KR20070067678A - 연결체들 - Google Patents

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Abstract

사이토카인 수용체에 결합할 수 있는 적어도 둘 이상의 도메인을 포함하는 치료적 폴리펩티드. 상기 도메인들은 펩티드 연결체에 의해 연결되고, 상기 연결체는 선택적으로 경직성 알파 나선형 도메인을 포함한다.

Description

연결체들{LINKERS}
본 발명은 사이토카인 수용체(cytokine receptor)에 결합할 수 있는 적어도 둘 이상의 도메인들(domains)을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 도메인들은 펩티드 연결체 분자에 의해 연결된다.
사이토카인과 같은 성장 인자들(growth factors)은 다양한 세포 기능들과 관련된다. 상기 기능들은 예컨대, 면역 시스템의 조절, 에너지 신진대사의 조절, 및 성장과 발육의 조절을 포함한다. 사이토카인은 표적 세포들(target cells)에 있어서 상기 세포 표면에 발현된 수용체를 통해 그 효과를 나타낸다. 사이토카인 수용체는 세 가지 서브 그룹으로 구분될 수 있다. 타입 1(성장 호르몬계(growth hormomne(GH) family)) 수용체는 세포외 도메인(domain)의 아미노말단(amino terminal) 부분에 보존되는 네 개의 시스테인 잔기(residue)와 C-말단 부분에 보존되는 Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser 모티프(motif)의 존재에 의해 특징지어질 수 있다. 상기 시스테인 모티프는 타입 2(인터페론계(interferon family)) 및 타입 3(종양 괴사 인자계(tumour necrosis factor family))에도 존재한다.
많은 사이토카인 도메인들은 특정 자리(specific site)를 통해 그들의 동족 수용체(cognate receptor)와 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다. 일부 사이토카 인 수용체들은 높은 친화력(high affinity)의 도메인 결합 자리와 낮은 친화력(low affinity)의 결합 자리를 갖는다.
예컨대, 단일 분자의 성장호르몬(GH)은 두 개의 수용체 분자들(GHR)과 결합하는 것으로 알려져 있다(Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992; Sundstrom et al., 1996; Clackson et al., 1998). 상기 결합은 성장호르몬(GH)에 있는 두 개의 독특한 수용체-결합 자리와 두 수용체들의 세포외 도메인에 있는 공통 결합 주머니(common binding pocket)를 통해 이루어진다. 성장 호르몬 분자에 있는 자리 1은 자리 2보다 더 높은 친화력을 가지며, 수용체 이합체화물(dimerization)은 제1 수용체와 성장호르몬의 자리 1의 결합과 제2 수용체와 자리 2와의 결합이 연속적으로 이루어짐으로써 형성될 수 있다. 수용체 분자(GHR)의 세포외 도메인은 각각이 대략 100 아미노산들로 이루어진 연결된 두 개의 도메인들로 존재한다. 호르몬과 결합하여 상기 두 개의 도메인들에서의 구조적 변화(conformational change)가 일어나서 삼량체 화합물(trimeric complex) GHR-GH-GHR이 형성된다. GHR-GH-GHR 화합물의 내재화(internalisation)에 이어 수용체 분자가 세포내 사용을 위해 재생되는 리사이클링 단계(recycling step)가 뒤따른다.
사이토카인들 및 다른 도메인들은 종종 결합에 의해 수용체-도메인 화합물을 형성한다. 화합물 형성과 관련된 수용체들은 동종(homogeneous)일 수도 있고, 이종(heterogeneous)일 수도 있다. 예컨대, 에리스로포이에틴(erythropoetin, 적혈구 생성 촉진 인자) 및 성장 호르몬 삼량체인 수용체-호르몬-수용체 화합물을 형성한다. 인터루킨-4(ineterleukin-4)는 삼량체인 수용체-호르몬-다른 수용체 화합물 을 형성한다. 종양 괴사 인자는 세포막 종양 괴사 인자 수용체들(TNF-1/p55 또는 TNF-2/p75)의 동형 타입의 삼량체 형성을 통해 신호를 보낸다. 다른 사이토카인들, 예컨대 렙틴(leptin) 및 GCSF는 사량체(tetrameric)인 수용체-호르몬-호르몬-수용체 화합물들을 형성한다. 다른 사이토 카인들(예컨대, 인터루킨 6)는 두 가용성 수용체 분자들, 두 세포막 수용체 분자들, 및 두 사이토카인 분자들을 포함하는 육량체 화합물들(hexameric complexes)을 형성할 수 있다. 각 경우에 수용체 화합물에서 사이토카인의 자리를 정하는 가장 친화력이 높은 결합 자리와, 형태를 변경시키거나 다른 분자들을 채용하여 시그널링(signalling)을 초기화하는데 부차적인 기능을 수행하는 부가적인 자리들이 있다.
TNF 수퍼계(super family) 사이토카인들은 세포 생존, 종말, 분화를 위해 임파(lymphoid) 조직, 유방(mammary) 조직, 신경(neuronal) 조직, 및 외배엽(ectodermal) 조직의 성장(development), 구조(organization), 및 항상성(homeostasis)을 조절하는 시그널링 경로들을 활성화시킨다. TNF는 지라 세포 분화, 완전한 IgG 응답 및 항체 급의 전환(isotype switching), 대식 세포의 활성화, 질소 산화물 및 반응적인 산소 라디칼의 발생과 같은 숙주 방어(host defence)에 실증된 기능을 가지고 있다. 그러나 TNF는 과잉으로 발현되는 경우 병인(pathogenesis)과 관련될 수 있다. 이에 대한 증거가 박테리아성 패혈증(bacterial sepsis), 이식 조직에 대한 숙주 질병(graft-versus-host disease), 대뇌 말라리아(cerebral malaria), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 원형 탈모증(alopecia areata/generalis), 천식(asthma), 암(cancer), 크론 병(Crohn's disease), 당뇨병(diabetes), 비만(obesity), 건선(psoriasis and psoriatic arthritis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma) 및 독소충격증후군(toxic shock syndrome) 같은 병상들(pathologies)에서 발견되어 왔다. 이러한 병상들은 항-TNF 작용제들(anti-TNF agents)로 사용되는 만성 및/또는 잠재적 병상들로 인식된다.
사이토카인들의 과잉 발현(over-expression)은 예컨대, 말단비대증(acromegaly), 거인증(gigantism), 성장호르몬 결핍(GH deficiency), 터너 증후군(Turners Syndrome), 신장병(renal failure), 골다공증(osteoporosis), 골관절염(osteoarthritis), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 암(caccer), 비만(obesity), 인슐린 저항(insulin resistance), 고지혈증(hyperlipidaemia), 고혈압(hypertension), 빈혈증(anaemia), 자기 면역 질화(autoimmune and infectious disease), 및 류마티즘성 관절염을 포함하는 염증성 장애들(inflammatory disorders including rheumatoid arthritis)과 같은 인간 질병들의 원인이 된다.
사이토카인들 예컨대, 성장 호르몬(GH), 젖분비호르몬(프로락틴) 또는 TNF의 활동을 억제하기 위한 접근법은 길항제(antagonists)의 투여이다.
GH 길항제의 일 예는 페그비소만트(Pegvisomant)이다. 페그비소만트는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅된 변형된 GH 분자이다. 페그비소만트는 예컨대, 증가된 유효 분자량에 기인한 감소된 사구체 여과율을 포함하여 여러 가지 유용한 효과를 갖는다. 감소된 사구체 여과율은 요구되는 효과를 일으키는데 필요한 투여양을 감소시킬 수 있다[Abuchowski et al J Biol Chem., 252, 3578-3581, (1977) 참조]. 그러나, 페그화(pegylation)에 의해 성장 호르몬 수용체(GHR)에 대한 변형된 GH 분자의 친화력이 감소할 수 있다.
프로락틴 길항제의 일 예는 ＷＯ03/057729(상기 프로락틴 길항제를 암호화(encode)하는(encoding) 뉴클레오티드 및 단백질 서열(protein sequence)을 보다 명확하게 보여준다)에 개시된다. 프로락틴 길항제는 위치 129에서 글리신 잔기(glycine residue)가 아르기닌 잔기(arginene residue)로 치환된 인간 프로락틴 아미노산 서열의 변형을 포함한다. 변형된 프로락틴 단밸질은 프로락틴 수용체 활성의 억제제로 기능한다.
TNF를 억제하는 많은 치료 방법이 ⅰ) TNF 합성을 억제할 수 있다는 점(예컨대, 억제 사이토카인들, IL-10, 탈리도마이드(thalidomide), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 시클로스포린 A(cyclosporin A), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides)를 사용함으로써), ⅱ) TNF 프로세싱을 억제할 수 있다는 점(예컨대, 메탈로프로테아제(TACE) 억제제들), ⅲ) TNF를 중화(neutralisation)시킬 수 있다는 점(예컨대, 가용성 TNF 수용체들 또는 TNF에 대한 항체들을 사용함으로써)을 토대로 개발되고 있다.
사이토카인 수용체들의 다중 리간드 결합 도메인들을 포함하는 폴리펩티드들과 수용체가 개재된 사이토카인 활성화의 조절에 있어서 상기 폴리펩티드들의 사용을 설명한다.
본 발명의 실시예들에 따른 폴리펩티드는 사이토카인 수용체와 결합할 수 있는 적어도 두 사이토카인 결합 도메인들을 포함한다. 상기 도메인들은 비유연성 나선형 영역(inflexible helical region)을 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해 연결된다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 상기 사이토카인 수용체(들)의 길항제로 기능할 수 있다. 선택적으로 상기 폴리펩티드는 작용제(agonist)로 기능할 수 있다.
상기 폴리펩티드는 탄뎀 배열(tandem array)에서 상기 도메인들을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 탄뎀 배열에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 도메인들을 포함할 수 있다.
일 실시에에서, 상기 폴리펩티드는 탄뎀 배열에서 10이상의 도메인들을 포함할 수 있다.
상기 비유연성 나선형 영역은 모티프 A(EAAAK)XA 또는 그것의 기능적 변형체(functional variant)의 적어도 하나의 복제(copy)를 포함할 수 있다. 상기 펩티드 연결체 분자는 상기 모티프 EAAAK의 두 복제들을 포함할 수 있다. 상기 펩티드 연결체 분자의 길이는 적어도 하나의 아미노산의 점증적 추가(incremental addition)에 의해 신장될 수 있다.
'기능적 변형체'는 하나 또는 그 이상의 치환들, 추가, 결손(deletion)에 의해 아미노산 서열에서 다를 수 있지만, 실질적으로 나선형 또는 비나선형 구조를 갖는 연결체 분자이다. 바람직한 기능적 변형체들은 종래의 아미노산 치환들에 의해 기준 아미노산 서열(reference amino acid sequence)과 달라질 수 있다. 상기 치환들은 소정의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 바꿀 수 있다. 예를 들어 여기에 열거된 아미노산들에 한정되는 것은 아니며, 치환체들은: a) 알라닌(alanine), 세린(serine), 및 트레오닌(threonine), b) 글루타민산(glutamic acid) 및 아스파르트산(asparatic acid), c) 아스파라긴(asparagine) 및 글루타민(glutamine), d) 아르기닌(arginine), 리신(lysine), 및 히스티딘(histidine), e) 아이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 메티오닌(methionine), 및 발린(valine), f) 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 및 트립토판(tryptophan)과 같은 보존적 치환체들(conservative replacements)일 수 있다. 실질적으로 유연성 또는 비유연성 나선형 연결체 부위(region)를 유지시킬 수 있는 아미노산 치환들이 바람직하다.
일 실시예에서, 연결체 분자는 적어도 하나의 유연성 비나선형 부위(region)를 포함할 수 있다.
비유연성 나선형 부위의 공급은 상기 도메인들의 공간적 분리를 유지시켜주는 반면, 유연성 비나선형 부위는 상기 도메인들이 사이토카인 수용체(들)의 결합 자리들을 향하도록 할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 유연성 비나선형 부위는 펩티드 연결체 분자의 아미노 종단(amino-terminal end)에 위치하거나 그에 가깝게 위치할 수 있다. 이에 의해, 그것의 동종 수용체와 관련하여 상기 펩티드 연결체 분자의 아미노 종단에 위치하는 결합 도메인의 배향(orientation)이 허용될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 유연성 비나선형 부위는 펩티드 연결체 분자의 카르복실 종단(carboxyl-terminal end)에 위치하거나 그에 가깝게 위치할 수 있다. 이에 의해, 그것의 동종 수용체와 관련하여 상기 펩티드 연결체 분자의 카르복실 종단에 위치하는 결합 도메인의 배향(orientation)이 허용될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 유연성 비나선형 부위는 펩티드 연결체 분자의 아미노 및 카르복실 종단(amino and carboxyl-terminal end)에 위치하거나 그에 가깝게 위치할 수 있다. 이에 의해, 그것의 동종 수용체와 관련하여 상기 펩티드 연결체 분자의 아미노 및 카르복실 종단 각각에 위치하는 결합 도메인들의 배향(orientation)이 허용될 수 있다.
상기 유연성 비나선형 부위는 상기 결합 도메인들 중 적어도 어느 하나에 인접하게 위치할 수 있다. 상기 유연성 비나선형 부위는 상기 결합 도메인과 상기 비유연성 나선형 부위 사이의 접합(junction)을 형성할 수 있다.
상기 비유연성 나선형 부위는 상기 모티프 A(EAAAK)XA의 적어도 하나의 복제를 포함할 수 있다. 비유연성 비나선형 부위의 길이는 상기 A(EAAAK)XA 모티프의 반복되는 수를 증가시킴으로써 신장될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 A(EAAAK)XA 모티프에서 X는 10 이하일 수 있다. 상기 X는 5 이하인 것이 바람직하다. 상기 X는 1, 2, 3, 4 또는 5에서 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 엄결성 알파 나선형 연결체들과 상기 결합 도메인들 사이에 유연한 연결은 없지만, 상기 결합 도메인들은 상기 비유연성 알파 나선형 연결체에 의해 직접 연결될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 결합 도메인들은 비유연성 알파 나선을 포함하는 연결체 분자에 의해 연결될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나선형 연결체 분자는 제1 결합 도메인의 상기 카르복실 말단(terminus)을 제2 결합 도메인의 상기 아미노 말단에 연결시킬 수 있다.
상기 실시예에서, 상기 나선형 연결체는 제1 사이토카인 분자의 C-말단 나선과 제2 사이토카인 분자의 N-말단 나선 사이에 연속될 수 있다. 따라서 상기 두 사이토카인 결합 도메인들은 실질적으로 고정된 배향에서 단단하게 연결될 수 있다. 예컨대, 이는 제1 사이토카인 도메인으로부터 짧은 N-말단 및 후-나선형 C-말단 영역의 결손(deletion) 및 제2 사이토카인으로부터 짧은 전-나선형 N-말단 영역의 결손(deletion)을 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 사이토카인의 잔기들 182-190 및 제2 사이토카인의 잔기들 1-5은 제1 사이토카인에서 상기 C-말단 나선(예컨대, 도 1B에서 나선 4) 이후 및 제2 사이토카인에서 N-말단 나선(도 1B에서 나선 1') 이전 임의의 코일 구조의 짧은 영역들일 수 있다.
다른 구조체에서 상기 고정된 배향(병진 및 회전에서)은, 신규 특성들, 예컨대 길항 특성들(antagonistic properties)을 갖는 분자들을 생성하기 위해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 추가적인 아미노산들을 삽입하거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산들을 삭제함으로써, 변경될 수 있다. 여분의 아미노산의 추가에 의해, 상기 두 도메인들의 약 1.5Å정도의 추가적인 상대적인 병진 및 나선축 주위로 약 약 100°로 상기 두 도메인들의 상대적인 회전이 이루어질 수 있다. 전형적으로 연결체들은 두 EAAAK 유닛들로 시작할 수 있고, A, AA, AAA, AAAA, EAAAA, 및 EAAAK 서열의 추가에 의해 길어질 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드의 상기 결합 도메인들은 서로 같거나 유사할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 성장 호르몬(growth hormone), 렙틴(leptin), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 프로락틴(prolactin), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11의 인터루킨들(interleukins,IL)과 IL-12, IL-13, IL-15의 p35 서브유닛, 과립성 백혈구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 과립성 백혈구 대식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 섬모의 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF), 카디오트로핀(cardiotrophin, CT-1), 백혈구 억제 인자(leukocyte inhibitory factor, LIF), 온코스타틴 M(oncostatin M, OSM), 인터페론인 IFNα 및 IFNγ, 종양 괴사 인자인 TNFα, TNFβ, 및 RANK 리간드를 포함하는 그룹에서 선택된 위치카인들의 결합 도메인들을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 도메인들의 적어도 하나는 성장 호르몬 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 성장 호르몬 또는 성장 호르몬 변형체의 적어도 두 결합 도메인을 포함할 수 있다.
변형된 GH 변형체들은 US 5,849,535에 개시된다. 성장 호르몬에서의 변형은 결합 자리인 자리 1과 자리 2에서 모두 이루어질 수 있다. 자리 1에서의 변형은 다른 타입의 GH에 비하여 GHR에 대하여 더 높은 친화력을 갖는 GH 분자를 생성할 수 있다. 이러한 변형된 GH 분자들은 작동제로 기능할 수 있다. 자리 2에서의 변형은 GH 길항제를 생성할 수 있다. 자리 1에서 GH의 결합 친화력을 변경시키는 GH에서의 변형들의 예들은 US 5,854,026, US 6,004,931, US 6,022,931, US 6,057,292 및 US 6,136,563에 개시된다. 자리 2에서의 변형들은 특히 GH내 아미노산 잔기 G120로 설명될 수 있다. 상기 아미노산 잔기 G120은 아르기닌, 리신, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 또는 글루타민산으로 변형될 때 길항적 특성들을 갖는 GH 분자를 생성한다.
본 출원과 동시에 출원중인 ＷＯ03/070765의 내용은 본 명세서에 참조로 포함되며, 거기에는 GH 수용체 활성화에 대하여 길항적 활동을 갖는 GH 변형체(variants)와 GH 수용체의 융합(fusion)이 개시되어 있다. 상기 GH 변형체는 유연성 연결체를 통해 상기 성장 호르몬 수용체의 세포외 영역에 융합될 수 있다. 이러한 키메라 폴리펩티드(chimeric polypeptide)는 지연된 제거율 및 길항적 활동을 보여준다. 비유연성 또는 부분적으로 유연한 연결체를 갖는 유사한 키메라 폴리펩티드의 공급도 여기에 개시되는 본 발명의 범위에 포함된다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 프로락틴 또는 프로락틴 변형체의 적어도 두 결합 도메인들을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 프로락틴 변형체 폴리펩티드는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열은 인간 프로락틴의 위치 129에서 변형된 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 변형은 아미노산 치환일 수 있다. 상기 치환은 글리신 아미노산 잔기를 아르기닌 아미노산 잔기로 바꿀 수 있다. 상기 변경은 적어도 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 아미노 말단 아미노산 잔기들의 결실(deletion)을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드의 상기 결합 도메인들은 서로 다를 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 성장 호르몬 결합 도메인인 제1 결합 도메인과 프로락틴 결합 도메인인 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다.
상기 폴리펩티드는 성장 호르몬 결합 도메인과 프로락틴 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 변형된 성장 호르몬 결합 도메인인 제1 결합 도메인과 변형된 프로락틴 결합 도메인인 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다.
상기 폴리펩티드는 변형된 성장 호르몬 결합 도메인과 변형된 프로락틴 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 변형된 성장 호르몬 결합 도메인은 아미노산 위치 글리신 120에서 아미노산 치환체를 포함할 수 있다. 상기 변형은 글리신 120을 아르기닌, 리신, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌 또는 글루타민산을 포함하는 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환하는 것이다.
일 실시예에서, 상기 변형은 글리신 120을 아르기닌 아미노산 잔기로 치환한 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 변형된 프로락틴 결합 도메인은 글리신 129의 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 아르기닌 아미노산 잔기로 글리신 129를 치환한 것일 수 있다. 상기 변경은 적어도 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 아미노 말단 아미노산 잔기들의 결실(deletion)을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 사이토카인 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다. 상기 수용체는 성장 호르몬 수용체일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 수용체는 상기 수용체는 프로락틴 수용체일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 리간드 결합 도메인은 비유연성 나선형 부위를 포함하는 연결체에 의해 상기 사이토카인 결합 도메인에 연결될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 핵산 분자(nucleic acid molecule)는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화(encode)한다.
일 실시예에서, 상기 핵산 분자는 상기 폴리펩티드의 형질 발현에 적응된(adapted) 벡터이다.
상기 적응(adaptation)은 세포/조직의 특유한 형질 발현을 조정하는 전사 제어 서열들(프로모터 서열들)의 공급을 포함할 수 있다. 상기 프로모터 서열들은 세포/조직에 대한 특이성(specific), 세포/조직 유도성(inducible), 또는 세포/조직 구조성(constitutive)을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 프로모터는 명확성을 위해 다음 예(example)가 제공하는 특징들을 포함하는 용어로 사용된다. 인핸서 요소들(enhancer elements)은 흔히 유전자의 전사 시작 자리에서 5'로 발견되는 시스 작용(cis acting) 핵산 서열들일 수 있다(인핸서들은 또한 유전자 서열에서 3'으로 발견될 수도 있고, 또는 인트론 서열들내에 위치할 수도 있어, 위치에 독립적이다). 인핸서들은 상기 인핸서가 연결된 유전자의 전사 속도를 증가시키는 기능을 한다. 인핸서 활동은 인핸서 요소들과 결합하는 트랜스 작용 전사 인자들(trans acting transcription factors)(폴리펩티드들)에 응답할 수 있다. 전사 인자들의 결합/활동(Eukaryotic Transcription Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego 참조)은 예컨대, 글루코스(glucose)와 같은 중간 대사 산물들, 열과 같은 환경 작동자들(effectors)을 포함하는 많은 환경 신호들에 응답할 수 있다.
프로모터 요소들은 전사 시작 자리를 선택하는 기능을 하는 소위 TATA 박스(box) 및 RNA 폴리머라제 시작 선택(RNA polymerase initiation selection, RIS) 서열들을 포함할 수 있다. 상기 서열들은 RNA 폴리머라제에 의한 전사 시작 선택을 용이하게 하는 기능을 하는 폴리펩티드와 결합할 수 있다.
적응들(adaptations)은 진핵 세포 또는 원핵 세포 내 상기 벡터의 유지를 용이하게 하는 선택가능한 마커들(selectable markers)과 자율 복제 서열들의 공급을 포함할 수 있다. 자율적으로 유지되는 벡터들은 에피솜 벡터들(episomal vectors)로 호칭될 수 있다.
벡터 암호화된 유전자들의 형질 발현을 용이하게 하는 적응들은 전사 종결/폴리아데닐레이션(polyadenylation) 서열들의 공급을 포함할 수 있다. 상기 적응들은 바이시스트론 또는 멀티-시스트론 형질 발현 카세트들(bicistronic or multi-cistronic expression cassettes) 내에 배열된 벡터 암호화된 유전자들의 형질 발현을 최대화하는 기능을 하는 내부 리보솜 엔트리 자리들(internal ribosome entry sites, IRES)의 공급을 포함할 수 있다.
상기 적응들은 동종 기술 분양에서 널리 알려져 있다. 형질 발현 벡터 구조와 재조합 DNA 기술들에 대하여 간행된 서적들이 있다(Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY and references therein; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol Ⅲ IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994) 참조).
본 발명에 따른 벡터들은 유전자 치료 벡터들일 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 유전자 치료 벡터들은 바이러스를 기본으로 한다. 많은 바이러스들은 외인성 유전자들(exogenous genes)의 운반용 벡터들로 사용된다. 일반적으로 사용되는 벡터들은 재조합으로 변경된 외피보유(enveloped) 또는 외피미보유(non-enveloped) DNA 및 RNA 바이러스들, 바람직하게는 바큘로비리디애(baculoviridiae), 파보비리디애(parvoviridiae), 피코노비리디애(picornoviridiae), 허피스베리디애(herpesveridiae), 폭스비리디애(poxviridae), 아데노비리디애(adenoviridiae)로부터 선택된 바이러스들을 포함할 수 있다. 키메라 벡터들은 모벡터 특성들(parent vector properties)의 장점들을 이용하도록 사용될 수 있다(Feng, et al.(1997) Nature Biotechnology 15:866-870 참조). 상기 바이러스성 벡터들은 와일드-타입(wild-type)일 수 있고, 재조합 DNA 기술에 의해 변경되어 불완전 복제(replication deficient), 조건 복제(conditionally replicating), 또는 완전 복제(replication competent)된 것일 수 있다.
벡터들은 아데노바이러스(adenoviral), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated viral) 및 RNA 종양 바이러스(retroviral) 게놈들(genomes)로부터 유도될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 벡터들은 인간의 아데노바이러스 게놈으로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는 상기 벡터들은 인간의 아데노바이러스 세로타입들(serotypes) 2 또는 5로부터 유도될 수 있다. 상기 벡터들의 복제 능력은 E1a 및/또는 E1b 코딩 영역들(coding regions) 내의 변경(modifications) 및 삭제(deletions)에 의해 약화(불완전 복제(replication deficient)로 고려되는 점까지)될 수 있다. 특별한 형질 발현 특성을 획득하거나, 반복 투여(repeat administration)를 허용하거나, 면역 반응(immune response)을 낮추기 위해 상기 바이러스 게놈은 다른 변경들을 포함할 수 있다.
상기 바이러스 벡터들은 조건 복제(conditionally replicating), 또는 완전 복제(replication competent)된 것일 수 있다. 조건 복제된 바이러스 벡터들은 특별한 세표 타입들에서 선택 형질 발현을 획득하도록 사용될 수 있다. 한편, 조건 복제된 바이러스 벡터들은 부적당한 넓은 스펙트럼 감염을 피할 수 있다. 조건 복제된 벡터들의 예들이 문헌(Pennisi, E.(1996) Science 274:342-343; Russell, and S.J.(1994) Eur. J. of Cancer 30A(8):1165-1171 참조)에 개시되어 있다. 선택적 복제 벡터들은 상기 바이러스 복제에 필요한 유전자가 프로모터에 의해 조절되는 상기 벡터들을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 특정 세포 타입 또는 세포 상태에서만 활동하므로 상기 유전자의 형질 발현이 존재하지 않으면 상기 바이러스는 복제되지 않을 것이다. 상기 벡터들의 예들이 문헌(Henderson, et al., United States Patent No. 5,698,443 issued December 16, 1997 and Henderson, et al., United States Patent No. 5,871,726 issued February 16, 1997)에 개시되어 있다.
바이러스 게놈은 특정 조건들에서만 복제 또는 형질 발현을 획득할 수 있는 유도성 프로모터들을 포함하도록 변경될 수 있다. 유도성 프로모터들의 예들이 과학 문헌(Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al.(1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al.(1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; and Dreher, et al.(1997) J. Biol. Chem 272(46);29364-29371 등 참조)에 개시되어 있다.
벡터들은 비바이러스성(non-viral)일 수 있고, 당업자가 많이 사용하고 있는 자원들(sources)로부터 손쉽게 구해질 수 있다. 예컨대, 상기 벡터들은 플라스미드들(plasmids)일 수 있고, 상기 플라스미드들은 에피솜(episome)일 수도 있고, 통합된(integrating) 것일 수도 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 세포는 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터로 변형 또는 감염된다.
일 실시예에서, 상기 세포는 진핵 세포일 수 있다.
상기 진핵 세포는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 피치아종(Pichia spp)과 같은 균성 세포(fungal cell); 딕티오스텔리움종(Dictyostelium spp)과 같은 동균류(slime mold); 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda)와 같은 곤충 세포(insect cell), 식물 세포(plant cell); 또는 CHO 세포와 같은 포유류 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세포는 원핵 세포일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 폴리펩티드 조제 방법은 ⅰ) 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조에 적당한 조건에서 세포를 성장시키는 단계, 및 ⅱ) 상기 세포 및 그 성장 환경으로부터 상기 폴리펩티드를 분리시키는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 친화 태그(affinity tag)를 가질 수 있다.
친화 태그들은 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein), 글루타티온 S 트랜스퍼라제(glutathione S transferase), 칼모둘린 결합 단백질(calmodulin binding protein), 그리고 매트릭스를 포함하는 니켈 상에 진화 정제(affinity purification)에 의해 정제된 단백질들에 삽입되는 폴리히스티딘(polyhistidine) 트랙들의 조작을 포함한다. 많은 경우에 있어서, 상업적으로 이용가능한 벡터들 및/또는 킷들(kits)은 형질 발현과 친화 매트릭스 상의 일련의 추출 및 정제를 위해 숙주 세포(host cell) 내로 감염되는 적절한 친화 태그에 관심 단백질을 융합시키는데 사용될 수 있다.
ＷＯ03/034275에서, 폴리펩티드에 GPI(glycosylphosphatidylinositol)의 부가를 지시하는 신호 서열(signal sequence)을 포함하는 도메인을 이용하는 폴리펩티드를 위한 새로운 친화 태그가 개시되어 있다. GPI 태그를 포함하는 폴리펩티드는 지질막(lipid membranes)으로 삽입될 수 있고, 사이토카인 수용체 활성화에 길항적 효과를 가질 수 있다. 따라서 본 발명은 부착된 GPI 분자를 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 폴리펩티드는 제2 사이토카인 결합 도메인에 연결된 제1 사이토카인 결합 도메인을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 사이토카인 수용체의 세포외 도메인을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인들은 유연성 연결체 분자에 의해 연결될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인들은 비유연성 나선형 부위를 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해 연결될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인들은 비유연성 나선형 부위 및 유연성 비나선형 부위를 포함하는 펩티드 열결체 분자에 의해 연결될 수 있다.
전술한 비유연성 나선형 부위들 및 비유연성 나선형 부위들과 유연성 비나선형 부위들의 조합들(combinations)을 포함하는 펩티드 연결체들이 전술한 사이토카인들 및 사이토카인 수용체들과 마찬가지로 본 실시예에 적용될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 사이토카인 수용체의 상기 세포외 도메인은 연결체 분자에 의해 상기 제1 또는 제2 사이토카인 결합 도메인들에 연결될 수 있다. 상기 연결체 분자는 비유연성 나선형 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 연결체 분자(linker molecule )는 유연하다.
바람직하게는, 상기 연결 분자는 유연하지 않은(비유연성) 나선형 부위(region) 그리고 유연하고 나선형이 아닌(비나선형) 부위를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 사이토카인(cytokine) 결합 도메인(binding domain)은 성장 호르몬 또는 상기 성장 호르몬의 변형체이고, 상기 세포외 도메인(extracelluar domain )은 성장 호르몬 세포외 도메인이다. 바람직하게는, 상기 도메인들은 인간이다.
본 발명의 상기 폴리펩티드(polypeptide)는 이중 기능성(dual functionality)을 나타낼 수 있다. 첫째, 바람직하게는 비유연성 나선형 부위를 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해 연결되는 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 부분들을 포함하는 상기 제1 및 제2 도메인들은 셀 표면 사이토카인 수용체(receptor)들에 연결될 수 있고 입체구조적으로 상기 수용체들이 수용체 복합체들로 결합하는 것을 간섭하여, 결과적으로 하향식 셀 신호전달(downstream cell signalling )을 막을 수 있다. 둘째, 사이토카인 수용체들 또는 상기 사이토카인의 부분들을 포함하는 제3 도메인의 제공은 용해성의 수용체로써 기능할 수 있어, 상기 사이토카인이 상기 셀 표면 수용체에 연결되기 전에 어떤 사이토카인이든 결찰할 수 있다. 상기 제3 도메인은 바람직하게 비유연성 나선형 부위를 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해 상기 제1 또는 제2 도메인에 연결된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 제3 도메인은 바람직하게 유연성 비나선형 도메인을 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해 상기 제1 또는 제2 도메인에 연결된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩티드 연결체 분자는 단백질 용해성 분해(proteolytic cleavage)에 민감한 아미노산 서열(sequence)을 더 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 약제학적(pharmaceutical) 용도로써 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 사용하는 것이 제공된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 바람직하게, 상기 약제학적 조성물은 운반체(carrier), 부형제(excipient) 및/또는 희석액을 포함한다. 투여될 때, 본 발명의 상기 치료(therapeutic) 조성물들은 약제학적으로 허용된 조제에 따라 투여된다. '약제학적으로 허용된' 이라는 문구는 상기 활성 성분들의 생물학적 활성의 효과와 간섭하지 않는 무독성의(non-toxic) 물질을 의미한다. 상기 조제들은 관례적으로 염(salt), 완충제(buffering agent), 양립가능한 운반체(compatible carrier), 보존제 및 선택적으로 다른 치료제(therapeutic agent)들을 포함할 수 있다.
의학적으로 사용될 때, 상기 염들은 약제학적으로 허용할만해야 하나, 약제학적 이외에서 허용할만한 염들은 약제학적으로 타당한 염들을 조제하기 위해 편리하게 사용될 수 있고, 본 발명의 범위에서 배제되지 않는다. 약리학적으로, 약제학적으로 허용할만한 염들은 다음의 산들로부터 조제되나 이에 제한되지 않는다: 염산(hydrochloric acid), 브롬화수소산(hydrobromic acid), 황산(sulfuric acid), 질산(nitric acid), 인산(phosphoric acid), 말레산(maleic acid), 아세트산(acetic aicd), 살리실산(salicylic acid), 구연산(citric acid), 포름산(formic aicd), 말론산(malonic acid), 호박산(succinic acid), 및 이와 유사한 산. 또한, 약제학적으로 허용할만한 염들은 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염과 같은 알칼리금속 또는 알칼리토류염으로써 조제될 수 있다.
상기 약제학적 조성물들은 염 내의 아세트산(acetic acid in a salt), 염 내의 구연산(citric acid in a salt), 염 내의 붕산(boric acid in a salt) 및 염 내의 인산(phosphoric acid in a salt )을 포함하는 적당한 완충제들을 포함할 수 있다.
만약 원한다면, 상기 조성물들은, 약제학적으로 허용할만한 운반체와 결합할 수 있다. 여기서 사용된 상기 "약제학적으로 허용할만한 운반체"라는 문구는 인체에 투여하기 적당한 하나 또는 그 이상의 양립가능한 고체 또는 액체 필터들, 희석액들 또는 캡슐제(encapsulating substance)들을 의미한다. 상기 "운반체"라는 단어는 활성 성분이 응용을 촉진하기 위해 결합하는 유기 또는 무기 성분, 천연의 또는 합성의 물질을 나타낸다. 원하는 약제학적 효율을 실질적으로 약화시키는 상호작용 없이, 상기 약제학적 조성물들의 성분들은 또한 본 발명의 상기 분자들과 혼합될 수 있고 상기 성분들 서로 혼합될 수 있다.
상기 약제학적 조성물들은 단위 투여량 형태(unit dosage form )로 편리하게 준비될 수 있고 약학분야에서 잘 알려진 어떤 방법들에 의해서 조제될 수 있다. 모든 방법들은, 활성제(active agent)를 하나 또는 그 이상의 보조 성분(accessory ingredient)들을 구성하는 운반체와의 결합으로 보내는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물들은 균일하고 친밀하게 상기 액체 운반체, 미세하게 분할된 고체 운반체 또는 상기 모두와의 결합하도록 상기 활성 화합물을 제공하는 것에 의해 조제되고, 필요하다면, 상기 결과물을 성형(shaping)하는 것에 의해 제조된다.
상기 약제학적 조성물들은 또한 선택적으로 다음과 같은 적당한 보존제들을 포함할 수 있다: 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride); 클로로부탄올(chlorobutanol); 파라벤(parabens) 및 티메로살(thimerosal).
본 발명의 상기 약제학적 조성물들은 주사(injection) 또는 시간에 따른 점진적인 주입(infusion )을 포함하는 어떤 통상적인 방식에 의해 투여될 수 있다. 상기 투여는 예컨대, 경구 투여형(oral), 정맥주사형(intravenous), intraperitoneal(복강내 투여형), 근육내 투여형(intramuscular), 강내 투여형(intracavity), 피하 투하형(subcutaneous) 또는 경피 투여형(transdermal)일 수 있다.
경구 투여에 적당한 조성물들은 각각 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함하는 캡슐(capsules), 알약(tablets), 함당 정제lozenges)과 같은 분리된 단위들로써 존재할 수 있다. 다른 조성물들은 수용성 액체(aqueous liquids) 또는 시럽(syrup), 엘릭시르(elixir) 또는 유제(emulsion)과 같은 비수용성 액체에 현탁액(suspensions )을 포함한다.
본 발명의 상기 조성물들은 유효량으로 투여된다. 상기 "유효량"이란, 원하는 결과를 나타내는 조성물의 양 혹은 그 이상의 양을 나타낸다. 암과 같은 특정 질병을 치료하는 경우, 상기 원하는 결과는 상기 질병의 진전을 억제하는 것이다. 상기 억제는 단지 상기 질병을 일시적으로 느리게 하는 것을 포함할 수 있고, 더 바람직하게는, 상기 질병의 진전을 영구적으로 정지시키는 것을 포함할 수 있다. 이는 일반적인 방법에 의해 모니터될 수 있다.
이러한 양은 물론, 치료되는 특정 질병 상태, 상태의 경중도, 나이, 신체조건, 크기 및 무게와 같은 개개인의 환자 인자, 치료 기간, (있는 경우) 현재 시행중인 치료의 성격(있는 경우), 특정 투여 경로 및 당업자가 알 수 있는 기타 인자들에 의존할 수 있다. 이런 인자들은 그 기술이 속하는 부분의 통상의 지식을 가진자에게 잘 알려진 것이고, 더 이상의 설명 없이도 이해될 수 있다. 일반적으로, 각각의 성분들 또는 이들 화합물의 최대 투여량이 사용되는 것이 바람직하고, 즉, 안전한 의학적 판단에 따른 최대 안전한 투여량이다. 이는 본 발명이 속한 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해될 수 있으나, 환자는 의학적인 이유, 심리적인 이유 또는 다른 이유로 적은 투여량 또는 참을 수 있는 투여량을 주장할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 말단 비대증(acromegaly); 거인증(gigantism); GH 결핍; 터너 증후군(Turners Syndrome); 신부전증(renal failure); 골다공증(osteoporosis); 골관절염(osteoarthritis); 진성 당뇨병(diabetes mellitus); 암(cancer) (예컨대, 전립선암(prostate cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 유방암(breast cancer), 흑색종암(melanoma), 간암(hepatoma), 신장암(renal cancer), 신경아교종(glioma), 방광암(bladder cancer), 폐암(lung cancer), 신경계암(neural cancer), 난소암(ovarian cancer), 고환암(testicular cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 림프종(lymphoma)); 비만(obesity); 일슐린 저항(insulin resistance); 고지혈증(hyperlipidaemia); 고혈압(hypertension); 빈혈(anemia); 자기면역성 및 전염성의 병(autoimmune and infectious disease); 류마티스성 관절염을 포함하는 염증성 장애를 포함하는 그룹에서 선택된 질병의 치료를 위한 의약의 생산을 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 사용이 제공된다.
본 발명은 또한 인간 또는 동물 대상을 치료하는 방법을 위해, 폴리펩티드, 핵산 분자, 약제학적 조성물 또는 의약의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것을 제공한다.
본 명세서의 발명의 상세한 설명 및 청구범위를 통해, 단어들 "포함하다(comprise)" 및 "함유하다(contain)" 그리고, 상기 단어들의 변형들은, 예컨대 "포함하는(comprising)" 및 "포함한다(comprises)"라는 것은 "열거된 것을 포함하나 열거된 것에 제한되지 않는"을 의미하고, 다른 모이어티들(moieties), 부가(additives), 구성요소(components), 완전체(integers) 또는 단계(steps)를 배제할 의도는 아니다.
본 명세서의 발명의 상세한 설명 및 청구범위를 통해, 단수는 문맥상 달리 요구하지 않다면 복수를 포함한다. 특히, 부정 관사가 사용된 곳에서, 만약 문맥이 다른 의미를 필요로 하지 않는다면, 명세서는 단수뿐만 아니라 복수를 의도하는 것으로써 이해될 수 있다.
본 발명의 특정 양상, 실시예 또는 예시에서 묘사된 특징(Features), 완전체(integers), 특성(characteristics), 화합물(compounds), 화학적 모이티(chemical moieties) 또는 그룹(groups)은 만약 이들과 양립할 수 없는 것이 아니라면 어떤 다른 양상(aspect), 실시예(embodiment) 또는 예시(example)로 응용될 수 있도록 이해될 수 있다.
도 1A. 사이토카인 도메인들(타원체들)은 알파 나선(음영진 사각형)에 의해 연결된다. 유연한 연결체들(굽은 화살표들)은 제1 사이토카인 도메인을 나선에 연결하고 상기 나선을 제2 사이토카인 도메인에 연결한다; 도 1B. 상기 사이토카인 도메인들은 알파 나선에 의해 연결된다. 유연한 연결체들은 제1 사이토카인 도메인을 나선형의 연결체에 연결하고 나선형의 연결체를 제2 사이토카인 도메인에 연결한다.
도 2. 상기 나선형의 연결체는 유연한 연결부분을 갖지 않는다 - 대신에 상기 나선형의 연결체는 사이토카인1의 C-말단 나선(4)에서 연속하여 그것을 사이토카2의 N-말단 나선(1')에 연결시켜 단일의 긴 나선 4-연결체 나선-1' 에 의해 연결된 경직성 탄뎀을 형성한다. 따라서 상기 2개의 사이토카인 도메인들의 상대적인 배향(orientation)은 고정된다. 그러나, 상기 연결체로부터 아미노산을 제거하거나 부가하는 것에 의해 다른 구조체를 만듦으로써 상기 도메인들이 다른 배향이 되는 일련의 경직성 탄뎀들을 생성하는 것이 가능하다.
도 3은 구조체 χ1Clb의 지도 및 뉴클레오티드/아미노산 서열을 도시한다.
도 4는 유연한 종단을 갖는 나선형의 연결체를 포함하는 탄뎀을 생성하기 위 해 사용된 프라이머들 및 연결체 디자인의 개관도이다.
도 5는 A) 도메인들 사이의 연속된 나선형의 연결체를 생산하기 위한 프라이머 듀플렉스의 접합을 위한 연결체 및 GH 도메인들 사이의 경계 부위들의 디자인을 도시한다. B) 프라이머들은 χ1C5를 생성하기 위해 χ1Clb를 변형하기 위해 사용되었다.
도 6은 연결체 부위의 서열 및 구조체 χ1C5의 지도를 도시한다.
도 7은 경직성 나선형의 연결체들을 갖는 탄뎀들을 생성하기 위해 사용된 프라이머들 및 연결체 디자인의 개관도를 도시한다.
도 8은 χ1Ll의 형성을 위한 방법을 나타낸 개략도이다.
도 9는 χ1Ll의 뉴클리오티드 서열을 도시하고, GH 도메인들은 회색으로 보여지고, GHR 도메인은 굵은 글씨로, 연결체들은 밑줄쳐져 나타낸다.
도 10은 χ1Ll의 아미노산 서열을 도시하고, GH 도메인들은 회색으로, GHR 도메인은 굵은 글씨로, 연결체들은 밑줄쳐서 나타낸다.
도 11은 χ1Ll의 구조체를 위한 복제 방법을 나타낸 개략도이다.
도 12는 χ1Ll의 발현을 도시한다.
도 13은 χ1Ll-His의 예비 정제를 도시하고, χ1Ll-His는 Co2 +- 칼럼을 이용하여 정제되었다.
도 14는 χ1Ll이 효현 활성(agonistic activity)을 보이는 것을 도시한다.
도 15는 경직성 또는 반-경직성 GH 구조체들에 관한 명명법을 요약한다.
도 16은 a) 반-경직성 연결체 서열을 포함하는 GH 탄뎀의 핵산 서열; b) 반-경직성 연결체 서열을 포함하는 GH 탄뎀의 아미노산 서열; c) GH 탄뎀의 구조체에 사용된 반-경직성 연결체의 예시; d) 반-경직성 연결체를 포함하는 CH 탄뎀의 박테리아 발현; 및 e) 반-경직성 연결체를 포함하는 GH 탄뎀의 생물학적 활성도를 도시한다.
도 17은 a) 경직성 연결체 서열을 포함하는 GH 탄뎀의 핵산 서열; b) 경직성연결체 서열을 포함하는 GH 탄뎀의 아미노산 서열; c) GH 탄뎀의 구조체에 사용된 경직성 연결체의 예시; d) 경직성 연결체를 포함하는 GH 탄뎀의 박테리아 발현; 및 e) 경직성 연결체를 포함하는 GH 탄뎀의 생물학적 활성도를 도시한다.
도 18A는 TlcEAK2+3his의 정제 및 쿠마시 염색(coomassie staining) 및 웨스턴 블로트(western blot)에 의한 분석을 도시한다.
도 18B 및 18C는 TlcEAK2+3his의 생물학적 활성도를 도시한다.
도 18D는 TlcEAK2+4his의 정제 및 쿠마시 염색 및 웨스턴 블로트에 의한 분석을 도시한다.
도 18E 및 18F는 TlcEAK2+4his의 생물학적 활성도를 도시한다.
도 19는 성장 호르몬 탄뎀의 검출을 위한 효소면역측정법(ELISA)를 도시한다.
도 20은 유연한 연결체, 반-경직성 연결체 및 경직성 연결체에 의해 연결된 성장 호르몬 탄뎀들의 개략도이다.
도 21은 젖분비호르몬(PRL), 성장 호르몬(GH) 및 이들의 대항성 돌연변이(antagonistic mutant)의 가능한 결합의 예시들을 도시한다.
도 22는 젖분비호르몬의 뉴클리오티드 및 아미노산 서열 및 이들의 대항성 형태(antagonistic forms) 중 하나인 1-14 아미노산이 절단된 G129R 돌연변이(밑줄)를 도시한다.
도 23은 성장 호르몬의 뉴클리오티드 및 아미노산 서열 및 이들의 대항성 형태인 G120R 돌연변이(밑줄)를 도시한다.
도 24는 젖분비호르몬 탄뎀의 개략도이다.
도 25는 (A) 이웃하는 도메인들의 말단 나선들에 직접적으로 연결체들을 연결하도록하고 연결체의 변형을 촉진하도록 조작된 제한 자리들인 NotI 및 NruI를 포함하는 GH 경직성-탄뎀 구조체들(GH rigid-tandem constructs)의 개략도, (B) NotI 자리는 연결체 부위에 있고 도메인 A에 있는 끝이 잘린(truncated) 젖분비호르몬(PRL) 유전자에 연결될 수 있으며, (A)에서와 유사한 기능을 갖도록 조작된 제한 자리들 NotI 및 NruI를 포함하는 젖분비호르몬-연결체-성장호르몬(PRL-linker-GH) 경직성 구조체의 개략도, (C) 탄뎀 유전자의 쉬운 합성 및 변형이 가능하도록 도메인 B 내의 연결체 및 젖분비호르몬 사이의 경계에서, 축퇴성 아미노산 코드(degenerate amino acid code)를 이용하여, 특이한 제한 자리가 설계되는 것이 필요한, 젖분비호르몬 경직성 탄뎀의 개략도이다.
물질 및 방법
도 3을 참조하면, GH 탄뎀(tandem)상의 연결체(linker)의 변형은, 발현된 단 백질의 N-말단(N-terminus)으로부터 30 아미노산 과잉(overhang)을 제거하기 위해 변형된 GH-(G4S)-GH 분자(χCl)를 위한 유전자로부터 개시되고, 상기 유전자는 또한 변형된 pET21(+) 벡터로 부차복제(subclone)되어 pET21:χClb가 형성되었다.
유연한 종단(end)들을 가지는 나선형의 연결체(linker)들을 갖는 구조체 (construct)들을 위해, 상보형의 올리고뉴클리오티드(oligonucleotide)들을 함께 결찰함으로써, 연결체(linker)는 구성되었다. 상기 올리고뉴클리오티드들은 원하는 연결체를 인코드(encode)하기 위해서 디자인되었고 NotI 및 EcoRI 으로 침지(digest)되어 벡터 pET21:χ1Clb로 결찰되는(ligate) 종단을 갖도록 디자인되었다. 상기 연결체들의 개관도가 도 4에 도시된다.
상기 GH 도메인들 사이의 경직성 연결체를 위해, 상기 GH 도메인들은 그들의 C 말단(C-terminus)(GH1) 및 N 말단(N-terminus)(GH2)을 절단하도록 변형되어야한다. 결과적으로, 상기 도메인들은 상기 나선들의 끝에서 종결된다. 도 5a를 참조하면, 이후 축퇴성 코돈 용법을 사용하여 제한 자리들이 디자인되었는 데, 이는 상기 2개의 도메인들 사이에 형성되어야할 상기 나선에 대한 어떤 방해 없이 새로운 연결체들이 도입될 수 있도록 한다. 도 5b를 참조하면, 상기 GH 탄뎀(tandem)의 GH 도메인들에 상기 변형들이 수행되도록 프라이머(primer)들은 디자인되었다. 도 6을 참조하면, 상기 결과 구조물은 χ1C5로 지정되었다. 상보형의 올리고뉴클리오티드들은 그 측면들에 NotI 및 NruI 자리들이 위치하는 연결체 부위를 형성하기 위해 사용되었다. 이후, 이들은 NotI 및 NruI로 침지되어 pET21 :χ1C5와 연결되었다. 상기 연결체들의 개관도가 도 6에 도시된다.
상기 구조체들의 발현(Expression)은 상기 pET 발현 벡터을 상기 발현 세포주(strain) E. coli BL21(DE3) CodonPlus RJPL로의 제1 변환(transforming)에 의해 수행될 것이다. 발현은 다른 배양(incubation) 온도(예를 들어 실온, 37 0C), 다른 배지(medium)(예를 들어 LB, 2YT, 5YT, etc.), 다른 유도(induction) 지점(즉, 배양이 유발되는 OD600), 배양을 유도하기 위해 사용된 다른 EPTG 농도(또는 다른 유도체(inducer)), 그리고 상기 셀들이 유도 후 얻어지는 시간을 포함하는 수많은 조건하에서 수행될 수 있다.
(Ni + or Co2 + 컬럼을 사용하는) 고정성 금속-이온 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 정제(purification)를 촉진할 구조체의 C 말단에 히스-태그(His-tag)가 부가될 수 있다. 히스태그(His-tag)를 갖지 않는 구조체들은 이온교환크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 컬럼(hydrophobic columns) 및 크기배재크로마토그래피(size- exclusion chromatography)와 같은 다양한 수단에 의해 정제될 수 있다. 상기 정제 기술들 중 하나 또는 그 이상의 방법이 적당한 순도의 단백질을 얻기 위해 필요할 수 있다.
χ lC5 의 형성(construction of χ lC5 )
변형된 GH 도메인들은 PCR 및 적절한 프라이머들을 이용하여 생산되었다. GHl은 DiGHNcoGF 및 GH[AEA3]NotR을 이용하여 변형되었다. GH2는 EcoI-(Nru)GH-F and GHΔ*-HR을 이용하여 변형되었다. 상기 PCR 반응들은 lμl lOOpmol/μl 순방향 프라이머(forward primer), lμl lOOpmol/μl 역방향 프라이머(reverse primer), lμl pTrcHisGHstop (dilute), lμl 1OmM dNTPs, 5μl 1Ox 증폭 버퍼(amplification buffer), lμl 5OmM MgSO4, 0.5μl Pfx 중합효소(polymerase), 39.5μl 멸균수(sterile water) 로 이루어진다. PCR은 상기 반응 혼합물들 상에서 다음의 온도 조건하에서 수행되었다; 95 0C에서 5min; 15 x (95 ℃ 에서 45sec, 55 ℃ 에서 45sec, 72 ℃ 에서 45sec); 72 0C 에서 5min. 상기 PCR 생성물들은 한천 겔(agarose gel) 및 정제된 원하는 PCR 생성물을 이용하여 확인되었다. 변형된 GHl은, pET21 :χC4를 형성하기 위해, NcoI 및 NotI 자리들 사이에서 pET21 :χClb 에 결찰되었다. 변형된 GH2는 pET21:χC5를 형성하기 위해 EcoRI and HindIII 사이에서 pETT21:χ1C4 에 결찰되었다. 본 프로세스의 개관도가 도 8에 도시된다.
연결체 변형(linker variaton )
프라이머들의 인산화( Phosphorylation of Primers)
2개 또는 그 이상의 프라이머 듀플렉스(duplexe)들이 상기 연결체를 형성하기 위해 필요할 때, 내부 5'-종단(internal 5 '-end)을 포함하는 상기 프라이머들이 첫 번째로 인산화되었다. 2μl lOOpmol/μl 올리고뉴클레오티드들, 2μl 1Ox 키나아제 버퍼(Kinase Buffer), 2μl 1OmM ATP, 13μl 멸균수(sterile water), lμl T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(polynucleotide kinase) (lOU/μl)의 반응 혼합은 인산화될 각각의 프라이머를 위해 만들어졌다. 이들은 30분 동안 37 0C에서 배양된 후 70 0C에서 lO분 동안 배양되었다. 샘플들은 이후, 어닐링 버퍼(Annealing Buffer)(1OmM TRIS, 5OmM NaCl, ImM EDTA, pH 7.5-8.0)를 이용하여 0. lpmol/μl용액을 얻기 위해 1:10으로 희석되었다. 이들은 이후, 하기의 어닐링 반응에서 사용될 수 있다.
프라이머 듀플렉스들의 어닐링 (Annealing of the Primer Duplexes)
상기 프라이머들은 어닐링 버퍼(Annealing Buffer)(1OmM TRIS, 5OmM NaCl, ImM EDTA, pH 7.5-8.0)를 이용하여 0. lpmol/μl로 희석되었다. lOμl의 상보형의 프라이머들이 새로운 튜브에서 혼합되었다. 상기 튜브는 이후, 95 0C 에서 2min 동안 배향되었고, 상기 온도는 30 0C까지 40-60min에 걸쳐 떨어지도록 방치되었다. 하나 이상의 프라이머 듀플렉스가 필요한 경우, 동일 부피의 상기 프라이머 듀플렉스들이 원하는 연결체를 형성하기 위해 필요한 모든 프라이머 듀플렉스들을 포함하는 용액을 제공하기 위해 혼합되었다. 상기 용액은 이후, 얼음에 방치되었다.
결찰 및 형질전환(Ligation and Transformation)
적절한 제한 효소(restriction enzyme)들(예를 들어 NotI and EcoRI로 침지된 pET21:χClb 또는 NotI and NruI 로 침지된 pET21 :χ1C5)로 침지된 약 200ng의 벡터가 4μl의 어닐된 프라이머들, 1μl의 리가아제 버퍼(ligase buffer), 2μl의 T4 DNA 리가아제(Ligase)와 함께 배양되었고, 상기 반응은 멸균수(sterile water)와 함께 lOμl 까지 진행되었다. 이들은 배양되는 동안 해동되는 얼음 비이커에서 하룻밤 배양되었다. 상기 하룻밤 결찰에 따른 5μl가 화학적으로 경쟁적인 50μl의 E. coli SURE cells에 더해졌다. 이는 얼음에서 1시간 배양되었고, 이후, 42℃에서 30초간 열 쇼크(shock)되었다. 450μl의 LB 배치(media)가 셀들에 더해진 후, 30분 동안 37℃에서 배양된 샘플에 더해졌다. 상기 미니 배양(mini-culture)은 이후, 5분 동안 4000rpm으로 원심 분리되었고, 수득된 침전물(resulting pellet)이 50μl LB 배지(media)에 재 부유되고, 이후 카르베니실린(carbenicillin) (lOOμl/ml), 테트라사이클린(tetracycline)(100μg/ml) 및 글루코스(glucose) (0.3% w/v)를 포함하는 LB 플레이트들(plate)상에 평판 배양(plate)되었다. 이는 37℃에서 하룻밤 배양되었다. 상기 결과 콜로니(colonies)는 이후 상기 연결체 변이(linker variation)가 성공적인지 확인하기 위해 스크린되었다.
일반적 방법의 변형(Modifications to the General Strategy)
pET21:χlC5를 침지하는 제한 효소인 NotI 및 NruI를 이용한 경직성 연결체를 갖는 구조체들의 형성은 형질전환(transformation) 후에 음성 컨트롤 플레이트(negative control plates)(결찰 반응에서 프라이머 듀플렉스가 없는) 상에 수많은 콜로니들(colonies)을 형성하였다. 따라서, 양성 클론들(positive clones)를 위해 스크린 하는 것이 어려웠다. 이는 상기 침지된 벡터를 탈인산화(dephosphorylating)함으로써 교정되었다; NotI 및 NmI로 침지된 15μl의 pET21:χ1C5 가 2μl CIAP 1Ox buffer, lμl CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (lOU/μl) 및 2μl 멸균수(sterile water)와 혼합되었다. 이는 37 0C에서 1시간 배양된 후, 80℃에서 30min 배양되었다. DNA는 이후 정제 키트(purification kit)(예를 들어, Qiagen PCR Purification Kit)를 이용하여 용액으로부터 세척되었다. 프라이머 듀플렉스들(primer duplexes)을 만들기 위해 사용된 모든 프라이머들은 앞서 언급된 방법에 의해 인산화되었다. 상기 인산화된 프라이머 듀플렉스들은 이후 앞서 언급된 바와 같이 인산화된 벡터에 결찰되었다.
χ ILl 의 복제 및 발현(Cloning and Expression of χ ILl )
도 8을 참조하면, χILl은 각각 하나의 세포외 성장 호르몬 도메인이 뒤따라는 성장 호르몬 GH의 2개의 도메인들로 구성되며, 상기 도메인들은 각각 (Gly4Ser)4 연결체와 연결된다. 상기 χILl의 뉴클리오사이드 서열(nucleotide sequence)은 도 9에 개시되고 상기 아미노산 서열은 도 10에 개시된다.
χILl은 측면에 NheI and XhoI 자리들이 위치하는 hGH 유전자(gene)를 χE2 (GHRa-GH-GHRb)에 결찰함으로써 형성되었다; 이는 χ1Kl 를 주었다. 상기 GHR 도메인은 이후 χILl을 주도록, EcoRI 및 HindIII 자리들 사이에서 χ1Kl 에 결찰되었다. 상기 과정의 개관도가 도 11에 개시된다.
상기 χILl 유전자는 시퀀싱(sequencing)에 의해 체크 되었고 올바른 것으로 확인되었다. 발현(Expression)은 E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIPL cells 내에서 변형된 pET21(+) 벡터를 이용하여 수행되었다. 0.5-0.6의 OD600 에서 ImM IPTG (ㅊl최종 농도)로 유도 후 4시간 LB 배지에서 발현된 단백질은, 부분적으로 용해되었고 GH에 대한 웨스턴 블롯(western blot)에서 다중 Mw 밴드들이 관찰되었다.(도 12).
χILl의 C 말단 히스-태그 버전(C-terminal His-tagged version)이 Co2 + 컬 럼을 이용하여 정제되었다(도 13). 다수의 오염된 단백질들이 단백질 제조(prep)에 잔류하였고 상기 다중 Mw 밴드들이 여전히 웨스턴 블롯(western blot)에서 관찰되었다. 상기 단백질 제조의 예비적인 생물학적분석(Preliminary bioassays)은 상당한 효현 활동도(agonistic activity)를 나타낸다는 것을 보여줬다(도 14).
젖샘분비호르몬 탄뎀 및 젖샘분비호르몬의 형성: 성장 호르몬 탄뎀(Construction of Prolactin Tandems and Prolactin : Growth Hormone Tandems)
PRL 및 GH 탄뎀의 구조체들은 표준 PCR 기술을 이용하여 형성되었고 뒤이어 준비된 벡터의 결찰 및 형질전환을 이용하여 형성되었다. 상기 연결체는 어닐된 올리고뉴클리오티드 쌍을 준비된 벡터들로 결찰 및 형질전환함으로써 다양해질 수 있다. 3개의 예시적인 방법들이 PRL 및 GH 탄뎀의 형성을 위해 하기에 개시된다.
방법 1(Strategy 1)
PRL -( G 4 S ) 4 - PRL 의 생성(Generation of PRL -( G 4 S ) 4 - PRL )
1. Ncol and Notl 자리들 사이에서 PCR PRL (순방향 프라이머 = atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC; 역방향 프라이머 = atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG).
2. NcoI and NotI 으로 PCR 산물을 침지.
3. NcoI and NotI 으로 수용자 벡터를 침지 -> pET21(m)χ1Clb (i.e. GH- (G4S)4-GH).
4. PCR 산물을 벡터에 결찰; pET21(m)PRL-(G4S)4-GH 생성
5. EcoRI and HindIIII 자리들 사이에서 PCR PRL (순방향 프라이머 = atatgaattcTTGCCCATCTGTCC ; 역방향 프라이머 = atataagcttGCAGTTGTTGTTGTGG) .
6. EcoRI and HindIII 으로 PCR 산물을 침지
7. EcoRI and HindIII 으로 받는 부위 벡터(recipient vector)를 침지-> pET21(m)PRL-(G4S)4-GH.
8. PCR 산물을 벡터에 결찰; pET21 (m)PRL-(G4S)4-PRL 형성.
방법 2(Strategy 2)
PRL -A( EA 3 K ) 2 A - GH 의 생성(Generation Of PRL -A( EA 3 K ) 2 A - GH )
1 NcoI and NotI 자리들 사이에서 PCR PRL (순방향 프라이머 = atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC; 역방향 프라이머 = atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG).
2 NcoI and NotI 으로 PCR 산물을 침지.
3 NcoI and NotI 으로 받는 부위 벡터를 침지-> pET21(m)TlaEAK2 (i.e. GH- A(EA3K)2A -GH).
4 Ligate PCR product into vector; to give PRL-A(EA3K)2A -GH.
방법 3(Strategy 3)
PRL -A( EA 3 K ) 4 A - PRL 의 생성(Generation Of PRL -A( EA 3 K ) 4 A - PRL )
1. A(EA3K)4A 연결체를 생성하기 위해서 프라이머들을 어닐.
2. NotI and EcoRI 으로 받는 부위 벡터를 침지-> pET21 (m) PRL-(G4S)4-PRL (위 방법 1로부터)
3. 올리고뉴클레오티드 이합체(dimer)를 벡터에 결찰; PRL-A(EA3K)4A -PRL 형성.
상기 방법은 도 24에 도시되었다.
실시예 1
반-경직성 탄뎀
E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL 셀들이 카르베니실린(carbenicillin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 코람페니콜(choramphenicol)로 보충된 10ml LB 배지(media)에서 성장되었다. 상기 셀들은 37℃에서 흔들면서 성장되었다. 배양들(cultures)은 0.4-0.7의 OD600에서 IPTG를 이용하여 최종 농도 1mM이 이르도록 유도되었다. 배양들은 수집(harvesting)하기 전에 4시간 더 성장되었다. 상기 셀들은 리소자임(lysozyme), 소듐 데옥시클로에이트(sodium deoxychloate) 및 초음파처리(sonication)의 결합을 이용하여 용해되었다. 가용성 부분은 이후 원심분리에 의해 분리되었다. 쿠마시 염색된(coomassie stained) PAGE 겔들은 탄뎀 발현을 위한 분명한 밴드들을 보이지 않았다.
가용성 부분은 ELISA에 의해 결정되었고, 40ng/well 의 탄뎀이 12% PAGE 겔 상으로 로드되었다. 상기 단백질은 PVDF 막(membrane)으로 이동되었고 토끼 항-GH Ab (일차) 및 항-토끼-HRP AJD (이차)을 이용하여 웨스턴 블롯이 행해었다(도 16d). 상기 반-경직성 연결체를 포함하는 GH 탄뎀의 생물학적 활성(bioactivity)이 도 16e에 보여진다.
실시예 2
Rigid Tandems
E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL 셀들이 카르베니실린(carbenicillin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 코람페니콜(choramphenicol)로 보충된 10ml LB 배지에서 성장되었다. 상기 셀들은 37℃에서 흔들면서 성장되었다. 배양들(cultures)은 0.4-0.7의 OD600에서 IPTG를 이용하여 최종 농도 1mM이 이르도록 유도되었다. 상기 배양들을 수집(harvesting)하기 전에 4시간 더 성장되었다.
상기 셀들은 리소자임(lysozyme), 소듐 데옥시클로에이트(sodium deoxychloate) 및 초음파처리(sonication)의 결합을 이용하여 용해되었다. 가용성 부분은 이후 원심분리에 의해 분리되었다. 쿠마시 염색된(coomassie stained) PAGE 겔들은 탄뎀 발현을 위한 분명한 밴드들을 보이지 않았다.
가용성 부분은 ELISA에 의해 결정되었고, 40ng/well의 탄뎀이 12% PAGE 겔 상으로 로드되었다. 상기 단백질은 PVDF 막으로 이동되었고 토끼 항-GH Ab (일차) 및 항-토끼-HRP AJD (이차)을 이용하는 웨스턴 블롯이 행해졌다(도 17d). 상기 반-경직성 연결체를 포함하는 Gh 탄뎀의 생물학적 활성(bioactivity)이 도 17e에 보여진다.
실시예 3
Purification of Tandems
생물학적 분석에서 초기 특-최대 활성(spura-maximal activities)에 기초한 앞으로의 연구를 위해서 TlcEAK2+3His 및 TlcEAK2+4His의 구조체들이 후보자 명단에 올랐다. 상기 발현 플라스미드는 E. coli BL21(DE3) Codonplus RIPL 셀들로 전환되었고 발현은 1L의 배치(batch) 배양(cultures)에서 수행되었다. 정제는 IMAC( Ni-chelate immobilised metal-ion affinity chromatography) 및 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 이용하여 가용성 단백질 부분에서 수행되었다. IMAC는 제1 정제 단계(purification step) 였으며, 초기에 용리(elution)가 pH 구배(gradient)(pH 8 to pH 3)를 이용하여 달성되었다; 그러나 다량의 단백질이 칼럼 세척 중에 손실된다는 것이 발견되었다. 그러므로 70% 넘는 순도를 얻었던 정제 방법에 변형을 하여 이미다졸 용리(imidazole elution)(0 to 0.5M imidazole)를 이용하는 것으로 선회했다. 이온 교환 칼럼(ion-exchange column)(Resource Q)이 이후, 90% 넘게 단백질을 정제하기 위해 사용되었다. 도 18에 도시되었다.
ELISA 결과에 기초한 정량분석: T1cEAK2+3His (RQ13/4) = 215μg/ml; TlcEAK2+3His (RQ14/4) = 177μg/ml
1ml의 각각 얻어진 전체 수율은 392μg이다. 2 리터(litres)의 배양에서 얻어졌다 -> 리터당 수율(yield per litre) = ~200μg
TlcEAK2+3-His의 활성도는 더 높은 단백질 농도에서 rhGH 보다 더 높은 폴드(fold) 유도에 도달한다. 유사한 결과가 상기 탄뎀이 몰을 기초로(molar basis) 테스트될 때 얻어진다(도 18B 및 18C). 유사한 분석이 TlcEAK2+4His에 대해서 수행되었다. 상기 정제 및 생물학적 활성도가 도 18D, 18E 및 l8F에 도시된다.
ELISA 결과에 기초한 정량 분석: TlcEAK2+4His (RQ13/4) = 550μg/ml.
1ml의 각각 얻어진 전체 수율은 550μg이다. 2리터의 배양으로부터 얻어졌다 -> 리터당 수율 =~275μg. 상기 TlcEAK2+4-His의 활성도는 높은 단백질 농도일수록 rhGH 보다 높은 폴드 유도(fold induction)를 갖는다. 유사 결과가 탄뎀이 몰 기초에서 테스트 되었을 때 관찰된다.
실시예 4
χ1C3의 농도는 브래드포드 에세이(Bradford's Assay)를 이용하여 측정되었다. rhGH (@lmg/ml)가 브래드포트 에세이로부터 얻은 데이타의 정확도를 증명하는 동시에 측정되었다. χ1C3는 GH 생물학적 분석에 있어서 GH 표준을 직접적으로 대체하기 위해 사용되었고 탄뎀 표준 곡선(tandem standard curve)을 제공하기 위해 사용되었다. 순수한 탄뎀 샘플, 불순물이 있는 탄뎀 샘플 및 rhGH는 상기 GH 표준 곡선 및 상기 탄뎀 표준 곡선에 대해 측정되었고, 상기 단백질 농도는 각각의 ELISA 플레이트(plate)로부터 측정되었다. 상기 GH ELISA는 상기 ELISAs에 의해 측정됨으로써 상기 탄뎀의 실제값의 약 2/3를 나타낸다. 도 19에 도시된다.
실시예 5
Prolactin / GH Tandems
각각의 대항적인 돌연변이(antagonistic mutation)를 동반하거나 동반하지 않던간에, 젖분비호르몬(prolactin) 및/또는 GH의 탄뎀들은 상기 탄뎀 유전자로 결 찰될 수 있도록 상기 유전자의 양 말단에 적당한 제한 자리들 도입하도록 PCR을 이용하여 합성될 수 있다.
유연성 탄뎀(Flexible Tandems
상기 탄뎀 유전자는 서열 (G4S)n에 기초하여 유연한 연결체를 갖는 2개의 단백질 도메인들을 연결함으로써 형성된다; 상기 단백질 도메인 및 연결체의 각 종단에 특이한 제한 자리들이 있다(도 20).
따라서, 상기 탄뎀에 있는 2개의 단백질 도메인들은 다른 도메인에 결찰됨으로써 다양할 수 있다. 예컨대, 상기 젖분비호르몬(PRL), 젖분비호르몬 1-14 아미노산이 제거된 G129R 돌연변이(Δ1-14PRL .G129R), 성장 호르몬(GH) 및 성장 호르몬 G120R 대항성 돌연변이 (GH.G120R)은 다양한 방법으로 탄뎀 유전자 내에서 결찰될 수 있다(도 B). 도 22 및 23은 상기 도메인들을 위한 뉴클리오티드 서열 및 단백질 서열을 나타낸다.
표준 PCR이 원하는 단백질 도메인의 측면에 적당한 제한 핵속핵산분해효소(endonuclease) 사이트들이 연결되도록 유전자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 제한 핵속핵산분해효소를 사용하여 상기 PCR 생성물 및 받는 부위 백터(recipient vector)의 침지(Digestion) 그리고 뒤이은 결찰 및 형질 전환은 원하는 단백질 도메인을 갖는 탄뎀을 생성할 것이다. 상기 프로세스는 단백질 도메인 또는 연결체(linker)에서 수행될 수 있는 데, 이미 앞서 언급한 바와 같이 올리고뉴클리오티드 이량체(oligonucleotide dimer)를 이용하여 대체될 수 있다(도 24).
반-경직성 탄뎀 (Semi-Rigid Tandems)
상기 탄뎀 유전자는 서열 A(EA3K)nA에 기초하여 나선형의 연결체를 갖는 2개의 단백질 도메인들을 연결함으로써 형성된다; 상기 단백질 도메인 및 상기 연결체의 각 종단에 특이한 제한 자리들이 있다(도 20).
따라서, 상기 탄뎀에 있는 2개의 단백질 도메인들은 다른 도메인에 결찰됨으로써 다양할 수 있다. 예컨대, 상기 젖분비호르몬(PRL), G129R 돌연변이가 제거된 프로락틴 1-14 아미노산(prolactin 1-14 amino acid deleted G129R mutant)(Δ1-14PRL .G129R), 성장호르몬 (GH) 및 성장호르몬 G120R 대항성 돌연변이 (GH.G120R)은 다양한 방법으로 탄뎀 유전자 내에서 결합될 수 있다(도 21). 도 22 및 23은 상기 도메인들을 위한 뉴클리오티드 서열 및 단백질 서열을 나타낸다.
표준 PCR이 원하는 단백질 도메인의 측면에 적당한 제한 핵속핵산분해효소 자리들이 연결되도록 유전자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 제한 핵속핵산분해효소를 사용하여 상기 PCR 생성물 및 받는 부위 백터(recipient vector)의 침지(Digestion) 그리고 뒤이은 결찰 및 형질 전환은 원하는 단백질 도메인을 갖는 탄뎀을 생성할 것이다. 상기 프로세스는 단백질 도메인 또는 연결체(linker)에서 수행될 수 있는 데, 이미 앞서 언급한 바와 같이 올리고뉴클리오티드 이량체(oligonucleotide dimer)를 이용하여 대체될 수 있다(도 24).
경직성 탄뎀 (Rigid Tandems)
상기 탄뎀의 2개의 도메인들은 A 도메인의 C 말단 α나선 및 B 도메인의 N 터미널 α'나선을 통해서 직접적으로 연결될 필요가 있다. 따라서, A 및 B 도메인들에서 상기 단백질들을 위한 상기 유전자들은 절단될 필요가 있다. 결과적으로 상기 나선의 연결체[A[EA3K)nA]는 상기 나선들에 직접적으로 연결된다.
따라서:-
단백질 A 도메인 절단(domain A truncation) B 도메인 절단(domain B truncation)
GH 184-191 1-6
PRL 191-199 1-14
탄뎀 유전자는 서열 A(EA3K)nA에 기초하여 나선형의 연결체를 갖는 2개의 단백질 도메인들을 연결함으로써 형성된다; 상기 단백질 도메인 및 상기 연결체의 각 종단에 특이한 제한 자리들이 있다(도 20). 특이한 NotI 자리는 상기 연결체 부위의 상기 N 말단 종단으로 처리되었고, 특이한 NruI 자리는 GH의 C 말단 종단으로 처리되었다(도 5 및 6); 이는 GH 탄뎀의 연결체 부위의 변형을 가능하게 한다.
NotI 자리를 포함하는 상기 N 말단 연결체 서열은, 형성될 주형(template) PRL-연결체-GH에 기초한 구조체를 가능하도록 하는 A 도메인 위치에 있는 PRL 유전자에 직접적으로 연결될 수 있다(도 25). 그러나, 특이한 제한 자리는 B 도메인이 PRL인 경우에, 상기 연결체 및 B 도메인 사이 경계에 도입되어야 한다(도 25).
따라서, 상기 탄뎀에 있는 2개의 단백질 도메인들은 다른 절단된 도메인에 결찰됨으로써 다양할 수 있다. 예컨대, 상기 젖분비호르몬(PRL), G129R 돌연변이가 제거된 프로락틴 1-14 아미노산(prolactin 1-14 amino acid deleted G129R mutant)(Δ1-14PRL .G129R), 성장호르몬 (GH) 및 성장호르몬 G120R 대항성 돌연변이 (GH.G120R)은 다양한 방법으로 탄뎀 유전자 내에서 결합될 수 있다(도 21). A 도메인 또는 B 도메인에 있는 그들의 위치에 의존하여, 상기 단백질 도메인들은 앞서 묘사된 바와 같이 절단될 수 있다.
표준 PCR이 원하는 단백질 도메인의 측면에 적당한 제한 핵속핵산분해효소 자리들이 연결되도록 유전자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 제한 핵속핵산분해효소를 사용하여 상기 PCR 생성물 및 받는 부위 백터(recipient vector)의 침지(Digestion) 그리고 뒤이은 결찰 및 형질 전환은 원하는 단백질 도메인을 갖는 탄뎀을 생성할 것이다. 상기 프로세스는 단백질 도메인 또는 연결체(linker)에서 수행될 수 있고 유연하고 반-경직성 연결체들을 위해 사용된 방법론에 유사하다(도 24).
사이토카인 수용체에 결합할 수 있는 적어도 둘 이상의 도메인을 포함하는 치료적 폴리펩티드
<110> Asterion Limited <120> Linkers <130> P106751WO <150> US 60/591,358 <151> 2004-07-26 <150> GB 0416687.2 <151> 2004-07-27 <150> GB 0502839.4 <151> 2005-02-11 <160> 81 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1243 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccatgggctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctagt ctccgcgccc 60 atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc tatatcccaa 120 aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc tcagagtcta 180 ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag ctgctccgca 240 tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg agtgtcttcg 300 ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta aaggacctag 360 aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg actgggcaga 420 tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac gcactactca 480 agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag acattcctgc 540 gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt cggcggccgc ggtggcggag 600 gtagtggtgg cggaggtagc ggtggcggag gttctggtgg cggaggttcc gaattcttcc 660 caaccattcc cttatccagg ctttttgaca acgctagtct ccgcgcccat cgtctgcacc 720 agctggcctt tgacacctac caggagtttg aagaagccta tatcccaaag gaacagaagt 780 attcattcct gcagaacccc cagacctccc tctgtttctc agagtctatt ccgacaccct 840 ccaacaggga ggaaacacaa cagaaatcca acctagagct gctccgcatc tccctgctgc 900 tcatccagtc gtggctggag cccgtgcagt tcctcaggag tgtcttcgcc aacagcctgg 960 tgtacggcgc ctctgacagc aacgtctatg acctcctaaa ggacctagag gaaggcatcc 1020 aaacgctgat ggggaggctg gaagatggca gcccccggac tgggcagatc ttcaagcaga 1080 cctacagcaa gttcgacaca aactcacaca acgatgacgc actactcaag aactacgggc 1140 tgctctactg cttcaggaag gacatggaca aggtcgagac attcctgcgc atcgtgcagt 1200 gccgctctgt ggagggcagc tgtggcttca agcttttcga ata 1243 <210> 2 <211> 413 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser 1 5 10 15 Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln 35 40 45 Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val 100 105 110 Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 115 120 125 Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr 130 135 140 Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys 145 150 155 160 Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu 165 170 175 Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly 180 185 190 Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 195 200 205 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Phe Pro Thr Ile Pro Leu 210 215 220 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 225 230 235 240 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 245 250 255 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 260 265 270 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 275 280 285 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 290 295 300 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 305 310 315 320 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 325 330 335 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 340 345 350 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 355 360 365 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 370 375 380 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 385 390 395 400 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Lys Leu Phe Glu 405 410 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> helical peptide <400> 3 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> two copies of helical peptide <400> 4 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> three copies of helical peptide <400> 5 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ala <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 6 ggccgcgcag aggctgcggc caaggcag 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 7 aattctgcct tggccgcagc ctctgcgc 28 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 8 ggccgcgcag aggccgcagc taaagaagct gcggccaagg cag 43 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 9 aattctgcct tggccgcagc ttctttagct gcggcctctg cgc 43 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 10 ggccgcgcag aggccgcagc taaagaagcg gcagccaagg aagctgcggc caaggcag 58 <210> 11 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 11 aattctgcct tggccgcagc ttccttggct gccgcttctt tagctgcggc ctctgcgc 58 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 12 ggccgcgcag aggccgcagc taaagaagcg gcagccaagg ag 42 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 13 gcagccgcta aagaagctgc ggccaaggca g 31 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 14 aattctgcct tggccgcagc ttctttagcg gctgcctcct tg 42 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer encoding helical peptide <400> 15 gctgccgctt ctttagctgc ggcctctgcg c 31 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker to link GH molecules <400> 16 Gln Ala Arg Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ser Arg Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding linker amino acid sequence <400> 17 caagcacgag cagaagcagc agcagcagca gcaaaagcat cacgacta 48 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding linker sequence <400> 18 caggctcgtg ctgaggctgc tgctgctgct gctaaggctt ctcgtctt 48 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding linker sequence <400> 19 caagcccgcg ccgaagccgc cgccgccgcc gccaaagcct cccgcctc 48 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequenc encoding linker sequence <400> 20 caagcgcggg cggaagcggc ggcggcggcg gcgaaagcgt cgcggctg 48 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding linker sequence <400> 21 caagcaagag cagaagcagc agcagcagca gcaaaagcat caagatta 48 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding linker sequence <400> 22 caagcaaggg cagaagcagc agcagcagca gcaaaagcat caaggttg 48 <210> 23 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction site for Not 1 <400> 23 gcggccgc 8 <210> 24 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction site for Nru I <400> 24 tcgcga 6 <210> 25 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction site for SacII <400> 25 ccgcgg 6 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for modifying GH1 and GH2 domains <400> 26 aaaccatggg cttcccaacc attcccttat cc 32 <210> 27 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for modifying GH1 and GH2 domains <400> 27 agtagtagta gagcggccgc ctctgcgcgg gcctgcacga tgc 43 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for modifying GH1 and GH2 domains <400> 28 ttccgaattc tcgcgacttt ttgacaacgc tagtctcc 38 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for modifying GH1 and GH2 domains <400> 29 agccaagctt gaagccacag ctgccctcc 29 <210> 30 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tandem linker domain <400> 30 caggcccgcg cagaggcggc cgcggtggcg gaggtagtgg tggcggaggt agcggtggcg 60 gaggttctgg tggcggaggt tccgaattct cgcgactttt tg 102 <210> 31 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tandem linker domain amino acid sequence <400> 31 Gln Ala Arg Ala Glu Ala Ala Ala Val Ala Glu Val Val Val Ala Glu 1 5 10 15 Val Ala Val Ala Glu Val Leu Val Ala Glu Val Pro Asn Ser Arg Asp 20 25 30 Phe Leu Leu 35 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence used to generate rigid helical linker <400> 32 ggccgctaaa gccgcggctt cg 22 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 33 cgaagccgcg gctttagc 18 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 34 ggccgctaaa gaagccgcgg ctaaggcatc g 31 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linke <400> 35 cgatgcctta gccgcggctt ctttagc 27 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 36 ggccgctaaa gaagccgcgg ctaaggcagc ttcg 34 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 37 cgaagctgcc ttagccgcgg cttctttagc 30 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 38 ggccgctaaa gaagccgcgg ctaaggcagc tgcgtcg 37 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 39 cgacgcagct gccttagccg cggcttcttt agc 33 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 40 ggccgctaaa gaagccgcgg ctaaggcagc tgcggcatcg 40 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 41 cgatgccgca gctgccttag ccgcggcttc tttagc 36 <210> 42 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 42 ggccgctaaa gaagccgcgg ctaaggcaga ggctgcggcc aaatcg 46 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 43 cgatttggcc gcagcctctg ccttagccgc ggcttcttta gc 42 <210> 44 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 44 ggccgctaaa gaagccgcgg ctaaggcaga ggctgcggcc aaagcttcg 49 <210> 45 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 45 cgaagctttg gccgcagcct ctgccttagc cgcggcttct ttagc 45 <210> 46 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 46 ggccgctaaa gaagccgcgg ctaaggcaga ggctgcggcc aaagctgcgt cg 52 <210> 47 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used to generate rigid helical linker <400> 47 cgacgcagct ttggccgcag cctctgcctt agccgcggct tctttagc 48 <210> 48 <211> 2016 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding growth hormone fused to growth hormone receptor extracellular domain <400> 48 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta gtctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttcctcgagg gtggcggagg tagtggaggc 600 ggtggctctg gcggtggagg ctccggaggc ggtggatcaa aggatccaac ccttttccca 660 accattccct tatccaggct ttttgacaac gctagtctcc gcgcccatcg tctgcaccag 720 ctggcctttg acacctacca ggagtttgaa gaagcctata tcccaaagga acagaagtat 780 tcattcctgc agaaccccca gacctccctc tgtttctcag agtctattcc gacaccctcc 840 aacagggagg aaacacaaca gaaatccaac ctagagctgc tccgcatctc cctgctgctc 900 atccagtcgt ggctggagcc cgtgcagttc ctcaggagtg tcttcgccaa cagcctggtg 960 tacggcgcct ctgacagcaa cgtctatgac ctcctaaagg acctagagga aggcatccaa 1020 acgctgatgg ggaggctgga agatggcagc ccccggactg ggcagatctt caagcagacc 1080 tacagcaagt tcgacacaaa ctcacacaac gatgacgcac tactcaagaa ctacgggctg 1140 ctctactgct tcaggaagga catggacaag gtcgagacat tcctgcgcat cgtgcagtgc 1200 cgctctgtgg agggcagctg tggcttcggc ggccgcggtg gcggaggtag tggtggcgga 1260 ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcgga ggttccgaat tcttttctgg aagtgaggcc 1320 acagcagcta tccttagcag agcaccctgg agtctgcaaa gtgttaatcc aggcctaaag 1380 acaaattctt ctaaggagcc taaattcacc aagtgccgtt cacctgagcg agagactttt 1440 tcatgccact ggacagatga ggttcaccat ggaacaaaga acctaggacc catacagctg 1500 ttctatacca gaaggaacac tcaagaatgg actcaagaat ggaaagaatg ccctgattat 1560 gtttctgctg gggaaaacag ctgttacttt aattcatcgt ttacctccat ctggatacct 1620 tattgtatca agctaactag caatggtggt acagtggatg aaaagtgttt ctctgttgat 1680 gaaatagtgc aaccagatcc acccattgcc ctcaactgga ctttactgaa cgtcagttta 1740 actgggattc atgcagatat ccaagtgaga tgggaagcac cacgcaatgc agatattcag 1800 aaaggatgga tggttctgga gtatgaactt caatacaaag aagtaaatga aactaaatgg 1860 aaaatgatgg accctatatt gacaacatca gttccagtgt actcattgaa agtggataag 1920 gaatatgaag tgcgtgtgag atccaaacaa cgaaactctg gaaattatgg cgagttcagt 1980 gaggtgctct atgtaacact tcctcagatg agccaa 2016 <210> 49 <211> 672 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of growth hormone fused to extracellular domain of growth hormone receptor <400> 49 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 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Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 260 265 270 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 275 280 285 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 290 295 300 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 305 310 315 320 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 325 330 335 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 340 345 350 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 355 360 365 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 370 375 380 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 385 390 395 400 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly 405 410 415 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 420 425 430 Glu Phe Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala 435 440 445 Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser 450 455 460 Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe 465 470 475 480 Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly 485 490 495 Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln 500 505 510 Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys 515 520 525 Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys 530 535 540 Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp 545 550 555 560 Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu 565 570 575 Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu 580 585 590 Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr 595 600 605 Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp 610 615 620 Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys 625 630 635 640 Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr 645 650 655 Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln 660 665 670 <210> 50 <211> 1217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> growth hormone tandem fused via semi-rigid linker <400> 50 ccatgggctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg ctccgcgccc 60 atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc tatatcccaa 120 aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc tcagagtcta 180 ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag ctgctccgca 240 tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg agtgtcttcg 300 ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta aaggacctag 360 aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg actgggcaga 420 tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac gcactactca 480 agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag acattcctgc 540 gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt cggcggccgc gaattcttcc 600 caaccattcc cttatccagg ctttttgaca acgctatgct ccgcgcccat cgtctgcacc 660 agctggcctt tgacacctac caggagtttg aagaagccta tatcccaaag gaacagaagt 720 attcattcct gcagaacccc cagacctccc tctgtttctc agagtctatt ccgacaccct 780 ccaacaggga ggaaacacaa cagaaatcca acctagagct gctccgcatc tccctgctgc 840 tcatccagtc gtggctggag cccgtgcagt tcctcaggag tgtcttcgcc aacagcctgg 900 tgtacggcgc ctctgacagc aacgtctatg acctcctaaa ggacctagag gaaggcatcc 960 aaacgctgat ggggaggctg gaagatggca gcccccggac tgggcagatc ttcaagcaga 1020 cctacagcaa gttcgacaca aactcacaca acgatgacgc actactcaag aactacgggc 1080 tgctctactg cttcaggaag gacatggaca aggtcgagac attcctgcgc atcgtgcagt 1140 gccgctctgt ggagggcagc tgtggcttca agcttttcga ataaatcgat gtcgagcacc 1200 accaccacca ccactga 1217 <210> 51 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> growth hormone tandem fused via semi-rigid linker <400> 51 Met Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met 1 5 10 15 Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln 35 40 45 Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val 100 105 110 Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 115 120 125 Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr 130 135 140 Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys 145 150 155 160 Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu 165 170 175 Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly 180 185 190 Phe Gly Gly Arg Glu Phe Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe 195 200 205 Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp 210 215 220 Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr 225 230 235 240 Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile 245 250 255 Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu 260 265 270 Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 275 280 285 Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser 290 295 300 Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln 305 310 315 320 Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile 325 330 335 Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp 340 345 350 Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met 355 360 365 Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu 370 375 380 Gly Ser Cys Gly Phe Lys Leu Phe Glu Ile Asp Val Glu His His His 385 390 395 400 His His His <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding semi-rigid linker <400> 52 gcagaggccg cagctaaaga agctgcggcc aaggca 36 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> semi-rigid linker amino acid sequence <400> 53 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding semi-rigid linker <400> 54 gcagaggccg cagctaaaga agcggcagcc aaggaggcag ccgctaaaga agctgcggcc 60 aaggca 66 <210> 55 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> semi-rigid linker amini acid sequence <400> 55 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala 20 <210> 56 <211> 1174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> growth hormone tandem linked via a rigid linker <400> 56 ccatgggctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg ctccgcgccc 60 atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc tatatcccaa 120 aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc tcagagtcta 180 ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag ctgctccgca 240 tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg agtgtcttcg 300 ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta aaggacctag 360 aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg actgggcaga 420 tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac gcactactca 480 agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag acattcctgc 540 gcatcgtgca ggcccgcgca gaggcggccg ctcgcgactt tttgacaacg ctatgctccg 600 cgcccatcgt ctgcaccagc tggcctttga cacctaccag gagtttgaag aagcctatat 660 cccaaaggaa cagaagtatt cattcctgca gaacccccag acctccctct gtttctcaga 720 gtctattccg acaccctcca acagggagga aacacaacag aaatccaacc tagagctgct 780 ccgcatctcc ctgctgctca tccagtcgtg gctggagccc gtgcagttcc tcaggagtgt 840 cttcgccaac agcctggtgt acggcgcctc tgacagcaac gtctatgacc tcctaaagga 900 cctagaggaa ggcatccaaa cgctgatggg gaggctggaa gatggcagcc cccggactgg 960 gcagatcttc aagcagacct acagcaagtt cgacacaaac tcacacaacg atgacgcact 1020 actcaagaac tacgggctgc tctactgctt caggaaggac atggacaagg tcgagacatt 1080 cctgcgcatc gtgcagtgcc gctctgtgga gggcagctgt ggcttcaagc ttttcgaata 1140 aatcgatgtc gagcaccacc accaccacca ctga 1174 <210> 57 <211> 389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence growth hormone tandem linked via rigid linker <400> 57 Met Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met 1 5 10 15 Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln 35 40 45 Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val 100 105 110 Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 115 120 125 Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr 130 135 140 Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys 145 150 155 160 Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu 165 170 175 Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Ala Arg Ala Glu Ala Ala Ala Ser Arg 180 185 190 Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala 195 200 205 Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln 210 215 220 Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu 225 230 235 240 Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu 260 265 270 Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly 275 280 285 Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 290 295 300 Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly 305 310 315 320 Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn 325 330 335 Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys 340 345 350 Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser 355 360 365 Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Lys Leu Phe Glu Ile Asp Val Glu His 370 375 380 His His His His His 385 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker <400> 58 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker 2 <400> 59 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker 2 <400> 60 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker <400> 61 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker <400> 62 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker <400> 63 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker <400> 64 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala 1 5 10 <210> 65 <211> 597 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 ttgcccatct gtcccggcgg ggctgcccga tgccaggtga cccttcgaga cctgtttgac 60 cgcgccgtcg tcctgtccca ctacatccat aacctctcct cagaaatgtt cagcgaattc 120 gataaacggt atacccatgg ccgggggttc attaccaagg ccatcaacag ctgccacact 180 tcttcccttg ccacccccga agacaaggag caagcccaac agatgaatca aaaagacttt 240 ctgagcctga tagtcagcat attgcgatcc tggaatgagc ctctgtatca tctggtcacg 300 gaagtacgtg gtatgcaaga agccccggag gctatcctat ccaaagctgt agagattgag 360 gagcaaacca aacggcttct agagggcatg gagctgatag tcagccaggt tcatcctgaa 420 accaaagaaa atgagatcta ccctgtctgg tcgggacttc catccctgca gatggctgat 480 gaagagtctc gcctttctgc ttattataac ctgctccact gcctacgcag ggattcacat 540 aaaatcgaca attatctcaa gctcctgaag tgccgaatca tccacaacaa caactgc 597 <210> 66 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg 1 5 10 15 Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu 20 25 30 Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg 35 40 45 Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala 50 55 60 Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe 65 70 75 80 Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr 85 90 95 His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile 100 105 110 Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu 115 120 125 Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn 130 135 140 Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp 145 150 155 160 Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg 165 170 175 Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg 180 185 190 Ile Ile His Asn Asn Asn Cys 195 <210> 67 <211> 555 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 cttcgagacc tgtttgaccg cgccgtcgtc ctgtcccact acatccataa cctctcctca 60 gaaatgttca gcgaattcga taaacggtat acccatggcc gggggttcat taccaaggcc 120 atcaacagct gccacacttc ttcccttgcc acccccgaag acaaggagca agcccaacag 180 atgaatcaaa aagactttct gagcctgata gtcagcatat tgcgatcctg gaatgagcct 240 ctgtatcatc tggtcacgga agtacgtggt atgcaagaag ccccggaggc tatcctatcc 300 aaagctgtag agattgagga gcaaaccaaa cggcttctag agcgcatgga gctgatagtc 360 agccaggttc atcctgaaac caaagaaaat gagatctacc ctgtctggtc gggacttcca 420 tccctgcaga tggctgatga agagtctcgc ctttctgctt attataacct gctccactgc 480 ctacgcaggg attcacataa aatcgacaat tatctcaagc tcctgaagtg ccgaatcatc 540 cacaacaaca actgc 555 <210> 68 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Leu Arg Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His 1 5 10 15 Asn Leu Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His 20 25 30 Gly Arg Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser 35 40 45 Leu Ala Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys 50 55 60 Asp Phe Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro 65 70 75 80 Leu Tyr His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu 85 90 95 Ala Ile Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu 100 105 110 Leu Glu Arg Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys 115 120 125 Glu Asn Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met 130 135 140 Ala Asp Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys 145 150 155 160 Leu Arg Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys 165 170 175 Cys Arg Ile Ile His Asn Asn Asn Cys 180 185 <210> 69 <211> 573 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttc 573 <210> 70 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 71 <211> 573 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaacgc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttc 573 <210> 72 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Arg Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 73 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site for Nco 1 <400> 73 ccatgggc 8 <210> 74 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction site for EcoR1 <400> 74 gaattc 6 <210> 75 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction site for HindIII <400> 75 aagctt 6 <210> 76 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH linker domain <400> 76 caggcccgcg cagaggcggc cgcgtcgcga ctttt 35 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GH rigid linker domain <400> 77 Gln Ala Arg Ala Glu Ala Ala Ala Ser Arg Leu 1 5 10 <210> 78 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding linker between growth hormone and prolactin <400> 78 ctcctgaagg cagaggcggc cgcgtcgcga ctttt 35 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker domain linking growth hormone with prolactin <400> 79 Leu Leu Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ser Arg Leu 1 5 10 <210> 80 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding linker domain linking prolactin to prolactin <400> 80 ctcctgaagg cagaggcggc cgcgcttcga gac 33 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker domain linking prolactin to prolactin <400> 81 Leu Leu Lys Ala Glu Ala Ala Ala Leu Arg Asp 1 5 10

Claims (56)

  1. 사이토카인 수용체에 결합할 수 있는 적어도 둘 이상의 사이토카인 결합 도메인을 포함하며,
    상기 결합 도메인들은 비유연성 나선형 부위를 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해서 연결되는 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 탄뎀 배열에서 상기 결합 도메인들은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 탄뎀 배열에서 10개 이상의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비유연성 나성형 부위를 A(EAAAK)XA 모티프의 적어도 하나 이상의 복사 또는 그것의 기능적 변이를 포함하는 폴리펩티드.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 분자는 적어도 하나 이상의 유연성 비-나선형 부위를 포함하는 폴리펩티드.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 유연성 비-나성형 부위는 상기 펩티드 연결체 분자의 아미노말단 끝 또는 그 근처에 위치하는 폴리펩티드.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 유연성 비-나선형 부위는 상기 펩티드 연결체 분자의 카르복실말단 끝 또는 그 근처에 위치하는 폴리펩티드.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 유연성 비-나성형 부위는 상기 펩티드 연결체 분자의 아미노말단 끝 및 카르복실말단 끝 또는 그 근처에 위치하는 폴리펩티드.
  9. 청구항 5 내지 청구항 8중 어느 한 항에 있어서, 상기 유연성 비-나선형 부위는 결합 도메인들 중 적어도 하나에 인접하게 위치하는 폴리펩티드.
  10. 청구항 4 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 10개 미만의 EAAAK 모티프의 복사를 포함하는 폴리펩티드.
  11. 청구항 4 내지 청구항 9중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 5개 미만의 EAAK 모티프의 복사를 포함하는 폴리펩티드.
  12. 청구항 2 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 도메인은 비유 연성 나선형 연결체로 구성된 연결 분자에 의해 연결되는 폴리펩티드.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 나선형 연결체는 제1 결합 도메인의 카르복실말단을 제2 결합 도메인의 아미노말단에 연결하는 폴리펩티드.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 나선형 연결체는 상기 제1 결합 도메인의 C-말단 나선과 상기 제2 결합 도메인의 N-말단 나선 사이에서 연속적이며, 실질적으로 고정된 배향에서 상기 두 결합 도메인을 견고하게 연결하는 폴리펩티드.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 결합 도메인들은 서로 동일하거나 또는 유사한 폴리펩티드.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 폴리펩티드는, 성장 호르몬; 렙틴; 적혈구생성인자; 젖분비호르몬; 인터루킨(IL) IL-2, IL-3, IL-4, IL5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL11, IL-12의 p35 서브 유닛, IL-13, IL-15; G-CSF(과립세포군촉진인자); GM-CSF(과립구-대식세포군촉진인자); CNTF(섬모 향정신성 인자); 카디오트로핀(CT-1); LIF(백혈구억제인자); 온코스타틴 M(OSM); 인터페론, INFα 및 INFγ; 종양괴사인자, TNFα 및 TNFβ; 그리고 RANK 리간드로 이루어진 군에서 선택된 사이토카인의 결합 도메인들을 포함하는 폴리펩티드.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 결합 도메인들의 적어도 하나 이상은 성자 호르몬 결합 도메인, 또는 성장 호르몬 변이인 폴리펩티드.
  18. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서, 상기 폴리펩티드는 성장 호르몬 또는 성장 호르몬 변이 폴리펩티드의 적어도 둘 이상의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 폴리펩티드는 젖분비호르몬 또는 젖분비호르몬 변이의 적어도 둘 이상의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 젖분비호르몬 변이 폴리펩티드는 젖분비호르몬의 129번 위치에서 아미노산 순서가 변형된 아미노산 순서를 포함하는 폴리펩티드.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 변형은 아미노산 치환인 폴리펩티드.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 치환은 글리신 아미노산 잔기를 아르기닌 아미노산 잔기로 치환하는 폴리펩티드.
  23. 청구항 19 내지 청구항 22중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 젖분비호르몬의 9 내지 14 사이의 아미노말단 아미노산 잔기의 제거를 포함하는 폴리펩 티드.
  24. 청구항 1 내지 청구항 14중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 도메인들은 서로 다른 폴리펩티드.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 폴리펩티드는 성장 호르몬 결합 도메인인 제1 결합 도메인과 젖분비호르몬 결합 도메인인 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 폴리펩티드는 성장호르몬 결합 도메인 및 젖분비호르몬 결합 도메인으로 구성된 폴리펩티드.
  27. 청구항 24에 있어서, 상기 폴리펩티드는 변형된 성장 호르몬 결합 도메인인 제1 결합 도메인과 변형된 젖분비호르몬 결합 도메인인 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  28. 청구항 24에 있어서, 상기 폴리펩티드는 변형된 성장호르몬 결합 도메인 및 변형된 젖분비호르몬 결합 도메인으로 구성된 폴리펩티드.
  29. 청구항 27 또는 청구항 28에 있어서, 상기 변형된 성장호르몬 결합 도메인은 아미노산 위치 글리신 120에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 변형은 글리신 120을 아르기닌, 리신, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 또는 글루탐산으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 변형은 글리신 120을 아르기닌 아미노산 잔기로 치환하는 폴리펩티드.
  32. 청구항 27 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 젖분비호르몬 결합 도메인은 글리신 129의 변형을 포함하는 폴리펩티드.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 변형은 글리신 129 를 아르기닌 아미노산 잔기로 치환하는 폴리펩티드.
  34. 청구항 28 내지 청구항 32중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 젖분비호르몬의 9 내지 14 아미노말단 아미노산의 제거를 포함하는 폴리펩티드.
  35. 청구항 1 내지 청구항 34중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 사이토카인 수용체의 리간드 결합 도메인을 더 포함하는 폴리펩티드.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 수용체는 성장호르몬 수용체인 폴리펩티드.
  37. 청구항 35에 있어서, 상기 수용체는 젖분비호르몬 수용체인 폴리펩티드.
  38. 청구항 1 내지 청구항 37중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 핵산은 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 벡터인 핵산 분자.
  40. 청구항 38 또는 청구항 39의 핵산 또는 벡터로 형질전환된 또는 핵산감염된 분리된 세포.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인 세포.
  42. 청구항 40에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인 세포.
  43. 폴리펩티드를 조제하는 방법에 있어서, 상기 조제는,
    i) 청구항 40 내지 청구항 42 중 어느 한 항의 세포를 청구항 1 내지 청구항 37중 어느 한 항의 폴리펩티드 생성에 도움이 되는 조건에서 성장하는 단계; 그리 고
    ii) 상기 세포로부터 또는 그 성장 환경으로부터 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 조제하는 방법.
  44. 제2 사이토카인 결합 도메인에 연결된 제1 사이토카인 결합 도메인을 포함하고, 사이토카인 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 제1 및 제2 사이토카인 결합 도메인들은 유연성 연결 분자에 의해 연결된 폴리펩티드.
  46. 청구항 44에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인들은 유연성 나선형 부위를 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해 연결된 폴리펩티드.
  47. 청구항 44에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인들은 비유연성 나선형 부위 및 유연성 비-나선형 부위를 포함하는 펩티드 연결체 분자에 의해서 연결되는 폴리펩티드.
  48. 청구항 44 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인 결합 도메인은 성장호르몬 또는 성장호르몬 변이이고, 상기 세포외 도메인은 성장호르몬 세포외 도메인인 폴리펩티드.
  49. 청구항 44 내지 청구항 48중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 핵산은 상기 폴리펩티드의 발현을 위해 적합한 벡터인 핵산 분자.
  51. 청구항 49의 핵산 분자를 포함하는 베터.
  52. 청구항 39 또는 청구항 44 내지 청구항 51 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 제약학적 사용.
  53. 청구항 1 내지 청구항 39 또는 청구항 44 내지 청구항 51 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 포함하는 제약학적 조성물.
  54. 청구항 49 또는 청구항 51의 핵산 분자 또는 벡터로 형질전환된 또는 핵산감염된 분리된 세포.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인 세포.
  56. 청구항 54에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인 세포.
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090016959A1 (en) * 2005-02-18 2009-01-15 Richard Beliveau Delivery of antibodies to the central nervous system
BRPI0613005A8 (pt) 2005-07-15 2017-12-26 Angiochem Inc uso de polipeptídeos de aprotinina como veículos em conjugados farmacêuticos.
GB0606946D0 (en) * 2006-04-06 2006-05-17 Asterion Ltd Polypeptide antagonist
EP2094291A1 (en) * 2006-12-21 2009-09-02 Novo Nordisk A/S Dimeric prolactin receptor ligands
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
WO2009004057A2 (en) * 2007-07-05 2009-01-08 Novo Nordisk A/S Mutated dimeric prolactin receptor ligands
GB0717985D0 (en) * 2007-07-20 2007-10-24 Asterion Ltd Growth hormone fusion proteins
GB0715216D0 (en) * 2007-08-03 2007-09-12 Asterion Ltd Leptin
CN108129573B (zh) * 2007-09-21 2021-10-08 加利福尼亚大学董事会 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性
GB0719818D0 (en) * 2007-10-11 2007-11-21 Asterion Ltd Growth hormone fusion polypeptides
WO2009077731A2 (en) * 2007-12-19 2009-06-25 Asterion Limited Prolactin fusion proteins
GB0725201D0 (en) * 2007-12-24 2008-01-30 Asterion Ltd Peptide fusion proteins
EP2288386A1 (en) * 2008-02-19 2011-03-02 Asterion Limited Modified linkers
AU2009238187B2 (en) * 2008-04-18 2014-03-06 Angiochem Inc. Pharmaceutical compositions of paclitaxel, paclitaxel analogs or paclitaxel conjugates and related methods of preparation and use
GB0812019D0 (en) * 2008-07-02 2008-08-06 Asterion Ltd Insulin
RU2011118056A (ru) 2008-10-15 2012-11-27 Ангиокем Инк. Конъюгаты агонистов glp-1 и их применение
EP2346896A4 (en) 2008-10-15 2014-06-25 Angiochem Inc CONJUGATES OF ETOPOSIDE AND DOXORUBICIN FOR THE ADMINISTRATION OF MEDICAMENTS
CA2745524C (en) 2008-12-05 2020-06-09 Angiochem Inc. Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof
US8697654B2 (en) 2008-12-18 2014-04-15 E I Du Pont De Nemours And Company Peptide linkers for effective multivalent peptide binding
CN102510759A (zh) 2009-04-20 2012-06-20 安吉奥开米公司 利用与血管肽-2类似物结合的抗癌剂治疗卵巢癌
JP5932642B2 (ja) 2009-07-02 2016-06-08 アンジオケム インコーポレーテッド 多量体ペプチドコンジュゲートおよびその使用
EP2531211A4 (en) * 2010-02-03 2013-10-23 Orbis Health Solutions Llc METHOD FOR THE SENSITIZATION OF CELLS TO TREATMENT AGAINST CANCER
WO2011153642A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Angiochem Inc. Leptin and leptin analog conjugates and fusion proteins and uses thereof
GB201104285D0 (en) 2011-03-15 2011-04-27 Asterion Ltd Modified receptor fusion proteins
EP2592103A1 (en) 2011-11-08 2013-05-15 Adriacell S.p.A. Polymer aldehyde derivatives
US20150133383A1 (en) * 2012-05-11 2015-05-14 Prorec Bio Ab Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
US9803021B2 (en) 2012-12-07 2017-10-31 The Regents Of The University Of California CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
JP2016520053A (ja) * 2013-05-06 2016-07-11 中国▲薬▼科大学Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 腫瘍微小環境における血管再生の抑制及び適応免疫応答の活性化を有する二機能の融合タンパク質及びその遺伝子並びに使用
WO2014194100A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
US9272019B2 (en) * 2014-06-24 2016-03-01 Novo Nordisk A/S MIC-1 fusion proteins and uses thereof
JP6823055B2 (ja) 2015-06-15 2021-01-27 アンジオケム インコーポレーテッド 軟髄膜癌腫症の治療方法
GB201520021D0 (en) * 2015-11-13 2015-12-30 Asterion Ltd Fusion polypeptide
CA3010632A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 Meditope Biosciences, Inc. Self-crosslinking antibodies
GB201706781D0 (en) 2017-04-28 2017-06-14 Univ Sheffield Parathyroid hormone fusion polypeptide
TWI710377B (zh) 2017-05-23 2020-11-21 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Ｍｉｃ－１化合物及其用途
CN114746121A (zh) 2019-11-27 2022-07-12 伊利诺伊大学理事会 五肽及其使用方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5534617A (en) * 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
US5698443A (en) * 1995-06-27 1997-12-16 Calydon, Inc. Tissue specific viral vectors
CA2658039A1 (en) * 1995-09-21 1997-03-27 Genentech, Inc. Human growth hormone variants
EP1290170A2 (en) * 2000-06-16 2003-03-12 Asterion Limited Binding agents: chimeric ligand/receptor proteins
GB2384001B (en) * 2001-12-14 2004-02-04 Asterion Ltd Chimeric growth hormone-growth hormone receptor proteins
GB0315182D0 (en) * 2003-06-28 2003-08-06 Asterion Ltd Cytokine variant polypeptides

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