JP2018507187A - 改善された半減期を有する合成アペリン脂肪酸コンジュゲート - Google Patents

Abstract

本発明は、式（Ｉ）：Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ＊−Ｆ （Ｉ）［式中、「＊」で標識された２つのシステインアミノ酸は、それらの側鎖のチオール官能基の間にジスルフィド結合を形成している］の合成ポリペプチド、またはそのアミドもしくはエステル；と、から選択される脂肪酸であって、そのカルボン酸官能基のうちの１つを介して、任意選択的にポリエチレングリコールリンカーを介して、ペプチドのＮ末端に共有結合によって連結している、脂肪酸とを含む、コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。コンジュゲートは、ＡＰＪ受容体のアゴニストである。本発明はまた、本発明のコンジュゲートの製造方法、ならびに、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症の治療または予防などの、その治療的使用に関する。本発明はさらに、薬理活性薬剤の組合せおよび医薬組成物を提供する。

Description

本発明は、ＡＰＪアゴニストポリペプチドと脂肪酸部分のバイオコンジュゲートである半合成生物学的分子を含む組成物に関する。特に、本発明のバイオコンジュゲートは、ＡＰＪアゴニスト活性を保持しながら、その対応する裸のポリペプチドに比べておよび／または先に記載されたアペリンバイオコンジュゲートに比べて、ペプチダーゼの作用によるタンパク質分解性分解に対する耐性がより高い。本発明はさらに、前記組成物の製造方法および前記組成物を心血管疾患治療において薬学的活性剤として使用する方法に関する。

西欧諸国における心不全の発生率は、６５才を過ぎた成人のおよそ１００人に１人である。最も一般的な病態は、心収縮性、したがって、心拍出量、すなわち、どちらかの心室によって排出される有効血液量が徐々に慢性的に不足することである。慢性心不全の患者は、代償不全、すなわち、心臓が十分な血液循環を維持できないという急性エピソードを伴う場合があり、その場合、心収縮性はさらに低下する。米国だけで、「急性代償不全心不全」（ＡＤＨＦ）での入院は、毎年約５０万件である。

ＡＤＨＦの現行の療法としては、利尿薬、血管拡張薬、およびイノトロープが挙げられ、これらは、心収縮性を直接増大させる。現用の静脈内イノトロープ（ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、レボシメンダン）は、不整脈などの有害事象および長期死亡率の増大と関連付けられているにもかかわらず、急性の状況で使用される。こうした傾向があることは、これらを慢性心不全に適用する妨げとなっている。ジゴキシンは、経口イノトロープ（oral inotrope）であるが、狭い治療指数、潜在的な催不整脈性の増大、および腎不全における禁忌による制約がある。

催不整脈性または死亡の傾向なしに心収縮性を増大させる心不全の療法は、ＡＤＨＦ用に差し迫って求められてはいるが、慢性心不全における未対応の膨大な医学的要求にも対処できるはずである。

アペリンは、アペリン受容体、アンジオテンシン様１受容体、アンジオテンシンＩＩ様１受容体などとも呼ばれる、以前はオーファンであったＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ＡＰＪの、内因性リガンドである。アペリン／ＡＰＪ経路は、心血管系において広く発現され、アペリンは、前臨床モデルにおいて、有益な主要な心血管効果を示している。ヒトにおける急性アペリン投与は、末梢および冠動脈の血管拡張を引き起こし、心拍出量を増加させる（Circulation. 2010; 121:1818-1827）。結果として、ＡＰＪアゴニズムは、心不全患者にとっての重要な治療ターゲットとして浮上している。アペリン受容体ＡＰＪの活性化は、現行の療法の傾向を伴わずに、心収縮性を増大させ、心臓保護になると考えられている。しかし、自然のアペリンは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期および作用持続期間が非常に短い。非常に短い半減期は、急速な血清クリアランス、およびペプチダーゼの作用によるタンパク質分解性分解を原因とする、このような治療用内因性ペプチド送達の、広く認められている主要な難題である。

この欠点を克服するために現在使用されている一手段は、一部の治療用ペプチドが分解されるとしても、十分治療上有効なままとなるように、問題の治療用ペプチドを高い投薬量で患者に投与することである。しかし、この方法は、患者にとって快適ではない。大半の治療用ペプチドは経口投与することができないので、治療用ペプチドは、絶えず注入する、静脈内注射によって頻回注入する、または皮下注射という不便な経路によって頻回投与することのいずれかの必要があることになる。頻回投与が必要となる結果、潜在的可能性のある多くのペプチド治療薬には、許容されない非常に突出した治療コストが伴う。分解された多量のペプチドの存在は、望ましくない副作用も生じかねない。

投与の苦痛および高いコストは、魅力的な生物活性プロファイルを有する大半の治療用ペプチドが、薬物候補として開発されることのない、２つの理由である。

したがって、ペプチドの半減期を延長する１つの手法は、生物学的活性を依然として維持しながら、その分解速度を緩めるように、治療用ペプチドを修飾することである。そのような合成的に修飾されたポリペプチドは、米国特許第８，６７３，８４８号明細書（代理人整理番号ＰＡＴ０５４９６１−ＵＳ−ＮＰ）に記載されている。別の手法としては、ペプチドを、腎臓を介したその排出を妨げ得る脂肪酸部分などの１種または複数の分子にコンジュゲートさせることにより、クリアランスの速度を減速することが挙げられる。そのような脂肪酸コンジュゲートの例は、米国仮特許出願第６２／０８２３２７号明細書（ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ２）、米国特許出願第１４／３３６，２９０号明細書（ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＮＰ）および米国特許出願第１４／３３６，２６２号明細書（ＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＮＰ）に記載されている。

しかし、そのようなバイオコンジュゲートは、依然としてプロテアーゼ活性を受けやすいかまたはもはやそれらのコンジュゲートされていない類似体と同等に活性ではない場合がある。

したがって、修飾ペプチドの治療上の利点を依然として保持しつつ低い毒性を維持しながら、ｉｎ ｖｉｖｏでの作用持続時間をより長くするために半減期が延長されている、修飾された治療用ペプチドが求められている。

本発明は、問題の治療用ペプチドまたはポリペプチド、すなわち、ＡＰＪアゴニストを修飾することにより、身体内でのペプチド分解の問題を克服することを対象とする。

したがって、本発明の目的は、ａ）以下の式（Ｉ）：
ａ．以下の式（Ｉ）：
Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ^＊−Ｆ （Ｉ）
［式中、
「^＊」で標識された２つのシステインアミノ酸は、それらの側鎖のチオール官能基の間にジスルフィド結合を形成している］
を有するＡＰＪアゴニストペプチド、またはそのアミドもしくはエステル、またはそれと実質的に等価なペプチド；と
ｂ．脂肪酸であって：

から選択され、そのカルボン酸官能基のうちの１つを介して、任意選択的にポリエチレングリコールリンカーを介して、ペプチドのＮ末端に共有結合によって連結している、脂肪酸と
を含む、新規コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供することである。

一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、野生型アペリンに優るおよび／または裸の（コンジュゲートされていない）アペリン類似体（たとえば、Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ^＊−Ｆ）に優るおよび／または他の先に記載されたアペリンコンジュゲートに優る以下の改良点、すなわち、半減期の延長、投与後および／または可溶化後の分解に対するより強い免疫性、ＡＰＪ受容体におけるより大きなアゴニスト活性のうちの少なくとも１つを有する。したがって、本発明のアペリンコンジュゲートは、心不全などの心血管疾患、心不全と関連する障害および状態、ならびにＡＰＪ受容体活性の活性化に反応を示す障害および状態の治療または予防に特に有用である。

上で挙げた式Ｉのアミノ酸残基のいずれも、本発明のコンジュゲートが、機能活性および構造特性（たとえば、半減期の延長、分解からの保護、立体配座拘束）を依然として保持するという前提で、保存的に置換されていてもよい。許容される保存的なアミノ酸置換の原理および例は、本明細書でさらに説明する。

半減期延長性部分である脂肪酸は、本発明のコンジュゲートの構成部分の生物学的機能を増強するように、かつ／またはその妨げとならないようにして付着させる。たとえば、脂肪酸部分を、（リンカーがないときには）そのカルボン酸官能基のうちの１つを介してペプチドのＮ末端のアミノ官能基に付着させ、アミド結合を形成する。代わりに、脂肪酸部分を、（リンカーがあるときには）そのカルボン酸官能基のうちの１つを介してＰＥＧリンカーのアミノ官能基に付着させる。

一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、心不全と関連する障害もしくは状態、またはＡＰＪ受容体活性の活性化（もしくはアゴニズム）に反応を示す障害の治療または予防に特に有用である。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症の治療において特に有用である。

好ましい実施形態では、本発明のアペリンコンジュゲートは、急性非代償心不全（ＡＤＨＦ）の治療において有用である。別の好ましい実施形態では、アペリンコンジュゲートは、慢性心不全の治療において有用である。

別の実施形態では、本発明は、そのような治療の必要のある対象において、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、対象におけるＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患が治療されるような有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含む方法に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のコンジュゲートを製造する方法に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートと、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートと、１種または複数の治療活性薬剤の医薬合剤とを含む組合せに関する。

別の実施形態では、本発明は、その必要のある対象においてＡＰＪ受容体を活性化させる方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含む方法に関する。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明において解明される。

皮下投薬後の実施例１および４の化合物のマウス血漿中曝露量（plasma exposure）プロフィールを表す。

定義
本出願を説明する目的のために、別段指定しない限り、また相応しい場合は常に、以下の定義が適用され、単数形で使用する用語は、複数形の語も包含し、逆の場合も同様である。

本明細書で使用するとき、「ＡＰＪ受容体の変調に反応を示す障害または疾患」、「ＡＰＪの変調に反応を示す障害および状態」、「ＡＰＪ受容体活性の変調に反応を示す障害および状態」、「ＡＰＪ受容体活性の活性化（またはアゴニズム）に反応を示す障害」および同様の用語は、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症を包含する。

用語「ＡＰＪ」（「アペリン受容体」、「アンジオテンシン様１受容体」、「アンジオテンシンＩＩ様１受容体」などとも呼ばれる）とは、３８０残基、７回膜貫通ドメインのＧｉ共役型受容体を指し、その遺伝子は、ヒトの１１番染色体の長腕上に位置する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５１５２．１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５１６１によってコードされる）。ＡＰＪは、１９９３年に、変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡから初めてクローン化され（O’Dowd et al. Gene, 136:355-60、1993）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体と有意に相同的である。しかし、この相同性にもかかわらず、アンジオテンシンＩＩは、ＡＰＪを結合しない。この内因性リガンドは、長年の間オーファンであったが、単離され、アペリンと命名された（Tatemoto et al., Biochem Biophys Res Commun 251, 471-6 (1998)）。

本明細書で使用するとき、「ＡＰＪ受容体活性の活性化」または「ＡＰＪ受容体の活性化」とは、ＡＰＪ受容体活性の増大を指す。ＡＰＪ受容体活性の活性化は、たとえば、本発明のコンジュゲートの投与による、ＡＰＪ受容体の「アゴニズム」とも呼ぶ。

用語「アペリン」は、７７残基のプレタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ ００５９１０９．３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ ０１７４１３．３によってコードされる）を指し、これがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２になる。「アペリン−３６」と呼ばれる全長成熟ペプチドは、３６アミノ酸を含むが、最も強力なアイソフォームは、「Ｐｙｒ−１−アペリン−１３またはＰｙｒ^１−アペリン−１３」と呼ばれる、ピログルタミン酸化型のアペリン１３量体（アペリン−１３）である。種々のアペリン型は、たとえば、米国特許第６，４９２，３２４Ｂ１号明細書に記載されている。

用語「ＡＰＪアゴニストペプチド」または「アペリンペプチド」は、互換的に使用され、分解を最小化し、血清安定性を高め、ならびにより良い発展性プロフィールを提供するために改変されている、上で規定したとおりの「アペリン」を含む。ある特定の実施形態では、「ＡＰＪアゴニストペプチド」または「アペリンペプチド」は、式（Ｉ）のペプチドを含む。

本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、互いに連結した２個以上のアミノ酸を指すのに、互換的に使用する。当業界で受け入れられている３文字または１文字略語を使用して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表す。「Ｄ」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。１文字略語が大文字であるとき、略語は、Ｌ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字であるとき、略語は、Ｄ−アミノ酸を指す。集まりまたは連なりまたはアミノ酸略語を使用して、ペプチドを表す。ペプチドは、Ｎ末端を左側にして示し、配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって記す。

本発明のペプチドは、非天然アミノ酸（すなわち、自然界では発生しない化合物）を含んでおり、当業界で知られているような他のアミノ酸類似体をその代わりとして用いてもよい。

ある特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003、Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003、Wang et al., Science 292:498-500, 2001、Zhang et al., Science 303:371-373, 2004、または米国特許第７，０８３，９７０号に記載の技術によって導入することができる。簡潔に述べると、こうした発現系の一部には、部位特異的突然変異誘発が関与して、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに、アンバーＴＡＧなどのナンセンスコドンが導入される。次いで、このような発現ベクターは、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用することのできる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸を積み込んでいる。

当業者なら、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの配列において、その活性を必然的に低下させることなく、種々のアミノ酸置換、たとえば、保存的アミノ酸置換がなされてもよいことは理解されよう。本明細書で使用するとき、「その置換基として一般に使用されるアミノ酸」は、保存的置換（すなわち、化学的特徴が同等であるアミノ酸での置換）を包含する。保存的置換の目的で、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性（親水性）天然アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。アミノ酸置換の例としては、その対応するＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を用いるもの、ホモシステインもしくは含チオール側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにシステインを用いるもの、ホモリシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、オルニチン、もしくは含アミノ側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにリシンを用いるもの、またはノルバリンの代わりにアラニンを用いるものなどが挙げられる。

本明細書で使用する用語「アミノ酸」とは、その構造でそうした立体異性体型が可能である場合、すべて、そのＤおよびＬ立体異性体の、自然に存在するアミノ酸、天然でないアミノ酸、アミノ酸類似体、および、自然に存在するアミノ酸と同様にして機能するアミノ酸模倣物を指す。アミノ酸は、本明細書では、その名称、一般に知られているその３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで呼ぶ。

用語「自然に存在する」とは、自然界で見出され、人の手で操作されていない材料を指す。同様に、「自然に存在しない」や「自然でない」などは、本明細書で使用するとき、自然界で見出されない、または人の手で構造が改変されもしくは合成されている材料を指す。アミノ酸に関連して使用するとき、用語「自然に存在する」とは、２０種の通常のアミノ酸（すなわち、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）を指す。

本明細書で使用する用語「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」は、同じであろうと異なっていようと、任意の生物中で、任意の生物からの未改変または改変遺伝子を使用して、生合成によって生成することのできないアミノ酸構造を、互換的に表すものである。これら用語は、自然に存在する（野生型）アペリンタンパク質配列または本発明の配列中に存在しないアミノ酸残基を指す。これらの用語は、限定はしないが、２０種の自然に存在するアミノ酸の１つ、セレノシステイン、ピロリシン（Ｐｙｌ）、またはピロリン−カルボキシ−リシン（Ｐｃｌ、たとえば、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１０／４８５８２に記載のとおり）でない、改変アミノ酸および／またはアミノ酸類似体を包含する。このような非天然アミノ酸残基は、自然に存在するアミノ酸の置換によって、および／または自然に存在する（野生型）アペリンタンパク質配列もしくは本発明の配列への非天然アミノ酸の挿入によって導入することができる。非天然アミノ酸残基は、アペリン分子に所望の機能性、たとえば、機能性部分（たとえば、ＰＥＧ）を連結する能力が付与されるように組み込むこともできる。アミノ酸に関連して使用するとき、記号「Ｕ」は、本明細書で使用される「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」を意味するものとする。

加えて、このような「天然でないアミノ酸」をタンパク質に組み込むのに、改変ｔＲＮＡおよび改変ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）が必要であることも理解される。こうした「選択された」ｔＲＮＡ／ＲＳ直交対は、Ｓｃｈｕｌｔｚらが開発した選定方法によって、またはランダムもしくは標的突然変異によって生み出される。例として、ピロリン−カルボキシ−リシンは、ある生物から宿主細胞に移された遺伝子によって生合成で生成され、また天然のｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子を使用してタンパク質に組み込まれるので、「天然アミノ酸」であるが、ｐ−アミノフェニルアラニン（Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9を参照されたい）は、生合成で生成されるとはいえ、「選択された」ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンセターゼ直交対によってタンパク質に組み込まれるので、「天然でないアミノ酸」である。

改変コードアミノ酸としては、限定はしないが、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ｂｅｔａ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロプリオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、ａｌｌｏ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、ａｌｌｏ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが挙げられる。用語「アミノ酸」は、ある特定の生物における代謝産物であるが、タンパク質への組み込みについては遺伝暗号によってコードされていない、自然に存在するアミノ酸も包含する。このようなアミノ酸として、限定はしないが、オルニチン、Ｄ−オルニチン、およびＤ−アルギニンが挙げられる。

本明細書で使用する用語「アミノ酸類似体」とは、自然に存在するアミノ酸と同じ基礎化学構造、すなわち、単なる例として、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα−炭素を有する化合物を指す。アミノ酸類似体には、可逆的もしくは不可逆的に化学的ブロックがなされ、またはそのＣ末端カルボキシ基、そのＮ末端アミノ基、および／もしくはその側鎖官能基が化学的に修飾されている、天然および天然でないアミノ酸が含まれる。そのような類似体として、限定はしないが、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホン、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシン、およびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。

本明細書で使用するとき、用語「アミド」とは、Ｃ末端におけるカルボン酸基のアミド誘導体（たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ_１〜２アルキルフェニル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＮＨＢｎ、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ_１〜６アルキル）_２）を指す。

用語「アミド」とは、Ｎ末端におけるアミノ基の誘導体（たとえば、脂肪酸のカルボン酸官能基はアペリンペプチドのＮ末端におけるアミノ官能基とアミド結合を形成する）も指す。

本明細書で使用するとき、用語「エステル」とは、Ｃ末端におけるカルボン酸基のエステル誘導体（たとえば、−ＣＯＯＲ）を指し、エステルのＲは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１〜６アルキル基、シクロペンチルやシクロヘキシルなどのＣ_３〜８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６〜１０アリール基、Ｃ_６〜１０アリール−Ｃ_１〜６アルキル基、たとえば、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_１〜２アルキル基およびα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１〜２アルキル基などを指す。経口投与用のエステルとして一般に使用されるピバロイルオキシメチルエステルなども挙げることができる。式ＩのＡＰＪアゴニストペプチドがＣ末端以外の位置に追加のカルボキシル基またはカルボキシレート基を有するとき、こうした基がアミド化またはエステル化されているポリペプチドも、本発明のポリペプチドの範疇に入る。そうした場合において、エステルは、たとえば、上述のＣ末端エステルと同じ種類のエステルでよい。

用語「コンジュゲート」と「バイオコンジュゲート」は、互換的に使用され、ＡＰＪアゴニストポリペプチドまたは式Ｉのポリペプチドと脂肪酸部分とが、任意選択のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して共有結合によって付着した結果として生成したエンティティを指すものである。

用語「半減期の延長」または「血清半減期を延長する」または「半減期を延長すること」とは、修飾された生物学的活性分子（たとえば、アペリン１３または類似体）の、その非修飾型（または裸の形態のペプチド）と比べた、循環半減期の肯定的な変化の意味である。血清半減期は、生物学的活性分子が投与された後の様々な時点で血液サンプルを採取し、各サンプル中のその分子の濃度を求めることにより測定される。血清濃度の変化を経時的に測定することで、修飾された分子（たとえば、コンジュゲートした分子）の血清半減期の算出が可能になる。修飾された分子（たとえば、コンジュゲートした分子）の血清半減期を、非修飾分子（たとえば、アペリン１３またはその類似体）と比較することにより、血清半減期またはｔ１／２の相対的な延長を明らかにすることができる。延長は、少なくとも２倍であることが望ましいが、より短い延長も有用となり得る。

本発明のコンジュゲート：
本発明の種々の実施形態を本明細書に記載する。各実施形態において明記する特色を、明記された他の特色と組み合わせて、別の実施形態としてもよいことは、認識されるであろう。

したがって、実施形態１では、本発明は、
ａ． 以下の式（Ｉ）：
Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ^＊−Ｆ （Ｉ）
［式中、
「^＊」で標識された２つのシステインアミノ酸は、それらの側鎖のチオール官能基の間にジスルフィド結合を形成している］
を有するＡＰＪアゴニストペプチド、またはそのアミドもしくはエステル、またはそれと実質的に等価なペプチド；と
ｂ．脂肪酸であって：

から選択され、そのカルボン酸官能基のうちの１つを介して、任意選択的にポリエチレングリコールリンカーを介してペプチドのＮ末端に共有結合によって連結している、脂肪酸と
を含む、コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。

実施形態１Ａでは、本発明は、
ａ． 以下の式（Ｉ）：
Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ^＊−Ｆ （Ｉ）
［式中、
「^＊」で標識された２つのシステインアミノ酸は、それらの側鎖のチオール官能基の間にジスルフィド結合を形成している］
を有するＡＰＪアゴニストペプチド；と
ｂ．脂肪酸であって：

から選択され、そのカルボン酸官能基のうちの１つを介して、任意選択的にポリエチレングリコールリンカーを介してペプチドのＮ末端に共有結合によって連結している、脂肪酸と
を含む、コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩に関する。

実施形態１または１Ａに記載された脂肪酸は、米国仮特許出願第６２／０８２３２７号明細書（ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ２）に記載されている。

任意のポリレチレングリコールリンカー基は、任意選択である。リンカーは、ポリマーの性質のものであり、２つの反応性基／官能基を含んでおり、一方が式Ｉのポリペプチドと、他方が脂肪酸部分と反応し得る、ポリレチレングリコール部分である。

実施形態２では、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーが存在し、式（ＩＩＩ）：

［式中、
ｙは、１〜３０であり、ＰＥＧリンカーのカルボニル官能基は、式（Ｉ）のペプチドのＮ末端におけるアミノ官能基とアミド結合を形成し、ＰＥＧリンカーのアミノ官能基は、脂肪酸のカルボン酸官能基のうちの１つとアミド結合を形成している］
のものである、実施形態１または１Ａに従うコンジュゲートに関する。

実施形態３では、本発明は、ポリレチレングリコールリンカーが式（ＩＩＩ）のものであり、ｙが２〜２５である、実施形態１、１Ａまたは２に従うコンジュゲートに関する。

実施形態４では、本発明は、脂肪酸が：

である、先行する実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

実施形態５では、本発明は、脂肪酸が、そのジェミナルなカルボン酸官能基のうちの１つを介して、ＰＥＧリンカーのアミノ官能基に、またはＰＥＧリンカーがない場合には、ペプチドのＮ末端のアミノ官能基に付着している、先行する実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。これは、リンカーまたはペプチドのＮ末端への付着点を示す、以下の式：

によって表される。

実施形態６では、本発明は、脂肪酸が、その末端カルボン酸官能基を介して、ＰＥＧリンカーのアミノ官能基に、またはＰＥＧリンカーがない場合には、ペプチドのアミノ官能基に付着している、実施形態１〜４のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。これは、リンカーまたはペプチドのＮ末端への付着点を示す、以下の式：

によって表される。

実施形態７では、本発明は、以下の：

から選択される、実施形態１または１Ａに従うコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩に関する。

別段指定しない限り、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「ＡＰＪペプチドアゴニスト」などは、式（Ｉ）のポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくは薬学的に許容される塩を指す。

実施形態７Ａでは、本発明のコンジュゲートは：１．野生型アペリン、アペリン−１３、ｐｙｒ−１−アペリン−１３および／または対応する裸の（コンジュゲートされていない）式（Ｉ）のアペリンペプチドもしくはその類似体に比べて、実質的に等価なまたは改良された活性；ならびに／あるいは２．野生型アペリン、アペリン−１３、ｐｙｒ−１−アペリン−１３および／または対応する裸の（コンジュゲートされていない）式（Ｉ）のアペリンペプチドもしくはその類似体に比べて、実質的に同等または改善された血漿安定性を示す。

実施形態７Ｂでは、本発明のコンジュゲートは：１．米国特許出願第１４／３３６，２９３号明細書（ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＮＰ）に記載されているアペリンコンジュゲートに比べておよび／または米国特許出願第１４／３３６，２６２号明細書（ＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＮＰ）に記載されているアペリン脂肪酸コンジュゲートに比べて実質的に同等または改良された活性；ならびに／あるいは２．アペリンコンジュゲートに比べて、より具体的には、米国特許出願第１４／３３６，２９３号明細書（ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＮＰ）および／または米国特許出願第１４／３３６，２６２号明細書（ＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＮＰ）に記載されているアペリンコンジュゲートに比べて同等または改善された血漿安定性を示す。

実施形態７Ａおよび７Ｂの一態様では、血漿安定性の改善は、少なくとも２倍である。

実施形態７Ｃでは、本発明の脂肪酸コンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも３０分である。別の実施形態では、本発明の脂肪酸コンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも６０分である。別の実施形態では、本発明の脂肪酸コンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも５時間、好ましくは少なくとも１０時間、より好ましくは少なくとも１２時間である。

実施形態７Ｄでは、本発明のアペリン脂肪酸コンジュゲートは、ＥＣ_５０が４００ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明のアペリン脂肪酸コンジュゲートは、ＥＣ_５０が３００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１６０ｎＭ未満である。さらに別の実施形態では、本発明のアペリン脂肪酸コンジュゲートは、ＥＣ_５０が１００ｎＭ未満である。

本発明のアペリン脂肪酸コンジュゲートは、実質的にそれと同等なアペリン脂肪酸コンジュゲートも包含する。本発明のアペリン脂肪酸コンジュゲートは、式Ｉによるペプチドに対する同一性が少なくとも約９５％であるアペリンペプチド、またはそのアミド、エステルもしくは塩を含むコンジュゲートも包含する。

本明細書で使用するとき、語句「相同アミノ酸配列」またはその変形形態は、アミノ酸レベルでの相同性が少なくとも指定されたパーセンテージであることを特徴とする配列を指し、「配列同一性」と互換的に使用する。相同アミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換を含んでおり、そのポリペプチドが、同じ結合および／または活性を有する、アミノ酸配列が含まれる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、比較配列との同一性が、９９％までの少なくとも６０％以上であれば、相同である。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、比較配列と、６０までの１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が共通していれば、相同である。一部の実施形態では、相同アミノ酸配列は、５以下または３以下の保存的アミノ酸置換を有する。

相同性は、ポリペプチドレベルでもよい。本発明のペプチドもしくはポリペプチドまたはその一部分と、異なるアミノ酸配列との同一性の程度またはパーセンテージは、２つの配列の配列比較における正確な一致の数を、「発明配列」または「外来配列」のいずれか短い方の長さで割ったものとして算出される。結果は、同一性パーセントとして示す。

式Ｉのアミノ酸配列との相同性が約８０〜９９．９％、好ましくは９０〜９９．９％のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、アペリン−１３および／またはｐｙｒ−１−アペリン−１３および／または対応するコンジュゲートされていないペプチドを凌ぐ血漿安定性を有するコンジュゲートは、本発明のコンジュゲートの範疇に入る。

生物学的に活性なコンジュゲートは、アペリン−１３および／またはｐｙｒ−１−アペリン−１３および／または対応するコンジュゲートされていないペプチドに比べて同様または増強された生物学的特性を有することが理想的であるにもかかわらず、それでもなお、アペリン−１３および／またはｐｙｒ−１−アペリン−１３および／または対応するコンジュゲートされていないペプチドに対して活性レベルがいくらか減少した変異型コンジュゲートは、機能的かつ生物学的な変異型であるとみなされ得る。

用語「実質的に同等」とは、受容体結合活性やシグナル伝達活性などの性質が同等であることを意味する。したがって、受容体結合活性の強度やポリペプチドの分子量などの度合いに差が存在しても差し支えない。

本明細書に記載のポリペプチド、または１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、もしくは挿入によるその実質的同等物は、上の意味でのアミノ酸配列実質的同等物（複数可）を含んだポリペプチドとして挙げることができる。本明細書に記載のポリペプチド、または１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１もしくは２アミノ酸の天然もしくは天然でないアミノ酸での置換によるその実質的同等物は、上の意味でのアミノ酸配列実質的同等物（複数可）を含んだポリペプチドとして挙げることができる。好ましくは、ジサルファー（disulfur）架橋を形成している２つのシステインは置換されていない。さらなる修飾および変更としては、そのようなペプチドを含むコンジュゲートのＡＰＪアゴニスト活性が維持され、血漿安定性がアペリン−１３のピログルタミン酸型に比べて改善されおよび／または対応するコンジュゲートされていないペプチドに比べて改善されている限り、Ｄ−アミノ酸によるＬ−アミノ酸の置換、または限定はしないが、リン酸化、カルボキシル化、アルキル化などの他の変異が挙げられ得る。

式Ｉのペプチドの調製：
式Ｉのアペリンペプチドは、合成化学的方法もしくは組換え法のいずれかによって、または両方の方法を組み合わせて生成することができる。アペリンペプチドおよび／またはペプチド−リンカー構築物は、全長として生成してもよいし、または全長でない断片として合成し、つないでもよい。本発明のペプチドは、ペプチド合成のための、それ自体が知られている手順によって生成することができる。ペプチド合成の方法は、固相合成および液相合成のいずれかのものでよい。すなわち、問題のペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質を構成し得る部分的なペプチドまたはアミノ酸をその残部と縮合させ、生成物が保護基を有するとき、保護基を外し、その後、所望のペプチドを製造することができる。縮合および脱保護の既知の方法としては、以下の文献（１）〜（５）に記載の手順が挙げられる。
（１）M. Bodanszky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966、
（２）Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965、
（３）Nobuo Izumiya et al. Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975、
（４）Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977、および
（５）Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten

反応後、ペプチドは、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などの従来の精製技術を組み合わせて、精製および単離することができる。上述のように単離したペプチドが遊離化合物である場合、既知の方法によってペプチドを適切な塩に変換することができる。逆に、単離された生成物が塩である場合、既知の方法によってペプチドを遊離ペプチドに変換することができる。

ポリペプチドのアミドは、アミド化に適した、ペプチド合成用の樹脂を使用して得ることができる。樹脂としては、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂、塩化２−クロロトリチル樹脂などが挙げられる。このような樹脂を使用して、α−アミノ基および側鎖の官能基が適切に保護されているアミノ酸を、目的のペプチドの配列に従い、それ自体が知られている種々の縮合技術によって樹脂上で縮合させる。一連の反応の終盤に、ペプチドまたは保護されたペプチドを樹脂から外し、必要に応じて保護基を除去し、ジスルフィド結合を形成させて、目的のポリペプチドを得る。

上述の保護されたアミノ酸の縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＣＴＵ、またはたとえばカルボジイミドなどの、ペプチド合成用の様々な活性化試薬を使用することができる。カルボジイミドとしては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。このような試薬を用いた活性化には、ラセミ化防止添加剤、たとえば、ＨＯＢｔまたはＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅを使用することができる。保護されたアミノ酸は、活性化試薬およびラセミ化防止剤と共に、樹脂にそのまま加えてもよいし、または対称酸無水物、ＨＯＢｔエステル、またはＨＯＯＢｔエステルとして予め活性化し、次いで樹脂に加えてもよい。保護されたアミノ酸の活性化または樹脂との縮合のための溶媒は、ペプチド縮合反応に有用であることがわかっている溶媒の中から適正に選択することができる。たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、ピリジン、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、またはこれらの適切な混合物を挙げることができる。

反応温度は、ペプチド結合形成に有用であることがこれまでにわかっている範囲から選択することができ、普通は、約−２０℃〜５０℃の範囲から選択する。活性化型アミノ酸誘導体は、一般に、１．５〜４倍過剰の割合で使用する。ニンヒドリン反応を利用した試験によって、縮合が不十分であるとわかったなら、十分な縮合を実現するために、保護基を除去せずに、縮合反応を繰り返すことができる。繰り返した縮合によって、それでも十分な程度の縮合がなされない場合、未反応のアミノ基を、無水酢酸またはアセチルイミダゾールでアセチル化することができる。

出発材料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、Ｚ、Ｂｏｃ、第三級アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ＣＩ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、またはＦｍｏｃが挙げられる。使用することのできるカルボキシ保護基としては、限定はしないが、上述のＣ_１〜６アルキル、Ｃ_３〜８シクロアルキル、およびＣ_６〜１０アリール−Ｃ_１〜２アルキル、ならびに２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、第三級ブトキシカルボニルヒドラジド、およびトリチルヒドラジドが挙げられる。

セリンおよびトレオニンのヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。前記エステル化に適した基としては、炭素から導かれる基、たとえば、低級アルカノイル基、たとえばアセチルなど、アロイル基、たとえばベンゾイルなど、ベンジルオキシカルボニル、およびエトキシカルボニルが挙げられる。前記エーテル化に適した基としては、ベンジル、テトラヒドロピラニル、および第三級ブチルが挙げられる。チロシンのフェノール性ヒドロキシル基の保護基としては、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、および第三級ブチルが挙げられる。

ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリエチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、およびＦｍｏｃが挙げられる。

出発アミノ酸の活性化型カルボキシル基には、対応する酸無水物、アジ化物、および活性エステル、たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔなどのアルコールとのエステルなどが含まれる。出発アミノ酸の活性化型アミノ基には、対応するホスホルアミドが挙げられる。

保護基の脱離方法としては、パラジウムブラックやパラジウム炭素などの触媒の存在下で水素ガスを使用する触媒還元、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこうした酸の混合物での酸処理、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンでの塩基処理、液体アンモニア中でのナトリウム金属による還元が挙げられる。上述の酸処理による脱離反応は、一般に、−２０℃〜４０℃の温度で実施され、アニソール、フェノール、チオアニソール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、硫化ジメチル、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのカチオンアクセプターを加えて、有利に行うことができる。ヒスチジンのイミダゾール基の保護に使用した２，４−ジニトロフェニル基は、チオフェノールでの処理によって脱離させることができ、トリプトファンのインドール基の保護に使用したホルミル基は、希水酸化ナトリウム溶液または希アンモニア水溶液でのアルカリ処理、ならびに１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール存在下での上述の酸処理によって脱離させることができる。

出発材料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法、使用することのできる保護基、保護基の除去方法、および反応に関与すべき官能基を活性化する方法は、すべて、既知の基および方法の中から公正に選択することができる。

アミド型のポリペプチドを得る別の方法は、Ｃ末端アミノ酸の−カルボキシル基を最初にアミド化するステップと、次いでペプチド鎖を所望の鎖長までＮ側に伸長し、次いで、Ｃ末端ペプチドのα−アミノ基、および目的ポリペプチドの残部を形成することになるアミノ酸またはペプチドのα−カルボキシ基を選択的に脱保護するステップと、α−アミノ基および側鎖官能基が上述の適切な保護基で保護されている２つの断片を、上で挙げたものなどの混合溶媒中で縮合させるステップとを含む。この縮合反応のパラメータは、上述したのと同じものでよい。縮合によって得られた保護ペプチドから、上述の方法によってすべての保護基を除去して、その結果、所望の粗製ペプチドが得られる。この粗製ペプチドを、既知の精製手順によって精製し、主画分を凍結乾燥して、目的のアミド化ポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドのエステルを得るには、Ｃ末端アミノ酸のａ−カルボキシル基を所望のアルコールと縮合させて、アミノ酸エステルを得、次いで、アミド生成について上述した手順に従う。

脂肪酸部分の合成
スキーム１は、実施形態１に従う脂肪酸部分の合成を記載する。

式中、実施形態１に記載するとおり、Ｐ^１およびＰ^２は、カルボン酸保護基、たとえば、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシベンジル、ベンジル、ベンジルオキシ、メトキシメチル、メチルチオメチル、テトラヒドロピラニル、フェナシル、Ｎ−フタルイミド、シンナミル、トリフェニルメチル、９−アンスリルメチル、ピペロニル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルまたは２−アルキル１，３オキサゾリンであり；ＬＧは、脱離基、たとえば、ハロ（たとえば、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）またはトリフルオロメタンスルホニルオキシであり、Ｒ^１がＣＨ_３であり、かつｐが１０であるか、またはＲ^１がＣＨ＝ＣＨ_２であり、かつｐが９であり、ｍは、１０であり、Ｒ^２は、ＣＯ_２Ｈである。

塩基（たとえば、水素化ナトリウム、炭酸カリウムまたは炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムテトラメチルピペリジド、１，８−ジアザシクロウンデカ−７−エン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンまたは２，６−ジｔ−ブチルプトリジン（2,6-dit-butylputridine））の存在下における、ＤＭＦ、ＴＨＦまたはジメチルアセトアミドのような溶媒中での、保護されたマロン酸（１Ａ）のアルキル化剤（１Ｂ）によるアルキル化は、保護された二酸部分（１Ｃ）を生成する。

保護された二酸部分（１Ｃ）は、ジアルキル化された保護された生成物（１Ｅ）を得るために、上で記載したとおりの塩基性条件下でのアルキル化剤（１Ｄ）による第２のアルキル化を受ける。実施形態１に従う脂肪酸は、適切な脱保護方法を使用する脱保護によって得られる。中間体（１Ｅ）の加水分解には、限定はしないが、ＮａＯＨ、ＫＯＨもしくはＬｉＯＨから選択される塩基、または限定はしないが、ＴＦＡ，ＨＣｌもしくはＢＣｌ_３から選択される酸を使用する標準方法を適用することができる。Ｐ^１またはＰ^２がベンジルまたはメトキシベンジルであるとき、好ましい脱保護の方法は、限定はしないが、パラジウム炭素などの触媒の存在下での水素化である。

２つのアルキル化ステップの順番は、逆転してよい。加えて、ＣＯ_２ＨであるＲ^２によって、アルキル化ステップの前にこの官能基の保護が必要である可能性がある。カルボン酸のための保護基は、当業界で既知である（たとえば、ベンジル基）。

脂肪酸合成のさらなる具体例は、以下の実験の部および仮特許出願第６２／０８２３２７号明細書（ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ２）に記載されている。

脂肪酸（ＦＡ）−ＰＥＧリンカー構築物の合成：
スキーム２は、末端ＣＯ_２Ｈ官能基を有する脂肪酸−ＰＥＧリンカー構築物の合成を記載する。

式中、ＦＡは、式：

の脂肪酸またはその保護された形態であり、ｙは、１〜３０である。カルボン酸のための保護基は、上でスキーム１に記載した。

限定はしないが、ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソピロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ ＨＣｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、またはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）が挙げられ得るペプチド縮合試薬を使用して、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールまたはジメチルアミノピリジンなどの試薬の存在下または不存在下で、脂肪酸（２Ｂ）をＰＥＧ含有リンカー（２Ａ）に付着させることができる。好ましくは、（２Ｂ）の酸官能基を、ＰＥＧリンカー（２Ａ）のアミノ官能基と反応させる前に、ＮＨＳ化学を使用してその活性型に変換する。

脂肪酸およびＰＥＧリンカーの両方における追加のカルボキシル官能基の存在下では、反応部位を制御するために、カップリング反応の前に保護基を導入することができる。カルボン酸のための保護基を上記スキーム１中に記載する。代わりに、カルボン酸の選択的活性化は、ＮＨＳ化学を使用して達成できる。

脂肪酸−ＰＥＧ構築物合成のさらなる具体例は、以下の実験の部および仮特許出願第６２／０８２３２７号明細書（ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ２）に記載されている。

コンジュゲートの調製
スキーム３は、脂肪酸または脂肪酸−ＰＥＧ構築物の式ＩのアペリンペプチドのＮ末端におけるアミノ官能基へのコンジュゲーションを記載する：

カップリング条件を使用する直接的付着によるコンジュゲーション

式中、Ｐは、式Ｉのアペリンペプチドであり、脂肪酸または脂肪酸−ＰＥＧ構築物が、生体分子のＮ末端に付着しており、ＦＡは、上記スキーム２に定義されるとおりである。

脂肪酸−リンカー構築物（３Ｂ）または脂肪酸（３Ｂ‘）を、標準的なアミドカップリング方法を使用して、そのカルボン酸反応性基を介してペプチド（３Ａ）のアミノ残基（Ｎ末端のアミノ官能基）に付着させる。既知のカップリング方法を上記スキーム２に詳細に記載する。好ましくは、脂肪酸（３Ｂ’）または脂肪酸−ＰＥＧ構築物（３Ｂ）の酸官能基を、ＮＨＳ化学を使用して活性化する。

より詳細な実験条件は、以下の実験の部および米国仮特許出願第６２／０８２３２７号（ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ２）に記載されている。

医薬組成物
本発明のコンジュゲートは、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、吸入、鼻腔内、経口などを始めとする様々な手段のいずれかにおいて投与することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩の連続的な静脈内投与を使用する。本発明の別の好ましい実施形態は、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステルもしくは塩の皮下投与を使用する。

本発明におけるコンジュゲートは、ボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入として投与することができる。移植可能なポンプを使用してもよい。本発明のある特定の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を、１日〜数日間（たとえば、２〜３日間以上）またはより長期間、たとえば、数週間、数か月、もしくは数年間継続する。一部の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約３日間施す。別の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約１週間施す。他の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約２週間施す。投与中または複数回の投与の合間に、特定の閾値を上回る平均血漿コンジュゲート濃度を維持することが望ましい場合もある。望ましい濃度は、たとえば、対象の生理的状態、疾患重症度などに基づき決定することができる。そのような望ましい値（複数可）は、標準の臨床試験を実施して割り出すことができる。代わりに、ペプチドおよびそのコンジュゲートは、ＦｃＲｎ機序によって、経口的に送達することができるはずである（Nat Rev Immunol. 7(9), 715-25, 2007、Nat Commun. 3;3:610, 2012、Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304: G262-G270, 2013）。

別の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与、非経口投与、直腸投与などの特定の投与経路用に製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定はせず、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒、凍結乾燥剤、粉末、または坐剤を含める）、または液体形態（限定はせず、溶液、懸濁液、または乳濁液を含める）に仕立てることができる。医薬組成物は、無菌製造、滅菌などの従来の製薬業務にかけることができ、かつ／または、従来の不活性希釈剤、膜形成剤、等張化剤、滑沢剤、または緩衝剤、ならびに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などの佐剤を含有してよい。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は皮下投与用である。タンパク質／ポリペプチドの皮下投与に適した処方成分および方法は、当業界で既知である。たとえば、米国特許出願公開第２０１１／００４４９７７号明細書および米国特許第８，４６５，７３９号明細書および米国特許第８，４７６，２３９号明細書を参照されたい。典型的に、皮下投与用の医薬組成物は、好適な安定剤（たとえば、メチオニンなどのアミノ酸、および／またはスクロースなどの糖）、緩衝剤および等張化剤を含む。

注射用途に適する医薬組成物は、通常、滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と滅菌粉末を含む。

静脈内の投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌とすべきであり、容易な注射適用性（syringability）が存在する程度に流動的にすべきである。好ましい医薬製剤は、製造および貯蔵の条件下で安定しており、細菌や真菌などの微生物による汚染作用に対抗して保存しなければならない。一般に、妥当な担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でよい。適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物による作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、アミノ酸、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物に含めることにより実現できる。

ある特定の注射用組成物は、水性の等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪質の乳濁液または懸濁液から調製することが有利である。前記組成物は、滅菌され、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤（solution promoter）、浸透圧調節用の塩、および／または緩衝液などの佐剤を含有するものでよい。加えて、前記組成物は、治療上価値のある他の物質も含有してよい。前記組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング法に従って調製され、それぞれ、約０．１〜７５％、または約１〜５０％の活性成分を含有する。

滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分の１つまたは組合せを含有する適切な溶媒に、必要な量の活性化合物を混ぜた後、濾過滅菌することにより調製できる。分散液は、一般に、基礎の分散媒、および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を混ぜることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であるが、この方法では、活性成分の粉末と、所望の任意の追加成分が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。

本発明はさらに、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を減速する１種または複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。本明細書では「安定剤」と呼ぶ、そのような薬剤として、限定はしないが、アスコルビン酸などの酸化防止剤、ｐＨ緩衝液、または塩緩衝液などが挙げられる。

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明のコンジュゲートの生物学的有効性および特性を保持し、通常は生物学的または別な意味で望ましい塩を指す。多くの場合、本発明のコンジュゲートは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれと同様の基が存在するおかげで、酸および／または塩基の塩を形成することができる。

薬学的に許容される酸付加塩、たとえば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロルテオフィリン酸塩（chlortheophyllonate）、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩は、無機酸および有機酸に対して生成することができる。

塩を導くことのできる無機酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。塩を導くことのできる有機酸としては、たとえば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸などが挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基に対して生成することができる。

塩を導くことのできる無機塩基としては、たとえば、アンモニウム塩、および周期表のＩ〜ＸＩＩ列の金属が挙げられる。ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅から導かれ、特に適切な塩として、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。

塩を導くことのできる有機塩基としては、たとえば、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に存在する置換アミンを始めとする置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂などが挙げられる。ある特定の有機アミンとして、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン、およびトロメタミンが挙げられる。

本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、親化合物、塩基性または酸性部分から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、またはＫの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩など）と反応させる、または遊離塩基形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい酸と反応させることにより調製できる。こうした反応は通常、水もしくは有機溶媒中または二者の混合物中で実施される。一般に、実用可能な場合、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒質の使用が望ましい。追加の適切な塩の一覧は、たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)ならびにStahlおよびWermuthによる“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)で見ることができる。

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られているであろうが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（たとえば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素など、およびこれらの組合せを包含する（たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329を参照されたい）。従来のいかなる担体も、活性成分と相容れない範囲にあるものを除き、治療組成物または医薬組成物におけるその使用を企図する。

本発明の方法：
アペリンファミリーのペプチドは、Ｇタンパク質共役型ＡＰＪ受容体の、知られている唯一の天然リガンドファミリーである。アペリン遺伝子は、７７アミノ酸のポリペプチドをコードし、このポリペプチドがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２、およびピログルタミン酸修飾型のアペリン−１３（Ｐｙｒ^１−アペリン−１３）になる。これらアペリンペプチドのいずれでも１種が、ＡＰＪ受容体に結合すると、ＧｉおよびＧｑタンパク質を介してシグナルを伝達する。心筋細胞では、ＧｉまたはＧｑとの共役によって、細胞内ｐＨが変化し、ＰＬＣが活性化され、ＩＰ３が産生され、それにより筋フィラメントのカルシウム感受性が増強され、最終的に心収縮性が増大する。Ｇｉ共役により、活性化型Ｇｓ、アデニリルシクラーゼ、およびｃＡＭＰの産生が抑制され、ｐＡｋｔレベルが上昇して、心臓保護につながる。血管内皮細胞では、Ｇｉを介したＡＰＪ活性化、ｐＡＫＴによって、一酸化窒素（ＮＯ）産生が増大し、これにより平滑筋弛緩が増進される結果、全体として血管が拡張する。

慢性安定心不全の患者は、心収縮性がさらに低下し、症状が悪化する、不定期の急性代償不全エピソードを伴う。こうした増悪は、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）と呼ばれる。ＡＤＨＦの現行の療法としては、利尿薬、血管拡張薬、およびイノトロープが挙げられ、これらは、心収縮性を直接増大させる。現用の静脈内イノトロープ（ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、レボシメンダン）は、不整脈などの有害事象を伴い、長期死亡率を増大させることでよく知られている。本発明の合成アペリン脂肪酸コンジュゲート類似体は、催不整脈または死亡の傾向なしに心収縮性を増大させるＡＤＨＦ療法となり、慢性心不全における未対応の膨大な医学的要求に対処するものである。

実際に、ヒトにおける急性アペリン治療（５分）の結果、冠血管は拡張し、心拍出量は改善される。しかし、天然のアペリンは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｔ１／２（数秒）および作用持続時間（数分）が非常に短い。本発明の強力な合成コンジュゲートＡＰＪアゴニストは、それぞれ天然のアペリンに比べておよび／または先に記載された合成アペリンペプチドに比べておよび／または米国特許第８，６７３，８４８号明細書（代理人整理番号ＰＡＴ０５４９６１−ＵＳ−ＮＰ）および米国特許出願第１４／３３６，２９３号明細書（ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＮＰ）に記載されたものなどの合成アペリン脂肪酸コンジュゲートに比べて、半減期が長い。

心筋細胞におけるＡＰＪ受容体の活性化により、ａ）Ｇｉ／Ｇｑ、ＰＬＣ、およびＣａ２＋を介した心収縮性が向上し、ｂ）Ｇｉ、ｐＡｋｔ活性化を介した心臓保護が講じられるが、（他のイノトロープで見られるような）ｃＡＭＰの漸増は伴わない。加えて、内皮細胞におけるＡＰＪアゴニズムによって、動脈の血管は拡張され、これが、左心室の仕事量を軽減することにより、さらに心不全のためになる。まとめると、本発明のコンジュゲートは、全体としての心機能を向上させ、催不整脈を減少させ、生存利益をもたらし得る。

より最近では、アペリンの糖尿病およびインスリン抵抗性への潜在的な関与に焦点を当てた前臨床研究がいくつか発表されている。アペリンは、１）筋肉、脂肪、および心臓におけるグルコースの取込みを改善することによって血糖レベルを下げ、２）膵臓β細胞をＥＲストレスおよび後続のアポプトーシスから保護し、３）β細胞におけるインスリン分泌を減少させ、４）脂肪組織において、カテコールアミンによって誘発される脂肪分解を調節することが示されている。ｐＡＫＴ経路の活性化は、こうした過程と関連付けられている。

遊離形態または薬学的に許容される塩の形態の式Ｉのポリペプチドを含むコンジュゲートは、価値のある薬理学的特性、たとえば、次の部において提供されるとおりのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの試験において示され、したがって治療に適応されるものなどのＡＰＪ受容体拮抗特性を示す。

本発明のコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩は、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症から選択される適応症の治療において有用となり得る。

したがって、別の実施形態として、本発明は、ＡＰＪ受容体活性と関連する疾患を治療するための、本明細書に記載のとおりのコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。別の実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患から選択される。別の実施形態では、疾患は、前述の一覧から選択され、急性代償不全心不全が適切である。この実施形態のさらに別のサブセットにおいて、本発明は、ＡＰＪ受容体活性と関連する疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載のとおりのコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。

したがって、別の実施形態として、本発明は、コンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩の、療法における使用を提供する。別の実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体の活性化（アゴニズム）によって治療することのできる疾患から選択される。

別の実施形態では、本発明は、治療上許容される量の実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲートのまたはその薬学的に許容される塩の投与を含む、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患を治療する方法を提供する。さらなる実施形態では、疾患は、前述の一覧から選択され、急性代償不全心不全が適切である。

この実施形態のさらに別のサブセットでは、本発明は、治療上許容される量の実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩の投与を含む、ＡＰＪ受容体活性と関連する疾患を治療する方法を提供する。

治療に用いることになる、本発明の医薬組成物または組合せの有効量は、たとえば、治療の状況および目的に左右される。当業者には、したがって、治療に相応しい投薬量レベルが、幾分、送達される分子、コンジュゲートを使用する適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または臓器サイズ）および状態（年齢および全般的健康状態）に応じて様々となることは理解されよう。それに応じて、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を設定し、投与経路を変更することができる。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲またはそれ以上となり得る。他の実施形態では、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲となり得る。

投薬の頻度は、使用する製剤中の二重機能タンパク質の薬動学的パラメータに応じて決まる。通常、臨床医は、所望の効果を実現する投薬量に到達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単一用量として、一定期間にわたる（同量の所望の分子を含有するかどうかは定かでない）２回以上の用量として、または移植デバイスもしくはカテーテルによる連続的な注入として、投与することができる。適切な投薬量のさらなる微調整は、当業者によって型通りになされ、当業者によって型通りに行われる作業領域の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量反応データを使用して突き止めることができる。

本発明のコンジュゲートの「治療有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的反応、たとえば、症状の改善、状態の緩和、疾患進行の緩慢化もしくは遅延、または疾患の予防などを惹起する、本発明のコンジュゲートの量を指す。非限定的な一実施形態では、用語「治療有効量」は、対象に投与されたとき、（１）（ｉ）ＡＰＪ受容体の活性化によって改善させ、（ｉｉ）ＡＰＪ受容体の活性と関連し、または（ｉｉｉ）ＡＰＪ受容体の異常な活性を特徴とする、状態、障害、もしくは疾患、またはその症状を少なくとも部分的に緩和し、抑制し、予防し、かつ／または改善させ、または（２）ＡＰＪ受容体を活性化するのに有効である、本発明のバイオコンジュゲートの量を指す。

非限定的な別の実施形態では、用語「治療有効量」とは、細胞、組織、細胞でない生物材料、または培地に投与したとき、ＡＰＪ受容体を少なくとも部分的に活性化するのに有効である、本発明のバイオコンジュゲートの量を指す。当業者の認めるところとなるとおり、特定の薬剤の、有効である絶対量は、所望の生物学的終点、送達する薬剤、ターゲット組織などの要因に応じて様々となり得る。当業者には、「治療有効量」を、単一用量にして投与してもよいし、または複数回の用量の投与によって実現してもよいことは理解される。たとえば、心不全治療のための薬剤の場合、有効量は、患者の臨床的改善、たとえば、運動耐性／能力の向上、血圧の上昇、体液停留の減少、および／または心臓機能性、たとえば、駆出率、運動能力（消耗までの時間）などの定量試験に関する結果の改善をもたらすのに十分な量でよい。

本明細書で使用するとき、用語「対象」とは、動物を指す。通常、動物は哺乳動物である。対象は、たとえば、霊長類（たとえば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚、鳥なども指す。ある特定の実施形態では、対象は霊長類である。さらに他の実施形態では、対象はヒトである。

本明細書で使用するとき、用語「抑制する」、「抑制」、または「抑制すること」とは、所与の状態、症状、障害、もしくは疾患の軽減もしくは抑止、または生物学的活性もしくは過程のベースライン活性の有意な低下をいう。

本明細書で使用するとき、任意の疾患または障害を「治療する」、「治療すること」、またはその「治療」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を改善させる（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発生を緩慢にし、阻止し、または軽減する）ことをいう。別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、患者によって識別されない場合があるものを含めて、少なくとも１つの身体的パラメータを緩和し、または改善させることをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害を、身体的に（たとえば、識別可能な症状の安定化）、生理的に（たとえば、身体的パラメータの安定化）、または両方において、変調することをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害の発症、発生、または進行を防ぎ、または遅らせることをいう。

本明細書で使用するとき、用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、療法（たとえば、治療薬）の投与または療法の組合せ（たとえば、治療薬の組合せ）の投与の結果として生じる、対象における障害の１つまたは複数の症状の再発、発症、または発生の予防をいう。

本明細書で使用するとき、対象が、生物学的に、医学的に、または生活の質において治療の恩恵を受けることになる場合、その対象は、そのような治療の「必要がある」。

本明細書で使用するとき、本発明の文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用する用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の用語は、本明細書で別段指摘しない限り、また文脈と明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈される。

本明細書に記載の方法はすべて、本明細書で別段指摘しない限り、またはそうでなくとも文脈と明らかに矛盾しない限り、適切などんな順序で実施してもよい。本明細書において提供される、ありとあらゆる例または例示的な言い回し（たとえば、「など」）の使用は、単に本発明をより明解にするためのものであり、別途特許請求する本発明の範囲を限定するものでない。

本発明によるコンジュゲートの活性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって評価することができる。

ｈＡＰＪカルシウムフラックスアッセイ：
３８４ウェルフォーマットにおいて、２５ｕｌ成長培地に、Ｃｈｅｍ−５ ＡＰＪ安定細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＨＴＳ０６８Ｃ）を１０，０００細胞／ウェルで播き、次いで、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて２４時間成長させた。アッセイの１時間前に、２．５ｍＭのプロベネシドを含有する２５ｕｌ／ウェルのＦＬＩＰＲ Ｃａｌｃｉｕｍ ４色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｒ８１４２）を加え、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて細胞を１時間インキュベートした。バイオコンジュゲートをＨＢＳＳ、ＨＥＰＥＳ、および０．１％ＢＳＡ緩衝液に可溶化し、三通りに５０ｕＭから５ｐＭまで１０倍ずつ連続希釈した。ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａを使用して、色素を有する細胞にバイオコンジュゲートを加えた（１：５、１０ｕＭ〜１ｐＭの範囲の最終バイオコンジュゲート濃度にする）。細胞の内側のＦＬＩＰＲ色素は、カルシウムに結合後に蛍光を発光し、細胞の外側からの蛍光は遮蔽された。ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａにおいて４７０〜４９５の励起波長および５１５〜５７５の発光波長を使用して、蛍光を測定した。読取りは、バイオコンジュゲートを加える１０秒前に開始して、合計３分間行った。最大−最小値を算出し、各バイオコンジュゲート濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、バイオコンジュゲートによるカルシウムフラックス刺激について、曲線変曲点におけるＥＣ_５０値を算出した。

血漿安定性アッセイ：
材料：
作業溶液：１ｍｇ／ｍＬの試験物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に調製する。
抽出溶液：０．１％のギ酸および４００ｎｇ／ｍＬのグリブリドを含有するメタノール：アセトニトリル：水（１：１：１）
血漿：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から購入した雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット血漿（ヘパリンナトリウム添加）
全血：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から購入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ全血（ヘパリンナトリウム添加）
肺ホモジネート：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの肺を購入した。肺は、５倍体積の１倍ＰＢＳを加えた後、ポリトロンホモジナイザーを使用してホモジナイズした。ホモジネートを４℃にて９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を３０００ｒｐｍで３０分間再び遠心分離して、澄んだ上清を作った。タンパク質濃度は、市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して求めた。

サンプル調製手順：（ペプチド）
試験物は、次の生物学的材料、すなわち、ヘパリン処置ラット血漿、ヘパリン処置ラット全血、または肺ホモジネートのうちの１つにおいて調製した。血漿および全血サンプルは、９９５ｕＬのラット血漿または全血に１ｍｇ／ｍＬの作業溶液５ｕＬを加えることにより、５０００ｎｇ／ｍＬで調製した。肺ホモジネートサンプルは、肺ホモジネートをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した後、５ｕＬの作業溶液を加えて、９９５ｕＬの希釈された肺ホモジネートとすることにより調製した。サンプルは、水浴インキュベーターにおいて、穏やかに振盪（６５〜７５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。０分、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、および２４０分の時点で、インキュベートサンプルの２５ｕＬのアリコートを９６ウェルプレートに移し、１５０ｕＬの抽出溶液を使用して、直ちにタンパク質を沈殿させた。インキュベート実験が完了した後、サンプルプレートを４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、ピペット操作装置（Ｔｅｃａｎ Ｔｅｍｏ）を使用して、上清を別のプレートに移し、すべてのサンプルに５０ｕＬの水を加えた。プレートは、ＬＣ−ＭＳ分析の前にボルテックスした。

サンプル調製手順（コンジュゲート）
１ｍｇ／ｍＬの作業溶液５ｕＬをラット血漿４９５ｕＬに加えることにより、試験物を５０，０００ｎｇ／ｍＬで調製した。サンプルは、水浴インキュベーターにおいて、穏やかに振盪（６５〜７５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、および２４時間の時点で、インキュベートサンプルの５０ｕＬのアリコートを９６ウェルプレートに移し、４０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）１００ｕＬを各サンプルに加えた。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。反応が完了した後、３００ｕＬのアセトニトリルを使用して、タンパク質を沈殿させた。サンプルプレートを４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、ピペット操作装置（Ｔｅｃａｎ Ｔｅｍｏ）を使用して、１２５ｕＬの上清を別のプレートに移し、すべてのサンプルに５０ｕＬの水を加えた。プレートは、ＬＣ−ＭＳ分析の前にボルテックスした。

ＬＣ−ＭＳ安定性分析のサンプル
ＨＰＬＣ：オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣ
カラム：ＭＡＣ−ＭＯＤ ＡＣＥ Ｃ１８、３μｍ、３０ｍｍ×内径２．１ｍｍ
移動相Ａ：０．１％のギ酸アセトニトリル溶液
移動相Ｂ：０．１％のギ酸水溶液

勾配プログラム：

質量分析計：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｑ−ＴＯＦ６５３０
データ取得モード：１００〜１０００ｍ／ｚの質量範囲での完全走査
データ取得および分析ソフトウェア：ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ

データ分析：
安定性アッセイ：安定性半減期（ｔ１／２）の値は、各時点におけるピーク面積を、初期（ｔ＝０）ピーク面積を基準とした残存パーセントに変換することにより求めた。
残存パーセント＝１００×（サンプルピーク面積）÷（ｔ＝０ピーク面積）

残存パーセント値の自然対数を算出し、サンプル時間に対してプロットした（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）。この直線の傾きｋを、線形回帰によって求めた（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）。

次いで、安定性半減期を、式ｔ１／２＝０．６９３÷ｋによって算出した。

代替活性ベースの血漿安定性アッセイ：
以下の変更を有する上記カルシウムフラックスプロトコールに従った。ペプチドを、５％ラット血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ＃ＲＡＴＰＬＮＡＨＰ−Ｍ、Ｎａヘパリン処理）とも一緒にインキュベートした。読取りを、３７℃の組織培養インキュベーターにおけるインキュベーション後ｔ_０およびｔ_２４時間の時点で行った。分で表したペプチド血漿半減期を、以下の：
１）ＬＮ（（ｔ_０におけるＥＣ_５０）／（ｔ_２４時間におけるＥＣ_５０））、
２）上記値の勾配を計算する、および
３）ｔ_１／２＝０．６９３／（勾配^２）
を算出することによって推定した。

ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣ投薬を介する薬物動態評価のためのプロトコールおよびデータ
処方、投薬およびサンプル取得：
実施例１および実施例４を、３０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３００およびＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）デキストロースに溶解させ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。溶解した化合物を、皮下（ＳＣ）注射によってＣ５７／Ｂ６マウス（約２０週齢）側腹部に投薬した（化合物あたりｎ＝４）。注入量は１０ｍｇ／ｋｇであった。投薬後３および６時間ならびに投薬後１、２、４、７および１０日に、伏在静脈から血液サンプルを採血した。直ちに血液サンプルを４０００×ｇで１０分間、遠心分離した。血漿上清（１０μＬ）を、９６ウェルプレートに移し、分析まで−８０℃で凍結した。

国際公開第ＷＯ２０１３／１１１１１０号パンフレットの実施例８を、１ｍｇ／ｍｌ濃度で注射用滅菌水（Ｈｏｓｐｉｒａ）に溶解した。Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウス（約２２週齢）に、溶解した化合物をＳＣ注射によって投薬した（ｎ＝４）。注射後１５、３０、６０および１２０分で、尾静脈から血液サンプルを採血した。これらを直ちに遠心分離し、次いで血漿上清を９６ウェルプレートに移し、分析まで−８０℃で凍結した。

生物分析用のサンプルの調製
予め量り分けた各化合物のサンプル（１〜３ｍｇ）を得て、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解した。分析のための標準曲線を作成するために、これらをマウス血漿（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）中、１０，０００、５，０００、１，０００、５００、１００、５０、１０、５および１ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで連続的に希釈した。

ＰＫ研究からの血漿サンプルを融解し、マウス血漿を加えることによって全体積２５μＬに希釈した。

各サンプルおよび標準曲線サンプルの２５μＬアリコートを、９６ウェルプレートに配置した。内部標準としての１００ｎｇ／ｍｌのグリブリドを含有するアセトニトリル１５０μＬを各サンプルに加え、サンプルを３０秒間ボルテックスした。次いで、サンプルを４０００×ｇで１０分間、遠心分離した。次いで、１２５μＬの上清を未使用の９６ウェルプレートに移した。５０μＬの水を加え、３０秒間ボルテックスにより混合した。

ＬＣ／ＭＳ生物分析（Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０）：
ＣＴＣ ＰＡＬオートサンプラーを使用して、サンプル（１０μＬ）をＨＰＬＣに移した。ＬＣカラムは、ＡＣＥ Ｃ１８ ３０×２．１ｍｍ、３．０μｍビーズであった。水中の０．１％ギ酸からなる溶媒Ａおよびアセトニトリル中の０．１％ギ酸からなる溶媒Ｂによる二元溶媒システムを使用した。９５％の溶媒Ａ（０〜０．５分）中のカラムにサンプルを添加し、５％〜５０％の溶媒Ｂ（０．５〜１．８分）および１．８〜２．３分にわたる５０％〜９８％の溶媒Ｂの勾配によって溶出した。２．３から２．９分まで、カラムを９８％の溶媒Ｂに保持し、２．９〜３．０分にわたって９５％の溶媒Ａに戻し、３．０から３．５分まで、９５％の溶媒Ａでカラムを平衡化した。溶媒の流量は７００μＬ／分、カラム温度は５０℃であった。

結果：ｓ．ｃ．投薬後の実施例１および４の化合物のマウス血漿への曝露プロフィールを図１に示し；半減期を表３に要約する；

本発明のコンジュゲートは、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３と同様のＡＰＪ受容体効力を有することができる。一実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、ＥＣ_５０が４００ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明のアペリン脂肪酸コンジュゲートは、ＥＣ_５０が３００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１６０ｎＭ未満である。さらに別の実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、ＥＣ_５０が１００ｎＭ未満である。

本発明のコンジュゲートは、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３を凌ぐおよび／またはコンジュゲートされていない類似体Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ＊−Ｆ（またはｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ＊−Ｆ−ＯＨ）を凌ぐおよび／または先に記載されたアペリン脂肪酸コンジュゲート（米国特許出願第１４／３３６，２９０号（ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＮＰ）の実施例２０）を凌ぐ血漿安定性を有する。一実施形態では、血漿安定性の改善は少なくとも２倍である。別の実施形態では、血漿安定性の改善は少なくとも１０倍である。一実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも３０分または少なくとも６０分である。別の実施形態では、本発明の脂肪酸コンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも５時間、好ましくは少なくとも１０時間、より好ましくは少なくとも１２時間である。

本発明のコンジュゲートは、１種または複数の他の治療薬と同時、またはその前もしくは後のいずれかに投与されてよい。本発明のコンジュゲートは、他の薬剤と同じもしくは異なる投与経路によって別個に、または同じ医薬組成物中で一緒に投与されてよい。

一実施形態では、本発明は、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つのコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩と、少なくとも１種の他の治療薬とを含む、療法において同時に、別個に、または順次使用するための一体型調製物としての製品を提供する。一実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す疾患または状態の治療である。

一体型調製物として提供される製品としては、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つのコンジュゲートもしくはその薬学的に許容される塩と、他の治療薬（複数可）とを同じ医薬組成物中に一緒に、または実施形態１〜７Ｄのいずれか１つのコンジュゲートもしくはその薬学的に許容される塩と、他の治療薬（複数可）とを別個の形態で、たとえば、キットの形態で含む組成物が挙げられる。

一実施形態では、本発明は、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つのコンジュゲートもしくはその薬学的に許容される塩と、別の治療薬（複数可）とを含む、医薬組成物を提供する。任意選択により、医薬組成物は、上述のとおりの薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。

一実施形態では、本発明は、２種以上の別個の医薬組成物を含み、その少なくとも１種が、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を含有する、キットを提供する。一実施形態では、キットは、容器、隔てられたボトル、分包ホイルなどの、前記組成物を別個に保持する手段を含む。このようなキットの一例は、錠剤、カプセル剤などの包装に典型的に使用されるようなブリスターパックである。

本発明のキットは、たとえば経口と非経口の、異なる剤形を投与する、別個の組成物を異なる投薬間隔で投与する、または別個の組成物を互いに合わせて漸増するのに使用することもできる。服薬遵守を支援するために、本発明のキットは通常、投与の説明書を含む。

本発明の併用療法では、本発明のコンジュゲートと他の治療薬は、同じまたは異なる製造業者によって製造および／または製剤化されたものでよい。さらに、本発明のコンジュゲートと他の治療薬は、（ｉ）（たとえば、本発明のコンジュゲートと他の治療薬を含むキットの場合において）組合せ製品が医師に渡る前に、（ｉｉ）投与のすぐ前に医師自身によって（または医師の指導のもとで）、（ｉｉｉ）たとえば、本発明のコンジュゲートと他の治療薬が順次投与される際、患者自身で、併用療法に一体化されるものでよい。

したがって、本発明は、医薬が別の治療薬との投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明はまた、医薬が、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩とともに投与される、アペリン受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための別の治療薬の使用を提供する。

本発明はまた、コンジュゲートが別の治療薬との投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明はまた、他の治療薬が、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩との投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、別の治療薬を提供する。

本発明はまた、患者が、別の治療薬で（たとえば、２４時間以内に）予め治療を受けている、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明はまた、患者が、実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩で（たとえば２４時間以内に）予め治療を受けている、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、別の治療薬の使用を提供する。

一実施形態では、他の治療薬は、イノトロープ、βアドレナリン性受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗薬、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬（obesity-reducing agent）、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、およびＮＥＰ阻害薬から選択される。

第２の薬剤または治療と「組み合わせて」という用語は、本発明のコンジュゲート（実施形態１〜７Ｄのいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩、または本明細書に別な形で記載するコンジュゲート）を第２の薬剤または治療と同時投与すること、最初に本発明の化合物を投与した後、第２の薬剤または治療を投与することおよび最初に第２の薬剤または治療を投与した後、本発明のコンジュゲートを投与することを包含する。

用語「第２の薬剤」は、本明細書に記載の疾患または障害、たとえば、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患、たとえば、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症の症状を治療、予防、または軽減することが当業界で知られている任意の薬剤を包含する。

第２の薬剤の例としては、イノトロープ、βアドレナリン性受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗薬、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、および／またはＮＥＰ阻害薬が挙げられる。

本明細書で使用するイノトロープとしては、たとえば、ドブタミン、イソプロテレノール、ミルリノン、アミリノン（amirinone）、レボシメンダン、エピネフリン、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、およびジゴキシンが挙げられる。

本明細書で使用するβアドレナリン性受容体遮断薬としては、たとえば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、およびチモロールが挙げられる。

本明細書で使用する抗凝血薬としては、ダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、ヘパリン、チンザパリン、ワルファリンが挙げられる。

用語「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬」（β−ヒドロキシ−β−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素阻害薬とも呼ばれる）は、血中コレステロールを始めとする脂質レベルを下げるのに使用することのできる活性薬剤を包含する。例としては、アトルバスタチン、セリバスタチン、コンパクチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、フルインドスタチン（fluindostatin）、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、リバスタチン（rivastatin）、シンバスタチン、およびベロスタチン（velostatin）、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。

用語「ＡＣＥ阻害薬」（アンジオテンシン変換酵素阻害薬とも呼ばれる）は、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩにする酵素的分解を妨げる分子を包含する。このような化合物は、血圧の調節およびうっ血性心不全の治療に使用することができる。例としては、アラセプリル、ベナゼプリル、ベナゼプリラート、カプトプリル、セロナプリル（ceronapril）、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナプリラート（enaprilat）、ホシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、モベルトプリル（moveltopril）、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、テモカプリル、およびトランドラプリル、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。

用語「エンドセリン拮抗薬」は、ボセンタン（ＥＰ５２６７０８Ａを参照のこと）、テゾセンタン（ＷＯ９６／１９４５９を参照のこと）、またはこれらの薬学的に許容される塩を包含する。

用語「レニン阻害薬」は、ジテキレン（ditekiren）（化学名：［１Ｓ−［１Ｒ^＊，２Ｒ^＊，４Ｒ^＊（１Ｒ^＊，２Ｒ^＊）］］−１−［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［２−ヒドロキシ−５−メチル−１−（２−メチルプロピル）−４−［［［２−メチル−１−［［（２−ピリジニルメチル）アミノ］カルボニル］ブチル］アミノ］カルボニル］ヘキシル］−Ｎ−α−メチル−Ｌ−ヒスチジンアミド）；テルラキレン（化学名：［Ｒ−（Ｒ^＊，Ｓ^＊）］−Ｎ−（４−モルホリニルカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［１−（シクロヘキシルメチル）−２−ヒドロキシ−３−（１−メチルエトキシ）−３−オキソプロピル］−Ｓ−メチル−Ｌ−システイネアミド）；アリスキレン（化学名：（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，７Ｓ）−５−アミノ−Ｎ−（２−カルバモイル−２，２−ジメチルエチル）−４−ヒドロキシ−７−｛［４−メトキシ−３−（３−メトキシプロポキシ）フェニル］メチル｝−８−メチル−２−（プロパン−２−イル）ノナンアミド）およびザンキレン（化学名：［１Ｓ−［１Ｒ^＊［Ｒ^＊（Ｒ^＊）］，２Ｓ^＊，３Ｒ^＊］］−Ｎ−［１−（シクロヘキシルメチル）−２，３−ジヒドロキシ−５−メチルヘキシル］−α−［［２−［［（４−メチル−１−ピペラジニル）スルホニル］メチル］−１−オキソ−３−フェニルプロピル］−アミノ］−４−チアゾールプロパンアミド）、もしくはこれらの塩酸塩、またはＳｐｅｅｄｅｌが開発したＳＰＰ６３０、ＳＰＰ６３５、およびＳＰＰ８００、または式（Ａ）および（Ｂ）：

のＲＯ６６−１１３２およびＲＯ６６−１１６８、または
これらの薬学的に許容される塩を包含する。

用語「アリスキレン」は、詳細に定義しない場合、遊離塩基とその塩の両方、特に薬学的に許容されるその塩、最も好ましくはその半フマル酸塩であると理解される。

用語「カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）」は、ジヒドロピリジン（ＤＨＰ）および非ＤＨＰ（たとえば、ジルチアゼム型およびベラパミル型ＣＣＢ）を包含する。例としては、アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、リオシジン（ryosidine）、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン（niludipine）、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ベラパミル、およびニバルジピン（nivaldipine）が挙げられ、フルナリジン、プレニラミン、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、ミベフラジル、アニパミル（anipamil）、チアパミル、およびベラパミル、またはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される代表的非ＤＨＰであることが好ましい。ＣＣＢは、降圧薬、抗狭心症薬、または抗不整脈薬として使用することができる。

用語「利尿薬」は、チアジド誘導体（たとえば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチルクロチアジド（methylclothiazide）、およびクロロタリドン（chlorothalidon））を包含する。

用語「ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬」は、Ｄ４Ｆペプチド（たとえば、式Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ）を包含する。

アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬または薬学的に許容されるその塩は、アンジオテンシンＩＩ受容体のＡＴ_１受容体サブタイプに結合するが、結果として受容体を活性化しない活性成分であると理解される。ＡＴ_１受容体が抑制される結果として、こうした拮抗薬は、たとえば、降圧薬として、またはうっ血性心不全の治療に用いることができる。

ＡＴ_１受容体拮抗薬のクラスは、構造上の特色が異なっている化合物を含み、実用上好ましいのは、非ペプチド性化合物である。たとえば、バルサルタン、ロサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、サプリサルタン（saprisartan）、タソサルタン、テルミサルタン、次式

のＥ−１４７７という呼称の化合物、次式

のＳＣ−５２４５８という呼称の化合物、および次式

のＺＤ−８７３１という呼称の化合物、または、各場合において、薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される化合物を挙げることができる。

好ましいＡＴ_１受容体拮抗薬は、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタンである。他にも好ましいのは、市販されている薬剤であり、最も好ましいのは、バルサルタンまたは薬学的に許容されるその塩である。

用語「抗糖尿病薬」は、膵臓細胞からのインスリンの分泌を促進するインスリン分泌増強剤を包含する。例としては、ビグアナイド誘導体（たとえば、メトホルミン）、スルホニル尿素（ＳＵ）（たとえば、トルブタミド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、４−クロロ−Ｎ−［（１−ピロリジニルアミノ）カルボニル］−ベンゼンスルホンアミド（グリコピルアミド（glycopyramide））、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジド、１−ブチル−３−メタニリル尿素、カルブタミド（carbutamide）、グリボヌリド（glibonuride）、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリブチアゾール（glybuthiazole）、グリブゾール（glibuzole）、グリヘキサミド（glyhexamide）、グリミジン、グリピンアミド（glypinamide）、フェンブタニド（phenbutanide）、およびトリルシクラミド（tolylcyclamide））、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。別の例としては、フェニルアラニン誘導体（たとえば、式

のナテグリニド［Ｎ−（ｔｒａｎｓ−４−イソプロピルシクロヘキシルカルボニル）−Ｄ−フェニルアラニン］（ＥＰ１９６２２２およびＥＰ５２６１７１を参照のこと）、レパグリニド［（Ｓ）−２−エトキシ−４−｛２−［［３−メチル−１−［２−（１−ピペリジニル）フェニル］ブチル］アミノ］−２−オキソエチル｝安息香酸］（ＥＰ５８９８７４、ＥＰ１４７８５０Ａ２、詳細には、６１頁の実施例１１、およびＥＰ２０７３３１Ａ１を参照のこと）、カルシウム（２Ｓ）−２−ベンジル−３−（ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−イソインドリンリカルボニル）−プロピオネート二水和物（たとえば、ミチグリニド（ＥＰ５０７５３４を参照のこと））、およびグリメピリド（ＥＰ３１０５８を参照のこと）が挙げられる。

本発明のコンジュゲートと組み合わせて使用することのできる第２の薬剤の別の例として、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１アゴニストが挙げられる。

ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１の不活性化を担う。より詳細には、ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを発生させ、それによってＧＬＰ−１に対する生理的反応が短縮される。ＧＬＰ−１は、膵臓のインスリン分泌の主要な刺激物質であり、グルコース処理に直接有益な影響を及ぼす。

ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害薬は、ペプチド性でも、または好ましくは、非ペプチド性でもよい。ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬は、各場合につき、たとえば、ＷＯ９８／１９９９８、ＤＥ１９６１６４８６Ａ１、ＷＯ００／３４２４１、およびＷＯ９５／１５３０９において、各場合につき、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されており、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題は、これら刊行物を参照することにより、本明細書に援用される。好ましいのは、それぞれ、ＷＯ９８／１９９９８の実施例３およびＷＯ００／３４２４１の実施例１において詳細に開示されている化合物である。

ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）は、たとえば、W.E. SchmidtらによるDiabetologia, 28, 1985, 704-707およびＵＳ５，７０５，４８３に記載されているインスリン分泌性タンパク質である。

用語「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、特にＵＳ５，１２０，７１２、ＵＳ５，１１８６６６、ＵＳ５，５１２，５４９、ＷＯ９１／１１４５７、およびC. OrskovらによるJ. Biol. Chem. 264 (1989) 12826において開示されているＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の変異体および類似体を包含する。別の例としては、化合物中ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２分子の第３７位においてＡｒｇ^３６のカルボキシ末端側アミド官能基がＧｌｙで置換されているＧＬＰ−１（７−３７）、ならびにＧＬＮ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−ＧＬＮ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、アセチルＬＹＳ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＬＹＳ^１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、特にＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＶＡＬ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＹ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＴＨＲ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＭＥＴ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）、および４−イミダゾプロピオニル−ＧＬＰ−１を含めたその変異体および類似体が挙げられる。GreigらによるDiabetologia 1999, 42, 45-50に記載されているＧＬＰアゴニスト類似体エキセンディン−４も、特に好まれる。

定義「抗糖尿病薬」には、損なわれたインスリン受容体機能を回復させて、インスリン抵抗性を減らし、その結果としてインスリン感受性を増強するインスリン感受性増強剤も含まれる。例としては、血糖降下性チアゾリジンジオン誘導体（たとえば、グリタゾン、（Ｓ）−（（３，４−ジヒドロ−２−（フェニル−メチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）メチル−チアゾリジン−２，４−ジオン（エングリタゾン）、５−｛［４−（３−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−１−オキソプロピル）−フェニル］−メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ダルグリタゾン）、５−｛［４−（１−メチル−シクロヘキシル）メトキシ）−フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（シグリタゾン）、５−｛［４−（２−（１−インドリル）エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＤＲＦ２１８９）、５−｛４−［２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−エトキシ）］ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＢＭ−１３．１２４６）、５−（２−ナフチルスルホニル）−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＡＹ−３１６３７）、ビス｛４−［（２，４−ジオキソ−５−チアゾリジニル）メチル］フェニル｝メタン（ＹＭ２６８）、５−｛４−［２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−２−ヒドロキシエトキシ］ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＡＤ−５０７５）、５−［４−（１−フェニル−１−シクロプロパンカルボニルアミノ）−ベンジル］−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＤＮ−１０８）５−｛［４−（２−（２，３−ジヒドロインドール−１−イル）エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［３−（４−クロロ−フェニル］）−２−プロピニル］−５−フェニルスルホニル）チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［３−（４−クロロフェニル］）−２−プロピニル］−５−（４−フルオロフェニル−スルホニル）チアゾリジン−２，４−ジオン、５−｛［４−（２−（メチル−２−ピリジニル−アミノ）−エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ロシグリタゾン）、５−｛［４−（２−（５−エチル−２−ピリジル）エトキシ）フェニル］−メチル｝チアゾリジン−２，４−ジオン（ピオグリタゾン）、５−｛［４−（（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）メトキシ）−フェニル］−メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（トログリタゾン）、５−［６−（２−フルオロ−ベンジルオキシ）ナフタレン−２−イルメチル］−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＭＣＣ５５５）、５−｛［２−（２−ナフチル）−ベンゾオキサゾール−５−イル］−メチル｝チアゾリジン−２，４−ジオン（Ｔ−１７４）および５−（２，４−ジオキソチアゾリジン−５−イルメチル）−２−メトキシ−Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）ベンズアミド（ＫＲＰ２９７））が挙げられる。

これ以外の抗糖尿病薬としては、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）の阻害薬、抗糖尿病性非小分子模倣化合物、グルタミン−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）の阻害薬のような、インスリンシグナル伝達経路モジュレーター；グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）の阻害薬、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（Ｆ−１，６−Ｂｐアーゼ）の阻害薬、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧＰ）の阻害薬、グルカゴン受容体拮抗薬、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の阻害薬のような、肝臓グルコース産生の調節不全に影響を及ぼす化合物；ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＨＫ）阻害薬；胃内容排出の阻害薬；インスリン；ＧＳＫ−３の阻害薬；レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト；β−３ＡＲのアゴニスト；脱共役タンパク質（ＵＣＰ）のアゴニスト；非グリタゾン型ＰＰＡＲγアゴニスト；ＰＰＡＲα／ＰＰＡＲγ二重アゴニスト；抗糖尿病性含バナジウム化合物；グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）やＧＬＰ−１アゴニストのようなインクレチンホルモン；β細胞イミダゾリン受容体アンタゴニスト；ミグリトール；α_２−アドレナリンアンタゴニスト；ならびにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。

一実施形態では、本発明は、治療有効量の実施形態１〜７Ｄのいずれか１つまたは薬学的に許容されるその塩に従うコンジュゲートと、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロールなどのβ−アドレナリン受容体遮断薬；ＡＴ１遮断薬などのアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト；ＤＰＰＩＶ阻害薬（たとえば、ビルダグリプチン）やＧＬＰ１ペプチドアゴニストなどの抗糖尿病薬から選択される１種または複数の治療活性薬剤とを含む組合せ、詳細には医薬合剤を提供する。

用語「抗肥満薬」は、リパーゼ阻害薬（たとえば、オーリスタット）および食欲抑制薬（たとえば、シブトラミンおよびフェンテルミン）を包含する。

アルドステロンシンターゼ阻害薬または薬学的に許容されるその塩は、アルドステロンの産生を抑制する特性を有する活性成分であると理解される。アルドステロンシンターゼ（ＣＹＰ１１Ｂ２）は、副腎皮質におけるアルドステロン産生の最後のステップ、すなわち、１１−デオキシコルチコステロンのアルドステロンへの変換を触媒する、ミトコンドリアのシトクロムＰ４５０酵素である。いわゆるアルドステロンシンターゼ阻害薬によるアルドステロン産生の抑制は、低カリウム血症、高血圧、うっ血性心不全、心房細動、または腎不全の治療に奏効する変異形態であることが知られている。このようなアルドステロンシンターゼ抑制活性は、当業者によって、標準のアッセイ（たとえば、ＵＳ２００７／００４９６１６）に従い、容易に見極められる。

アルドステロンシンターゼ阻害薬のクラスは、ステロイド性および非ステロイド性両方のアルドステロンシンターゼ阻害薬を含み、後者が最も好ましい。

市販品として入手可能なアルドステロンシンターゼ阻害薬または保健当局によって承認されているアルドステロンシンターゼ阻害薬が好ましい。

アルドステロンシンターゼ阻害薬のクラスは、構造上の特色が異なっている化合物を含む。非ステロイド性アルドステロンシンターゼ阻害薬の例は、式

のファドロゾールの塩酸塩（米国特許４６１７３０７および４８８９８６１）の（＋）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩である。

前記組合せにおいて有用なアルドステロンシンターゼ阻害薬は、たとえば、ＵＳ２００７／００４９６１６において、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されている化合物および類似体であり、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題は、この刊行物を参照することにより、本明細書に援用される。本発明における使用に適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬としては、限定はせず、４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−３−メチルベンゾニトリル；５−（２−クロロ−４−シアノフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸（４−メトキシベンジル）メチルアミド；４’−フルオロ−６−（６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル；５−（４−シアノ−２−メトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸ブチルエステル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；５−（２−クロロ−４−シアノフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸４−フルオロベンジルエステル；５−（４−シアノ−２−トリフルオロメトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸メチルエステル；５−（４−シアノ−２−メトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸２−イソプロポキシエチルエステル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メチルベンゾニトリル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−３−フルオロベンゾニトリル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；３−フルオロ−４−（７−メチレン−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）ベンゾニトリル；ｃｉｓ−３−フルオロ−４−［７−（４−フルオロ−ベンジル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−イミダゾ［１，５−ａ］ピリジン−５−イル］ベンゾニトリル；４’−フルオロ−６−（９−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル；４’−フルオロ−６−（９−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル、または各場合において、その（Ｒ）もしくは（Ｓ）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩が挙げられる。

用語アルドステロンシンターゼ阻害薬は、ＷＯ２００８／０７６８６０、ＷＯ２００８／０７６３３６、ＷＯ２００８／０７６８６２、ＷＯ２００８／０２７２８４、ＷＯ２００４／０４６１４５、ＷＯ２００４／０１４９１４、ＷＯ２００１／０７６５７４で開示されている化合物および類似体も包含する。

さらに、アルドステロンシンターゼ阻害薬は、米国特許出願ＵＳ２００７／０２２５２３２、ＵＳ２００７／０２０８０３５、ＵＳ２００８／０３１８９７８、ＵＳ２００８／００７６７９４、ＵＳ２００９／００１２０６８、ＵＳ２００９００４８２４１、およびＰＣＴ出願ＷＯ２００６／００５７２６、ＷＯ２００６／１２８８５３、ＷＯ２００６１２８８５１、ＷＯ２００６／１２８８５２、ＷＯ２００７０６５９４２、ＷＯ２００７／１１６０９９、ＷＯ２００７／１１６９０８、ＷＯ２００８／１１９７４４、および欧州特許出願ＥＰ１８８６６９５において開示されている化合物および類似体も包含する。本発明における使用に適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬として、限定はせず、Ｓｐｅｅｄｅｌが開発した８−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ１［１，４１オキサジン；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２−フルオロベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２，６−ジフルオロベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；３−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）フタロニトリル；４−（８−（４−シアノフェニル）−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ナフタレン−１−カルボニトリル；８−［４−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル１−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン、または各場合において、その（Ｒ）もしくは（Ｓ）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩が挙げられる。

前記組合せにおいて有用なアルドステロンシンターゼ阻害薬は、たとえば、ＷＯ２００９／１５６４６２およびＷＯ２０１０／１３０７９６において、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されている化合物および類似体、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題である。本発明における組合せに適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬としては、３−（６−フルオロ−３−メチル−２−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−１−イルメチル）−ベンゾニトリルヒドロクロリド、１−（４−メタンスルホニル−ベンジル）−３−メチル−２−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール、２−（５−ベンジルオキシ−ピリジン−３−イル）−６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール、５−（３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ニコチン酸エチルエステル、Ｎ−［５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−エタンスルホンアミド、ピロリジン−１−スルホン酸 ５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルエステル、Ｎ−メチル−Ｎ−［５−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−メタンスルホンアミド、６−クロロ−１−メチル−２−｛５−［（２−ピロリジン−１−イル−エチルアミノ）−メチル］−ピリジン−３−イル｝−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、６−クロロ−２−［５−（４−メタンスルホニル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−３−イル］−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、６−クロロ−１−メチル−２−｛５−［（１−メチル−ピペリジン−４−イルアミノ）−メチル］−ピリジン−３−イル｝−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、モルホリン−４−カルボン酸［５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−アミド、Ｎ−［５−（６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−エタンスルホンアミド、Ｃ，Ｃ，Ｃ−トリフルオロ−Ｎ−［５−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−メタンスルホンアミド、Ｎ−［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−４−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−１−フェニル−メタンスルホンアミド、Ｎ−（５−（３−クロロ−４−シアノフェニル）ピリジン−３−イル）ブタン−１−スルホンアミド、Ｎ−（１−（５−（４−シアノ−３−メトキシフェニル）ピリジン−３−イル）エチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（（５−（３−クロロ−４−シアノフェニル）ピリジン−３−イル）（シクロプロピル）メチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（シクロプロピル（５−（１Ｈ−インドール−５−イル）ピリジン−３−イル）メチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（シクロプロピル（５−ナフタレン−１−イル−ピリジン−３−イル）メチル）エタンスルホンアミド、エタンスルホン酸［５−（６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−アミドおよびエタンスルホン酸｛［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−シクロプロピル−メチル｝−エチル−アミドが挙げられる。

用語「エンドセリン受容体遮断薬」は、ボセンタンおよびアンブリセンタンを包含する。

用語「ＣＥＴＰ阻害薬」とは、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）を媒介とする、種々のコレステリルエステルおよびトリグリセリドのＨＤＬからＬＤＬおよびＶＬＤＬへの輸送を抑制する化合物を指す。このようなＣＥＴＰ抑制活性は、当業者によって、標準のアッセイ（たとえば、米国特許第６，１４０，３４３号）に従い、容易に見極められる。例として、米国特許第６，１４０，３４３号および米国特許第６，１９７，７８６号で開示されている化合物（たとえば、［２Ｒ，４Ｓ］４−［（３，５−ビス−トリフルオロメチル−ベンジル）−メトキシカルボニル−アミノ］−２−エチル−６−トリフルオロメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−カルボン酸エチルエステル（トルセトラピブ）、米国特許第６，７２３，７５２号で開示されている化合物（たとえば、（２Ｒ）−３−｛［３−（４−クロロ−３−エチル−フェノキシ）−フェニル］−［［３−（１，１，２，２−テトラフルオロ−エトキシ）−フェニル］−メチル］−アミノ｝−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール）、米国特許出願第１０／８０７，８３８号で開示されている化合物、米国特許第５，５１２，５４８号で開示されているポリペプチド誘導体、それぞれJ. Antibiot., 49(8): 815- 816 (1996)およびBioorg. Med. Chem. Lett.; 6:1951-1954 (1996)で開示されているロセノノラクトン誘導体およびコレステリルエステルの含リン酸類似体が挙げられる。さらに、ＣＥＴＰ阻害薬として、ＷＯ２０００／０１７１６５、ＷＯ２００５／０９５４０９、ＷＯ２００５／０９７８０６、ＷＯ２００７／１２８５６８、ＷＯ２００８／００９４３５、ＷＯ２００９／０５９９４３、およびＷＯ２００９／０７１５０９で開示されているものも挙げられる。

用語「ＮＥＰ阻害薬」とは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）ＥＣ３．４．２４．１１を抑制する化合物を指す。例として、カンドキサトリル、カンドキサトリラート、デキセカドトリル（Dexecadotril）、エカドトリル（Ecadotril）、ラセカドトリル、サンパトリラート（Sampatrilat）、ファシドトリル、オマパトリラート、ゲモパトリラート（Gemopatrilat）、ダグルトリル（Daglutril）、ＳＣＨ−４２４９５、ＳＣＨ−３２６１５、ＵＫ−４４７８４１、ＡＶＥ−０８４８、ＰＬ−３７、および（２Ｒ，４Ｓ）−５−ビフェニル−４−イル−４−（３−カルボキシ−プロピオニルアミノ）−２−メチル−ペンタン酸エチルエステル、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。ＮＥＰ阻害薬には、米国特許第ＵＳ５，１５５，１００号で開示されているようなホスホノ／ビアリール置換ジペプチド誘導体も含まれる。ＮＥＰ阻害薬には、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００３／１０４２００号で開示されているようなＮ−メルカプトアシルフェニルアラニン誘導体も含まれる。ＮＥＰ阻害薬には、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／１３３８９６、ＷＯ２００９／０３５５４３、またはＷＯ２００９／１３４７４１で開示されているような二重作用性降圧薬も含まれる。他の例としては、ＵＳ出願第１２／７８８，７９４号、第１２／７８８，７６６号、および第１２／９４７，０２９号で開示されている化合物が挙げられる。ＮＥＰ阻害薬として、ＷＯ２０１０／１３６４７４、ＷＯ２０１０／１３６４９３、ＷＯ２０１１／０６１２７１、ならびにＵＳ仮出願第６１／４１４１７１号および第６１／４１４１６３号で開示されている化合物も挙げられる。

一実施形態では、本発明は、対象においてＡＰＪ受容体を活性化する方法であって、治療有効量の前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す疾患または状態を治療する方法であって、治療有効量の前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＪ受容体の活性化（アゴニズム）に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、障害または疾患が、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症から選択される方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、医薬として使用するための、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

一実施形態では、本発明は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療するための医薬の製造における、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療するための医薬の製造における、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、前記障害または疾患が、詳細には、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症から選択される、使用を提供する。

方法
分析方法Ａ：
− Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水（０．１％ギ酸）；Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ギ酸）
− 流量：１ｍＬ／分
− 勾配：０分間２％のＢ；１．７６分間２％〜９８％のＢ；２．０６分間９８％のＢ；２．１６分間２％のＢ
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ 走査範囲１２０〜１６００
− ＨＰＬＣ：ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
− 温度：５０℃

分析方法Ｂ：
− Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水（０．１％ギ酸）；Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ギ酸）
− 流量：１ｍＬ／分
− 勾配：０分間４０％のＢ；１．４０分間４０％〜９８％のＢ；２．０５分間９８％のＢ；２．１分間４０％のＢ
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ 走査範囲１２０〜１６００
− ＨＰＬＣ：ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
− 温度：５０℃

分析方法Ｃ：
− Ｈｉｌｉｃ ２．１×１００ｍｍ
− 溶離液； Ａ；ＣＯ２ Ｂ：ＭｅＯＨ
− 流量：２ｍＬ／分
− 勾配：０．１５分間２％のＢ、１．６５分間２％〜５０％のＢ、２．１分間５０％のＢ、２．２５分間２％のＢ、２．５分間２％のＢ
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ
− ＳＣＦ：ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
− 温度：５５℃

分析方法Ｄ：
− Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３，５μｍ ３．０×３．０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水（０．０５％トリフルオロ酢酸）；Ｂ：ＡＣＮ
− 流量：２ｍＬ／分
− 勾配：０分間５％のＢ、４．３分間５％〜８０％のＢ、４．７０分間９５％のＢ，５．００分間９５％のＢ、５．１０分間５％のＢ
− 質量分析計：Ｗａｒｔｅｒｓ ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ；Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ 走査範囲１２０〜１６００
− ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ
− 温度：４０℃

分析方法Ｅ：
− Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム、３．５μｍ、３．０×３．０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水＋５ｍＭ水酸化アンモニウム Ｂ：ＡＣＮ
− 流量：２ｍＬ／分
− 勾配：０．０分間２％のＢ、１．７０分間２％〜９５％のＢ、２．００分間９５％のＢ、２．１０分間５％のＢ
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ
− ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ
− 温度：４０℃

脂肪酸−リンカー構築物＃１の調製

ステップ１：ベンジル３−ｔｅｒｔ−ブチル２−ウンデシルマロネート

Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（８ｍＬ）中のＮａＨ（１６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃でＤＭＦ（２ｍＬ）中のベンジルｔｅｒｔ−ブチルマロネート（１．０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０分間撹拌し、その後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の１−ブロモウンデカンを加えた。追加の１時間の撹拌後、反応液を室温まで温まらせた。終夜、反応を維持した。Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を加えて、反応液を分配した。Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で水性相を抽出し、合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で脱水した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（Ｃ１８ １２ｇ、４０〜１００％ＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）で精製して、表題の化合物（１．１４ｇ、２．８２ｍｍｏｌ、７１％）を無色の油状物として得た：ＬＣＭＳ方法Ｂ Ｒｔ＝１．５８分、Ｍ＋Ｎａ４２７．４；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 0.84 - 0.96 (m, 3 H) 1.28 (br. s, 12 H) 1.31 (m, J=3.90 Hz, 6 H) 1.41 (s, 9 H) 1.88 (q, J=7.38 Hz, 2 H) 3.29 (t, J=7.58 Hz, 1 H) 5.19 (q, J=12.27 Hz, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 5 H).

ステップ２：１，１１−ジベンジル１１−ｔｅｒｔ−ブチルドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（６ｍＬ）中のＮａＨ（７０．７ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃でＤＭＦ（１ｍＬ）中の１−ベンジル３−ｔｅｒｔ−ブチル２−ウンデシルマロネート（６５０ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加えた。ＤＭＦ（１ｍＬ）中のベンジル１１−ブロモウンデカノエート（５７１ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）を加える前に、混合物を４０分間撹拌した。添加後、反応液を室温まで温まらせ、終夜撹拌した。Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で反応液を希釈し、水（２０ｍＬ）で抽出した。Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で水性相を抽出し、合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で脱水した。溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（シリカ８０ｇ、０〜１０％ＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題の化合物を無色の油状物として得た（８２３ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ、７５％）。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.12 (m, J=6.60 Hz, 4 H) 1.19 - 1.33 (m, 28 H) 1.35 (s, 9 H) 1.66 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.85 (t, J=8.44 Hz, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.16 (s, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 10 H).

ステップ３：１３−（ベンジルオキシ）−２−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−１３−オキソ−２−ウンデシルトリデカン酸

ＤＣＭ（３ｍＬ）中のステップ２からの化合物（２００ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．６ｍＬ）を加え、室温で３時間、反応液を撹拌した。溶媒を蒸発させ、フラッシュカラム（シリカ１２ｇ、０〜１５％ＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって残渣を精製して、表題の化合物（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ、９６％）を得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 0.87 - 0.94 (m, 3 H) 0.94 - 1.05 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 14 H) 1.23 - 1.37 (m, 16 H) 1.65 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.78 - 1.91 (m, 2 H) 1.93 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.27 (s, 2 H) 7.31 - 7.44 (m, 10 H).

ステップ４：１，１１−ジベンジル−１１−（２，５−ジオキソシクロペンチル）ドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

Ｎ_２中にて、ＤＣＭ（１ｍＬ）中のＤＣＣ（５８．６ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）の溶液を、ステップ３からの酸（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）の溶液およびＤＣＭ（２ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３２．７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（０．３ｍＬ）に加えた。室温で４時間、反応液を撹拌した。溶媒を蒸発させ、フラッシュカラム（シリカ１２ｇ、０〜３５％ＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって残渣を精製して、表題の化合物（１５３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ、７５％）を無色の油状物として得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.12 - 1.21 (m, 2 H) 1.21 - 1.37 (m, 30 H) 1.66 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.89 - 2.07 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.84 (br. s., 4 H) 5.13 (s, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 7.30 - 7.47 (m, 10 H).

ステップ５：

ＴＨＦ（１．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）中のステップ４からの中間体（１４５ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）の溶液を、アミノ−ＰＥＧ２４−カルボン酸を入れたバイアルに加えた。ＤＩＰＥＡ（８８μＬ、０．５０４ｍｍｏｌ）を加え、シェーカープレート上で反応液を１５時間、撹拌した。溶媒を蒸発させ、超臨界液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ＨＩＬＩＣ ２０×１５０ｍｍ；１５〜２５％ ＭｅＯＨ／ＣＯ２）によって残渣を精製して、所望のカップリングした化合物（１５１ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、４３％）を得た：ＬＣＭＳ方法Ｃ；Ｒｔ＝１．３０分、［Ｍ＋２Ｈ］＋２ ８７６．４；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 0.93 - 1.04 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 15 H) 1.23 - 1.37 (m, 15 H) 1.61 - 1.68 (m, 2 H) 1.78 (td, J=12.44, 4.34 Hz, 2 H) 1.92 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.62 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 3.49 (dd, J=6.72, 2.32 Hz, 2 H) 3.52 - 3.59 (m, 2 H) 3.59 - 3.73 (m, 92 H) 3.80 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 5.13 (s, 2 H) 5.18 (s, 2 H) 7.31 - 7.42 (m, 10 H) 8.09 (t, J=5.26 Hz, 1 H).

ステップ６：

ＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中のＤＣＣ（２２ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１．５ｍＬ）中のステップ５からの化合物（１５０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドに加えた。反応液を１．５時間、撹拌した。追加のＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ）およびＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中のＤＣＣ（２２ｍｇ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、フラッシュカラム（シリカ１２ｇ、０〜５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって残渣を精製して、活性化したＮＨＳ化合物（１５９ｍｇ、定量的（quantitative））を白色固体として得た：ＬＣＭＳ方法Ｂ；Ｒｔ＝１．５５分、［Ｍ＋Ｈ_３Ｏ＋Ｈ］^＋２９３３．９。

ステップ７：

ＴＨＦ（５ｍＬ）中のステップ６からの化合物（１５９ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１ｍＬ）中の１０％のパラジウム炭素（４．６ｍｇ、４．３μｍｏｌ）の懸濁液を加えた。反応液を水素中に置き、４０分間撹拌した。さらなるパラジウム炭素（７ｍｇ、６．５μｍｏｌ）を加え、水素中にてさらに１時間撹拌した。反応液をメンブレンフィルターに通過させ、ろ液を蒸発させた。ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％ＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって残渣を精製して、脱保護した化合物（８３ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、５４％）を得た：ＬＣＭＳ方法Ｂ Ｒｔ＝１．０３分、［Ｍ＋２Ｈ］／２ ８３５．２；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.17 (br. s., 2 H) 1.21 - 1.39 (m, 30 H) 1.57 - 1.68 (m, 2 H) 1.69 - 1.80 (m, 2 H) 1.97 - 2.10 (m, 2 H) 2.34 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 2.92 (t, J=6.48 Hz, 2 H) 3.51 - 3.73 (m, 96 H) 3.87 (t, J=6.48 Hz, 2 H) 7.45 (t, J=4.46 Hz, 1 H).

アミノ−ＰＥＧ２４−カルボン酸を適切なアミノ−ＰＥＧｎ−カルボン酸で置換することによって、以下の化合物を脂肪酸−リンカー構築物＃１と同様に調製した。

脂肪酸−リンカー構築物＃２の調製

脂肪酸−リンカー構築物＃２を、アミノ−ＰＥＧ１２−カルボン酸を使用して調製し、無色の油状物として単離した；ＬＣＭＳ：方法Ａ：ＣＡＤ：Ｒｔ１．６４分 ＭＳｍ／ｚ １１３８．０［Ｍ−Ｈ］−；
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.36 (1H, br t), 3.76 (2H, t), 3.61-3.47 (46H, br m), 3.46-3.40 (2H, br m), 2.81 (2H, t), 2.74 (4H, br s), 2.24 (2H. t), 1.93 (2H, br t), 1.68-1.57 (2H, br m), 1.56-1.50 (2H, br m), 1.26-1.08 (34H, br m), 0.78 (3H, t).

脂肪酸−リンカー構築物＃３の調製

脂肪酸−リンカー構築物＃３を、アミノ−ＰＥＧ８−カルボン酸を試使用して調製し、それぞれがわずかに異なる不純物を含み、それぞれが無色の油状物である、２つの画分として単離した。

ＬＣＭＳ：方法Ａ ＣＡＤ：Ｒｔ １．６５分 ＭＳｍ／ｚ ９６３．８［Ｍ＋Ｈ］＋；
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.27 (1H, br m), 3.70 (2H, t), 3.56-3.41 (30H, br m), 3.41-3.34 (2H, br m), 2.75 (2H, t), 2.69 (4H, br s), 2.19 (2H. t), 1.87 (2H, br t), 1.63-1.52 (2H, br m), 1.52-1.43 (2H, br m), 1.22-1.02 (32H, br m), 0.78 (3H, t).

ＬＣＭＳ：方法Ｂ ＣＡＤ：Ｒｔ １．６５分 ＭＳｍ／ｚ ９６３．８［Ｍ＋Ｈ］＋；
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.48 (1H, m), 3.85 (2H, t), 3.71-3.56 (30H, br m), 3.56-3.49 (2H, br m), 2.90 (2H, t), 2.84 (4H, br s), 2.38-2.32 (2H, m), 2.02 (2H, br t), 1.78-1.58 (4H, br m), 1.38-1.16 (32H, m), 0.88 (3H, t).

脂肪酸−リンカー構築物４の調製：

脂肪酸−リンカー構築物を、アミノ−ＰＥＧ４−カルボン酸を使用して調製し、薄黄色の油状物として単離した；
ＬＣＭＳ：方法Ａ ＣＡＤ：Ｒｔ １．６６分 ＭＳｍ／ｚ ７８７．６［Ｍ＋Ｈ］＋；
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.24 (1H, br t), 3.85 (2H, t), 3.71-3.57 (14H, br m), 3.56-3.48 (2H, br m), 2.90 (2H, t), 2.84 (4H, br s), 2.35 (2H, t), 2.10-1.99 (2H, br m), 1.74-1.58 (4H, br m), 1.38-1,18 (32H, br m), 0.88 (3H, t).

Ｈ２Ｎ−Ｑ（Ｔｒｔ）−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｌ−Ｃ（Ｔｒｔ）−Ｈ（Ｔｒｔ）−Ｋ（Ｂｏｃ）−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ（Ｔｒｔ）−Ｆ−ＣＯＯＨの調製

ステップ１：中間体１ａの調製
Ｈ−Ｐｈｅ−２−ＣＩＴｒｔ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、３２４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、０．７３ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ａｒｇ残基に２倍の標準Ａｒｇを用いた、自動ペプチド合成装置（ＬＩＢＥＲＲＴＹ ＢＬＵＥ）での固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、０．２Ｍ ＤＭＦ溶液として調製した。

カップリングサイクルは、以下のとおりに定めた：
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（４．０当量）、ＨＡＴＵ（４．０当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×７ｍＬ、各回１分）
− Ｆｍｏｃ脱保護：ピペリジン／ＤＭＦ（１；４）（７ｍＬ、７５℃で３分間）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×７ｍＬ、各回１分）

ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。ペプチド樹脂を真空中にて室温で乾燥させて、中間体１ａ（２．３４７ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を得た。

ステップ２：中間体１ｂ、Ｈ２Ｎ−Ｑ（Ｔｒｔ）−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｌ−Ｃ（Ｔｒｔ）−Ｈ（Ｔｒｔ）−Ｋ（Ｂｏｃ）−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ（Ｔｒｔ）−Ｆ−ＣＯＯＨの調製

中間体１ａ（２．３４７ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）に、２０％ ＨＦＩＰ／ＤＣＭの２４ｍｌの溶液を加え、得られる混合物を室温で２０分間振盪し、次いでろ過し、ろ液をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。完全に切断するために、上記手順を４回実施した。合わせたろ液を真空中にて濃縮して、粗製中間体１ｂ（２．０９ｇ、６８％）を得て、これを精製することなく、直接次の反応ステップのために投入した。ＬＣ／ＭＳ 方法Ｅ：保持時間：１．７４分；ＭＳ Ｍ／２＋１：実測値：１５６５．９、計算値：１５６４．４５８。

実施例１：脂肪酸−リンカー＃１−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ^＊−Ｆ（Ｃ_６−Ｃ_１２ジスルフィド架橋）

ステップ１：
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の中間体１ｂ（３００ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（３５ｍＬ）および水（１５ｍＬ）中の脂肪酸−リンカー構築物＃１（９６０ｍｇ、０．５７５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。完了後、部分真空中にて反応液を濃縮し、定量的収量と推測する粗製物（生成物ＭＷ：４６８１．８７０）として次の反応ステップに送った。

ステップ２：脱保護
ＴＦＡ（４．７５ｍＬ）、ＴＩＰＳ（０．１２５ｍＬ）および水（０．１２５ｍＬ）の溶液に、ＤＴＴ（２９６ｍｇ、１．９２０ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、予め混合したカクテルをステップ１の化合物：（４４９ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）に加え、室温で撹拌した。完了後、部分真空中にて反応液を濃縮した。冷却したジエチルエーテルで残渣を処理し、濁った反応混合物を得て、これを室温で静置した。デカントしてジエチルエーテルを除き、さらなる冷却したジエチルエーテルですすぐことによって、結果として生成したゴムを単離した。ゴムを水（最小量）に溶解し、逆相クロマトグラフィー用の５５ｇのＣ−１８カラムに添加した。２０分間にわたる１００％の水（０．１％ＴＦＡ）から１００％のＡＣＮまでの溶媒の勾配を使用して精製し、薄黄色の油状物として脱保護した化合物（１６０ｍｇ、５４％収率）を得た。
ＬＣＭＳ：方法Ｄ：ＥＬＳＤ：Ｒｔ２．６２分 ＭＳｍ／ｚ １５５５．２［（Ｍ／２）＋Ｈ］＋；

ステップ３：環化−ジスルフィド結合形成

水（２ｍＬ）中のステップ２の脱保護した化合物（１６０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨウ素（ＡｃＯＨ中で５０ｍＭ）（１．３３９ｍＬ、０．０６７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で反応混合物を撹拌した。完了後、反応混合物を逆相クロマトグラフィー用の５５ｇのＣ１８（５５μｇ）カラムに直接添加した。１５分間にわたる１００％水（０．１％ＴＦＡ）から１００％ＡＣＮまでの溶媒の勾配を使用し、ＬＣＭＳによる適切な画分を合わせ、溶媒を蒸発させて除去した。結果として生じた残渣を凍結乾燥させて、表題の化合物（実施例１）を白色固体として得た；
ＬＣＭＳ：方法Ｄ：ＥＬＳＤ：Ｒｔ２．６４分；ＭＳｍ／ｚ１５５４．３［（Ｍ／２）＋Ｈ］＋；

脂肪酸−リンカー構築物＃１を適切な脂肪酸−リンカー構築物＃２〜＃４で置換することによって、以下の実施例を実施例１と同様に調製した。

実施例２：脂肪酸−リンカー構築物＃２を含むコンジュゲート

ＬＣＭＳ：方法Ｄ：ＥＬＳＤ：Ｒｔ２．５６分；ＭＳｍ／ｚ１２８９．９［（Ｍ／２）＋Ｈ］＋；

実施例３：脂肪酸−リンカー構築物＃３を含むコンジュゲート

ＬＣＭＳ：方法Ｄ：ＥＬＳＤ：Ｒｔ２．５２分；ＭＳｍ／ｚ１２０１．８［（Ｍ／２）＋Ｈ］＋；

実施例４：脂肪酸−リンカー構築物＃４を含むコンジュゲート

ＬＣＭＳ：方法Ｄ：ＥＬＳＤ：Ｒｔ２．４９分；ＭＳｍ／ｚ１１１３．６［（Ｍ／２）＋Ｈ］＋；

上記実施例におけるコンジュゲートは、ＡＰＪ受容体力価についてのＥＣ_５０値が約０．０１ｎＭ〜約１１００ｎＭの範囲にあることがわかっている。上記実施例におけるコンジュゲートは、血漿安定性が、３０分より長い、６０分より長い、５時間より長い、１０時間より長い、１２時間より長いことがわかっている。

本発明のコンジュゲートは、ＡＰＪ受容体のアゴニストとして有用であり、したがって、本明細書で開示する疾患などの、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す疾患および状態の治療において有用であるとみなすことができる。

こうして本発明の例示的な実施形態について述べてきたが、当業者は、内部の開示が例示的なものに過ぎないこと、ならびに本発明の範囲内で他の種々の代替形態、改造形態、および変更形態を案出してもよいことを留意すべきである。したがって、本発明は、本明細書で例示するような詳細な実施形態に限定されない。

Claims (15)

1. ａ．以下の式（Ｉ）：
   Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｎｌｅ）−Ｃ^＊−Ｆ （Ｉ）
   ［式中、
   「^＊」で標識された２つのシステインアミノ酸は、それらの側鎖のチオール官能基の間にジスルフィド結合を形成している］
   を有するＡＰＪアゴニストペプチド、またはそのアミドもしくはエステルと、
   ｂ．脂肪酸であって：
   
   から選択され、そのカルボン酸官能基のうちの１つを介して、任意選択的にポリエチレングリコールリンカーを介して、前記ペプチドのＮ末端に共有結合によって連結している、脂肪酸と
   を含む、コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
2. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーが存在し、式（ＩＩＩ）：
   
   ［式中、
   ｙは、１〜３０であり、ＰＥＧリンカーのカルボニル官能基は、式（Ｉ）のペプチドのＮ末端におけるアミノ官能基とアミド結合を形成し、ＰＥＧリンカーのアミノ官能基は、脂肪酸のカルボン酸官能基のうちの１つとアミド結合を形成している］
   のものである、請求項１に記載のコンジュゲート。
3. 前記ポリレチレングリコールリンカーが、式（ＩＩＩ）のものであり、ｙが２〜２５である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
4. 前記脂肪酸が、
   
   である、請求項１から３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
5. 前記脂肪酸が、そのジェミナルなカルボン酸官能基のうちの１つを介して、ＰＥＧリンカーのアミノ官能基に、またはＰＥＧリンカーがない場合には、前記ペプチドのＮ末端のアミノ官能基に付着している、請求項１から４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
6. 前記脂肪酸が、その末端カルボン酸官能基を介して、ＰＥＧリンカーのアミノ官能基に、またはＰＥＧリンカーがない場合には、前記ペプチドのアミノ官能基に付着している、請求項１から４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
7. 
   から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩。
8. その必要のある対象において、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法。
9. 前記疾患または障害が、急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 医薬として使用するための、請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
11. ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または障害の治療または予防において使用するための、請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
12. 急性代償不全心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）または子癇前症の治療において使用するための、請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
13. 治療有効量の請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩と、治療活性のある１種または複数の共薬剤とを含む、組合せ。
14. 前記共薬剤が、イノトロープ、βアドレナリン受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリンアンタゴニスト、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、およびＮＥＰ阻害薬から選択される、請求項１３に記載の組合せ。
15. 治療有効量の請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩と、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。