞の感染を阻害するまたは防止することを含む。
一実施形態において、本発明は、必要とする対象において細菌感染症を処置する方法であって、該対象は大腸菌、K.ニューモニエ、K.オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラなどの腸内細菌に感染している、方法を提供する。一部の実施形態において、腸内細菌は、尿路疾患性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエである。本方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与し、それによって対象の細菌感染症を処置することを含む。一部の実施形態において、細菌感染は大腸炎または敗血症である。本方法によって処置される感染症のさらなる代表的な例としては、挿管患者における換気肺炎を含む肺炎、尿道カテーテルと血液ラインカテーテルを含むカテーテル関連感染症、新生児髄膜炎、膣内コロニー形成と尿道周囲コロニー形成に起因するものを含む尿路感染症、および創傷感染症が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
一実施形態において、本発明は、対象における炎症性腸疾患(IBD)を処置するまたは防止する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与し、それによって対象におけるIBDを処置または予防することを含む。一実施形態において、投与することは、皮下投与、局所投与、経皮投与、静脈内投与、経口投与または結腸内投与による。
本発明は、大腸菌のマンノース結合アドヘシンで、知られている阻害物質の2つのカテゴリーにいずれにも入らないFimHに対する1種類の阻害モノクローナル抗体の驚くべき予想外の発見に基づいている。アロステリック阻害物質のように、この抗体は非競合阻害を発揮するが、オルソステリック阻害物質のようにリガンド結合ポケット内で結合する。しかし、後者とは異なり、ポケットがリガンドマンノースによって占有されているときでも、この抗体は結合ポケットをオープンで不活性の構造に転換させる。
本明細書に記載するように、異なる抗FimH抗体の阻害機構を比較し、阻害のパラステリックモデルと整合する異なる方法で接着機能を阻止する抗体を説明する。オルソステリック抗体と比較して、パラステリック抗体は細菌接着、表面結合バイオフィルム、in vivoでのコロニー形成に対してより強力な阻害物質であり、パラステリック阻害物質のデザインは、抗接着予防戦略および治療戦略の開発に向けて極めて強力なアプローチを潜在的に意味することを示している。
本発明の抗体は、0.4nMもの低さのIC50で細菌接着を阻害する。本明細書では、腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエの線毛アドヘシンFimHの結合ポケットからマンノースを移動させる方法と抗体組成物を説明する。本発明の抗体はFimHのマンノース結合ポケット内で結合し、FimHへの結合をマンノースと競合することができ、またはポケットに結合したマンノースを非競合的に、例えばポケットの横側に結合することによって放出することができる。このように、抗体は、マンノース被覆表面への細菌の付着を防止することができ、マンノース被覆表面にすでに付着している細菌を解離することもできる。この抗体を用いて、マンノース被覆表面への細菌の単層の付着を妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムの形成を妨害もしくは防止することができる。このように本発明の抗体組成物を方法で用いて、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止する、もしくは元に戻すことが可能であり、例えば尿路病原性大腸菌などの細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するもしくは防止することが可能であり、それを必要とする対象において細菌感染症を処置することが可能であり、炎症性腸疾患(IBD)を処置するもしくは防止することが可能である。
定義
本明細書で用いる場合、「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)および所望の抗原結合活性を示す限り抗体フラグメントを指す。「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、二重特異性抗体、線形抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)および抗体フラグメントから形成されている多特異的抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
本明細書で用いる場合、「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)および所望の抗原結合活性を示す限り抗体フラグメントを指す。「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、二重特異性抗体、線形抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)および抗体フラグメントから形成されている多特異的抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
本明細書で用いる場合、「特異的に結合する」とは、抗体と特異的なタンパク質または標的との結合であって、タンパク質の異種集団の間に存在する結合を指す。したがって、特定の免疫アッセイ条件下で存在するとき、抗体は、FimHなどの特定のタンパク質標的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に相当量で結合しない。
本明細書で用いる場合、アミノ酸配列に関して、「同一の」とは、整列させた配列中の任意の特定のアミノ酸残基の位置で、そのアミノ酸残基が整列させた配列間で同一であることを意味する。本明細書で用いる場合「類似性」または「配列類似性」という用語は、整列させた配列中の任意の特定の位置で、そのアミノ酸残基が配列間で類似した種類であることを示す。例えば、ロイシンはイソロイシン残基またはバリン残基に対して置換することができる。この種の置換は、保存的置換と呼ぶことができる。好ましくは、任意のアミノ酸残基の保存的置換が所定のアミノ酸残基に含まれ、無修飾抗体と比較すると、これらの変化が前述の抗体の結合特異性または機能活性に影響を及ぼさない。
本明細書で用いる場合、「対応する位置」とは、2つの配列間の最大配列同一性を可能にするために2つの配列を整列させると、第1の配列において、その位置と同じ位置で特定されたアミノ酸残基に対応する位置で第2の配列中に存在するアミノ酸残基を指す。
本明細書で用いる場合、「本質的にからなる」または「本質的にからなっている」とは、ポリペプチドは、追加の特徴または記載のもの以上のエレメント有し得ることを意味するが、ただし追加の特徴またはエレメントが記載された結合特異性を有する抗体もしくは抗体フラグメントの能力に物質的に影響しないことを条件とする。ポリペプチドを含む抗体もしくは抗体フラグメントは、その標的に結合し、その機能活性を示す抗体もしくは抗体フラグメントの能力に干渉しない追加の特徴またはエレメント、例えばマンノース被覆表面への細菌接着を妨害するまたは防止することを有し得る。抗体の免疫原性を低下させるために、そのような修飾をアミノ酸配列に導入することができる。例えば、特定された配列から本質的になるポリペプチドは、配列のどちらかの端または両端で1、2、3、4、5またはそれ以上の追加アミノ酸、欠失アミノ酸、または置換アミノ酸を含み得るが、ただしこれらのアミノ酸が、抗体もしくは抗体フラグメントのその標的に結合し、その生物活性を示すことにおける役割に干渉する、阻害する、阻止するまたは妨げることがないことを条件とする。
本明細書で用いる場合、「異種」配列または「異種」分子とは、記載された配列または分子に関連して自然起源でない部分を指す。異種分子の代表的な例としては、ポリペプチド、抗体、エピトープ、ポリヌクレオチド、小分子または薬物が挙げられるがこれらに限定されるものではない。そのような異種部分は、記載された配列または分子の溶解度、送達、免疫原性、有効性、検出または同定を改善するために役立つことがある。一部の実施形態において、異種配列は不活性配列または無関係な配列である。本発明の抗体に関与する部分は、1つまたは複数の官能基で化学的に修飾されることができるが、ただし、そのような官能基がFimHに結合する抗体もしくは抗体フラグメントの能力に干渉することなく、マンノース被覆表面への細菌接着を妨害するまたは防止することを条件とする。
本明細書で用いる場合、「腸内細菌」(または腸内細菌科)とは、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現するグラム陰性菌を指す。腸内細菌の例としては、大腸菌、K.ニューモニエ、K.オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
本明細書で用いる場合、「炎症性腸疾患」(またはIBD)とは、結腸および小腸の炎症状態を指し、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容されるキャリア」とは、活性成分と組み合わせると、成分が生物活性を保持することができ、対象の免疫系と反応しない任意の物質が含まれる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水などの標準医薬的キャリア、油/水エマルジョンなどの乳剤、および種々の湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。噴霧剤または非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸塩緩衝生理的食塩水または生理食塩水(0.9%)である。
そのようなキャリアを含む組成物は、周知の従来法(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18版(Remington and Gennaro 1990))によって調製される。
本明細書で用いる場合、状態を「防止する」または「処置する」こととは、状態を示す症状を減少させるもしくは阻害する、または発症を遅延させる、または状態の重症度を低下させることを意味する。
本明細書で用いる場合、「アジュバント」とは、免疫応答を促進するために当技術分野で通常使用されているアジュバント類が含まれる。一部の実施形態において、例えばポリヌクレオチドワクチンの使用で、ヘルパーペプチドまたはサイトカインなどのアジュバントはポリヌクレオチドをコードするアジュバントを介して提供されることが可能である。
本明細書で用いる場合「a」または「an」は、明らかに別途示されない限り、少なくとも1つを意味する。
本明細書で用いる場合、用語「含む」もしくは「含まれる」または「含む」もしくは「含んでいる」などの変化は、記載される項目の包含もしくは項目の群を意味するが、いずれの他の項目もしくは項目の群を除外しない。
本発明の方法と用途
一実施形態において、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止するまたは元に戻す方法を提供する。腸内細菌の例としては、大腸菌、K.ニューモニエ、K.オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラが挙げられるがこれらに限定されるものではない。表面は、生体表面または非生体表面であり得る。腸内細菌によるコロニー形成が可能な生体表面の例としては、粘膜上皮表面が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腸内細菌によるコロニー形成が可能な非生体表面の例としては、カテーテルおよび挿管器具が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本方法は、一般的に、本発明の抗体を含む組成物と該表面を接触させることを含む。
一実施形態において、細菌1型線毛アドヘシンFimHを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止するまたは元に戻す方法を提供する。腸内細菌の例としては、大腸菌、K.ニューモニエ、K.オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラが挙げられるがこれらに限定されるものではない。表面は、生体表面または非生体表面であり得る。腸内細菌によるコロニー形成が可能な生体表面の例としては、粘膜上皮表面が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腸内細菌によるコロニー形成が可能な非生体表面の例としては、カテーテルおよび挿管器具が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本方法は、一般的に、本発明の抗体を含む組成物と該表面を接触させることを含む。
一実施形態において、本発明は、細菌1型線毛アドヘシンFimH、例えば尿路病原性大腸菌を発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するまたは防止する方法を提供する。本方法は、腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌または大腸菌の他の種、K.ニューモニエ、K.オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラに感染した組織に投与することを含む。本方法は発明の組成物を有効量で細胞に接触させ、それによって細胞の感染を阻害するか、防止することを含む。
一実施形態において、本発明は、必要とする対象において細菌感染症を処置する方法であって、該対象は大腸菌、K.ニューモニエ、K.オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラなどの腸内細菌に感染している、方法を提供する。一部の実施形態において、腸内細菌は尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエである。本明細書に記載のように、本方法は対象に組成物の有効量を投与し、それによって対象において細菌感染症を処置することを含む。一部の実施形態において、細菌感染症は大腸炎または敗血症である。本方法によって処置される感染症のさらなる代表的な例としては、挿管患者における換気肺炎を含む肺炎、尿道カテーテルと血液ラインカテーテルを含むカテーテル関連感染症、新生児髄膜炎、膣内コロニー形成と尿道周囲コロニー形成に起因するものを含む尿路感染症、および創傷感染症が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
一実施形態において、本発明は、対象において炎症性腸疾患(IBD)を処置するまたは防止する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与し、それによって対象においてIBDを処置または予防することを含む。一実施形態において、投与することは、皮下投与、局所投与、経皮投与、静脈内投与、経口投与または結腸内投与による。
本発明の抗体と組成物
一実施形態において、本発明は、尿路病原性大腸菌(E.coli)線毛アドヘシンFimHを特異的に認識して結合する抗体またはポリヌクレオチドをコードする抗体を含み、尿路病原性大腸菌によって表面のコロニー形成を防止することができる組成物を提供する。一実施形態において、抗体は軽鎖可変領域、および任意選択で重鎖可変領域を含む。一般的な一実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号1、配列番号3およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は、3つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2とCDR3のうちの1つ、2つまたは3つを含む。CDR1配列は、QNVSN(配列番号1の残基27〜31)またはQNIVHNNGNTY(配列番号3の残基27〜37)を含む。CDR2配列は、SAS(配列番号1の残基49〜51)またはKVS(配列番号3の残基55〜57)を含む。CDR3配列は、QQNSSFPFT(配列番号1の残基88〜96)またはFQGSHVPFT(配列番号3の残基94〜102)を含む。一般的な一実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号2、配列番号4およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。重鎖可変領域は、3つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2、CDR3のうちの1つ、2つまたは3つを含む。CDR1配列は、GYAFSSYW(配列番号2の残基26〜33)またはGYTSTNYW(配列番号4の残基26〜33)を含む。CDR2配列は、IYPRDGDT(配列番号2の残基51〜58)またはINPTSGYT(配列番号4の残基51〜58)を含む。CDR3配列は、EVGRGFYGMDY(配列番号2の残基97〜107)またはARGVIRDF(配列番号4の残基97〜107)を含む。
一実施形態において、本発明は、尿路病原性大腸菌(E.coli)線毛アドヘシンFimHを特異的に認識して結合する抗体またはポリヌクレオチドをコードする抗体を含み、尿路病原性大腸菌によって表面のコロニー形成を防止することができる組成物を提供する。一実施形態において、抗体は軽鎖可変領域、および任意選択で重鎖可変領域を含む。一般的な一実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号1、配列番号3およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は、3つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2とCDR3のうちの1つ、2つまたは3つを含む。CDR1配列は、QNVSN(配列番号1の残基27〜31)またはQNIVHNNGNTY(配列番号3の残基27〜37)を含む。CDR2配列は、SAS(配列番号1の残基49〜51)またはKVS(配列番号3の残基55〜57)を含む。CDR3配列は、QQNSSFPFT(配列番号1の残基88〜96)またはFQGSHVPFT(配列番号3の残基94〜102)を含む。一般的な一実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号2、配列番号4およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。重鎖可変領域は、3つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2、CDR3のうちの1つ、2つまたは3つを含む。CDR1配列は、GYAFSSYW(配列番号2の残基26〜33)またはGYTSTNYW(配列番号4の残基26〜33)を含む。CDR2配列は、IYPRDGDT(配列番号2の残基51〜58)またはINPTSGYT(配列番号4の残基51〜58)を含む。CDR3配列は、EVGRGFYGMDY(配列番号2の残基97〜107)またはARGVIRDF(配列番号4の残基97〜107)を含む。
一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1または3と少なくとも95%の同一性を有する。軽鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号1、3、5および6からなる群が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3である。
一部の実施形態において、重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、配列番号2または4と少なくとも95%の同一性を有する。重鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号2、4、6、8からなる群が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態において、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号4である。
一実施形態において、抗体は尿路病原性大腸菌FimHのマンノース結合ポケット内で結合する。一般的な一実施形態において、抗体は、配列番号14に示すFimHアミノ酸配列のアミノ酸残基133〜142内で結合する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号14のI52、N135、N136、Y137、N138、D140および配列番号14のF1、N46、I52、D54、Q133、N135およびN136から選択される高次構造エピトープに結合する。配列番号14は、K12のFimHのアミノ酸配列である。配列番号15は、以下に示すように、ほんの少数の残基で異なるUT189のFimHのアミノ酸配列である。
特定の一実施形態において、抗体はFimHのマンノース結合ポケット内で結合し、それによってFimHへの結合をマンノースと競合する。別の特定の実施形態において、抗体はFimHのマンノース結合ポケット内で結合し、それによって非競合的にポケットに結合したマンノースを、例えばポケットの側面に結合することによって放出する。これらの様式において、抗体はマンノース被覆表面への細菌の付着の防止と、マンノース被覆表面にすでに付着している細菌の解離との両方を行うことができる。抗体を用いて、マンノース被覆表面への細菌の単層の付着を妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムの形成を妨害もしくは防止することができる。本発明は、尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカもしくはクレブシエラ・ニューモニエなどの腸内細菌の線毛アドヘシンFimHの結合ポケットからマンノースを移動させる方法を提供する。一般的な一実施形態において、この方法は、結合ポケットを本発明の組成物と接触させることを含む。
一実施形態において、抗体は約15nM未満のIC50で、細菌接着を阻害する。別の実施形態において、抗体は1nM未満のIC50で、細菌接着を阻害する。特定の一実施形態において、抗体は約14nMのIC50で、細菌接着を阻害する。別の特定の実施形態において、抗体は約0.4nMのIC50で、細菌接着を阻害する。
一部の実施形態において、抗体は異種配列をさらに含む。異種配列の例としては、ポリペプチド、抗体、エピトープのすべてもしくは一部をコードする配列、または自然条件下で、記載された配列に隣接して発見されない他の部分のすべてもしくは一部をコードする配列が挙げられるがこれに限定されない。そのような異種部分は、記載された配列または分子の溶解度、送達、免疫原性、有効性、検出または同定を改善するために役立つことがある。一部の実施形態において、異種配列は不活性配列または無関係な配列である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体誘導体、ベニヤ抗体、二重特異性抗体、抗体誘導体、組換えヒト抗体、キメラ抗体または抗体フラグメントの1つまたは複数であり得る。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。
本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。このように、一部の実施形態において、本発明の抗体組成は、記載された抗体をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態において、1つの核酸分子が抗体全体またはその機能的フラグメントをコードするが、他の実施形態において、抗体の複数の部分、領域および/またはフラグメントをコードする別々の核酸分子が提供される。
一実施形態において、組成物は医薬組成物である。該組成物は、本発明の抗体または該抗体をコードするポリヌクレオチドの治療有効量または予防有効量を含むことができる。
有効量は、細菌接着および/またはバイオフィルム形成を妨害する、または状態、疾患もしくは感染症の症状を軽減するのに十分な量である。一部の実施形態において、本発明の組成物は、キャリアをさらに含む。キャリアは、薬学的に許容されるキャリアまたは抗体組成物の使用を容易にする他のキャリアであり得る。
有効量は、細菌接着および/またはバイオフィルム形成を妨害する、または状態、疾患もしくは感染症の症状を軽減するのに十分な量である。一部の実施形態において、本発明の組成物は、キャリアをさらに含む。キャリアは、薬学的に許容されるキャリアまたは抗体組成物の使用を容易にする他のキャリアであり得る。
当業者に知られている任意の適切なキャリアを本発明の医薬組成物に用いることができるが、キャリアの種類は投与方法によって変わる。本発明の組成物は、投与の任意の適切な投与方法用、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内の投与を含む投与方法用に調製されることができる。非経口投与、例えば皮下注射の場合、キャリアは好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与の場合、上記のキャリアのいずれかまたは固体キャリア、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖および炭酸マグネシウムを用いることができる。
そのような組成物は、緩衝液(例えば、中性緩衝食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、ショ糖もしくはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、EDTAもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)および/または保存剤も含むことができる。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として調製されることができる。化合物は、既知の方法でリポソーム内にカプセル化されることもできる。
組成物の投与
処置は、予防処置と治療処置が含まれる。予防または処置は、単一時点または複数時点で単回直接注射によって行われることができる。投与は、多部位へほとんど同時に行われることも可能である。患者または対象としては、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタおよびヒツジなどの哺乳動物ならびに他の獣医学対象)が挙げられる。一般的な患者または対象はヒトである。
処置は、予防処置と治療処置が含まれる。予防または処置は、単一時点または複数時点で単回直接注射によって行われることができる。投与は、多部位へほとんど同時に行われることも可能である。患者または対象としては、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタおよびヒツジなどの哺乳動物ならびに他の獣医学対象)が挙げられる。一般的な患者または対象はヒトである。
組成物は、一般的に、in vivoで非経口経路(例えば静脈内、皮下および筋肉内)または口腔内/舌下、直腸、経口、経鼻などの他の従来の直接経路、局所経路(経皮および点眼)、腟経路、肺経路、動脈内経路、腹腔内経路、眼内もしくは鼻腔内経路、または直接特定の組織に投与される。
組成物は、任意の適切な方法で、しばしば薬学的に許容されるキャリアとともに投与される。本発明と関連して細胞を患者に投与する適切な方法が利用可能であり、複数の経路を用いて、特定の組成物を投与することが可能であるが、特定の経路はしばしば別の経路よりもより直接的で効果的な反応をもたらすことができる。
本発明と関連して、患者に投与される用量は、患者において経時的に有益な治療応答をもたらす、または感染症もしくは感染症に起因する疾患を阻害するのに十分でなければならない。このように、組成物は、症状および/または疾患もしくは感染からの合併症を軽減するか、低減するか、治療するか、少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するのに十分な量を「治療有効用量」と定める。
用量は、生成された組成物の活性および患者の状態によって、ならびに処置される患者の体重または表面積によって決定される。用量の大きさも、特定の患者において特定の組成物の投与に伴ういずれの有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。腸内細菌感染症などの疾患の処置または予防において投与される組成物の有効量を決定する際に、医師は疾患の悪化およびいかなる処置関連毒性も評価する必要がある。
キット
本明細書に記載の方法において使用するためのキットも本発明の範囲内である。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの1つまたは複数の容器を収容するように区画化されているパッケージまたは容器を含むことができ、各容器(複数可)には本方法で使用される別々のエレメント(例えば抗体、キャリア)の1つが含まれている。一般的に、キットは本発明の1種または複数種の抗体またはポリヌクレオチドを含む。キットは、1または複数の容器をさらに含み、1種または複数種の抗体をその容器に保管する。本発明のキットには、一般的に、上述の容器と、市販の望ましい材料を含む1または複数の別の容器とを含み、ユーザーの観点から緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用方法に関する添付文書が含まれる。加えて、組成物が特定の治療適用または非治療適用のために使われることを示すために、ラベルを容器面に提示することができ、および使用方法を示すこともできる。使用方法および、または他の情報も、キットに含まれる挿入物に組み入れることができる。
本明細書に記載の方法において使用するためのキットも本発明の範囲内である。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの1つまたは複数の容器を収容するように区画化されているパッケージまたは容器を含むことができ、各容器(複数可)には本方法で使用される別々のエレメント(例えば抗体、キャリア)の1つが含まれている。一般的に、キットは本発明の1種または複数種の抗体またはポリヌクレオチドを含む。キットは、1または複数の容器をさらに含み、1種または複数種の抗体をその容器に保管する。本発明のキットには、一般的に、上述の容器と、市販の望ましい材料を含む1または複数の別の容器とを含み、ユーザーの観点から緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用方法に関する添付文書が含まれる。加えて、組成物が特定の治療適用または非治療適用のために使われることを示すために、ラベルを容器面に提示することができ、および使用方法を示すこともできる。使用方法および、または他の情報も、キットに含まれる挿入物に組み入れることができる。
実施例
以下に実施例を示して、本発明を例示し、当業者が同実施例を作製し使用することを支援する。これらの実施例は、その他の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
以下に実施例を示して、本発明を例示し、当業者が同実施例を作製し使用することを支援する。これらの実施例は、その他の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例1:抗FimH抗体mAb926とmAb475は異なる効率と機構で細菌接着を阻害する
本実施例は、マンノース結合と直接競合するmAb475抗体(Kisielaら、2013)を記載の先行研究において特性を明らかにされた不活性構造においてFimHのレクチンドメインに対する抗FimH阻害抗体の活性をより詳細に述べる。ここで、IMGT/V−Questソフトウェア(Brochetら、2008;Giudicelliら、2011)を用いて、mAb475およびいくつかの他のFimH阻害モノクローナル抗体の生殖系列起源を比較した。これらの抗体の1つ、mAb926は、mAb475とは異なる生殖系列起源であり、軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列相同性がそれぞれわずか56%と71%であり、3つの相補性決定領域のすべてが非常に多様である(図13)。したがって、mAb926とmAb475のFimHを阻害する能力をより詳細に比較した。
本実施例は、マンノース結合と直接競合するmAb475抗体(Kisielaら、2013)を記載の先行研究において特性を明らかにされた不活性構造においてFimHのレクチンドメインに対する抗FimH阻害抗体の活性をより詳細に述べる。ここで、IMGT/V−Questソフトウェア(Brochetら、2008;Giudicelliら、2011)を用いて、mAb475およびいくつかの他のFimH阻害モノクローナル抗体の生殖系列起源を比較した。これらの抗体の1つ、mAb926は、mAb475とは異なる生殖系列起源であり、軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列相同性がそれぞれわずか56%と71%であり、3つの相補性決定領域のすべてが非常に多様である(図13)。したがって、mAb926とmAb475のFimHを阻害する能力をより詳細に比較した。
尿路病原性大腸菌株J96の野生型FimHアドヘジン変異体(FimHwt)を発現する1型線毛細菌細胞を種々の濃度の抗体とともにプレインキュベートし、次いでマンノシル化表面に結合させておいた(図1)。mAb926は、0.4±0.1nMの最大半量阻害濃度(IC50)で細菌接着を阻害し、mAb475は14±1nMのIC50で細菌接着を阻害し、mAb926の阻害活性がはるかに高いことを示した(図1)。抗体の阻害活性において32倍の差(P≦0.005)が結合親和性の差に反映されたかを判定するために、表面プラズモン共鳴法を用いて、FimHwtを保有する精製線毛と抗体との結合の特性を明らかにした。図14に示すように、mAb926のKDはmAb475のKDよりも7倍低かった(それぞれ、0.58nM対4.15nM)。このように、これらの2つの抗体間のIC50の差異は、親和性の差異によって説明することができなかった。実際、mAb926がそのKD濃度で>50%阻害を示すが、mAb475はそのKD濃度で測定可能な阻害を示さない(図1)。さらに、mAb926がmAb475と比較して会合速度が17.6倍高く(それぞれ、49.7対2.8×104M−1s−1)、解離速度が2.5倍高い(それぞれ、2.89対1.17×10−4s−1)が、親和性の差異はmAb926の会合速度が速いことに起因した。ワシントン大学のAnalytical Biopharmacy Coreにて、SPR実験を(抗原基質の別の調製と)並行して行い、結果は、本明細書に報告するものと完全に一致し、我々の分析(表1)に信頼性が増した。阻害アッセイにおいて抗体を細菌とともに1時間プレインキュベートしたので、両抗体とも結合は飽和に達した可能性があった。このように、その時点で、阻害抗体の解離速度の差は、それらの会合速度よりも重要であり、したがってmAb926の有効性の増加は、そのわずかに高い解離速度を考慮すると、さらにいっそう注目に値する。
したがって、総合すると、これらの結果は、mAb475抗体のそれよりもmAb926の阻害能力がかなり高いことは、これらの2つの抗体の結合反応速度または親和性における差異によって説明できないことを示している。その代わりに、阻害活性の大きな差は、阻害機構におけるなんらかの未知の差を反映するにちがいない。
*Analytical Biopharmacy Core、UW Seattleで行われたSPR2測定。実験は、Biacore T100システム(GE/Healthcare)を用いて、HBS−EP緩衝液中で行われた。10mM、pH=2.6のグリシン中のFimHwt線毛を、14分間の接触時間を用いて、1231レゾナンスユニット(RU)でシリーズS CM5チップ(GE Healthcare)上に固定した。固定後、流速30μL/分、0μMから938μMにわたるモノクローナル抗体アナライト濃度を接触時間60秒と解離時間900秒を用いて、三つ組でテストした。各実験に続いて、表面を再生させるために、グリシンpH=1.5を30秒間3回注入した。得られたデータから基準面シグナルとブランク注入シグンルの両方を減算し、このような方法で「二重参照」反応速度データをBiacore T200評価ソフトウェア(GE Healthcareバージョン2.0)を用いて、すべての濃度にわたり1:1Langmuir結合モデルに全般的にフィッティングさせた。
実施例2:マンノースは、mAb475と直接競合するがmAb926結合とは競合しない
本実施例は、可溶性マンノースの存在下でFimHに結合するmAb475とmAb926の能力を比較する。図2Aに示すように、マンノースは、mAb475結合を強く阻害し、その結合曲線が抗体のより高い濃度へかなりのシフトを示している。mAb475の半数効果濃度(EC50)は、可溶性マンノースの存在下で179倍増加した。対照的に、mAb926の結合は、マンノースによってはるかに少ない程度の影響を受け、結合曲線が比較的小さい右方向シフトを示し、mAb926のEC50において6.2倍増加した(図2B)。
本実施例は、可溶性マンノースの存在下でFimHに結合するmAb475とmAb926の能力を比較する。図2Aに示すように、マンノースは、mAb475結合を強く阻害し、その結合曲線が抗体のより高い濃度へかなりのシフトを示している。mAb475の半数効果濃度(EC50)は、可溶性マンノースの存在下で179倍増加した。対照的に、mAb926の結合は、マンノースによってはるかに少ない程度の影響を受け、結合曲線が比較的小さい右方向シフトを示し、mAb926のEC50において6.2倍増加した(図2B)。
マンノースと抗体の競合対非競合間の相互作用を識別するために、抗体結合の観察されたEC50比の値を、受容体への2つのリガンド結合のモデルのEC50比と比較した(Ehlert、1988)。このモデルに基づいて、マンノースと抗体は、それらの相対濃度と親和性によってFimH上の同じ部位への結合を競い合うことが可能であり、または協調性因子α(Kenakin、2004)によって変化した親和性で受容体に同時に結合することが可能である(図15)。競合結合の算出したEC50比(材料および方法を参照されたい)は175±30であった。これは実験的に決定したmAb475のEC50比(179)と整合しており、抗体が直接の競合者であることが確信された。このように、FimHへのmAb475とマンノースの結合は、同時ではなく、相互排他的であり、構造的に同じ部位への結合を意味しており、我々がこれまでに報告したmAb475エピトープの決定(Kisielaら、2013)と整合している。しかし、マンノースによってmAb926のEC50が6.2倍変化することは、競合阻害モデルによって説明できないが、代わりにマンノースが非競合的に結合するmAb926を阻害することを示しており、FimHへの抗体とマノースとの同時結合と整合する。
mAb926のマンノースリガンドとの非競合的な関係は、mAb475とは異なり、mAb926によるFimH活性の阻害が直接的なオルソステリック機構によるものではないことを示している。しかし、それはむしろ、抗体とリガンドの結合のための遠位部位を構造上含む必要があるアロステリック阻害物質によって発揮される機構により似ている。
阻害性mAb475とmAb926は、活性FimH構造のマンノース結合ポケット内で重複するが異なったエピトープを認識する。次に、FimH中のmAb926結合エピトープを部位特異的変異誘発(表2)によって判定し、それをmAb475エピトープの位置と、高親和性(活性)マンノース結合構造で結晶化されたレクチンドメイン(図3A)に従って定められたアドヘシンのマンノース相互作用残基とで比較した。
*FimH(FimHwt(186−201)Foch)のレクチンドメイン中の異なる変異を有する精製した同質遺伝子線毛とmAb926との結合を材料および方法に記載のようにテストした。モノクローナル抗体結合(またFimH結晶構造上に群がっている)を>25%減少させた、予測されるmAb926エピトープ残基の変異を太字体で示す。
FimH中の位置52、135〜138、140の変化はmAb926結合を抑制した(表2および表3)。これらの位置は、レクチンドメインの上部、すなわちマンノース結合ポケットが配置されるβバレルの側面に位置する小さいエピトープ(図3A、黒い球体)を形成する。このエピトープ位置は、レクチンドメインの自然のアロステリック部位を含むドメイン−ドメイン相互作用界面の向かい側にある(図3A、明るい灰色の球体)(Le Trongら、2010)。mAb926エピトープ中の6の残基のうちの3つ、I52、N135、N136はmAb475エピトープ(位置1、46、52、54、133、135、136を含む)の一部でもある(表3および図3B)(Kisielaら、2013)。mAb926とmAb475のエピトープの予測される構造重複も、mAb926とmAb475が互いにFimHとの結合を強く交差干渉するという事実によって実験的に裏づけられている(図16)。
表2.FimHポケット残基と、mAb926エピトープおよびmAb475エピトープとの間の重複。
結合ポケットの活性および不活性構造においてマンノースリガンドと、水素結合形成FimHアミノ酸との間の距離も示す。
結合ポケットの活性および不活性構造においてマンノースリガンドと、水素結合形成FimHアミノ酸との間の距離も示す。
両抗体のエピトープは、マンノース結合ポケットと重複し(表3および図3B)、特にリガンドと11の水素結合を形成する7つの側鎖残基のネットワークと重複する(Hungら、2002)。しかし、mAb475エピトープは、該ポケットの少なくとも3つの異なる領域(46〜54ループ、133〜142ループおよびN末端)上に位置し、リガンドと総計9の水素結合を形成するこれらのマンノース相互作用残基のうちの総計5を含む(Hungら、2002;Kisielaら、2013)。これに対して、ほぼ全mAb926エピトープは、ループ133〜142によって形成されるポケットの片側だけに限定され、135と140のわずかに2つの残基がマンノースと総計3つの水素結合を形成する。構造データと整合し、リガンドとの水素結合に直接関与する残基(N135とD140)または間接的に関与する残基(N138)の変異は実質的にリガンド結合を減少させる(Hungら、2002;Kisielaら、2013;Nilssonら、2006b)が、mAb926エピトープ残基に残存する変異はマンノースとの相互作用には影響を及ぼさないか、またはわずかな影響を及ぼす(Kisielaら、2013)。
このように、mAb475エピトープと対照的に、mAb926を非競合的に阻害するエピトープは、活性FimHのマンノース結合ポケットと重複するが、大部分は該ポケットのただ1つのループに限定される。しかし、mAb926エピトープの2つの残基がマンノースリガンドとの水素結合のネットワークに寄与しているので、マンノース結合に対してmAb926のある程度の阻害効果を期待することは妥当と思われ、上記に報告する結果と整合する。
実施例3:mAb926エピトープは不活性FimHにおいてマンノース相互作用残基からシフトする
活性FimHにおいてmAb926エピトープとマンノース結合残基との重複が抗体の阻害能力を説明するが、mAb926阻害の非競合性を説明していない。したがって、レクチンドメインがよりねじれた構造であることが想定され、ピリンドメインと相互作用する、代替のFimH構造(3JWN)に着目した(図3D)。この構造はマンノースリガンドの非存在下で得られ、その結合ポケットはオープンで低親和性(すなわち不活性)の構造である。
活性FimHにおいてmAb926エピトープとマンノース結合残基との重複が抗体の阻害能力を説明するが、mAb926阻害の非競合性を説明していない。したがって、レクチンドメインがよりねじれた構造であることが想定され、ピリンドメインと相互作用する、代替のFimH構造(3JWN)に着目した(図3D)。この構造はマンノースリガンドの非存在下で得られ、その結合ポケットはオープンで低親和性(すなわち不活性)の構造である。
不活性FimH構造はリガンドの非存在下で得られたので、まず、結合ポケットのオープン立体配置でのマンノースの潜在的な位置を判定した。マンノースは、活性1UWF構造中に存在する座標を用い、続いてCHARMMとPARAM22の力場を用いるエネルギー最小化によって3JWN結晶構造のポケットに結合させた。表3と図3Eに示すように、マンノースは、活性FimHと、7のマンノース相互作用残基のうちの5、すなわちPhe1、Asn46、Asp47、Asp54およびGln133の側鎖との11の水素相互作用のうちの8を保持するオープンポケットにおいて位置をとることが予測される(Hung、ら 2002)。興味深いことに、不活性結合ポケットでのこれらの5の残基は、活性FimHでのように互いに対して本質的に同じ位置を保持し(図3Cと3F)、距離シフトが0.1〜1Å(平均0.44ű0.3)である(図17)。マンノースのこの位置は、活性ポケットまたは変異によって不活性化したFimHの分解結晶構造の分子動力学シミュレーションを使用した以前の試験によっても裏づけられている(Hungら、2002;NIlssonら、2008)。
マンノースの予測される位置によって、活性構造においてマンノースと相互作用する2つの残基、すなわちAsn135とAsp140は、オープン結合ポケットにおいてマンノースとの接触を失うと思われる(図3Eと表3)。代替のFimH構造において、これらの2つの残基も互いに対して、および他の5のマンノース相互作用残基に対してかなりシフトし(図3F)、シフトは1.2〜7.7Å(平均3.9±2.2Å)であった(図17)。
したがって、不活性FimHにおいて予測されるマンノース位置に基づいて、活性構造においてマンノースと水素結合を形成するmAb926エピトープ残基は、不活性構造におけるリガンドから比較的さらに離れてシフトされる。このように、活性FimHポケットにおいてmAb926エピトープの一部がマンノースによって占有されるが、不活性FimHにおいて全mAb926エピトープは潜在的に抗体に到達可能である。
実施例4:mAb926は不活性構造から活性構造へのFimHの転換を阻止する
FimHのマンノース結合ポケットが他のレクチンドメインとアロステリックに結合するので、FimHの構造上でmAb926抗体とmAb475抗体の効果を比較した。このために、FimHの活性構造だけを認識するmAb21抗体を用いた。mAb21エピトープ(図3A、濃い灰色の球体)は、マンノース結合ポケットから遠位に、ドメイン間の界面、すなわち推定される自然のアロステリック部位(図3A、薄い灰色の球体)の近くに位置している(Le Trongら、2010)。
FimHのマンノース結合ポケットが他のレクチンドメインとアロステリックに結合するので、FimHの構造上でmAb926抗体とmAb475抗体の効果を比較した。このために、FimHの活性構造だけを認識するmAb21抗体を用いた。mAb21エピトープ(図3A、濃い灰色の球体)は、マンノース結合ポケットから遠位に、ドメイン間の界面、すなわち推定される自然のアロステリック部位(図3A、薄い灰色の球体)の近くに位置している(Le Trongら、2010)。
図4Aに示すように、mAb475およびマンノースと線毛FimHwtとが結合することによって、活性構造特異的mAb21の結合によって判定されるように、不活性構造から活性構造に転換される。対照的に、mAb926はそのような転換を誘導できなかった。次いで、同じ実験を、FimH突然変異体を用いて行った。該突然変異体は、レクチンドメインとのその相互作用を干渉するピリンドメイン中にA188D変異を有し、FimHwtと対照的に、マンノースの非存在下でさえもFimHを活性状態で維持する(Tchesnokovaら、2008)。mAb926を用いてFimHA188D線毛を事前処置することにより、mAb21によるその認識を完全に消失させた(図4B)。ここでも、その後のmAb21結合を強化したmAb475を用いる事前処置とは際だって対照的だった。さらに、まずFimHA188DをmAb21で事前処置し、続いて阻害性モノクローナル抗体とともにインキュベートすると、mAb475はmAb21結合を安定させたが、mAb926はアドヘシンから活性状態特異的抗体をほぼ完全に移動させた(図4C)。
このように、mAb926は、レクチンドメインの不活性構造から活性構造へのシフトを誘発することができないFimHポケットに結合しているだけでなく、反対に活性構造から離れるシフトを誘発する。
実施例5:マンノースはFimHからmAb926を移動させることはできるが、mAb475を移動させることはできない
本実施例において、非競合阻害モデルによって予測されるように、可溶性マンノースとmAb926が同時に結合ポケットと相互作用することが可能かどうかを評価した。もしマンノースとmAb926がともにFimHに結合すれば、その場合、マンノースはFimHと抗体との予備形成された複合体に結合でき、不安定化することができるはずで、mAb926の解離速度がより高くなると仮定した。対照的に、FimHに結合したmAb475ではこれは起こってはならない。なぜならば、この競合抗体はマンノースがポケットに接近するのを完全に防止し、マンノースのmAb475−FimH複合体に対する影響はわずかであるからだ。換言すれば、抗体結合の後のマンノースの影響は、その結合の前/結合中の影響と正反対である(図2)。したがって、マンノースリガンドの抗体−FimH複合体に対する影響を、表面プラズモン共鳴を使用して測定した。
本実施例において、非競合阻害モデルによって予測されるように、可溶性マンノースとmAb926が同時に結合ポケットと相互作用することが可能かどうかを評価した。もしマンノースとmAb926がともにFimHに結合すれば、その場合、マンノースはFimHと抗体との予備形成された複合体に結合でき、不安定化することができるはずで、mAb926の解離速度がより高くなると仮定した。対照的に、FimHに結合したmAb475ではこれは起こってはならない。なぜならば、この競合抗体はマンノースがポケットに接近するのを完全に防止し、マンノースのmAb475−FimH複合体に対する影響はわずかであるからだ。換言すれば、抗体結合の後のマンノースの影響は、その結合の前/結合中の影響と正反対である(図2)。したがって、マンノースリガンドの抗体−FimH複合体に対する影響を、表面プラズモン共鳴を使用して測定した。
まず、FimHwt線毛で被覆した表面をmAb926またはmAb475に結合させておき、次いで抗体−FimH複合体を高濃度(1%)の可溶性マンノースとともに、およびマンノースなしでランニング緩衝液に曝した。図5に示すように、FimHからのmAb926の解離速度は、マンノースの存在下で劇的に増加した。同時に、マンノースは、観測時間にわたって、mAb475とFimHの間の複合体の安定性に有意な影響を及ぼさなかった。
これらの結果は、可溶性マンノースを添加することでFimH−mAb926複合体の安定性が影響を受け、したがって抗体とリガンドが同時にFimHに結合できるにちがいなく、それらの相互作用の非競合性と整合することを示している。対照的に、マンノースおよびmAb475とFimHとの同時相互作用については、その抗体の直接的オルソステリック阻害機構と整合するそのような証拠はない。このように、予備形成された抗体−FimH複合体へのマンノースの影響は、複合体形成に対する抗体の影響と正反対だった。
実施例6:mAb926は、FimHの低親和性状態をアロステリックに安定させるmAb824と異なる
mAb926がFimHの低親和性構造を安定させることが判明したことを考慮し、我々独自のパネル(Kisielaら、2013)由来のいずれの抗体に類似の活性があるかどうかを判定した。実際に、複数種の抗体のうちの1種、mAb824も、可溶性マンノースの存在下で活性状態特異的mAb21とFimHwtとの結合を防止することができる(図6A)、すなわちmAb824がmAb926に類似するアドヘシンの低親和性状態を安定させることが判明した。しかし、後者とは異なり、mAb824は、マンノース結合ポケット(残基G79、S80、Y82、P91;表4)から離れて位置するエピトープを認識し、FimHの低親和性構造の安定化がアロステリック機構、すなわちリガンドから離れた機構によって生じることを示唆した。SPR実験においてマンノースがFimHwtからmAb824を移動させることができなかったが(図18A)、mAb824抗体の結合の場合、抗原表面を再生させることが困難なため、mAb824を用いたSPR試験を確実に行うことができなかった。したがって、可溶性マンノースの存在下でmAb926−FimHwt複合体とmAb824−FimHwt複合体の安定性はELISAによって測定した。mAb926とは異なり、mAb824はリガンドが高濃度(8%)でもFimHwtから移動されない。特に、マンノースの非存在下で両抗体は、PBSとともに4時間インキュベーションすると、同じレベルでFimHに結合した(図18B)。
mAb926がFimHの低親和性構造を安定させることが判明したことを考慮し、我々独自のパネル(Kisielaら、2013)由来のいずれの抗体に類似の活性があるかどうかを判定した。実際に、複数種の抗体のうちの1種、mAb824も、可溶性マンノースの存在下で活性状態特異的mAb21とFimHwtとの結合を防止することができる(図6A)、すなわちmAb824がmAb926に類似するアドヘシンの低親和性状態を安定させることが判明した。しかし、後者とは異なり、mAb824は、マンノース結合ポケット(残基G79、S80、Y82、P91;表4)から離れて位置するエピトープを認識し、FimHの低親和性構造の安定化がアロステリック機構、すなわちリガンドから離れた機構によって生じることを示唆した。SPR実験においてマンノースがFimHwtからmAb824を移動させることができなかったが(図18A)、mAb824抗体の結合の場合、抗原表面を再生させることが困難なため、mAb824を用いたSPR試験を確実に行うことができなかった。したがって、可溶性マンノースの存在下でmAb926−FimHwt複合体とmAb824−FimHwt複合体の安定性はELISAによって測定した。mAb926とは異なり、mAb824はリガンドが高濃度(8%)でもFimHwtから移動されない。特に、マンノースの非存在下で両抗体は、PBSとともに4時間インキュベーションすると、同じレベルでFimHに結合した(図18B)。
*FimHwtのレクチンドメイン中に異なる変異を有する精製した同質遺伝子線毛とmAb824との結合を材料および方法に記載のようにテストした。モノクローナル抗体結合(またFimH結晶構造上に群がっている)を>25%減少させた、予測されるmAb824エピトープ残基の変異を太文字で示す。
これらの結果は、抗体によるFimHの低親和性構造の安定化がアロステリック機構によって達成し得るが、アロステリック機構によってもたらされないマンノースリガンドmAb926結合の間の干渉のユニークな特性をパラステリック機構がもたらすことができることを示唆した。
実施例7:mAb926は、バイオフィルム面を解離し、尿路感染症を予防することにおいて競合抗体mAb475より優れている
本実施例は、マンノース被覆表面に形成される大腸菌バイオフィルムに対する阻害抗体の効果を、1型線毛を発現するモデル尿路病原性菌株UT189(Kisielaら、2015)によって評価する。mAb475とmAb926の両抗体(ならびに可溶性マンノース)は、マンノース被覆表面での増殖前に大腸菌に添加されると、該表面で大腸菌バイオフィルムが形成されることを防止し(P<0.005)、バイオフィルム形成がマンノース特異的細菌接着に依存することを示している(図7A)。しかし、まず一晩、マンノース被覆表面で表面バイオフィルムを形成させておき、次いで抗体(またはマンノース)を添加すると、mAb475または可溶性マンノースのいずれも表面付着バイオフィルムの実質的な解離を生じさせなかった(図7B)。対照的に、mAb926はバイオフィルム(バイオフィルム減少mAb926の93%対mAb475の12%、P<0.0005)を効果的に溶解した。我々の以前の細菌接着アッセイ(Kisielaら、2013)の結果と一致して、活性状態特異的抗体のmAb21はバイオフィルム形成を強化し、マンノース被覆表面上に形成されたバイオフィルムの溶解が減少した(図7AおよびB)。
本実施例は、マンノース被覆表面に形成される大腸菌バイオフィルムに対する阻害抗体の効果を、1型線毛を発現するモデル尿路病原性菌株UT189(Kisielaら、2015)によって評価する。mAb475とmAb926の両抗体(ならびに可溶性マンノース)は、マンノース被覆表面での増殖前に大腸菌に添加されると、該表面で大腸菌バイオフィルムが形成されることを防止し(P<0.005)、バイオフィルム形成がマンノース特異的細菌接着に依存することを示している(図7A)。しかし、まず一晩、マンノース被覆表面で表面バイオフィルムを形成させておき、次いで抗体(またはマンノース)を添加すると、mAb475または可溶性マンノースのいずれも表面付着バイオフィルムの実質的な解離を生じさせなかった(図7B)。対照的に、mAb926はバイオフィルム(バイオフィルム減少mAb926の93%対mAb475の12%、P<0.0005)を効果的に溶解した。我々の以前の細菌接着アッセイ(Kisielaら、2013)の結果と一致して、活性状態特異的抗体のmAb21はバイオフィルム形成を強化し、マンノース被覆表面上に形成されたバイオフィルムの溶解が減少した(図7AおよびB)。
次いで、これらの抗体のin vivoでの大腸菌感染を阻止する能力について比較した。図7Cに示すように、膀胱カテーテルによってマウスに接種する前に、大腸菌UT189をmAb926とともにインキュベーションすることで、膀胱でのコロニー形成をmAb475よりも効果的に阻止した。mAb926を用いて事前処置した大腸菌UT189で感染させたマウスの膀胱から回収した細菌の減少は83%であった(図7C)が、mAb475による阻害は52%であった(P=0.0087)。mAb21によって生じた細菌量のわずかな減少は、統計的有意性に達成しなかった(P=0.1508)。
このように、尿路病原性大腸菌によるバイオフィルムの解離および膀胱感染症の防止などの最も生理学的に適切なアッセイにおいて、非競合的に阻害するmAb926は、競合的に阻害するmAb475よりもより効果的である。
mAb926には、マウスにおいて、抗原投与(UPEC菌株、UT189)(図7C)で用いた細菌とともに膀胱に経尿道的に投与されると、in vitroで細菌接着を阻止し、膀胱でのコロニー形成を減少させる優れた効力があることを示した。
また、マウスの腹膜腔に抗体mAb926を受身移入したときの、異なるUPEC菌株のCFT073に対するmAb926の保護効果を評価した。CFT073大腸菌の抗原投与の1日前と1日後に腹腔内注射を完了した(ワクチン候補に関するA07試験、契約番号第HHSN272201000040I、タスクオーダー第HHSN27200005、Galveston)。この試験において、受身移入したmAb926(FimH LDmutに対して産生された)の効果を受身投与されたmAb21抗体(FimH LDwtに対して産生された)の作用と比較し、ならびにこれらに対してモノクローナル抗体が産生された2種類の抗原(LDwtとLDmut)による能動免疫化の効果を比較した。受身移入のための抗体混合物は、50μL量の無菌HBS中にマウス投与当たり150μgとして調製した。抗体の効果を、それぞれ非糖尿病および糖尿病のC57B1/6マウスを含む2つのマウスモデルで評価した。フロイント不完全アジュバント(IFA)だけを注射したマウスを各モデルの対照(モック)群として用いた。細菌抗原投与から24時間後に開始し、14日間にわたり毎日、マウス尿の細菌量を分析した。
図8AおよびCに示すように、mAb926による非糖尿病マウスの受動免疫化は、抗原投与後1日目に開始したモック群と比較すると、尿中の細菌数の有意な減少となったが、mAb21ではこの減少が見られず、細菌数の推定平均log10はモック群マウス2.58±0.3対mAb926とmAb21マウス1.31±0.5および2.47±0.5であり、それぞれP=0.009とP=0.801であった。類似の傾向は、抗原投与後にテストした14日間中10日間存在し続けた(図8AおよびC)。1日目と3日目、mAb926処置したマウスの推定細菌数も、mAb21で処置したマウスの細菌数と比較すると、有意に低かった(それぞれ、log10 1.31±0.5と0.99±0.4対2.47±0.5と1.89±0.4、P=0.018とP=0.019)。モノクローナル抗体の尿道内投与に関してこれまでに観察されたように、mAb21の腹腔内注射は、モック群と比較して、細菌クリアランスがいくぶん良好な結果となったが、この処置の効果(LDwtによる能動免疫化と類似して)統計的有意性に達成しなかった(図8AおよびC)。次に、mAb926の受身移入の効果は、LDmutによる能動免疫化の効果と酷似しており、これに対してmAb926は両処置によって誘発され、モック群と比較して、尿中の細菌レベルの有意な減少をもたらし、感染のクリアランスが良好であった(図8AおよびC)。さらに、mAb926の受身移入も、糖尿病マウスにおいて細菌数が減少した(図8BおよびC)。しかし、このモデルにおいて、すべての処置群からのマウスは、平均して非糖尿病マウスよりも尿中の細菌数がはるかに高く、これは抗原投与後テストした全期間にわたり当てはまった(図8BおよびC)。mAb926による受動免疫化(またはLDmutによる能動免疫化)は、モック群と比較して尿中の細菌数が有意に減少したが、これらの処置について経時的に細胞数の有意な減少はなかった(図8BおよびC)。
実施例8:mAb926は、相同体FimHアドヘシンを発現する他の腸内細菌に対して活性である
クレブシエアラ・ニューモニエ(肺炎桿菌)は、しばしば尿路感染症、敗血症または気道感染症を引き起こす重要な日和見病原体である。大腸菌と同様に、クレブシエアラ・ニューモニエは、マンノース特異的1型線毛を発現し、FimHアドヘシンはアミノ酸配列レベルで大腸菌FimHと72〜84%同一である。配列アライメントによって、mAb475とmAb926のエピトープがアミノ酸変化によって標的にされないが、クレブシエラ結合ポケット内の132位(RからH)にアミノ酸置換が存在すると、間接的に抗体結合に影響を及ぼし得ることが明らかとなった。これは特にmAb475に関し、そのエピトープは133位からの近隣の残基、すなわち大腸菌においてリガンド認識にとって重要な残基、を含む。実際、クレブシエラFimHは大腸菌とは対照的に、末端に露出されたモノマンノース残基に結合する能力の低下を示すように、FimHアドヘシンの微細特異性が多少異なっている。
クレブシエアラ・ニューモニエ(肺炎桿菌)は、しばしば尿路感染症、敗血症または気道感染症を引き起こす重要な日和見病原体である。大腸菌と同様に、クレブシエアラ・ニューモニエは、マンノース特異的1型線毛を発現し、FimHアドヘシンはアミノ酸配列レベルで大腸菌FimHと72〜84%同一である。配列アライメントによって、mAb475とmAb926のエピトープがアミノ酸変化によって標的にされないが、クレブシエラ結合ポケット内の132位(RからH)にアミノ酸置換が存在すると、間接的に抗体結合に影響を及ぼし得ることが明らかとなった。これは特にmAb475に関し、そのエピトープは133位からの近隣の残基、すなわち大腸菌においてリガンド認識にとって重要な残基、を含む。実際、クレブシエラFimHは大腸菌とは対照的に、末端に露出されたモノマンノース残基に結合する能力の低下を示すように、FimHアドヘシンの微細特異性が多少異なっている。
抗体結合の分析は、両方の抗大腸菌FimH抗体がクレブシエラFimHを認識することを示した(図9)。mAb926は両方のFimHアドヘシンへの同じレベルの結合を示したが、クレブシエラFimH変異体に結合したmAb475は大腸菌FimHへの結合よりも低いレベルであった。mAb475およびmAb926とともにクレブシエラ細胞のインキュベーションは、マンノースリガンド被覆プレート(RNaseB)への細菌接着をかなり減少させ、mAb926はmAb475の阻害効果を実質的に凌駕する(図10)。次に、mAb926がクレブシエラによってバイオフィルムの形成を阻止することができるか、またはすでに形成されているバイオフィルムに影響を及ぼすことができるかどうかをテストした。図11Aに示すように、mAb926は、38〜67%の阻害を引き起こす可溶性マンノースよりも効力がある2つの異なるクレブシエラFimH変異体によってバイオフィルムの形成を効果的に阻害した(76〜86%の阻害、P<0.0005)。同様に、14時間経過したバイオフィルムを、マンノースまたはmAb21を含まずに、mAb926とともにインキュベーションすると、バイオフィルムの有意な(P=0.0005)不安定化を引き起こした(図11B)。
このように、非競合的に阻害するmAb926は、相同体FimHアドヘシンを発現するクレブシエラの接着およびバイオフィルム形成を阻止するのに効果的であり、したがってこの抗体は他の腸内細菌に起因する感染症に対して有望な抗感染症薬になり得る。
実施例9:新規のパラステリック機構を介して細菌接着の阻害と回復の両方のためのリガンド結合部位のわずかに1つのループへの抗体結合の有意性
受容体タンパク質のリガンド結合部位エピトープを標的にする抗体を作製することは、防御抗体または治療抗体の開発における主要目的である。これらの抗体は、リガンドと直接競合することによって受容体結合機能を阻止すると思われる。定義上、発生する競合阻害の場合、結合ポケットは阻害物質結合の時点でリガンドによって占有されることができない(図12A)。したがって、そのようなオルソステリック阻害物質は、ポケットからのリガンドの解離を誘発することによってリガンド結合を元に戻すことができなく、高濃度の内因性リガンドの存在下で効果がない。これはオルソステリック阻害物質の有用性を限定している。結合したリガンドを解離することが可能な唯一の阻害物質は、リガンド結合ポケットより遠位に位置する部位からの構造変化のシグナリングによって結合が弱い不活性受容体状態を誘発するアロステリックな性質を持ったものと考えられる(図12B)。しかし、アロステリック阻害物質のデザインは、高次構造の制御が未知であり、存在しないかまたは複雑であるタンパク質の場合、問題になる。
受容体タンパク質のリガンド結合部位エピトープを標的にする抗体を作製することは、防御抗体または治療抗体の開発における主要目的である。これらの抗体は、リガンドと直接競合することによって受容体結合機能を阻止すると思われる。定義上、発生する競合阻害の場合、結合ポケットは阻害物質結合の時点でリガンドによって占有されることができない(図12A)。したがって、そのようなオルソステリック阻害物質は、ポケットからのリガンドの解離を誘発することによってリガンド結合を元に戻すことができなく、高濃度の内因性リガンドの存在下で効果がない。これはオルソステリック阻害物質の有用性を限定している。結合したリガンドを解離することが可能な唯一の阻害物質は、リガンド結合ポケットより遠位に位置する部位からの構造変化のシグナリングによって結合が弱い不活性受容体状態を誘発するアロステリックな性質を持ったものと考えられる(図12B)。しかし、アロステリック阻害物質のデザインは、高次構造の制御が未知であり、存在しないかまたは複雑であるタンパク質の場合、問題になる。
受容体タンパク質のリガンド結合部位が、ポケット内のリガンド結合に干渉する(オルソステリック阻害物質のように)が、われわれがパラステリック(リガンドの隣に)阻害と呼ぶ機構を介して非競合的(アロステリック阻害物質のように)に干渉する強力な阻害抗体に対してエピトープを提供することを我々は本明細書で示した。アロステリック阻害物質は、ポケット近くに結合する(Luoら、2004;Mukundら、2013;Wuら、2007)がしかし、パラステリック阻害物質とは異なり、リガンド相互作用ポケット残基自体を結合しないことが記載されている。「パラステリク阻害」という用語はこれまでは、阻害物質とリガンドが、オルソステリック阻害物質とアロステリック阻害物資についてそれぞれ予想されるように完全に重複する、または遠位部位で結合するよりもむしろ互いに極めて接近して結合し得るという理論的可能性を少なくとも強調することが示唆されていた(Dissingら、1993)。その研究はプリン調節物質によるACP1の酵素活性の調節に焦点を合わせていたが、阻害の構造的詳細または機構詳細は検討されてなかった。パラステリック抗体の際だった明らかな特性の1つは、リガンドと同時に結合ポケットに結合し、活性状態へのその転換を防止することであることを我々は本明細書で示す(図12C)。このように、パラステリック概念も、ポケットの不活性状態を安定化することができるが、リガンドと同時に結合しない、ヒトGタンパク質共役受容体について示されるものなどのインバースアゴニストの概念と異なる(Jaakolaら、2008;Labonら、2011)。
パラステリック阻害は、広範囲にわたる受容体に潜在的に適用できる。結合ポケットの高次構造ダイナミクスは、すべてのリガンド−結合タンパクの本質的な特性であると考えられている(Boehrら、2009;Gohら、2004;Henzler−WildmanおよびKern、2007)。結合ポケットの少なくとも2つの異なる構造状態、すなわちリガンドと強力に結合する活性状態と、リガンドと比較的弱く結合する不活性状態とが受容体タンパク質に存在すると提唱される。多くの場合または大多数の場合でも、活性状態のポケットは、不活性状態と比較してリガンドの周辺を締める。例えば、マルトース結合タンパク質の2つのドメインは親和性を高めるために密接して結合しており(Quiochoら、1997;Spurlinoら、1991)、アデニル酸キナーゼの結合部位上の「蓋」は基質出口を防止するために閉鎖し(Wolf−Watzら、2004)、植物ホルモンアブシジン酸受容体の「ゲート」はホルモンリガンドの周りで閉鎖し(Nilssonら、2008)、およびβアドレナリン受容体の結合ポケットはカテコラミンの周りで収縮する(Lebonら、2001;Warneら、2011)。同様に、種々の受容体タンパク質のリガンド結合ループは、NMRおよびFRET分析によって高度に柔軟であることが明らかになった(Kimら、2013;Tangら、2007)。これは、パラステリック阻害物質が潜在的に、よりゆるやかな結合オープンポケットにリガンドと同時に結合することが可能であり、多くの異なる受容体−リガンド系においてポケットがしっかりと閉まるのを防ぐことを示唆している。特に、これらの受容体の多くは、本来アロステリックではない、局在的な高次構造ダイナミクスだけを受け、したがってパラステリック機構はアロステリック機構よりもより広範囲の受容体に適用できるはずである。異なるFimH状態に関する多量の蓄積された構造および機能データと種々の高次構造特異的モノクローナル抗体が入手可能なので、FimHをプロトコル分子として使用する、活性状態と不活性状態の間の高次構造シフトのダイナミクスを調べる、および種々の種類の阻害物質と構造調節物質をテストする機会が提供されている。
mAb926阻害機構への洞察を得るために、我々は、マンノースなしで得られるオープンマンノース結合ポケットを含む不活性FimHの結晶構造(Le Trongら、2010)に着目した。不活性構造をロックすることについての我々の以前の試験は、FimHのオープンポケットがマンノースと相互作用する能力を多少保持していることを示唆した(Le Trongら、2010)。また、他の試験ではマンノース結合残基、Gln133〜Asn、のうちの1つの変異がFimHの結合機能を実質的除去したが、マンノースは依然としてこの変異体と共結晶化することが可能であることが明らかになった(Hungら、2002)。後者の構造では、マンノースは、野生型の活性ポケット中でのように、リガンドから離れてシフトしたN135とD140の残基を除いて、すべての結合残基と同じ相互作用を保持した。これは、後者の残基が柔軟なポケットループ上にあるという我々の結論を裏づけた。我々のモデルに対するさらなる裏づけは、F1とD54の残基(すなわち柔軟なルプープ上にない残基)がリガンドと最強の相互作用を形成することを予測した以前の分子動力学シミュレーションによって提供されている(Nilssonら、2008)。このように、133〜140ループの動的性質を指し示す我々のモデルは、これまでの試験と整合する。
リガンドがすでに結合している場合、mAb926(または一般的に任意のパラステリック阻害物質)がそのエピトープに接近するために、結合ポケットが活性構造から不活性構造にシフトを遂げなければならないかどうかは依然として不明である。FimHの場合、mAb926エピトープを保有するポケットの132〜140ループは一時的に付着マンノースから離れてシフトすることもある。実際、マルトース結合タンパク質の本来の開口速度がリガンド解離を決定することが最近明らかになった(Seoら、2014)。mAb926作用の別の可能性のあるシナリオは、マンノース結合残基N135とD140を含まないエピトープの一部を介して、FimHのマンノース占有ポケットの活性構造へのその中間結合を含み得る。次に、結合の可能な中間ステップは、柔軟なループの全開を促進することが可能であり、したがって活性状態を非活性化する。実際、リガンドとの水素結合に関与することなく、ポッケット間隙の外側に面していないmAb926エピトープ残基(I52、N136、Y137)の変異体は、マンノースリガンド結合を減少することもなく、またはそれに最小限の影響を及ぼしただけであり(Kisielaら、2013)、これらの残基が、ポケットがリガンドによって占有されていたとしても、抗体との相互作用のために利用でき得ることを示唆している。mAb926の阻害作用の構造詳細および他の潜在的なパラステリック阻害物質の構造詳細を解明するためにさらなる試験が必要である。
FimHにおけるレクチンドメインとピリンドメインの相互作用が結合ポケットの不活性構造をアロステリックに促進するが、可溶性ピリンドメインはアドヘシンの低親和性状態を安定させることはできなかった(Aprikianら、2007)。しかし、本試験において、結合ポケットから離れて位置するエピトープを結合することによって、FimHwtが低親和性から高親和性にシフトするのを明らかにアロステリックに防止するように見える抗体mAb824を見いだした。このエピトープは、スイッチの構造経路において重要な領域であり得るFimHのレクチンドメインの間隙シートの側面に位置するが、mAb824の作用の詳細はさらなる調査を必要とする。重要なことに、mAb926とは異なり、mAb824が可溶性マンノースによってFimHから移動されることはなく、FimHにおけるリガンド誘発構造シフトによってmAb824の構造安定化効果が圧倒されないことを示唆している。少なくとも一部の受容体タンパク質において、不活性構造に結合しているアロステリック抗体は受容体タンパク質のリガンド誘発活性によって移動されることもあり、反対に活性化構造に結合しているリガンドはアロステリック阻害抗体によって移動され得ることを予想することは妥当と思われる。しかし、アロステリック抗体は、誘発された解離の問題に影響を及ぼす可能性のあるパラステリック抗体とはある意味で根本的に異なる。アロステリック抗体は、結合部位と異なる部位に結合し、比較的弱く結合する(Christopoulos、2002)。これは、抗体エピトープが不活性構造にあり得るが、結合部位は活性構造にあることを意味する。対照的に、我々の定義によるパラステリック抗体には、ある程度結合部位と重複するエピトープがあり、そのため結合反応速度は抗体が結合する場合、およびその逆の場合も変化するはずである。我々は、この差が、マンノースによってmAb824がFimHから移動されないことを説明すると解釈するが、この問題に取り組むためにはmAb842についてより詳細にわたる試験が必要である。このように、FimHに結合するmAb926にはレクチンドメインに対するアロステリック効果があるが、マンノース結合のその阻害はアロステリック機構それ自体によるのではなく、mAb824または他の受容体リガンド相互作用系に記載される他の古典的なアロステリック阻害物質によって発揮される作用とは基本的に異なる(Doernら、2009;Hinoら、2012;Luoら、2004)。
mAb926による非競合阻害のモデルは、抗体とリガンドがFimHに同時に結合することができる、すなわち少なくとも一時的なFimH−マンノース−mAb926複合体を形成することを示す。これは、マンノースがmAb926によって占有されたFimHポケットに接近するが、mAb475によって占有された該ポケットには接近することはなく、mAb926の結合が解除されることが観察によって実験的に裏づけられている。3者複合体が形成される方法および該複合体が不安定な理由についての正確な機構は不明であるが、リガンド結合に起因する構造の歪みまたは立体障害が原因で抗体がFimHから溶離される可能性がある。次いで、相反的に、受容体がリガンドによってすでに占有されている場合、mAb926の共結合特性は、リガンドに結合解除をさせる。実際、mAb475抗体の比較的少ない影響と比較して、または高濃度の可溶性マンノースでさえ比較すると、マンノース被覆表面に形成された細菌バイオフィルムは、mAb926によってのみ効果的に解離されることが可能であることが観察された。我々の知る限りでは、mAb926は、細菌バイオフィルムを溶解することを示した唯一の抗体である。
結合部位が重複するにもかかわらず阻害物質mAb926とマンノースリガンドとの明らかな同時結合の現象により、オルソステリック阻害物質およびアロステリック阻害物質の両方とは異なったものなり、新規のリガンド結合阻害のパラステリック機構を定めるための理論的根拠を提供する。パラステリック阻害物質のオルソステリック阻害物資に対する利点は、前者が結合ポケットからの結合解除においてより強力であり、かつ高濃度の内因性リガンドの存在下でより効果的であることである。いずれの効果も、競合阻害物質mAb475と比較してmAb926によるかなり強力な阻害、およびFimHが媒介するマウス膀胱でのコロニー形成を阻止するmAb926の優れた能力を説明することができる。リガンドは結合したmAb926とともに結合ポケットに入り、実際に抗体を移動させることができることを示したが、これは、極めて高い非生理的濃度でのみ生じ、リガンド結合阻害物質としての抗体の有効性を損なうことはないだろう。多くの細菌アドヘジンはFimHに類似したせん断力が増強した接着を媒介し(Dingら、2010;Georgeら、2006;Nilssonら、2006a;Tchesnokovaら、2010)、アドへジンも構造変化を遂げることがあり得、パラステリック阻害の候補になり得ることを示唆している。パラステリック阻害物質のアロステリック阻害物質に対する利点は、パラステリック阻害の有効性がアロステリック部位とリガンド結合部位との弱い結合によって限定されることはなく、かつパラステリック阻害は受容体がアロステリックであることを必要としないことである。アロステリック部位の位置についての知識が不足しているため、合理的設計についての問題点が存在するアロステリック阻害物質と比較すると、パラステリック阻害物質の開発はタンパク質がアロステリックであるか否かにかかわらず、規定されたリガンド結合部位を有する任意のタンパク質に対してより広範囲に適用でき得る。
mAb926のエピトープは、高度に保存されているように見える。種々の起源(腸管、腸管外および周辺)の大腸菌の4271菌株から488の異なるfimHアレルにおけるエピトープ領域の配列解析により、488アレルのうちわずか1アレル(5菌株)がエピトープ位置の1つD140に変異性があることが明らかになった。しかし、このアレルは、極めてまれであり(>4,000分離菌から5菌株中に存在)、mAb926が多種多様な大腸菌分離菌に対して広範囲に効力があり得ることを示している。さらに、この抗体は、クレブシエラ・ニューモニエの接着とバイオフィルムの形成を効果的に阻止した。しばしば尿路感染症、敗血症または気道感染症を引き起こす重要な日和見病原体であるクレブシエラ・ニューモニエは、マンノース特異的1型線毛を発現し、FimHアドヘシンは大腸菌FimHと72〜84%(アミノ酸配列レベルで)同一である。クレブシエラFimHの結合ポケットは、大腸菌といくぶん異なっているが、大腸菌と比較すると、mAb926のエピトープは依然として元のまま維持されおり、解析された>540クレブシエラ菌株から100を超える異なるFimHアレルで同一である。これは、mAb926が相同体FimHアドヘシンを発現する他の腸内細菌に対しても強力な阻害物質であり得ることを示唆した。
総合すると、我々の調査結果は、リガンド結合部位のただ1つのループに結合する抗体には、新規のパラステリック機構を介して細菌接着の阻害と回復の両方に極めて効果的な可能性があることを示唆している。細菌アドヘジンの結合ポケットサイドループは、そのような可能性を有する抗体の生成の良好な標的であるように見える。mAb926エピトープが主に単一ループによって形成されていることを観察することにより、このループは合成環状ペプチドを用いたパラステリック抗体の誘発のための良好な候補免疫原になる。ループ形状エピトープは、本来のエピトープを十分に模倣するだけでなく、免疫原として極めて高い安定性を示す環状形で合成されると、その構造特性のために、合成ペプチド系ワクチンとして極めて効力があることが示された(Hoogerhoutら、1995;Misumiら、2003)。
実施例10:モノクローナル抗体の産生と精製
マウス抗体mAb475m、mAb824、mAb926およびmAb21を産生するハイブリドーマ細胞を、10%FBS(Gibco,#10082147)、Pen/Strep(Gibco,315140−122)、ピルビン酸ナトリウム(Gibro,#11360)を補充したIMDM培地(Lonza)中で増殖させた。抗体は、メーカーの推奨に従い、タンパク質G−アガロース(Millipore)を用いて、ハイブリドーマ細胞培地上清から精製し、続いて16/60Superdex75カラム(GE Healthcare)を用いてFPLC精製を行った。すべてのFPLC精製ステップは、HBS中で行い、最終濃度5〜10mg/mLの抗体を4℃で保存した。
マウス抗体mAb475m、mAb824、mAb926およびmAb21を産生するハイブリドーマ細胞を、10%FBS(Gibco,#10082147)、Pen/Strep(Gibco,315140−122)、ピルビン酸ナトリウム(Gibro,#11360)を補充したIMDM培地(Lonza)中で増殖させた。抗体は、メーカーの推奨に従い、タンパク質G−アガロース(Millipore)を用いて、ハイブリドーマ細胞培地上清から精製し、続いて16/60Superdex75カラム(GE Healthcare)を用いてFPLC精製を行った。すべてのFPLC精製ステップは、HBS中で行い、最終濃度5〜10mg/mLの抗体を4℃で保存した。
実施例11:モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列決定
完全mRNAを、RNaseミニキット(Qiagen、#74104)を用いてハイブリドーマ細胞から単離し、続いてcDNA合成をOmniscript RTキット(Qiagen)とオリゴdTプライマー(Qiagen)によって行った。可変領域を、以下のプライマーを用いて、20μLのRT反応容量から2μLを用いてPCR増幅させた。
順方向:
VL4(mAb475):CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA(配列番号9);
VL5(mAb926):CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA(配列番号10);
VH1(mAb475とmAb926):AGGTCCAGCTGCTCGAGTCTGG(配列番号11);ならびに
逆方向:
VLr(mAb475とmAb926):GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA(配列番号12);および
VH3r(IgG1特異的):AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT(配列番号13)。
完全mRNAを、RNaseミニキット(Qiagen、#74104)を用いてハイブリドーマ細胞から単離し、続いてcDNA合成をOmniscript RTキット(Qiagen)とオリゴdTプライマー(Qiagen)によって行った。可変領域を、以下のプライマーを用いて、20μLのRT反応容量から2μLを用いてPCR増幅させた。
順方向:
VL4(mAb475):CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA(配列番号9);
VL5(mAb926):CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA(配列番号10);
VH1(mAb475とmAb926):AGGTCCAGCTGCTCGAGTCTGG(配列番号11);ならびに
逆方向:
VLr(mAb475とmAb926):GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA(配列番号12);および
VH3r(IgG1特異的):AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT(配列番号13)。
精製PCR産物をGenewiz Inc.(Seattle)による配列決定に委ねた。
抗FimH抗体の生殖系列起源を、IMGT/V−Questソフトウェア(オンラインで利用可能)(Brochetら、2008;Giudicelliら、2011)を用いてそれらの軽鎖と重鎖の可変領域配列に基づいて判定した。
抗FimH抗体の生殖系列起源を、IMGT/V−Questソフトウェア(オンラインで利用可能)(Brochetら、2008;Giudicelliら、2011)を用いてそれらの軽鎖と重鎖の可変領域配列に基づいて判定した。
実施例12:抗体エピトープマッピング
mAb926エピトープとmAb824エピトープのマピングを前述のように行った(Kisiela、ら 2013)。手短に言うと、FimHのLDに異なる変異を保有する精製した同質遺伝子線毛を認識する能力についこれらの抗体をテストした。親の(変異してない)線毛を基準として用い、それに対して抗体とすべての他の変異体線毛との結合を正規化した。mAb926とmAb824のエピトープをそれぞれ、高親和性FimH変異体(FimHwt:(186〜201)Foch)(Aprikianら、2007)と低親和性FimH変異体(FimHwt)を用いて位置づけた。
mAb926エピトープとmAb824エピトープのマピングを前述のように行った(Kisiela、ら 2013)。手短に言うと、FimHのLDに異なる変異を保有する精製した同質遺伝子線毛を認識する能力についこれらの抗体をテストした。親の(変異してない)線毛を基準として用い、それに対して抗体とすべての他の変異体線毛との結合を正規化した。mAb926とmAb824のエピトープをそれぞれ、高親和性FimH変異体(FimHwt:(186〜201)Foch)(Aprikianら、2007)と低親和性FimH変異体(FimHwt)を用いて位置づけた。
実施例13:細菌株
大腸菌臨床分離株UTI89および異なる構造FimH変種を有する1型線毛を発現する大腸菌K12の組換え株は、前述した(Aprikianら、2007;Liuら、2012;Tchesnokovaら、2008)。手短に言うと、大腸菌K12の組換え株(AAEC191A)は、大腸菌株K12由来の全fim遺伝子集団を含有するpPKL114プラスミドを保有するが、不活性fimH遺伝子を有する。1型線毛発現のために、pPKL114プラスミド含有細菌をfimH遺伝子の異なるアレルを保有する同質遺伝子pGB2−24ベースのプラスミドで形質転換させた。AAEC191A組換え株も用いて、FimH野生型(FimHwt)とS62A変異体(FimHS62A)を含むクレブシエア・ニューモニエFimH(Stahlhutら、2009)を保有する1型線毛を生成した。異なるfimH変異体で補完したクレブシエア・ニューモニエfimH変異体は前述した(Struveら、2008)。
大腸菌臨床分離株UTI89および異なる構造FimH変種を有する1型線毛を発現する大腸菌K12の組換え株は、前述した(Aprikianら、2007;Liuら、2012;Tchesnokovaら、2008)。手短に言うと、大腸菌K12の組換え株(AAEC191A)は、大腸菌株K12由来の全fim遺伝子集団を含有するpPKL114プラスミドを保有するが、不活性fimH遺伝子を有する。1型線毛発現のために、pPKL114プラスミド含有細菌をfimH遺伝子の異なるアレルを保有する同質遺伝子pGB2−24ベースのプラスミドで形質転換させた。AAEC191A組換え株も用いて、FimH野生型(FimHwt)とS62A変異体(FimHS62A)を含むクレブシエア・ニューモニエFimH(Stahlhutら、2009)を保有する1型線毛を生成した。異なるfimH変異体で補完したクレブシエア・ニューモニエfimH変異体は前述した(Struveら、2008)。
実施例14:ELISAアッセイ
マイクロタイタープレート・ウェルに、0.02MのNaHCO3緩衝液中の精製線毛(Kisielaら、2013)を0.1mg/mL(特に明記しない限り)の濃度で、37℃で1時間、被覆した。これらのウェルをPBSで洗浄して、PBSに溶解した0.2%BSAで20分間クエンチした。マンノースのモノクローナル抗体に対する効果をテストするために、52mMのα−メチル−D−マンノピラノシド(αmm、以下「マンノ−ス」と呼ぶ)の非存在下または存在下で段階希釈した純粋な抗体とともに固定化線毛をインキュベートした。結合した抗体を、1:5,000に希釈したHRP結合ヤギ抗マウス抗体(Bio−Rad)で検出した。反応液を3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、KPL)を用いて展開させ、吸光度を650nmで読み取った。各抗体それぞれに対して、Prismソフトウェア6.0版(GraphPad,La Jolla,CA)を用いて非線形回避曲線フィッティングによってEC50値を決定した。
マイクロタイタープレート・ウェルに、0.02MのNaHCO3緩衝液中の精製線毛(Kisielaら、2013)を0.1mg/mL(特に明記しない限り)の濃度で、37℃で1時間、被覆した。これらのウェルをPBSで洗浄して、PBSに溶解した0.2%BSAで20分間クエンチした。マンノースのモノクローナル抗体に対する効果をテストするために、52mMのα−メチル−D−マンノピラノシド(αmm、以下「マンノ−ス」と呼ぶ)の非存在下または存在下で段階希釈した純粋な抗体とともに固定化線毛をインキュベートした。結合した抗体を、1:5,000に希釈したHRP結合ヤギ抗マウス抗体(Bio−Rad)で検出した。反応液を3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、KPL)を用いて展開させ、吸光度を650nmで読み取った。各抗体それぞれに対して、Prismソフトウェア6.0版(GraphPad,La Jolla,CA)を用いて非線形回避曲線フィッティングによってEC50値を決定した。
アドヘシン構造に対する抗体の影響をテストするために、固定化線毛を50μg/mLの純粋な抗体、または52mMのマンノースとともに1時間インキュベートし、次いで0.5μg/mLのビオチン化mAb21をウェルに加えた。洗浄後、ビオチン化モノクローナル抗体の結合を1:5,000に希釈したHRP結合ストレプトアビジン(Sigma−Aldrich)を用いて検出した。一部の実験において、まず、表面固定化線毛を0.5μg/mLのビオチン化モノクローナル抗体とともに(52mMノマンノースの非存在下または存在下で)インキュベートし、続いて精製モノクローナル抗体50μg/mLとともに1時間インキュベートした。
FimH−抗体複合体の安定性に対するリガンドの影響をテストするために、まず、0.4μg/mLの濃度で抗体を表面固定化線毛に結合させ、続いて8%マンノースまたはPBSとともに1〜4時間インキュベートした。
実施例15:表面プラズモン共鳴(SPR)分析
FimHwtへのmAb926、mAb475およびmAb824の結合に続いて1%(w/v)マンノースの非存在または存在によるSPR分析を25℃で、Biacore T100システム(GE Healthcare)上で0.1mg/mLのBSAを用い、HBS−EP+(0.01MのHepes pH7.4、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.05%(v/v)界面活性剤P20)のランニング緩衝液(RB)中で行った。標準アミンカップリング反応を使用して、約2000RUのFimHwt線毛を20μg/mLで10mMグリシン(pH2.5)中で、シリーズS CM5チップ(GE Healthcare)の2つのフローセルにアミン結合させた。2つの基準面は、タンパク質を添加せずに、フローセルを活性化、不活性化することによって調製した。単一濃度で二つ組(1つはmAb824用)サンプルを、T100コントロールソフトウェア(2.0.4版)の「デュアル」インジェクションコマンドを用い、インジェクション1を5分間、インジェクション2を10分間、最終解離時間を1分間で、10μL/分の流速でインジェクトした。モノクローナル抗体単独の曲線は、モノクローナル抗体をインジェクトし、続いてRBをインジェクトすることよって作成し、次いでRBの後RBのデュアルインジェクションを差し引くことによって二重参照した(Myszka、1999)。モノクローナル抗体+マンノース曲線は、モノクローナル抗体(マンノースを含まないRB中で)をインジェクトし、続いて1%マンノースを含むRBをインジェクトすることによって作成し、次いでRBの後1%マンノースを含むRBのデュアルインジェクションを差し引くことによって二重参照した。最適再生は、10mMグリシン、pH1.5を流速50μL/分で、30秒パルスのインジェクションを1回(mAb926の場合)または2回(mAb475の場合)のいずれか、続いて2分間の緩衝液安定相によって達成された。mAb824サンプル結合のための最適再生条件がわからなかったため、2つのFimHwt線毛表面の生成が必要であり、各々mAb824インジェクションを1回だけ行った。mAb824結合表面にできるだけ密接に適合させ、ならびに比較のための対照を用意するために、マンノースを含む、および含まないmAb926とmAb475のインジェクションをmAb824のインジェクションに先立って各FimHwt線毛表面で行った。センサーグラムをScrubberソフトウェア2.0b版(BioLogic Software)で二重参照し、テキストファイルとして保存し、Prism GraphPadソフトウェア6版で再プロットした。
FimHwtへのmAb926、mAb475およびmAb824の結合に続いて1%(w/v)マンノースの非存在または存在によるSPR分析を25℃で、Biacore T100システム(GE Healthcare)上で0.1mg/mLのBSAを用い、HBS−EP+(0.01MのHepes pH7.4、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.05%(v/v)界面活性剤P20)のランニング緩衝液(RB)中で行った。標準アミンカップリング反応を使用して、約2000RUのFimHwt線毛を20μg/mLで10mMグリシン(pH2.5)中で、シリーズS CM5チップ(GE Healthcare)の2つのフローセルにアミン結合させた。2つの基準面は、タンパク質を添加せずに、フローセルを活性化、不活性化することによって調製した。単一濃度で二つ組(1つはmAb824用)サンプルを、T100コントロールソフトウェア(2.0.4版)の「デュアル」インジェクションコマンドを用い、インジェクション1を5分間、インジェクション2を10分間、最終解離時間を1分間で、10μL/分の流速でインジェクトした。モノクローナル抗体単独の曲線は、モノクローナル抗体をインジェクトし、続いてRBをインジェクトすることよって作成し、次いでRBの後RBのデュアルインジェクションを差し引くことによって二重参照した(Myszka、1999)。モノクローナル抗体+マンノース曲線は、モノクローナル抗体(マンノースを含まないRB中で)をインジェクトし、続いて1%マンノースを含むRBをインジェクトすることによって作成し、次いでRBの後1%マンノースを含むRBのデュアルインジェクションを差し引くことによって二重参照した。最適再生は、10mMグリシン、pH1.5を流速50μL/分で、30秒パルスのインジェクションを1回(mAb926の場合)または2回(mAb475の場合)のいずれか、続いて2分間の緩衝液安定相によって達成された。mAb824サンプル結合のための最適再生条件がわからなかったため、2つのFimHwt線毛表面の生成が必要であり、各々mAb824インジェクションを1回だけ行った。mAb824結合表面にできるだけ密接に適合させ、ならびに比較のための対照を用意するために、マンノースを含む、および含まないmAb926とmAb475のインジェクションをmAb824のインジェクションに先立って各FimHwt線毛表面で行った。センサーグラムをScrubberソフトウェア2.0b版(BioLogic Software)で二重参照し、テキストファイルとして保存し、Prism GraphPadソフトウェア6版で再プロットした。
見かけの反応速度と平衡結合定数を判定するために、FimHwt線毛を上述の通り1300RUの密度にアミン結合し、活性化/不活性化表面を参考として用いた。アナライトの2倍段階希釈を12.5nM(mAb926)または200nM(mAb475)で開始し、緩衝液ブランクを順不同にインジェクトし、二つ組で、0.1mg/mLのBSAを含むHBS−EP中、30μL/分の流速で、700秒の結合と1200秒の解離で行った。表面は、10mMグリシン、pH1.5の50μL/分で30秒のインジェクションを1回(mAb926)または30秒のインジェクションを2回(mAb475)のいずれかに続いて緩衝液安定化を2分間行うことで再生させた。二重参照データを、BIAevaluationソフトウェア2.0.4版(GE Healthcare)を用いて1:1結合モデルとフィッティングさせた。
実施例16:細菌接着
0.02MのNaHCO3緩衝液、pH9.6に溶解した20μg/mLの酵母マンナンまたはRNaseB(Sigma−Aldrich)でマイクロタイター96ウェルプレートを被覆した。ウェルをPBSに溶解した0.2%ウシ血清アルブミン溶液(BSA、Sigma−Aldrich)で20分間クエンチさせた。まず、FimHアドヘシンを発現する細菌(OD=1またはOD=2)を異なる濃度のモノクローナル抗体とともに37℃で1時間プレインキュベートし、次いでさらに1時間、リガンド被覆表面に接着させておいた。PBSで十分に洗浄した後、プレートを乾燥させて、結合した細菌を室温(RT)で0.1%クリスタルバイレット(Becton Dickinson)で20分間染色した。ウェルを水で洗浄して、50%エタノールをウェルに添加した。吸光度を600nmで測定した。
0.02MのNaHCO3緩衝液、pH9.6に溶解した20μg/mLの酵母マンナンまたはRNaseB(Sigma−Aldrich)でマイクロタイター96ウェルプレートを被覆した。ウェルをPBSに溶解した0.2%ウシ血清アルブミン溶液(BSA、Sigma−Aldrich)で20分間クエンチさせた。まず、FimHアドヘシンを発現する細菌(OD=1またはOD=2)を異なる濃度のモノクローナル抗体とともに37℃で1時間プレインキュベートし、次いでさらに1時間、リガンド被覆表面に接着させておいた。PBSで十分に洗浄した後、プレートを乾燥させて、結合した細菌を室温(RT)で0.1%クリスタルバイレット(Becton Dickinson)で20分間染色した。ウェルを水で洗浄して、50%エタノールをウェルに添加した。吸光度を600nmで測定した。
実施例17:バイオフィルム形成アッセイ
0.02MのNaHCO3緩衝液、pH9.6に溶解した20μg/mLの酵母マンナンまたはRNaseB(Sigma−Aldrich)でマイクロタイター96ウェルプレートを被覆した。3mLのLB培地中で一晩増殖させた細菌株を遠心して、最小必須培地(MEM,Difco)で1回洗浄した。MEMに懸濁させた細菌懸濁液を最終濃度OD=0.2で、52mMマンノースまたは50μg/mLのモノクローナル抗体の非存在下および存在下でマンナン被覆ウェルに添加し、振盪させずに室温で16時間インキュベートした。細菌接着アッセイについて上述したように、PBSで洗浄した後、形成されたバイオフィルムを0.1%(v/v)のクリスタルバイオレット(Becton Dickinson)で染色した。バイオフィルム解離のために、マンナンを被覆したマイクロタイタープレート上で大腸菌UT189によって16時間生成されたバイオフィルムをPBSで3回洗浄し、1%マンノースまたは50μg/mLのモノクローナル抗体の非存在下または存在下で、室温で穏やかに振盪させながらインキュベートした。ウェルをPBSで3回洗浄し、上述のようにバイオフィルムを検出するために染色した。
0.02MのNaHCO3緩衝液、pH9.6に溶解した20μg/mLの酵母マンナンまたはRNaseB(Sigma−Aldrich)でマイクロタイター96ウェルプレートを被覆した。3mLのLB培地中で一晩増殖させた細菌株を遠心して、最小必須培地(MEM,Difco)で1回洗浄した。MEMに懸濁させた細菌懸濁液を最終濃度OD=0.2で、52mMマンノースまたは50μg/mLのモノクローナル抗体の非存在下および存在下でマンナン被覆ウェルに添加し、振盪させずに室温で16時間インキュベートした。細菌接着アッセイについて上述したように、PBSで洗浄した後、形成されたバイオフィルムを0.1%(v/v)のクリスタルバイオレット(Becton Dickinson)で染色した。バイオフィルム解離のために、マンナンを被覆したマイクロタイタープレート上で大腸菌UT189によって16時間生成されたバイオフィルムをPBSで3回洗浄し、1%マンノースまたは50μg/mLのモノクローナル抗体の非存在下または存在下で、室温で穏やかに振盪させながらインキュベートした。ウェルをPBSで3回洗浄し、上述のようにバイオフィルムを検出するために染色した。
実施例18:抗体の経尿道注入によるマウス実験
他で記載のように、10〜11週齢のC57BL/6雌マウスの感染を行った(Kisielaら、2013)。手短に言うと、細菌をLB培地中で振盪させずに48時間増殖させ、回収し、PBSで2回洗浄して、1mL当たり108コロニー形成単位(CFU)の最終濃度でPBSに再懸濁させた。接種に先立ち細菌を500μg/mLのモノクローナル抗体を用い37℃で1時間、前処置した。マウスにケタミン/キシラジンで麻酔をかけ、PBSに溶解したモノクローナル抗体で前処置した細菌液25マイクロリットルをカテーテルからマウスの膀胱に経尿道的に接種した。24時間後に、マウスを犠牲にして、膀胱を無菌的に摘出し、1mLのPBSでホモジナイズした。段階希釈液を播種し、膀胱当たりの総細菌量を算出した。統計的有意性をマン・ホィットニー両側検定(GraphPad Prismソフトウェア6版、La Jolla,Ca)を用いて決定した。
他で記載のように、10〜11週齢のC57BL/6雌マウスの感染を行った(Kisielaら、2013)。手短に言うと、細菌をLB培地中で振盪させずに48時間増殖させ、回収し、PBSで2回洗浄して、1mL当たり108コロニー形成単位(CFU)の最終濃度でPBSに再懸濁させた。接種に先立ち細菌を500μg/mLのモノクローナル抗体を用い37℃で1時間、前処置した。マウスにケタミン/キシラジンで麻酔をかけ、PBSに溶解したモノクローナル抗体で前処置した細菌液25マイクロリットルをカテーテルからマウスの膀胱に経尿道的に接種した。24時間後に、マウスを犠牲にして、膀胱を無菌的に摘出し、1mLのPBSでホモジナイズした。段階希釈液を播種し、膀胱当たりの総細菌量を算出した。統計的有意性をマン・ホィットニー両側検定(GraphPad Prismソフトウェア6版、La Jolla,Ca)を用いて決定した。
実施例19:受動免疫用の非糖尿病および糖尿病マウスモデル
C57B1/6マウスにおいて糖尿病状態を、腹腔内注射によるストレプトゾトシン(STZ)を用いる4日間の処置によって誘発した。100匹のC57B1/6マウスの群を糖尿病状態について10匹からなる5群および非糖尿病状態について10匹からなる5群にそれぞれ無作為に分けた。各病態の一群に、アジュバント単独(モック)、15μgのLDmutまたは15μgのLDwtを(抗原注射の4週間と1週間前に)皮下に注射し、他の2群に150μgのmAb926またはmAb21を腹腔内注射によって(抗原投与の1日前と1日後に)投与した。イソフルラン麻酔下で尿道内カテーテル留置によってマウスにCFT073 UPEC菌株(各マウスに1×106cfu/50μL)を用いて抗原を投与した。細菌抗原の投与から24時間後に開始し14日間にわたり毎日マウス尿中の細菌量を分析した。ゲノム細菌量は、qPCRによって各尿サンプル(10μL)中で定量化した。データの統計分析は、Generalized Estimating Equationモデル(GEE)(STATAソフトウェア、StataCorp.のxtgeeコマンド、2015、State Statistical Software:リリース14版。College Station,TX:StataCorp LP)を用いて行った。全体的に見て、14日間にわたり100匹のマウスに対して1400回の観察を行った。総計1,400回のうち237回の観察をはずし(尿が提出されてなかった)、以降の分析から除外した。マウスIDは、パネル変数、マウス間で許容される相互作用による予測変数としての処置の種類と日数、結果変数としての大腸菌の計数としてセットした。不等分散性と非線形性を説明するために、対数変換大腸菌計数の分析を行った。log10変換のために、ゼロ計数(大腸菌が検出されなかった)は、値1に置き換えた。糖尿病マウスと非糖尿病マウスに関するデータを別々にフィッティングした。Wald検定を使用して、ナイーブ標準誤差を用いた回帰母数の推論を算出した。糖尿病マウスからの細菌計数について、残差分析は、独立変数からの従属変数の分布の正規性の要求を満たすために本試験から除外した影響力のない外れ値(尿中の大腸菌DNAが時々ないことを表した)の存在を示した。外れ値の除外後、617回(最初の673回から、91.6%)の観察を同じモデルを使用して分析した。
C57B1/6マウスにおいて糖尿病状態を、腹腔内注射によるストレプトゾトシン(STZ)を用いる4日間の処置によって誘発した。100匹のC57B1/6マウスの群を糖尿病状態について10匹からなる5群および非糖尿病状態について10匹からなる5群にそれぞれ無作為に分けた。各病態の一群に、アジュバント単独(モック)、15μgのLDmutまたは15μgのLDwtを(抗原注射の4週間と1週間前に)皮下に注射し、他の2群に150μgのmAb926またはmAb21を腹腔内注射によって(抗原投与の1日前と1日後に)投与した。イソフルラン麻酔下で尿道内カテーテル留置によってマウスにCFT073 UPEC菌株(各マウスに1×106cfu/50μL)を用いて抗原を投与した。細菌抗原の投与から24時間後に開始し14日間にわたり毎日マウス尿中の細菌量を分析した。ゲノム細菌量は、qPCRによって各尿サンプル(10μL)中で定量化した。データの統計分析は、Generalized Estimating Equationモデル(GEE)(STATAソフトウェア、StataCorp.のxtgeeコマンド、2015、State Statistical Software:リリース14版。College Station,TX:StataCorp LP)を用いて行った。全体的に見て、14日間にわたり100匹のマウスに対して1400回の観察を行った。総計1,400回のうち237回の観察をはずし(尿が提出されてなかった)、以降の分析から除外した。マウスIDは、パネル変数、マウス間で許容される相互作用による予測変数としての処置の種類と日数、結果変数としての大腸菌の計数としてセットした。不等分散性と非線形性を説明するために、対数変換大腸菌計数の分析を行った。log10変換のために、ゼロ計数(大腸菌が検出されなかった)は、値1に置き換えた。糖尿病マウスと非糖尿病マウスに関するデータを別々にフィッティングした。Wald検定を使用して、ナイーブ標準誤差を用いた回帰母数の推論を算出した。糖尿病マウスからの細菌計数について、残差分析は、独立変数からの従属変数の分布の正規性の要求を満たすために本試験から除外した影響力のない外れ値(尿中の大腸菌DNAが時々ないことを表した)の存在を示した。外れ値の除外後、617回(最初の673回から、91.6%)の観察を同じモデルを使用して分析した。
実施例20:タンパク質構造のモデリングと可視化
FimHの不活性構造の結合部位にα−D−マンノースを結合させるために、レクチンドメインの結晶構造(残基1〜158、PDBコード:3JWN)をFimHレクチンドメインの高親和性構造(PDBコード:1UWF)上に整列させ、続いて残基1〜6と44〜48のRMSD(平均二乗偏差)の最小化を行った。次いで、1UWF構造に存在するマンノースの座標を用いて、低親和性構造中のLDとリガンドとの間の複合体を作成した。次いで、プログラムCHARMM 13(Brooksら、2009)およびPARAM22力場(MacKerrellら、1998)を使用して、全システムを減圧下での最急降下最小化の100ステップと、誘電連続体における共役勾配最小化の500ステップとにかけた。公開されている構造データ(Bouckaertら、2005;Hungら、2002;Wellensら、2008)に基づいて、マンノース環は、マンノシル化リガンド(すなわち、α−Dマンノース、マンノースまたはオリゴマンノース基質のアルキル誘導体)の性質に関係なく、ポケット内で同じ位置を保持し、水素結合の同じネットワークを作成する。したがって、単純にするために、α−Dマンノースのマンノース環だけをモデル化し、FimH構造で示す。
FimHの不活性構造の結合部位にα−D−マンノースを結合させるために、レクチンドメインの結晶構造(残基1〜158、PDBコード:3JWN)をFimHレクチンドメインの高親和性構造(PDBコード:1UWF)上に整列させ、続いて残基1〜6と44〜48のRMSD(平均二乗偏差)の最小化を行った。次いで、1UWF構造に存在するマンノースの座標を用いて、低親和性構造中のLDとリガンドとの間の複合体を作成した。次いで、プログラムCHARMM 13(Brooksら、2009)およびPARAM22力場(MacKerrellら、1998)を使用して、全システムを減圧下での最急降下最小化の100ステップと、誘電連続体における共役勾配最小化の500ステップとにかけた。公開されている構造データ(Bouckaertら、2005;Hungら、2002;Wellensら、2008)に基づいて、マンノース環は、マンノシル化リガンド(すなわち、α−Dマンノース、マンノースまたはオリゴマンノース基質のアルキル誘導体)の性質に関係なく、ポケット内で同じ位置を保持し、水素結合の同じネットワークを作成する。したがって、単純にするために、α−Dマンノースのマンノース環だけをモデル化し、FimH構造で示す。
IUWF構造において、α−Dマンノースを、本来の結晶構造のマンノース残基の糖環との整列によってモデル化した。モノクローナル抗体エピトープに関連するアミノ酸残基の空間分布および水素結合を形成する原子と、3JWN構造および1UWF構造中のマンノースリガンドとの間の距離を分子可視化ソフトウェアプログラムPyMOL(DeLano Scientific LLC)を使用して測定した。
実施例21:統計分析とデータ分析
すべての値は、特に明記しない限り、平均およびSEMとして表示する。統計有意性は、Prismソフトウェア6.0版(GraphPad,La Jolla,Ca)を用いて両側スチューデント検定によって決定した。
すべての値は、特に明記しない限り、平均およびSEMとして表示する。統計有意性は、Prismソフトウェア6.0版(GraphPad,La Jolla,Ca)を用いて両側スチューデント検定によって決定した。
マンノースの存在下で抗体による受容体占有は以下の式から算出した。
式中、αはマンノースおよび抗体のための協同係数であり、[M]はマンノース濃度であり、KDはその平衡定数である。最強の可能な負の協同性(マンノースと抗体が直接の競合者である場合)の場合、α=0および
である。
マンノースと線毛FimHwtの解離定数が298±50μMであり(Tchesnokovaら、2008)、および抗体結合をマンノースの52mM濃度でテストしたので、競合結合の予想されるEC50比は175±30である。
参考文献
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本出願全体を通して種々の刊行物が参照されている。本発明が関連する技術水準をより完全に記述するために、これらの刊行物のその全体における開示は、参照により本出願に本明細書によって組み込まれている。
前述から、本発明の特定の実施形態が例示目的のために本明細書に記載されているが、種々の修正は本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われることが可能である。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲を除いて、限定されるものではない。
Claims (18)
- 尿路病原性大腸菌(E.coli)線毛アドヘシンFimHを特異的に認識して、結合し、および尿路病原性大腸菌による表面のコロニー形成を防止することができる抗体を含む組成物であって、前記抗体が
(a)配列番号1、配列番号3およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域が、QNVSN (配列番号1の残基27〜31)またはQNIVHNNGNTY(配列番号3の残基27〜37)を含むCDR1配列と、SAS(配列番号1の残基49〜51)またはKVS(配列番号3の残基55〜57)を含むCDR2配列と、QQNSSFPFT(配列番号1の残基88〜96)またはFQGSHVPFT(配列番号3の残基94〜102)を含むCDR3配列とを含む、軽鎖可変領域、および
(b)配列番号2、配列番号4およびこれと少なくとも90%同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が、GYAFSSYW(配列番号2の残基26〜33)またはGYTSTNYW(配列番号4の残基26〜33)を含むCDR1配列と、IYPRDGDT(配列番号2の残基51〜58)またはINPTSGYT(配列番号4の残基51〜58)を含むCDR2配列と、EVGRGFYGMDY(配列番号2の残基97〜107)またはARGVIRDF(配列番号4の残基97〜107)を含むCDR3配列とを含む、重鎖可変領域
を含む組成物。 - 前記抗体が1未満のIC50でマンノース被覆表面への細菌接着を阻害する、請求項1に記載の組成物。
- 前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号1または3と少なくとも95%同一性を有する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号2または4と少なくとも95%同一性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号1、3、5および6からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号2、4、6および8からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号2である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号4である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗体が異種配列をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体誘導体、ベニヤ抗体、二重特異性抗体、抗体誘導体、組換えヒト抗体、キメラ抗体または抗体フラグメントの1つまたは複数である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- キャリアをさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 尿路病原性大腸菌による細胞の感染症を阻害または防止する方法であって、尿路病原性大腸菌に感染した組織に投与し、前記細胞を請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物の有効量と接触させ、それによって前記細胞の感染症を阻害または防止することを含む、方法。
- 必要とする対象において細菌感染症を処置する方法であって、前記対象は尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエに感染しており、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象の細菌感染症を処置することを含む、方法。
- 前記細菌感染症が大腸炎または敗血症である、請求項14に記載の方法。
- 対象において炎症性腸疾患(IBD)を処置または防止する方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象のIBDを処置または防止することを含む、方法。
- 前記投与することが皮下投与、局所投与、経皮投与、静脈内投与、経口投与または結腸内投与による、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエの線毛アドヘシンFimHの結合ポケットからマンノースを移動させる方法であって、前記結合ポケットを請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
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