BR112016028884B1 - Conjugado compreendendo uma biomolécula ligada a um ácido graxo, seu uso, mistura, combinação, composição farmacêutica, e composto - Google Patents

Abstract

ÁCIDOS GRAXOS E SEU USO EM CONJUGAÇÃO A BIOMOLÉCULAS. A presente invenção refere-se a um conjugado compreendendo uma biomolécula ligada a um ácido graxo através de um ligante onde o ácido graxo tem a Fórmula A1, A2 ou A3 que segue: onde R1, R2, R3, R4, Ak, n, m e p são aqui definidos. A invenção refere-se também a um método para fabricação do conjugado da invenção tal como conjugado de GDF15 e seus usos terapêuticos tal como trata-mento ou prevenção de distúrbios ou doenças metabólicas, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica/esteatoepatite e outras doenças hepáticas progressivas, resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, com-plicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastroparese e outros distúrbios metabólicos. A presente invenção provê ainda uma combinação de agentes farmacologicamente ativos e uma composição farmacêutica.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a novos conjugados de GDF15 que têm meia-vida e duração de ação aperfeiçoadas, método de fabricação dos mesmos e uso dos mesmos. A invenção se refere ainda a novos ácidos graxos e seu uso no prolongamento da meia- vida de biomoléculas através de conjugação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Peptídeos e proteínas são amplamente usados em prática médica, e uma vez que eles podem ser produzidos através de tecnologia de DNA recombinante pode ser esperado que sua importância vá aumentar também nos próximos anos. O número de peptídeos e proteínas endógenos conhecidos com atividades biológicas interessantes está crescendo rapidamente, também como um resultado da exploração em curso do genoma humano. Devido às suas atividades biológicas, muitos desses polipeptídeos e proteínas poderiam a princípio ser usados como agentes terapêuticos. Peptídeos ou proteínas endógenos, no entanto, não são sempre adequados como candidatos a fármaco porque eles têm frequentemente meias-vidas de alguns minutos devido à degradação rápida por peptidases e/ou devido à filtragem renal e excreção na urina. A meia-vida de polipeptídeos ou proteínas em plasma humano varia muito (de alguns minutos a mais de uma semana).

[003] Uma eliminação alta de um agente terapêutico é inconveniente em casos onde é desejado manter um nível no sangue alto do mesmo durante um período de tempo prolongado. Uma maneira que tem sido atualmente usada para superar esta desvantagem é administrar dosagem grande de peptídeos ou proteínas terapêuticos de inte- resse ao paciente de maneira que mesmo se um pouco de peptídeo ou proteína terapêutico for degradado, o suficiente permanece para ser terapeuticamente eficaz. No entanto, este método é desconfortável para os pacientes. Uma vez que a maioria dos peptídeos ou proteínas terapêuticos não pode ser administrada oralmente, o peptídeo ou proteínas terapêuticos teriam que ser ou constantemente infundidos, frequentemente infundidos através de injeção intravenosa ou administrados frequentemente através da via inconveniente de injeções subcutâneas. A necessidade de administração frequente também resulta em muitos agentes terapêuticos de peptídeo ou proteína potenciais tendo um custo de tratamento projetado alto inaceitável. A presença de grandes quantidades de peptídeo ou proteína degradado pode também gerar efeitos colaterais indesejados.

[004] Desconforto em administração e custos altos são duas razões pelas quais a maioria dos peptídeos ou proteínas terapêuticos com perfis de bioatividade atraentes podem não ser desenvolvidos como candidatos a fármaco.

[005] Desta maneira, uma abordagem para prolongar a meia-vida de peptídeos ou proteínas é modificar os peptídeos ou proteínas terapêuticos de tal maneira que sua degradação é deixada mais lenta enquanto ainda mantendo a atividade biológica. Albumina do soro tem uma meia-vida de mais de uma semana, e uma abordagem para aumentar a meia-vida no plasma de peptídeos ou proteínas foi derivatizá- los com uma entidade química que se liga à albumina do soro ou outras proteínas do plasma.

[006] No entanto, há ainda uma necessidade de identificar novas porções de prolongamento da meia-vida para modificar biomoléculas terapêuticas tais como peptídeos e proteínas a fim de prover duração mais longa de ação in vivo enquanto mantendo baixa toxidez e vantagens terapêuticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção se refere a um conjugado compreendendo uma biomolécula ligada a um ácido graxo através de um ligante onde o ácido graxo tem as Fórmulas A1, A2 ou A3 que seguem:

[008] R1 é CO2H ou H;

[009] R2, R3 e R4 são independentemente um do outro H, OH, CO2H, -CH=CH2 ou -C=CH;

[0010] Ak é C6-C30 alquileno ramificado;

[0011] n, m e p são independentemente um do outro um inteiro entre 6 e 30, ou uma amida, um éster ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0012] O ácido graxo de Fórmulas A1, A2 e A3 quando conjugado a uma biomolécula de interesse através de um ligante foi verificado aumentar a meia-vida da dita biomolécula para um grau muito maior do que os resíduos de ácido graxo mais comumente usados.

[0013] Em uma outra modalidade, a invenção se refere a um conjugado compreendendo uma biomolécula ligada a um ácido graxo de Fórmula A1 onde pelo menos um de R2 e R3 é CO2H.

[0014] Em uma outra modalidade da presente invenção, a biomo- lécula de interesse é um peptídeo terapêutico, uma proteína terapêutica ou um RNA. Em ainda um outro aspecto da presente modalidade, a biomolécula de interesse é um peptídeo ou polipeptídeo. Em ainda um aspecto adicional da presente modalidade, o peptídeo ou polipeptídeo é um peptídeo agonista de APJ, um peptídeo agonista de receptor de oxitocina, serelaxina, NPFF, um peptídeo PIP, um peptídeo FGF23, um peptídeo AgRP ou uma proteína Fator de Diferenciação de Crescimento 15 (GDF15), homólogos, variantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos.

[0015] Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo um conjugado da invenção e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0016] Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere a combinações incluindo um conjugado da invenção e combinações farmacêuticas de um ou mais agentes terapeuticamente ativos.

[0017] Em uma outra modalidade a invenção se refere ao ácido graxo de Fórmula A1, A2 ou A3.

[0018] Em uma outra modalidade, a presente invenção compreende o uso dos conjugados descritos aqui, e composições dos mesmos, para tratar e/ou prevenir várias doenças, distúrbios e condições e/ou os sintomas dos mesmos.

[0019] Por exemplo, a invenção se refere a um método para ativação do receptor de APJ em um indivíduo com necessidade do mesmo compreendendo: administração ao indivíduo de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é um agonista de APJ. Os conjugados da invenção, através da ativação do receptor de APJ, têm utilidade no tratamento de falência cardíaca descompensada aguda (ADHF), falência cardíaca crônica, hipertensão pulmonar, fibrilação atrial, síndrome Brugada, taquicardia ventricular, aterosclerose, hipertensão, restenose, doenças cardiovasculares isquêmicas, cardiomiopatia, fibrose cardíaca, arritmia, retenção de água, diabetes (incluindo diabetes gestacional), obesidade, doença arterial periférica, acidentes cerebrovasculares, ataques isquêmicos transientes, lesões cerebrais traumáticas, esclerose amiotrófica lateral, lesões por queimadura (incluindo queimadura solar) e pré-eclâmpsia. Em um aspecto preferido da presente modalidade os conjugados da invenção são úteis no tratamento de falência cardíaca descompensada aguda (ADHF) ou falência cardíaca crônica.

[0020] Em uma outra modalidade, a invenção se refere a um método para ativação do receptor de oxitocina em um indivíduo com necessidade do mesmo compreendendo: administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é um peptídeo agonista de receptor de oxito- cina. Os conjugados da invenção, através da ativação do receptor de oxitocina, têm utilidade no tratamento de autismo (terapêutico ou profilático), enxaqueca, distúrbios de hiperatividade com déficit de atenção (ADHD), distúrbio definhante oposicional (ODD), estresse, incluindo distúrbio de estresse pós-traumático, ansiedade, incluindo distúrbios de ansiedade e depressão, esquizofrenia, distúrbios psiquiátricos e perda de memória, retirada de álcool, vício de droga, Síndrome Prader-Willi, distúrbios ou doenças metabólicos, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, dislipidemia, níveis de glicose elevados, níveis de insulina elevados e nefropatia diabética, fibromialgia, distúrbio do sono, apneia do sono, falência cardíaca diastólica, incontinência urinária, ateroscle- rose, hipertensão, disfunção erétil, sintomas de hipertrofia prostática, doença hepática graxa não alcoólica, condições de lactação comprometidas, comprometimento da indução do trabalho de parto, condições de atonia uterina, sangramento excessivo, inflamação, dor, dor abdominal, dor nas costas, disfunção sexual masculina e feminina, síndro- me do intestino irritável (IBS), constipação, obstrução gastrointestinal, perda de sangue cirúrgica, hemorragia pós-parto, cicatrização de ferina, infecção, mastite, comprometimento da expulsão da placenta, os- teoporose; e para o diagnóstico de câncer e insuficiência placentária. Em um aspecto preferido da presente modalidade os conjugados da invenção são úteis no tratamento de autismo, incluindo distúrbios de ansiedade e depressão, enxaqueca, ADHD, distúrbio definhante opo- sicional, esquizofrenia, distúrbios psiquiátricos, obesidade, condições de lactação comprometidas, comprometimento de indução do trabalho de parto, condições de atonia uterina, sangramento excessivo, hemorragia pós-parto. Em uma modalidade ainda mais preferida, os conjugados da invenção são úteis para o tratamento da Síndrome de Prader-Willi.

[0021] Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento de síndrome de Cushing, Hipercotisolismo, a síndrome ACTH ectópica, a mudança em massa adrenocortical, doença adrenocortical nodular pigmentada primária (PPNAD), complexo de Carney (CNC), o excesso mineralocorticoide induzido por cortisol, Condições associadas com distúrbio do estresse pós-traumático, hirsutismo, pele fina, miopatia, osteoporose, fragilidade do tecido aumen- taa, cicatrização de ferida pobre, hipertensão, diabetes mellitus, teor de potássio no soro baixo, teor de eosinófilos baixo e linfopenia compreendendo: administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é um peptídeo AgRP. Em um aspecto preferido da presente modalidade os conjugados da invenção são úteis no tratamento de síndrome de Cushing, Hipercortisolismo e síndrome ACTH ectópica, osteoporose.

[0022] Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de doenças relacionadas a FGF23 tais como condições relacionadas à idade (selecionadas do grupo consistindo em sarcopenia, atrofia da pele, enfraquecimento muscular, atrofia cerebral, aterosclerose, arteriosclerose, enfisema pulmonar, osteoporose, osteoartrite, incompetência imunológica, pressão sanguínea alta, demência, doença de Huntington, doença de Alzheimer, cataratas, degeneração macular relacionada com a idade, cancer de próstata, acidente vascular cerebral, expectativa de vida diminuída, perda de memória, rugas, função renal prejudicada e perda de audição relacionada com a idade), um distúrbio metabólico (selecionado do grupo consistindo em Diabetes Tipo II, Síndrome Metabólica, hiperglicemia e obesidade), hiperfosfatemia (calcinose tumoral, sín- drome de hiperostose hiperfosfatêmica), doença renal crônica, falência renal crônica, câncer, câncer de mama e/ou atrofia muscular compreendendo: administração ao indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é um peptídeo de FGF23.

[0023] Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento de falência cardíaca aguda, falência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (HFrEF), falência cardíaca crônica com fração de ejeção preservada (HFpEF), disfunção diastólica, remodelagem pós-miocardial, angina, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão da artéria pulmonar, fibrose (difusa, cardíaca, renal, pulmonar, hepática), escleroderma, cicatrização de ferida, isquemia do membro crítica, doença vascular periférica, claudicação intermitente, disfunção renal e doença renal crônica compreendendo: administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é um peptídeo serelaxina. Em um aspecto preferido da presente modalidade, os conjugados de sere- laxina da invenção são úteis no tratamento de falência cardíaca aguda, falência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (HFrEF), falência cardíaca crônica com fração de ejeção preservada (HFpEF), disfunção diastólica, remodelagem pós-miocardial, angina, hipertensão, hipertensão pulmonar ou hipertensão da artéria pulmonar.

[0024] Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de distúrbios metabólicos tais como diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), comprometimento da célula beta pancreática, intolerância à glicose, hiperglicemia, resistência à insulina, obesidade, dislipidemia, esteatoepatite não alcoólica (NASH), síndrome metabólica e outros distúrbios metabólicos compreendendo: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é um peptídeo PIP.

[0025] Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de distúrbios ou doenças metabólicas, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, es- teatoepatite não alcoólica, resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastroparese, incontinência de urgência, sedação, dores neuropática e inflamatória, perda de memória e outros distúrbios metabólicos compreendendo: administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é peptídeo NPFF.

[0026] Em ainda um outro aspecto da presente invenção, a invenção se refere a um método de tratamento de distúrbios ou doenças metabólicas, diabetes, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, doenças hepáticas gordurosas/esteatoepatite alcoólicas e não alcoólicas e outras doenças do fígado progressivas, pancreatite, dislipidemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, ateroscle- rose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastropa- rese e outros distúrbios metabólicos, em um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo: administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção onde a biomolécula é Fator de Diferenciação de Crescimento 15 humano (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos.

[0027] Estes e outros aspectos da invenção serão elucidados na descrição detalhada da invenção que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

[0028] A Figura 1 mostra que o Exemplo 24 diminuiu os níveis de APOC3 no plasma mais eficazmente do que o exemplo de referência

3. DESCRIÇÃO DETALHADA Definição:

[0029] Para propósitos de interpretação do presente pedido, as definições que seguem se aplicarão a menos que de outro modo especificado e, sempre que apropriado, termos usados no singular também incluirão o plural e vice versa.

[0030] Deve ser notado que conforme aqui usado e nas reivindicações apensas, as formas no singular "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Desta maneira, por exemplo, referência a "o conjugado" inclui referência a um ou mais conjugados; referência a "o polipeptídeo" inclui referência a um ou mais polipeptídeos; e assim por diante.

[0031] O termo alquila se refere a uma porção hidrocarboneto ramificada ou não ramificada saturada (ou de cadeia reta ou linear), compreendendo 1 a 30 átomos de carbono. Preferivelmente a alquila compreende 5 a 20 átomos de carbono e mais preferivelmente 10 a 15 átomos de carbono. C10-15alquila se refere a uma cadeia alquila compreendendo 10 a 15 carbonos. O termo "alquileno" se refere a uma alquila divalente como definido supra.

[0032] O termo "alquenila" se refere a um hidrocarboneto ramificado ou não ramificado tendo pelo menos uma ligação dupla carbono- carbono. O termo "C2-30alquinila" se refere a um hidrocarboneto tendo dois a sete átomos de carbono e compreendendo pelo menos uma li- gação tripla carbono-carbono.

[0033] O termo "alquinila" se refere a um hidrocarboneto ramificado ou não ramificado tendo pelo menos uma ligação tripla carbono- carbono. O termo "C2-30alquinila" se refere a um hidrocarboneto tendo dois a sete átomos de carbono e compreendendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono.

[0034] O termo arila se refere a grupos hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos ou bicíclicos tendo 6-10 átomos de carbono na porção de anel. Exemplos representativos de arila são fenila ou naftila.

[0035] O termo heteroarila inclui heteroarila monocíclica ou bicícli- ca, contendo de 5-10 membros no anel selecionados de átomos de carbono e 1 a 5 heteroátomos, e cada heteroátomo é independentemente selecionado de O, N ou S onde S e N podem ser oxidados para vários estados de oxidação. Para sistema heteroarila bicíclico, o sistema é totalmente aromático (isto é, todos os anéis são aromáticos).

[0036] O termo cicloalquila se refere a grupos hidrocarbonetos monocíclicos, bicíclicos ou tricíclicos saturados ou insaturados, mas não aromáticos, de 3-12 átomos de carbono, preferivelmente 3-8, ou 3-7, átomos de carbono. Para sistema cicloalquila bicíclico ou tricíclico, todos os anéis são não aromáticos. Por exemplo, cicloalquila compreende cicloalquenila ou cicloalquinila. O termo "cicloalquenila" se refere a um grupo hidrocarboneto bicíclico ou tricíclico de 3-12 átomos de carbono, tendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. O termo "cicloalquinila" se refere a um grupo hidrocarboneto bicíclico ou tricíclico de 3-12 átomos de carbono, tendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono.

[0037] O termo heterociclila se refere a um sistema de anel mono- cíclico, bicíclico ou tricíclico não aromático saturado ou insaturado (parcialmente insaturado, mas não aromático) que contém pelo menos um heteroátomo selecionado de O, S e N, onde o N e o S podem tam- bém ser opcionalmente oxidados para vários estados de oxidação. Em uma modalidade, porção heterociclila representa um anel monocíclico saturado contendo de 5-7 átomos no anel e contendo opcionalmente um heteroátomo adicional, selecionado de O, S ou N. O anel heterocí- clico pode ser substituído com alquila, halo, oxo, haloalquila, haloalcó- xi. Em uma outra modalidade, heterociclila é di- ou tricíclico. Para sistema policíclico, um pouco do anel pode ser aromático e fundido a anel ou anéis saturados ou parcialmente saturados. O sistema fundido total não é totalmente aromático. Por exemplo, um sistema de anel hetero- cíclico pode ser um anel heteroarila aromático fundido com sistema de anel cicloalquila saturado ou parcialmente saturado.

[0038] O termo "conjugado" pretende se referir à entidade formada como um resultado de uma ligação covalente de biomolécula e uma porção de ácido graxo, através de um ligante. O termo "conjugação" se refere à reação química resultante na ligação covalente da biomolécu- la e da porção de ácido graxo.

Biomolécula:

[0039] Como aqui usado, o termo biomolécula inclui, mas não é limitado a, anticorpos (por exemplo, monoclonais, quiméricos, humanizados, nanocorpos e fragmentos dos mesmos, etc), colesterol, hormônios, peptídeos, proteínas, quimioterapêuticos e outros tipos de agentes antineoplásticos, fármacos de peso molecular baixo, vitaminas, co- fatores, nucleosídeos, nucleotídeos, oligonucleotídeos, ácidos nuclei- cos enzimáticos, ácidos nucleicos de antissentido, oligonucleotídeos de formação de tríplex, composições de DNA ou RNA de antissentido, composições de DNA:RNA quimérico, alozimas, aptâmeros, ribozima, decoys e análogos dos mesmos, plasmídeos e outros tipos de vetores de expressão, e moléculas de ácido nucleico pequenas, agentes RNAi, ácido nucleico de interferência curto (siNA), ácido ribonucleico mensageiro (RNA mensageiro, mRNA), RNA de interferência curto (siRNA), RNA de filamento duplo (dsRNA), micro-RNA (miRNA) e moléculas de RNA grampo-de-cabelo curto (shRNA), ácido nucleico de peptídeo (PNA), um ribonucleotídeo de ácido nucleico travado (LNA), nucleotí- deo morfolino, ácido nucleico treose (TNA), ácido nucleico glicol (GNA), sisiRNA (RNA de interferência internamente segmentado pequeno), aiRNA (RNA de interferência assimétrico) e siRNA com 1, 2 ou mais incompatibilidades entre os filamentos de sentido e antissentido com células e/ou tecidos relevantes, tal como em uma cultura de célula, indivíduo ou organismo. Tais compostos podem ser purificados ou parcialmente purificados, podem ser de ocorrência natural e podem ser quimicamente modificados.

[0040] Em uma modalidade, a biomolécula é um polipeptídeo, pep- tídeo, proteínas ou um agente RNAi, ácido nucleico de interferência curto (siNA), RNA de interferência curto (siRNA), RNA de filamento duplo (dsRNA), micro-RNA (miRNA) ou uma molécula de RNA gram- po-de-cabelo curto (shRNA).

[0041] Em uma outra modalidade, a biomolécula é um polipeptídeo (ou proteína) ou peptídeo. Exemplos de polipeptídeos ou peptídeos são peptídeos agonistas de APJ, peptídeos de oxitocina, serelaxina, NPFF, um peptídeo PIP, um peptídeo FGF23, peptídeos AgRP e pep- tídeo GDF15. Em uma modalidade preferida, a biomolécula é polipep- tídeo GDF15, homólogo, variante, mutante, fragmento ou outras formas modificadas dos mesmos.

[0042] Um "ácido ribonucleico" (RNA) é um polímero de nucleotí- deos ligado por uma ligação fosfodiéster, onde cada nucleotídeo contém ribose ou uma modificação da mesma como o componente açúcar. Cada nucleotídeo contém uma adenina (A), uma guanina (G), uma citosina (C), uma uracila (U) ou uma modificação das mesmas como a base. A informação genética em uma molécula de mRNA é codificada na sequência das bases de nucleotídeo da molécula de mRNA, que estão dispostas em códons consistindo em três bases de nucleotídeo cada um. Cada códon codifica um aminoácido específico do polipeptí- deo, exceto os códons de parada, que terminam a tradução (síntese de proteína). Dentro de uma célula viva, mRNA é transportado para um ribossomo, o sítio de síntese de proteína, onde ele provê a informação genética para síntese de proteína (tradução). Para descrição mais completa vide Alberts B e outros (2007) Molecular Biology of the Cell, Quinta Edição, Garland Science.

[0043] Os termos "agente RNAi", "RNA de interferência curto", "siRNA", "ácido nucleico de interferência curto", "siNA" e similar como aqui usado se referem a qualquer molécula de ácido nucleico capaz de inibir ou subregular expressão de gene ou replicação viral através da mediação da interferência de RNA (RNAi) ou silencia- mento de gene de uma maneira específica de sequência. Os termos incluem RNA de interferência curto (siRNA), RNA grampo-de-cabelo (shRNA), microRNA (miRNA), oligonucleotídeos de interferência cur-tos, moléculas de ácido nucleico de interferência curtas quimicamente modificadas, sisiRNA (RNA de interferência internamente segmentado pequeno), aiRNA (RNA de interferência assimétrico), siRNA com 1, 2 ou mais incompatibilidades entre os filamentos de sentido e antissentido com células e/ou tecidos relevantes, agentes RNAi onde existem uma ou mais incompatibilidades entre os filamentos de sentido e antissentido, agentes RNAi onde o filamento de sentido é muito curto em relação ao filamento de antissentido e/ou tem um ou mais cortes de filamento simples, ou qualquer outra molécula capaz de mediar interferência de RNA. Agentes RNAi podem compreender ribonucleotídeos ou ser modificados ou substituídos em um ou mais açúcar, base e/ou fosfato. Como exemplos não limi- tantes, os agentes RNAi podem ser modificados na posição 2' com uma modificação 2' selecionada do grupo consistindo em: 2'-desóxi, 2'-desóxi-2'-flúor, 2'-O-metila, 2'-O-metoxietila (2'-O-MOE), 2'-O- aminopropila (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetila (2'-O-DMAOE), 2'-O- dimetilaminopropila (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietila (2'-O- DMAEOE) e 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA). Em uma modalidade, todas as pirimidinas (uridina e citidina) são nucleosídeos 2'-O- metila modificados. Em várias modalidades, um ou mais fosfatos podem ser substituídos com um ligante internucleosídeo modificado selecionado de fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, borano- fosfonoato e um ligante amida. Em várias modalidades, um ou mais nucleotídeos podem ser modificados ou substituídos com DNA, um ácido nucleico de peptídeo (PNA), ácido nucleico travado (LNA), nu- cleotídeo morfolino, ácido nucleico treose (TNA), ácido nucleico gli- col (GNA), ácido nucleico arabinose (ANA), ácido nucleico 2'- fluorarabinose (FANA), ácido nucleico ciclo-hexeno (CeNA), ácido nucleico anidroexitol (HNA), ácido nucleico destravado (UNA). Várias modificações e substituições de agentes RNAi são conhecidas na técnica e podem ser usadas no contexto da presente descrição. siRNAs são responsáveis por interferência de RNA, o processo de silenciamento de gene pós-transcripcional específico de sequência em animais e plantas. siRNAs são gerados naturalmente através de clivagem de ribonuclease III a partir de RNA de filamento duplo mais longo (dsRNA) que são homólogos a, ou específicos para, o alvo do gene silenciado; agentes RNAi artificiais podem ser produzidos através de qualquer método conhecido na técnica.

[0044] Como aqui usado, o termo "polipeptídeo" se refere a um polímero de resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídicas, sejam produzidos naturalmente ou sinteticamente. Polipeptídeos de menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácido são geralmente referidos como "peptídeos". O termo "peptídeo" pretende indicar uma sequência de dois ou mais aminoácidos ligados por ligações peptídi- cas, onde os ditos aminoácidos podem ser naturais ou não naturais. O termo compreende os termos polipeptídeos e proteínas, que podem consistir em dois ou mais peptídeos mantidos juntos por interações covalentes, tais como, por exemplo, pontes de cisteína, ou interações não covalentes. As abreviações de três letras ou uma letra reconhecida na técnica são usadas para representar resíduos de aminoácido que constituem os peptídeos e polipeptídeos da invenção. Exceto quando precedido com "D", o aminoácido é um L-aminoácido. Quando a abreviação de uma letra é uma letra maiúscula, ela se refere ao D- aminoácido. Quando a abreviação de uma letra é uma letra minúscula, ela se refere ao L-aminoácido. Abreviações de grupos ou fitas ou ami- noácidos são usadas para representar peptídeos. Peptídeos são indicados com o terminal N à esquerda e a sequência é escrita do terminal N para o terminal C.

[0045] Os peptídeos da invenção contêm aminoácidos não naturais (isto é, compostos que não ocorrem na natureza) e outros análogos de aminoácido como são conhecidos na técnica podem ser alternativamente empregados.

[0046] Certos aminoácidos não naturais podem ser introduzidos através da tecnologia descrita em Deiters e outros, J. Am. Chem. Soc. 125:11782-11783, 2003; Wang e Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang e outros, Science 292:498-500, 2001; Zhang e outros, Science 303:371-373, 2004 ou na Patente U.S. No. 7.083.970. Em suma, alguns desses sistemas de expressão envolvem mutagênese direcionada a sítio para introduzir um códon de não sentido, tal como um TAG âmbar, em uma estrutura de leitura aberta codificando um polipeptídeo da invenção. Tais vetores de expressão são então introduzidos em um hospedeiro que pode utilizar um tRNA específico para o códon de não sentido introduzido e carregado com o aminoácido não natural de escolha. Aminoácidos não naturais particulares que são benéficos para propósito de conjugação de porções aos polipeptídeos da invenção incluem aqueles com cadeias laterais acetileno e azido.

[0047] Uma "proteína" é uma macromolécula compreendendo uma ou mais cadeias de polipeptídeo. Cada uma dessas cadeias de poli- peptídeo pode ser conjugada com uma molécula de ácido graxo de Fórmula A1, A2 ou A3. Uma proteína pode também compreender componentes não peptídicos, tais como grupos carboidrato. Carboidratos e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzida, e variará com o tipo de célula. Proteínas são definidas aqui em termos de suas estruturas de estrutura principal de aminoácido; substituintes tais como grupos carboidrato são geralmente não especificados, mas podem estar presentes, não obstante. Uma proteína ou polipeptídeo codificado por uma molécula de DNA não hospedeiro é uma proteína ou polipeptídeo "heterólogo".

[0048] Um "polipeptídeo isolado ou proteína isolada" é um polipep- tídeo ou proteína (por exemplo, GDF15) que é essencialmente livre de componentes celulares, tal como carboidrato, lipídeo ou outras impurezas proteináceas associadas com o polipeptídeo na natureza. Tipicamente, uma preparação de polipeptídeo ou proteína isolado contém o polipeptídeo ou proteína em uma forma altamente purificada, isto é, pelo menos cerca de 80% pura, pelo menos cerca de 90% pura, pelo menos cerca de 95% pura, mais do que 95% pura, tal como 96%, 97% ou 98% ou mais pura ou mais do que 99% pura. Uma maneira de mostrar que uma preparação de proteína particular contém um polipeptí- deo ou proteína isolado é através do aparecimento de uma faixa única seguindo eletroforese em dodecil sulfato de sódio (SDS)-gel de polia- crilamida da preparação de proteína e tingimento com Coomassie Brilliant Blue do gel. No entanto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipeptídeo ou proteína em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou formas alternativamente glicosiladas ou derivatiza- das. Preferivelmente, o polipeptídeo isolado é substancialmente livre de quaisquer outros polipeptídeos contaminantes ou outros contami- nantes que são encontrados em seu ambiente natural que interfeririam com seu uso terapêutico, de diagnóstico, profilático ou de pesquisa.

[0049] Um versado comum na técnica compreenderá que várias substituições de aminoácido, por exemplo, substituições de aminoáci- do conservativas, podem ser feitas na sequência de qualquer um do polipeptídeo ou proteína descrito aqui, sem necessariamente diminuir sua atividade. Como aqui usado, "aminoácido comumente usado como um substituto para o mesmo" inclui substituições conservativas (isto é, substituições com aminoácidos de características químicas comparáveis). Para os propósitos de substituição conservativa, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, glicina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos polares (hidrofílicos), neutros, incluem serina, treonina, cisteína, tirosi- na, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmi- co. Exemplos de substituições de aminoácido incluem substituição de um D-aminoácido por um L-aminoácido correspondente, substituição de homocisteína ou cisteína ou outros aminoácidos não naturais tendo uma cadeia lateral contendo tiol, substituição de uma homolisina por uma lisina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiônico, ornitina ou outros aminoácidos não naturais tendo uma cadeia lateral contendo amino ou substituição de norvalina por alanina ou similar.

[0050] O termo "aminoácido", como aqui usado, se refere a ami- noácidos de ocorrência natural, aminoácidos não naturais, análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural, todos em seus estereoisômeros D e L se sua estrutura permitir tais formas estere- oisoméricas. Aminoácidos são referidos aqui ou pelo seu nome, seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

[0051] O termo "de ocorrência natural" se refere a materiais que são encontrados na natureza e não são manipulados pelo homem. Similarmente, "de ocorrência não natural", "não natural", e similar, como aqui usado, se referem a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem. Quando usado em conexão com aminoácidos, o termo "de ocorrência natural" se refere aos 20 aminoácidos convencionais (isto é, alanina, (A ou Ala), cisteína (C ou Cys), ácido aspártico (D ou Asp), ácido glutâmico (E ou Glu), fenilalanina (F ou Phe), glicina (G ou Gly), histidina (H ou His), isoleucina (I ou Ile), lisina (K ou Lys), leucina (L ou Leu), metionina (M ou Met), asparagina (N ou Asn), prolina (P ou Pro), glutamina (Q ou Gln), arginina (R ou Arg), serina (S ou Ser), treonina (T ou Thr), valina (V ou Val), triptofano (W ou Trp) e tirosina (Y ou Tyr)).

[0052] O termo "aminoácido não natural", como aqui usado, pretende representar estruturas de aminoácido que não podem ser geradas biossinteticamente em nenhum organismo usando genes não modificados ou modificados de nenhum organismo, seja o mesmo ou diferente. O termo se refere a um resíduo de aminoácido que não está presente na sequência ou sequências de proteína de ocorrência natural (tipo selvagem) da presente invenção. Estas incluem, mas não estão limitadas a, aminoácidos modificados e/ou análogos que aminoáci- do que não são um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, seleno- cisteína, pirrolisina (Pyl) ou pirrolino-carbóxi-lisina (Pcl, por exemplo, como descrito na publicação de patente PCT WO2010/48582). Tais resíduos de aminoácido não naturais podem ser introduzidos através de substituição de aminoácidos de ocorrência natural e/ou através de inserção de aminoácidos não naturais na sequência ou sequências de proteína de ocorrência natural (tipo selvagem) da invenção. O resíduo de aminoácido não natural também pode ser incorporado de maneira que uma funcionalidade desejada é fornecida à molécula, por exemplo, a habilidade em ligar uma porção funcional (por exemplo, PEG). Quando usado em conexão com aminoácidos, o símbolo "U" deve significar "aminoácido não natural", como aqui usado.

[0053] O termo "análogo" como aqui usado se referindo a um poli- peptídeo ou proteína significa um peptídeo ou proteína modificado onde um ou mais resíduos de aminoácido do peptídeo/proteína foram substituídos por outros resíduos de aminoácido e/ou onde um ou mais resíduos de aminoácido foram deletados do peptídeo/proteína e/ou onde um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados ao peptí- deo/proteína. Tal adição ou deleção de resíduos de aminoácido pode acontecer no terminal N do peptídeo e/ou no terminal C do peptídeo.

[0054] Como aqui usado, o termo "éster do conjugado" se refere a um conjugado que compreende um peptídeo ou polipeptídeo onde um derivado de éster de um grupo de ácido carboxílico está presente (por exemplo, CO2H no terminal C foi convertido em -COOR) onde R do éster se refere a grupos C1-6 alquila tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, etc, grupos C3-8 cicloalquila tais como ciclopentila, ciclo-hexila, etc, grupos C6-10 arila tais como fenila, a-naftila, etc, grupos C6-10 aril-C1-6 alquila, por exemplo, grupos fenil-C1-2 alquila tais como benzila, fenetila, benzidrila, etc, e grupos a-naftil-C1-2 alquila tal como a-naftilmetila e similar. Quando a porção de peptídeo ou polipep- tídeo do conjugado possui grupos carboxila ou carboxilato adicionais em posições outras que não o terminal C, estes polipeptídeos onde tais grupos são amidados ou esterificados também se encaixam na categoria do polipeptídeo da invenção. Em tais casos, os ésteres po- dem, por exemplo, ser os mesmos tipos de ésteres que os ésteres C- terminais mencionados acima.

[0055] Como aqui usado, o termo "amida do conjugado" se refere a um conjugado que compreende um peptídeo ou polipeptídeo onde um derivado de amida de um grupo ácido carboxílico está presente (por exemplo, -CO2H foi convertido em -CO(NR'R') onde R' é H ou R e R são como acima definido. O termo "amida do conjugado" se refere também a um conjugado que compreende um peptídeo ou polipeptídeo onde um derivado de amida de um grupo amino está presente (isto é, outro que não o grupo amino conjugado a um ácido graxo) (por exemplo, -NH2 foi convertido em -NH-C(O)R) onde R é definido supra. Em uma modalidade preferida, uma "amida do conjugado" é um conjugado que compreende um peptídeo ou polipeptídeo onde o grupo carboxílico no terminal C foi amidado (por exemplo, -CO2H foi convertido em -C(O)NH2, -C(O)NH- C1-6 alquila, -C(O)NH-C1-2alquilfenila ou -C(O)N(C1-6 alquila)2).

[0056] O termo "APJ" (também referido como "receptor de apeli- na", "receptor de angiotensina tipo 1", "receptor de angiotensina II tipo 1" e similar) indica um receptor acoplado a Gi domínio de transmem- brana 7, resíduo 380, cujo gene está localizado no braço longo de cromossomo 11 em humanos (Sequência de Referência NCBI: NP_005152.1, e codificado pela Sequência de Referência NCBI: NM_005161). APJ foi primeiro clonado em 1993 a partir do DNA ge- nômico humano usando primers de oligonucleotídeo degenerados (O'Dowd e outros, Gene, 136:355-60, 1993) e compartilha homologia significante com receptor de angiotensina II tipo 1. Apesar desta homo- logia, no entanto, angiotensina II não se liga a APJ. Embora órfão por muitos anos, o ligante endógeno foi isolado e chamado apelina (Tate- moto e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 471-6 (1998)).

[0057] O termo "agonista de APJ" inclui polipeptídeos de apelina: Apelina indica uma pré-proteína de resíduo 77 (Sequência de Refe- rência NCBI: NP_0059109.3 e codificada pela Sequência de Referência NCBI: NM_017413.3), que é processada em formas biologicamente ativas de peptídeos d apelina, tais como apelina-36, apelina-17, apelina-13, apelina-12. O peptídeo maduro de comprimento integral, referido como "apelina-36" compreende 36 aminoácidos, mas a isoforma mais potente é a forma piroglutamatada de um 13mer de apelina (apelina-13), referida como "Pyr-1-apelina-13 ou Pyr1-apelina-13". Formas diferentes de apelina são descritas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos 6.492.324B1. Agonistas do peptídeo de apelina são também descritos nos pedidos de patente número WO 2013/111110, Pedido US No. 14/082771 e pedidos de patente US provisórios Nos. 61/858263, 61/858280 e 61/858290, que são aqui incorporados a título de referência.

[0058] Os termos "peptídeo agonista de receptor de oxitocina" e "peptídeo de oxitocina" são usados intercomutavelmente e incluem oxitocina e seus análogos. Oxitocina é um hormônio de peptídeo cíclico de nove aminoácidos com dois resíduos cisteína que formam uma ponte dissulfeto entre as posições 1 e 6. Oxitocina humana compreende a sequência Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly. O termo "peptí- deo agonista de receptor de oxitocina" também inclui análogos de oxi- tocina que retêm bioatividade. Tais moléculas análogas são capazes de agir de uma maneira similar à oxitocina endógena, incluindo ligação ao receptor de oxitocina. Análogos de oxitocina de interesse particular são aqueles revelados no pedido PCT No. WO 2014/095773 (particu-larmente Exemplo 13); aqueles revelados no pedido de patente US No. US2011/044905 (particularmente Exemplo 49); e aqueles revelados em Kazimierz Wisniewski e outros, Journal of Medicinal Chemistry 2014, 57, 5306-5317 e Zbigniew Grzonka e outros, Journal of Medicinal Chemistry 1983, 26, 1786-1787; que são todos aqui incorporados a título de referência.

[0059] Por "PIP" ou "Peptídeo Induzível por Prolactina" quer dizer a proteína com No. de Acesso GenBank NP_002643 que exibe papéis em processos biológicos diversos. PIP é também conhecido na técnica como proteína-15 do fluido da doença cística bruto (GCDFP-15); proteína de ligação à actina secretora (SABP); glicoproteína extrapartótida (EP-GP); e proteína de ligação a CD4 de 17 kDa (GP17). PIP é expresso em órgãos exócrinos e em tumores de mama humanos benignos e malignos. A proteína PIP secretada madura tem uma massa molecular de 13 kDa e opera como um polipeptídeo de 17-20 kDa em SDS-PAGE sugerindo um evento de glicosilação. PIP é expresso na maioria dos órgãos que contribuem para fluidos corporais humanos; a expressão de PIP é a mais alta em glândula salivar seguido por glândulas lacrimal, próstata, músculo, traqueia e mamária. O gene de PIP codifica o polipeptídeo PIP.

[0060] O "peptídeo PIP" como aqui usado significa um PIP humano ou um homólogo, variante, fragmento ou forma modificada do mesmo, que retém pelo menos uma atividade de PIP humano.

[0061] A sequência de um exemplo não limitante de PIP humano é apresentada na SEQ ID NO: 11: 1 MRLLQLLFRA SPATLLLVLC LQLGANKAQD NTRKIIIKNF DIPKSVRPND EVTAVLAVQT 61 ELKECMVVKT YLISSIPLQG AFNYKYTACL CDDNPKTFYW DFYTNRTVQI AAVVDVIREL 121 GICPDDAAVI PIKNNRFYTI EILKVE (SEQ ID NO: 11).

[0062] A SEQ ID NO: 11 representa o PIP do tipo selvagem humano de comprimento integral, incluindo o peptídeo de sinal (aminoá- cidos 1-28), que não é requerido para funcionamento.

[0063] Um outro exemplo não limitante do termo "PIP" como aqui usado são aminoácidos (aa) 29-146 de SEQ ID NO: 11, que então não têm o peptídeo de sinal (aminoácidos 1-28) e são apresentados abaixo como SEQ IDNO: 12. 1 QDNTRKIIIK NFDIPKSVRP NDEVTAVLAV QTELKECMVV KTYLISSIPL QGAFNYKYTA 61 CLCDDNPKTF YWDFYTNRTV QIAAVVDVIR ELGICPDDAA VIPIKNNRFY TIEILKVE (SEQ ID NO: 12)

[0064] Por um "homólogo", "variante", "fragmento" ou "forma modificada" de PIP ou similar se quer dizer um polipeptídeo similar, mas não idêntico, a um PIP humano, mas que retém pelo menos uma atividade de PIP humano. Tal polipeptídeo pode ter uma sequência não idêntica àquela de PIP humano (por exemplo, SEQ ID NO: 12) ou ter uma sequência idêntica àquela de PIP humano (por exemplo, SEQ ID NO: 12), mas varia de alguma outra maneira (por exemplo, uma modificação pós-traducio- nal). Tal polipeptídeo pode compreender, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 ou ter, por exemplo, um máximo de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 diferenças de aminoácido (por exemplo, substituições, deleções e/ou adições) da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, o homólogo de PIP, variante, fragmento ou forma modificada do mesmo retém pelo menos 90% de identidade de sequência ou tem um máximo de 25 diferenças de aminoá- cido da SEQ ID NO: 12. Um homólogo de PIP, variante, fragmento ou forma modificada retém pelo menos uma atividade de PIP humano.

[0065] Por "FGF23" ou "Fator de Crescimento de Fibroblasto 23" quer dizer o polipeptídeo também conhecido como FGF-23, ADHR; FGFN; HPDR2; HYPF; PHPTC; Ids Externas: OMIM: 605380 MGI: 1891427 HomoloGene: 10771 GeneCards: FGF23 Gene; Espécie: Humana; Entrez 8074; Ensembl ENSG00000118972; UniProt: Q9GZV9; Re- fSeq (mRNA): NM_020638; RefSeq (proteína): NP_065689; Localização (UCSC): Chr 12: 4.48 - 4.49 Mb; Espécie: Camundongo; Entrez: 64654; Ensembl: ENSMUSG00000000182; UniProt: Q9EPC2; RefSeq (mRNA): NM_022657; RefSeq (proteína): NP_073148; Localização (UCSC): Chr 6: 127.07 - 127.08 Mb. O gene FGF23 codifica o polipeptídeo FGF23.

[0066] Por "peptídeo FGF23" como aqui usado quer dizer FGF23 humano ou um homólogo, variante, fragmento ou forma modificada do mesmo, que retém pelo menos uma atividade de FGF23 humano.

[0067] A sequência de um exemplo não limitante de FGF23, incluindo o peptídeo de sinal, é apresentada na SEQ ID NO: 9.

[0068] A SEQ ID NO: 9 representa um FGF23 do tipo selvagem humano, de comprimento integral, incluindo o peptídeo de sinal (ami- noácidos 1-24), que não é requerido para funcionamento. Yamashita e outros. 2000 Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 494-498; Shimada e outros. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6500-6505; e Zhang e outros. 2004 Protein Sci. 13: 2819-2824.

[0069] Um exemplo não limitante do termo "FGF23" como aqui usado são aminoácidos (aa) 25-251 de SEQ ID NO: 9, que então não têm o peptídeo de sinal (aminoácidos 1-24) e é apresentado abaixo como SEQ ID NO: 8.

[0070] Por "homólogo", "variante", "fragmento" ou "forma modificada" de FGF23 ou similar quer dizer um polipeptídeo similar, mas não idêntico, a FGF23 humano (por exemplo, SEQ ID NO: 8), mas que retém pelo menos uma atividade de FGF23 humano. Tal polipeptídeo pode compreender, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou ter, por exemplo, um máximo de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 diferenças de aminoácido (por exemplo, substituições, deleções e/ou adições) da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o homólogo de FGF23, variante, fragmento ou forma modificada do mesmo retém pelo menos 90% de identidade de sequência ou tem um máximo de 25 diferenças de ami- noácido da SEQ ID NO: 8. Um homólogo de FGF23, variante, fragmento ou forma modificada retém pelo menos uma atividade de FGF23 humano. Tais atividades (ou funções) incluem, como exemplos não limitantes, aquelas conhecidas para FGF23 humano, incluindo papéis em ligação a receptor de FGF23, interação com proteína Klotho, proliferação celular e sinalização celular; e atividade em vários ensaios in vitro de atividade de FGF23, incluindo um ensaio de Egr-1- luciferase; e uma atividade relacionada a uma doença relacionada a FGF23 tal como uma condição relacionada com a idade (selecionada do grupo consistindo em sarcopenia, atrofia da pele, enfraquecimento muscular, atrofia cerebral, aterosclerose, arteriosclerose, enfisema pulmonar, osteroporose, osteoartrite, incompetência imunológica, pressão sanguínea alta, demência, doença de Huntington, doença de Alzheimer, cataratas, degeneração macular relacionada com a idade, câncer de próstata, acidente vascular cerebral, expectativa de vida diminuída, perda de memória, rugas, função renal comprometida e perda de audição relacionada com a idade), um distúrbio metabólico (se- lecionado do grupo consistindo em Diabetes Tipo II, Síndrome Metabólica, hiperglicemia e obesidade), hiperfosfatemia (calcinose tumoral, síndrome da hiperostose hiperfosfatêmica), doença renal crônica, falência renal crônica, câncer, câncer de mama e/ou atrofia muscular. Yamashita e outros. 2000 Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 494498; Shimada e outros. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 65006505; Urakawa e outros. 2006 Nature 444: 770-774; Zhang e outros, 2004 Protein Sci. 13: 2819-2824; WO 2013/027191, WO 2011/092234 e WO 2009/095372. Em algumas modalidades, a invenção provê um conjugado compreendendo um ácido graxo descrito aqui e um peptí- deo FGF23, onde o peptídeo FGF23 retém pelo menos uma atividade de FGF23; e em algumas modalidades, a atividade de FGF23 retida é função no ensaio de Egr-1-luciferase in vitro.

[0071] Por um "homólogo" de GFG23 quer dizer um polipeptídeo correspondendo a FGF23 humano, mas de uma fonte diferente, tal como um mamífero, tal como camundongo, rato, macaco Cynomolgus, vaca, porco, ovelha, cavalo, cachorros, etc, ainda retém pelo menos uma função de FGF23 humano.

[0072] Por uma "variante" de FGF23 quer dizer um FGF23 que compreende uma ou mais mutações (por exemplo, deleção, substituição ou adição), por exemplo, com relação à SEQ ID NO: 8, ainda retém pelo menos uma função de FGF23 humano. Mutações em FGF23 incluem aquelas nas posições Y154, Q156, R176, R179, C206 e C244. Tais mutações foram anteriormente descritas. Uma mutação em R179 confere resistência à proteólise em FGF23; em ADHR, mutações do sítio 176RXXR179 previnem clivagem e inativação de FGF23. White e outros. 2000 Nat. Genet. 26: 345-348; Liu e outros. 2003 J. Biol. Chem. 278: 37419-37426. A mutação em Y154 diminui a degradação; mutação em Q156 elimina um sítio de clivagem; e mutação em C206 e C244 reduz dimerização e agregação. O WO 2013/027191 e o WO 2011/092234. Um homólogo de FGF23, variante ou forma modificada pode compreender ainda um ou mais aminoácidos adicionais (que não são normalmente encontrados em FGF23 do tipo selvagem humano).

[0073] Um exemplo não limitante de variante de FGF23 é mostrado aqui:

[0074] A SEQ ID NO: 10 mostra uma variante de FGF23 onde o peptídeo de sinal (aa 1-24) foi deletado, mas um M inicial na posição 1 foi reintroduzido; e o aminoácido correspondendo a R179 foi mutado para Q. A SEQ ID NO: 10 é também chamada "hFGF23 R 179Q", "FGF23 R179", "hFGF23(R179Q)" e similar e representa uma variante de FGF23 que é usada no Exemplo 28C.

[0075] Variantes de FGF23 adicionais incluem, como exemplos não limitantes, aquelas que têm a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, mas também têm uma mutação em um ou mais de Y154, Q156, R176, R179, C206 e C244. Variantes de FGF23 adicionais incluem, como exemplos não limitantes, aquelas que têm a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, mas também têm uma mutação em um ou mais de: Y154, Q156, R176, R179, C206 e C244 e compreendem ainda um ou mais aminoácidos adicionais (que não são normalmente encontrados em FGF23 humano do tipo selvagem).

[0076] Por um "fragmento" de FGF23 quer dizer um FGF23 que compreende um ou mais aminoácidos deletados, por exemplo, com relação à SEQ ID NO: 8, ainda retém pelo menos uma função de FGF23 humano. Fragmentos funcionais de FGF23 incluem aminoáci- dos 180-251 de SEQ ID NO: 8, Goetz e outros. 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 407-412. Um fragmento de FGF23 pode ter também uma ou mais mutações, por exemplo, em qualquer uma ou mais posições Y154, Q156, R176, R179, C206 e C244, mas pode reter pelo menos uma atividade de FGF23 humano.

[0077] Por "forma modificada" de FGF23 quer dizer um FGF23 que compreende uma sequência similar ou idêntica àquela de FGF23, por exemplo, SEQ ID NO: 8, mas que tem uma ou mais modificações, e que retém pelo menos uma atividade de FGF23 humano. Tal modificação pode incluir, como exemplos não limitantes, uma modificação pós-traducional (fosforilação, metilação ou adição de um carboidrato) ou conjugação a uma segunda porção, que não é FGF23. Tal segunda porção pode ser, como exemplos não limitantes, um peptídeo de sinal, alfa ou beta Klotho ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Klotho ou sKlotho solúvel), um Fc (por exemplo, FcLALA) ou outra modificação. WO 2011/092234 e WO 2009/095372.

[0078] Como aqui usado, o termo "peptídeo ou polipeptídeo AgRP" e termos similares se referem ao Peptídeo Relacionado a Agouti, isto é, uma molécula de sinalização formada de 132 aminoácidos que é pós-traducionalmente processada em sua forma ativa ou madura, AgRP (83-132), que contém 10 resíduos cisteína e forma uma rede de cinco ligações dissulfeto. AgRP desempenha um papel como um ago- nista inverso dos receptores de melanocortina MC3R e MC4R. O termo "peptídeo AgRP" em todos os casos inclui sais dos mesmos. Em algumas modalidades, AgRP pode estar em uma forma amida, por exemplo, amidação de -CO2H terminal C para fornecer C(O)-NH2. Em outras modalidades, AgRP pode estar em uma forma ácida.

[0079] O termo "peptídeo AgRP" também inclui fragmentos biologicamente ativos mais curtos de AgRP. Um fragmento é uma porção da sequência parental que é idêntica em sequência, mas mais curta em comprimento do que a sequência parental e retém atividade biológica (isto é, agonismo inverso). Fragmentos de polipeptídeos AgRP bem como variantes dos mesmos foram também descritos em Jackson, P.J. e outros, Biochemistry 41, 7565-7572, que é aqui incorporado a título de referência. Por exemplo, AgRP (87-120) e AgRP (87-132) possuem aproximadamente a mesma afinidade com MC3R e MC4R que AgRP (83-132) e exibem agonista inverso equivalente. Fragmentos adicionais de polipeptídeo AgRP foram descritos em Christine G. Joseph e outros, Peptides 24 (2003), 263-270; que é aqui incorporado a título de referência. Exemplos de fragmentos são AgRP (86-132) e AgRP monocíclico (109-118) bem como alongamento dos mesmos no terminal N e/ou C.

[0080] O termo "polipeptídeos AgRP" também compreende "poli- peptídeos mutantes AgRP" que são polipeptídeo AgRP onde uma sequência de polipeptídeo AgRP de ocorrência natural foi modificada. Tais modificações foram descritas no pedido de patente PCT No. WO2013/006656, que é aqui incorporado a título de referência.

[0081] Os termos "peptídeo GDF15", "polipeptídeo GDF15" e "proteína GDF15" são usados intercomutavelmente e significam polipeptí- deo do tipo selvagem de ocorrência natural expresso em um mamífero, tal como um ser humano ou um camundongo. Para propósitos da presente descrição, o termo "proteína GDF15" pode ser usado inter- comutavelmente para se referir a qualquer polipeptídeo GDF15 de comprimento integral, que consiste em 308 resíduos de aminoácido; (NCI Ref. Seq. NP_004855.2) contendo um peptídeo de sinal de 29 aminoácidos (aminoácidos 1-29), um pró-domínio de 167 aminoácidos (aminoácidos 30-196) e um domínio maduro de 112 aminoácidos (aminoácidos 197-308) que é excisado do pró-domínio por proteases tipo furina. Um polipeptídeo GDF15 de 308 aminoácidos é referido como polipeptídeo GDF15 de "comprimento integral"; um polipeptídeo GDF15 de 112 aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 197-308) é um polipeptídeo GDF15 "maduro". O peptídeo GDF15 maduro contém os sete resíduos cisteína conservados requeridos para a formação do motivo de nó de cisteína (tendo três ligações dissulfeto intracadeia) e a ligação dissulfeto intercadeia simples que são típicos para os membros da superfamília TGF~. O peptídeo GDF15 maduro contém dois resíduos cisteína adicionais que formam uma quarta ligação dissulfeto in- tracadeia. Desta maneira, GDF15 biologicamente ativo é um homodí- mero do peptídeo maduro covalentemente ligado por uma ligação dis- sulfeto intercadeia. Uma proteína ou polipeptídeo GDF15 desta maneira inclui também multímero, mais particularmente dímero, da proteína. Cada unidade monomérica que constitui o homodímero GDF15 pode ser ligada a um ácido graxo de fórmula A1, A2 ou A3.

[0082] Por "GDF15" ou "proteína GDF15" como aqui usado quer dizer também GDF15 humano ou um homólogo, variante, mutante, fragmento ou forma modificada do mesmo, que retém pelo menos uma atividade de GDF15 humano.

[0083] O termo "polipeptídeo mutante GDF15" ou "polipeptídeo variante GDF15" compreende um polipeptídeo de GDF15 onde uma sequência de polipeptídeo de GDF15 de ocorrência natural foi modificada. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, uma ou mais substituições de aminoácido, incluindo substituições com amino- ácidos de ocorrência não natural, análogos de aminoácido de ocorrência não natural e miméticos de aminoácido.

[0084] Em um aspecto, o termo "proteína mutante GDF15" ou "po- lipeptídeo variante GDF15" se refere a uma sequência de proteína GDF15 onde pelo menos um resíduo normalmente encontrado em uma dada posição de um polipeptídeo de GDF15 nativo é deletado ou é substituído por um resíduo não encontrado normalmente nesta posição na sequência de gDF15 nativa. Em alguns casos será desejável substituir um resíduo simples normalmente encontrado em uma dada posição de um polipeptídeo de GDF15 nativo com mais de um resíduo que não é normalmente encontrado na posição; em ainda outros casos pode ser desejável manter a sequência de polipeptídeo de GDF15 nativa e inserir um ou mais resíduos em uma dada posição na proteína; em ainda outros casos pode ser desejável deletar um dado resíduo totalmente; todos esses construtos são compreendidos pelo termo "proteína mutante GDF15" ou "proteína variante GDF15". Em um as-pecto da invenção, a proteína mutante GDF15 ou "proteína variante GDF15" tem uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 7. A presente invenção também compreende moléculas de ácido nucleico codificando tais sequências de polipeptídeo mutante GDF15 ou sequências de polipeptídeo variante GDF15.

[0085] Por um "homólogo", "variante", "fragmento" ou "forma modificada" de GDF15 ou similar quer dizer um polipeptídeo similar, mas não idêntico, a um GDF15 humano, mas que retém pelo menos uma atividade de GDF15 humano.

[0086] Por "forma modificada" de GDF15 quer dizer um GDF15 que compreende uma sequência similar ou idêntica àquela de GDF15, mas que tem uma ou mais modificação, e que retém pelo menos uma atividade de GDF15 humano. Tal modificação pode incluir, como exemplos não limitantes, uma modificação pós-traducional (fosforila- ção, metilação ou adição de um carboidrato).

[0087] Por um "homólogo" de GDF15 quer dizer um polipeptídeo correspondendo a GDF15 humano, mas de uma fonte diferente, tal como um mamífero, tais como macacos cynomolgous, camundongos e ratos, etc, que ainda retém pelo menos uma função de GDF15 humano. Em alguns casos, um homólogo de GDF15 pode ser usado para tratar ou melhorar um distúrbio metabólico em um indivíduo em uma forma madura de um polipeptídeo mutante GDF15 que é derivada da mesma espécie que o indivíduo.

[0088] Em várias modalidades, um polipeptídeo GDF15, homólogo, variante, mutante, fragmento ou forma modificada do mesmo compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 85 idêntica a uma proteína GDF15 de ocorrência natural. Em outras modalidades, um polipeptídeo GDF15 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90 porcento ou cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento idêntica a uma sequência de aminoácido de polipeptídeo GDF15 de ocorrência natural. Tal polipeptídeo GDF15, homólogo, variante, mutante, fragmento ou forma modificada do mesmo possui pelo menos uma atividade de um polipeptídeo mutante GDF15 do tipo selvagem, tal como a habilidade em diminuir os níveis de glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol no sangue; a habilidade em reduzir o peso corporal; ou a habilidade em melhorar a tolerância à glicose, gasto de energia ou sensibilidade à insulina.

[0089] Em várias modalidades respectivas, um polipeptídeo GDF15 ou homólogo, variante, mutante, fragmento ou forma modificada do mesmo tem uma atividade biológica que é equivalente a, maior ou menor do que aquela da forma de ocorrência natural da proteína GDF15 madura. Exemplos de atividades biológicas incluem a habilidade em diminuir níveis de glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol no sangue; a habilidade em reduzir o peso corporal; ou a habilidade em melhorar a tolerância à glicose, tolerância a lipídeo ou sensibilidade à insulina; a habilidade em diminuir a excreção de glicose e proteína na urina.

[0090] Como aqui usado no contexto da estrutura de um polipeptí- deo ou proteína, os termos "terminal N" (ou "terminal amino") e "terminal C" (ou "terminal carboxila") se referem às extremidades amino e carboxila extremas do polipeptídeo, respectivamente.

[0091] O termo "polipeptídeo terapêutico" ou "proteína terapêutica" como aqui usado significa um polipeptídeo ou proteína que está sendo desenvolvido para uso terapêutico ou que foi desenvolvido para uso terapêutico.

[0092] O ligante separa a biomolécula e a porção de ácido graxo. Sua estrutura química não é crítica, uma vez que ele serve principalmente como um espaçador.

[0093] O ligante é uma porção química que contém dois grupos reativos/grupos funcionais, um dos quais pode reagir com a biomolé- cula e o outro com a porção de ácido graxo. Os dois grupos reati- vos/funcionais do ligante são ligados através de uma porção de ligação ou espaçador, cuja estrutura não é crítica contanto que ela não interfira com o acoplamento do ligante à biomolécula e à porção de ácido graxo de Fórmula A1, A2 ou A3.

[0094] O ligante pode ser formado de aminoácidos ligados juntos por ligações peptídicas. Em algumas modalidades da presente invenção, o ligante é formado a partir de 1 a 20 aminoácidos ligados por ligações peptídicas, onde os aminoácidos são selecionados dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em várias modalidades, os 1 a 20 aminoácidos são selecionados dos aminoácidos glicina, serina, alani- na, metionina, asparagina, glutamina, cisteína e lisina. Em algumas modalidades, um ligante é formado de uma maioria de aminoácidos que são estericamente não impedidos, tais como glicina e alanina. Em algumas modalidades, ligantes são poliglicinas, polianilinas, combinações de glicina e alanina (tal como poli(Gly-Ala)) ou combinações de glicina e serina (tal como poli(Gly-Ser)). Em algumas modalidades, um ligante é formado de uma maioria de aminoácidos selecionados de his- tidina, alanina, metionina, glutamina, asparagina e glicina. Em algumas modalidades, ligantes contêm porção poli-histidina.

[0095] Em algumas modalidades, o ligante compreende 1 a 20 aminoácidos que são selecionados de aminoácidos não naturais. Embora um ligante de 1-10 resíduos de aminoácido seja preferido para conjugação com a porção de ácido graxo, a presente invenção compreende ligantes de qualquer comprimento ou composição. Um exemplo de ligante de aminoácido não natural é ácido 8-amino-3,6- dioxaoctanoico tendo a fórmula que segue:

[0096] ou suas unidades de repetição.

[0097] Os ligantes descritos aqui são exemplares, e ligantes que são muito mais longos e que incluem outros resíduos são compreendidos pela presente invenção. Ligantes de não peptídeo são também compreendidos pela presente invenção.

[0098] Em outras modalidades, o ligante compreende um ou mais grupos alquila, grupos alquenila, grupos cicloalquila, grupos arila, grupos heteroarila, grupos heterocíclicos, polietileno glicol e/ou um ou mais aminoácidos naturais ou não naturais, ou combinação dos mesmos, onde cada um dos alquila, alquenila, cicloalquila, arila, heteroari- la, heterociclila, polietileno glicol e/ou os aminoácidos naturais ou não naturais são opcionalmente combinados e ligados juntos, ou ligados à biomolécula e/ou à porção de ácido graxo, através de um grupo químico selecionado de -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, - S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- ou =NH- N(alquila)-.

[0099] Ligantes contendo espaçador alquila são, por exemplo, - NH-(CH2)z-C(O)- ou -S-(CH2)z-C(O)- ou -O-(CH2)z-C(O)-, -NH-(CH2)z- NH- , -O-C(O)-(CH2)z-C(O)-O-, -C(O)-(CH2)z-O-, -NHC(O)-(CH2)z- C(O)-NH- e similar onde z é 2-20 pode ser usado. Esses ligantes de alquila podem ser ainda substituídos por qualquer grupo não esteri- camente impedido incluindo, mas não limitado a, alquila inferior (por exemplo, C1-C6), acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2 ou fenila.

[00100] O ligante pode também ser de natureza polimérica. O ligan- te pode incluir cadeias ou unidades poliméricas que são bioestáveis ou biodegradáveis. Polímeros com ligação de repetição podem ter graus de estabilidade variáveis sob condições fisiológicas dependendo da labilidade de ligação. Polímeros podem conter ligações tais como policarbonatos (-O-C(O)-O-), poliésteres (-C(O)-O-), poliuretanas (-NH- C(O)-O-), poliamida (-C(O)-NH-). Estas ligações são providas a título de exemplo e não pretendem limitar o tipo de ligações empregáveis nas cadeias de polímero ou ligantes da invenção. Polímeros adequados incluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polivinil pirrolidona, álcool de polivinila, poliaminoácidos, anidrido maleico de diviniléter, N- (2-hidroxipropil)-metacrilamida, derivados de dextrano, polipropileno glicol, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polissa- carídeos, celulose e derivados de celulose, amido e derivados de ami-do, polialquileno glicol e derivados dos mesmos, copolímeros de poli- alquileno glicóis e derivados dos mesmos, éter de polivinil etila e similar e misturas dos mesmos. Um ligante de polímero é, por exemplo, polietileno glicol (PEG). O ligante PEG pode ser linear ou ramificado. Um peso molecular do ligante PEG na presente invenção não é restrito a nenhum tamanho particular, mas certas modalidades têm um peso molecular entre 100 a 5000 Dáltons, por exemplo, 500 a 1500 Dáltons.

[00101] O ligante contém grupos reativos funcionais apropriados em ambos os terminais que formam uma ponte entre o grupo amino do peptídeo ou polipeptídeo/proteína e um grupo funcional/reativo na por- ção de ácido graxo (por exemplo, a funcionalidade de ácido carboxílico da porção de ácido graxo de fórmulas A1, A2 e A3).

[00102] O ligante pode compreender várias porções de ligação (ou espaçadores) de natureza diferente (por exemplo, uma combinação de aminoácidos, porção heterocíclica, PEG e/ou porções alquila). Neste caso, cada porção de ligação contém grupos funcionais-reativos apropriados em ambos os terminais que formam uma ponte entre o grupo amino do peptídeo ou polipeptídeo/proteína e a próxima porção de ligação de natureza diferente e/ou contém grupos funcionais-reativos apropriados que formam uma ponte entre a porção de ligação anterior de natureza diferente e a porção de ácido graxo.

[00103] Os peptídeos ou polipeptídeos modificados e/ou construto parcial de peptídeo-polipeptídeo (isto é, peptídeo/polipeptídeo ligado a um ligante parcial) incluem grupos reativos que podem reagir com funcionalidades reativas disponíveis na porção de ácido graxo (ou porção de ácido graxo modificada: isto é, já ligada a um ligante parcial) para formar uma ligação covalente. Grupos reativos são grupos químicos capazes de formar uma ligação covalente. Grupos reativos estão localizados em um sítio de conjugação e podem ser geralmente grupos carbóxi, fosforila, acila, éster ou anidrido misto, maleimida, N- hidroxissuccinimida, tetrazina, alcina, imidato, piridino-2-il-dissulfanila, desta maneira capaz de formar uma ligação covalente com funcionalidades tais como grupo amino, grupo hidroxila, grupo alceno, grupo hi- drazina, grupo hidroxilamina, um grupo azida ou um grupo tiol no outro lado de conjugação.

[00104] Grupos reativos de interesse particular para conjugação de uma biomolécula ou biomolécula modificada a um ligante e/ou um li- gante à porção de ácido graxo e/ou conjugar várias porções de ligação de natureza diferente juntas são N-hidroxissuccinimida, alcina (mais particularmente ciclo-octina).

[00105] Funcionalidades incluem: 1. grupos tióis para reação com maleimidas, tosil sulfona ou piridino-2-ildissulfanila; 2. grupos amino (por exemplo, funcionalidade amino de um aminoácido) para ligação a ácido carboxílico ou ácido carboxílico ativado (por exemplo, formação de ligação amida através de química N-hidroxissuccinamida), grupos fosforila, grupo acila ou anidrido misto; 3. Azida para sofrer uma cicloadição Huisgen com uma alcina terminal e mais particularmente ciclo-octina (mais comumente conhecida como química click); 4. grupo carbonila para reagir com hidroxilamina ou hidrazina para formar oxima ou hidrazina, respectivamente; 5. Alceno e mais particularmente alceno reto para reagir com tetrazina em uma adição aza [4+2]. Embora vários exemplos de ligantes e funcionalida- des/grupo reativo sejam descritos aqui, a invenção compreende li- gantes ou qualquer comprimento e composição.

Modalidades

[00106] Várias modalidades da invenção são descritas aqui. Será reconhecido que características especificadas em cada modalidade podem ser combinadas com outras características especificadas para prover modalidades adicionais.

[00107] Na modalidade 1, a invenção se refere a um conjugado compreendendo uma biomolécula ligada a uma porção de ácido graxo através de um ligante onde a porção de ácido graxo tem a Fórmula A1, A2 ou A3 que segue:

[00108] R1 é CO2H, H;

[00109] R2, R3 e R4 são independentemente um do outro H, OH, CO2H, -CH=CH2 ou -C=CH;

[00110] Ak é um C6-C30 alquileno ramificado;

[00111] n, m e p são cada um independentemente do outro um inteiro entre 6 e 30; ou uma amida, um éster ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo.

[00112] Em um aspecto adicional da modalidade 1, o conjugado de acordo com a modalidade 1 pode compreender ainda um ácido graxo de fórmula A1, A2 ou A3 como descrito supra. Em vista das dificuldades de obter conjugação seletiva e/ou obter monoconjuga- ção de um ácido graxo a uma biomolécula, os conjugados da invenção podem compreender uma biomolécula que é ligada a uma ou mais porções de ácido graxo de Fórmula A1, A2 ou A3. Ainda, em vista da natureza multimérica de algumas proteínas, cada unidade monomérica que constitui uma proteína multimérica pode ser ligada a uma porção de ácido graxo, mas não todas as unidades monomé- ricas têm que ser necessariamente ligadas a uma porção de ácido graxo contanto que pelo menos uma da unidade monomérica esteja ligada a uma porção de ácido graxo. Em um aspecto adicional, a invenção se refere a misturas dos conjugados da invenção. Por exemplo, a mistura pode compreender uma biomolécula, por exemplo, uma biomolécula multimérica, por exemplo, uma biomolécula dimérica, que é ligada a uma porção de ácido graxo de Fórmula A1, A2 ou A3 e uma biomolécula, por exemplo, uma biomolécula multi- mérica, por exemplo, uma biomolécula dimérica, que é ligada a mais de uma porção de ácido graxo de Fórmula A1, A2 ou A3. Exemplos da invenção abaixo destacam mais este aspecto de multiconjugação seletiva ou não seletiva de ácidos graxos a uma proteína ou polipep- tídeo.

[00113] Na modalidade 1A, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1 onde a porção de ácido graxo é de Fórmula A1. Em um aspecto particular da presente modalidade, o conjugado compreende uma porção de ácido graxo de Fórmula A1 onde n e m são independentemente 8 a 20, preferivelmente 10 a 16. Em um outro aspecto da presente modalidade, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1 ou 1A onde a porção de ácido graxo é de Fórmula A1 e onde pelo menos um de R2 e R3 é CO2H.

[00114] Na modalidade 2, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1 ou 1A, onde a porção de ácido graxo é selecionada das Fórmulas que seguem:

[00115] onde Ak3, Ak4, Ak5, Ak6 e Ak7 são independentemente um (C8-20)alquileno, R5 e R6 são independentemente (C8-20)alquila.

[00116] Na modalidade 3, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1, 1A ou 2 onde a porção de ácido gra- xo é selecionada das Fórmulas que seguem:

[00117] Na modalidade 3A, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1, 1A ou 2 onde a porção de ácido graxo é selecionada das Fórmulas que seguem:

[00118] Na modalidade 3B, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1 onde a porção de ácido graxo é de Fórmula A2 ou A3. Em um aspecto particular da presente modalidade, o con-jugado compreende uma porção de ácido graxo de Fórmula A2 onde p é 8 a 20 ou uma porção de ácido graxo de Fórmula A3 onde Ak é C8-20 alquileno.

[00119] Na modalidade 3C, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1 ou 3B onde a porção de ácido graxo é se-lecionada das Fórmulas que seguem:

[00120] onde Ak2 é C8-20alquileno.

[00121] Na modalidade 4, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde o ligante compreende um ou mais grupos alquila, grupos alquenila, grupos ci- cloalquila, grupos arila, grupos heteroarila, grupos heterocíclicos, polie- tileno glicol, um ou mais aminoácidos naturais ou não naturais, ou combinações dos mesmos, onde cada um de alquila, alquenila, ciclo- alquila, arila, heteroarila, heterociclila, polietileno glicol e/ou os amino- ácidos naturais ou não naturais é opcionalmente combinado e ligado junto ou ligado à biomolécula e/ou à porção de ácido graxo através de um grupo químico selecionado de -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, - C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- ou =NH-N(alquila)-.

[00122] Na modalidade 5, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, onde o ligante compreende uma porção oligo etileno glicol não ramificada de Fórmula:

[00123] onde y é 0 a 34.

[00124] Na modalidade 6, a invenção se refere a conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, onde o ligante compreende (ou compreende ainda) uma porção heterocíclica selecio-nada das Fórmulas que seguem:

[00125] Tais ligantes contendo heterociclila são obtidos, por exemplo, através de cicloadição Huisgen azida-alcina, mais comumente conhecida como química click. Mais particularmente, um pouco da hete- rociclila mostrada supra resulta da reação de uma cicloalcina com uma porção contendo azida.

[00126] Cicloalcinas estão prontamente disponíveis de fontes comerciais e podem então ser funcionalizadas através da cicloadição com uma porção contendo uma funcionalidade azida (por exemplo, um ligante contendo uma funcionalidade azida terminal). Exemplos do uso de química click de alcina cíclica em marcação de proteína foram descritos na US 2009/0068738 que é aqui incorporada a título de referência.

[00127] Exemplos não limitantes de agentes cicloalcina que podem ser usados em cicloadição Huisgen são:

[00128] Na modalidade 6A, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, onde o ligante com-preende (ou compreende ainda) uma heterociclila selecionada da Fórmula que segue:

[00129] onde r é um inteiro de 0 a 2 e s é um inteiro de 0 a 3.

[00130] Tais ligantes heterocíclicos podem ser obtidos através de uma cicloadição aza [4+2] de um alceno, ou preferivelmente um alceno reto tal como cicloalcano, com a porção que segue:

[00131] onde Rf é, por exemplo, -CH2NH2, -OH, -CH2-CO2H, -S- CH2-CO2H, -(O-CH2)4-6-C(O)-OH -ou

[00132] Tais porções tretrazina estão prontamente disponíveis de fontes comerciais e podem reagir com uma porção contendo alceno, por exemplo, um ligante contendo funcionalidade alceno terminal.

[00133] Na modalidade 6B, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5 onde o ligante com-preende (ou compreende ainda) uma heterociclila de Fórmula:

[00134] Tal porção heterocíclica pode ser obtida através de reação de uma maleimida com uma porção contendo tiol, tal como, por exemplo, um ligante contendo uma funcionalidade tiol terminal.

[00135] Estes reagentes que estão prontamente disponíveis e/ou comercialmente disponíveis são ligados diretamente ou através de um ligante como descrito supra ao peptídeo ou polipeptídeo de interesse. Os grupos reativos alcina, maleimida ou tetrazina são reagidos com um grupo funcional (azida, tiol e alceno, respectivamente) que está presente na porção de ácido graxo ou em um construto de ligan- te-ácido graxo (tal como, por exemplo, um construto de PEG-ácido graxo).

[00136] Na modalidade 7, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde o ligante compreende ou compreende ainda um ou mais aminoácidos indepen-dentemente selecionados de histidina, metionina, alanina, glutamina, asparagina e glicina. Em um aspecto particular da presente modalidade, o ligante compreende 1 a 6 aminoácidos selecionados de histidina, alanina e metionina.

[00137] Na modalidade 8, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a bio- molécula é um peptídeo ou polipeptídeo. Em um aspecto particular da modalidade 8, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde o peptídeo ou polipep- tídeo é 1) Fator de Diferenciação de Crescimento 15 humano (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos; 2) um peptídeo agonista de APJ; 3) um pep- tídeo agonista de receptor de oxitocina, 4) serelaxina, 5) NPFF, 6) um peptídeo PIP, 7) um peptídeo FGF23, 8) um peptídeo AgRP ou 9) um siRNA.

[00138] Na modalidade 8A, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde a biomo- lécula é um Fator de Diferenciação de Crescimento 15 humano (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos; ou um dímero do mesmo. Em um aspecto da presente modalidade, a biomolécula é Fator de Diferenciação de Crescimento 15 humano (GDF15) ou variante. Em uma modalidade preferida, a biomolécula é um dímero de GDF15 ou uma variante ou mutante do mesmo. Em vista da natureza de homodímero do polipep- tídeo GDF15 ou mutante ou variante do mesmo, cada uma das duas cadeias de polipeptídeo (isto é, cada unidade monomérica) que constitui o homodímero pode ser ligada a uma molécula de ácido graxo de Fórmula A1, A2 ou A3 através de um ligante. Desta maneira o homo- dímero de GDF15 pode ser ligado a um ou dois ácidos graxos através de um ligante. A estrutura do GDF15 ligado a uma porção de ácido graxo através de um ligante pode ser representada como segue:

[00139] onde FA representa a porção de ácido graxo e L o ligante e a unidade 1 de monômero e unidade 2 de monômero de GDF15 são ambas ligadas a uma porção de ácido graxo através de um ligante; ou

[00140] onde FA é a porção de ácido graxo e L o ligante e apenas uma da unidade de monômero é ligada a uma porção de ácido graxo através do ligante e onde a linha entre as 2 unidades monoméricas representa uma ligação dissulfeto. Ainda, a invenção se refere também a uma mistura compreendendo um conjugado de estrutura A e um conjugado de estrutura B.

[00141] Na modalidade 8B, a invenção compreende um conjugado de acordo com a modalidade 8A onde o mutante de GDF15 humano é obtido através de substituição de um ou mais resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro com um outro resíduo. Em um aspecto particular da presente modalidade, os pelo menos dois resíduos de aminoácido no terminal N de GDF15 humano (isto é, Argi- nina 198 e Alanina 197) foram substituídos com uma sequência de aminoácido XH onde H é histidina e X é um aminoácido selecionado de metionina, alanina, glutamina, asparagina e glicina. Em um aspecto preferido da presente modalidade, o mutante de hGDF15 é MH(199-308)hGDF15 ou AH(199-308)hGDF15.

[00142] Na modalidade 8C, os três últimos resíduos de aminoáci- do no terminal N de GDF15 humano (isto é, Asparagina 199, Argini- na 198 e Alanina 197) foram substituídos com uma sequência de aminoácido XHX'-onde H é histidina e X' e X são aminoácidos independentemente selecionados de metionina, alanina, glutamina, as- paragina e glicina. Em um outro aspecto da presente modalidade, os três últimos resíduos de aminoácido no terminal N de GDF15 humano (isto é, Asparagina 199, Arginina 198 e Alanina 197) foram substituídos com uma sequência de aminoácido AHX'- onde H é histidina e X' é um aminoácido independentemente selecionado de metionina, alanina, glutamina, asparagina e glicina. Em um aspecto preferido da presente modalidade, a proteína GDF15 modificada é MHA(200- 308)hGDF15 ou AHA(200-308)hGDF15.

[00143] Comparado com a proteína GDF15 nativa, o mutante de GDF15 permite a marcação seletiva da proteína no terminal N (isto é, conjugação do ácido graxo no terminal N preferido do GDF15). A marcação seletiva de peptídeo e proteína é descrita em mais detalhes nos pedidos de patente US codepositados 62/015.858 (Procurador PAT056275-US-PSP) e 62/082.337 (Número do procurador PAT056275-US-PSP02).

[00144] Na modalidade 8D, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é um peptídeo agonista de APJ. Em um aspecto particular da presente modalidade, o peptídeo agonista de APJ é um peptídeo descrito nos pedidos de patente PCT números WO 2013/111110, WO 2014/081702, WO 2015/013168, WO 2015/013165, WO 2015/013167 e WO 2015/013169, que são aqui incorporados a título de referência.

[00145] Na modalidade 8E, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é um peptídeo agonista de receptor de oxitocina. Em um aspecto particular da presente modalidade, o peptídeo agonista de receptor de oxitocina é um peptídeo descrito nos pedidos de patente PCT números WO 2009/122285 (Ferring B.V.) e WO 2014/095773 (Hoffman-La Roche) que são aqui incorporados a título de referência.

[00146] Na modalidade 8F, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é um peptídeo AgRP. Em um aspecto particular da presente modalidade, o peptídeo AgRP é AgRP (83-132) onde o terminal C está na forma de um CO2H livre ou uma amida do mesmo (por exemplo, -C(O)NH2).

[00147] Na modalidade 8G, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é um peptídeo FGF23. Em um aspecto particular da presente modalidade, o peptídeo FGF23 é uma variante de FGF23 de SEQ ID NO: 8 tendo uma mutação em R179 e opcionalmente uma ou mais mutações adicionais em Y154, Q156, R176, R179, C206 e C244. Em um outro aspecto particular da presente modalidade, o peptídeo FGF23 é uma variante de FGF23 de SEQ ID NO: 8 tendo mutações em R179, Q156, C206 e C244.

[00148] Na modalidade 8H, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é Serelaxina.

[00149] Na modalidade 8I, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é peptídeo NPFF.

[00150] Na modalidade 8J, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é um peptídeo PIP. Em um aspecto particular da presente modalidade, o peptídeo PIP é a proteína marcada com his MHHHH- HHH-PIP onde PIP é de SEQ ID NO: 12.

[00151] Na modalidade 8K, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 onde a biomo- lécula é um siRNA.

[00152] Na modalidade 8L, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, compreendendo ainda uma segunda porção de ácido graxo ligada à biomo- lécula através de um ligante. Preferivelmente as duas porções ligan- tes de ácido graxo são da mesma estrutura.

[00153] Na modalidade 9, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 1, 2, 8, 8A, 8B ou 8C tendo a estrutura que segue:

[00154] onde hGDF15* é hGDF15 onde o aminoácido 2 ou 3 no terminal N foi substituído com uma sequência de aminoácido XH- ou XHX'-, respectivamente,

[00155] onde H é histidina e X e X' são independentemente selecionados de M e A; ou um dímero do mesmo; e

[00156] onde his-hGDF15 é hGDF15 onde um marcador, compreendendo 1 a 6 aminoácidos histidina e opcionalmente 1 ou 2 aminoá- cidos histidina, foi adicionado ao terminal N de hGDF15; ou um dímero do mesmo; e

[00157] s é um inteiro entre 20-30.

[00158] Em um aspecto da presente modalidade o marcador compreende aminoácidos histidina e 1 ou 2 aminoácidos metionina não adjacentes. Em um outro aspecto da presente modalidade, a disposição de aminoácidos histidina e metionina é tal de maneira que o ami- noácido na posição adjacente ao aminoácido N-terminal é uma histidi- na. Em um aspecto adicional da presente modalidade o marcador é selecionado de MHHHHHHM- e MHHHHHH-.

[00159] Em um aspecto particular da modalidade 9, em vista da natureza de homodímero de hGDF15* e his-hGDF15, uma ou duas cadeias de polipeptídeo (unidade monomérica) que constituem o homo- dímero podem ser ligadas à molécula de ácido graxo através de um ligante. Como resultado, o homodímero pode ser ligado a uma ou pode ser ligado a duas moléculas de ácido graxo através de um ligante no terminal N. Tal modalidade pode ser representada pela biomolécula de GDF15 ligada ao ácido graxo através de um ligante tendo as Fórmulas abaixo:

[00160] onde ambas as unidades monoméricas de his-hGDF15 ou hGDF15* (como acima definido) são ligadas à porção de ácido graxo através de um ligante em ambos os terminais N; ou

[00161] onde apenas uma da unidade de monômero de his- hGDF15 ou hGDF15* (como acima definido) é ligada à porção de ácido graxo através de um ligante no terminal N. Ainda, a invenção se refere também a misturas de conjugados da invenção; por exemplo, uma mistura compreendendo um conjugado de Fórmula C e um conjugado de Fórmula E ou uma mistura compreendendo um conjugado de fórmula D e um conjugado de fórmula F.

[00162] Na modalidade 10, a invenção se refere a uma composição compreendendo uma mistura de um conjugado de Fórmula C e um conjugado de Fórmula E. Na modalidade 10A, a invenção se refere a uma composição compreendendo uma mistura de um conjugado de Fórmula D e um conjugado de Fórmula F.

[00163] Desta maneira, na modalidade 10B, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a reivindicação 1, 2, 9 ou 10 compreendendo:

[00164] uma variante de hGDF15 homodímero onde o aminoácido 2 ou 3 no terminal N foi substituído com uma sequência de aminoácido XH- ou XHX'-, respectivamente, onde H é histidina e X e X' são inde-pendentemente selecionados de M e A; ou

[00165] um hGDF15 homodímero onde um marcador, compreendendo 1 a 6 aminoácidos histidina e opcionalmente 1 ou 2 aminoáci- dos metionina, foi adicionado ao terminal N de hGDF15; e

[00166] um ou dois ácidos graxos de Fórmula:

[00167] onde o ácido graxo é ligado ao terminal N da cadeia de po- lipeptídeo através de um ligante; ou uma mistura de conjugados.

[00168] Na modalidade 10C, a invenção se refere a um conjugado de modalidade 9, 10, 10A ou 10B, onde hGDF15* é hGDF15 onde o aminoácido 2 ou 3 no terminal N foi substituído com uma sequência de aminoácido XH- ou XHX'-, respectivamente,

[00169] onde H é histidina e X e X' são independentemente selecionados de M e A; ou um dímero do mesmo; e

[00170] onde his-hGDF15 é hGDF15 onde um marcador, compreendendo 4 a 6 aminoácidos histidina e 1 ou 2 aminoácidos metionina, foi adicionado ao terminal N de hGDF15; ou um dímero do mesmo;

[00171] e s é um inteiro entre 22 e 28. Em um aspecto da presente modalidade o marcador compreende aminoácidos histidina e 1 ou 2 aminoácidos metionina não adjacentes. Em um outro aspecto da presente modalidade, a disposição de aminoácidos histidina e metionina é tal de maneira que o aminoácido na posição adjacente ao aminoácido N-terminal seja uma histidina. Em um aspecto adicional da presente modalidade o marcador é selecionado de MHHHHHHM- e MHHHHHH-.

[00172] Na modalidade 11, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde a biomo- lécula é selecionada de M-(His)6-hGDF15 (SEQ ID No 1), M-(his)6-M- hGDF15 (SEQ ID NO: 2), MH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 4), MHA(200-308)hGDF15(SEQ ID NO: 6), AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7) e AH(199-308)GDF15 (SEQ ID NO: 5); ou um dímero da mesma.

[00173] Na modalidade 11A, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 11 onde a biomolécula é selecionada de MH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 4), MHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 6), AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7) e AH(199- 308)GDF15 (SEQ ID NO: 5); ou um dímero da mesma.

[00174] Na modalidade 11B, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 11 onde a biomolécula é selecionada de AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7); ou um dímero da mesma.

[00175] Na modalidade 12, a invenção se refere a um conjugado de acordo com a modalidade 11B onde a biomolécula ligada ao ácido graxo através de um ligante é de Fórmula G ou de Fórmula H:

[00176] onde AHA-hGDF15 é SEQ ID NO: 7 e o ácido graxo é ligado ao terminal N de uma ou das 2 unidades monoméricas. Ainda, a invenção compreende uma mistura compreendendo o conjugado de Fórmula G e o conjugado de Fórmula H.

[00177] Na modalidade 13, a invenção se refere a uma composição compreendendo uma mistura de um conjugado de acordo com a modalidade 12 tendo Fórmula G e um conjugado de acordo com a modalidade 12 tendo Fórmula H. Em um aspecto particular da presente modalidade, a mistura é uma razão molar 1:1 de um conjugado de Fórmula G e um conjugado de Fórmula H.

[00178] O AHA-(200-308)-hGDF15 (SEQ ID NO: 7) foi projetado para remover o sítio de corte observado dentro da proteína nativa bem como remover o sítio de formilação de metionina (M1) potencial e o sítio de desamidação N-199. A qualidade e a homogeneidade superiores do AHA foram confirmadas pela qualidade do material checado não mostrando nenhum corte, desamidação ou oxidação de metionina que foi observado com a sequência nativa de hGDF15.

[00179] Na modalidade 14, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde o resíduo de ácido graxo está ligado ao terminal N do peptídeo ou proteína através de um ligante. Na modalidade 15, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde o conjugado tem uma meia-vida de estabilidade no plasma de mais de 5 h. Em um aspecto da presente modalidade, o conjugado tem uma meia-vida de estabilidade no plasma de mais de 10 h. Em um outro aspecto da presente modalidade, o conjugado tem uma meia-vida de estabilidade no plasma de mais de 20 h ou mais de 30 h. Em ainda um outro aspecto da presente modalidade, o conjugado tem uma meia-vida de estabilidade no plasma de mais de 40 h ou mais de 50 h.

[00180] Na modalidade 16, a invenção se refere a um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores onde o aperfeiçoamento da meia-vida de estabilidade no plasma comparado com a biomolécula não conjugada é de 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 75 vezes.

[00181] Em uma outra modalidade, a biomolécula, o ligante e a porção de ácido graxo (R1 a R4, n, m, p e Ak) são aqueles definidos pela seção de Exemplos abaixo.

[00182] Em uma modalidade, a invenção se refere a um compos- to de Fórmula:

[00183] R1 é CO2H ou H;

[00184] R2 e R3 são independentemente um do outro H, OH, CO2H, -CH=CH2 ou -C=CH; contanto que R2 e R3 não sejam idênticos;

[00185] R4 é CO2H;

[00186] n e m são independentemente um do outro um inteiro entre 6 e 30; ou uma amida, éster ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em um outro aspecto da presente modalidade, a invenção se refere a um composto de Fórmula A1 onde pelo menos um de R2 e R3 é CO2H. Em ainda um aspecto adicional da presente modalidade, a invenção se refere a um composto selecionado do grupo consistindo em:

Síntese de Peptídeo/polipeptídeo e/ou forma modificada do mesmo

[00187] Os peptídeos ou polipeptídeos da invenção podem ser produzidos ou através de processos químicos sintéticos ou através de métodos recombinantes ou combinação de ambos os métodos. Os construtos de peptídeos ou polipeptídeos/proteína podem ser preparados como comprimento integral ou podem ser sintetizados como fragmentos de comprimento não integral e unidos. Os peptídeos ou poli- peptídeos da presente invenção podem ser produzidos através de procedimentos conhecidos per se para síntese de peptídeo. Os métodos para síntese de peptídeo podem ser qualquer um de uma síntese de fase sólida e uma síntese de fase líquida. Desta maneira, o peptídeo ou polipeptídeo de interesse pode ser produzido através de condensação de um peptídeo ou aminoácido parcial capaz de constituir a proteína com a parte residual do mesmo e, quando o produto tem um grupo de proteção, o grupo de proteção é separado de maneira que um pep- tídeo desejado pode ser fabricado. Os métodos conhecidos para condensação e desproteção incluem os procedimentos descritos na literatura (1)-(5) que segue.

[00188] (1) M. Bodanszky e M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Inter science Publishers, New York, 1966,

[00189] (2) Schroeder e Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965,

[00190] (3) Nobuo Izumiya e outros. Fundamentals and Experi- ments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975,

[00191] (4) Haruaki Yajima e Shumpei Sakakibara, Biochemical Ex periment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977, and

[00192] (5) Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten.

[00193] Após a reação, o peptídeo ou polipeptídeo pode ser purificado e isolado através de uma combinação de técnicas de purificação convencionais tais como extração com solvente, cromatografia de co-luna, cromatografia líquida, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de troca de íon e recristalização. Onde o peptídeo isolado como acima é um composto livre, ele pode ser convertido em um sal adequado através do método conhecido. Por outro lado, onde o produto isolado é um sal, ele pode ser convertido no peptídeo livre através do método conhecido.

[00194] A amida de peptídeo pode ser obtida usando uma resina para síntese de peptídeo que é adequada para amidação. A resina inclui resina de clorometila, resina de hidroximetila, resina de benzidri- lamina, resina de aminometila, resina de álcool de 4-beziloxibenzila, resina de 4-metilbenzidrilamina, resina de PAM, resina de 4- hidroximetilmetilfenilacetamidometila, resina de poliacrilamida, resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-hidroximetil)fenóxi, resina de 4-(2',4'- dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenóxi, resina de cloreto de 2-clorotritila e assim por diante. Usando tal resina, aminoácidos cujos grupos a- amino e grupos funcionais de cadeia lateral foram adequadamente protegidos são condensados na resina de acordo com a sequência do peptídeo objeto através de várias técnicas de condensação que são conhecidas per se. No final da série de reações, o peptídeo ou o pep- tídeo protegido é removido da resina e os grupos de proteção são removidos e, se necessário, ligações dissulfeto são formadas para obter o polipeptídeo objeto.

[00195] Para a condensação dos aminoácidos protegidos mencionados acima, uma variedade de reagentes de ativação para síntese de peptídeo pode ser usada tal como HATU, HCTU ou, por exemplo, uma carbodiimida. A carbodiimida inclui DCC, N,N'-di-isopropilcarbodiimida e N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Para ativação com tal reagente, um aditivo inibidor de racemização, por exemplo, HOBt ou Oxyma Pure, pode ser usado. O aminoácido protegido pode ser dire-tamente adicionado à resina junto com os reagentes de ativação e ini-bidor de racemização ou ser pré-ativado como anidrido ácido simétrico, éster de HOBt ou éster de HOOBt, então adicionado à resina. O solvente para a ativação de aminoácidos protegidos ou condensação com a resina pode ser apropriadamente selecionado dentre aqueles solventes que são conhecidos como sendo úteis para reações de condensação de peptídeo. Por exemplo, N,N-dimetilformamida, N- metilpirrolidona, clorofórmio, trifluoretanol, sulfóxido de dimetila, DMF, piridina, dioxana, cloreto de metileno, tetraidrofurano, acetonitrila, acetato de etila ou misturas adequadas dos mesmos podem ser mencionados. A temperatura de reação pode ser selecionada da faixa até agora conhecida ser útil para formação de ligação peptídica e é geralmente selecionada da faixa de cerca de -20° C a -50° C. O derivado de aminoácido ativado é geralmente usado em uma proporção de excesso de 1,5-4 vezes. Se a condensação for verificada ser insuficiente através de um teste utilizando a reação de ninidrina, a reação de condensação pode ser repetida para obter uma condensação suficiente sem remoção do grupo de proteção. Se condensação repetida ainda falhar em prover um grau de condensação suficiente, o grupo amino não reagido pode ser acetilado com anidrido acético ou acetilimidazol.

[00196] O grupo de proteção de grupo amino para o material de partida aminoácido inclui Z, Boc, amiloxicarbonila terciária, isoborni- loxicarbonila, 4-metoxibenziloxicarbonila, Cl-Z, Br-Z, adamantiloxicar- bonila, trifluoracetila, ftalila, formila, 2-nitrofenilsulfenila, difenilfosfino- tioíla ou Fmoc. O grupo de proteção carbóxi que pode ser usado inclui, mas não é limitado a, C1-6 alquila mencionada acima, C3-8 cicloalquila e C6-10aril-C1-2alquila bem como 2-adamantila, 4-nitrobenzila, 4- clorobenzenil, fenacila, benziloxicarbonilidrazido, butoxicarbonilidrazido terciário e tritilidrazido.

[00197] O grupo hidróxi de serina e treonina pode ser protegido através de esterificação ou eterificação. O grupo adequado para a dita esterificação inclui grupos derivados de carbono tais como grupos al- canoíla inferior, por exemplo, acetila, etc, grupos aroíla, por exemplo, benzoíla, etc., benziloxicarbonila e etoxicarbonila. O grupo adequado para a dita eterificação inclui benzila, tetraidropiranila e butila terciária. O grupo de proteção para o grupo hidroxila fenólico de tirosina inclui Bzl, Cl2-Bzl, 2-nitrobenzila, Br-Z e butila terciária.

[00198] O grupo de proteção imidazol para histidina inclui Tos, 4- metóxi-2,3,6-trietilbenzenossulfonila, DNP, benziloximetila, Bum, Boc, Trt e Fmoc.

[00199] O grupo carboxila ativado do aminoácido de partida inclui o anidrido ácido correspondente, azida e ésteres ativos, por exemplo, ésteres com álcoois tais como pentaclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 2,4-dinitrofenol, álcool de cianometila, p-nitrofenol, HONB, N- hidroxissuccinimida, N-hidroxiftalimida, HOBt, etc. O grupo amino ati-vado do aminoácido de partida inclui a fosforamida correspondente.

[00200] O método para eliminação de grupos de proteção inclui redução catalítica usando gás hidrogênio na presença de um catalisador tal como negro de paládio ou paládio sobre carbono, tratamento ácido com fluoreto de hidrogênio anidro, ácido metanossulfônico, ácido triflu- ormetanossulfônico, ácido trifluoracético ou uma mistura de tais ácidos, tratamento de base com di-isopropiletilamina, trietilamina, piperi- dina, piperazina, redução com metal de sódio em amônia líquida. A reação de eliminação através do tratamento ácido mencionado acima é geralmente realizada em uma temperatura de -20° C a -40° C e pode ser conduzida vantajosamente com adição de um aceitador de cátion tal como anisol, fenol, tioanisol, m-cresol, p-cresol, sulfeto de dimetila, 1,4-butanoditiol, 1,2-etanoditiol. O grupo 2,4-dinitrofenila usado para proteção do grupo imidazol de histidina pode ser eliminado através de tratamento com tiofenol, enquanto o grupo formila usado para proteção do grupo indol de triptofano pode ser eliminado através de tratamento alcalino com solução de hidróxido de sódio diluída ou amônia aquosa diluída bem como o tratamento ácido mencionado acima na presença de 1,2-etanoditiol, 1,4-butanoditiol.

[00201] O método para proteção de grupos funcionais que não devem participar na reação do material de partida, os grupos de proteção que podem ser usados, o método de remoção dos grupos de proteção e o método de ativação dos grupos funcionais que devem participar da reação podem ser todos selecionados criteriosamente dentre os grupos e métodos conhecidos.

[00202] Um outro método para obtenção da forma amida do polipep- tídeo compreende amidação do grupo -carboxila do aminoácido C- terminal primeiro, então extensão da cadeia de peptídeo para o lado N até o comprimento de cadeia desejado, e então seletivamente desproteção do grupo a-amino do peptídeo C-terminal e do grupo a-carbóxi do aminoácido ou peptídeo que deve formar o restante do polipeptídeo obje-to e condensação dos dois fragmentos cujos grupo a-amino e grupos funcionais de cadeia lateral foram protegidos com grupos de proteção adequados mencionados acima em um solvente misto tal como aquele mencionado anteriormente. Os parâmetros desta reação de condensação podem ser iguais aos descritos anteriormente. A partir do peptídeo protegido obtido através de condensação, todos os grupos de proteção são removidos através do método descrito acima para então prover o peptídeo bruto desejado. Este peptídeo bruto pode ser purificado através de procedimentos de purificação conhecidos e a fração principal ser liofi- lizada para prover o polipeptídeo amidado objeto. Para obter um éster do polipeptídeo, o grupo a-carboxila do aminoácido C-terminal é condensado com um álcool desejado para fornecer um éster de aminoácido e então o procedimento descrito acima para produção da amida é seguido.

[00203] Alternativamente, métodos de expressão recombinante são particularmente úteis. Expressão de proteína recombinante usando uma célula hospedeiro (uma célula artificialmente engenheirada para compreender ácidos nucleicos codificando a sequência do peptídeo e que realizará a transcrição e tradução e, opcionalmente, secreção do peptídeo no meio de crescimento celular) é usada rotineiramente na técnica. Para processo de produção recombinante, um ácido nucleico codificando sequência de aminoácido do peptídeo seria tipicamente sintetizado através de métodos convencionais e integrado em um vetor de expressão. Tais métodos são particularmente preferidos para fabri-cação das composições de polipeptídeo compreendendo os peptídeos fundidos a sequências de peptídeo adicionais ou outras proteínas ou fragmentos ou domínios de proteína. A célula hospedeiro pode ser pelo menos uma selecionada de E. coli, COS-1, COS-7, HEK293, BHT21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, heLa, mieloma, linfo- ma, levedura, células de inseto ou planta, ou qualquer célula derivada, imortalizada ou transformada das mesmas.

[00204] A invenção também compreende polinucleotídeos codificando as variantes descritas acima que podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA, DNA que inclui cDNA, DNA genômico e DNA sintético. O DNA pode ser de filamento duplo ou filamento simples. As sequências de codificação que codificam as composições da presente invenção podem variar como um resultado da redundância ou degeneração do código genético.

[00205] Os polinucleotídeos que codificam as composições da presente invenção podem incluir o que segue: apenas a sequência de codificação para a variante, a sequência de codificação para a variante e sequência de codificação adicional tal como um polipeptídeo funcional, ou uma sequência líder ou secretora ou uma sequência de pró- proteína; a sequência de codificação para a sequência variante e de não codificação, tais como íntrons ou sequência de não codificação 5' e/ou 3' da sequência de codificação para a variante. Desta maneira o termo "polinucleotídeo codificando uma variante" compreende um poli- nucleotídeo que pode incluir não apenas sequência de codificação para a variante, mas também um polinucleotídeo que inclui sequência de codificação e não codificação adicional.

[00206] A invenção se refere ainda a variantes dos polinucleotídeos descritos que codificam fragmentos, análogos e derivados do polipep- tídeo que contêm as substituições indicadas. A variante do polinucleo- tídeo pode ser uma variante alélica de ocorrência natural da sequência de GDF15 humano, uma variante de ocorrência não natural ou uma variante truncada como descrito acima. Desta maneira, a presente in-venção inclui também polinucleotídeos codificando as variantes descritas acima, bem como variantes de tais polinucleotídeos, variantes que codificam um fragmento, derivado ou análogo da variante revelada. Tais variantes de nucleotídeo incluem variantes de deleção, variantes de substituição, variantes truncadas e variantes de adição ou inserção contanto que pelo menos uma das substituições de aminoácido indicadas da primeira ou segunda modalidade esteja presente.

[00207] Os polinucleotídeos da invenção podem ser expressos em hospedeiros após as sequências terem sido operavelmente ligadas a (isto é, posicionadas para assegurar o funcionamento de) uma sequência controle de expressão. Estes vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros ou como epissomos ou como uma parte integral do DNA cromossomal hospedeiro. Geral-mente, vetores de expressão conterão marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina, neomicina e di-hidrofolato redutase, para permitir detecção daquelas células transformadas com as sequências de DNA desejadas. A variante de GDF15 pode ser expressa em células de mamífero, inseto, levedura, bacterianas ou outras células sob o controle de promotores apropriados. Sistemas de tradução livres de célula podem ser também empregados para produzir tais proteínas usando RNAs derivados de construtos de DNA da presente invenção.

[00208] Escherichia coli (E. coli) é um hospedeiro procariótico parti-cularmente útil para clonagem dos polinucleotídeos da presente inven-ção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem Bacillus subtilus, Salmonella typhimurium e várias espécies de Serra- tia, Pseudomonas, Streptococcus e Staphylococcus, embora outros possam ser também empregados como uma questão de escolha. Nestes hospedeiro procarióticos, vetores de expressão podem ser também feitos, os quais conterão tipicamente sequências de controle de ex-pressão compatíveis com a célula hospedeiro (por exemplo, uma origem de replicação). Ainda, qualquer um de vários promotores bem co-nhecidos pode estar presente, tal como o sistema de promotor de lac-tose, um sistema promotor de triptofano (Trp), um sistema de promotor de beta-lactamase ou um sistema de promotor de fagos lambda ou T7. Os promotores tipicamente controlarão expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e terão sequências de sítio de ligação de ribossomo e similar, para início e término de transcrição e tradução.

[00209] Um versado na técnica de expressão de proteínas reconhecerá que sequência de metionina ou metionina-arginina pode ser introduzida no terminal N da sequência madura para expressão em E. coli e são compreendidas dentro do contexto da presente invenção. Desta maneira, a menos que de outro modo mencionado, as composi- ções da presente invenção expressas em E. coli têm uma sequência de metionina introduzida no terminal N.

[00210] Outros micróbios, tais como levedura ou fungos, podem ser também usados para expressão. Pichia pastoris, Saccharomyces ce- revisiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia angusta são exemplos de hospedeiros de levedura preferidos, com vetores adequados tendo sequências de controle de expressão, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, e uma origem de replicação, sequências de terminação e similar como desejado. Asper-gillus niger, Trichoderma reesei; e Schizophyllum commune são exemplos de hospedeiros de fungos, embora outros também possam ser empregados como uma questão de escolha.

[00211] Cultura de célula de tecido de mamífero pode ser também usada para expressar e produzir os polipeptídeos da presente invenção. Várias linhagens de célula hospedeiro adequadas capazes de secreção de variantes intactas foram desenvolvidas na técnica e incluem as linhagens de célula CHO, várias linhagens de célula COS, células NOS, linhagens de célula de Ovário de Hamster Sírio, célula HeLa ou linhagens de célula de rim embriônico humano (isto é, HEK293, HEK293EBNA).

[00212] Vetores de expressão para células de mamífero podem incluir sequências de controle de expressão, tal como uma origem de replicação, um promotor, um potencializador e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação de ribossomo, sítios de união de RNA, sítios de poliadenilação e sequências termina- doras transcripcionais. Sequências de controle de expressão preferidas são promotores derivados de SV40, adenovírus, vírus papiloma bovino, citomegalovírus, vírus sarcoma Raus e similar. Sítios de polia- denilação preferidos incluem sequências derivadas de SV40 e hormônio de crescimento bovino.

[00213] Os vetores contendo as sequências de polinucleotídeo de interesse (por exemplo, que codificam as composições da presente invenção e sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeiro através de métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção com cloreto de cálcio é geralmente utilizada para células procarióticas, enquanto tratamento com fosfato de cálcio ou eletropo- ração pode ser usado para outros hospedeiros celulares.

[00214] Vários métodos de purificação da proteína podem ser em-pregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) e Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(ão), por exemplo, da natureza do processo de produção usado para as composições da presente invenção.

[00215] Os polipeptídeos podem ser preparados em forma substanci-almente pura ou isolada (por exemplo, forma livre de outros polipeptí- deos). Os polipeptídeos podem estar presentes em uma composição que é enriquecida em polipeptídeo com relação a outros componentes que possam estar presentes (por exemplo, outros polipeptídeos ou outros componentes de célula hospedeiro). Por exemplo, polipeptídeo purificado pode ser provido de maneira que o polipeptídeo está presente em uma composição que é substancialmente livre de outras proteínas de expres-são, por exemplo, menos do que 90%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 20%, menos do que 10%, menos do que 5% ou menos do que 1% da compo-sição são formados de outras proteínas expressas.

Síntese de porção de ácido graxo

[00216] O Esquema 1 descreve a síntese de uma porção de ácido graxo de Fórmula A2. Esquema 1

[00217] onde P1 e P2 são grupo de proteção tais como, por exemplo, metila, etila, terc-butila, metoxibenzila, benzila, benzilóxi, metoxi- metila, metiltiometila, tetraidropiranila, fenacila, N-Ftalimida, cinamila, trifenilmetila, 9-antrilmetila, piperonila, trimetilsilila, t-butildimetilsilila ou 2-alquil 1,3-oxazolinas; onde LG é um grupo de saída tal como, por exemplo, halo (por exemplo, Br, Cl, l) ou trifluormetanossulfonilóxi e onde R4 e p são como descrito na modalidade 1.

[00218] Alquilação de ácido malônico protegido (1A) com um agente de alquilação (1B) na presença de uma base (por exemplo, hidreto de sódio, carbonatos de potássio ou césio, hidróxido de sódio, di-isopropil amida de lítio, bis(trimetilsilil)amida de sódio, bis(trimetilsilil)amida de potássio, tetrametilpiperidina de lítio, 1,8-diazacicloundec-7-eno, N,N-di- isopropil etil amina ou 2,6-di-t-butilputridina), em um solvente tal como DFM, THF ou dimetil acetamida, gera a porção de ácido graxo protegida (1C). Quando R4 é OH ou CO2H, proteção desses grupos funcionais pode ser requerida antes da etapa de alquilação. Grupos de proteção para hidroxila são conhecidos na técnica e são, por exemplo, éteres tais como éter de metila, éter de metoximetila (MOM), éter de tetraidropiranila (THP), éter de t-butila, éter de alila, éter de benzila, éter de b- butildimetilsilila, éter de t-butildifenil silil, éter de tribenzil silila, éter de iso- propildimetilsilila, éter de trifenilmetila, éter de nitrobenzila, 2. Ésteres e carbonatos tais como éster de ácido acético, éster de formato, éster de tricloroacetato, éster de fenoxiacetato, éster de pivaloato, éster de ben- zoato, carbonato de metila, carbonato de benzila, carbonato de alila, és- ter de nitrato, éster de adamanoato, carbonato de nitrofenila.

[00219] A porção de ácido graxo de Fórmula A2 é obtida através de desproteção usando método de desproteção apropriado. Métodos padrão podem ser aplicados para a hidrólise do intermediário (1C) usando uma base selecionada de, mas não limitado a, NaOH, KOH ou Li- OH, ou um ácido selecionado de, mas não limitado a, TFA, HCl ou BCl3. Quando P1 ou P2 é benzila ou metoxibenzila, um método preferido da desproteção é hidrogenação na presença de um catalisador tal como, mas não limitado a, paládio sobre carbono.

[00220] O Esquema 2 ilustra a síntese de uma porção de ácido gra- xo de Fórmula A1 onde R1 é C(O)2H. Esquema 2

[00221] onde P1 e P2 e LG são como definido supra e R2, R3, n e m são como definido na modalidade 1.

[00222] Ácido malônico (1A) protegido sofre 2 alquilações subsequentes com um agente de alquilação (2A) e (2C), cuja ordem pode ser revertida, antes da desproteção usando método apropriado como descrito supra no Esquema 1. Quando R2 e R3 são OH ou CO2H, proteção desses grupos funcionais pode ser requerida antes das etapas de alquilação.

[00223] A porção de ácido graxo de Fórmula A1 onde R1 é H pode ser preparada através de descarboxilação da porção de ácido graxo correspondente de Fórmula A1 onde R1 é CO2H. Condições de des- carboxilação são bem conhecidas na técnica tal como, por exemplo, descarboxilação sob condição básica (por exemplo, Hidróxido de amônio). Síntese de construto de biomolécula-ligante Esquema 3

[00224] onde B é biomolécula ou uma forma modificada da mesma, Z1 é um ligante C1-C20 alquileno onde a cadeia alquileno é opcionalmente substituída com oxo (=O), e onde um ou mais carbono é substituído com O ou NH; e onde C1 é um sistema de anel carbocíclico ou heterocícico mono, di ou tricíclico opcionalmente substituído com flúor.

[00225] A cicloalcina (3B) é ligada a um resíduo amino da biomo- lécula (3A) (por exemplo, a funcionalidade amino do terminal N ou a cadeia lateral de uma lisina) através de seu grupo reativo de ácido carboxílico usando métodos de acoplamento amida padrão. Métodos de acoplamento conhecidos podem ser aplicados incluindo, mas não limitado a, conversão do intermediário (3B) em uma forma ativada do mesmo [por exemplo, em uma pirrolidino-2,5-diona correspondente (usando química de N-hidroxissuccinimida padrão) ou conversão de ácido (3B) usando reagentes tal como trifosgênio, carbonildiimidazol, cloroformato de 4-nitrofenila ou carbonato de dissuccinimidila, conversão do ácido (3B) em um haleto ácido correspondente, usando reagentes tal como cloreto de tionila ou cloreto de oxalila ou conver- são do ácido (3B) em um anidrido misto correspondente usando rea-gentes tal como ClC(O)O-isobutila, cloreto de 2,4,6-triclorobenzoíla ou trímero cíclico do anidrido do ácido propil fosfônico (T3P), seguido por reação da oxazolidino-2,5-diona, o haleto ácido ou o anidrido misto] com a biomolécula (3A) na presença ou ausência de uma base tal como amina terciária (por exemplo, trietilamina ou N,N-di-isopropil etilamina) ou K2CO3. Alternativamente, a biomolécula 3A pode ser acoplada com o ácido 3B usando reagentes de condensação de pep- tídeo incluindo, mas não limitado a, diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), di-isopropilcarbodiimida (DIC), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (HCl EDC), hexafluorfosfato de ben- zotriazol-1-il-óxi-tris-pirrolidino-fosfônio (PyBOP) ou hexafluorfosfato de benzotriazol-1-il-óxi-tris-(dimetilamino)-fosfônio (BOP) na presença ou ausência de um reagente tal como 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidróxi- 7-azabenzotriazol ou dimetilaminopiridina. Preferivelmente, a cicloal- cina/intermediário ácido (3B) é convertido em sua forma ativada usando química NHS antes da reação com a funcionalidade amino na biomolécula.

[00226] Uma acilação seletiva da funcionalidade amino no terminal N da biomolécula foi desenvolvida e relatada nos pedidos US codepo- sitados números 62/015.858 (Documento de procuração número PAT056275-US-PSP) e 62/082.337 (Documento de procuração número PAT056275-US-PSP02).

[00227] A acilação seletiva envolve a reação de análogo de ciclo- octina ativado com NHS (derivados de NHS de (3B)) com uma biomo- lécula onde o terminal N foi modificado para incluir um aminoácido his- tidina adjacente ao aminoácido N-terminal. A reação é altamente seletiva para a funcionalidade amino no terminal N quando realizada em pH 4, devido à presença de um efeito vizinho do aminoácido histidina. Síntese de construto ligante de resíduo de ácido graxo

Construto ligante de ácido graxo para química click

[00228] O Esquema 4 descreve a síntese de um construto ligante de PEG de ácido graxo com um grupo funcional azido terminal. Esquema 4

[00229] onde y é 0 e 34 e FA é uma porção de ácido graxo como descrito na Fórmula A1, A2 ou A3 que é ligada através de uma de sua funcionalidade de ácido carboxílico ao ligante de PEG, FA tem a fórmula que segue:

[00230] A porção de ácido graxo (4B) é ligada a um ligante contendo PEG (4A) através de uma reação de acoplamento amida. Métodos de acoplamento conhecidos foram descritos em detalhes supra no Esquema 3. Preferivelmente, a funcionalidade ácida na porção de ácido graxo é ativada usando química NHS.

[00231] Onde R1 é CO2H, R2, R3 e R4 são CO2H ou OH, grupos de proteção podem precisar ser introduzidos antes da reação de acopla-mento a fim de controlar o sítio reativo. Grupos de proteção para grupos de ácido carboxílico e hidróxi foram descritos supra no esquema 1. Alternativamente, ativação seletiva de ácido carboxílico pode ser obtida usando química NHS.

Ligante de ácido graxo para ligação direta à biomolécula de interesse

[00232] O Esquema 5 descreve a síntese de um construto ligante de PEG de ácido graxo com um grupo funcional CO2H terminal. Esquema 5

[00233] onde FA é como definido supra no Esquema 4 e y é 0 a 34.

[00234] O ácido graxo (4B) pode ser ligado a um ligante contendo PEG (5A) usando acoplamento amida descrito supra. Construto ligante de ácido graxo para ligação a uma biomolécula de interesse usando enzima Transglutaminase

[00235] O Esquema 5A descreve a preparação de um construto li- gante de ácido graxo contendo um aminoácido ácido glutâmico permitindo modificação seletiva de sítio de uma lisina quando usando enzima transglutaminase. Esquema 5B

[00236] onde y e FA são como anteriormente definido. Tais constru- tos permitem modificação de sítio seletiva de um grupo amino na cadeia lateral de uma lisina. Esta modificação de sítio seletiva de trans-glutaminase de proteína foi descrita no pedido de patente 61/845.273 depositado em 11 de julho de 2013 (documento de procuração número PAT055641-US-PSP). Síntese de Conjugado da Invenção Conjugação usando Química Click Esquema 6

[00237] onde B é uma biomolécula de interesse ou uma forma modificada da mesma (por exemplo, mutante ou uma biomolécula contendo um marcador histidina) e y, C1, Z1, FA e y são definidos supra.

[00238] O construto cicloalcina (3C) sofre uma cicloadição Huisgen com uma azida terminal do construto ligante de ácido graxo (4C) como comumente conhecido como química click. Exemplo de químicas click foram descritos na US 2009/0068738. Conjugação através de ligação direta usando condições de acoplamento Esquema 7

[00239] onde B é uma biomolécula de interesse ou uma forma modificada da mesma (tal como, por exemplo, mutante e/ou uma biomo- lécula contendo um marcador histidina) e o construto ácido graxo- ligante é ligado ao terminal N da biomolécula.

[00240] O construto de ligante de ácido graxo (5B) é ligado a um resíduo de aminoácido da biomolécula (3A) (por exemplo, à funcionali- dade amino do terminal N ou à cadeia lateral de uma lisina) através de seu grupo reativo de ácido carboxílico usando métodos de acoplamento amida padrão. Métodos de acoplamento conhecidos foram descritos em detalhes supra no Esquema 3. Preferivelmente a funcionalidade ácida no construto ligante de ácido graxo é ativada usando química NHS.

[00241] Uma acilação seletiva da funcionalidade amino no terminal N da biomolécula foi desenvolvida e relatada nos pedidos de patente US codepositados números 62/015.858 (Documento de procuração número PAT056275-US-PSP) e 62/082.337 (documento de procuração número PAT056275-US-PSP02). A acilação seletiva envolve a reação de um composto ativado com NHS (derivados de NHS de (5B)) com uma biomolécula onde o terminal N foi modificado para incluir um aminoácido histidina adjacente ao aminoácido N-terminal. A reação é altamente seletiva para funcionalidade amino no terminal N quando realizada em pH 4 devido à presença de um efeito vizinho do aminoá- cido histidina. Conjugação usando enzima Transglutaminase Esquema 7B

[00242] Modificação seletiva da biomolécula em sua cadeia lateral da lisina pode ser obtida usando enzima transglutaminase. Tal modificação foi relatada no pedido de patente US número 61/845.273 depositado em 11 de julho de 2013 (documento de procuração número PAT055641-US- PSP) ou WO 2015/006728 (no exemplo 25 do presente pedido).

Composição farmacêutica

[00243] O conjugado da presente invenção pode ser administrado de qualquer uma de várias maneiras, incluindo subcutaneamente, in-tramuscularmente, intravenosamente, intraperitonealmente, através de inalação, intranasalmente, oralmente, etc. Modalidades particularmente preferidas da invenção empregam administração intravenosa contínua dos conjugados da presente invenção ou uma amida, éster ou sal dos mesmos. Os conjugados da presente invenção podem ser administrados como um bolo ou como uma infusão contínua durante um período de tempo. Uma bomba implantada pode ser usada. Em certas modalidades da invenção, administração de conjugados intermitente ou contínua é continuada por um a vários dias (por exemplo 2-3 ou mais dias) ou por períodos de tempo mais longos, por exemplo, semanas, meses ou anos. Em algumas modalidades, administração de conjugados intermitente ou contínua é provida por pelo menos cerca de 3 dias, preferivelmente pelo menos cerca de 6 dias. Em outras modalidades, administração de conjugado intermitente ou contínua é provida por pelo menos cerca de uma semana. Em outras modalidades, administração de conjugado intermitente ou contínua é provida por pelo menos cerca de duas semanas. Pode ser desejável manter uma concentração de conjugado no plasma média acima de um valor limiar particular ou durante administração ou entre administração de doses múltiplas. Uma concentração desejável pode ser determinada, por exemplo, com base na condição fisiológica do indivíduo, severidade da doença, etc. Tal(ais) valor(es) desejável(eis) pode(m) ser identifica- do(s) através da realização de testes clínicos padrão. Alternativamente, os peptídeos e conjugados dos mesmos poderiam ser administrados oralmente através de mecanismo FcRn (Nat. Ver. Immunol. 7(9), 715-25, 2007; Nat. Commun. 3;3:610, 2012, Am. J. Physiol. Gastroin- test Liver Physiol. 304: G262-G270, 2013).

[00244] Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado da presente invenção ou uma amida, um éster ou um sal do mesmo e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica pode ser formulada para vias de administração particulares tais como administração oral, administração subcutânea, administração parenteral e administração retal, etc. Ainda, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser feitas em uma forma sólida (incluindo, sem limitação, cápsulas, comprimidos, pílulas, grânulos, liofilizados, pós ou supositórios) ou em uma forma líquida (incluindo, sem limitação, soluções, suspensões ou emulsões). As composições farmacêuticas podem ser submetidas a operações farmacêuticas convencionais tais como fabricação asséptica, esterilização e/ou podem conter dilu- entes inertes convencionais, agentes de formação de torta, agentes de tonicidade, agentes lubrificantes ou agentes de tamponamento, bem como adjuvantes, tais como conservantes, estabilizadores, agentes umectantes, emulsificantes e tampões, etc.

[00245] Composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem tipicamente soluções aquosas estéreis (onde solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetável estéril.

[00246] Para administração intravenosa, veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida até o ponto que fácil manuseio em seringa exista. Formulações farmacêuticas preferidas são estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento e devem ser conservadas contra a ação contami- nante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. Em geral, o veículo relevante pode ser um solvente ou meio de dispersão conten- do, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similar) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. Prevenção da ação de micro-organismos pode ser obtida através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similar. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, aminoácidos, sorbitol, cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. Em algumas modalidades, um excipiente multifuncional tal como albumina recombinante pode ser incorporado ao processo de formulação para facilitar a estabilização do produto conjugado de degradação ou agregação, para aperfeiçoar a solubilizar e auxiliar na administração e liberação do componente ativo. (Bio Pharm International, 2012, Vol 23, Issue 3, pp 40-44).

[00247] Certas composições injetáveis são soluções ou suspensões isotônicas aquosas, e supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões graxas. As ditas composições podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, tais como agentes con-servantes, de estabilização, umectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regulagem da pressão osmótica e/ou tampões. Ainda, elas podem também conter outras substâncias terapeuticamen- te valiosas. As ditas composições são preparadas de acordo com métodos de mistura, granulação ou revestimento convencionais, respectivamente, e contêm cerca de 0,1-75%, ou contêm cerca de 1-50%, do ingrediente ativo.

[00248] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por esterilização com filtragem. Em geral, dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que fornecem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[00249] Composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um veículo comestível. Para o propósito de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. Composições orais podem ser também preparadas usando um veículo fluido para uso como um enxaguatório bucal. Agentes de ligação e/ou materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e similar podem conter qualquer um dos ingredientes que seguem ou compostos de uma natureza similar: um ligante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente de desintegração tal como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um glidante tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou agente saborizante tal como saborizante de hortelã, salicitato de metila ou laranja. Formulações para administração oral podem incorporar vantajosamente agentes para aperfeiçoar a es- tabilidade dentro do trato gastrointestinal e/ou aumentar a absorção.

[00250] Para administração através de inalação, os agentes terapêuticos da invenção são preferivelmente administrados na forma de um spray aerossol a partir de recipiente ou aplicador de pressão que contém um propelente adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador. É notado que os pulmões proveem uma área de superfície grande para administração sistêmica de agentes terapêuticos.

[00251] Os agentes podem ser encapsulados, por exemplo, em mi- cropartículas poliméricas tais como aquelas descritas na publicação U.S. 20040096403 ou em associação com qualquer um de uma ampla variedade de outros veículos de administração de fármaco que são conhecidos na técnica. Em outras modalidades da invenção os agentes são administrados em associação com um lipídeo carregado como descrito, por exemplo, na publicação U.S. 20040062718. É notado que o último sistema foi usado para administração de um polipeptídeo te-rapêutico, insulina, demonstrando a utilidade deste sistema para admi-nistração de agentes de peptídeo.

[00252] Administração sistêmica também pode ser através de meios transmucosais ou transdermais.

[00253] Composições adequadas para aplicação transdermal incluem uma quantidade eficaz de um conjugado da invenção com um veículo adequado. Veículos adequados para administração transdermal incluem solventes farmacologicamente aceitáveis absorvíveis para auxiliar na passagem através da pele do hospedeiro. Por exemplo, dispositivos transdermais estão na forma de uma bandagem compreendendo um membro de apoio, um reservatório contendo o composto opcionalmente com veículos, opcionalmente uma barreira de controle de taxa para administrar o composto da pele do hospedeiro em uma taxa controlada e predeterminada durante um período de tempo pro- longado e meios para prender o dispositivo à pele.

[00254] Composições adequadas para aplicação tópica, por exemplo, à pele e olhos, incluem soluções aquosas, suspensões, unguentos, cremes, géis ou formulações pulverizáveis, por exemplo, para ad-ministração através de aerossol ou similar. Tais sistemas de adminis-tração tópica serão apropriados em particular para aplicação dermal. Eles são então particularmente adequados para uso em formulações tópicas, incluindo cosméticos, bem conhecidas na técnica. Tais podem conter solubilizantes, estabilizadores, agentes de aumento da tonicidade, tampões e conservantes.

[00255] Em certas modalidades, a composição farmacêutica é para administração subcutânea. Componentes de formulação e métodos para administração subcutânea adequados de agentes terapêuticos de peptídeo (por exemplo, anticorpos, proteínas de fusão e similar) são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Pedido de Patente dos Es-tados Unidos Publicado No 2011/0044977 e Patente US No. 8.465.739 e Patente US No. 8.476.239. Tipicamente, as composições farmacêuticas para administração subcutânea contêm estabilizadores adequados (por exemplo, aminoácidos, tais como metionina e sacarídeos tal como sacarose), agentes de tamponamento e agentes de tonicidade.

[00256] Como aqui usado, uma aplicação tópica pode também pertencer a uma aplicação de inalação ou a uma intranasal. Elas podem ser convenientemente administradas na forma de um pó seco (ou sozinho ou como uma mistura, por exemplo, uma mistura seca com lactose, ou uma partícula componente misturada, por exemplo, com fos- folipídeos) a partir de uma apresentação de inalador de pó seco ou de spray aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, spray, atomizador ou nebulizador, com ou sem o uso de um propelente adequado.

[00257] A invenção provê ainda composições farmacêuticas e for mas de dosagem que compreendem um ou mais agentes que reduzem a taxa através da qual o composto da presente invenção como um ingrediente ativo vai se decompor. Tais agentes, que são referidos aqui como "estabilizadores", incluem, mas não estão limitados a, anti- oxidantes tais como ácido ascórbico, tampões de pH ou tampões de sal, Albumina recombinante.

[00258] Como aqui usado, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a sais que retêm a eficácia biológica e propriedades dos conjugados da presente invenção e que, tipicamente, não são biologi-camente nem de outro modo indesejáveis. Em muitos casos, os conju-gados da presente invenção são capazes de formação de sais de ácido e/ou base em virtude da presença de grupos amino e/ou carboxila ou grupos similares aos mesmos.

[00259] Sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados a partir de ácidos inorgânicos e ácidos orgânicos, por exemplo, sais de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bro- mo/bromidrato, bicarbonato/carbonato, bissulfato/sulfato, canforsulfo- nato, cloro/cloridrato, clorteofilonato, citrato, etanodissulfonato, fumara- to, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, iodrato/iodato, isetio- nato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/fosfato de hidrogênio/di-hidrogeno fosfato, poligalacturonato, propionato, es- tearato, succinato, sulfosalicilato, tartrato, tolisato e trifluoracetato.

[00260] Ácidos inorgânicos a partir dos quais sais podem ser derivados incluem, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similar. Ácidos orgânicos dos quais sais podem ser derivados incluem, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido eta- nossulfônico, ácido toluenossulfônico, ácido sulfossalicílico e similar. Sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis podem ser for-mados com bases inorgânicas e orgânicas.

[00261] Bases inorgânicas das quais sais podem ser derivados incluem, por exemplo, sais de amônio e sais de metal de colunas I a XII da tabela periódica. Em certas modalidades, os sais são derivados de sais de sódio, potássio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, prata, zinco e cobre; sais particularmente adequados incluem sais de amônio, potássio, sódio, cálcio e magnésio.

[00262] Bases orgânicas a partir das quais sais podem ser derivados incluem, por exemplo, aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas, resinas de troca de íon básicas e similar. Certas aminas orgânicas incluem isopropilamina, benzatina, colinato, dietano- lamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina e trometamina.

[00263] Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir de um composto parental, uma porção básica ou ácida, através de métodos químicos convencionais. Em geral, tais sais podem ser preparados através da reação de formas de ácido livre desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base apropriada (tal como hidróxido de Na, Ca, Mg ou K, carbonato, bicarbonato ou similar) ou através da reação de formas de base livre desses compostos com uma quantidade estequiométrica do ácido apropriado. Tais reações são tipicamente realizadas em água ou em um solvente orgânico ou em uma mistura dos dois. Em geral, uso de meios não aquosos tal como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila é desejável, onde praticável. Listas de sais adequados adicionais podem ser encontradas, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 20a ed., Mack Publishing Company, Eas ton, Pa., (1985); e em "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" de Stahl e Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Ger-many, 2002).

[00264] Como aqui usado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardo de absorção, sais, conservantes, fármacos, estabi-lizadores de fármaco, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes saborizantes, corantes, ex- cipientes multifuncionais tal como albumina recombinante e similar e combinações dos mesmos, como seria conhecido daqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329). Exceto até o ponto que qualquer veículo convencional for incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é compreendido.

Método da invenção

[00265] Os níveis de GDF15 em circulação foram relatados estar elevados em múltiplas condições patológicas e fisiológicas, mais nota- damente gravidez (Moore, A.G. 2000. J Clin Endocrinol Metab 85: 4781-4788), ß-talassemia (Tanno, T. 2007, Nat. Med. 13:1096-101) (Zimmermann, M.B., 2008 Am. J. Clin. Nutr. 88:1026-31) e anemia di- seritropoiética congênita (Tamary, H. 2008, Blood. 112:5241-4). GTDF15 também está ligado a múltiplas atividades biológicas em relatos na literatura. Estudos de inativação de GDF15 em camundongos transgênicos sugeriram que GDF15 pode ser protetor contra lesão cardíaca induzida por isquemia/reperfusão ou sobrecarga (Kempf, T., 2006, Circ Res. 98:351-60) (Xu, J., 2006, Circ Res. 98:342-50), protetor contra perda de neurônio motor e neurônio sensorial associada com envelhecimento (Strelau, J., 2009, 29: 13640-8), levemente protetor contra acidose metabólica em rim e pode causar caquexia em pacientes com câncer (Johnen, H., 2007, Nat. Med. 11: 1333-40). Muitos grupos também estudaram o papel de GDF15 em apoptose e proliferação celular e relataram resultados controversos usando modelos de cultura e xenoenxerto de célula diferentes. Estudos em camundongos transgênicos mostraram que GDF15 é protetor contra neoplasia carci- nogênica e induzida por mutação em símio em intestino e pulmão (Baek, S.J. 2006, Gastroenterology. 131: 1553-60; Cekanova, M. 2009, Cancer Prev Res 2:450-8).

[00266] GDF15 foi também relatado desempenhar um papel em in-flamação, câncer e metabolismo (Samule Breit e outros, Growth Factors, outubro de 2011; 29(5): 187-195). GDF15 está ainda implicado na regulagem de apetite fisiológico e peso do corpo (Vicky Wang-Wei Tsai e outros, Public Library of Science: PLOS ONE 2013, Vol. 8, Issue 2, e55174)

[00267] A presente invenção provê métodos para tratamento ou prevenção de distúrbios ou doenças metabólicos, diabetes, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica/esteatoepatite e outras doenças hepáticas progressivas, resistência à insulina, hiperinsulinemia, intole-rância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, do-ença cardiovascular, aterosclerose, doença da artéria periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastroparese e outros distúrbios metabólicos, em um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção, ou uma amida, éster ou sal do mesmo ou uma mistura de conjugados, onde a biomolécula é Fator de Diferenciação de Crescimento 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, frag-mentos e outras formas modificadas dos mesmos.

[00268] Tais métodos têm um efeito vantajoso tal como, por exemplo, diminuição da frequência de administração.

[00269] Desta maneira, como uma modalidade adicional, a presente invenção provê o uso de um conjugado como aqui descrito, ou uma amida, éster ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma mistura dos conjugados descritos aqui, onde a biomolécula é Fator de Diferenciação de Crescimento 15 humano (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos, para o tratamento de distúrbios ou doenças metabólicas, di-abetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica/esteatoepatite e outras doenças hepáticas progressivas, resistência à insulina, hiperinsuline- mia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hiper-tensão, doenças cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastroparese e outros distúrbios metabólicos.

[00270] Desta maneira, como uma modalidade adicional, a presente invenção provê o uso de um conjugado ou uma amida, um éster ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou uma mistura de conju-gados, em terapia.

[00271] A quantidade eficaz de uma composição ou combinação farmacêutica da invenção a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Um versado na técnica compreenderá que os níveis de dosagem apropriados para tratamento então variarão dependendo, em parte, da molécula admi-nistrada, da indicação para a qual o conjugado está sendo usado, da via de administração e do tamanho (peso do corpo, superfície do corpo ou tamanho do órgão) e condição (a idade e saúde geral) do paciente. Desta maneira, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo. Uma dosagem típica pode variar a partir de cerca de 0,1 µg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em outras mo-dalidades, a faixa de dosagem pode variar de 0,1 µg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 1 µg/kg até cerca de 100 mg/kg. Em um aspecto adicional da presente modalidade, a dosagem pode variar a partir de cerca de 5 µg/kg até cerca de 25 µg/kg. Em ainda um aspecto adicional da presente modalidade, a dosagem pode variar a partir de 10 µg/kg a 20 µg/kg.

[00272] A frequência de dosagem variará dependendo dos parâmetro farmacocinéticos da proteína de função dupla na formulação sendo usada. Tipicamente, um médico administrará a composição até que seja atingida uma dosagem que obtenha o efeito desejado. A composição pode então ser administrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) com o tempo ou como uma infusão contínua através de um dispositivo ou cateter de implante. Correção adicional da dosagem apropriada é rotineiramente feita por aqueles de habilidade comum na técnica e está dentro do âmbito de tarefas rotineiramente realizadas por eles. Dosagens apropriadas podem ser determinadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados.

[00273] Os termos "dose terapeuticamente eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz", como aqui usado, significam uma quantidade de conjugado que elicita uma resposta biológica ou medicinal em um sistema de tecido, animal ou humano sendo acompanhado por um pesquisador, médico ou outro clínico, que inclui alívio ou melhora dos sintomas da doença ou distúrbio sendo tratado, isto é, uma quantidade de conjugado de polipeptídeo de GDF15 (ou mutante de GDF15) que apoia um nível observável de uma ou mais resposta biológica ou me-dicinal desejada, por exemplo, diminuição do níveis de glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol; redução do peso corporal, redução da ingestão de alimento ou melhora da tolerância à glicose, gasto de energia ou sensibilidade à insulina).

[00274] Os termos "paciente" ou "indivíduo" são usados intercomu- tavelmente para se referir a um ser humano ou um animal não humano (por exemplo, um mamífero).

[00275] Como aqui usado, o termo "tratar", "tratando" ou "tratamento" de qualquer doença ou distúrbio se refere em uma modalidade à melhora da doença ou distúrbio (isto é, diminuição ou parada ou redução do desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos sintomas clínicos da mesma). Em uma outra modalidade, "tratar", "tratando" ou "tratamento" se refere ao alívio ou melhora de pelo menos um parâmetro físico incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo paciente. Em ainda uma outra modalidade, "tratar", "tratando" ou "tratamento" se refere à modulação da doença ou distúrbio, ou fisicamente (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologica- mente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Desta maneira, tratamento inclui inibição (isto é, parada do desenvolvimento ou desenvolivmento adicional da doença, distúrbio ou condição ou sintomas clínicos associados com os mesmos) de uma doença ativa (por exemplo, no caso de conjugado de GDF15, de maneira a diminuir o peso corporal, diminuir ingestão de alimento, diminuir o nível de insulina e/ou glicose na corrente sanguínea, aumentar a tolerância à glicose de maneira a minimizar flutuação dos níveis de glicose e/ou de maneira a proteger contra doenças causadas por rompimento de homeostase de glicose).

[00276] Em ainda uma outra modalidade, "tratar", "tratando" ou "tra- tamento" se refere à prevenção ou retardo do início ou desenvolvimento ou progressão da doença ou distúrbio.

[00277] O termo "com necessidade de tratamento" conforme aqui usado se refere a um julgamento feito por um médico ou outro cuidador que um indivíduo requer ou se beneficiará de tratamento. Este julgamento é feito com base em uma variedade de fatores que estão no domínio da especialidade do médico ou cuidador.

[00278] Os termos "prevenir", "prevenindo", "prevenção" e similar se referem a um curso de ação (tal como administração de um conjugado da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado) iniciado de uma maneira (por exemplo, antes do início de uma doença, distúrbio, condição ou sintoma do mesmo) de modo a prevenir, suprimir, inibir ou reduzir, ou temporariamente ou permanentemente, o risco de um indivíduo desenvolver uma doença, distúrbio, condição ou similar (como determinado através de, por exemplo, ausência de sintomas clínicos) ou retardo do início do mesmo, geralmente no contexto de um indivíduo predisposto a ter uma doença, distúrbio ou condição particular. Em certos casos, os termos se referem também a deixar mais lenta a progressão da doença, distúrbio ou condição ou inibição da progressão do mesmo para um estado prejudicial ou de outro modo indesejado.

[00279] O termo "doença ou distúrbio metabólico" se refere a um grupo associado de caraterísticas que inclui, mas não está limitado a, hiperinsulinemia, tolerância à glicose anormal, obesidade, redistribui- ção de gordura para o compartimento abdominal ou do corpo superior, hipertensão, dislipidemia caracterizada por nível alto de partículas de triglicerídeos, baixo de lipoproteína de alta densidade (HDL)-colesterol e alto de lipoproteína de baixa densidade pequena e densa (LDL). Os indivíduos tendo doença ou distúrbio metabólico estão sob risco de desenvolvimento de diabetes Tipo 2 e, por exemplo, aterosclerose.

[00280] A expressão "distúrbio de metabolismo de glicose" compreende qualquer distúrbio caracterizado por um sintoma clínico ou uma combinação de sintomas clínicos que está associado com um nível elevado de glicose e/ou um nível elevado de glicose em um indivíduo com relação a um indivíduo saudável. Níveis elevados de glicose e/ou insulina podem ser manifestados nas doenças, distúrbios e condições que seguem: hiperglicemia, diabetes tipo II, diabetes gestacional, dia-betes tipo I, resistência à insulina, tolerância à glicose comprometida, hiperinsulinemia, metabolismo de glicose comprometido, pré-diabetes, distúrbios metabólicos (tal como doença ou distúrbio metabólico, que é também referido como síndrome X) e obesidade, dentre outros. Os conjugados de GDF15 da presente invenção, e composições dos mesmos, podem ser usados, por exemplo, para obter e/ou manter ho- meostase de glicose, por exemplo, reduzir nível de glicose na corrente sanguínea e/ou reduzir o nível de glicose para uma faixa encontrada em um indivíduo saudável.

[00281] O termo "resistência à insulina" como aqui usado se refere a uma condição onde uma quantidade normal de insulina é incapaz de produzir uma resposta fisiológica ou molecular normal. Em alguns casos, uma quantidade hiperfisiológica de insulina, ou endogenamen- te produzida ou exogenamente administrada, é capaz de superar a resistência à insulina, no todo ou em parte, e produzir uma resposta biológica.

[00282] A expressão "tolerância à glicose", como aqui usado, se refere à habilidade de um indivíduo em controlar ou nível de glicose no plasma e/ou insulina no plasma quando a ingestão de glicose flutua. Por exemplo, tolerância à glicose compreende a habilidade do indivíduo em reduzir, dentro de cerca de 120 minutos, o nível de glicose no plasma de volta para um nível determinado antes da ingestão de glicose.

[00283] O termo "intolerância à glicose" ou "Tolerância à Glicose Comprometida" (IGT) é um estado pré-diabético de disglicemia que está associado com risco aumentado de patologia cardiovascular. A condição pré-diabética previne que o indivíduo leve glicose para células eficientemente e utilizando-a como uma fonte de combustível eficiente, levando a níveis de glicose elevados no sangue e algum grau de resistência à insulina.

[00284] O termo "diabetes Mellitus Tipo 2" é uma condição caracterizada por produção de glicose em excesso e os níveis de glicose em circulação permanecem excessivamente altos como um resultado de eliminação de glicose inadequada e a incapacidade do pâncreas em produzir insulina suficiente.

[00285] O termo "hiperglicemia", como aqui usado, se refere a uma condição onde uma quantidade elevada de glicose circula no plasma sanguíneo de um indivíduo com relação a um indivíduo saudável. Hi- perglicemia pode ser diagnosticada usando métodos conhecidos na técnica, incluindo medição de níveis de glicose no sangue em jejum como descrito aqui.

[00286] O termo "hipoglicemia", também chamado pouco açúcar no sangue, ocorre quando o nível de glicose no sangue cai muito para prover energia suficiente para as atividades do corpo.

[00287] O termo "hiperinsulinemia", como aqui usado, se refere a uma condição onde há níveis elevados de insulina em circulação quando, concomitantemente, níveis de glicose no sangue ou estão elevados ou normais. Hiperinsulinemia pode ser causada por resistência à insulina que é associada com dislipidemia tais como glicerídeos altos, colesterol alto, lipoproteína de baixa densidade (LDL) alta e lipo- proteína de alta densidade (HDL) baixa; níveis de ácidos úricos altos; síndrome do ovário policístico; diabetes tipo II e obesidade. Hiperinsu- linemia pode ser diagnosticada como tendo um nível de insulina no plasma maior do que cerca de 2 pU/mL.

[00288] O termo "Pancreatite" é inflamação do pâncreas.

[00289] O termo "Dislipidemia" é um distúrbio de metabolismo de lipoproteína, incluindo superprodução ou deficiência de lipoproteína. Dislipidemia pode ser manifestada por elevação das concentrações colesterol total, colesterol lipoproteína de baixa densidade (LDL) e tri- glicerídeos e uma diminuição em concentração de colesterol lipoprote- ína de alta densidade (HDL) no sangue.

[00290] O termo "Doença hepática gordurosa (FLD)", também conhecida como fígado gorduroso, é uma condição onde grandes vacúo- los de gordura triglicerídeo acumulam em células do fígado através do processo de esteatose (isto é, retenção anormal de lipídeos dentro de uma célula). Apesar de ter causas múltiplas, o fígado gorduroso pode ser considerado uma doença única que ocorre em todo o mundo naquelas com ingestão excessiva de álcool e no obeso (com ou sem efeitos de resistência à insulina). Quando este processo de metabolismo de gordura é rompido, a gordura pode acumular no fígado em quantidades excessivas, desta maneira resultando em fígado gorduroso. Acúmulo de gordura também pode ser acompanhado por uma inflamação progressiva do fígado (hepatite), chamada esteatoepatite. Ao considerar a contribuição do álcool, a gordura no fígado pode ser chamada esteatose alcoólica ou doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), e as formas mais severas de esteatoepatite alcoólica e esteatoepatite não alcoólica (NASH).

[00291] O termo "esteatoepatite" é um tipo de doença hepática, ca-racterizada por mudança gordurosa de hepatócitos, acompanhada por inflamação intralobular e inflamação. Quando não associada com in-gestão de álcool excessiva, ela é referida como Esteatoepatite não al-coólica (NASH).

[00292] O termo "doença hepática progressiva" é uma doença hepática causada por uma ampla gama de patologias do fígado que progride de um estado relativamente benigno tal como esteatose hepática para estados mais severos incluindo hepatite, fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular. PNPLA3 foi especificamente associada com as doenças hepáticas progressivas tais como NA- FLD/NASH, AFLD/ASH, hepatite viral, doença de Wilson, hemocro- matose hereditária e colangite esclerosante primária (Paola Dongio- vanni e outros. World Journal of Gastroenterology, 2013, 19(41), 6969-6978).

[00293] O termo "Obesidade", em termos do indivíduo humano, pode ser definido como um adulto com um Índice de Massa Corporal (BMI) de 30 ou mais (Centers for Disease Control and Prevention). "Síndrome metabólica" pode ser definida como um grupo de fatores de risco que cria o risco para doença cardíaca e outras doenças tais como diabetes e acidente vascular cerebral. Estes fatores de risco incluem: nível de açúcar no sangue alto - pelo menso 110 miligramas por decilitro (mg/dl) após jejum; triglicerídeos altos - pelo menos 150 mg/dL na corrente sanguínea; HDL baixo - menos de 40 mg/dL; e pressão sanguínea de 130/85 mmHg ou mais (Organização Mundial de Saúde).

[00294] O termo "Doenças cardiovasculares" são doenças relacionadas ao coração ou vasos sanguíneos.

[00295] O termo "Aterosclerose" é uma doença vascular caracterizada por depósitos de lipídeo irregularmente distribuídos no íntimo de artérias de tamanhos grande e médio, algumas vezes causando estreitamento dos lúmens arteriais e precedendo eventualmente fibrose e calcificação. As lesões são geralmente focais e progridem lentamente e intermitentemente. Limitação de fluxo sanguíneo é responsável pela maioria das manifestações clínicas, que variam com a distribuição e a severidade de lesões.

[00296] O termo "Doença cardíaca coronária", também chamada doença da artéria coronária, é um estreitamento de vasos sanguíneos pequenos que fornecem sangue e oxigênio para o coração.

[00297] "Complicações diabéticas" são problemas causados por níveis de glicose altos no sangue, com outras funções do corpo tais como rins, nervos (neuropatias), pés (úlceras no pé e circulação pobre) e olhos (por exemplo, retinopatias). O diabetes também aumenta o risco de doença cardíaca e distúrbios do osso e juntas. Outras complicações a longo prazo de diabetes incluem problemas de pele, problemas digestivos, disfunção sexual e problemas com dentes e gengivas.

[00298] Como aqui usado, a expressão "distúrbio de peso corporal" se refere a condições associadas com peso corporal excessivo e/ou apetite aumentado. Vários parâmetros são usados para determinar se um indivíduo está com excesso de peso comparado com um indivíduo saudável de referência, incluindo a idade, altura, sexo e estado de saúde do indivíduo. Por exemplo, um indivíduo pode ser considerado estar com excesso de peso ou obeso através da avaliação do Índice de Massa Corporal (BMI) do indivíduo, que é calculado dividindo o peso do indivíduo em quilogramas pela altura do indivíduo em metros quadrados. Um adulto tendo um BMI na faixa de -18,5 a -24,9 kg/m é considerado ter um peso normal; um adulto tendo um BMI entre -25 e - 29,9 kg/m pode ser considerado estar com excesso de peso (pré- obeso); um adulto tendo um BMI de -30 kg/m ou mais pode ser considerado obeso. Apetite aumentado frequentemente contribui para peso corporal excessivo. Há várias condições associadas com apetite aumentado incluindo, por exemplo, síndrome alimentar noturna, que é caracterizada por anorexia de manhã e polifagia à noite frequentemente associada com insônia, mas que pode estar relacionada com lesão ao hipotálamo.

[00299] Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que de outro modo indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como"), providos aqui pretende apenas iluminar melhor a invenção e não impõe uma limitação ao escopo da invenção de outro modo reivindicada.

[00300] A atividade e a estabilidade no plasma de um conjugado de acordo com a presente invenção podem ser avaliadas através dos mé-todos que seguem descritos abaixo.

Ensaios e dados

[00301] A atividade e a estabilidade no plasma dos conjugados de GDF15 dos Exemplos 1 e 19B de acordo com a presente invenção podem ser avaliadas através dos métodos in vitro e in vivo que seguem descritos abaixo.

Métodos para estudos animais

[00302] Todos os estudos animais descritos no presente documento foram aprovados pela Novartis Institutes for Biomedical Research Animal Care and Use Committeee de acordo com regulações e orientações locais e federais. Camundongos machos obesos induzidos pela dieta (C57BL/6NTac) foram comprados da Taconic e alimentados com uma dieta de 60% de gordura (Research Diets D12492i) de 6 semanas de vida em diante. Quando da chegada, os camundongos foram alojados um animal por gaiola sob um ciclo de luz-escuro reverso 12h:12h. Todos os animais receberam um mínimo de 1 semana de aclimatação antes de qualquer uso. Os camundongos foram tipicamente estudados entre 3-4 meses de vida. Um dia antes de serem estudados, os camundongos foram aleatorizados com base em peso corporal de maneira que cada grupo tinha um peso corporal médio similar. No dia do estudo, os camundongos foram postos em gaiolas limpas e a comida velha removida. Aproxi- madamente 1 hora depois e um pouco antes do ciclo escuro, os ca-mundongos receberam uma dose subcutânea única ou de veículo (acetato de sódio 30 mM, pH 4) ou um análogo de GDF15 conjugado a lipídeo (0,5 mg/kg). Após todas as injeções terem sido completadas, os camundongos foram novamente pesados e uma quantidade definida de alimento retornada (~50 g por camundongo). Ingestão de alimento e peso corporal foram medidos durante o curso de ~2 semanas nos momentos indicados nas figuras. Em animais substitutos tratados como acima descrito, plasma foi coletado nos momentos indicados e níveis de GDF15 foram medidos através de ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems Quantiki- ne Human GDF15 Immunoassay; DGD150).

[00303] Dose de 0,5 mg/kg sc única a camundongo DIO

[00304] A atividade e a meia-vida dos conjugados da invenção foram testadas no ensaio descrito supra. Tabela 1 *Camundongo magro Exp 1: experimento in vivo 1; Exp 2: experimento in vivo 2.

[00305] Os dados na Tabela 1 demonstram que os conjugados da invenção possuem uma duração de ação significante mais longa comparado com hGDF15 não conjugado e/ou como comparado com hGDF15 peguilado.

Eficácia de conjugado de GDF15 em cachorros alimentados com ração: conjugado de ácido graxo de GDF15

[00306] Objetivo do estudo: Avaliar os efeitos de administração subcutânea de 0,05 mg/kg de um conjugado de GDF15-porção de ácido graxo de acordo com a invenção ou controle de veículo sobre ingestão de alimento em um ambiente agudo (6 horas) e durante um período de 96 horas no cachorro Beagle. Amostras de plasma foram coletadas em vários pontos de tempo durante o período de 14 dias pós-dose a fim de avaliar o perfil de PK deste composto. O peso corporal foi determinado durante o estudo. Tabela 2 Animais: Pesos corporais de linha basal e tratamentos

[00307] Procedimento de dosagem: Dosagem de Veículo ou GDF15 foi realizada após coleta de peso corporal de linha basal e amostra de sangue. O conjugado de GDF15-porção de ácido graxo foi fornecido como uma solução de 0,97 mg/mL e foi dosado através de injeção subcutânea sem diluição a 0,05 mg/kg. Um volume equivalente de 30 mmol/L de Acetato de Sódio pH 4 Veículo (52 µL/kg) foi dado aos animais veículos através de injeção subcutânea.

[00308] Coleta de sangue: Amostras de sangue foram coletadas da veia cefálica ou jugular (3 mL, em tubos contendo EDTA e os inibidores de protease Diprotina A e Aprotinina) e foram postas em gelo até centrifugação a 3.000 rpm por 20 min a 4° C. Plasma foi distribuído em alíquotas e armazenado a -70° C até análise. Os pontos de tempo que seguem foram coletados: 0, 6,75, 24,75, 48,75, 72,75 e 96,75. Amostras adicionais foram coletadas nos dias 7, 10 e 14.

[00309] Medições de Ingestão de Alimento: Medição de ingestão de alimento ad libitum foi iniciada 45 minutos após dosagem. Esta medição de ingestão de alimento consiste em duas fases: uma medição aguda (0-6 horas) e uma medição subcrônica (0-96 horas).

[00310] De 0-2 horas, os cachorros receberam 500 g de ração comum (dieta J/D da Hill). Em 2 horas, a comida restante foi removida, pesada e mais 500 g de ração foram oferecidos para o período de 2-4 horas. Em 4 horas, a comida restante foi removida, pesada e mais 300 g de ração foram oferecidos pelo período de 4-6 horas. Em 6 horas, o alimento restante foi removido e pesado. Uma amostra de sangue foi coletada neste momento (6,75 horas). Os cachorros foram então ofe-recidos com 500 g de ração de um dia para o outro. Na manhã do Dia 1-4, a comida restante foi removida, pesada e uma amostra de sangue foi coletada de cada animal. Nos dias 1-3 os cachorros foram então oferecidos com 500 g de alimento por um período de 24 horas. No dia 4, os cachorros foram retornados para sua porção normal de ração (260 g).

[00311] Medições de Ingestão de Alimento Adicionais: Nos dias 7, 14 e 28 os animais de estudo tiveram 6 horas para consumir sua ração diária (260 g). No final deste período de tempo, qualquer comida restante foi coletada e pesada.

[00312] Medições de Peso Corporal: Os pesos corporais foram medidos na linha basal e dias 2, 4, 7, 10, 14, 18 e 28. Os pesos corporais na linha basal foram coletados no estado em jejum. Os pesos corporais coletados nos dias 2 e 4 não estavam em jejum. Para os animais tratados com veículo, todos os pesos corporais foram coletados no estado em jejum. Para os animais tratados com GDF15, os pesos corporais determinados nos dias 7-28 não eram em jejum uma vez que os animais receberam comida continuamente a fim de estimular o apetite e ganhar peso novamente.

Eficácia de conjugado de ensaio de ácido graxo de GDF15 da invenção em cachorros alimentados com ração

[00313] Objetivo do Estudo: Avaliar os efeitos de administração subcutânea de controle de veículo e 0,015 mg/kg ou 0,005 mg/kg de conjugado de GDF15-porção de ácido graxo da invenção sobre ingestão de alimento em um ambiente agudo (6 horas) e durante um período de 96 horas no cachorro Beagle (Neste estudo o braço do veículo será realizado antes do braço de tratamento em todos os cachorros). Amostras de plasma serão coletadas em vários pontos de tempo durante o período pós-dose de 14 dias a fim de avaliar o perfil de PK deste composto. O peso corporal foi determinado durante o estudo. Tabela 3

[00314] Procedimento de Dosagem: Dosagem de Veículo foi realizada após coleta de peso corporal basal e amostra de sangue. 52 µL/kg de 30 mmol/L de Acetato de Sódio pH 4 Veículo (52 µL/kg) foram dados aos animais veículo através de injeção subcutânea. Dosagem de GDF15 foi realizada após coleta de peso corporal basal e amostra de sangue. O conjugado de GDF15-porção de ácido graxo foi fornecido como 1,20 g/mL de solução e foi dosado através de injeção subcutânea após diluição a 0,015 mg/kg e 0,005 mg/kg. O estoque de GDF15 foi diluído a fim de manter os 52 µL/kg administrados em um estudo anterior.

[00315] Coleta de Sangue: Amostras de sangue foram coletadas para os braços de veículo e tratamento do estudo. As amostras foram coletadas da veia cefálica ou jugular (3 mL, em tubos contendo EDTA e os inibidores de protease Diprotina A e Aprotinina) e foram postas em gelo até centrifugação a 3.000 rpm por 20 min a 4° C. Plasma foi distribuído em alíquotas e armazenado a -70° C até análise. Os pontos de tempo que seguem foram coletados: 0, 6,75, 24,75, 48,75, 72,75 e 96,75 horas. Amostras adicionais foram coletadas nos dias 7, 10 e 14.

[00316] Medições de ingestão de comida: Ingestão de comida foi medida durante ambos os braços de veículo e tratamento do estudo. Medição de ingestão de comida ad libitum foi iniciada 45 minutos após a dosagem. Esta medição de ingestão de comida consistia em duas fases: uma medição aguda (0-6 horas) e uma medição subcrô- nica (0-96 horas).

[00317] De 0-2 horas, os cachorros receberam 500 g de ração comum (dieta J/D da Hill). Em 2 horas, a comida restante foi removida, pesada e mais 500 g de ração foram oferecidos pelo período de 2-4 horas. Em 4 horas, a comida restante foi removida, pesada e mais 300 g de ração foram oferecidos para o período de 4-6 horas. Em 6 horas, a comida restante foi removida e pesada. Uma amostra de sangue foi coletada neste momento (6,75 horas). Os cachorros foram então oferecidos com 500 g de ração de um dia para o outro. Nas manhãs do Dia 1-4, a comida restante foi removida, pesada e uma amostra de sangue foi coletada de cada animal. Nos dias 1-3 os cachorros foram então oferecidos com 500 g de ração por um período de 24 horas. No dia 4, os cachorros foram retornados para sua porção normal de ração (260 g).

[00318] Medições de Ingestão de Comida Adicionais: Nos vários dias entre os dias 7 e 14 no braço de veículo e entre os dias 7 e 27 no braço de tratamento, os animais de estudo tiveram 6 horas para consumir sua ração diária (225 g). No final deste período de tempo, qualquer comida restante foi coletada e pesada. Uma vez por semana, uma medição cronometrada de consumo de comida foi obtida. Consumo de 225 g de ração foi medido em 1, 2, 4 e 6 horas após alimentação para determinar se cada padrão do cachorro tinha retornado para o normal.

[00319] Medições do Peso Corporal: O Peso Corporal foi medido durante ambos os braços de veículo e tratamento do estudo. Durante o braço de veículo, os pesos corporais foram medidos na linha basal nos dias 2, 4, 7, 10 e 14. Durante o braço de tratamento, os pesos corporais foram medidos na linha basal e dias 2, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 24 e 28. Os pesos corporais coletados nos dias 2 e 4 não foram em jejum. Todos os outros pesos corporais foram determinados em estado em jejum.

[00320] O conjugado do Exemplo 2 foi testado no ensaio acima.

[00321] Dose sc única de cachorro Tabela 4 Conjugado de GDF15 melhora as medições de doença metabólica incluindo diabetes e doença hepática gordurosa em camundongos obesos

[00322] Camundongos obesos induzidos por dieta foram dosados uma vez por semana com veículo do Exemplo 19Bm (0,5 mg/kg/s.c.) por 4 semanas. Glicose e insulina não jejum foram me- didas 2 semanas após a primeira dose e glicose e insulina no sangue em jejum de um dia para o outro foram medidos 4 semanas após a primeira dose. O Exemplo 19Bm reduziu a glicose não jejum em 23% (207,1 mg/dl de veículo tratado vs. 160,4 mg/dl de Exemplo 19Bm; p<0,05). O Exemplo 19Bm reduziu os níveis de insulina não jejum em 75% comparado com camundongos tratados com veículo (2,1 vs 8,7 ng/mL; p<0,05). Quatro semanas após a dose inicial, o Exemplo 19Bm reduziu a glicose no sangue em jejum em 28% (142,7 vs. 199,5 mg/dl; p<0,05) e insulina em jejum em 78% (0,77 vs. 3,5 ng/mL; p<0,05). Marcadores de doença hepática gordurosa foram também melhorados em quatro doses, uma vez por semana, de Exemplo 19Bm. O Exemplo 19Bm reduziu esteatose hepática em 57,5% (11,36 vs. 26,73% de gordura no fígado; p<0,05) e níveis no soro de um marcador de dano de hepatócito, alanina aminotransferase (ALT), em 58% (46,2% vs. 110,5 U/L; p<0,05). Ainda, o Exemplo 19Bm diminui a expressão hepática de PNPLA3, um gene causador em doenças hepáticas progressivas, em 77% (p<0,05).

[00323] A atividade e a estabilidade no plasma de conjugados de APJ-agonista dos Exemplos 20 e 21 de acordo com a presente invenção podem ser avaliadas através dos métodos in vitro e in vivo descritos abaixo.

Ensaio de fluxo de Cálcio hAPJ:

[00324] Células estáveis APJ Chem-5 (Millipore No. HTS068C) foram plaqueadas em formato de 384 cavidades com 10.000 célu- las/cavidade em 25 µL de meio de crescimento, então cultivadas 24 horas em uma incubadora de cultura de tecido a 37° C. Uma hora antes do ensaio, 25 µL/cavidade de corante FLIPR Calcium 4 (Molecular Devices R8142) com 2,5 mM de probenecide foram adicionados e as células foram incubadas uma hora em uma incubadora de cultura de tecido a 37° C. Os peptídeos foram solubilizados em HBSS, HEPES & tampão de BSA 0,1%, e serialmente diluídos 10 vezes, de 50 uM para 5 pM, em triplicata. FLIPR Tetra foi usado para adicionar peptídeo às células com corante (1:5, para concentração de peptídeo final variando de 10 uM a 1 pM). Corante FLIPR dentro das células emitiu fluorescência após ligação a cálcio, enquanto fluorescência a partir do exterior das células foi mascarada. Fluorescência foi medida usando comprimentos de onda de excitação de 470-495 e de emissão de 515-575 do FLIPR Tetra. As leituras foram feitas por 3 minutos no total, começando 10 segundos antes da adição de peptídeo. Valores mínimo-máximo foram calculados e postos em gráfico para cada concentração de peptídeo, e software GraphPrism foi usado para calcular valores de EC50 nos pontos de inflexão da curva, para estimulação de fluxo de cálcio pelos peptídeos.

Ensaio in vivo:

[00325] Conjugado foi dissolvido em PBS (Solução salina tampo- nada com fosfato) para uma concentração de 1 mg/mL para forma de Solução de dosagem. A solução de dosagem foi administrada intravenosamente a ratos Sprague-Dawley através da veia da cauda lateral em um volume de 1 ml/kg de peso corporal, correspondendo a uma dose de 1 mg/kg. Amostras de sangue venoso foram adquiridas de um cateter da veia jugular em tempos prescritos após dosagem e imediatamente postas em gelo seco. Estas amostras foram centrifugadas a 4° C, com plasma sobrenadante transferido para um tubo limpo para análise.

Bioanálise:

[00326] Preparação da curva padrão: Solução de estoque foi preparada através de dissolução de conjugado de peptídeo em água para 1 mg/mL. 10 µL de Estoque foram misturados com 990 µL de plasma de rato para formar um estoque de trabalho de 10.000 ng/mL em plasma. Isto foi serialmente diluído em plasma para formar padrões de 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5 e 1 ng/mL.

[00327] Preparação de amostra e padrão: 25 µL de amostra de plasma ou padrão foram transferidos para uma placa limpa. 150 µL de acetonitrila: MeOH (1:1) contendo 100 ng/mL de gliburida como padrão interno foram adicionados a cada frasco e a placa vortexada para misturar os teores. A placa foi centrifugada a 4000 rpm a 4° C. 125 µL de sobrenadante foram transferidos para uma placa limpa, misturados com 50 µL de água e analisados através de LC/MS.

[00328] Análise de LC/MS:

[00329] HPLC: Agilent 1290 HPLC com autoamostrador

[00330] Coluna: MAC-MOD ACE C18, 3 µm, 30mm x 2,1mm i.d.

[00331] Fase móvel A: Ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila

[00332] Fase móvel B: Ácido fórmico a 0,1% em água

[00333] Programa de Gradiente:

[00334] Espectrômetro de massa: AB Sciex 6500

[00335] Condições de MS: Q1 (m/z+) 809,3; Q3 (m/z+) 923,7; DP: 60; CE: 25

[00336] Análise de dados: Dados de MS foram capturados e anali sados usando software WatsonLIMS v7.4. Tabela 5 Atividade e estabilidade de conjugado de agonista de APJ da invenção usando ensaios descritos supra

[00337] A atividade e a estabilidade no plasma dos conjugados de oxi- tocina dos Exemplos 26A e 26B de acordo com a presente invenção po-dem ser avaliadas através dos métodos in vitro e in vivo descritos abaixo. Descrição de ensaio in vitro: Materiais & Métodos Preparação de Placa de Composto

[00338] Os compostos fornecidos foram preparados em DMSO e por fim preparado no Eurofins Discovery Services GPCRProfiler® Assay Buffer para concentrações que eram três vezes maiores do que a concentração de ensaio final. Similarmente, controles veículo e controles positivos foram preparados para assegurar que todos os ensaios fossem apropriadamente controlados. Controles de Referência

[00339] Todas as cavidades foram preparadas usando o Eurofins Discovery Services GPCRProfiler® Assay Buffer. The GPCRProfiler® Assay Buffer era uma Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) onde HBSS foi suplementado para conter HEPES 20 mM e Probene- cide 2,5 mM em pH 7,4.

Ensaio de Fluxo de Cálcio Ensaio de Agonista

[00340] Composto(s) fornecido(s) foi(foram) plaqueado(s) em duplicada para cada concentração ensaiada. O agonista de referência, oxitocina, foi preparado de uma maneira similar para servir como controle de ensaio. O agonista de referência, oxitocina, foi incluído em Emax (a concentração onde o agonista de referência elicitou uma resposta máxima).

[00341] O ensaio de agonista foi conduzido em um instrumento FLIPRTETRA onde o(s) composto(s) de teste, controles de veículo e agonista de referência foram adicionados à placa de ensaio após uma linha basal de fluorescência/luminescência ter sido estabelecida. O ensaio de agonista era de um total de 180 segundos e foi usado para avaliar a habilidade de cada composto em ativar o GPCR ensaiado. Quando do término do ensaio agonista de três minutos, a placa de ensaio foi incubada a 25° C por mais sete (7) minutos.

Processamento de Dados

[00342] Todas as placas foram submetidas a correções de linha basal apropriadas. Uma vez as correções de linha basal tendo sido pro-cessadas, valores de fluorescência/luminescência máximos foram ex-portados e os dados manipulados para calcular a ativação percentual e a inibição percentual. Valores negativos de 0 a -30% podem ser o resultado de variância biológica. Cálculo de manipulação de dados é como segue: ((Max RLU)-(Linha Basal Média))/(Média Pos.)-(Média Linha Basal))

Descrição de ensaio in vivo:

[00343] Conjugado foi dissolvido em PBS (Solução salina tampona- da com fosfato) para uma concentração de 3 mg/mL para formar Solução de dosagem. Solução de dosagem foi administrada intravenosamente a ratos Sprague-Dawley através da veia da cauda lateral em um volume de 1 mg/kg de peso corporal, correspondendo a uma dose de 3 mg/kg. Amostras de sangue venoso foram adquiridas de um cateter na veia jugular em tempos prescritos após dosagem e imediatamente postas em gelo seco. Estas amostras foram centrifugadas a 4° C, com plasma sobrenadante transferido para um tubo limpo para análise.

Bioanálise:

[00344] Preparação de curva padrão: Solução de estoque foi preparada dissolvendo conjugado de peptídeo e peptídeo em dois frascos separados em sulfóxido de dimetila para 1 mg/mL. 10 µL de cada es-toque foram misturados com 980 µL de plasma para formar um estoque de trabalho de 10.000 ng/mL em plasma. Isto foi serialmente diluído em plasma para formar padrões de 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1, 0,5 e 0,1 ng/mL.

[00345] Preparação de amostra e padrão: 25 µL de amostra de plasma ou padrão foram transferidos para uma placa limpa. 150 µL de acetonitrila contendo 100 ng/mL de gluburida como padrão interno foram adicionados a cada frasco e a placa vortexada para misturar os teores. A placa foi centrifugada a 4000 rpm a 4° C. 125 µL de sobre- nadante foram transferidos para uma placa limpa, misturados com 150 µL de água e analisados através de LC/MS.

[00346] Análise de LC/MS:

[00347] HPLC: Agilent 1290 HPLC com autoamostrador

[00348] Coluna: MAC-MOD ACE C18, 3 µm, 30mm x 2,1mm i.d.

[00349] Fase móvel A: Ácido fórmico 0,1% em acetonitrila

[00350] Fase móvel B: Ácido fórmico 0,1% em água

[00351] PROGRAMA DE GRADIENTE:

[00352] Espectrômetro de massa: AB Sciex 6500

[00353] Condições de MS de peptídeo: Q1 (m/z+) 945,20; Q3 (m/z+) 687,27 ; DP: 140 ; CE : 39

[00354] Condições de MS de Conjugado de Peptídeo: Q1 (m/z+) 1270,85 ; Q3 (m/z+) 468,30 ; DP : 140 ; CE : 77

[00355] Análise de dados: Os dados de MS foram capturados e analisados usando software WatsonLIMS v7,4. Tabela 6 Atividade e Estabilidade de conjugado de ácido graxo de oxitocina da invenção de acordo com os ensaios descritos supra

[00356] O Exemplo 13 do WO2014/095773 é representado abaixo:

[00357] O conjugado de oxitocina-ácido graxo da invenção demonstra um aumento de 75 vezes em meia-vida comparado com análogo de oxitocina não conjugado.

[00358] A atividade e a estabilidade no plasma dos conjugados de AgRP dos Exemplos 17A e 27B de acordo com a presente invenção podem ser ensaiadas através dos métodos in vitro e in vivo que seguem descritos abaixo.

A) Protocolo de Ensaio cAMP HTRF: Passagem de Células HEK293/MC4R

[00359] Célula: linhagem de célula estável HEK293/MC4R

[00360] Meio completo: DMEM/F12 1:1 (Gibco, No. Cat. 11039, Para ensaio, meio sem vermelho fenol No. Cat. 21041)

[00361] 10% FBS (Inativado com calor, Gibco, No. Cat. 10082)

[00362] 200µg/mL de Geneticina (Gibco, No. Cat. 10131)

[00363] Hepes a 15 mM (GIBCO, No. Cat 15630)

[00364] L-glutamina a 2mM (GIBCO, No. Cat 25030)

[00365] Frasco: frasco tratado com cultura de tecido de 150cm2 (Corning, No. Cat. 430825).

[00366] - Aspirar o meio condicionado

[00367] - Lavar com 25mL de DPBS (Gibco, No. Cat. 14190), então aspirá-lo

[00368] *FBS inibe tratamento com Tripsina-EDTA.

[00369] - Adicionar 2,5mL de Tripsina-EDTA 0,05% (Gibco, No. Cat. 25300)

[00370] - Deixar alguns minutos, então tampar o frasco por um tem po para separar as células

[00371] - Adicionar 25 mL de meio completo para parar o tratamen to com Tripsina-EDTA

[00372] *Preparação de célula para ensaios, meio completo sem vermelho fenol tem que ser usado.

[00373] - Pipetar suavemente por algumas vezes para ressuspen- der as células em grumo

[00374] - Transferir a suspensão para um tubo de centrífuga de 50 mL

[00375] - Girar a 1200rpm por 3 min

[00376] - Aspirar o sobrenadante

[00377] - Dispersar as células batendo suavemente no fundo

[00378] - Adicionar 5-10 mL do meio completo, então ressuspender pipetando suavemente

[00379] *Preparação de célula para ensaios, meio completo sem vermelho fenol tem que ser usado.

[00380] - Transferir 0,5 mL da suspensão par um frasco de amostra para Vi-cell

[00381] - Contar o número de célula usando um Vi-cell *Registrar a densidade e a viabilidade de célula cada vez

[00382] - Transferir 1-3x106 células para um frasco de 150 cm novo

[00383] Por 3 dias: 3x106 células/frasco

[00384] Por 4 dias: 1x106 células/frasco

[00385] - Incubar a 37° C com CO2 5%

Semeadura de célula para ensaio de cAMP HTRF (Um dia antes do ensaio)

[00386] • Preparar suspensão celular como na seção de passagem

[00387] • Diluir a suspensão para 2,34 x 105 células/mL

[00388] *13 mL são suficientes para uma placa de 384 cavidades.

[00389] • Despejar 30 µL da suspensão celular em cada cavidade de uma placa transparente de 384 cavidades Poly-D-Lisina BIOCOAT (Becton Dickinson, No. Cat. 354660); 7000 células/cavidade

[00390] *Placa revestida com Poli-D-Lisina é essencial neste ensaio.

[00391] *Nenhuma célula para cavidades de padrão cAMP

[00392] • Incubar a 37° C com CO2 5% de um dia para o outro 1. Ensaio (protocolo de 2 etapas) Kit de ensaio: kit Cisbio cAMP HiRange HTRF (No. Cat. 62AM6PEB)

[00393] - Preparação de mistura de IgG/AgRP (1:1)

[00394] • Misturar 15 µL de soluções de trabalho de IgG e 15 µL de AgRP a 120 nM, então incubar por 1 h em temperatura ambiente

[00395] - Preparação de placa de ensaio

[00396] • Descartar meio de cultura invertendo a placa de ensaio de 384 cavidades contendo células em um Wipeall, então bater levemente a fim de remover os meios de cultura.

[00397] • Adicionar 100 µL de DPBS a cada cavidade e descartar da mesma maneira

[00398] *Assim que descartar PBS, ir logo para a próxima assim que possível para evitar secagem

[00399] • Transferir 10 µL dos reagentes que seguem para cada cavidade com base em seu alinhamento de amostra Padrão cAMP Controle negativo para titulação de cAMP Controle Positivo : padrões cAMP : Diluente em kit de HTRF : controle positivo cAMP em kit de HTRF titulação de MSH titulação de AgRP Titulação de IgG : Tampão de ensaio 2 : soluções de trabalho de AgRP : mistura de IgG/AgRP Controle negativo para ensaio de célula : Tampão de ensaio 2

[00400] - Girar rapidamente a placa de 384 cavidades a 1200 RPM

[00401] - Incubar as células por 15 minutos em uma temperatura ambiente

[00402] - ADICIONAR 10 µL DOS REAGENTES QUE SEGUEM EM CADA CAVIDADE COM BASE EM SEU ALINHAMENTO DE AMOSTRA PADRÃO CAMP : TAMPÃO DE ENSAIO 1 CONTROLE NEGATIVO PARA TITULAÇÃO DE CAMP : TAMPÃO DE ENSAIO 1 CONTROLE POSITIVO : TAMPÃO DE ENSAIO 1 TITULAÇÃO DE MSH : SOLUÇÕES DE TRABALHO DE MSH TITULAÇÃO DE AGRP : SOLUÇÃO MSH 6 NM TITULAÇÃO DE IGG : SOLUÇÃO MSH 6 NM Controle negativo para ensaio de célula : Tampão de ensaio 1

[00403] - Girar rapidamente a placa de 384 cavidades a 1200 RPM

[00404] - Incubar as células por mais 30 minutos em uma tempera tura ambiente

[00405] *Este tempo de incubação não é estrito. +/- 5 min deve es tar OK de acordo com os dados de desenvolvimento do ensaio.

[00406] - Adicionar 10 µL de cAMP-d2 (diluído 1:4 no tampão de lise provido no kit)

[00407] *Importante! Para controle negativo, sem cAMP-d2, mas apenas o tampão de lise

[00408] - Adicionar 10 µL de Criptato anti-cAMP (diluído 1:4 no tampão de lise provido no kit)

[00409] - Girar rapidamente a 1200 RPM

[00410] - Incubar a placa de ensaio por 45-60 min em uma tempera tura ambiente

[00411] - Transferir 30 µL de cada amostra para uma cultura de te cido tratada com placa de ensaio de poliestireno de 384 cavidades (Corning, No. Cat. 3572)

[00412] - Girar rapidamente a 1200 RPM

[00413] - Medir a fluorescência com um Molecular device M5 ou M5e com o ajuste que segue. Ajuste do dispositivo molecular M5/M5e B) Ensaio de cAMP MC3 Materiais: Células: Linhagem de célula estável HEK293/MC3R Meio completo: DMEM/F12 1:1 (Gibco, No. Cat.11039) FBS a 10% (Inativado com calor, Gibco, No. Cat.10082) x Geneticina 200µg/mL (Gibco, No. 10131 Cat.) L-glutamina 2mM (GIBCO, No. Cat 25030)

[00414] Frasco: Frasco tratado com cultura de tecido de 150cm2 (Corning, No. Cat. 430825).

[00415] De fundo sólido de 384 cavidades, Greiner bio-one (No. Cat - 781080) Protocolo de ensaio (Protocolo antagonista):

[00416] I. Aspirar o meio condicionado

[00417] II. Lavar com 2,5 mL de DPBS (Gibco, No. Cat. 14190)

[00418] III. Adicionar 2 mL de Tripsina 0,25%-EDTA (Gibco. No. Cat. 25200-056)

[00419] IV. Deixar o frasco por alguns minutos em incubadora, bater levemente no frasco algumas vezes para soltar as células

[00420] V. Adicionar 10 mL do meio completo para parar o tratamento com Tripsina-EDTA e misturar bem através de pipetagem suavemente alguns minutos para ressuspender as células aglomeradas

[00421] VI. Transferir 1,5 ml de células para um frasco de 150 cm novo contendo 20 ml de meio completo

[00422] VII. Transferir a suspensão restante para um tubo de centrífuga de 50 mL

[00423] VIII. Girar a 1200 rpm por 4 min. Aspirar o sobrenadante

[00424] IX. Adicionar 6 mL do tampão de ensaio ao tubo e ressus- pender as células pipetando suavemente

[00425] X. Transferir 0,5 mL da suspensão para um frasco de amostra para Vi-cell e adicionar mais 0,5 ml de PBS

[00426] XI. Contar o número de célula usando um Vi-cell *Registrar a densidade e viabilidade de célula toda vez

[00427] i. Plaquear as células a 4K/cavidade em 10 µL/cavidade de tampão de ensaio contendo IBMX.

[00428] ii. Deixar a placa em incubadora por ~30 min antes do ensaio ser iniciado nas células em suspensão.

[00429] O protocolo de cAMP de duas etapas é seguido pela determinação de cAMP.

Procedimento

[00430] I. A 10 µL/cavidade de células adicionar 5 µL de AgRP preparados a 3x em tampão de ensaio apenas a cavidades antagonistas.

[00431] II. Adicionar 5 µL de tampão a cavidades controle positivo (cavidades que terão DNP-a-MSH).

[00432] III. Incubar a placa a 37° C por ~20 min.

[00433] IV. Adicionar 5 µL/cavidade de agonista de EC80 (DNP-a- MSH) preparado a 4X a cavidades contendo DRC AgRP.

[00434] V. Adicionar 5 µL/cavidade de DRC agonista (NDP-a-MSH) preparado a 4X (concentração mais alta final na placa é 100 nM) para cálculo de EC50 de NDP-a-MSH.

[00435] VI. Adicionar tampão apenas a controle negativo.

[00436] VII. Girar em pulsar a placa de 384 cavidades e incubar as células por 30 minutos em incubadora.

[00437] VIII. Adicionar 10 µL dos reagentes que seguem em cada cavidade:

[00438] a. 10 µL de cAMP-d2

[00439] b. *Importante! Para controle negativo, não adicionar cAMP- d2, mas apenas o tampão de lise e 10 µL/cavidade de Tb-criptato

[00440] c. Adicionar 10 µL de Criptato anti-cAMP

[00441] d. Girar em pulsar a placa e incubar por 60 minutos em temperatura ambiente

C. Descrição do Ensaio In vivo:

[00442] 10 nanomoles de conjugado foram dissolvidos em 300 µL de PBS (Solução salina tamponada com fosfato) para formar Solução de dosagem. A solução de dosagem (300 µM) foi administrada intra-venosamente a ratos Sprague-Dawley através da veia da cauda lateral (correspondendo a uma dose de 10 nanomoles por rato). Sangue foi coletado através de pedaço da cauda em momentos prescritos após dosagem e imediatamente posto em gelo úmido. Estas amostras foram centrifugadas a 4° C, com plasma sobrenadante transferido para um tubo limpo para análise.

Bioanálise:

[00443] Preparação de curva padrão: Os dois conjugados de ácido graxo dos Exemplos 27A e 27B e um peptídeo AgRP maduro foram usados para fazer padrões. Soluções de estoque intermediárias de cada AgRP foram preparadas diluindo os peptídeos marcados em estoque em diluente de amostra de ELISA com caseína para 100 ug/mL. Para ensaio, os intermediários foram diluídos para uma concentração padrão máxima de 2500 pg/mL e então diluídos 2 vezes serialmente para 16 pontos incluindo um padrão de dose zero em diluente de amostra de ELISA com albumina de soro bovino (BSA).

[00444] Diluição da amostra: Amostras de plasma foram diluídas 10 vezes e então 5 vezes serialmente para 31.250 vezes em diluente de amostra de ELISA com BSA.

[00445] Método ELISA de AgRP Humana 5B1: Microplacas de 384 cavidades foram revestidas com clone de AgRP anti-humano 5B1 de um dia para o outro a 30 µL/cavidade em 1x PBS em temperatura ambiente (TA). As placas foram aspiradas e bloqueadas com bloqueador à base de leite a 90 µL/cavidade por 2 horas em TA. Todas as incubações adicionais foram realizadas a 30 µL/cavidade. As placas foram aspiradas novamente e amostras e padrões foram adicionados às cavidades por 2 horas em TA. Então as placas foram lavadas três vezes com um tampão de lavagem à base de fosfato com Tween-20 e um anticorpo policlonal para AgRP anti-humano de cabra biotinilado foi adicionado às cavidades para detectar o AgRP ligado por 2 horas em TA. As placas foram lavadas novamente e um reagente estreptavidina marcado com HRP foi adicionado às cavidades por 30 minutos em TA. As placas foram lavadas uma vez final, um substrato quimiolumines- cente foi adicionado a todas as cavidades e as placas foram lidas imediatamente em um Spectramax M5 para saída de luz.

[00446] Análise de dados: Dados brutos foram organizados e analisados quanto a parâmetros PK básicos. Tabela 7 Atividade e Estabilidade de conjugados de ácido graxo de AgRP da invenção de acordo com ensaios descritos supra.

[00447] A atividade e a estabilidade no plasma do conjugado FGF23 dos Exemplos 28A, 28B e 28C podem ser avaliadas através dos métodos in vitro descritos abaixo.

Ensaio de atividade in vitro

[00448] Egr-1-luciferase: A atividade biológica do conjugado hFGF23-FA foi testada em ensaios de repórter de Egr-1-luciferase. Ligação do conjugado hFGF23-FA ao receptor de FGF23 resultou na ativação a jusante de Egr-1 e na expressão de um repórter da luciferase regulado pelo promotor de Egr-1. O gene repórter da Egr-1-luciferase foi construído com base naquele relatado por Urakawa e outros (Nature, 2006, Vol. 444, 770-774). Células HEK293T semeadas em placa de poli-D-lisina de 48 cavidades foram transfectadas com gene repórter da Egr-1-luciferase, a forma de transmembrana de comprimento integral de Klotho e um gene repórter de normalização de transfecção (luciferase Renilla). Cinco horas após as transfecções, a mistura de transfecção foi substituída com 3 ml de DMEM mais FBS 1% contendo concentrações graduadas da proteína de teste. As células foram lisadas 20 horas mais tarde em tampão de lise passivo (Promega, No. Cat. E194A) e atividade de luciferase foi determinada usando Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, No. Cat. E2940). Tabela 8 Resultados

[00449] A atividade e a estabilidade no plasma dos conjugados de serelaxina ácido graxo dos Exemplos 29A e 28B de acordo com a presente invenção foram avaliadas através dos métodos in vitro e in vivo que seguem descritos abaixo.

Ensaios de Atividade In vitro No. 1: Materiais:

[00450] DMEM: meio F12 (Gibco, No. Cat. 11320)

[00451] IBMX (Sigma, No. Cat. I5879)

[00452] 384 placas brancas de fundo sólido (Greiner bio-one, No. Cat. 781945)

[00453] kit 20,000 dynamic-2 cAMP (Cisbio, No. Cat. 62AM4PEC)

[00454] monofosfato de adenosina 3', 5'- cíclico (Sigma, No. Cat. A9501)

[00455] Placa associada adicionada à matriz (usada para adição de 5 µl de reagentes de ensaio)

[00456] PBS-Gibco (No. Cat. 10010-023)

Protocolo:

[00457] Dia1: Semeadas células RXFP1-HEK293/HEK293 paren tais em 8k em 10 µL de meio DMEM: F12 em placas brancas revestidas com PDL de fundo sólido

[00458] Dia2: Realizado o ensaio com o composto

Modo agonista (visão geral)

[00459] • Células em 10 µL de meio DMEM:F12 @ 37° C O/N

[00460] • 5 µL de 2000 µM (4x) de IBMX às células por 30 min a

[00461] 37° C

[00462] • 5 µL de 4x composto/Serelaxina ao acima por 30 min a 37° C (da etapa 3 de diluição cpd, 400 nM- final é 100 nM máximo)

[00463] • 10 µL de conjugado de cAMP-d2

[00464] • 10 µL de conjugado de anti-cAMP criptato

[00465] • Incubado por 1 h em TA

[00466] • Ler sinal de FRET - Envision 665 nm/620 nm

Preparação do composto Serelaxina:

[00467] 1) Diluído o estoque 683,3 µM, isto é, 11,7 µl, em 188,3 de PBS pH7,4 diluído 3x em PBS através de transferência de 15 µL de cpd para 30 µL (final é 40 µM) - à mão

[00468] 2) Diluído 1:10, isto é, 6 µl do acima, em 54µl de DMEM:F12 (o final é 4 µM) - à mão

[00469] 3) Diluído 1:10, isto é, 10 µl do acima, em 90µl de DMEM:F12 (o final é 400nM) - à mão

Conjugado de Serelaxin- AF

[00470] 1) Diluído o estoque para 40µM em PBS pH7,4 diluído 3x em PBS através de transferência de 15 µL de composto para 30µl

[00471] 2) Diluído 1:10, isto é, 6 µl do acima, em 54 µl de DMEM:F12 - à mão

[00472] 3) Diluído 1:10, isto é, 10 µl do acima, em 90µl de DMEM:F12 (diluição 1:100)- à mão

Ácido graxo

[00473] 1) Diluído o estoque para 40 µM em PBS pH7,4 diluído 3x em PBS através de transferência de 15 µL de cpd para 30 µl

[00474] 2) Diluído 1:10, isto é, 6 µl do acima, em 54µl de DMEM:F12 - à mão

[00475] 3) Diluído 1:10, isto é, 10 µl do acima, em 90µl deD- MEM:F12 (diluição 1:100)- à mão

Diluições de curva padrão de cAMP

[00476] 1. 150 µL de cAMP padrão diluído em meio DMEM:F12 pa ra primeira coluna (2800 nM)

[00477] 2. 100 µL de meio DMEM:F12 para as colunas subsequen tes até 10 (1-11)

[00478] 3. Diluições 3x, através de transferência de 50 µL para 100 µL

[00479] 4. 20 µL da etapa 3 para cavidades apropriadas da placa de curva padrão

[00480] 5. 10 µL de conjugado de Anti-d2 & Anti-cAMP criptato

[00481] 6. Incubar 1 h em temperatura ambiente

[00482] 7. Ler Sinal FRET-Envision 665 nm/620 nm

Análise:

[00483] A concentração de cAMP nM foi transformada Log(x) usando Graph pad prism.

[00484] A quantidade de cAMP foi interpolada a partir da curva padrão usando regressão não linear de 4 parâmetros.

[00485] Os valores interpolados foram convertidos em nM usando transformação 10AY.

[00486] As quantidades de cAMP computadas foram postas em gráfico contra a concentração de composto, usando regressão não linear de 4 parâmetros. Tabela 9 Resultados: ATIVIDADE IN VITRO NA PRESENÇA DE ALBUMINA DE SORO BOVINO E SORO HUmano No. 2:

Materiais:

[00487] Meio DMEM: F12 (Gibco, No. Cat. 11320)

[00488] IBMX (Sigma, No. Cat. I5879)

[00489] 384 Placas brancas de fundo sólido (Greiner bio-one, No. Cat. 781945)

[00490] Kit 20,000 dynamic-2 cAMP (Cisbio, No. Cat. 62AM4PEC)

[00491] Monofosfato de adenosina 3', 5'- cíclico (Sigma, No. Cat. A9501)

[00492] Placa associada adicionada à matriz (usada para adição de 5 µL de reagentes de ensaio)

[00493] PBS-Gibco (No. Cat. 10010-023)

[00494] 1M de HEPES Gibco (cat-15630-080)

[00495] 1X HBSS Gibco (cat-14175-095)

[00496] Tampão de ensaio - 1xHBSS + 10mM HEPES

[00497] Albumina de soro bovino No. Cat. A2153 (Sigma-Aldrich)

[00498] Sigma Aldrich -H4522 (Soro humano)

Condições:

[00499] • 600 µM de BSA

[00500] • 4% de Soro Humano

[00501] • 10% de Soro Humano (Sigma aldrich -H4522)

[00502] • Tampão de ensaio

Compostos testados:

[00503] • Serelaxina

[00504] • Serelaxina-FA (Exemplo 29A)

Manuseamento do composto:

[00505] Serelaxina-: O estoque é (796,57 uM) isto é, PM de 4,75 mg/mL é 5963 Dáltons

[00506] Estoque de 10 µL de Serelaxina dissolvidos em 190 µL de PBS, a concentração final é 40µM, que são diluídos 3x através de transferência de 30 µL para 60 µL da curva de 11 pontos de tampão de ensaio, (A2-A12) 12o é zero.

[00507] Conjugado de Serelaxina-FA: O estoque é (287,79 uM) isto é, PM de 2,61 mg/mL é 9069 Dáltons

[00508] Solução de estoque de Serelaxin 27,798 µL dissolvidos em 172,2ul de PBS, a concentração final é 40µM, que são diluídos 3x através de transferência de 30 µL para 60 µL da curva de 11 pontos de tampão de ensaio, (A2-A12) 12o é zero.

Preparação da solução de estoque de BSA:

[00509] Para 666,66 uM de BSA: Fazer o tampão de ensaio 30 ml dissolvendo 1,32 g de BSA

[00510] Para 600 uM de BSA: Fazer o tampão de ensaio 30 ml dissolvendo 18 g de BSA

[00511] Sem BSA, tem apenas tampão de ensaio

Soro Humano

[00512] Para HS 4,44%: 1,34 ml em 28,66 ml de tampão de ensaio

[00513] Para HS 4%: 1,2ml em 28,8 ml de tampão de ensaio

[00514] Para HS 11,11%: 3,33 ml em 26,67 ml de tampão de ensaio

[00515] Para HS 10%: 3 ml em 27 ml de tampão de ensaio

Procedimento:

[00516] Dia 1: Semear 8.000 células/cavidade de RXFP1-HEK293 e células HEK293 (parentais) em volume de 10 µL/cavidade em meio basal DMEM:F12 em placa de fundo sólido. Incubar as células de um dia para o outro a 37° C/CO2 5%.

[00517] Dia 2:

[00518] 1. Lavar as células 2x com 50 µL de tampão de ensaio e foram batidas suavemente em toalha de papel para retirar o tampão de ensaio após primeira e segunda lavagens

[00519] 2. As células foram pré-tratadas com 15 µL de meio com IBMX (666,66 uM) contendo respectivo meio (600 uM de BSA, BSA 4%, Soro Humano 10% e tampão de ensaio sozinho) por 30 minutos a 37° C

[00520] 3. Diluir serialmente cpds 3x vezes, curva de 11 pontos - transferência de 15 µL de cpds da cavidade anterior para a cavidade subsequente com 30 µL de PBS, cavidade 11 é PBS sozinho

[00521] 4. Diluir (1:10) em tampão de ensaio da etapa 3 (isto é, é 10 µL para 90 µL de tampão de ensaio)

[00522] 5. Diluir novamente da etapa 4 (1:10) em respectivos meios (666,66 µM de BSA & 4,44% & 11,11% de Soro humano e tampão de ensaio) concentração final de BSA é 600 µM e Soro humano é 4 & 10%

[00523] 6. (*Incubar os cpds por 1 em TA em seus respectivos mei os, antes da adição às células)

[00524] 7. 5 µL da etapa 6, isto é, 4x de Serelaxina/Serelaxina-GA a 15 µL de células por mais 30 minutos a 37° C (concentração máxima de Serelaxina é 100 nM)

[00525] 8. Adicionar 10 µL de conjugado de cAMP d2

[00526] 9. Adicionar 10 µL de anti-cAMP-Criptato

[00527] 10. Incubar por 1 h em temperatura ambiente

[00528] 11. Ler FRET em Evision

[00529] 12. Curvas padrão de cAMP foram feitas em seus respecti vos meios

Diluições de curva padrão de cAMP

[00530] O estoque inicial de padrão de cAMP é 1120000 nM

[00531] 1. Diluir o estoque inicial (1:4) dissolvendo 20 µL do esto que de cAMP em 60 µL de tampão de ensaio

[00532] 2. Diluição (1:10) da etapa 1 no tampão de ensaio (isto é, é 20 µL em 180 µL de tampão de ensaio)

[00533] 3. Diluição (1:10) da etapa 2 na respectiva concentração de HS 4,44% & 11,11%, BSA 666,66 uM ou Sem BSA - A concentração final terminaria sendo 4%, 10% de HS e 600 µM de BSA.

[00534] Curva padrão de cAMP

[00535] 1. Adicionar 150 µL dos respectivos padrões de cAMP à primeira coluna (2800nM)

[00536] 2. Adicionar 100 µL do tampão de ensaio com respectivas concentrações de BSA 600 uM, 4% & 10% de HS e 0% às 11 colunas subsequentes, isto é, (2-12)

[00537] 3. Diluições 3x, através de transferência de 50 µL para 100 µL de cavidades subsequentes, a 12° cavidade é Zero sem cAMP

[00538] 4. 20 µL da etapa 3 a cavidades apropriadas da placa de curva padrão

[00539] 5. Adicionar 10 µL de conjugado d2

[00540] 6. Incubar 1h à temperatura ambiente

[00541] 7. Ler em HTRF-Envision

Análise:

[00542] A concentração de cAMP é transformada Log (x) usando Graph pad prism.

[00543] A quantidade de cAMP foi interpolada a partir da curva padrão usando regressão não linear de 4 parâmetros.

[00544] Os valores interpolados foram convertidos para nM usando transformação 10AY.

[00545] As quantidades de cAMP computadas foram postas em gráfico contra a concentração de composto usando regressão não linear de 4 parâmetros. Tabela 10 Resultado:

[00546] Os compostos (serelaxina e conjugados de serelaxina) podem ser testados em vários modelos de roedor para avaliar respostas cardiovasculares a curto e longo prazos.

[00547] Modelos a curto prazo - Camundongos (qualquer linhagem, mas DBA/2 preferido) ou ratos (qualquer linhagem, mas Sprague- Dawley preferido) são anestesiados com isoflurano inalado, mantidos em um plano cirúrgico estável de anestesia com ~2% de isoflurano em 100% de oxigênio e a temperatura retal mantida em um nível normal. Uma artéria carótida e veia jugular (camundongos) ou uma artéria e veia femoral (rato) são expostas através de incisões de sobreposição cutânea e os vasos cateterizados. O cateter arterial é conectado a um transdutor de pressão e o sinal é direcionado para um sistema de aquisição de dados digital (por exemplo, Ponemah) para medição contínua de pressão arterial e desencadeamento da frequência cardíaca. Alternativamente, a frequência cardíaca é desencadeada por um sinal de eletrocardiograma registrado através de eletrodos de agulha subcu- taneamente inseridos. Após permitir que a pressão arterial e a frequência cardíaca estabilizem, um coquetel de agentes de bloqueio autônomos (por exemplo, atropina e propanonol a 2 mg/kg cada) é administrado intravenosamente durante ~3-4 minutos. Quando os parâmetros cardiovasculares restabelecem, serelaxina ou conjugados de sere- laxina são injetados como um bolo intravenoso durante ~3 seg. A rela- xina elicita um aumento em frequência cardíaca com um início lento característico (resposta de pico em ~6 minutos) e duração de ação sustentada (horas). Na mesma preparação animal, função cardíaca ventricular (por exemplo, fração de ejeção, encurtamento fracional, débito cardíaco) é medida através da coleta de imagens ecocardiográ- ficas seriais, que são analisadas off-line.

[00548] Modelos a longo prazo - Camundongos (qualquer linhagem, mas DBA/2 preferida) ou ratos (qualquer linhagem, mas Sprague-Dawley preferida) são anestesiados com isoflurano inalado e mantidos em um plano cirúrgico estável de anestesia com ~2% de isoflura- no em 100% de oxigênio. Os analgésicos são administrados peri- e pós-operatoriamente. Uma artéria e uma veia são canuladas como acima descrito, mas os cateteres exteriorizados através da região da pele dorsal recebem fluxo de solução salina heparinizada e tapados com um pino de aço inoxidável. Um cateter subcutâneo seria também implantado subcutaneamente em camundongos e exteriorizados de uma maneira similar. Em ratos, os cateteres são direcionados através de um sistema de mola/giratório (springtether/swivel). No dia do estudo, cateteres arteriais são conectados a transdutores de pressão, bloqueio automático é obtido como acima descrito exceto que os agentes de bloqueio também podem ser administrados através do cateter subcutâneo em camundongos, e o bloqueio em ambas as espécies é mantido em seguida através de infusões intravenosa e subcutânea contínuas dos agentes autônomos. A pressão arterial e a frequência cardíaca são monitoradas continuamente com um sistema de aquisição de dados digital. Após permitir que a pressão arterial e a frequência cardíaca estabilizem, os agentes de bloqueio autônomos são administrados intravenosamente ou subcutaneamente durante ~3-4 mi-nutos. Quando parâmetros cardiovasculares restabelecem, serelaxina ou conjugados de serelaxina são injetados como um bolo intravenoso durante ~3 s. Para avaliar a função cardíaca ventricular e a frequência cardíaca durante um período de semanas em camundongos ou ratos, conjugados de serelaxina são injetados subcutaneamente 1-3 vezes por semana e imagens ecocardiográficas seriais coletadas na linha basal e depois semanalmente.

Fonte de Serelaxina:

[00549] Serelaxina (relaxina humana de 1 cadeia recombinante)

[00550] Connectis Corporation, No. lote 00L605

[00551] 1,0 mg/mL (frasco de 5 mL) em tampão de acetato de Na 20 nM (pH 5,0)

[00552] Diluição de solução de estoque em veículo para a concentração desejada de serelaxina para cada dose.

[00553] A atividade e a estabilidade no plasma do conjugado de PIP do exemplo 30 podem ser avaliadas através dos métodos in vitro e in vivo que seguem descritos abaixo.

Ensaio de Secreção de Insulina Estimulada por Glicose (GSIS):

[00554] Teste GSIS foi realizado como uma medição de função de célula beta pancreática in vivo seguindo Proteína induzível por Prolac- tina humana recombinante (hPIP) em camundongos obesos induzidos por dieta de alto teor de gordura (DIO). Em suma, os camundongos (m=5-7/grupo) foram deixados em jejum de um dia para o outro (17:008:00) e no dia do teste o peso corporal e glicose no sangue (BG; determinado com medidores de glicose Embrace) que foi designado como ponto de tempo de linha basal. Em seguida, os camundongos foram administrados com PIP (PIP nativo e conjugado a FA; solução em PBS; administrada em 4 ml/kg de peso corpora) ou um veículo- controle (PBS) uma vez intravenosamente (IV). Quarenta minutos seguindo a administração de hPIP, todos os camundongos foram dosados com glicose oral (3 g/kg de dextrose; solução em PBS; administrada em 4 ml/kg de peso corpora). Glicose no sangue foi medida imediatamente antes da carga de glicose (designado ponto de tempo 0 min) e em 15 e 30 min pós-glicose. Amostras de sangue foram coletadas para isolamento de plasma e medição de insulina no plasma foi realizada em 0, 15 e 30 min pós-glicose.

Ensaio Farmacocinético (PK):

[00555] Exposição ao plasma de hPIP foi medida em camundongos DIO seguindo uma administração IV única. Em suma, camundongos DIO alimentados livremente (n=2) foram administrados com hPIP (PIP nativo e conjugado a FA; solução em PBS; administrada a 4 mg/kg de peso corporal) uma vez intravenosamente (IV). Amostras de sangue foram coletadas e o plasma isolado em 0,25, 0,5, 1, 3, 7, 24 e 48 horas pós-dose e ensaio ELISA da casa (protocolo mostrado abaixo).

[00556] Os ensaios foram medidos através das etapas que seguem:

[00557] • As placas foram revestidas de um dia para o outro em temperatura ambiente com 30 µL de anticorpo para hPIP (chamado PIP-8-AB; produzido na casa; No. clone NCB 87.19G9A11, a 8 ug/mL em PBS)

[00558] • Aspiradas antes do bloqueio 2 h com 100 µL de reagente de bloqueio

[00559] • Aspiradas e amostras de 30 µL adicionadas para incubar por 2 h, amostras e padrões são diluídos em tampão de Caseína (Caseína 1%, Fosfato de Sódio Monobásico 1,7 mM, Heptaidrato de Fosfato de Sódio Dibásico 8,1 mM, Cloreto de Sódio 0,15 M, Triton X-100 0,7% e Azida de Sódio 0,1%)

[00560] • As placas foram lavadas 3x 100 µL com tampão de lava gem Teknova (Tween 0,05% em PBS)

[00561] • 30 µL de anticorpo para PIP biotinilado (chamado PIP-6 Ab; produzido na casa; No. clone MBC 87.8C6B3, a 10 ug/mL em tampão de caseína) e incubar por 1 h

[00562] • Lavadas como acima

[00563] • Adicionados 30 µL de Estreptavidina-HRP (No. cat. Pier ce 21140, a 0,4 ug/mL em tampão de HRP) tampão de HRP (Caseína 0,4%, Fosfato de Sódio Monobásico 1,7 mM, Heptaidrato de Fosfato de Sódio Dibásico 8,1 mM, Cloreto de Sódio 0,15M e Cloroacetamida 0,1%) incubar por 30 min

[00564] • Lavadas como acima

[00565] • Adicionado Substrato Quimioluminescente Femto 30 (No. Cat. Thermo 34096) e lidas imediatamente. Tabela 11 Atividade e Estabilidade de conjugado de ácido graxo de PIP da in- venção de acordo com ensaios descritos supra *Comparado com veículo

[00566] O conjugado de ácido graxo de PIP da invenção tem uma exposição prolongada resultando em uma eficácia aperfeiçoada.

[00567] A atividade e a estabilidade no plasma do conjugado de NPFF do exemplo 31 podem ser avaliadas através dos métodos in vitro que seguem descritos abaixo.

Protocolo de ensaio de cAMP com Kit Cisbio cAMP

[00568] O conjugado de NPFF-FA da invenção foi testado na presença de Forscolina no ensaio descrito abaixo. REAGENTES/MATERIAIS

Dia 1: Células de placa em placa de 384 cavidades Seguindo "protocolo de subcultura".

[00569] 1. Fazer meio de crescimento sem antibiótico (se necessário)

[00570] 2. Equilibrar meio de crescimento sem garrafa de antibiótico em banho de água a 37° C após pulverização com etanol a 70%

[00571] 3. Separar as células com Versene (3 ml por frasco T.75)

[00572] 4. Transferir para tubo Falcon de 50 ml contendo 17 ml de meio de crescimento

[00573] 5. Centrifugar 4 min a 150 g

[00574] 6. Ressuspender o pélete de célula em 10 ml de Tampão de Estimulação. Contar as células.

[00575] 7. Preparar suspensão de célula em meio de crescimento com antibióticos a 5.000 células/50 µL.

[00576] 8. Plaquear 50 µL de suspensão de célula usando a pipeta de 384-125 µL Viaflow

[00577] 9. Deixar as placas descansando sob a cabine de cultura de tecido por 15 min

[00578] 10. Incubar a 37° C, CO2 a 5% e umidade a 90%. Dia 2: PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES REAGENTES: 1. Tampão de Ensaio:

[00579] 500 ml de HBSS + HEPES 10 ml. Armazenar em tempera tura ambiente.

[00580] Tampão de ensaio: 250 ml de HBSS/HEPES + 250 µL de solução IBMX 1000X + BSA 0,1% (825 µL). Fazer fresco todos os dias. 2. Solução de Forscolina 2X: final 1 uM em ensaio:

[00581] Para diluições de cpds: 40 µL de FSK/100 ml de Tampão de ensaio

[00582] Para diluição de NPFF: 10 µL de DMSO/10 ml de FSK 2X. 3. Diluições de NPFF: solução de estoque a 1 mM em dH2O- Final em ensaio 1 uM

[00583] a. estoque de 5 µL/625 µL FSK 2X/DMSO

[00584] b. 100 µL de sol. a + 300 µL de FSK 2x/DMSO. Final em ensaio 1 uM

[00585] c. Fazer 10 diluições etapas %: 100 µL + 300 µL em FSK 2X/DMSO 4. Diluições de Cpds: solução de estoque a 10 mM em DMSO- Final em ensaio 40 uM

[00586] a. Estoque de 5 µL/625 µL FSK 2X.

[00587] b. Fazer 11 diluições etapas %: 100 µL + 300 µL de FSK 2X. 5. Padrão de cAMP:

[00588] a. Estoque padrão de cAMP 10 µL (1,12 mM) + 90 µL de Tampão de ensaio

[00589] b. Diluição a de 10 µL + 90 µL de tampão de estimulação

[00590] c. Dilição b de 20 µL + tampão de estimulação de 428 µL: 500 nM

[00591] d. Fazer 11 diluições ^ partindo da diluição c: diluição c 100 µL + 100 µL de tampão de estimulação 6. Reagentes de Detecção de cAMP

[00592] a. d2-cAMP: 1000 µL/20 ml de Tampão de lise (250 µL/5 ml para uma placa de 384 cavidades)

[00593] b. Conjugado de criptato: 1000 µL/20 ml de Tampão de Lise. (250 µL/5 ml para uma placa de 384 cavidades) PROCEDIMENTO DE ENSAIO Etapa Um:

[00594] 1. Preparar Tampão de estimulação

[00595] 2. Pôr Tampão de lise Cisbio em temperatura ambiente

[00596] 3. Preparar o WellMate (lavar com álcool 70% seguido por dH2O e HBSS/HEPES)

[00597] 4. Preparar diluições de Forscolina e cpds Etapa Dois: Estimulação com Forscolina

[00598] 1. Lavar as células com 50 µL de tampão de estimulação:

[00599] a. Bater suavemente nas placas para remover meio O/N

[00600] b. Pôr toalha de papel branca em cima da placa e centrifugar a placa para cima e para baixo por 20 seg a 300 RPM usando a centrífuga VWR Symphony 4417

[00601] c. Adicionar 50 µL de tampão de estimulação usando a WellMate

[00602] d. Bater suavemente nas placas para remover meio O/N

[00603] e. Pôr toalha de papel branca em cima da placa e centrifugar a placa para cima e para baixo por 20 seg a 300 RPM usando a centrífuga VWR Symphony 4417

[00604] f. Checar as células sob o microscópio

[00605] 2. Adicionar 10 µL de Tampão de estimulação contendo IBMX usando Viaflow 384

[00606] 3. Adicionar 10 µL de solução de Forskolina 2x contendo o cpds usando o Viaflow 384 (no 7° andar). Misturar a solução antes de adicionar às células.

[00607] 4. Incubar 30 min em temperatura ambiente (pôr a placa em uma gaveta para evitar mudanças de temperatura)

[00608] 5. Preparar curva padrão de cAMP e reagentes de detec ção de cAMP

[00609] 6. Adicionar 20 µL/cavidade de curva padrão de cAMP à placa de curva padrão (a mesma placa que a placa de ensaio). Etapa três: Ensaio de cAMP LANCE

[00610] 1. Adicionar 10 µL de d2 cAMP/cavidade à placa de ensaio usando Combi 384

[00611] 2. Adicionar 10 µL/cavidade de conjugado de Criptato para ensaiar a placa manualmente

[00612] 3. Vedar a placa

[00613] 4. Incubar no mínimo por 1 hora em temperatura ambiente (a placa pode ser lida dentro de 24 horas)

[00614] 5. Pôr fita no fundo da placa

[00615] 6. Ler em programa Envision "Cisbio 384 full plate"

[00616] 7. Ver os dados brutos em arquivos acessórios

[00617] 8. Dados analisados com GraphPad (vide arquivo em ar quivos acessórios) Tabela 12 Resultados:

[00618] A atividade e a estabilidade no plasma do conjugado da invenção onde a biomolécula é um siRNA podem ser avaliadas através dos métodos in vivo que seguem descritos abaixo.

Métodos

[00619] O conjugado do Exemplo 24 é um composto do conjugado de siRNA APOC3 com GalNAc (Exemplo de Referência 3) e o ácido graxo. Camundongos transgênicos APOC3 humano (B6;CBA- Tg(APOC3)3707Bres/J) foram comprados do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Os camundongos foram alimentados com ração de roedor padrão e água ad libitum com um ciclo de luz/escuro de 12 h. Sob esta condição, camundongos transgênicos APOC3 desenvolveram hipertrigliceridemia espontaneamente com teor de TG no plasma notadamente aumentado (Aalto-Setala K., J. Clin. Invest. 1992). Quatro camundongos em cada grupo foram injetados subcu- taneamente ou com exemplo de referência 3 (siRNA APOC3- GalNAc) ou conjugado de Exemplo 24 em uma dose de 25 mg/kg de peso corporal. Sangue foi coletado na linha basal imediatamente antes da injeção e 2, 4, 7 e 14 dias após a injeção. Plasma foi usado para mediar níveis de proteína APOC3 humana com um ensaio de HTRF da Cisbio. ANOVA de uma via foi usado para comparar a diferença estatística entre os grupos.

Resultados

[00620] Os níveis de APOC3 no plasma de linha basal eram 176±21 mg/dL e 178±9 mg/dL no exemplo de referência 3 e os 24 grupos conjugados, respectivamente. O exemplo de referência 3 diminuiu os níveis de APOC3 no plasma dependentemente do tempo, em 56% cinco dias após dosagem versus linha basal. Através de comparação, conjugado do exemplo 24 diminuiu APOC3 no plasma mais eficazmente, com uma diminuição de 80% cinco dias após a dosagem (Figura 1). A duração de ação é similar para ambos o exemplo de referência 3 e o exemplo 24 como mostrado na Figura 1.

[00621] O conjugado da presente invenção tem estabilidade no plasma de pelo menos 5 h, pelo menos 10 h, pelo menos 20 h, pelo menos 30 h, pelo menos 40 h ou pelo menos 50 h. Em uma modalidade, a melhora da estabilidade no plasma comparado com a bio- molécula não conjugada é pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes ou 50 vezes ou 75 vezes.

Terapia de Combinação

[00622] O conjugado da presente invenção pode ser administrado ou simultaneamente com, ou antes ou após um ou mais outro agente terapêutico. O conjugado da presente invenção pode ser administrado separadamente, através da mesma via de administração ou uma diferente ou junto na mesma composição farmacêutica que os outros agentes.

[00623] Em uma modalidade, a invenção provê um produto compreendendo um conjugado de qualquer uma das modalidades anteriores ou uma mistura de conjugados como descrito nas modalidades 10 e 13 e pelo menos um outro agente terapêutico como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial em terapia. Em uma modalidade, a terapia é o tratamento de um distúrbio ou doença metabólico, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, dislipidemia, níveis de glicose elevados, níveis de insulina elevados e nefropatia diabética em um indivíduo com necessidade do mesmo compreendendo: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um conjugado da invenção ou uma amida, éster ou sal do mesmo, onde a biomolécula é Fator de Diferenciação de Crescimento 15 humano (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos.

[00624] Os produtos providos como uma preparação combinada incluem uma composição compreendendo um conjugado de qual- quer uma das modalidades anteriores, e o(s) outro(s) agente(s) te- rapêutico(s) juntos na mesma composição farmacêutica, ou um conjugado de qualquer uma das modalidades anteriores, e o(s) outro(s) agente(s) terapêutico(s) em forma separada, por exemplo, na forma de um kit.

[00625] Em uma modalidade, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado de qualquer uma das modalidades anteriores ou uma mistura de conjugados de acordo com a modalidade 10 ou 13 e outro(s) agente(s) terapêutico(s). Opcionalmente, a composição farmacêutica pode compreender um ex- cipiente farmaceuticamente aceitável, como descrito acima.

[00626] Em uma modalidade, a invenção provê um kit compreendendo duas ou mais composições farmacêuticas separadas, pelo menos uma das quais contém um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. Em uma modalidade, o kit compreende meios para separadamente conter as ditas composições, tal como um recipiente, garrafa dividida ou embalagem de folha dividida. Um exemplo de tal kit é uma embalagem blister, como tipicamente usado para a embalagem de comprimidos, cápsulas e similar.

[00627] O kit da invenção pode ser usado para administração de formas de dosagem diferentes, por exemplo, oral, subcutânea ou parenteral, para administração das composições separadas em intervalos de dosagem diferentes ou para titulação das composições separadas umas contra as outras. Para auxiliar na obediência, o kit da invenção compreende tipicamente orientações para administração. Nas terapias de combinação da invenção, o conjugado da invenção e o outro agente terapêutico podem ser fabricados e/ou formulados pelo menos fabricantes ou fabricantes diferentes. Além disso, o conjugado da invenção e o outro agente terapêutico podem ser reunidos em uma terapia de combinação: (i) antes da liberação do produto de combinação aos médicos (por exemplo, no caso de um kit compreendendo o conjugado da invenção e o outro agente terapêutico); (ii) pelos próprios médicos (ou sob a orientação do médico) um pouco antes da administração; (iii) nos próprios pacientes, por exemplo, durante administração sequencial de um conjugado da invenção e o outro agente terapêutico.

[00628] A invenção também provê o uso de um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, para tratamento de uma doença ou condição mostrada aqui, onde o paciente foi anteriormente (por exemplo, dentro de 24 horas) tratado com um outro agente terapêutico. A invenção também provê o uso de um outro agente terapêutico para tratamento de uma doença ou condição mostrada aqui, onde o paciente foi anteriormente (por exemplo, dentro de 24 horas) tratado com um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.

[00629] O termo "em combinação com" um segundo agente ou tratamento inclui coadministração do conjugado da invenção (por exemplo, um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou conjugado de outro modo descrito aqui) com o segundo agente ou tratamento, administração do composto da invenção primeiro, seguido pelo segundo agente ou tratamento e administração do segundo agente ou tratamento primeiro, seguido pelo conjugado da invenção.

[00630] Os termos "segundo agente" e "coagente" são usados in- tercomutavelmente e incluem qualquer agente que é conhecido na técnica para tratar, prevenir ou reduzir os sintomas de uma doença ou distúrbio descrito aqui, por exemplo, um distúrbio ou doença selecionado de um distúrbio ou doença metabólico, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica/esteatoepatite e outras doenças hepáticas progressivas, resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastroparese e outros distúrbios metabólicos.

[00631] Em uma modalidade, a terapia é o tratamento de distúrbios ou doenças metabólicos, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica/esteatoepatite e outras doenças hepática progressivas, re-sistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hipergli- cemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropa- tia, gastroparese e outros distúrbios metabólicos, em um indivíduo com necessidade do mesmo compreendendo: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção, ou uma amida, éster ou sal do mesmo, onde a biomolécu- la é um Fator de Diferenciação de Crescimento 15 humano (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos.

[00632] Exemplos de segundos agentes para combinar com um conjugado da presente invenção, onde a biomolécula é Fator de Diferenciação de Crescimento 15 (GDF15), homólogos, variantes, mu- tantes, fragmentos e outras formas modificadas dos mesmos, incluem:

[00633] 1. Agentes antidiabéticos, tais como insulina, derivados de insulina e miméticos; secretagogos de insulina tais como sulfoni- lureia (por exemplo, clorpropamida, tolazamida, acetoexamida, tol- butamida, gliburida, glimepirida, glipizida); gliburida e Amarila; ligan- tes de receptor de sulfonilureia insulinotrópico tais como meglitini- das, por exemplo, nateglinida e repaglinida; tiazolidinodionas (por exemplo, rosiglitazona (AVANDIA), troglitazona (REZULIN), pioglita- zona (ACTOS), balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglita- zona, englitazona, ciglitazona, adaglitazona, darglitazona, que aumentam a ação da insulina (por exemplo, através de sensibilização da insulina), desta maneira promovendo utilização da glicose em tecidos periféricos; inibidores da proteína tirosina fosfatase-1B (PTP- 1B) tal como PTP-12; inibidores da proteína de transferência de éster de colesterila (CETP) tais como torcetrapibe, inibidores de GSK3 (glicogênio sintase cinase-3) tais como SB-517955, SB-4195052, SB-216763, NN-57-05441 e NN-57-05445; ligantes de RXR tais como GW-0791 e AGN-194204; inibidores de co-transporte de glicose dependente de sódio tal como T-1095; inibidores de glicogênio fos- forilase A tal como BAY R3401; biguanidas tal como metformina e outros agentes que agem através da promoção de utilização de glicose, reduzindo a produção de glicose hepática e/ou diminuindo a produção de glicose intestinal; inibidores de alfa-glicosidase tais como acarbose e miglitol) e outros agentes que deixam mais lenta a digestão de carboidrato e consequentemente absorção a partir do intestino e reduzem hiperglicemia pós-prandial; GLP-1 (peptídeo-1 tipo glucagon), análogos de GLP-1 tais como Exendina-4 e miméti- cos de GLP-1; e inibidores de DPPIV (dipeptidil peptidase IV) tal como vidagliptina;

[00634] 2. Agentes hipolipidêmicos tais como inibidores da coen- zima A redutase 3-hidróxi-3-metil-glutarila (HMG-CoA), por exemplo, lovastatina, pitavastatina, simvastatina, pravastatina, cerivastatina, mevastatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, atorvastatina, rosuvastatina e rivastatina; inibidores de esqualeno sintase; ligantes de FXR (receptor X farnesoide) e LXR (receptor X do fígado); se- questrantes do ácido da bile, tais como colestiramina e colesevelam; fibratos; ácido nicotínico e aspirina;

[00635] 3. Agentes antiobesidade tal como orlistate ou rimona- bante, fentermina, topiramato, qnexa e lorcaserina;

[00636] 4. Agentes anti-hipertensivos, por exemplo, diuréticos de alça tais como ácido etacrínico, furosemida e torsemida; inibidores da enzima de conversão de angiotensina (ACE) tais como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, moexipril, perinodopril, quinapril, ramipril e trandolapril; inibidores da bomba da membrana Na-K-APTase tal como digoxina; inibidores de neutralendopeptidase (NEP); inibidores de ACE/NEP tais como omapatrilate, sampatrilate e fasidotril; antagonistas de angiotensina II tais como candesartana, eprosartana, irbesartana, losartana, telmisartana e valsartana, em particular valsartana; inibidores da renina tais como ditequireno, zanquireno, terlaquireno, alisquireno, RO 66-1132 e RO-66-1168; bloqueadores de receptor e-adrenérgico tais como acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, metoprolol, nadolol, propranolol, sotalol e timolol; agentes inotrópicos tais como digoxina, dobutamina e milri- nona; bloqueadores de canal de cálcio tais como amlodipina, bepri- dil, diltiazem, felodipina, nicardipina, nimodipina, nifedipina, nisoldi- pina e verapamil; antagonistas de receptor de aldosterona; e inibidores de aldosterona sintase;

[00637] 5. Agonistas de proliferador-ativador de peroxissoma, tais como fenofibrato, pioglitazona, rosiglitazona, tesaglitazar, BMS- 298585, L-796449, os compostos especificamente descritos no pedido de patente WO 2004/103995, isto é, compostos dos exemplos 1 a 35 ou compostos especificamente listados na reivindicação 21, ou os compostos especificamente descritos no pedido de patente WO 03/043985, isto é, compostos dos exemplos 1 a 7 ou compostos es-pecificamente listados na reivindicação 19 e especialmente (R)-1-{4-[5-metil-2-(4-trifluormetil-fenil)-oxazol-4-ilmetóxi]-benzenossulfonil}- 2,3-di-hidro-1H-indol-2-carboxílico ou um sal do mesmo; e

[00638] 6. Os compostos antidiabéticos específicos descritos em Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623-633, figuras 1 a 7.

[00639] Ainda, a presente invenção compreende terapia de combinação com agentes e métodos de promoção de perda de peso, tais como agentes que estimulam metabolismo ou diminuem o apetite, e dietas modificadas e/ou regimes de exercício para promover perda de peso. Exemplo da Invenção Abreviação ACN Acetonitrila BEH Híbrido com Ponte de Etileno BOC terc-Butiloxicarbonila BSA Albumina de soro bovino DCM diclorometano DCC N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida DIC N,N'-Di-isopropilcarbodiimida DIPEA N,N'-Di-isopropiletilamina DMAP Dimetilaminopiridina DMF N,N'-Dimetilformamida DTT Ditiotreitol DOT 3,6-Dioxa-1,8-octanoditiol EDC 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida EDTA ácido etilenodiaminotetra-acético ESI ionização por eletropulverização FFA ensaio de foco fluorescente Fmoc cloreto de fluorenilmetiloxicarbonila HCTU: hexafluorfosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio HEP Heptano HFIP Hexafluoroisopropanol HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho HRMS Espectrometria de massa de alta resolução HOBT Hidroxibenzotriazol HS Soro humano LC/MS cromatografia líquida/espectrometria de massa MS espectrometria de massa PM peso molecular MRT tempo de residência médio NHS N-hidroxissuccinimida NMM N-metilmorfolina RMN Ressonância magnética nuclear PEG polietileno glicol pE pbf PG: Piroglutamato 2,2,4,6,7-Pentametildi-hidrobenzofuran-5-sulfonila grupo de proteção PK farmacocinético Pol Apoio de polímero QTOF: espectrômetro de massa de tempo-de-voo quadrupolo Tr : tempo de retenção Ta ou TA: temperatura ambiente Rpm: rotações por minuto Sc subcutâneo SFC fluido supercrítico SPPS Síntese de peptídeo de fase sólida TBME terc-butil éter de metila Trt tritila THF tetraidrofurano TEA trimetilamina TIS trietilsilano t, s, quin, br, m, d (tripleto, singleto, quinteto, amplo, multipleto ) UPLC cromatografia líquida de µLtradesempenho Sínteses: Métodos de LCMS descritos HPLC - Método Analítico F

[00640] • Coluna: XBridge BEH300 C18 (100x4,6 mm), 3 µm; Part n°: 186003612

[00641] • Eluente A: TFA 0,1% em água / Eluente B: TFA 0,1% em ACN

[00642] • Fluxo: 1,0 ml/min

[00643] • Temperatura: 40 °C

[00644] • Gradiente:

UPLC-HRMS - Método Analítico G

[00645] • Waters Acquity UPLC® BEH C18, 1,7 µm, 2,1x50 mm; Part n°: 186002350

[00646] • Eluente A: FA 0,05% + acetato de amônio em água 3,75 mM; Eluente B: FA 0,04% em ACN

[00647] • Fluxo: 1,0 ml/min

[00648] • Temperatura: 50 °C

[00649] • Gradiente: 2 a 98% em 4,4 min

Método H: Método LC-MS

[00650] • HPLC: Fase móvel A: HFIP 2% + TEA 0,1%; Fase móvel B: Metanol;

[00651] • Gradiente: 0 min A 95%, 4 min: A 75%, 8 min A 10%, 8,1min A 95%, 10 min A 95%;

[00652] • Taxa de fluxo: 250 µL/min;

[00653] • Coluna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7um, 2,1x50mm(waters);

[00654] • Temp da coluna: 75 oC

[00655] • MS: QTOF(waters) modo negativo;

[00656] • ESI: 2.9kv; Temp capilar 350 oC; Gás de pulverização: 600ml/min; Temp. da fonte: 150 oC

Método I: Método LC-MS:

[00657] • Fase móvel A: ÁGUA+ÁCIDO FÓRMICO a 0,1%;

[00658] • Fase móvel B: ACETONITRILA+ÁCIDO FÓRMICO a 0,1%;

[00659] • Gradiente: 0min de A a 98%, 0,06min de A a 98%, 1,76min. A a 2%, 2,06min de A a 2%, 2,16min a 98%; Taxa de fluxo: 1ml/min.;

[00660] • Coluna: ACQUITY UPLC BEH C18, 130Â, 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm;

[00661] • Temperatura da coluna: 50 oC;

[00662] • Detector: UV/Vis/CAD (Detector Aerossol carregado)

UPLC HRMS Método J:

[00663] • Coluna: Acquity BEH300 C4 1,7 µm, 2,1x50mm

[00664] • Eluente A: Água (TFA 0,1 %)

[00665] • Eluente B: ACN (TFA 0,1 %)

[00666] • Fluxo: 0,5 mL/min

[00667] • Temperatura: 40°C

[00668] • Gradiente: 20% manter 0,5 min, aumentar para ACN 80% em 10 min

Método K:

[00669] • Coluna: Coluna Waters Protein BEH C4, 300 Angstrom, 3,5um, 4,6x100mm

[00670] • Fase móvel: A: Água (TFA 0,05%) B: ACN (TFA 0,05%)

[00671] • Fluxo: 2 mL/min

[00672] • Temperatura: 40°C

[00673] • Gradiente: Manter B 25%por 1 min, aumentar de ACN 25 60% a 10 min, aumentar para B 95% a 10,50 min e manter por 2 min, então equilibrar a 25% por 2 min. O tempo de atividade total é de 15 min.

[00674] • Espectrômetro de massa: Waters ZQ mass spec

[00675] • UPLC: Coluna: BEH C4, 300 Angstrom, 1,7um, 2,1x50mm

Método L:

[00676] • Coluna: Proswift Monolith 4,6 x 50mm

[00677] • Fase móvel: A: Água (ácido fórmico 0,1%) B: ACN (ácido fórmico 0,1%)

[00678] • Fluxo: 1 mL/min

[00679] • Temperatura: 50°C

[00680] • Gradiente: 0 min de B a 3%; B de 3% a 80% em 2 min; 2,1 min de B a 10%; 2,8 min de B a 95%; 2,9 min de B a 3%

[00681] • Espectrômetro de massa: Faixa de varredura Qtof ESI 100 1900; desconvoluído por Max Ent 1 em pacote de software Mass Lynx

[00682] • UPLC: Waters Acquity

MÉTODO ANALÍTICO S:

[00683] • Coluna Xbridge C18, 3,5 µM, 3,0 x 3,0 mm

[00684] • Eluente: A: Água + Hidróxido de Amônio 5mM B: ACN

[00685] • Taxa de fluxo: 2 mL/min

[00686] • Gradiente: 0,0 min B 2%; B 2% a 95% em 1,70 min; 2,00 min B 95%; 2,10 min B 5%;

[00687] • Espectrômetro de Massa: Single Quadrupole ESI

[00688] • HPLC: Agilent 1100 series

[00689] • Temperatura: 40° C Método Analítico T:

[00690] Ácido 11-bromoundecanoico (4 g, 15,08 mmol), álcool benzí- lico (1,875 mL, 18,10 mmol) e DMAP (92 mg, 0,754 mmol) foram dissolvidos em DCM sob N2 em temperatura ambiente. EDC-HCl (4,34 g, 22,63 mmol) foi adicionado e a reação agitada por 17 h. A reação foi concentrada, seguido pela diluição com Et2O (150 mL). A mistura foi ex-traída com água (30 mL) e a fase aquosa extraída com Et2O (150 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (20 mL) e secos em Na2SO4. O solvente foi removido e o resíduo purificado através de coluna rápida (sílica 120 g, Et2O 0-10%/éter de petróleo) para fornecer intermediário 1 como um líquido incolor (6,75 g, quantitativo): Método LCMS Método A Tr= 1,79 min, M+H 355,2; 1H RMN (400 MHz, CLORO- FÓRMIO-d) d ppm 1,18 - 1,36 (m, 10 H) 1,37 - 1,47 (m, 2 H) 1,64 (quin, J=7,33 Hz, 2 H) 1,85 (dt, J=14,56, 7,06 Hz, 2 H) 2,35 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 3,40 (t, J=6,88 Hz, 2 H) 5,11 (s, 2 H) 7,28 - 7,45 (m, 5 H). Intermediário 2: Undecano-1,1,11-tricarboxilato de tribenzila

[00691] NaH (113 mg, 2,83 mmol) foi suspenso em DMF (6 mL) sob N2 a 0o C. Malonato de dibenzila (0,704 mL, 2,82 mmol) foi lentamente adicionado à suspensão em agitação durante 30 min. Intermediário 1 (903 mg, 2,54 mmol) dissolvido em DMF (3 mL) foi adicionado e a reação deixada agitar a 0o C por 2,75 h antes de ser deixada aquecer para a temperatura ambiente e agitar de um dia para o outro. A reação foi diluída com Et2O (75 mL) e extraída com água (20 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O (75 mL) e os orgânicos combinados lavados com salmoura (30 mL). Os orgânicos foram secos em Na2SO4 e concentrados. O concentrado foi purificado através de coluna rápida (sílica 80 g, EtOAc 0- 10%/HEP) para fornecer um óleo incolor (770 mg, 1,38 mmol, 34%) de pureza de 70%: LCMS Método B Tr= 1,41 min, M+H = 559,6. Intermediário 3: Docosano-1,11,11-tricarboxilato de tribenzila

[00692] A uma suspensão de NaH (66,1 mg, 1,65 mmol) em DMF (2 mL) a 0o C sob N2 foi adicionado Intermediário 2 (770 mg, 1,38 mmol) em DMF (4 mL). Após 35 min uma solução de 1-bromoundecano (0,338 mL, 1,52 mmol) em DMF (2 mL) foi adicionada à reação, que foi deixada aquecer para temperatura ambiente após agitação por 25 min. A reação foi agitada por 2 dias. A reação foi diluída com Et2O (75 mL) extraída com LiCl 10% (25 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O (75 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos em Na2SO4 e o solvente evaporado. Purificação do resíduo através de coluna rápida (sílica 80 g, EtOAc 0-10%/HEP) forneceu intermediário 3 como um óleo incolor (590 mg, 0,827 mmol, 33%). Método LCMS Método B Tr= 1,89min, M+Na 735,5; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,87 - 0,95 (m, 3 H) 1,07 (br. s., 4 H) 1,14 - 1,36 (m, 28 H) 1,66 (quin, J=7,43 Hz, 2 H) 1,85 - 1,95 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 5,12 (s, 4 H) 5,14 (s, 2 H) 7,27 (d, J=2,32 Hz, 1 H) 7,28 - 7,43 (m, 14 H). Intermediário 4: Ácido docosano-1,11,11-tricarboxílico

[00693] Intermediário 3 (590 mg, 0,827 mmol) dissolvido em THF (12 mL) foi combinado com uma suspensão de Pd sobre carbono 10% em THF (8 mL). A suspensão foi agitada e posta sob uma atmosfera de hidrogênio através de balão. Após 1 hora a reação foi passa por um filtro de membrana e os sólidos enxaguados com EtOAc. O filtrado foi evaporado, fornecendo o composto do título como um óleo incolor (353 mg, 0,798 mmol, 96%). Método LCMS Método B Tr= 1,16min, M+H 443,5; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,77 - 0,84 (m, 3 H) 1,06 - 1,33 (m, 32 H) 1,59 (quin, J=7,18 Hz, 2 H) 1,83 - 1,92 (m, 4 H) 2,32 (t, J=7,03 Hz, 2 H). Intermediário 5: Ácido 2-(((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)carbonil)-2- undeciltridecanodioico

[00694] Uma solução de DCC (126 mg, 0,610 mmol) em DCM (1,57 mL) foi adicionada a uma solução de Intermediário 4 e N- hidroxissuccinimida em DCM (5 mL) e THF (5 mL) sob N2. Após 3,5 horas o solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de cromato- grafia de fluido supercrítico (SFC; Princeton 2-etil-piridina, 20x150mm, MeOH 20-30%/CO2), fornecendo o composto do título como um óleo incolor (138 mg, 0,256 mmol, 50%): Método LCMS B Tr= 1,21min, M+H 540,5; 1H RMN (600 MHz, ACETONITRILA-d3) d ppm 0,91 (t, J=7,20 Hz, 3 H) 1,22 - 1,42 (m, 34 H) 1,57 (quin, J=7,34 Hz, 2 H) 1,93 - 1,96 (m, 2 H) 2,28 (t, J=7,47 Hz, 2 H) 2,79 (br. d, J=6,30 Hz, 4 H). Intermediários 6 e 6A: Construto do ácido 2-(azido-PEG23-carbamoil)- 2-undeciltridecanodioico (6) e construto do ácido 12-(azido-PEG23- cabamoil)tricosanoico (6A)

[00695] O intermediário 5 (36 mg, 0,066 mmol) e azido-dPEG23- NH2 (Quanta Biodesign: 73 mg, 0,066 mmol) foram combinados em THF (1,5 mL) e misturados em uma placa de agitação por 15 min antes da adição de DIPEA (17 µL, 0,10 mmol). A reação foi deixada na placa de agitação de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x5 mm, ACN 55- 80%/água + TFA 0,1%) para fornecer intermediário 6 (39 mg, 0,025 mmol, 38%) e intermediário 6a (20 mg, 0,013 mmol, 20%): LCMS Método B Tr= 1,11min, [M+2H]+2 763,4; 1H RMN (400 MHz, CLORO- FÓRMIO-d) d ppm 0,86 - 0,93 (m, 3 H) 1,10 - 1,19 (m, 2 H) 1,20 - 1,29 (m, 23 H) 1,32 (s amplo, 7 H) 1,58 - 1,69 (m, 2 H) 1,69 - 1,79 (m, 2 H) 1,96 - 2,10 (m, 2 H) 2,35 (t, J=7,15 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,51 - 3,57 (m, 2 H) 3,58 - 3,62 (m, 2 H) 3,62 - 3,73 (m, 90 H) 7,46 (s amplo, 1 H); LCMS Método B Tr= 1,23min, [M+2]+2 740,9; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,83 - 0,96 (m, 3 H) 1,27 (s amplo, 25 H) 1,29 - 1,37 (m, 7 H) 1,37 - 1,46 (m, 2 H) 1,53 - 1,73 (m, 4 H) 2,34 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,44 - 3,52 (m, 2 H) 3,55 - 3,60 (m, 2 H) 3,60 - 3,74 (m, 90 H) 6,19 - 6,30 (m, 1 H).

[00696] Alternativamente o construto 6 A é obtido de acordo com o procedimento que segue: Uma solução de intermediário 5 (48 mg, 0,042 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a um frasco carregado com azido- PEG23-amina (Quanta Biodesign No. Cat. 10525) (46 mg, 0,042 mmol). A reação foi agitada por 20 min antes da adição de DIPEA (11 µL, 0,063 mmol) e então mantendo de um dia para o outro. Azido-PEG23-amina (23 mg, 0,021 mmol) e DIPEA (5 µL, 0,029 mmol) foram adicionados e a reação agitada mais um dia. O solvente foi evaporado e o resíduo purifi-cado através de HPLC (Xbridge C18 30x50mm, ACN 10-30%/ NH4OH 5mM). Liofilização das frações resultou em uma mistura de produtos. O material foi purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50mm, ACN 45- 70%/água+TFA 0,1%) para fornecer o intermediário título 6A (30mg, 0,020mmol, 48%): LCMS Método B Tr= 0,81min, [M+H+H3O]+2 764,5; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILA-d3) d ppm 1,30 (s amplo, 28 H) 1,40 - 1,50 (m, 2 H) 1,50 - 1,62 (m, 6 H) 2,14 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 2,23 - 2,35 (m, 3 H) 3,32 (q, J=5,58 Hz, 2 H) 3,37 - 3,43 (m, 2 H) 3,47 - 3,52 (m, 2 H) 3,53 - 3,68 (m, 90 H) 6,54 (s amplo, 1 H) . Intermediário 7: (((11-Bromoundecil)óxi)metanotriil)tribenzeno

[00697] Cloreto de tritila (2,49 g, 8,92 mmol), 11-bromoundecan-1-ol (2,00 g, 7,96 mmol) e DMAP (10 mg, 0,080 mmol) foram dissolvidos em DCM (16 mL) sob N2. Com agitação DIPEA (1,39 mL, 7,96 mmol) foi adicionado e a reação foi mantida por 7 dias. A reação foi dividida entre DCM (20 mL) e água (10 mL). A fase orgânica foi extraída com água (20 mL), seca em MgSO4 e concentrada. O concentrado foi purificado através de coluna rápida (sílica 120 g, EtOAc 0-6%/HEP) para fornecer intermediário 7 (2,50 g, 5,07 mmol, 64%) como um óleo incolor: 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 1,19 - 1,49 (m, 14 H) 1,58 - 1,69 (m, 2 H) 1,79 (dt, J=14,50, 7,00 Hz, 1 H) 1,87 (dt, J=14,55, 7,03 Hz, 1 H) 3,07 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 3,43 (t, J=6,85 Hz, 1 H) 3,55 (t, J=6,79 Hz, 1 H) 7,18 - 7,36 (m, 10 H) 7,42 - 7,52 (m, 5 H). Intermediário 8: 2-(11-(Tritilóxi)undecil)malonato de dibenzila

[00698] NaH (113 mg, 2,83 mmol) foi suspenso em DMF (6 mL) a 0o C sob N2. Malonato de dibenzila foi lentamente adicionado à suspensão agitada. Após 30 min uma solução de intermediário 7 (1,26 g, 2,54 mmol) em DMF (3 mL) foi adicionada. Após 15 min de agitação, a mistura resultante foi deixada aquecer para a temperatura ambiente. Após 3 dias a reação foi diluída com Et2O (75 mL) e extraída com água (40 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O (75 mL). Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e concentrados. O concentrado foi purificado através de coluna rápida (sílica 80 g, EtOAc 0-10%/HEP) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (815 mg, 1,17 mmol, 41%); HPLC Método B Tr= 1,68 min; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 1,16 - 1,40 (m, 16 H) 1,58 - 1,69 (m, 2 H) 1,94 (q, J=7,38 Hz, 2 H) 3,06 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 3,45 (t, J=7,52 Hz, 1 H) 5,16 (s, 4 H) 7,21 - 7,28 (m, 3 H) 7,28 - 7,39 (m, 16 H) 7,42 - 7,51 (m, 6 H). Intermediário 9: 22-(Tritilóxi)docosano-1,11,11-tricarboxilato de tri- benzila

[00699] Uma solução de intermediário 8 (815 mg, 1,17 mmol) em DMF (2 mL) foi adicionada a uma suspensão de NaH (56 mg, 1,40 mmol) em DMF (2 mL) sob N2 a 0o C. A mistura foi agitada por 1 h. 11- Bromoundecanoato de benzila (457 mg, 1,29 mmol) em DMF (2 mL) foi adicionado à reação. A reação foi deixada aquecer para a tempera- tura ambiente 20 min após a adição e agitada de um dia para o outro. A reação foi diluída com Et2O (75 mL) e extraída com água (25 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O (75 mL) e os orgânicos combinados. Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e evaporados. O resíduo foi purificado através de coluna rápida (sílica 40 g, EtOAc 0- 10%/HEP) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (780 mg, 0,803 mmol, 69%). 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,99 - 1,14 (m, 4 H) 1,15 - 1,41 (m, 26 H) 1,58 - 1,71 (m, 4 H) 1,82 - 1,96 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 3,06 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 5,12 (s, 4 H) 5,14 (s, 2 H) 7,28 (s, 24 H) 7,42 - 7,52 (m, 6 H). Intermediário 10: Ácido 22-(tritilóxi)docosano-1,11,11-tricarboxílico

[00700] Uma suspensão de Pd sobre carbono 10% (11 mg, 0,010 mmol) em THF (2,5 mL) foi adicionada a uma solução de intermediário 9 (200 mg, 0,206 mmol) em THF (2,5 mL). A suspensão agitada foi posta sob hidrogênio através de balão. Após 2,25 h a reação foi passada por um filtro de membrana e os sólidos enxaguados com EtOAc. O filtrado foi evaporado para fornecer intermediário 10 (150 mg, quantitativo): 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 1,04 - 1,33 (m, 30 H) 1,45 - 1,62 (m, 4 H) 1,76 - 1,91 (m, 4 H) 2,21 - 2,36 (m, 2 H) 2,97 (t, J=6,60 Hz, 2 H) 7,06 - 7,18 (m, 4 H) 7,19 - 7,24 (m, 5 H) 7,33 - 7,50 (m, 6 H). Intermediário 11: Ácido 2-(((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)carbonil)-2-(11- (tritilóxi)undecil)tridecanodioico (11)

[00701] Intermediário 10 (150 mg, 0,214 mmol) e N- hidroxissuccinimida (25 mg, 0,214 mmol) foram combinados em DCM (4 mL). DCC (49 mg, 0,235 mmol) dissolvido em DCM (0,61 mL) foi adicio-nado e a reação agitada em temperatura ambiente por 7 horas. O solven-te foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50mm; 65-95% ACN/água + TFA 0,1%) seguido por SFC (coluna de 2-etilpiridina Princeton 20x100mm, MeOH 25-35%/ CO2) para fornecer intermediário 11 (34mg, 0,043mmol, 20%) como um óleo incolor: LCMS Método B Tr= 1,47min, M-CO2H 752,7; 1H RMN (400 MHz, CLORO- FÓRMIO-d) d ppm 1,13 - 1,42 (m, 30 H) 1,56 - 1,73 (m, 4 H) 1,94 - 2,14 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 2,83 (s amplo, 4 H) 3,06 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 7,15 - 7,28 (m, 3 H) 7,29 - 7,36 (m, 6 H) 7,41 - 7,50 (m, 6 H). Intermediário 12: Construto de ácido 2-((azido-PEG23)carbamoil)-2- (11-hidroxiundecil)tridecanodioico

[00702] Azido-dPEG23-amina (Quanta Biodesign) 42 mg, 0,038 mmol) em THF (1,5 mL) foi combinado com intermediário 11 (34 mg, 0,043 mmol) sob N2. A reação foi posta em uma placa de agitação e agitada por 20 min. DIPEA (7,44 µL, 0,043 mmol) foi adicionado e a reação agitada por 2 h. DIPEA (4 µL, 0,023 mmol) foi adicionado e a reação mantida de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo absorvido em DCM (3 mL) e TFA (0,5 mL). A solução foi agitada por 1 h ponto quando o solvente foi extraído. O resíduo foi purificado através de HPLC (sunfire C18 30x50mm, ACN 45-70%/água +TFA 0,1%) para fornecer intermediário 12 (4mg, 1,8 µmol, 4,2%): LCMS Método B Tr= 0,75min, [M+2H]+2 771,4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 1,05 - 1,39 (m, 30 H) 1,52 - 1,82 (m, 6 H) 1,97 - 2,09 (m, 2 H) 2,35 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,51 - 3,63 (m, 6 H) 3,63 - 3,75 (m, 90 H) 4,36 (t, J=6,72 Hz, 1 H) 7,49 - 7,65 (m, 1 H). Intermediário 13: Ácido 13-(benzilóxi)-12-((benzilóxi)carbonil)-13- oxotridecanoico

[00703] Malonato de dibenzila (0,88 mL, 3,52 mmol) em DMF (3 mL) foi adicionado lentamente a uma suspensão de NaH (274 mg, 6,86 mmol) sob N2 a 0o C. A mistura foi agitada por 1,5 h antes de ser deixada aquecer para a temperatura ambiente. Ácido 11- bromoundecanoico (933 mg, 3,52 mmol) em DMF (3 mL) foi adicionado e a reação deixada prosseguir de um dia para o outro. A reação foi aquecida para 80° C por 3 h antes de ser deixada esfriar. A reação foi diluída com EtOAc (50 mL) e Et2O (50 mL) e extraída com HCl 1M (25 mL). A fase aquosa foi extraída com EtOAc/Et2O (100 mL). Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e o solvente evaporado. O resíduo foi purificado através de coluna rápida (C18 50 g ACN 30- 100%/água + TFA 0,1%) para fornecer intermediário 13 (315 mg, 0,672 mmol, 19%) como pó branco. LCMS Método B Tr= 1,05 min, M+H 469,5. Intermediário 14: Ácido 23-(benzilóxi)-12,12-bis((benzilóxi)carbonil)-23- oxotricosanoico

[00704] NaH (54 mg, 1,34 mmol) foi suspenso em DMF (1 mL) a 0o C sob N2. À mistura foi adicionado intermediário 13 (315 mg, 0,672 mmol) em DMF (3 mL) de uma maneira em gotas. A reação foi agitada por 1 h antes do intermediário 1 (239 mg, 0,672 mmol) em DMF (1 mL) ter sido adicionado. A reação foi mantida a 0o C por mais 45 min antes de ser deixada aquecer para a temperatura ambiente. A reação foi agitada de um dia para o outro. A reação foi diluída com Et2O 1:1 e EtOAc (75 mL) e extraída com HCl 1M (20 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O 1:1 e EtOAc (75 mL). Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e evaporados. Purificação do resíduo resultante através de HPLC (Xbridge C18 30x50mm, ACN 45-70%/água + NH4OH 5mM) forneceu o composto do título (132mg, 0,178mmol, 26%): LCMS Método B; Tr= 1,53min, M-H 741,8. Intermediário 15: 21-(2,5-Dioxopirrolidin-1-il) henicosano-1,11,11,21- tetracarboxilato de 1,11,11-tribenzila

[00705] DCC (44 mg, 0,213 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionado a uma solução de intermediário 14 (132 mg, 0,178 mmol) e N- hidroxissuccinimida (20 mg, 0,178 mmol) em DCM (2,5 mL). A reação foi agitada em uma placa de agitação por 17 h. A reação foi filtrada e os sólidos enxaguados com DCM. O filtrado foi concentrado e purificado através de coluna rápida (sílica 12 g, EtOAc 0-40%/HEP) para fornecer intermediário 15 (107 mg, 0,127 mmol, 72%): LCMS Método B Tr= 1,53 min, M+Na 8,62,8. Intermediário 16: Ácido 22-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-22- oxodocosano-1,11,11-tricarboxílico

[00706] A uma solução de intermediário 15 (107 mg, 0,127 mmol) em THF (2,5 mL) foi adicionada uma suspensão de Pd sobre carbono 10% em THF (2,5 mL). A mistura foi posta sob uma atmosfera de hidrogênio por 1,5 h. A reação foi passada por um filtro de membrana e os sólidos lavados com DCM e THF. O filtrado foi evaporado para fornecer um óleo incolor (95 mg, quantitativo) que continha o composto do título: LCMS Método B Tr= 0,65 min, M+H 570,5. Intermediário 17: Construto de ácido 2-(11-(azido-PEG23-amino)-11- oxoundecil)tridecanodioico

[00707] Uma solução de intermediário 16 (48 mg, 0,042 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a um frasco carregado com azido-dPEG23- amina (Quanta Biodesign: 46 mg, 0,042 mmol). A reação foi agitada por 20 min antes da adição de DIPEA (11 µL, 0,063 mmol) e então mantida de um dia para o outro. Azido-PEG23-amina (23 mg, 0,021 mmol) e DIPEA (5 µL, 0,029 mmol) foram adicionados e a reação agitada mais um dia. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Xbridge C18 30x50mm, ACN 10-30%/NH4OH 5mM). Liofilização das frações resultou em uma mistura de produtos. O material foi purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50 mm, ACN 45- 70%/água + TFA 0,1%) para fornecer o intermediário título 17 (30 mg, 0,020 mmol, 48%): LCMS SQ4 Tr= 0,81min, [M+H+H3O]+2 764,5; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILA-d3) d ppm 1,30 (s amplo, 28 H) 1,40 - 1,50 (m, 2 H) 1,50 - 1,62 (m, 6 H) 2,14 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 2,23 - 2,35 (m, 3 H) 3,32 (q, J=5,58 Hz, 2 H) 3,37 - 3,43 (m, 2 H) 3,47 - 3,52 (m, 2 H) 3,53 - 3,68 (m, 90 H) 6,54 (s amplo, 1 H). Intermediário 18: Henicosano-1,11,11,21-tetracarboxilato de tetrabenzila

[00708] A uma suspensão de NaH (48 mg, 1,21 mmol) em DMF (2 mL) a 0o C sob N2 foi lentamente adicionado intermediário 2 (337 mg, 0,603 mmol) em DMF (2 mL). A mistura foi agitada por 15 min antes da adição de intermediário 1 (429 mg, 1,21 mmol) em DMF (2 mL). A reação foi agitada a 0o C por 20 min antes de ser deixada aquecer para a temperatura ambiente. A reação foi mantida em temperatura ambiente com agitação por 3 dias. A reação foi diluída com Et2O (75 mL) e extraída com água (20 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O (75 mL). Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e evaporados. O resíduo foi purificado através de coluna rápida (sílica 24 g, EtOAc 0- 15%/HEP) para fornecer o composto do título (315 mg, 0,378 mmol, 63%): LCMS Método B Tr= 1,70 min, M+Na 855,8; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,95 - 1,13 (m, 4 H) 1,13 - 1,40 (m, 24 H) 1,59 - 1,72 (m, 4 H) 1,82 - 1,95 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 4 H) 5,12 (s, 4 H) 5,14 (s, 4 H) 7,14 - 7,44 (m, 20 H). Intermediário 19: Ácido henicosano-1,11,11,21-tetracarboxílico

[00709] Uma suspensão de Pd sobre carbono a 10% (20 mg, 0,019 mmol) em THF (4 mL) foi adicionada a uma solução de intermediário 18 (315 mg, 0,378 mmol) em THF (6 mL) e a reação foi posta sob uma atmosfera de hidrogênio por 2 h. O filtro de membrana foi usado para remover os sólidos que foram lavados com EtOAc. Evaporação do filtrado forneceu intermediário 19 (179 mg, quantitativo) como um sólido branco: LCMS Método A Tr= 1,24 min, M+H 473,4; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 0,99 - 1,15 (m, 4 H) 1,24 (s amplo, 24 H) 1,48 (quin, J=6,94 Hz, 4 H) 1,62 - 1,76 (m, 4 H) 2,18 (t, J=7,34 Hz, 4 H) 12,23 (s amplo 4 H). Intermediário 20: Ácido 11-(((2,5-dioxopirrolidin-1- il)óxi)carbonil)henicosano-1,11,21-tricarboxílico

[00710] N-hidroxissuccinimida (20 mg, 0,170 mmol) e intermediário 19 (90 mg, 0,190 mmol) foram dissolvidos em DCM (3 mL) e THF (0,3 mL). Uma solução de DCC (39 mg, 0,190 mmol) em DCM (0,5 mL) foi adicionada e a reação agitada de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50 mm; ACN 35-60%/água + TFA 0,1%) para fornecer o composto do título como um pó branco (21 mg, 0,037 mmol, 19%); LCMS (Método C Tr= 1,01 min, M+H 570,3). Intermediários 21 e 21a: Ácido 11-((azido-PEG23)carbamoil) henico- sano-1,11,21-tricarboxílico (21) e ácido 12-((azido-PEG23)carbamoil) tricosanodioico (21a)

[00711] Azido-PEG23-amina (41 mg, 0,037 mmol) e intermediário 20 (21 mg, 0,037 mmol) foram combinados em THF (1 mL) e agitados por 10 min. DIPEA (9,66 µL, 0,055 mmol) foi adicionado e a reação foi agitada de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50 mm; ACN 35-60%/água + TFA 0,1%) para fornecer intermediário 21 (22 mg, 0,014 mmol, 38%) e 21a (4 mg, 2,6 µmol, 7%). LCMS Método B Tr= 0,69 min, M+H 1555,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 1,27 (s amplo, 19 H) 1,29 - 1,41 (m, 9 H) 1,65 (quin, J=7,12 Hz, 4 H) 1,78 (td, J=12,13, 4,22 Hz, 2 H) 1,95 - 2,08 (m, 2 H) 2,35 (t, J=7,21 Hz, 4 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,54 (q, J=5,05 Hz, 2 H) 3,58 - 3,77 (m, 92 H) 7,60 (t, J=4,95 Hz, 1 H); LCMS Método B Tr= 0,78min, M-H 1509,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 1,18 (s amplo, 19 H) 1,21 - 1,38 (m, 11 H) 1,43 - 1,63 (m, 6 H) 1,91 - 2,04 (m, 1 H) 2,26 (t, J=7,15 Hz, 4 H) 3,31 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,40 (q, J=5,14 Hz, 2 H) 3,46 - 3,50 (m, 2 H) 3,51 - 3,69 (m, 90 H) 6,23 (t, J=5,01 Hz, 1 H). Intermediário 22: 2-Undecilmalonato de dibenzila

[00712] Malonato de dibenzila (0,88 mL, 3,52 mmol) em DMF (1,5 mL) foi adicionado em gotas a uma suspensão de NaH (155 mg, 3,87 mmol) em DMF (6 mL) sob N2 a 0o C. A mistura foi agitada por 30 min antes da adição de 1-bromoundecano (0,785 mL, 3,52 mmol) em DMF (1,5 mL) à reação. A reação foi deixada aquecer para a temperatura ambiente e agitada por 5 dias. A reação foi diluída com Et2O (75 mL) e extraída com água (20 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O (75 mL). Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e evaporados. O resíduo foi purificado através de coluna rápida (sílica 80 g, EtOAc 0- 10%/HEP) para fornecer o composto do título (974 mg, 2,22 mmol, 63%) como um óleo incolor: LCMS Método B Tr= 1,55 min, M+H 439,5. Intermediário 23: Ácido 2-(((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)carbonil)-2- undeciltridecanoico

[00713] 2-Undecilmalonato de dibenzila (Intermediário 22: 400 mg; 0,912 mmol) em DMF (1 mL) foi adicionado em gotas a uma suspensão de NaH (44 mg, 1,09 mmol) em DMF (2 mL) sob N2 a 0o C. A mis- tura foi agitada por 45 min antes da adição de 1-bromoundecano (0,285 mL, 1,28 mmol) em DMF (1 mL) à reação. A reação foi deixada aquecer para a temperatura ambiente e agitada por 1 dia. A reação foi diluída com Et2O (75 mL) e extraída com água (20 mL). Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e evaporados. O resíduo foi purificado através de coluna rápida (sílica 40 g, EtOAc 0-5%/HEP) para fornecer um óleo incolor (412 mg). O óleo foi dissolvido em THF/MeOH e passado por um Thales Nano H-Cube (1 mL/min, H2 2bar, 22° C) com um cartucho de Pd/C 10%. O efluente foi coletado e evaporado para fornecer um sólido ceroso (272 mg). O sólido ceroso foi dissolvido em DCM/THF 3:1 e concentrado para um óleo. O óleo foi redissolvido em DCM (6 mL) sob N2 e N-hidroxissuccinimida (68 mg), seguido por DCC (136 mg) em DCM (3 mL), foi adicionada. A reação foi filtrada e o filtrado concentrado. O concentrado foi purificado através de coluna rápida (C18 12 g, ACN 15-100%/água + ácido fórmico 0,1%). O material resultante foi purificado adicionalmente através de cromatografia de fluido supercrítico (2-etilpiridina Princeton 20x150 mm; MeOH 5- 15%/CO2) para fornecer intermediário 23 (37 mg, 0,073 mmol, 8%): LCMS Método B Tr= 1,67 min, M+NH4 527,6; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,80 - 0,94 (m, 6 H) 1,18 - 1,42 (m, 36 H) 1,97 - 2,14 (m, 4 H) 2,87 (br. s., 4 H). Intermediário 24: Ácido 2-((azido-PEG23)carbamoil)-2- Undeciltridecanoico

[00714] Uma solução de intermediário 23 (37 mg, 0,073 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a um frasco carregado com azido-dPEG23- amina (Quanta Biodesign: 80 mg, 0,073 mmol). A solução foi agitada em uma placa de agitação e DIPEA (11 µL, 0,065 mmol) foi adicionado. A reação foi agitada de um dia para o outro antes de uma porção adicional de DIPEA (12 µL, 0,071 mmol) ter sido adicionada, e a reação deixada prosseguir de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de cromatografia de fluido supercrí- tico (Amino Princeton 21x150 mm; MeOH 20-30%/CO2) para fornecer o composto do título (45 mg, 0,030 mmol, 41%): LCMS Método B Tr= 1,50 min, [M+2H]+2 748,1; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,90 (t, J=6,85 Hz, 6 H) 1,09 - 1,38 (m, 30 H) 1,58 (s amplo, 12 H) 1,64 - 1,76 (m, 2 H) 1,98 - 2,16 (m, 2 H) 3,41 (t, J=5,14 Hz, 2 H) 3,46 - 3,64 (m, 5 H) 3,64 - 3,91 (m, 83 H). Intermediário 25: 2-Undecilmalonato de di-terc-butila

[00715] Malonato de di-terc-butila (1,0 g, 4,62 mmol) em DMF (2 mL) foi adicionado a uma suspensão de NaH (213 mg, 5,32 mmol) em DMF (5 mL) sob N2 a 0o C. A reação foi agitada por 30 min antes da adição de 1-bromoundecano em DMF (2 mL). Quando da adição a reação foi deixada aquecer para a temperatura ambiente e agitada por 2 dias. A reação foi diluída com Et2O (75 mL) e extraída com água (25 mL). A fase aquosa foi extraída com Et2O (75 mL). Os orgânicos combinados foram secos em Na2SO4 e o solvente evaporado. O concentrado foi purificado através de coluna rápida (sílica 120 g, Et2O 0-40%/éter de petróleo) para fornecer intermediário 25 (0,998 g, 2,69 mmol, 58%): LCMS Método B Tr= 1,64 min, M+Na 393,5; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,85 - 0,94 (m, 3 H) 1,24 - 1,36 (m, 18 H) 1,41 - 1,52 (m, 18 H) 1,74 - 1,86 (m, 2 H) 3,13 (t, J=7,58 Hz, 1 H). Intermediário 26: Docosano-1,11,11-tricarboxilato de 1-benzil 11,11-di- terc-butila

[00716] O composto do título foi sintetizado de uma maneira similar ao intermediário 9 usando intermediário 25 como um material de partida para fornecer um óleo incolor (980 mg, 1,52 mmol, 66%): 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,89 (t, J=6,91 Hz, 3 H) 1,06 - 1,20 (m, 4 H) 1,20 - 1,35 (m, 28 H) 1,45 (s, 18 H) 1,58 - 1,70 (m, 2 H) 1,72 - 1,83 (m, 4 H) 2,36 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 5,12 (s, 2 H) 7,30 - 7,45 (m, 5 H). Intermediário 27: Ácido 12,12-bis(terc-butoxicarbonil)tricosanoico

[00717] Usando o intermediário 26, o composto do título (472 mg, 0,851 mmol, 100%) foi sintetizado de uma maneira similar ao intermediário 19: LCMS Método B Tr= 1,76 min, M-H 553,6; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,84 - 0,95 (m, 3 H) 1,07 - 1,21 (m, 4 H) 1,21 - 1,40 (m, 28 H) 1,46 (s, 18 H) 1,58 - 1,70 (m, 2 H) 1,72 - 1,84 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,46 Hz, 2 H). Intermediário 28: 1-(2,5-Dioxopirrolidin-1-il) docosano-1,11,11- tricarboxilato de 11,11-di-terc-butila

[00718] Intermediário 27 (200 mg, 0,360 mmol) e N- hidroxissuccinimida (42 mg, 0,360 mmol) foram dissolvidos em DCM (3 mL). Uma solução de DCC (89 mg, 0,433 mmol) em DCM (1,6 mL) foi adicionada e a reação agitada por 4,5 horas. A reação foi filtrada e o filtrado concentrado. O concentrado foi purificado através de coluna rápida (sílica 24 g, EtOAc 0-40%/HEP) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (70 mg, 0,107 mmol, 30%): LCMS Método B Tr= 1,74 min, M+Na 674,7. Intermediários 29 e 29A: ácido 2-(11-((azido-PEG23)-amino)-11- oxoundecil)-2-undecilmalônico (29) e ácido 13-((azido-PEG23)-amino)- 13-oxo-2-undeciltridecanoico (29A)

[00719] Uma solução de intermediário 28 (35 mg, 0,054 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a um frasco carregado com azido-PEG23- amina (59 mg, 0,054 mmol). DIPEA (14 µL, 0,081 mmol) foi adicionado e a reação foi agitada de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo redissolvido em DCM (1 mL) e TFA (0,2 mL). A reação foi agitada por 1,25 h antes do solvente ser evaporado. O resíduo foi purificado através de HPLC (Sunfire 30x50mm C18, ACN 55- 80%/água + TFA 0,1%) e o material resultante foi redissolvido em DCM (4 mL) e TFA (2 mL) e agitado por 1,5 h. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Sunfire 30x50mm C18, ACN 55-80%/água + TFA 0,1%) para fornecer intermediário 29 (28 mg, 0,016 mmol, 29%) e intermediário 29A (1 mg, 0,6 µmol, 1%); LCMS Método B Tr= 1,08 min, [M+H+H3O]+2 771,5; 1H RMN (400 MHz, CLO- ROFÓRMIO-d) d ppm 0,90 (t, J=6,72 Hz, 3 H) 1,26 (s amplo, 24 H) 1,32 - 1,41 (m, 8 H) 1,62 (quin, J=7,64 Hz, 2 H) 1,88 - 2,01 (m, 4 H) 2,31 (t, J=7,70 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,46 - 3,56 (m, 3 H) 3,57 - 3,90 (m, 91 H); LCMS Método B Tr= 1,29min, [M+2H]+2 741,1. Intermediário 30: Àcido 22-((azido-PEG23)amino)-22-oxodocosano- 1,11,11-tricarboxílico

[00720] Uma solução de intermediário 16 (58 mg, 0,063 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a um frasco carregado com azido-PEG23- amina (70 mg, 0,063 mmol). DIPEA (17 µL, 0,095 mmol) foi adicionado e a reação agitada em uma placa de agitação de um dia para o outro. A reação foi concentrada e purificada através de HPLC (Sunfire 30x50mm C18, ACN 35-60%/água + TFA 0,1%) para fornecer intermediário 30 (57 mg, 0,036 mmol, 57%) como sólido branco ceroso: LCMS Método B Tr= 0,62 min, M+H 1555,4; 1H RMN (400 MHz, CLO- ROFÓRMIO-d) d ppm 1,28 (s amplo, 18 H) 1,30 - 1,40 (m, 10 H) 1,63 (m, J=7,10, 7,10, 7,10, 7,10, 7,10 Hz, 4 H) 1,88 - 2,02 (m, 4 H) 2,28 (t, J=8,10 Hz, 2 H) 2,35 (t, J=7,40 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,50 (dt, J=9,20, 4,39 Hz, 2 H) 3,57 - 3,63 (m, 2 H) 3,63 - 3,73 (m, 90 H) Intermediário 31: 3-terc-Butil 2-undecilmalonato de 1-benzila

[00721] A uma suspensão de NaH (160 mg, 4,0 mmol) em DMF (8 mL) a 0o C sob N2 foi adicionado terc-butil malonato de benzila (1,0 g, 4,0 mmol) em DMF (2 mL). A mistura foi agitada por 50 min, após o que 1-bromoundecano em DMF (2 mL) foi adicionado. Após mais uma hora de agitação a reação foi deixada aquecer para a temperatura ambiente. A reação foi mantida de um dia para o outro. Et2O (100 mL) e água (20 mL) foram adicionados para dividir a reação. A fase aquosa foi extraída com Et2O (100 mL) e os orgânicos combinados secos em Na2SO4. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de coluna rápida (C18 12 g, ACN 40-100%/água + TFA 0,1%) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (1,14 g, 2,82 mmol, 71%): LCMS Método A Tr= 1,58 min, M+Na 427,4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,84 - 0,96 (m, 3 H) 1,28 (s amplo 12 H) 1,31 (m, J=3,90 Hz, 6 H) 1,41 (s, 9 H) 1,88 (q, J=7,38 Hz, 2 H) 3,29 (t, J=7,58 Hz, 1 H) 5,19 (q, J=12,27 Hz, 2 H) 7,30 - 7,42 (m, 5 H).

[00722] Alternativamente, alquilação de malonato de terc-butila pode ser realizada usando 1-iodoundecano (1,2 eq.) na presença de carbonato de potássio (2 eq.) em DFM. Intermediário 32: Docosano-1,11,11-tricarboxilato de 1,11-dibenzil 11- terc-butila

[00723] O composto do título foi sintetizado de uma maneira similar ao intermediário 9 usando intermediário 31 (650 mg, 1,61 mmol) como um material de partida para fornecer um óleo incolor (823 mg, 1,21 mmol, 75%): 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,84 - 0,94 (m, 3 H) 1,12 (m, J=6,60 Hz, 4 H) 1,19 - 1,33 (m, 28 H) 1,35 (s, 9 H) 1,66 (quin, J=7,40 Hz, 2 H) 1,85 (t, J=8,44 Hz, 4 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 5,14 (s, 2 H) 5,16 (s, 2 H) 7,30 - 7,42 (m, 10 H). Intermediário 33: Ácido 13-(benzilóxi)-2-((benzilóxi)carbonil)-13-oxo-2- undeciltridecanoico

[00724] A uma solução de intermediário 32 (200 mg, 0,295 mmol) em DCM (3 mL) foi adicionado TFA (0,6 mL) e a reação agitada em temperatura ambiente por 3 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de coluna rápida (sílica 12 g, EtOAc 0- 15%/HEP) para fornecer o composto do título (177mg, 0,284mmol, 96%): 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,87 - 0,94 (m, 3 H) 0,94 - 1,05 (m, 2 H) 1,19 (s amplo, 14 H) 1,23 - 1,37 (m, 16 H) 1,65 (quin, J=7,40 Hz, 2 H) 1,78 - 1,91 (m, 2 H) 1,93 - 2,05 (m, 2 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 5,14 (s, 2 H) 5,27 (s, 2 H) 7,31 - 7,44 (m, 10 H). Intermediário 34: Docosano-1,11,11-tricarboxilato de 1,11-dibenzil 11- (2,5-dioxociclopentila)

[00725] O composto do título foi sintetizado de uma maneira similar ao intermediário 15 usando intermediário 33 (177 mg, 0,284 mmol) como um material de partida para fornecer um óleo incolor (153 mg, 0,213 mmol, 75%): 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,86 - 0,93 (m, 3 H) 1,12 - 1,21 (m, 2 H) 1,21 - 1,37 (m, 30 H) 1,66 (quin, J=7,40 Hz, 2 H) 1,89 - 2,07 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 2,84 (s amplo, 4 H) 5,13 (s, 2 H) 5,25 (s, 2 H) 7,30 - 7,47 (m, 10 H). Intermediário 35:

[00726] Uma solução de intermediário 34 (145 mg, 0,201 mmol) em THF (1,5 mL) e DCM (1,5 mL) foi adicionada a um frasco carregado com amino-PEG24-ácido. DIPEA (88 µL, 0,504 mmol) foi adicionado e a reação agitada em uma placa de agitação por 15 h. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de cromatografia de fluido supercrítico (Waters HILIC 20x150 mm; MeOH 15-25%/CO2) para for-necer intermediário 35 (151 mg, 0,086 mmol, 43%): LCMS Método D Tr= 1,30 min, [M+2H]+2 876.4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,86 - 0,93 (m, 3 H) 0,93 - 1,04 (m, 2 H) 1,19 (s amplo, 15 H) 1,23 - 1,37 (m, 15 H) 1,61 - 1,68 (m, 2 H) 1,78 (td, J=12,44, 4,34 Hz, 2 H) 1,92 - 2,05 (m, 2 H) 2,37 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 2,62 (t, J=6,05 Hz, 2 H) 3,49 (dd, J=6,72, 2,32 Hz, 2 H) 3,52 - 3,59 (m, 2 H) 3,59 - 3,73 (m, 92 H) 3,80 (t, J=6,05 Hz, 2 H) 5,13 (s, 2 H) 5,18 (s, 2 H) 7,31 - 7,42 (m, 10 H) 8,09 (t, J=5,26 Hz, 1 H). Intermediário 36:

[00727] DCC (22 mg, 0,103 mmol) em DCM (0,265 mL) foi adicionado a uma solução de intermediário 35 (150 mg, 0,086 mmol) e N- hidroxissuccinimida em DCM (1,5 mL). A reação foi agitada por 1,5 h. Mais N-hidroxissuccinimida (10 mg) em THF (0,5 mL) e DCC (22 mg) em DCM (0,265 mL) foram adicionados e a reação agitada de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de coluna rápida (sílica 12, MeOH 0-5%/DCM) para fornecer intermediário 36 (159 mg, quantitativo) como um sólido branco: LCMS Método B Tr= 1,55 min, [M+H3O+H]+2 933,9. Intermediário 37:

[00728] A uma solução de intermediário 36 (159 mg, 0,086 mmol) em THF (5 mL) foi adicionada uma suspensão de Pd sobre carbono 10% (4,6 mg, 4,3 µmol) em THF (1 mL). A reação foi posta sob hidrogênio e agitada por 40 min. Mais Pd sobre carbono (7 mg, 6,5 µmol) foi adicionado e agitado por mais 1 h sobre hidrogênio. A reação foi passada por um filtro de membrana e o filtrado evaporado. O resíduo foi purificado através de UPLC (Sunfire C18 30x50mm, ACN 45-70%/água + TFA 0,1%) para fornecer o composto do título (83 mg, 0,047 mmol, 54%): LCMS Método B Tr= 1,03 min, [M+2H]+2 835,2; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,84 - 0,94 (m, 3 H) 1,17 (s amplo, 2 H) 1,21 - 1,39 (m, 30 H) 1,57 - 1,68 (m, 2 H) 1,69 - 1,80 (m, 2 H) 1,97 - 2,10 (m, 2 H) 2,34 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 2,86 (s, 4 H) 2,92 (t, J=6,48 Hz, 2 H) 3,51 - 3,73 (m, 96 H) 3,87 (t, J=6,48 Hz, 2 H) 7,45 (t, J=4,46 Hz, 1 H) Intermediário 38: 11-Bromoundec-1-ina

[00729] A uma solução de 10-undecin-1-ol (2,29 mL, 11,9 mmol) e tetracloreto de carbono (4,34 g, 13,1 mmol) em DCM (10 mL) sob N2 a 0o C foi adicionada trifenilfosfina (3,43 g, 13,1 mmol) em porções durante 30 min. Quando do término da adição, a reação foi deixada aquecer para temperatura ambiente. Após 1,5 h a reação foi despejada em ciclo-hexano em agitação (75 mL) e o precipitado coletado. O sólido foi lavado com ciclo-hexano e os filtrados combinados evaporados. O resíduo foi purificado através de coluna rápida (sílica 80 g, EtOAc 0-10%/HEP) para fornecer o composto do título (1,75 g, 7,57 mmol, 64%): 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 1,21 - 1,35 (m, 6 H) 1,35 - 1,48 (m, 4 H) 1,48 - 1,59 (m, 2 H) 1,80 - 1,91 (m, 2 H) 1,94 (t, J=2,63 Hz, 1 H) 2,19 (td, J=7,09, 2,69 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=6,85 Hz, 2 H). Intermediário 39: 2-(Undec-10-in-1-il)malonato de di-terc-butila

[00730] Malonato de di-terc-butila (800 mg, 3,70 mmol) foi dissolvido em DMF (9 mL) a 0o C sob N2 e NaH (148 mg, 3,70 mmol) foi adicionado. A reação foi agitada 30 minutos a 0o C e intermediário 38 (770 mg, 3,33 mmol) foi adicionado lentamente em gotas, resultando em uma solução amarela. A reação foi agitada a 0o C por 2 horas, então aquecida para r.t. e agitada por 16 horas. A mistura foi absorvida em EtOAc (75 mL) e lavada com H2O (25 mL). A camada aquosa foi extraída com EtOAc (75 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4, filtradas e concentradas. A mistura foi purificada duas vezes através de coluna rápida (cartucho de sílica de 12 g, EtOAc 0-20%/heptano) e as frações foram concentradas para fornecer 162,1 mg do produto desejado como um óleo incolor (12%). LCMS (Waters Acquity UPLC BEH C18, 130 A, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, 50°C, Nome do Solvente A: Água+Ácido Fór- mico 0,1%, Nome do Solvente B: Acetonitrila+Ácido Fórmico 0,1%, B 98% durante 2,20 min): Tr= 1,37 min, MS [M+H] observado: 366,0, calculado: 366,535. 1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) d ppm 1,29 (s, 10 H) 1,47 (s, 18 H) 1,52 (dd, J=14,78, 7,20 Hz, 3 H) 1,48 (d, J=1,26 Hz, 1 H) 1,75 - 1,83 (m, 2 H) 1,94 (t, J=2,65 Hz, 1 H) 2,18 (td, J=7,14, 2,65 Hz, 2 H) 3,11 (t, J=7,58 Hz, 1 H). Intermediário 40: Docos-21-ino-1,11,11-tricarboxilato de 11,11-di-terc- butil 1-etila

[00731] Intermediário 39 (162,1 mg, 0,442 mmol) foi dissolvido em DMF (2 mL) a 0o C e NaH (21,23 mg, 0,531 mmol) foi adicionado. A reação agitada a 0o C por 15 minutos e 11-bromoundecanoato de etila (143 mg, 0,486 mmol) foi adicionado lentamente em gotas. A reação foi aquecida para temperatura ambiente e agitada por 16 horas. A mistura foi diluída com EtOAc (40 mL) e lavada uma vez com H2O (20 mL). A camada aquosa foi extraída uma vez com EtOAc (40 mL) e as camadas orgânicas foram combinadas, secas em Na2SO4, filtradas e concentradas para fornecer um óleo amarelo, transparente. A amostra foi dissolvida em 1 mL de DCM e purificada através de coluna rápida (coluna de sílica 12 g, EtOAc 0-20%/heptano, 15 min). As frações foram combinadas e concentradas para fornecer 90,1 mg do produto desejado (35%). 1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) d ppm 1,28 (s amplo, 24 H) 1,45 (s, 18 H) 1,48 (s, 3 H) 1,53 (d, J=7,58 Hz, 3 H) 1,51 (s, 1 H) 1,64 (s amplo, 1 H) 1,61 (d, J=7,33 Hz, 1 H) 1,77 (d, J=16,93 Hz, 2 H) 1,74 - 1,80 (m, 2 H) 1,94 (t, J=2,65 Hz, 1 H) 2,18 (td, J=7,07, 2,53 Hz, 2 H) 2,29 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 4,13 (q, J=7,24 Hz, 2 H). Intermediário 41: Ácido 12,12-bis(terc-butoxicarbonil)tricos-22-inoico

[00732] A uma solução de intermediário 40 (21,7 mg, 0,037 mmol) em tBuOH (1 mL) foi adicionada uma solução de KOtBu (114 mg, 1,012 mmol) em tBuOH (2 mL) a 30° C sob N2. A mistura foi agitada em temperatura ambiente e monitorada através de TLC (EtO- Ac/hexanos 1:1, KMnO4, refluxo). O material de partida foi consumido após 3 horas e a mistura de reação foi extinta com HCl 1M (20 mL) e extraída duas vezes com EtOAc (25 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas em Na2SO4, filtradas e concentradas para um óleo incolor, transparente (18 mg, 87%). O material foi levado para a etapa seguinte sem purificação adicional. 1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) d ppm 1,27 (s amplo, 22 H) 1,44 (s amplo, 18 H) 1,48 (s, 3 H) 1,52 (s, 3 H) 1,62 (s amplo, 2 H) 1,77 (s amplo, 4 H) 1,94 (s amplo, 1 H) 2,18 (s, 2 H) 2,35 (s, 2 H). Intermediário 42: Ácido docos-21-ino-1,11,11-tricarboxílico

[00733] TFA (2 ml) foi adicionado a intermediário 41 (12 mg, 0,022 mmol) e a reação agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi diluída com DCM (10 mL) e concentrada duas vezes para fornecer um óleo marrom. O material foi absorvido em EtOAc (10 mL) e lavado com H2O (20 mL). A camada orgânica foi seca em Na2SO4, filtrada e concentrada para um óleo marrom. O material bruto foi dissolvido em 1 mL de MeOH e purificado através de HPLC ativada por MS (coluna Sunfire 30x50mm 5um ACN/H2O com TFA 0,1% 75 ml/min, injeção de 1,5 mL, ACN 45-70% durante 3,5 min): Tr= 3,42 min; MS MS [M+H+Na] observado: 461,00, calculado: 461,597. As frações foram agrupadas e liofilizadas para fornecer 5,3 mg e composto do título em 56% de rendimento. Intermediário 43: Ácido 2-(((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)carbonil)-2- (undec-10-in-1-il)tridecanodioico

[00734] A uma solução de intermediário 42 (5,3 mg, 0,012 mmol) em THF (0,5 mL) foi adicionada N-hidroxi succinimida (1,53 mg, 0,013 mmol). Uma solução de DCC (2,493 mg, 0,012 mmol) em THF (0,5 mL) foi adicionada e a mistura foi agitada em temperatura ambiente sob N2 por 4 horas. Conversão completa de material de partida foi observada através de LCMS. A mistura foi concentrada e levada para a etapa seguinte sem purificação adicional. LCMS (Sunfire C18 3,5 µm 3,0x30mm, 40° C, Eluente Ácido A: Água + Ácido Trifluoracético 0,05%, Eluente Básico A: Água + Hidróxido de Amô- nio 5 mM, Eluente B: ACN, 5-95% durante 2 min): Tr= 1,72 min; MS [M+H+Na] observado: 558,0, calculado: 558,67. Intermediário 44:

[00735] A uma solução de intermediário 43 (3,2 mg, 5,97 µmol) em DCM (0,5 mL) foi adicionada uma solução de azido-dPEG23-amina (Quanta Biodesign, 7,88 mg, 7,17 µmol) em DCM (0,5 ml) e DIPEA (2,09 µL, 0,012 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas ponto no qual conversão de material de partida foi observada atra-vés de LCMS. A mistura de reação foi concentrada e dissolvida em 1 mL de MeOH e purificada através de HPLC ativada por MS (coluna Sunfire 30x50mm 5um ACN/H2O com TFA 0,1% 75ml/min, injeção de 1,5 mL, ACN 55-80% gradiente 5 min, Tr= 1,92 min) e as frações foram agrupa-das e liofilizadas para fornecer 1,7 mg do composto do título em 19% de rendimento. LCMS (Acquity BEH 1,7µm 2,1x50mm - 50°C, Nome do Sol-vente A: Água+Ácido Fórmico 0,1%, Nome do Solvente B: Acetonitri- la+Ácido Fórmico 0,1%, B 98% durante 2,20 min): Tr= 1,89 min; MS [M+H/2] observado: 760,0, calculado: 759,5. Intermediário 45: Ácido docos-21-eno-1,11,11-tricarboxílico

[00736] O intermediário 45 é preparado seguindo o procedimento para o intermediário 39-42 substituindo 11-bromo-dec-1-eno por 11-bromo- dec-1-ino. Intermediário 46: Ácido 2-(((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)carbonil)-2-(undec- 10-en-1-il)tridecanodioico

[00737] DCC (187 mg, 0,908 mmol) em DCM (2 mL) foi adicionado a uma solução de N-hidroxissuccinimida (99 mg, 0,862 mmol) e ácido do- cos-21-eno-1,11,11-tricarboxílico (Intermediário 45: 400 mg, 0,908 mmol) em DCM (7 mL) e THF (0,7 mL). A reação foi agitada de um dia para o outro antes do solvente ter sido evaporado. O resíduo foi purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50mm; ACN 55-80%/água +TFA 0,1%) para fornecer o composto do título (155mg, 0,288mmol, 32%): através de LCMS Método C Tr= 1,51min, M+H 538,3; 1H RMN (400 MHz, CLORO- FÓRMIO-d) d ppm 1,16 - 1,46 (m, 28 H) 1,60 - 1,87 (m, 3H) 1,91 - 2,17 (m, 5H), 2,38 (t, J=7,03 Hz, 2 H) 2,86 (br. s., 4 H) 3,68 (dd, J=11,25, 7,34 Hz, 1 H) 3,78 (dd, J=11,31, 5,20 Hz, 1 H) 3,99 - 4,10 (m, 1 H). Intermediários 47 e 47A:

[00738] Azido-dPEG23-amina (Quanta Biodesign: 164 mg, 0,149 mmol) e intermediário 46 (80 mg, 0,149 mmol) foram dissolvidos em THF (2,5 mL). DIPEA (39 µL, 0,233 mmol) foi adicionado e a reação agitada de um dia para o outro. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50mm; 45-70% ACN/água +TFA 0,1%) para fornecer compostos 47 (97mg, 0,061mmol, 41%) e 47A (32mg, 0,021mmol, 14%): LCMS Método C Tr= 1,35min, [M+2H]+2 761,9; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILA-d3) d ppm 1,05 - 1,18 (m, 3 H) 1,19 - 1,32 (m, 20 H) 1,36 (t, J=7,15 Hz, 1 H) 1,48 - 1,59 (m, 2 H) 1,65 - 1,75 (m, 2 H) 2,01 - 2,06 (m, 2 H) 2,25 (t, J=7,46 Hz, 2 H) 3,33 - 3,39 (m, 2 H) 3,39 - 3,44 (m, 2 H) 3,50 - 3,67 (m, 98 H) 4,84 - 4,95 (m, 1 H) 4,95 - 5,06 (m, 1 H) 5,83 (ddt, J=17,07, 10,29, 6,68, 6,68 Hz, 1 H) 7,31 (t, J=5,44 Hz, 1 H); LCMS Método C Tr= 1,50min, [M+2H]+2 739,9; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILA-d3) d ppm 1,16 - 1,42 (m, 30 H) 1,42 - 1,63 (m, 5H) 2,00 - 2,07 (m, 2H), 2,22 - 2,28 (m, 2H), 2,40 - 2,52 (m, 2H), 3,25 - 3,33 (m, 2H), 3,33 - 3,42 (m, 2H), 3,42 - 3,50 (m, 2H) 3,50 - 3,68 (m, 88 H), 4,86 - 5,06 (m, 2H), 5,83 (ddt, J=17,04, 10,26, 6,71, 6,71 Hz, 1 H) 6,40 - 6,74 (m, 1 H). Intermediário 48: Ácido 2-undecilmalônico

[00739] Usando intermediário 22 (290 mg, 0,661 mmol), o composto do título (185 mg, quantitativo) foi sintetizado de uma maneira similar ao intermediário 19: LCMS Método B LCMS Tr= 0,82 min, M-H 257,3. Intermediário 49: Ácido 2-(((2,5-dioxopirrolidin-1- il)óxi)carbonil)tridecanoico

[00740] DCC (122 mg, 0,592 mmol) foi adicionado a uma solução de intermediário 48 (170 mg, 0,658 mmol) e N-hidroxissuccinimida (68 mg, 0,592 mmol) em DCM (6 mL) e THF (0,5 mL). A reação foi agitada por 16 h antes de mais DCC (30 mg, 0,145 mmol) em DCM (0,5 mL) ter sido adicionado. A reação foi agitada por mais 2 dias. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado através de HPLC (Sunfire C18 30x50mm, 45-70% ACN/água + TFA 0,1%) para fornecer o composto do título como um pó branco (46mg, 0,129mg, 20%): LCMS Método B Tr= 0,94min, M+H 356,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,89 (t , J=7,00 Hz, 3 H) 1,20 - 1,40 (m, 16 H) 1,43 - 1,55 (m, 2 H) 1,99 - 2,14 (m, 2 H) 2,86 (s, 4 H) 3,71 (t, J =7,46 Hz, 1 H). Intermediários 50 e 50A:

[00741] Os compostos do título foram sintetizados de uma maneira similar para 50 e 50A a partir do intermediário 49 (30 mg, 0,084 mmol) fornecendo intermediário 50 (18 mg, 0,013 mmol, 16%) e intermediário 50A (5 mg, 4 µmol, 5%): LCMS Método B Tr= 0,85 min, M+H 1340,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) d ppm 0,82 - 0,98 (m, 3 H) 1,20 - 1,36 (m, 16 H) 1,36 - 1,51 (m, 2 H) 1,83 - 2,02 (m, 1 H) 2,11 - 2,27 (m, 1 H) 2,33 (dd, J=11,80, 4,22 Hz, 1 H) 3,41 (t, J=5,14 Hz, 3 H) 3,49 (d, J=5,01 Hz, 1 H) 3,56 - 3,79 (m, 92 H); LCMS Método B Tr= 0,96min, M+H 1296,3.

Intermediários 51-57: mutante de proteína GDF15 Expressão de proteínas GDF-15 humanas em células de E. coli'

[00742] As células BL21 (DE3) Gold (Stratagene) e Rosetta (DE) pLysS (Novagen) de linhagens de E. coli foram transformadas com construtos 51 a 56 e construto MAHA-(200-308)-hGDF15, respectivamente, clonadas em vetores pET26b. As células transformadas foram cultivadas sob seleção de antibiótico primeiro em 3 ml e então em 50 ml de Caldo Luria (Bacto-Tryptone 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 5/L, glicose 6 g/L) até que um OD600 de 1,5 foi atingido. As pré-culturas foram usadas para inocular dois fermentadores de 1 L com meio de Caldo Terrific (NH4SO4 1,2 g/L, H2PO4 0,041 g/L, K2HPO4 0,052 g/L, Bacto-Tryptone 12 g/L, Extrato de Levedura 24 g/L). As culturas foram induzidas através da adição automática de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) 1 mM quando o pH aumentou acima de 7,1. Outros parâmetros de fermentação foram: temp. = 37° C; pH 7,0 +/- 0,2 ajustado pela adição de NaOH/H2SO4 2N; pO2>30% com cascatas de velocidade de agitador, fluxo de ar e adição de oxigênio. Cinco horas após indução as culturas foram esfriadas para 10° C e as células foram coletadas através de centrifugação.

Purificação e redobra de variantes de GD15 a) Corpos de inclusão

[00743] Péletes de coli recombinantes expressando a proteína de in-teresse foram ressuspensos (5% p/v) em 50 mM de NaH2PO4/NaCl 150 mM/benzamidina.HCl 5 mM/DTT 5 mM, pH 8,0 a 4° C, homogeneizados e lisados através de 2 passagens por uma prensa French (80 e 8 Mpa (800 e 80 bar)). Corpos de inclusão (IBs) foram isolados através de cen-trifugação a 12.000 rpm por 60 min a 4° C.

b) Purificação de proteína não dobrada bruta

[00744] IBs foram solubilizados (5% p/v) em guanidina 6 M/NaH2PO4 100 mM/Tris 10 mM/beta-mercaptoetanol 20 mM, pH 8,0 e agitados por 2 horas em temperatura ambiente. Os restos foram removidos através de centrifugação a 12.000 rpm. Os IBs solubilizados foram purificados adici-onalmente em Ni-NTA-Superflow (o construto sem marcador His se liga também a esta resina devido ao teor de histidina alto). Após lavagem de linha basal com guanidina 6 M/NaH2PO4 100 mM/Tris 10 mM/beta- mercaptoetanol 5 mM, pH 8,0, material ligado foi eluído com o mesmo tampão ajustado para pH 4,5. O eluato foi ajustado para pH 8,0, DTT 100 mM foi adicionado e a solução agitada de um dia para o outro a 4° C. O pH foi então ajustado para 2 através da adição de ácido trifluoracético (TFA, estoque 10% em água) e a solução diluída mais 1:1 com TFA 0,1% em água. A solução de proteína bruta foi purificada adicionalmente através de RP-HPLC (Poros) usando um gradiente de acetonitrila 0-50% em 50 min. As frações contendo GDF-15 foram agrupadas e liofilizadas.

c) Dobra da proteína

[00745] Método 1: Material liofilizado foi dissolvido a 2 mg/mL em ácido acético 100 mM, diluído 15-20 vezes em tampão de dobra (CHES 100 mM/NaCl 1 M/CHAPS 30 mM/GSH 5 mM/GSSG 0,5 mM/DMSO 20%, pH 9,5, 4° C) e a solução agitada suavemente durante 3 dias a 4° C. Após 3 dias 3 volumes de ácido acético 100 mM foram adicionados e a solução concentrada através de µLtrafiltragem (corte de 5 kDa) para cerca de 100-200 mL, diluída 10 vezes com 100 mM de ácido acético e novamente concentrada. O material redobrado foi purificado adicionalmente através de RP-HPLC preparativa em uma coluna Vydac C4 ativada a 50° C (tampão A: TFA 0,1% em água; tampão B: TFA 0,05% em acetonitrila). Após carregamento a coluna foi lavada com tampão B 15% e eluída com um gradiente de B 15% a B 65% em 50 min. As frações coletadas contendo a proteína de interesse foram diluídas com um volume igual de tampão A e liofilizadas. Os rendimentos de redobra foram cerca de 25% para ambas as proteínas.

[00746] Método 2: Protocolo seguido como no método 1 com tampão de dobra: CHES 100 mM, pH 9,4, arginina 0,9 M, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, GSH 2,5 mM, GSSG 1 mM (concentração final).

[00747] Os mutantes de GDF15 que seguem foram preparados de acordo com o procedimento acima: Intermediário 51: M-(His)6-hGDF15 MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI (SEQ ID NO: 1) LCMS: Massa calculada: 26462; Massa observada: 26464 Intermediário 52: M-(His)6-M-hGDF15 MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDL- GWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKP- DTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 2) LCMS: Massa calculada: 26724; Massa observada: 26725 Intermediário 53: His-dGDF15: MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVA- PRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCV- PASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV (SEQ ID NO: 3) LCMS: Massa calculada (dímero): 26368; Massa observada: 26363 Intermediário 54: MH-(199-308)-hGDF15 MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPRE- VQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN- PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 4) LCMS: Massa calculada: 24636; Massa observada: 24638 Intermediário 55: AH-(199-308)-hGDF15 AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPRE- VQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN- PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 5)

[00748] Etapa 1: preparação de construto M-His6-TEV(ENLYFQ/A)- H-hsGDF15 aa199-308

[00749] O construto M-His6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15 aa199-308 foi preparado de acordo com o procedimento acima (etapas a, b e c).

[00750] Etapa 2: Clivagem TEV da proteína da etapa 1

[00751] A proteína liofilizada foi solubilizada em água para uma concentração final de 1,75 mg/mL. A proteína foi desdobrada novamente através da diluição 1:1 de Guan 6M/Tris 50 mM, pH 8,0 + DTT 50 mM e agitada em temperatura ambiente por 1 h. O material foi novamente purificado através de RP-HPLC preparativa em uma coluna Vydac C4 e liofilizado. 26 mg de liofilizado foram solubilizados em 26 ml de Tris 50 mM/UREIA 3 M, pH 7,5 + 3000 Unidades de Protease AcTEV (Invitrogen, 12575-023) e incubados por 4 dias. O pH foi então ajustado para pH 2,0 através da adição de ácido trifluoracético (TFA, estoque 10% em água) e a solução diluída mais para 150 ml com TFA 0,1% em água. Após filtragem através de uma membrana de 0,22 um, o material foi novamente purificado através de RP-HPLC preparativa em uma coluna Vydac C4 para isolar proteína sucessivamente clivada. As frações foram coletadas manualmente; frações contendo proteína alvo foram isoladas e liofilizadas. A proteína GDF15 clivada foi então novamente dobrada e a proteína novamente dobrada purificada como descrito acima.

[00752] LCMS: Massa calculada (dímero): 24516; Massa observada: 24518

[00753] O mutante de GDF15 que segue pode ser preparado de acordo com o procedimento acima: Intermediário 56: MHA-(200-308)-hGDF15 MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPRE- VQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN- PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 6) LCMS: Massa calculada (dímero): 24752

[00754] O mutante de GDF15 que segue foi preparado de acordo com o procedimento acima: Intermediário 57: AHA-(200-308)-hGDF15 AHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPRE- VQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN- PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 7) LCMS: Massa calculada (dímero): 24430; Massa observada (dímero): 24432 Intermediário 58: Conjugado de His-hGDF15 BCN His-hGDF15 Seq:MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWV LSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCV- PASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 2)

[00755] Uma solução de estoque de His-hGDF15 (Intermediário 52: 0,6 mL, 4,8 mg/mL) foi diluída para 0,5 mg/mL com tampão de NaOAc 30 mM pH 4,5 (5,2 mL). Uma solução de estoque de 10 mg/mL de (2,5-dioxopirrolidin-1-il) carbonato de (1R,8S,9s)-biciclo [6.1.0]non-4-in- 9-ilmetila (NHS-BCN) em DMSO (251 µL) foi lentamente adicionada e a reação posta em uma placa de agitação a 24° C por 21 h. A reação foi diluída para 30 mL com tampão de NaOAc 30 mM pH 4,5 e concentrada para 2 mL usando um cartucho de µLtrafiltragem MWCO 10 kDa (repetido 4x) para fornecer 2,5 mL de concentrado. Com base em A280 (e = 29090M-1 cm-1, 26730 g/mol) o concentrado foi 0,93 mg/mL (2,33 mg, 80%): LCMS QT2_15-60kDa_15min_polar (método E). A solução resultante foi analisada através de MALDI para indicar conjugação maior ser +1 e +2 (marcação N-terminal de monômero e dímero).

[00756] His-hGDF15 +1BCN (biciclo [6.1.0]non-4-inila) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na molécula do ho- modímero de GDF15.

[00757] His-hGDF15 +2BCN corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméricas do homodímero de GDF15.

[00758] His-hGDF15 +3BCN corresponde a uma reação não seleti- va em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Intermediário 59: Conjugado de His-hGDF15 BCN His-hGDF15 Seq: MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI (SEQ ID NO: 1)

[00759] Uma solução de estoque de His-hGDF15 (Intermediário 51: 7,04 mL, 1,42 mg/mL) foi diluída para 0,5 mg/mL com tampão de Na- OAc pH 4,5 (12,95 mL). Uma solução de estoque de 10 mg/mL de (2,5-dioxopirrolidin-1-il) carbonato de (1R,8S,9s)-biciclo [6.1.0]non-4-in- 9-ilmetila (NHS-BCN) em DMSO (0,88mL) foi lentamente adicionada e a reação posta em uma placa de agitação a 24° C por 24 h. Uma porção adicional da solução de estoque de NHS-BCN (176 µL) foi adicionada e a reação mantida a 24° C por 24 h. A reação foi diluída para 60 mL com tampão de NaOAc 30 mM pH 4,5 e concentrada para 4 mL usando um cartucho de µLtrafiltragem MWCO 10 kDa (repetição 4x) para fornecer 4,1 mL de concentrado. Com base em A280 (e = 29090M-1 cm-1, 26700 g/mol) o concentrado foi 2,19 mg/mL (8,98 mg, 89%): LCMS QT2_15-60kDa_15min_polar (Método E).

[00760] His-hGDF15 +1BCN (biciclo [6.1.0]non-4-inila) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na molécula do ho- modímero de GDF15.

[00761] His-hGDF15 +2BCN corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméricas do homodímero de GDF15.

[00762] His-hGDF15 +3BCN corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Intermediário 60: His-dog-GDF15-BCN

[00763] 100 µL de His-dGDF15 (0,68 mg/mL), 100 µL de tampão pH 4,5, 4 µL de uma solução de 10 mg/mL de BCN-NHS foram combi-nados e incubados em temperatura ambiente por dois dias. A mistura resultante foi lavada com Amicon 10 k 4 vezes para fornecer 200 µL de solução, que foi usada na etapa seguinte. O produto foi levado adiante como bruto para conversão adicional em conjugado.

Exemplos da Invenção:

[00764] Procedimento geral para click de His-hGDF15 + ácido gra- xo-PEG-Nß. GDF15 marcado com BCN foi diluído para 0,5 mg/mL em tampão de NaOAc 30 mM pH 4,5 enquanto 10 mg/mL de uma solução de FA-PEG-N3 (ácido graxo-PEG23-azida) em água foram preparados. À solução de GDF15 foram adicionados 10 eq de FA-PEG-N3 e a reação foi posta em uma placa de agitação a 24° C de um dia para o outro. O progresso da reação foi monitorado através de LCMS (Método QTOF 15-60kDA_15min_polar) e mais FA-PEG-N3 foi adicionado, se necessário até 50 eq, até que nenhum GDF15 marcado com BCN não reagido fosse observado. A reação foi então diluída 5-10x com tampão de NaOAc 30 mM pH 4 e o tampão trocado com tampão fresco usando um cartucho de µLtrafiltragem MWCO 10 kDa (4 ciclos de concentração seguido por diluição). A amostra foi concentrada para ~1 mg/mL conforme medido através de A280, as recuperações foram quantitativas para 34%. Os conjugados finais foram analisados através de LCMS (método QTOF 15-60kDa_15min_polar) ou Maldi. Exemplo 1: His-hGDF15 BCN (I-59) conjugado a intermediário 21:

[00765] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00766] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméri- cas do homodímero de GDF15.

[00767] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 2: His-hGDF15 BCN (I-59) conjugado a intermediário 44:

[00768] His-hGDF 15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00769] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméri- cas do homodímero de GDF15.

[00770] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 3: His-hGDF15 BCN (I-59) conjugado a intermediário 29A:

[00771] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00772] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméri- cas do homodímero de GDF15.

[00773] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 4: His-hGDF15 BCN (Intermediário 58) conjugado a inter-mediário 24:

[00774] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00775] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméri- cas do homodímero de GDF15.

[00776] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 5: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a intermediário 29:

[00777] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00778] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméri- cas do homodímero de GDF15.

[00779] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 6: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a intermediário 55:

[00780] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00781] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméri- cas do homodímero de GDF15.

[00782] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 7: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a intermediário 6A:

[00783] His-hGDF 15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00784] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as unidades monoméri- cas do homodímero de GDF15.

[00785] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 9: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a intermediário 30:

[00786] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00787] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as moléculas (unidades monoméricas) do homodímero de GDF15.

[00788] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 10: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a intermediário 12:

[00789] His-hGDF 15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00790] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as moléculas (unidades monoméricas) do homodímero de GDF15.

[00791] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 13: His-hGDF15 BCN (I-59) conjugado a intermediário 6:

[00792] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00793] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as moléculas (ambas unidades monoméricas) do homodímero de GDF15.

[00794] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 14: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a intermediário 17:

[00795] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00796] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as moléculas (ambas unidades monoméricas) do homodímero de GDF15.

[00797] His-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15. Exemplo 15: Etapa 1:

[00798] A uma solução de ácido 2,2,13,13- tetrametiltetradecanodioico (Aldrich CPR, número de ordem PH002322) (100 mg, 0,318 mmol) e N-hidroxissuccinimida (40,3 mg, 0,35 mmol) em THF (5 mL) foi adicionada uma solução de DCC (65,6 mg, 0,318 mmol) em THF (5 mL) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Conversão parcial no produto desejado foi observada através de análise LC-MS. A mistura foi filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi redissolvido em DCM (40 mL) e lavado com água, seco em Na2SO4 e purificado através de cromato- grafia de sílica eluindo com um heptano/EtOAc/DCC (10:1:1) para fornecer uma mistura. A mistura foi purificada adicionalmente através de HPLC ácida ativada por MS ( [(ACN 55-80% gradiente de 3,5 min): rt: 2,48 min, massa calculada: 314,46 massa observada: 314,00] para fornecer o produto limpo (50 mg, 38,2% de rendimento) e recuperar material de partida. Etapa 2:

[00799] A uma solução de ácido NHS-2,2,13,13- tetrametiltetradecanodioico (10 mg, 0,024 mmol) em DCM (3 mL) foram adicionados azido-PEG3-amina (10 mg, 0,049 mmol) e DIPEA (9 µL, 0,049 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 h. A mistura foi concentrada, redissolvida em MeOH (3 mL) e purificada através de HPLC ativada por MS (ACN 55-80% gradiente de 3,5 min Tr=2,35, massa esperada: 514,70 massa observada: 514,40) para fornecer 7 mg de produto limpo em 58% de rendimento. Etapa 3

[00800] A uma solução de 100 µL de BCN-dGDF15 (I-60: 0,68 mg/mL em tampão de pH 4,5) foram adicionados tampão de pH 4,5 (100 µL) e azida (6 µL em DMSO, 10 mg/mL) e a mistura foi incubada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi lavada com Amicon 10 k 4 vezes. A solução resultante foi analisada através de MALDI para indicar conjugação maior a +1 e +2. Maldi: Massa cal- culada: 26546; Massa observada: 26483; Massa calculada: 27060; Massa observada: 27128; Massa calculada: 27574; Massa observada: 27789. Exemplo 16: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a intermediário 44:

[00801] His-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal na uma molécula (uma unidade monomérica) do homodímero de GDF15.

[00802] His-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as moléculas (ambas unidades monoméricas) do homodímero de GDF15. Exemplo 17: His-hGDF15-BCN conjugado a intermediário 52

[00803] A uma solução de 3 mL de GDF15 ciclo-octina (I-58: 0,46 mg/mL, 0,051 umol) em 7 mL de tampão de acetato de sódio pH 4 foi adicionada peg azida de ácido graxo (15 µL em 35 mg/mL de DMSO, 0,36 umol) e a mistura foi incubada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Conversão completa foi observada através de análise MALDI. Produto purificado através de filtragem em Amicon 10 kD lavando três vezes para fornecer 4,3 ml de 0,29 mg/mL de produto desejado em 90% de rendimento. Maldi: sm ciclo- octina ~5%, massa esperada: 26902; massa observada: 26997; +1 ácido graxo ~40% massa esperada: 28421; massa observada: 28525; +2 ácidos graxos ~50% massa esperada: 29940; massa observada: 30191; +3 ácidos graxos 5% massa esperada: 31459; massa observada: 31874. Exemplo 18: MH-(199-308)GDF15 (I-54) conjugado a intermediário 37

[00804] MH-(199-308)-GDF15 (Intermediário 54: 0,393 mL, 0,028 µmol, 1,78 mg/mL) foi adicionado a 1,5 ml de tampão de acetato de sódio 30 mM ácido graxo NHS (474 ug, 0,284 umol, 10 mg/mL) foi adicionado à solução. Após 5 horas, a reação estava completa de acordo com MALDI. Os produtos foram purificados lavando 5 vezes usando µLtrafiltragem Amicon 10 kD para fornecer 575 ug de conjugado em 73% de rendimento. MALDI: sm (18%), massa esperada: 24638; massa observada: 24735; +1 ácido graxo (38%); massa esperada: 26192; massa observada: 26268; +2 ácido graxo (40%) massa esperada: 27746; massa observada: 27798; +3 ácido graxo (4%) massa esperada: 29300; massa observada: 29333. Exemplo 19A: His-hGDF15 (I-59) conjugado a intermediário 37

[00805] His-GDF15 (0,493 mL, 0,026 µmol, 1,42mg/mL) foi adicionado a 1,5 ml de tampão acetato de sódio 30 mM pH 4 ácido graxo NHS (0,221 mg, 0,132 umol, 10 mg/mL) foi adicionado à solução. A reação não estava completa de um dia para o outro, então 2,5 mais equivalentes de ácido graxo NHS (0,110 mg, 0,066 umol, 10 mg/mL) foram adicionados e após 5 h Maldi mostrou conjugado +2 como produto principal. Os produtos foram purificados através de lavagem 5 vezes usando µLtrafiltragem Amicon 10 kD para fornecer 565 ug de conjugado em 76% de rendimento. MALDI: sm (18%), massa es-perada: 26468; massa observada: 26553; +1 ácido graxo (38%) massa esperada: 28022; massa observada: 28099; +2 ácido graxo (40%) massa esperada: 29576; massa observada: 29649; +3 ácido graxo (4%) massa esperada: 31130; massa observada: 31201. EXEMPLO 19B: AHA-HGDF15 CONJUGADO COM INTERMEDIÁRIO 37

[00806] Uma solução 10 mg/mL de Intermediário 37 em água de grau de biologia molecular foi preparada. A AHA-hGDF15 (intermediário 57, 6,67 mg/mL em NaOAc 30 mM pH 4,0, 5,247 mL, 1,433 µmol) foi adicionado NaOAc 30 mM pH 4,6 (faixa aceitável 4,5-5,0) para fornecer uma concentração de proteína final de 0,88 mg/mL. O intermediário 37 (10 eq., 2,39 mL, 0,014 mmol) foi adicionado e a reação foi misturada em temperatura ambiente por 18 horas. Precipitado tinha se formado no frasco de reação. A mistura de reação foi separada dentre filtros centrífugos Amicon 10 kDa 4x15 mL e cada uma foi diluída para 15 mL com NaOAc 30 mM, pH 4,0. O material teve tampão trocado 4x para NaOAc 30 mM pH 4,0 e as amostras foram combinadas para um volume de 25,6 mL, agitando o precipitado no filtrado com a ponta de uma pipeta entre as lavagens. O precipitado permaneceu em solução de maneira que a mistura foi deixada assentar a 4° C de um dia para o outro. A concentração foi medida através de A280 (30040 cm-1M-1, 27538 g/mol) ser 1,62 mg/mL (100%). Análise UPLC mostrou recupe ração de 60% de produtos +1 FA (Tempo de retenção: 4,88 min) e +2 FA (Tempo de retenção: 5,80 min) (Método J). LCMS Método T mostra massas desejadas.

[00807] Mistura bruta do Exemplo 19B (razão representada na tabela abaixo) foi testada in vivo e relatada na tabela 1:

[00808] AHA-hGDF15 +1FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal das cadeias de polipeptídeo (na unidade monomérica) do homodímero de GDF15 (como representado na modalidade 11B, Fórmula H).

[00809] AHA-hGDF15 +2FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação na funcionalidade amino N-terminal em ambas as cadeias de poli- peptídeo do homodímero de GDF15 (como representado na modalidade 11B, Fórmula G).

[00810] AHA-hGDF15 +3FA (Ácido graxo) corresponde a uma reação não seletiva em algum outro sítio do homodímero de GDF15.

Purificação:

[00811] O produto bruto foi purificado através de cromatografia de fase reversa (Tampão A TFA 0,1% em água; Tampão B TFA 0,1M em gradiente ACN; Tampão A 99%-98%) em um Waters BEH300 130Â, 3,5 µm, 4,6mmX100mm taxa de fluxo 2,5ml/min.

[00812] Fração 1: AHA-hGDF15 não reagido: Tr=17,33 min

[00813] Fração 2: (19B1): AHA-GDF15 +1FA: Tr=20,2 min (rendimento de aproximadamente 15%) (Fórmula H)

[00814] Fração 3: (19B2): AHA-GDF15 + 2FA: Tr=21,6 min (aproximadamente 15% de rendimento) (Fórmula G)

[00815] Fração 4: (19B3): AHA-GDF15 + 3 FA: Tr=23,0 min (rendimento de aproximadamente 5%)

[00816] Uma mistura de razão 1:1 de 19B1 e 19B2 foi preparada e testada (19Bm).

[00817] Alternativamente, a reação pode ser realizada em Na2HPO4 10 mM - 7H2O e NaOAc 30 mM em um pH de 4,73. Uma solução de 10 mg/mL de intermediário 37 em água de grau de biologia molecular foi preparada. A AHA-hGDF15 (intermediário 57, 12,04 mg/mL em NaOAc 30 mM, pH 4,0, 4,15 µL, 0,02 µmol) foram adicionados NaOAc 30 mM, NaHPO4 10 mM - 7H2O pH 4,73 para fornecer uma concen-tração de proteína final de 0,88 mg/mL. Intermediário 37 (20 eq., 6,83 µL, 0,041 µmol) foi adicionado e a reação foi misturada em temperatura ambiente por 18 horas. A mistura de reação tinha se tornado nebu-losa com precipitado. Análise UPLC mostrou 58% de produtos +1 e +2 (Método J).

[00818] A reação pode ser também realizada em NaOAc 30 mM e K2HPO4 10 mM em um pH de 4,6: Uma solução de 10 mg/mL de intermediário 37 em água de grau de biologia molecular foi preparada. A AHA-hGDF15 (intermediário 57, 6,21 mg/mL em NaOAc 30 mM pH 4,0, 5,261 mL, 1,337 µmol) foram adicionados NaOAc 30 mM, K2HPO4 10 mM pH 4,6 (faixa aceitável 4,5-5,0) para fornecer uma concentração de proteína final de 0,88 mg/mL. Intermediário 37 (10 eq., 68,3 µL, 0,409 µmol) foi adicionado e a reação foi misturada em temperatura ambiente por 7 horas. A mistura de reação foi tornada nebulosa com precipitado. A mistura de reação foi separada em quatro porções de 9 mL em filtro centrífugo Amicon 10 kDa 15 mL e diluída para 15 mL com NaOAc 30 mM pH 4,0. O material teve tampão trocado 4x para NaOAc 30 mM pH 4,0, agitando o precipitado entre cada lavagem com a ponta de uma pipeta. A mistura de reação foi concentrada para um volume de 75 mL. Precipitado permaneceu de maneira que o material foi armazenado a 4° C por dois dias. Concentração foi medida através de A280 (30040 cm-1M-1, 27538 g/mol) ser 0,4 mg/mL (97%). Análise UPLC mostrou 61% de recuperação de produtos +1 e +2 (Método J). Exemplo de Referência 1: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado a cons- truto de ácido PEG-mirístico intermediário: Etapa 1:

[00819] A uma mistura de Azido-PEG23-Amina (30 mg, 0,027 mmol) e éster NHS mirístico (Toronto Research Chemicals, No. cat. S69080) (12 mg, 0,037 mmol) foram adicionados DCM (1 mL) e DIPEA (13 µL) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi purificada através de cromatografia de sílica eluindo com EtOAc/heptano (0-100%), então MeOH/DCM (010%) para fornecer produto transparente em torno de MeOH 5%/DCM. LCMS: (Gradiente: de B 40 a 98% em 1,4 min - fluxo 1 mL/min, Eluente A: água + ácido fórmico 0,05% + acetato de amônio 3,75 mM, Eluente B: acetonitrila + ácido fórmico 0,04%). LCMS: rt = 2,20 (Método C), Massa +H calculada: 1354,71, Massa observada: 1354,4. Etapa 2:

[00820] A uma solução de BCN-hGDF15 (I-52: 800 µL, 0,25 mg/mL) foi adicionada uma __ (2 mg/mL em DMSO, 6,3 µL, 10 eq.) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. 1,1 mL 0,20 mg/mL em rendimento quantitativo. (Maldi: +1 massa calculada: 28223; massa observada: 28640; +2 massa calculada: 29543; massa observada: 29962; +3 massa calculada: 30863; massa observada: 31426; +4 massa calculada: 32183; massa observada: 32911). Exemplo de Referência 2: his-hGDF15-PEG23

[00821] A uma solução de His-hGDF15 BCN (I59: 427 µL, 1,17 mg/mL, 0,019 µmol) em NaOAc 30 mM pH 4,0 (427 µL) foi adicionada azido-dPEG23-amina (Quanta Biodesign, 104 µg, 0,094 µmol). A reação foi misturada em temperatura ambiente por 16 horas ponto no qual a mistura foi mudada para NaOAc 30 mM pH 4,0 usando filtro centrífugo Amicon MWCO 10 kDa através de diluição e concentração da amostra 5 vezes para um volume de 140 µL. Análise MALDI mostrou conversão completa em produtos +1 a +4. A concentração foi medida através de A280 (29090 M-1cm-1, 27600 g/mol) ser 2,099 mg/mL (57%). Exemplo 20: Peptídeo cíclico Apelina BCN conjugado a intermediário 47 Etapa 1: Síntese de Acetato de pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)- NH(Fenetila) (dissulfeto C4-C7)

[00822] • Preparação de Intermediário 20a

[00823] (Carregamento de resina de cloreto de 2-clorotritila com Fmoc-D-Nle-OH, remoção de Fmoc e determinação da carga da resina)

[00824] Resina de cloreto de 2-clorotritila (50,0 g, 85,0 mmol) foi suspensa em DCM (400 mL) e a suspensão foi agitada por 10 min e então o solvente foi drenado, a resina foi lavada com DCM (3 x 200 mL). Então uma solução de Fmoc-D-Nle-OH (24,0 g, 68,0 mmol) e DIPEA (96,5 mL, 552,5 mmol) em DCM (120,0 mL) foi adicionada à resina, a suspensão recebeu fluxo de nitrogênio e foi agitada em temperatura ambiente por 5 min. Uma outra porção de DIPEA (22,7 mL, 127,5 mmol) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro.

[00825] A mistura de reação foi drenada e a resina foi lavada com DCM (3 x 250 mL) por 2 min cada vez. A resina foi extinta com uma mistura de DCM/MeOH/DIPEA (70:15:15) 2 x 240 mL) por 10 min cada vez.

[00826] O grupo Fmoc foi clivado através de tratamento da resina com piperidina/DMF (1:3) (1 x 300 mL) por 5 min. A resina foi então drenada (1 x 300 mL) por 15 min, seguido por etapas de lavagem: DMF (6 x 250 mL, 2 min cada vez), isopropanol (2 x 250 mL, 2 min cada vez) e TBME (6 x 250 mL, 2 min cada vez). A resina foi seca sob vácuo a 35° C por 24 horas para fornecer Intermediário 20a (57,8 g, carga = 1,08 mmol/g).

[00827] • Preparação de Intermediário 20b

[00828] (Montagem de peptídeo linear)

[00829] O intermediário 20a (18,5 g, 20,0 mmol) foi submetido à síntese de peptídeo de fase sólida em um sintetizador de peptídeo automático (CSBIO536®). Um ciclo de acoplamento foi definido como segue:

[00830] • Acoplamento de aminoácido: AA (3,0 eq.), DIC (3,0 eq.), HOBt (3,0 eq.), DMF (vide tabela abaixo)

[00831] • Lavagem: DMF (4 x 150 mL, 2 min cada vez)

[00832] • Desproteção Fmoc: Piperidina/DMF (1:3) (150 mL por 5 min, então 150 mL por 15 min)

[00833] • Lavagem: DMF (6 x 150 mL, 2 min cada vez).

[00834] Após a montagem do peptídeo, a resina foi lavada com DFM (6 x 150 mL, 2 min cada vez), isopropanol (6 x 150 mL, 2 min cada vez) e TBME (6 x 150 mL, 2 min cada vez). A resina de peptídeo foi seca de um dia para o outro sob vácuo alto a 35° C para fornecer Intermediário 20b (57,6 g, 20,0 mmol).

[00835] • Preparação de Intermediário 20c

[00836] (Clivagem de HFIP a partir da resina)

[00837] Uma porção de Intermediário 20b (27 g, 9,37 mmol) foi suspensa em DCM (300 mL) e agitada por 15 min. A resina foi drenada, então tratada com HFIP/DCM (3:7) (3 x 270 mL, 15 min cada vez). A solução de clivagem foi filtrada e coletada. A resina foi lavada com DCM (3 x 300 mL). As soluções de clivagem e lavagem combinadas foram concentradas até secagem a vácuo. O pó branco foi seco de um dia para o outro sob vácuo a 35° C fornecendo Intermediário 20c- Batelada 1 (23,5 g, 9,37 mmol).

[00838] O procedimento mencionado acima foi repetido com uma outra porção de Intermediário 20b (28,0 g, 9,72 mmol), fornecendo in-termediário 20c-Batelada2 (26,1 g, 9,72 mmol).

[00839] • Preparação de Intermediário 20d

[00840] (Acoplamento de fase de solução de fenetilamina)

[00841] O Intermediário 20c-Batelada2 (20,0 g, 7,44 mmol, 1,0 eq.) e HATU (5,23 g, 13,8 mmol, 1,85 eq.) foram dissolvidos em DFM (400 mL). Uma solução de fenetilamina (1,67 g, 13,0 mmol, 1,85 eq.) e DIPEA (3,56 g, 27,6 mmol, 3,71 eq.) em DMF (60 mL) foi adicionada.

[00842] A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 30 min, então esfriada para 0o C, então salmoura (460 mL) foi adicionada. A suspensão foi agitada por 10 min, então o produto foi isolado através de filtragem. A torta de filtro foi lavada com H2O (300 mL), que foi então cuidadosamente removida, então dissolvida em DCM (300 mL). A solução foi seca em MgSO4, então concentrada até secagem a vácuo. O produto bruto foi submetido à cromatografia rápida em sílica-gel (eluentes: DCM e DCM/iPrOH (8:2)) para fornecer Intermediário 20d-Batelada1 (14,4 g, 6,6 mmol).

[00843] O mesmo procedimento foi repetido com Intermediário 20c- Batelada1 (23,4 g, 9,37 mmol), excluindo a cromatografia rápida, for-necendo Intermediário 20d-Batelada2 (28,0 g, 9,37 mmol).

[00844] • Preparação de Intermediário 20e

[00845] (Remoção de grupo de proteção)

[00846] O Intermediário 20d-Batelada2 (28,0 g, 9,37 mmol) foi dissolvido em TFA/DCM/EDT/TIS (90:5:2.5:2,5) (290mL) e a reação agitada em temperatura ambiente por 2 h.

[00847] A solução de clivagem foi filtrada e despejada em TMBE frio (3 L) (0-4° C). A suspensão turva foi agitada em um banho de água gelada por 30 min, então filtrada em um filtro de vidro de poro 4. O sólido branco então obtido foi lavado com TBME (2 x 100 mL), então seco a vácuo a 35° C de um dia para o outro para fornecer Intermediário 20e-Batela1 (8,9 g, 5,9 mmol).

[00848] O mesmo procedimento foi repetido com Intermediário 20d- Batelada1 (14,4 g, 6,6 mmol) fornecendo Intermediário 20e-Batelada2 (9,6 g, 6,3 mmol).

[00849] • Preparação de Acetato de p E-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D- Nle)-NH(Fenetila) (dissulfeto C4-C7)

[00850] 1) Ciclização

[00851] Intermediário 20e (5,0 g, 3,3 mmol) foi dissolvido em água (500 mL). Uma solução de iodo (1,18 g, 4,66 mmol, 1,41 eq.) em ácido acético (93 mL) foi adicionada em uma porção. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 10 min. Uma solução de ácido ascórbico (1,03 g, 5,83 mmol, 1,77 eq.) em água (5,8 mL) foi adicionada e a mistura de reação agitada por 10 min, filtrada e armazenada a 4° C até purificação.

[00852] O mesmo procedimento de ciclização foi repetido até que 18,3 g (12,1 mmol) de Intermediário 20e tivessem sido processados.

[00853] 2) Purificação

[00854] As soluções de peptídeo cíclico foram submetidas à HPLC preparativa em porções de 0,5-5,0 g de peptídeo por injeção. As frações tendo pureza maior do que 95% foram agrupadas e secas com congelamento para fornecer uma quantidade total de 4,89 g (3,2 mmol) de peptídeo purificado (sal de TFA) que foi produzido

[00855] 3) Formação de acetato através de troca de íon

[00856] 75 g (100 mL) de uma resina de troca de ânion forte (Ion exchanger III, Merck) em sua forma OH- foram postos em filtro de vidro sinterizado (porosidade 3) e então uma solução de ácido acético/água (1:3) (300 mL) foi adicionada, a suspensão foi manualmente agitada por 2 min, então a resina foi drenada. O processo foi repetido com uma outra porção de ácido acético/água (1:3) (300 mL). A resina foi lavada com água deionizada até que uma drenagem neutra foi observada. Então a resina foi transferida para uma coluna de 4 x 20 cm equipada com um filtro de vidro sinterizado (porosidade 3).

[00857] 4,8 g de peptídeo purificado foram dissolvidos em água deionizada (50 mL) e adicionados à coluna. O produto foi eluído com água deionizada (200 mL). Controle de eluição de produto foi feita através de polvilhamento de TLC, as frações ricas foram agrupadas e secas por congelamento para fornecer Acetato de pE-R-P-C*-L-S-C*- K-G-P-(D-Nle)-NH(Fenetila) (dissulfeto C4-C7) (4,1 g, 2,9 mmol).

[00858] O produto puro foi analisado através de HPLC analítica (Método analítico F; tR = 8,01 min) e UPLC-HRMS (Método analítico G; medido [M+2H]2+=643,328; calculado: [M+2H]2+=643,324). O teor de acetato foi 7,99-8,27% e o teor de água foi 1,94-1,96 %. Etapa 2: Preparação de pE-R-P-C*-L-S-CP-N6- [ [(1a,8a,9a)- biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetóxi]carbonil]-K-G-P-(D-Nle)-NH(Fenetil) [dissulfeto C4-C7]

[00859] Uma mistura de triacetato de pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D- Nle)-NH(Fenetila) [dissulfeto C4-C7] (100 mg, 0,068 mmol), bicarbonato de sódio (38 mg, 0,452 mmol) e água (83 µL) em DMF (1 mL) foi agitada em temperatura ambiente por 10 min, então carbonato de(1R,8S)-biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetil succinimidila (Berry & associates, 20 mg, 0,068 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 90 min. 1 mL de água foi adicionado à mistura e a solução resultante foi liofilizada para fornecer um pó que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. Etapa 3: Preparação de Exeplo 20:

[00860] Uma mistura de pE-R-P-C*-L-S-C*-N6- [ [(1a,8a,9a)- biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetóxi]carbonil]-K-G-P-(D-Nle)-NH(Fenetila) [dissulfeto C4-C7] (50 mg do produto da Etapa 2 em 1 mL de água, 0,034 mmol) e Intermediário 47 (52 mg em 268 µL de água) foi agitada em temperatura ambiente por cerca de 3 h. A mistura de reação foi então purificada através de HPLC preparativa (coluna Sunfire 30x50mm 5 um ACN/H2O com TFA 0,1% 75 ml/min, ACN 15-40% gradiente 5 min). A fração de produto foi liofilizada para fornecer o composto do título como sal de TFA (24 mg, 21%). LCMS (Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7um 2,1x50mm, 50oC, Eluente A: Água + Ácido Fórmico 0,1%, Eluente B: Acetonitrila + Ácido Fórmico 0,1%, gradiente B/A 2% a 98% durante 5,15 mins): Tempo de retenção: 2,77 mins; MS [M+2]2+: observado: 1491,8808, calculado: 1491,8560. Exemplo 21A: Peptídeo cíclico de apelina BCN conjugado a intermediário 47 Etapa 1:

[00861] Uma mistura de pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F- OH(Dissulfeto C6-C12) (SEQ ID NO: 18) 50 mg, 0,033 mmol, como preparado na Patente US No. 8.673.848), bicarbonato de sódio (18 mg, 0,215 mmol) e água (40 µL) em DMF (0,5 mL) foi agitada em temperatura ambiente por 10 min, então carbonato de (1R,8S)- biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetil succinimidila (Berry & associates, 18 mg, 0,065 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 90 min. A mistura de adições +1 e +2 foi observada através de LCMS, então a mistura foi purificada através de HPLC ativada por massa (Peptídeo Método 5 ACN 25-50% gradiente 5 min: Condições: coluna Sunfire 30x50mm 5um ACN/H2O com TFA 0,1% 75ml/min injeção 1,5 ml): rt 3,2min (+1), rt 4,65 min, 4,9min (mistura +1 e +2). LCMS confirma produto +1 desejado em 61% de rendimento e mistura +1, +2 em 18% de rendimento. LCMS: (Eluente Básico A: Água + Hidróxido de Amônio 5mM e Eluente B: Coluna Ácido de ACN: Sunfire C18 3,5µm 3,0x30mm - 40°C; Coluna Básica: XBridge C18 3,5µm 3,0x30mm - 40°C); Tempo de retenção: 0,98 mins; MS [M+2]2+: observado: 856,0, calculado: 865,0245. Etapa 2:

[00862] Uma mistura de p E-R-P-R-L-C*-H-N6- [ [(1a,8a,9a)- biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetóxi]carbonil]-K-G-P-Nle-C*-F- OH(Dissulfeto C6-C12) (SEQ ID NO: 19) (21,33 mg, 0,014 mmol) e Intermediário 47 (24 mg, 0,014 mmol) foi agitada em temperatura ambiente por cerca de 3 h. A reação estava completa através de LCMS e foi liofilizada para fornecer o produto título (23 mg, 48%). LCMS (Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7um 2,1x50mm, 50oC, Eluente A: Água + Ácido Fórmico 0,1%, Eluente B: Acetonitrila + Ácido Fórmico 0,1%, gradiente B/A 2% a 98% durante 5,15 min): Tempo de retenção: 2,22 min; MS [M+2]2+: observado: 1616,9464, calculado: 1616,976. Exemplo 21B: Peptídeo cíclico de Apelina conjugado a construto ligan- te de ácido graxo I-37 Etapa 1: Síntese de A-H-Q-R-P-C-L-S-C-K-G-P-Dnle-Fenetil amina Intermediário 21B1

[00863] Resina de fenetilamina-AMEBA (Sigma Aldrich, 0,1 mmol, 1,0 mmol/g) foi submetida à síntese de peptídeo de fase sólida em um sintetizador de peptídeo automático (CEM Liberty Blue Microwave) com Arg duplo padrão para os resíduos Arg e tempo duplo acoplado Dnle. Os aminoácidos foram preparados como solução 0,2 M em DMF. Um ciclo de acoplamento padrão foi definido como segue:

[00864] • Acoplamento de aminoácido: AA (5 eq.), HATU (5 eq.), DIEA (25 eq.)

[00865] • Lavagem: DMF (3 x 7 mL)

[00866] • Desproteção de Fmoc: Piperidina 20%/HOBt 0,1 M (2 x 7 mL)

[00867] • Lavagem: DMF (4 x 7 mL, então 1 x 5 mL)

[00868] Após a montagem do peptídeo, a resina foi lavada com DMF (2 x 50 mL) e DCM (2 x 50 mL), então seca sob vácuo para fornecer Intermediário 21B1 (276 mg, 0,1 mmol). Etapa 2: Preparação de Intermediário 21B2 (Clivagem de peptídeo a partir da resina)

[00869] O Intermediário 21B1 (276 mg, 0,1 mmol) foi combinado com solução de TFA 4 mL (37 mL de TFA, 1 mL de H2O, 1 mL de TIPS, 3,06 g de DTT) e agitado em temperatura ambiente por 3 horas. A solução foi removida da resina e precipitada em 40 mL de Et2O frio. A solução foi vortexada e deixada ficar em gelo por 10 minutos antes da centrifugação a 4000 rpm por 5 minutos. O solvente foi removido e o sólido branco foi lavado mais duas vezes com Et2O frio (40 mL cada vez), centrifugado (5 minutos cada vez) e decantado. O sólido foi seco sob vácuo de um dia para o outro fornecendo Intermediário 21B2 (17,4 mg, 0,012 mmol). LCMS (coluna SQ2 ProductAnalysis-Acidic-Peptide-Polar, Acquity UPLC BEH C18, 130 Â, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, 50°C): Tr= 1,83 minuto, MS [M+H] 1513,5.

Etapa 3: Preparação de Intermediário 21B3 (Ciclização de resíduos cisteína)

[00870] O Intermediário 21B1 (29,6 mg, 0,020 mmol) foi dissolvido em água (3 mL) e 10 gotas de DMSO para fornecer uma solução levemente nebulosa. Iodo (50 mM em HOAc, 0,783 mL, 0,039 mmol) foi adicionado lentamente em gotas e a reação foi misturada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Análise LCMS da reação bruta mostrou conversão completa de material de partida. Áci- do ascórbico 0,5 M foi adicionado em gotas até a cor ter dissipado. O material foi purificado através de HPLC ativada por MS. Liofiliza- ção das frações agrupadas forneceu 7 mg do produto desejado como um pó branco (4,63 µmol, 24%). LCMS (Coluna SQ2 ProductA- nalysis-Acidic-Peptide, Acquity UPLC BEH C18, 130 Â, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, 50°C): Tr= 0,90 minuto, MS [M+H] 1511,8. Etapa 4: Preparação de conjugado compreendendo A-H-Q-R-P-C-L-S- C-K-G-P-Dnle-Fenetil amina Apelina e Intermediário I-37 (conjugação N-terminal) - Exemplo 21B

[00871] Uma solução de 10 mg/mL de NHS-ácido graxo foi preparada em H2O. O Intermediário 21B3 (1,5 mg, 0,993 µmol) foi dissolvido em tampão de NaOAc pH 4 30 mM (672 µL) e NHS-ácido graxo (I-37: 0,850 mL, 5,10 µmol) foi adicionado. A reação foi misturada em temperatura ambiente por 16 horas, ponto quando mais 1,5 mg de NHS-ácido graxo (10 mg/mL em H2O) foi adicionado e a reação misturada em temperatura ambiente por 16 horas. 8 mg de NHS- ácido graxo (10 mg/mL em H2O) foram adicionados e a reação misturada em temperatura ambiente por 3 dias e 1,7 mg de NHS-ácido graxo (10 mg/mL em H2O) foi adicionado. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas e purificada através de HPLC ativado por M para fornecer 1,7 mg do composto do título como um pó branco (0,510 µmol, 51%). (Coluna ProductAnalysis-Acidic- Peptide-Polar, Acquity UPLC BEH C18, 130 Â, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, 50°C): Tr= 3,87 minutos, MS [M+H+2/2] 1533,1; [M+H+3/3] 1022,9.

Exemplos 22 a 24 se referem a conjugados de ácido graxo com um siRNA

[00872] Kits para síntese de siRNA estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da New England Biolabs e Ambion. Um agente de siRNA pode ser construído usando síntese química e reações de ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, agente siRNA pode ser quimicamente sintetizado usando nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos variadamente modificados projetados para diminuir efeitos fora do alvo e/ou aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou aumentar a estabilidade física do dúplex formado entre os ácidos nucleicos de antissentido e sentido, por exemplo, derivados de fosforotioato e nu- cleotídeos substituídos de acridina podem ser usados. "G," "C," "A," "T" e "U" cada um geralmente significa um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como uma base, respectivamente. No entanto, os termos "ribonucleotídeo", "desoxinu- cleotídeo" e "nucleotídeo" podem se referir também a um nucleotí- deo modificado ou uma porção de substituição.

[00873] Aqueles versados na técnica compreenderão que é possível sintetizar e modificar o siRNA como desejado, usando qualquer método convencional conhecido na técnica (vide Henschel e outros, 2004 "DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs". Nucleic Acids Research 32 (Web Server Issue): W113- W120). Exemplo 22: Conjugação de uma porção de ácido graxo de Fórmula A3 a siRNA

Preparação de Intermediário 22a:

[00874] De TTR siRNA [siRNA para transtirretina (TTR), sintetizado usando métodos convencionais conhecidos na técnica] foi convertido em 22a usando procedimentos de oligonucleotídeo padrão (por exemplo, reação com 6-(4-Monometoxitritilamino)hexil-(2-cianoetil)-(N,N-di- isopropil)- fosforamidita (No. catálogo Glen Research: 10-1906))

[00875] siRNA de TTR:

[00876] Filamento de antissentido Puagagcaagaacacugu*u*rX058 (SEQ ID NO: 20) onde:

[00877] P é fosfato, letras minúsculas indicam um nucleotídeo modificado 2'-OMe, letras sublinhadas indicam um nucleotídeo modificado 2'-F, letras em itálico indicam um nucleotídeo modificado 2'-MOE, r é ribitol abásico, * se refere a uma ligação fosforotioato e X058 é um ca- peamento de extremidade 3' não nucleotídico de Fórmula:

[00878] Filamento de Sentido: aacaguguuçuugçuç ua r-C6OH (SEQ ID NO: 21).

[00879] - se refere a um fosfato; e C6OH (também conhecido como C6) é um capeamento de extremidade 3' não nucleotídica de Fórmula:

Preparação de intermediário 22b:

[00880] A 0,556 ml de uma solução de siRNA 22a (siRNA TTR, 14,02 mM em H2O, 7,79 µmol) a 0o C, 0,556 ml de DMF foi adicionado e aquecido para temperatura ambiente. Então 208 µL de TEA (0,3 M em DFM, 62 µmol) foram adicionados e 260 µL de BCN-NHS carbonato de ((1R,8S,9s)-biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetil N-succinimidila (0,15 M em DMF, 39 µmol). A reação resultante agitada em temperatura ambiente por 1 h. HPLC analítica mostrou o desaparecimento de material de partida 22a. A reação foi diluída para 10 ml com H2O deionizada e se tornou nebulosa. A mistura acima foi extraída com acetato de etila 5 vezes para remover moléculas orgânicas pequenas. A camada aquosa foi separada e liofilizada. O sólido de produto seco (22b) foi usado como é.

Preparação do Exemplo 22:

[00881] Misturados 80 µL de composto 22b (12,3 mM em H2O, 0,968 µmol) e 65 µL de bis ácido graxo-N3 (22c: etapa 2 do Exemplo 15: 44,7 mM em DMSO, 2,90 µmol). A mistura resultante era nebulosa, então 80 µL de 1:1 de DMF/THF foram adicionados e a reação era ainda ligeira mente nebulosa. Mais 80 µL de DMSO foram adicionados para obter uma solução transparente. A reação agitou em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi diluída com H2O deionizada e purificada em HPLC para fornecer 5,6 mg de composto 22 (65,9% de rendimento). Condições de HPLC para purificação: Coluna: Xselect Prep phenylhexyl 5um OBD 19x50mm; solvente orgânico: ACN modificado com TEA.HOAc 100mM; solvente aquoso: H2O modificada com TEA.HOAc 100mM; Gra-diente: AcCN 5-60%/H2O; Tempo: 10min. Sob LC-MS método H, o pro-duto mostrou um pico único com tempo de retenção de 5,44 min com o PM desejado de 8778 após Desconvolução. Exemplo 3: Conjugação de uma porção de ácido graxo de Fórmula A1 à Preparação de siRNA de Composto 4

[00882] O Exemplo 23 foi preparado usando o mesmo procedimento que o Exemplo 22.

Preparação de 23a:

[00883] A uma solução de NHS-ácido graxo (20 mg) em DCM (16 mL) foram adicionados azido-peg7-amina (QuantaBiodesign, No. cat. 10523) (31 mg) e DIPEA (52 µL) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 h. Conversão completa foi observada através de análise LC-MS. A mistura foi concentrada, redissolvida em MeOH (3 mL) e purificada através de HPLC ativada por MS com TFA 0,1% (rt = 1,59 min, massa esperada (M+1): 818,062, massa observada: 817,9) para fornecer produto limpo. Metade do material foi perdida devido a um ajuste de corte de 800 Da no sistema HPLC MS. 5-10 mg (17-33%) de produto limpo foram obtidos.

[00884] Misturados 80 µL de 22b (12,3 mM em H2O, 0,968 µmol) e 65 µL de ácido graxo tris-N3 (23a: 44,7 mM em DMSO, 2,90 µmol). A reação forneceu 5,2 mg de composto 23 (58,0% de rendimento). Sob LC-MS Método H, o produto mostrou um pico único com tempo de retenção de 5,87 min com o PM desejado de 9257 após desconvolução. Exemplo 24: Conjugação de ácido graxo de Fórmula A3 a siRNA APOCIII

Preparação de 24b

[00885] A uma solução de 24a (1,244 g, 4,19 mmol) em 25 ml de DCM, TEA (0,58 mL, 4,19 mmol) foi adicionado, seguido por ácido N3- pentanoico (500 mg, 3,49 mmol). EDC (804 mg, 4,19 mmol) foi adicio-nado por último. A reação foi agitada em temperatura ambiente por 4 h. A reação foi extraída entre salmoura e DCM. Combinados todos os orgânicos, secos, concentrados e purificados em gel de SiO2 com ace-tato de etila 60%/heptano para fornecer 1,20 g de composto 24b (89% de rendimento). 1H RMN (CLOROFÓRMIO-d, 400NHz) d: 5,88-6,37 (m, 1H), 4,60 (d, J=4,8 Hz, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,33 (t, J=6,7 Hz, 2H), 3,13 (d, J=6,5 Hz, 2H), 2,30 (t, J=7,2 Hz, 2H), 1,81-1,95 (m, 1H), 1,631,81 (m, 5H), 1,48-1,57 (m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,36 (d, J=6,8 Hz, 2H)

Preparação de 24c

[00886] A uma solução de 24b (860 mg, 2,23 mmol) em 12 ml de THF, NaOH 1N (5,58 mL, 5,58 mmol) foi adicionado. A reação agitou em temperatura ambiente por 0,5 h. A reação foi diluída com salmoura e 20 ml de DCM foram adicionados. O pH da camada aquosa foi ajustado para pH ~5 com HCl 1N, então extraído com DCM. Combinados todos os orgânicos, secos, concentrados e o sólido bruto foi redissolvi- do em 6 ml de DCM. 0,6 ml de TFA foi adicionado e a reação agitada em temperatura ambiente por 2 h. A reação foi concentrada e forneceu o produto 24c (400 mg, 54%), que foi usado diretamente sem purificação adicional. Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico principal a 0,43 min com uma massa de 272,5 (M+H+).

Preparação de 24e

[00887] A uma solução de 24c (400 mg, 1,04 mmol) em 10 ml de DCM, TEA (0,434 mL, 3,11 mmol) foi adicionado, seguido pela adição de 24d (538 mg, 1,35 mmol). A reação agitada em temperatura ambiente por 3 h. A reação foi extraída entre H2O e DCM. Combinados todos os orgânicos, secos, concentrados e purificados em gel de SiO2 com MeOH 8%/DCM para fornecer 475 mg de 24e (82% de rendimento). 1H RMN (CLOROFÓRMIO-d, 400MHz) d: 6,74-6,98 (m, 1H), 5,956,13 (m, 1H), 4,55 (dd, J=7,2, 2,4 Hz, 2H), 3,32 (t, J=6,7 Hz, 4H), 3,11 (d, J=5,8 Hz, 2H), 2,30-2,37 (m, 2H), 2,20-2,26 (m, 2H), 1,90 (s amplo, 2H), 1,71-1,80 (m, 2H), 1,59-1,71 (m, 4H), 1,51-1,59 (m, 2H), 1,35-1,51 (m, 13H), 1,20-1,35 (m, 13H). Preparação de 24f

Preparação de intermediário 24f2

[00888] A uma solução de 24f1 (1,0 g, 4,97 mmol) em MeOH (40 ml), TEA (1,04 mL, 7,45 mmol) foi adicionado, seguido por dicarbonato de di-t-butila (2,17 g, 9,94 mmol). A reação foi aquecida a 60° C por 1,5 h. A reação foi concentrada e purificada em coluna de SiO2 com MeOH 5%/DCM para fornecer 1,2 g de composto 24f2 (80% de rendimento). 1H RMN (CLOROFÓRMIO-d, 400MHz) d: 4,51 (s amplo 1H), 3,00-3,22 (m, 2H), 2,37 (t, J=7,4 Hz, 2H), 1,59-1,71 (m, 2H), 1,46 (s, 11H), 1,29 (s amplo, 12H).

Preparação de intermediário 24f3

[00889] A uma solução de 24f2 (1,2 g 3,98 mmol) em DCM (30 ml), N-hidroxil succinimida (0,60 g, 5,18 mmol) foi adicionada, seguido por EDC (1,0 g, 5,18 mmol). A solução foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi concentrada, diretamente carregada em coluna de SiO2 e purificada com acetato de etila 40%/heptano para fornecer 1,46 g de composto 24f3 (92% de rendimento). 1H RMN (CLOROFÓRMIO-d, 400MHz) d: 4,49 (s amplo 1H), 3,04-3,19 (m, 2H), 2,86 (d, J=4,5 Hz, 4H), 2,62 (t, J=7,4 Hz, 2H), 1,701,82 (m, 2H), 1,37-1,53 (m, 13H), 1,30 (s amplo, 10H)

Preparação de intermediário 24f

[00890] A uma solução de GalNAc3-NH2 (300mg, 0,16mmol) em DCM (1,5ml), TEA (0,11mL, 0,79mmol) foi adicionado, seguido pela adição de 24f3 (188 mg, 0,47 mmol). A reação agitou em temperatura ambiente de um dia para o outro. Então ácido trifluoracético (1,0 ml) foi adicionado. Após 2 h, LC-MS mostrou o desaparecimento do intermediário. A reação foi concentrada e purificada em HPLC de acesso aberto sob condição ácida com ELSD como uma detecção. As frações de HPLC contendo o produto foram coletadas e o solvente foi evaporado para fornecer 220 mg de composto 24f (67% de rendimento). LC- MS mostrou que produto parcial perdeu um grupo acetila. Condições de HPLC para purificação: coluna: coluna Sunfire 30x100 mm 5 um; solvente orgânico: ACN com TFA 7,5%; solvente aquoso: H2O com TFA 7,5%; taxa de fluxo: 75 ml/min. Gradiente: 15-40% H2O/AcCN; Tempo: 9,5 min; detecção; ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) como detecção. Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico em 0,83 min com uma massa de 989,9 (M/2+H+).

Preparação de 24g

[00891] A uma solução de 24e (172 mg, 0,31 mmol) em DCM 3 mL, 24f (250 mg, 0,12 mmol) foi adicionado, seguido por TEA (0,069 mL, 0,50 mmol). EDC (95 mg, 0,5 mmol) foi adicionado por último. A reação agitou em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi concentrada e purificada em coluna de SiO2 com MeOH 5%/DCM para fornecer 230 mg de 24g (74% de rendimento). Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico de 1,30 min com uma massa de 1258,2 (M/2+H)+.

Preparação de 24h

[00892] A uma solução de 24g (230 mg, 0,091 mmol) em 1 ml de THF, 0,457 ml de HCl 4N (em dioxana, 1,83 mmol) foi adicionado. A reação agitada em temperatura ambiente por 1 h. A reação foi concen- trada e purificada em HPLC par fornecer 50 mg de 24h (23% de ren-dimento), que perdeu um grupo acetila no açúcar. Condições de HPLC para purificação: coluna: coluna Sunfire 30x100mm 5um; solvente or-gânico: ACN com TFA 7,5%; solvente aquoso: H2O com TFA 7,5%; taxa de fluxo: 75 ml/min. Gradiente: H2O 15-40%/AcCN; Tempo: 9,5 min; detecção: ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) como detecção. Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico em 0,95 min com uma massa de 1187,1 (M/2+ H+).

Preparação de 24i

[00893] A uma solução de ácido 2,2,13,13- tetrametiltetradecanodioico (40 mg, 0,127 mmol) em 2 ml de DCM, NOH succinimida (9,81 mg, 0,085 mmol) foi adicionada, seguido pela adição de EDC (16,34 mg, 0,085 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi concentrada e purificada em HPLC para fornecer 20 mg de 24i (38% de rendimento). Condições de HPLC para purificação: coluna: coluna Sunfire 30x100mm 5um; solvente orgânico: ACN com TFA 7,5%; solvente aquoso: H2O com TFA 7,5%; taxa de fluxo: 75 ml/min. Gradiente: H2O 45-70%/AcCN; Tempo: 9,5 min. ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) como detecção. Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico em 1,55 min com uma massa de 434,3 (M+Na+).

Preparação 24j

[00894] A uma solução de 24h (20 mg, 8,05 µmol) em 0,5 ml de DCM, TEA (4,5 µL, 32 µmol) foi adicionado, seguido pela adição de 24i (6,62 mg, 16 µmol) e DMAP (3,93 mg, 32 µmol). A reação agitou em temperatura ambiente de um dia para o outro. Então 0,5 ml de MeNH2 2N/MeOH foi adicionado para a desproteção. A reação agitou em tem-peratura ambiente mais um dia para o outro. A reação foi concentrada e acetona foi adicionada para precipitar o produto e remover reagentes e lipídeos em excesso para fornecer 12 mg de 24j (64% de rendimen- to). Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico em 0,69 min. Com uma massa de 1166,9 (M/2+ H+). Preparação de 24K

Etapa 1:

[00895] siRNA de APOCIII [siRNA para gene APOCIII (também co-nhecido como APOC3 ou Apoc3), sintetizado usando métodos con-vencionais conhecidos na técnica]:

Oligonucleotídeos de Anelamento Procedimento Geral:

[00896] Cada pélete de oligonucleotídeo é rapidamente girado em uma centrífuga e dissolvido em Duplex Buffer (Acetato de Potássio 100 mM; HEPES 30 mM, pH 7,5) em concentração alta (1-10 OD260 por 100 mL de tampão). Aquecimento (até 94° C) e vórtex podem ser usados para facilitar ressuspensão. Os filamento de sentido e antis- sentido são então adicionados juntos em quantidades equimolares. Os oligonucleotídeos mistos são então aquecidos para 94° C e gradualmente esfriados. Para sequências com estrutura secundária significan- te, uma etapa de esfriamento/anelamento mais gradual pode ser empregada. Isto é facilmente feito pondo a solução de oligo em um banho de água ou bloco de aquecimento e desplugando/desligando a máquina. O produto resultante estará em uma forma estável, de filamento duplo, e pode ser armazenado a 4° C ou congelado.

[00897] Filamento de antissentido de siRNA de APOCIII compreende uma sequência de APOCIII, onde a extremidade 3' do filamento termina em um fosfato e compreende ainda, na ordem 5' para 3', um ribitol, um outro fosfato e um capeamento de extremidade 3' X058, um capeamento de extremidade 3' não nucleotídica de Fórmula:

[00898] O filamento de sentido compreende uma sequência de APOCIII complementar ao filamento de antissentido, onde a extremidade 3' do filamento termina em um fosfato e compreende ainda, na ordem 5' para 3', um ribitol, um outro fosfato, e um capeamento de extremidade 3' C6OH, um capeamento de extremidade 3' não nucleotídi- ca de Fórmula:

[00899] siRNA de APOCIII foi reagido com 2-Dimetoxitritiloxometil- 6-fluorenilmetoxicarbonilamino-hexano-1-succinoíl-alquilamino de cadeia longa-CPG (Glen Research No. Catálogo 20-2957) para gerar produto 24k1.

Etapa 2

[00900] siRNA de APOCIII (24k1: 401 µL, 11,2 mM em H2O, 4,49 µmol) foi misturado com 401 µL de DMF para obter uma solução transparente. Então TEA (180 µL, 0,25M em DMF, 45 µmol) foi adicionado, seguido por BCN-NHS carbonato de ((1R,8S,9s)- biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetil N-succinimidila) (9,16 mg, 31 µmol). A reação agitou em temperatura ambiente por 1 h. A reação foi diluída com H2O para 10 ml e extraída com acetato de etila 3 vezes. A camada aquosa foi separada e concentrada para ~5 ml e purificada em coluna de dessalinização PD-10 (GE Healthcare).

Preparação de 24

[00901] 24j (5,8 mg, 2,5 µL) foi adicionado a 105 µL de composto 24k (siRNA de Apoc 3, 9,5 mM em H2O, 0,993 µmol). Após 1 h, a reação se tornou viscosa. Então mais 60 µL de H2O foram adicionados e a reação agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi diluída com H2O e purificada em HPLC para fornecer 5 mg de conjugado 24 (57% de rendimento). Condições de HPLC para purificação: Coluna: Xselect Prep fenilexila 5um OBD 19x50mm; solvente orgânico: AcCN modificado com TEA.HOAc 100mM; solvente aquoso: H2O modificada com TEA.HOAc 100 mM; Gradiente: AcCN/H2O 550%; Tempo: 10 min. Sob LC-MS Método H, o produto mostrou um pico de 5,96 min com a massa desejada de 8896 após desconvolução. Exemplo de Referência 3: siRNA conjugado com GalNAc

[00902] O Exemplo de Referência 3 foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 24 (substituindo 24j com GalNac3-N3 (abaixo)). Preparação de GalNac3-N3

Preparação de intermediário 2

[00903] O composto 1 (2,06 g, 1,07 mmol) foi dissolvido em 20 ml de etanol, TFA (82 µL, 1,07 mmol) foi adicionado, seguido por Pd/C 10% (0,114 g, 0,11 mmol). A reação foi tratada sob balão de H2 por 6 horas. A reação foi filtrada, lavada com etanol e concentrada para obter sólido branco, que foi usado diretamente para a etapa seguinte. Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico em 0,81 min com uma massa de 898,5 (M/2+H+).

Preparação de intermediário 3

[00904] O composto 2 (4,848 g, 0,479 mmol) foi dissolvido em 10 ml de DMF anidro, 2,5-dioxopirrolidin-1-il-4 azidobutanoato (0,325 g, 1,436 mmol) foi adicionado, seguido pela adição de DIPEA (0,418 mL, 2,394 mmol). A reação foi deixada reagir de um dia para o outro em temperatura ambiente. A reação foi concentrada sem nenhum aqueci-mento, diretamente carregada em uma coluna de SiO2 pré-equilibrada e purificada com gradiente de etapa de metanol/DCM 0-20% para fornecer 2,383 g de composto 3 (49,25% de rendimento). Sob LC-MS método I, o produto mostrou um pico em 1,27 min com uma massa de 953,7 (M/2+H+).

Preparação de intermediário 4

[00905] O composto misturado 3 (1,33 g, 0,70 mmol) com MeNH2 (17,45 mL, 2,0M em Metanol, 34,9 mmol). A reação agitou em temperatura ambiente por 2 h. LC-MS mostrou apenas o pico do produto. A reação foi concentrada. Então o sólido redissolvido em etanol e foi precipitado com acetona para fornecer 1,0 g de composto 4 (94% de rendimento). Sob LC-MS Método I, o produto mostrou um pico em 0,53 min com uma massa de 764,5 (M/2+H+). Exemplo 25: Conjugação de Proteína carreadora (CRM197) e um ácido graxo Etapa 1: Ácido 2-((2,2-dimetil-4-oxo-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38- dodecaoxa-5-azatetracontan-40-il)carbamoil)-2-undeciltridecanodioico (25a)

[00906] t-boc-N-Amido-dPEG®11-amina (100 mg, 0,155 mmol, Quanta Biodesign) e Intermediário 5 (80 mg, 0,148 mmol) foram dissolvidos em THF (3 mL) e agitados em temperatura ambiente sob nitrogênio. Após 30 min, DIPEA (0,05 mL, 0,286 mmol) foi adicionado e a mistura de reação agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Conversão completa foi observada através de LCMS (Eluente Ácido A: Água + Ácido trifluoracético 0,05%, Eluente B: ACN, coluna Sunfire C18 3,5 µm 3,0x30 mm - 40° C, gradiente 5-95% 2 minutos, tempo de retenção 1,92 min). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, então dissolvida em cerca de 1,5 mL de acetonitrila. Purificada em uma HPLC ativada por MS (coluna Sunfire 30x50mm 5um ACN/H2O com TFA 0,1% 75ml/min injeção de 1,5 mL, ACN 65-95% gradiente 3,5 min, tempo de retenção 3,23 minutos) e as frações agrupadas e liofilizadas para fornecer 85 mg de um produto limpo em 54% de rendimento. Óleo transparente. LCMS: Método D Tr= 1,18min, M+H 1070,1; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILA-d3) d ppm 0,82 - 1,03 (m, 1 H) 1,11 - 1,37 (m, 10 H) 1,37 - 1,51 (m, 2 H) 1,51 - 1,64 (m, 1 H) 1,69 - 1,82 (m, 1 H) 1,90 - 2,04 (m, 66 H) 2,05 - 2,21 (m, 8 H) 2,21 - 2,42 (m, 1 H) 3,17 - 3,28 (m, 1 H) 3,40 - 3,68 (m, 13 H). Etapa 2: Ácido 2-((35-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33- undecaoxapentatriacontil)carbamoil)-2-undeciltridecanodioico (25b).

[00907] 25a (5 mg, 4,68 µmol) foi dissolvido em DCM (Volume: 2 mL), então ácido trifluoracético (25 µL, 0,324 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente sob atmosfera de nitrogê-nio por cerca de 2 horas. Conversão completa foi observada através de LCMS (Eluente Ácido A: Água + Ácido Trifluoracético 0,05%, Eluente B: ACN, coluna Sunfire C18 3,5 µm 3,0x30 mm - 40° C, gradiente 5-95% 2 minutos, tempo de retenção 1,45). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, então enxaguada com DCM e concentrada nova-mente 3 vezes. Dissolvida em uma mistura de acetonitrila e DMSO. Puri- ficada em uma HPLC ativada por MS (coluna Sunfire 30x50mm 5um ACN/H2O com TFA 0,1% 75ml/min injeção 1,5 mL, ACN 45-70% gradien-te 3,5 min, tempo de retenção 2,50 minutos) e as frações agrupadas e liofilizadas para fornecer 2,5 mg de produto limpo em 55% de rendimento. Óleo transparente.

[00908] Método A Tr= 1,45min, M+H 969,9; 1H RMN (400 MHz, ACE- TONITRILA-d3) d ppm 0,62 - 0,91 (m, 2 H) 0,91 - 1,10 (m, 3 H) 1,10 - 1,31 (m, 18 H) 1,46 (quin, J=7,21 Hz, 2 H) 1,59 - 1,89 (m, 35 H) 1,94 - 2,09 (m, 1 H) 2,16 (t, J=7,40 Hz, 2 H) 2,97 - 3,11 (m, 1 H) 3,24 - 3,37 (m, 1 H) 3,37 - 3,61 (m, 28 H) 3,61 - 3,89 (m, 2 H) 7,85 (br. s., 1 H). Etapa 3: Ácido 2-(((S)-5-(3-amino-3-oxopropil)-3,6-dioxo-1-fenil- 2,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-4,7-diazadotetracontan- 42-il)carbamoil)-2-undeciltridecanodioico (25d).

[00909] Uma solução de 25b (20 mg, 0,018 mmol) em THF (Volume: 2 mL) foi adicionada a Z-L-Gln-Osu 25c (Santa Cruz Biotechnology, CAS 34078-85-8, 11 mg, 0,029 mmol), então DIPEA (75 µL, 0,429 mmol) foi adicionado. Agitada em temperatura ambiente sob uma atmosfera de ni-trogênio durante o final de semana. Conversão completa foi observada através de LCMS (Eluente Ácido A: Água + Ácido Trifluoracético 0,05%, Eluente B: ACN, coluna Sunfire C18 3,5 µm 3,0x30 mm - 40° C, gradiente 5-95% 2 minutos, tempo de retenção 1,77 min). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, então dissolvida em acetonitrila. Puri-ficada em uma HPLC ativada por MS (coluna Sunfire 30x50mm 5um ACN/H2O com TFA 0,1% 75ml/min injeção 1,5 mL, ACN 55-80% gradien-te 3,5 min, tempo de retenção 2,70 minutos) e as frações agrupadas e liofilizadas para fornecer 10,5 g de produto limpo em 46% de rendimento como um óleo incolor transparente. Método C Tr= 1,60 min, M+H 1232,4; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILA-d3) d ppm 0,67 - 0,93 (m, 2 H) 0,93 - 1,10 (m, 2 H) 1,10 - 1,32 (m, 15 H) 1,45 (quin, J=7,24 Hz, 1 H) 1,59 - 1,69 (m, 1 H) 1,75 - 1,93 (m, 30 H) 1,94 - 2,21 (m, 20 H) 3,23 (quin, J=5,26 Hz, 1 H) 3,28 - 3,51 (m, 23 H) 3,95 (td, J=7,73, 5,44 Hz, 1 H) 4,92 - 5,22 (m, 1 H) 5,78 (s amplo, 1 H) 6,13 - 6,42 (m, 1 H) 6,88 (s amplo, 1 H) 7,20 - 7,36 (m, 2 H) 7,42 (t, J=5,07 Hz, 1 H). Etapa 4: Marcação mediada por mTGase de CRM197 com ácido graxo (Exemplo 25):

[00910] A uma solução de 25d em tampão de tris 100 mM pH 8 (8 mg/mL, 203 µL, 1,316 µmol) foi adicionado CRM197 (33 mg/mL, 1,515 µL, 0,00086 µmol) seguido por uma solução de enzima transglutaminase (Ajinomoto) em PBS (50 mg/mL, 0,455 µL, 0,00060 µmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas. A mistura de reação foi trocada em tampão de tris 100 mM pH 8 usando filtro centrífugo Amicon MWCO 10 kDa através de diluição e concentração da reação 5 vezes para um volume de 100 µL. Análise LCMS mostrou conversão para produtos +1, +2, +3 e +4. LCMS QT2; Protein_35-70 kDa_3 min: Tr= 1,45 min; MS [M+25d]: observado: 59625, calculado: 59624; MS [M+(2 x 25d)]: observado: 60839, calculado: 60838; MS [M+(3 x 25d)]: observado: 62054, calculado: 62052; MS [M+(4 x 25d)]: observado: 63270, calculado: 63266. Sequência de CRM197 (SEQ ID NO: 22) : GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH

Sumário experimental de mapeamento de peptídeo:

[00911] Digestão de Mapeamento de Peptídeo: 5 µg de amostras de CRM197 modificada e CRM197 controle positivo foram reduzidos com DTT 20 mM e digeridos com 1/30 (p/p) de enzima/proteína a 26° C de um dia para o outro com tripsina. Uma alíquota de proteína digerida com tripsina foi digerida adicionalmente com enzima Gluc a 1/20 de razão de enzima/proteína por 4 h a 26° C; nota: todas as enzimas compradas da Roche Diagnostics (Gmbh, Alemanha).

[00912] Análise LC-MS/MS de Fase Reversa: Peptídeos digeridos resultantes foram analisados através de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem por eletropulverização (LC-ESI MS/MS) em um Thermo LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Fisher Scienti-fic Inc., Waltham, MA) acoplado a Agilent CapLC (Santa Clara, CA). Car-regados ~10-15 pmol de digestões controle de CRM e CRM197 modifi-cada em coluna a 40° C (Coluna Waters Acuity BEH C18, 1,7 µm, 1x100 mm). Realizar gradiente total de 80 min a 10 µL/min começando a 0-1 min, B 4%, aumentado para B 7% em 1,1 min, B 45% em 55 min, então B 95% em 63 min, seguido por lavagem e equilíbrio de coluna. Parâmetros de espectrômetro de massa incluíam um evento de escaneamento total usando o analisador FTMS em resolução de 30000 de m/z 3002000 por 30 ms. MS/MS Dissociação Induzida por Colisão foi conduzida nos sete íons mais intensos (excluindo íons 1+) no analisador de aprisionamento de íon, ativado em contagens de limiar de intensidade de sinal de 500 (para todos os eventos) por 30 ms.

[00913] Análise de Dados e Pesquisa de Banco de Dados: Todos os espectros de massa foram processados em Qual Browser V 2.0.7 (Thermo Scientific). Arquivos genéricos Mascot (mgf) foram gerados com MS DeconTools (R.D. Smith Lab, PPNL) e pesquisados usando pesquisa de banco de dados Mascot V2.3.01 (Matrix Science Inc., Boston, MA) contra a sequência de proteína provida adicionada a um banco de dados feito sob medida na casa e o banco de dados SwissProt (V57 com 513.877 sequências) para proteínas contaminantes. Parâmetros de pes- quisa incluíam: enzima: semitripsina ou tripsina/Glu-C, permitidas até três clivagens perdidas; modificações variáveis: massas esperadas adicionadas de moléculas pequenas (362,147787 Da e 463,206698 Da) a bancos de dados chamados "CRM Tgase +alkyne 362Da mod (CKR), CRM Tga- se +alkyne 362Da mod (N-term), CRM Tgase+azide 463Da mod (CKR), CRM Tgase+azide 463Da mod (N-term)"; tolerância de peptídeo: ±20 ppm; tolerância MS/MS: ±0,6 Da. Avaliações de cobertura de sequência e modificação de molécula pequena foram feitas em classificações de íon com >95% de confiança. Íons de peptídeo de classificação alta foram então selecionados para análise MS/MS manual usando Qual Browser.

[00914] Posições nas quais modificação de lisina ocorre podem ser determinadas de acordo com o experimento de mapeamento supra. De acordo com conjugações similares descritas em CRM197 no Pedido de Patente US No: US2015/0017192 depositado em 11 de julho de 2014 (documento de procuração número PAT055641-US-NP), a requerente extrapolou aquela modificação ocorrida em Lys37 ou Lys39, Lys33 e Lys440. Exemplo 26A: Conjugação de derivado de oxitocina e um ácido graxo Conjugado de oxitocina FA Etapa 1: Preparação de oxitocina protegida na resina

[00915] A forma protegida de oxitocina na resina (26a1) foi sintetizada em analogia ao Exemplo 21B etapa 1. Etapa 2: Desproteção de alila, ciclização, clivagem a partir da resina

[00916] O intermediário protegido (26a1) (0,2 mmol) foi absorvido em 6 ml de DCM contendo fenilsilano (1 mmol) e Pd(PPh3)4 (0,02 mmol). A resina foi agitada nesta solução por 15 minutos e então filtrada. Este procedimento foi repetido duas vezes com fenilsila- no/Pd(PPh3)4 em solução de DCM. Após a última agitação, a resina foi filtrada e lavada com NMP (3 vezes), DCM (3 vezes), DIEA/DCM 0,5% (3 vezes) e finalmente NMP (3 vezes). A resina lavada resultante foi seca sob vácuo. Uma porção da resina desejada (~0,1 mmol) foi absorvida em uma solução de PyBOP (0,2 mmol), HOBt (0,4 mmol) e DIEA (0,5 mmol) em 6 mL de NMP. Esta reação foi agitada em temperatura ambiente por 20 horas. A resina foi filtrada e lavada com EtOAc (3 vezes) e DCM (3 vezes). A resina foi absorvida em 4 mL de 95/2,5/2,5 de TFA/TIPS/H2O e agitada por 2 horas. A solução de TFA/TIPS/H2O foi então filtrada em Et2O gelado (<-20° C) para precipitar o peptídeo clivado. Após centrifugação, o Et2O foi decantado e o resíduo esbranquiçado foi lavado com Et2O e centrifugado novamente. O sólido esbranquiçado resultante foi seco sob N2 de um dia para o outro. O sólido foi purificado em HPLC preparativa ativada por massa (Waters Autopure HPLC System; coluna Sunfire C18 30x50mm 5um; fase móvel: ACN 7,5-20% em Água, gradiente 5 min, 75m L/min, modificado com TFA 0,1%). Frações correspondendo ao Intermediário (26a2) foram combinadas, congeladas e liofilizadas para um sólido branco (13,5 mg, 14%). HRMS- Método Analítico G: Tr= 0,90 min, MS m/z 988,5225 [M+H]+.

Etapa 3: Conjugação ao ácido graxo

[00917] A uma solução de Intermediário (26a2) (2,82 µmol) em 0,5 mL de tampão de fosfato pH = 6,40 foi adicionada uma solução de I-37 (8,39 µmol) em 0,5 ml de tampão de fosfato de pH = 6,40. A reação agitou em temperatura ambiente por 18 horas. A mistura de reação foi então filtrada em uma frita de 4,5 µm e purificada em HPLC preparativa ativada por massa (Waters Autopure HPLC System; coluna Sunfire C18 30x50mm 5um; fase móvel: ACN 45-70% em Água, gradiente 5 min, 75 ml/min, modificado com TFA 0,1%). Frações correspondendo ao Conjugado de Oxitocina-FA (26A) foram combinadas, congeladas e liofilizadas para um sólido branco (1,71 mg, 24%). LCMS-Analítica Método G: Tr= 3,07 mins, MS m/z 2540,5 [M+H]+. Exemplo 26B: Conjugação de derivado de oxitocina e um ácido graxo:

[00918] O exemplo (26B) acima pode ser preparado de acordo com a etapa 3 do Exemplo 26A descrito acima reagindo: *Butirato-Tyr-Ile- Gln-Asn-Cys*-Gly(N-CH2CH2CH2NH2)-Leu-Gly-NH2 (SEQ ID NO: 23) * = ligação sulfeto (26b1): (26b1) com intermediário I-37.

[00919] O peptídeo cíclico (26b1) foi preparado através da adaptação do procedimento do Exemplo 41 revelado em Wisniewski e outros, J. Med. Chem. (2014), 57 5306-5317, que é aqui incorporado a título de referência.

[00920] O peptídeo foi sintetizado manualmente em 1 mmol de resina Fmoc-Rink Amide MAS através de química Fmoc. Grupos de proteção usados para aminoácidos são: grupo t-butila para Tyr, grupo Trt para Gln e Asn. Dois aminoácidos incomuns, Fmoc- Cys(CH2CH2CH2CO2Allyl)-OH e Fmoc- [Na-CH2CH2CH2NH(Boc)]Gly- OH, foram usados. A cadeia de peptídeo foi montada em resina através da remoção repetitiva do grupo de proteção Fmoc e acoplamento do aminoácido protegido (3 eq.) em DMF. HBTU e HOBt (3 eq.:3eq.) foram usados como reagente de acoplamento; e N-metilmorfolina (NMM, 6 eq.) foi usada como base. Piperidina 20% em DMF (3 vezes em volume de resina) foi usada como reagente de-Fmoc. Resina foi lavada por DMF (3 vezes em volume de resina) após cada acoplamento e de-Fmoc; Teste de ninidrina foi realizado após cada acoplamento para checar a eficiência de acoplamento. Seguindo a remoção do último grupo de proteção Fmoc, a resina foi lavada com éter de etila e seca sob vácuo. A remoção em resina seletiva de grupo de proteção de éster de alila foi realizada por Pd(PPh3)4/5,5-dimetil-1,3-ciclo- hexanodiona (1 eq./10 eq.) em DCM/THF (1/1, 10 vezes de volume de resina) por 3 horas. A resina foi lavada com DMF (3 x) seguido por die- til ditiocarbamato de sódio em DMF (5x). No final, ciclização em resina foi realizada através de HCTU/NMM (3 eq./6 eq.) em DMF. A resina foi lavada e seca sob vácuo para fornecer 3,2 gramas de resina de peptí- deo que foi tratada com 32 ml de TFA/TIS/DOT/H2O (92,5/2,5/2,5/2.5, v/v) por 3 horas em temperatura ambiente para remover os grupos de proteção de cadeia lateral e clivar o peptídeo da resina. Peptídeo bruto foi precipitado de éter frio, então coletado através de filtragem e seco sob vácuo alto. Rendimento: 1,15 g (116%).

[00921] Todo o bruto do peptídeo foi purificado em coluna C18 de 5,08 cm (2 polegadas) com tampão de TFA (tampão A, TFA 0,1% em água; tampão B, acetonitrila). Frações agrupadas com pureza >95% foram liofilizadas para secagem. 84 mg de peptídeo final foram obtidos (sal de TFA). MS: 991,6 [M+H]+, tempo de retenção de HPLC 9,49 min (método: taxa de fluxo 1,2 mL/min; Tampão A: TFA 0,1% em água; Tampão B: TFA 0,1% em acetonitrila; temperatura ambiente; coluna: Discovery, C18, 4,6mm x 250 mm, 5 micro; Gradiente (linear) tampão B 15%-35% em 20 min; volume de injeção 0,02 mL). Exemplo 27: Conjugado de Proteína Relacionada a Agouti (AgRP)- ácido graxo Conjugados de AgRP (83-132)-FA: Exemplo 27A: Conjugado de ácido monograxo de AgRP (AgRP+1AG) onde o ácido graxo é ligado ao terminal N de AgRP através de um ligante (PEG) onde AgRP(83-132) tem a sequência que segue: Ser-Ser-Arg-Arg-Cys-Val-Arg-Leu-His-Glu-Ser-Cys-Leu-Gly-Gln-Gln- Val-Pro-Cys-Cys-Asp-Pro-Cys-Ala-Thr-Cys-Tyr-Cys-Arg-Phe-Phe-Asn- Ala-Phe-Cys-Tyr-Cys-Arg-Lys-Leu-Gly-Thr-Ala-Met-Asn-Pro-Cys-Ser- Arg-Thr (SEQ ID NO: 24); que contém 5 pontes dissulfeto nas posições Pontes C87&C102, C94&C108, C101&C119, C105&C129, C110&C117.

[00922] Exemplo 27B: Conjugado de ácido digraxo de AgRP (83132) (AgRP+2AG) onde um ácido graxo é ligado ao terminal N de AgRP (isto é, Serina 83) através de um ligante (PEG) e o outro ácido graxo é ligado à cadeia lateral de Lisina na posição 121 através de um ligante PEG.

[00923] A 0,90 ml de uma solução de 10 mg/mL de AgRP (83-132) (disponível da R&D Systems®) em tampão de citrato pH 4,5 (9 mg, 1,585 µmol) foi adicionado 0,80 ml de tampão de acetato pH=4,43 seguido por 1,30 ml de uma solução de 10 mg/mL de I-37 em H2O (13 mg, 7,79 µmol). A reação agitou em temperatura ambiente por 16 horas. HRMS (QT2) mostrou ambos AgRP +1FA, m/z 7226,3 [M+H]+ a 1,89 min e AgRP + 2FA, m/z 8778,4 [M+H]+ a 2,41min presentea. A reação foi filtrada em uma frita de 4,5 µm, combinada com uma segunda rodada de reação como acima (0,881 µmol de AgRP, 2,64 µmol de I-37) e purificada em HPLC preparativa (Waters Autopure HPLC System; Coluna Waters Protein BEH C4, 300 Angstrom, 5um, 10x250mm; fase móvel: ACN 20-80% em Água, gradiente 11 min, 10mL/min, modificado com TFA 0,1%; tempo da rodada: 15 min; coleta da fração: UV 210nm). Frações correspondendo a AgRP + 1FA e AgRP + 2FA foram isoladas, congeladas e liofilizadas para fornecer sais de TFA de AgRP + 1FA (27A) e AgRP + 2FA (27B) como sólido branco (3,24 mg, AgRP 16% + 1FA; 2,26mg, AgRP 9% + 2FA). LCMS-Analítico Método G: (AgRP + 1FA) Tr= 1,91 mins MS m/z 7226.4 [M+H]+; (AgRP + 2FA) Tr= 2,43 mins, MS m/z 87784 [M+H]+.

Experimento de marcação para determinar a posição de ligação do ácido graxo

[00924] Marcação em resíduo Ser N-terminal foi confirmada através de digestão da mistura de reação com Asp-N (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. Todos os ensaios de mapeamento de peptídeo foram obtidos usando um Thermo Dionex µLtimate 3000 LC acoplado a um espectrômetro de massa Bruker Maxis Impact Q-TOF. A separação foi realizada em uma coluna ACQUITY UPLC BEH130 C18 (2,1x150 mm, 1,7 µm, Waters) mantida a 40° C. A taxa de fluxo foi 0,1 mL/min com FA 0,1% em água como fase móvel A e FA 0,1% em acetonitrila como fase móvel B.

[00925] Uma solução de Asp-N (Promega No. Part V162A) foi re-constituída em 20 µL de água de HPLC/MS (0,1 µg/µL). Mais ou menos 10 µg de amostra foram diluídos para um volume final de 25 µL em ureia 6 M, ditiotreitol 10 mM, EDTA 5 mM e Tris_HCl 50 mM (pH = 8,0). Após redução e alquilação, as soluções foram diluídas seis vezes com Tris_HCl 50 mM (pH = 8,0), proteólise foi então realizada com mais 1 micrograma de Asp-N. As digestões aconteceram de um dia para o outro a 37 graus Celsius. Análise LCMS indicou que clivagem tinha ocorrido nas posições D N-terminais de AgRP do tipo selvagem e AgRP modificada com uma adição de ácido graxo em cada fragmento como mostrado na tabela que segue.

Exemplo 28 (28A, 28B e 28C) se refere a conjugados de variante de hFGF23 Variantes de FGF23 usadas

[00926] A sequência de uma variante de FGF23 humano, usada em e chamada neste exemplo "hFGF23(R179Q)", ""hFGF23 R179"" ou simplesmente "hFGF23", é provida na SEQ ID NO: 10. Esta variante de FGF23 não tem o peptídeo de sinal, mas tem um M restaurado na posição 1, e tem uma mutação em R179 (R179Q). Um conjugado compreendendo um ácido graxo descrito aqui foi preparado com este peptídeo de FGF23 (Exemplo 28C) e mostrou reter pelo menos uma atividade de FGF23 na tabela 8. Duas outras variantes de FGF23 humano foram também usadas neste exemplo (Exemplos 28A e 28B) para construir conjugados com ácidos graxos revelados aqui. Tal como o peptídeo de SEQ ID NO: 10, estes não têm o peptídeo de sinal de FGF23 e têm uma mutação em R179, mas têm uma ou mais mutações adicionais, mas retêm pelo menos uma atividade de FGF23. Estas duas variantes de FGF23 são usadas em e ambas chamadas neste exemplo "hFGF23-variante" ou "variante de FGF23" ou similar.

[00927] Os métodos de produção de conjugados descritos aqui podem ser usados com outros peptídeos de FGF23, incluindo FGF23, ou um homólogo, variante, fragmento ou forma modificada do mesmo.

Protocolo para produção de variantes de FGF23 Transformação:

[00928] O polipeptídeo hFGF23(R179) foi feito através de transfecção transiente do plasmídeo de expressão de R179Q pET28c-hFGF23 em células competentes BL21(DE3), incubando em gelo por 30 min, choque térmico a 43° C por 45 seg, adição de meios SOC e incubação das bac-térias em um agitador a 37° C por uma hora. Em seguida, a cultura bac- teriana foi espalhada sobre placas LB contendo Canamicina e incubada de um dia para o outro a 37° C. Colônias isoladas foram transferidas para meios LB contendo Canamicina, incubadas de um dia para o outro a 37° C com agitação e alíquotas de 25 mL transferidas para meio LB novo contendo Canamicina e agitadas a 37° C por cerca de 2,5 horas. Quando as células eram de densidade suficiente (OD de ~0,6), IPTG 1 M foi adi-cionado a cada cultura com agitação continuada a 37° C para induzir ex-pressão do polipeptídeo. Após quatro horas as células foram peletizadas através de centrifugação a 6000 rpm por 10 minutos e o pélete congelado a -20° C. Subsequentemente, o pélete foi ressuspenso em tampão de lise (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, Triton X-100 0,1%) e as células lisadas usando um microfluidizador. 10 mg de lisozima e 10 µL de Dnase (1 unidade por mL, Invitrogen) foram adicionados por 100 mL de mistura de lise e incubados em temperatura ambiente por 30 min, então girados a 8000 rpm a 4° C por 20 min, lavados com três mudanças de 100 mL de tampão de lise e girados, e a quarta vez com tampão de lise sem Triton X-100. O pélete (de corpos de inclusão) da rotação final foi imediatamen-te solubilizado em Tris 50 mM, pH, 7,4, guanidina 6 M, DTT 10 mM e a concentração de proteína determinada e ajustada para 1 mg/mL antes da redobra.

Redobra de proteína:

[00929] Para redobrar a proteína, 368 mg de glutationa reduzida (GSSH) e 74 mg de glutationa oxidada (GSSG) foram adicionados a cada 400 ml de corpo de inclusão solubilizado. A proteína foi dialisada de um dia para o outro a 4° C contra 4 L de Tris 50 mM, pH 8,0 e 250 mg de Arginina. Então 2 L de tampão de diálise foram removidos e substituídos com 2 L de água e a diálise continuou por mais 8 horas. O tampão de diálise foi então mudado para Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, Arginina 25 mM e a diálise continuou de um dia para o outro.

Purificação de proteína:

[00930] Para purificar a proteína, a mistura dialisada foi girada a 12000 rpm por 30 min, o sobrenadante carregado em coluna de Hepari- na-Sepharose equilibrada com o tampão de diálise final e a coluna lavada com 20x volume de leito de 1xPBS. A proteína redobrada foi eluída com 1xPBS suplementado com NaCl 0,5M, a pureza da proteína avaliada através de gel SDS-PAGE e a concentração de proteína medida pela sua OD em comprimento de onda de 280 nm. Exemplo 28A: Conjugação de variante de hFGF23 com um ácido graxo

[00931] onde o -NH2 na variante hFGF23-NH2 significa a funcionali dade amino de um resíduo lisina. Etapa 1: Intermediário 28ª

[00932] 5-Amino-2-(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (0,5 g, 1,325 mmol) foi dissolvido em DMF (Volume: 9,96 ml) e (2-(2-(2-aminoetóxi)etóxi)etil)carbamato de etila (0,503 mL, 2,120 mmol) foi adicionado. DIPEA (0,274 g, 2,120 mmol) foi adicionado à mistura e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas ponde onde análise LCMS mostrou formação de produto desejado e consumo de material de partida ZQ-NHS (Método A, Tr= 0,98 min, M+H 511,4). A mistura de reação foi despejada em DCM (100 mL) e lavada em água gelada (3 x 50 mL). A camada orgânica foi seca em Na2SO4, filtrada e concentrada para fornecer 1,14 g de óleo amarelo. Análise de LCMS indicou presença de produto desejado (Mé- todo M, Tr= 1,82 min, M+H 511,4, 1,14 g). Material foi levado para a etapa seguinte sem purificação adicional. Etapa 2:Intermediário 28b,(5-amino-1-((2-(2-(2- aminoetóxi)etóxi)etil)amino)-1,5-dioxopentan-2-il)carbamato de benzila

[00933] Ácido trifluoracético (10 mL, 2,233 mmol) foi adicionado a Intermediário 28a (1,14 g, 2,233 mmol) e agitado em temperatura am-biente por cerca de 1 hora. Análise LCMS mostrou conversão completa de material de partida no produto desejado (Método A, Tr= 0,56 min, M+H 411,3). A mistura de reação foi absorvida em DCM (30 mL) e concentrada para um óleo duas vezes. O óleo foi diluído com ACN 1 mL e MeOH 1 mL e purificado através de HPLC ativada por MS (Método N). Frações com massa desejada foram agrupadas, congeladas e liofilizadas para fornecer Intermediário 28b como um pó branco (Método O, Tr= 0,22 min, M+H 411,3, 160 mg, 18%). Etapa 3: Intermediário 28c

[00934] O Intermediário 28b (19,69 mg, 0,048 mmol) foi dissolvido em DMF (0,5 mL) e adicionado a uma solução de Intermediário 37 (50 mg, 0,030 mmol) em DMF (1,0 mL). 3 gotas de DIPEA foram adicion- das e a reação agitada em temperatura ambiente por 2 horas ponto no qual análise LCMS mostrou conversão completa em produto (Método B, Tr= 1,22 min, M+H+2/2 982,9). A mistura de reação foi carregada em uma coluna C18 de 20 g para cromatografia de fase reversa. Usando um gradiente de solvente de Água 100% (TFA 0,1%) para MeCN 100% durante um período de 20 minutos, as frações coletadas e analisadas através de LCMS. As frações com massa desejada foram combinadas, congeladas e liofilizadas de um dia para o outro para for- necer Intermediário 28c como um óleo incolor, transparente (Método C, Tr= 1,21 min, M+H+2/2 982,9, M+H+3/3 655,5, 15,3 mg, 26%). 1H- RMN provisoriamente interpretada indica a presença da ligação amida formada a 6,29 ppm (1H, m amplo). 1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) d 7,52 (s, 1H), 7,35 (d, J = 3,3 Hz, 5H), 5,10 (s, 2H), 4,30 (s, 1H), 3,77 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,69 - 3,49 (m, 94H), 3,46 (s, 4H), 2,59 (s, 3H), 2,32 (t, J = 7,2 Hz, 25H), 2,08 - 1,94 (m, 4H), 1,79 - 1,65 (m, 2H), 1,65 - 1,52 (m, 2H), 1,40 - 1,06 (m, 31H), 0,94 - 0,82 (m, 3H).

Etapa 4: Variante de hFGF23 + Intermediário 28c

[00935] Para esta etapa, uma variante de FGF23 humano (hFGF23) ("hFGF-variante") foi usada, a qual não tem o peptídeo de sinal, mas tem uma ou mais mutações com relação à SEQ ID NO: 8, mas retém pelo menos uma atividade de FGF23, e onde o "-NH2" em "FGF23- variante-NH2" indica a funcionalidade amino de um resíduo lisina.

[00936] Uma solução de 50 mg/mL de Tgase em MES 30 mM pH 6 e uma solução de 8 mg/mL de Intermediário 28c em tampão MES 30 mM pH 6 foram preparadas. A solução de ácido graxo ficou nebulosa em MES pH 6. A hFGF23-variante (0,3 mg/mL em MES 30 mM pH 6, 7,5 mL, 0,088 µmol) foi adicionado Intermediário 28c (217 µL, 0,883 µmol) seguido por TGase (33,5 µL, 0,044 µmol). A reação foi misturada em temperatura ambiente por 18 horas e mais 217 µL de Intermediário 28c foram adicionados. A reação misturada em temperatura ambiente por 18 horas e mais 217 µL de Intermediário 28c foram adicionados. A reação misturada em temperatura ambiente por 18 horas e mais 108,5 µL de Intermediário 28c foram adicionados. A reação foi misturada em tempera-tura ambiente por 4 horas ponto quando análise LCMS mostrou conver-são completa de material de partida (Método P, Tr= 1,55 min, M+H 27432). A mistura de reação foi dividida entre dois filtros centrífugos Ami- con MWCO 10 kDa 4 mL e tampão trocado 3x com tampão MES 30 mM pH 6, então concentrado para 1,5 mL. Material foi armazenado no refrigerador de um dia para o outro. Um pouco de sólido sedimentou no fundo do tubo. Concentração de sobrenadante foi medida através de A280 (18730 cm-1M-1, 25485 g/mol) ser 0,43 mg/mL (27%).

Exemplo 28B: Conjugação de hFGF23-variante com um ZQG-PEG11- ácido graxo

[00937] Para este exemplo, um conjugado foi preparado compreendendo um ácido graxo e uma variante de FGF23 que não tem o peptí- deo de sinal e tem uma ou mais mutações com relação à SEQ ID NO: 8, mas as variantes retêm pelo menos uma atividade de FGF23.

[00938] onde o -NH2 em hFGF23-variante-NH2 significa a funcionalidade amino de um resíduo lisina.

[00939] Uma solução de 8 mg/mL de Intermediário 25d foi preparada em tampão tris pH 8 100 mM. Uma solução de 50 mg/mL de Tgase foi preparada em H2O. A uma solução de hFGF23-variante (6,5 mL, 0,090 µmol) foi adicionado Intermediário 25d (0,207 mL, 1,343 µmol) seguido por TGase (0,136 mL, 0,179 µmol). A reação foi misturada em temperatura ambiente por 3 dias e 90% de conversão para espécie +1 foram observados (Método LCMS Q, Tr= 7,24 min, M+H 26616). A mistura de reação foi trocada por tampão de PBS 1X usando filtros centrífugos Amicon MWCO 10 kDa através da diluição e concentração da reação 6 vezes para um volume de 2 mL. A concentração foi medida através de A280 (18730 cm-1M-1, 26617 g/mol) ser 0,125 mg/mL (Método LCMS Q, Tr= 7,24 min, M+H 26616).

Exemplo 28C: Conjugação de h-FGF23 R179 + ZQG-PEG11-ácido graxo:

[00940] Para este exemplo, um conjugado foi preparado usando a variante de FGF23 "hFGF23 R179". Esta não tem peptídeo de sinal e tem uma mutação em R179. A sequência é provida como SEQ ID NO: 10.

Massa calculada: 25463

[00941] Uma solução de 8 mg/mL de Intermediário 25d foi preparada em tampão tris pH 8 100 mM. Uma solução de 50 mg/mL de TGase foi preparada em H2O. A uma solução de hFGF23 R179 (2,50E+0,4 µL, 0,393 µmol) foi adicionado Intermediário 25d (750 µL, 4,87 µmol) seguido por TGase (597 µL, 0,785 µmol). A reação foi misturada em temperatura ambiente por dois dias ponto quando análise LCMS mostrou conversão completa de material de partida (Método P, Tr= 1,58 min, M+H 26674). A mistura de reação foi purificada através de croma- tografia de troca de íon para fornecer o conjugado +1 (Método R, Tr= 3,87 min, M+H 26674):

[00942] onde o -NH2 em hFGF23 R179-NH2 significa a funcionalidade amino de um resíduo lisina. Exemplos 29A e 29B se referem a conjugados de serelaxina Exemplo 29A: Conjugado de serelaxina-ácido graxo (conjugado de ácido graxo +1)

[00943] Serelaxina + ZQG-PEG11-ácido graxo (Exemplo 25d):

[00944] Sequência de Serelaxina DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSCFRALS- RKTCGVHCCKNALASYLE (SEQ ID NO: 26); e

[00945] -NH2 em "serelaxina-NH2" significa a funcionalidade amino reativa na cadeia lateral de lisina K17 como evidenciado pelo experimento de mapeamento abaixo; PM 5963 g/mol.

[00946] Uma solução de 8 mg/mL de ZQG-PEG11-ácido graxo (Exemplo 25d) foi preparada em tampão de tris pH 8 100 mM. Uma solução de 50 mg/mL de mTGase foi preparada em H2O. A uma solução de serelaxina (211 µL, 0,168 µmol) em tris pH 8 100 mM (1,018 mL, reação de 0,5 mg/mL) foi adicionado Exemplo 25d (516 µL, 3,35 µmol) seguido por mTGase (Ajinomoto, 255 µL, 0,335 µmol). A reação foi misturada a 37° C por 3 dias e então mais 100 µL de ZQG-PEGn-ácido graxo foram adicionados. A reação foi misturada a 37° C por 18 horas e então troca- dapara tampão de PBS 1X usando filtro centrífugo Amicon MWCO 10 kDa através da diluição e concentração da reação 5 vezes para um vo-lume de 0,7 mL. O material foi purificado através do Método K e as fra-ções com o material desejado foram agrupadas, congeladas e liofilizadas para fornecer um pó branco. O material foi dissolvido em 1 mL de tampão de NaOAc 30 mM pH 5 e concentração foi medida através de A280 (5969cm-1M-1, 7178 g/mol) ser 0,25 mg/mL (25%). LCMS Método L: Tr= 1,65 min; MS [M+1+1AG]: observado: 7180, calculado: 7178. Procedimento experimental para mapeamento de Serelaxina Proteólise da Amostra

[00947] Aproximadamente 10 µg de proteína foram dissolvidos para um volume final de 25 µL em ureia 6 M, ditiotreitol 10 mM, EDTA 5 mM e Tris_HCl 50 mM (pH = 8,0) e mantidos a 37° C por 1 hora para reduzir ligações dissulfeto. Iodoacetamida (500 mM, 1 µL) foi adicionada para alquilar tióis livres e a solução foi deixada ficar em temperatura ambiente por 1 hora no escuro. A solução foi então diluída 6X com Tris_HCl 50 mM (pH = 8,0), Lys (1 ug, Promega V107A) foi adicionado e a solução foi mantida a 37° C de um dia para o outro para digerir a proteína. Ácido fórmico (98%, 2 µL) foi adicionar para extinguir proteólise e a mistura de peptídeo resultante foi analisada através de LC-MS/MS.

Análise LC-MS/MS

[00948] Mapeamento de peptídeo foi feito usando um Thermo Dionex µLtimate 3000 HPLC acoplado com um espectrômetro de massa Bruker Maxis Impact Q-TOF. A MS foi controlada usando software Bruker Com-pass v. 1.7 e Bruker otofControl v 3.4, com parâmetros instrumentais ajustados como segue: faixa da massa 300-2.000 Da; tensão de pulveri-zação 4,0 kV; temperatura capilar 200° C; fluxo de gás de secagem 5,0 L/min. Fracionamento foi feito com uma coluna C18 Waters ACQUITY UPLC BEH130 (2,1x100 mm, 1,7 µm) mantida a 40° C. As fases móveis eram ácido fórmico 0,1% em água e acetonitrila, respectivamente, e a taxa de fluxo era 100 µL/min. O gradiente usado foi 0-2 min, B 2%; 2-3 min, B 2%-8%; 3-10 min, B 8%-29%; 10-14 min, B 29%-33%; 14-16 min, B 33%-37%; 16-20 min, B 37%-73%; 20-22 min, B 73%-95%; 22-25 min, B 95%; 25-26 min, B 95%-2%; 26-30 min, B 2%. Processamento de da-dos foi feito usando Bruker DataAnalysis v. 4.2.

[00949] O experimento de mapeamento indicou que a adição de ácido graxo à serelaxina ocorre principalmente em Lisina K17 com base no peptídeo chamado [CCHVGCTKi7(fa)RSLARFC - 2H2O] (SEQ ID NO: 27), massa: 3088,56 Da, Carga: 5, Tr= 13,4 min, Observado m/z 618,71, Esperado m/z 618,72. Exemplo 29B: Conjugado de serelaxina-ácido graxo (mistura de conju-gado de +1FA, +2FA e +3FA como descrito abaixo)

[00950] onde o -NH2 em "serelaxina-NH2" significa a funcionalidade amino reativa na cadeia lateral de uma lisina. Serelaxina + intermediário 37: Exemplo 29B foi testado como a mistura abaixo

[00951] Sequência:

DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSCFRALS- RKTCGVHCCKNALASYLpE (SEQ ID NO: 28)

[00952] Uma solução de 10 mg/mL de intermediário 37 de ácido gra- xo foi preparada em H2O. A uma solução de serelaxina (105 µL, 0,084 µmol, 4,75 mg/mL) em tampão de NaOAc 30 mM pH 4 (755 µL) foi adicionado Intermediário 37 ácido graxo (140 µL, 0,839 µmol). A reação foi misturada em temperatura ambiente por 16 horas ponto quando análise LCMS mostrou 90% de conversão de material de partida. Mais 70 µL de intermediário 37 foram adicionados e a reação misturada por 16 horas em temperatura ambiente ponto quando análise MALDI indicou >95% de conversão. A solução foi trocada para tampão de PBS 1X usando filtro centrífugo Amicon MWCO 3 kDa através de diluição e concentração da reação 4 vezes para um volume de 0,2 mL. A concentração foi medida através de A280 (5969 M-1cm-1; 9068 g/mol) ser 2,61 mg/mL. LCMS Méto-do L: Tr= 1,56 min; MS [M+1 +1 FA]: observado: 7516, calculado: 7517; Tr= 1,65 min; MS [M+1 +2 FA]: observado: 9069, calculado: 9071; Tr= 1,74 min; MS [M+1 +3 FA]: observado: 10622, calculado: 10625. Exemplo 30: Conjugação de M-His-hPIP com construto de ácido graxo (I-37) - (Mistura de conjugado de +1 FA e conjugado de +2 FA como descrito abaixo) Sequência M-His-hPIP (29-146): MHHHHHHQDNTRKIIIKNFDIPKSVRPNDEVTAVLAVQTEL- KECMVVKTYLISSIPLQGAFNYKYTACLCDDNPKTFYWDFYTN- RTVQIAAVVDVIRELGICPDDAAVIPIKNNRFYTIEILKVE (SEQ ID NO:13) Forma expressa Sequência de Proteína Expressa: METDTLLLWVLLLWVPGSTGMHHHHHHQDNTRKIIIKN- FDIPKSVRPNDEVTAVLAVQTE LKECMVVKTYLISSIPLQGAFNYKYTACLCDDNPKTFYWDFYTN- RTVQIAAVVDVIRELG ICPDDAAVIPIKNNRFYTIEILKVE (SEQ ID NO: 29) Sequência de nucleotídeo: GCTAGCCACCATGGAGACTGATACTTTGTTGTTGTGGGTACTG- TTGCTTTGGGTGCCCGG TAGTACCGGTATGCATCACCACCACCATCACCAGGACAACAC- CCGGAAGATCATCATCAA GAACTTCGACATCCCTAAGAGCGTGCGCCCAAACGATGAAGT- CACCGCGGTGCTGGCAGT GCAGACTGAGCTGAAGGAGTGCATGGTGGTCAAGACGTAC- CTGATTTCGTCCATCCCGCT GCAAGGCGCCTTCAACTACAAGTACACTGCCTGCCTCTGTGA- CGACAACCCCAAGACCTT TTACTGGGACTTCTACACCAATAGAACTGTCCAGATTGCTGCCG- TGGTGGATGTGATCAG GGAATTGGGAATTTGCCCCGACGATGCGGCCGTGATTCCGAT- CAAGAACAACCGCTTCTA TACCATCGAGATCCTTAAAGTGGAATGAGAATTC (SEQ ID NO: 30) Vetor de Expressão de PIP:

[00953] Um vetor de expressão de mamífero codificando PIP humano foi gerado através de métodos de clonagem padrão. Um frag- mento contendo a sequência de sinal de cadeia kappa Ig de camundongo seguido por uma sequência MHHHHH (SEQ ID NO: 31), então PIP maduro com sítios 5'-Nhel (seguido pela sequência Kozak) e 3'- EcoRI foi otimizado e sintetizado (DNA2.0). Esta sequência foi então clonada em sítios 5'-Nhel e 3'-EcoRI de um vetor baseado em pcD- NA3.1 (Invitrogen) a jusante do promotor de CMV.

Expressão e Purificação de PIP:

[00954] O DNA de plasmídeo de expressão de PIP foi transfectado em células HEK293T em uma densidade de 1 x 106 células por ml usando métodos de polietilenoimina padrão. Culturas de 500 ml foram então cultivadas em FreeStyle 293 Medium (Life Technologies) em frascos de 3 L por 4 dias a 37° C com uma atmosfera umidificada de CO2 8%. Proteína PIP foi purificada de meio condicionado clarificado.

[00955] onde M-His-PIP tem a SEQ ID NO: 12 e "M-his" é MHHH- HHH (SEQ ID NO: 17).

Conjugação:

[00956] Uma solução de 10 mg/mL de construto ligante de ácido graxo No. 1 foi preparada em H2O. M-His-hPIP (0,700 mL, 0,048 µmol) foi diluído com tampão de NaOAc 30 mM pH 4 (619 µL, 0,5 mg/mL de reação) e Intermediário 37 (0,081 mL, 0,484 µmol) foi adicionado. A reação foi misturada em temperatura ambiente por 18 horas ponto no qual análise LCMS mostrou conversão de 70% para produtos +1 (50%) e +2 (20%). O material foi então trocado para tampão de PBS 1X usando filtro centrífugo Amicon MWCO 3 kDa através de diluição e concentração da reação 5 vezes para um volume de 350 µL. A con-centração foi medida através de A280 (13850 cm-1M-1, 14472 g/mol) ser 1,7 mg/mL (70%). LCMS Método L, Tr= 1,46 min; MS [M+1]: observado: 14472, calculado: 14476. Tr= 1,57 min; MS [M+1 +1FA desglicosi- lado]: observado: 16025, calculado: 16030. Tr= 1,69 min; MS [M+1 +2FA desglicosilado]: observado: 17578, calculado: 17584. Construto I-37 ligante de M-His-hPIP + de ácido graxo: Exemplo 30 foi testado como a mistura abaixo

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PARA MAPEAMENTO DE PIP Proteólise da Amostra

[00957] Aproximadamente 10 µg de proteína foram dissolvidos para um volume final de 25 µL em ureia 6 M, ditiotreitol 10 mM, EDTA 5 mM e Tris-HCl 50 mM (pH = 8,0) e mantidos a 37° C por 1 hora para reduzir ligações dissulfeto. Iodoacetamida (500 mM, 1 µL) foi adicionada a tióis livres de alquilato e a solução foi deixada ficar em temperatura ambiente por 1 hora no escuro. A solução foi então diluída 6X com Tris_HCl 50 mM (pH = 8,0), LysC (1 ug, Promega) ou mistura de Trip- sina/Lys C (1 ug, Promega) foi adicionada e a solução foi mantida a 37° C de um dia para o outro para digerir a proteína. Ácido fórmico (98%, 2 µL) foi adicionado para extinguir proteólise e a mistura de pep- tídeo resultante foi analisada através de LC-MS/MS.

Análise LC-MS/MS

[00958] Mapeamento de peptídeo foi feito usando um Thermo Dionex µLtimate 3000 HPLC acoplado com um espectrômetro de massa Bruker Maxis Impact Q-TOF. A MS foi controlada usando Bruker software Compass v 1.7 e Bruker otofControl v. 3.4, com parâmetros de instrumento ajustados como segue: faixa de massa 300-2,000 Da; tensão de pulverização 4,0 kV; temperatura capilar 200°C; fluxo de gás de secagem 5,0 L/min. Fracionamento foi feito com uma coluna Waters ACQUITY UPLC BEH130 C18 (2,1x100 mm, 1,7 µm) mantida a 40o C. As fases móveis foram ácido fórmico 0,1% em água e acetonitrila, respectivamente, e a taxa de fluxo foi 100 µL/min. O gradiente usado foi 0-2 min, B 2%; 2-3 min, B 2%-8%; 3-10 min, B 8%-29%; 10-14 min, B 29%-33%; 14-16 min, B 33%- 37%; 16-20 min, B 37%-73%; 20-22 min, B 73%-95%; 22-25 min, B 95%; 25-26 min, B 95%-2%; 26-30 min, B 2%. Processamento de dados foi feito usando um Bruker DataAnalysis v. 4.2.

[00959] O experimento de mapeamento indicou que a adição de ácido graxo a MH6-PIP ocorre preferivelmente no terminal N como evidenciado por [ag-MHHHHHHQDNTRK](SEQ ID NO: 32), massa: 3265,76 Da, Carga: 4, Tr= 23,4 min, observado m/z: 817,44, esperado m/z: 817,45.

[00960] Um grau pequeno de adição de ácido graxo ocorre em lisina K42 como evidenciado por fragmento de peptídeo [SVRPNDEVTAVLAVQTELK(fa)ECMVVK] (SEQ ID NO: 32), massa: 4366,45 Da, Carga 3, Tr= 23.5 min, observado m/z:1456,49, esperado m/z: 1456,49. Adição do ácido graxo em K42 bloqueia clivagem de tripsina adjacente a esta lisina, servindo para confirmar localização da adição. Exemplo 31: Conjugação de NPFF com ácido graxo usando química Click Etapa 1: Preparação de manejo de química click NPFF Calc. MH+ 1258,8

[00961] A uma solução de NPFF (Alfa Aesar, J66509, 5 mg, 3,82 µmol) em DMSO (1 mL) foi adicionada trietilamina (5,32 µL, 0,038 mmol) e então (2,5-dioxopirrolidin-1-il) carbonato de (1R,8S,9r)- biciclo [6.1.0]non-4-in-9-ilmetila (1,335 mg, 4,58 µmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente. Quando do término a mistura de reação foi levada como um produto bruto para a etapa de reação seguinte. Etapa 2: Conjugação

[00962] À mistura de reação bruta da Etapa 1 foi adicionado Intermediário 6 (I-6). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente. Quando do término a mistura de reação foi purificada usando cromatografia de fase reversa (Sistema: Agilent Bioinert SystemDate; Coluna: Coluna Waters Protein BEH C4, 300 Angstrom, 5um, 10x250mm; Coluna para desenvolivmento do método UPLC é BEH C4m, 300A, 1,7um, 2,1x50mm; Fase Móvel: gradiente ACN 46 56% em 6 min, Modificado com TFA 0,1% A: Água, B: Acetonitrila; Taxa de Fluxo: 2,0 mL/min; Tempo de realização: 15 min; Coleta de fração: UV 210nm) para fornecer o composto titulado, como um sólido branco como um sal de TFA;

[00963] LCMS: Método S: ELSD: Rt 1,46 min; MS m/z 928.3 [(M/3)+H]+

[00964] Pode ser visto que os conjugados da invenção têm eficácia similar ou aperfeiçoada comparado com a biomolécula não conjugada, mas ainda o conjugado da invenção tem estabilidade no plasma aper-feiçoada comparado com a biomolécula não conjugada. Os conjugados nos exemplos acima foram verificados ter uma estabilidade no plasma maior do que 5 h, maior do que 10 h, maior do que 20 h, maior do que 30 h, maior do que 40 h e em alguns casos maior do que 50 h.

[00965] Tendo então descrito modalidades exemplares da presente invenção, deve ser notado por aqueles de habilidade comum na técnica que as descrições são apenas exemplares e que várias outras alternativas, adaptações e modificações podem ser feitas dentro do escopo da presente invenção. Desta maneira, a presente invenção não é limitada às modalidades específicas como aqui ilustrado.

Claims (23)

1. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende uma biomolécula ligada a um ácido graxo através de um ligante, sendo que a biomolécula é MH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 4), MHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 6), AHA(200- 308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7), AH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 5), MHHHHHHM-hGDF15 (SEQ ID NO: 2), MHHHHHH-hGDF15 (SEQ ID NO: 1), ou his-hGDF15; ou um dímero do mesmo, sendo que his- hGDF15 é hGDF15(197-308) no qual um marcador, compreendendo 1 a 6 aminoácidos de histidina e, opcionalmente, 1 ou 2 aminoácidos de metionina, foi adicionado ao N-terminal de hGDF15; ou um díme- ro do mesmo, e sendo que o ácido graxo apresenta a Fórmula A1 que se-gue: na qual R1 é CO2H; R2 e R3 são independentemente um do outro H, OH, CO2H, -CH=CH2 ou -C=CH; n, m e p são independentemente um do outro um inteiro entre 6 e 30; ou uma amida, éster ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o ácido graxo é selecionado dentre: as quais Ak3, Ak4, Ak5, Ak6 e Ak7 são independentemente um (Cs- 2o)alquileno, R5e R6 são independentemente (Cs-2o)alquila linear, ou uma amida, um éster ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac-terizado pelo fato de que o ácido graxo é selecionado dentre: ou uma amida, éster, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende alquila, alquenila, cicloalquila, arila, heteroarila, heterociclila, polieti- leno glicol, um ou mais aminoácidos naturais ou não naturais, ou combinação dos mesmos, onde cada um dentre alquila, alquenila, cicloalquila, arila, heteroarila, heterociclila, polietileno glicol e/ou os aminoácidos naturais ou não naturais são opcionalmente combinados e ligados juntos ou ligados à biomolécula e/ou à porção de ácido graxo através de um grupo químico selecionado de -C(O)O-, - OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, - NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- ou =NH-N(alquila)-; ou uma amida, éster, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende uma porção de oligo etileno glicol não ramificada de Fórmula: nas quais y é 0 a 34; ou uma amida, um éster, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende uma porção heterocíclica de uma das Fórmulas que seguem: nas quais r é um inteiro de 0 a 2, e s é um inteiro de 0 a 3; ou uma amida, um éster, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um ou mais aminoácidos independentemente selecionados dentre histidina, metionina, alanina, glutamina, asparagina e glicina; ou uma amida, um éster, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a biomolécula ligada ao ácido graxo através de um ligante apresenta uma das Fórmulas que seguem: sendo que, nas Fórmulas C e D, ambas as unidades mo- noméricas de his-hGDF15 ou de hGDF15* são ligadas à porção de ácido graxo através do ligante em ambos os N-terminais; ou sendo que, nas Fórmulas E e F, apenas uma das unidades monoméricas de his-hGDF15 ou hGDF15* é ligada à porção de ácido graxo através do ligante no N-terminal; e hGDF15* é MH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 4), MHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 6), AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7), AH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 5), MHHHHHHM- hGDF15 (SEQ ID NO: 2) ou MHHHHHH-hGDF15 (SEQ ID NO: 1); e s é um inteiro entre 20-30; e a linha entre as 2 unidades monoméricas de his-hGDF15 ou as 2 unidades monoméricas de hGDF15* representam uma ligação dissulfeto.

9. Mistura, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado, como definido na reivindicação 8, apresentando a Fórmula C, e o conjugado, como definido na reivindicação 8, apresentando a Fórmula E, ou uma mistura compreendendo o conjugado, como definido na reivindicação 8, apresentando a Fórmula D, e o conjugado, como definido na reivindicação 8, apresentando a Fórmula F.

10. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a biomolécula é AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7) ou um dímero da mesma.

11. Conjugado, ou uma amida, ester ou sal farmaceutica- mente do mesmo, de acordo com a reivindicação 8 ou 10, caracterizado pelo fato de que o conjugado apresenta Fórmula G ou Fórmula H: nas quais AHA-hGDF15 é AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7), e o ácido graxo é ligado através do ligante no N-terminal de uma ou de duas unidades monoméricas, e sendo que a linha entre as duas unidades AHA-hGDF15 representa uma ligação dissulfeto.

12. Mistura, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado, como definido na reivindicação 11, apresentando a Fórmula G, e o conjugado, como definido na reivindicação 11, apresentando a Fórmula H.

13. Mistura de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a mistura é uma razão molar de 1:1 de um conjugado de Fórmulas G e um conjugado de Fórmula H.

14. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 10 e 11; ou uma mistura de conjugados, como definida na reivindicação 9, 12 e 13, ou uma amina, um éster, ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio selecionado de distúrbios ou doenças metabólicos, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica/esteatoepatite e outras doenças hepáticas progressivas, resistência à insulina, hiperinsuli- nemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastroparese e outros distúrbios metabólicos, em um indivíduo com necessidade do mesmo.

15. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi cações 1 a 8, 10 e11, ou uma mistura de conjugados, como definida na reivindicação 9, 12 e 13, ou uma amida, um éster, ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.

16. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 8, 10 e 11, ou uma mistura de conjugados, como definida na reivindicação 9, 12 e 13, ou uma amida, um éster de um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou na prevenção de distúrbios ou doenças me-tabólicos, diabetes, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoóli- ca/esteatoepatite e outras doenças hepáticas progressivas, resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, sín- drome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, falência cardíaca, doença cardíaca coronária, complicações diabéticas (incluindo, mas não limitado a, doença renal crônica), neuropatia, gastroparese e outros distúrbios metabólicos.

17. Combinação, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 10 e 11, ou uma mistura de conjugados, como definida na reivindicação 9, 12 e 13; e um ou mais coagentes terapeuticamente ativos.

18. Combinação, de acordo com a reivindicação 17, ca-racterizada pelo fato de que o coagente é selecionado dentre agente antidiabético, agente hipolipidêmico, agentes antiobesidade, agentes anti-hipertensivos e agonistas de receptores de ativador de proli- ferador de peroxissoma.

19. Combinação, de acordo com a reivindicação 18, carac-terizada pelo fato de que o coagente é selecionado dentre insulina, derivados e miméticos de insulina; secretagogos de insulina; gliburi- da, Amarila; ligantes de receptor de sulfonilureia insulinotrópico; ti- azolidinodionas, pioglitazona, balaglitazona, rivoglitazona, netoglita- zona, troglitazona, englitazona, ciglitazona, adaglitazona, darglitazo- na, inibidores de proteína de transferência do éster de colesterila (CETP), inibidores de GSK3 (cinase-3 de glicogênio sintase); ligantes de RXR; inibidores de co-transportador de glicose dependente de sódio; inibidores de glicogênio fosforilase A; biguanidas; inibidores de alfa-glicosidase, GLP-1 (peptídeo-1 tipo glucagon), análogos de GLP- 1, miméticos de GLP-1; inibidores de DPPIV (dipeptidil peptidase IV); inibidores da 3-hidróxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) redu- tase; inibidores de esqualeno sintase; ligantes de FXR (receptor de farnesoide X), LXR (receptor X hepático); colestiramina; fibratos; ácido nicotínico, aspirina; orlistate ou rimonabante; diuréticos de alça, furosemida, torsemida; inibidores da enzima de conversão de angio- tensina (ACE); inibidores da bomba da membrana de Na-K-ATPase; inibidores de neutralendopeptidase (NEP); inibidores de ACE/NEP; antagonistas de angiotensina II; inibidores de renina; bloqueadores de receptor f-adrenérgico; agentes inotrópicos, dobutamina, milrino- na; bloqueadores de canal de cálcio; antagonistas de receptor de al- dosterona; inibidores de aldosterona sintase; fenofibrato, pioglitazo- na, rosiglitazona, tesaglitazar, BMS-298585 e L-796449.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 10 e 11; ou uma mistura de conjugados, como definida na reivindicação 9, 12 ou 13, ou uma amida, um éster, ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo e um ou mais veículos farmaceuti- camente aceitáveis.

21. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula: na qual R1 é CO2H; R2 e R3 são independentemente um do outro H, OH, CO2H, -CH=CH2 ou -C=CH; contanto que R2 e R3 não sejam idênticos; n e m são independentemente um do outro um inteiro entre 6 e 30; ou uma amida ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

22. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre o grupo consistindo em: ou uma amida, ester ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

23. Composto, de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado pelo fato de que é selecionado dentre: