CN107406490A - 具有改善的半衰期的合成apelin脂肪酸缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了缀合物或其可药用盐，包含式I的合成多肽：Q‑R‑P‑R‑L‑C*‑H‑K‑G‑P‑(Nle)‑C*‑F(I)或其酰胺或酯；和脂肪酸，选自：其中所述脂肪酸经由其羧酸官能团之一、任选地经由聚乙二醇连接基共价连接至肽的N‑末端；和其中标有“*”的两个半胱氨酸氨基酸在它们侧链的硫醇官能团之间形成二硫键。所述缀合物是APJ受体的激动剂。本发明还涉及本发明的缀合物的制备方法及其治疗用途，例如治疗或预防急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。本发明还提供了药理学活性剂的组合和药物组合物。

Description

具有改善的半衰期的合成APELIN脂肪酸缀合物
发明领域：
本发明涉及包含半合成生物分子的组合物，所述半合成生物分子是APJ激动剂多肽和脂肪酸部分的生物缀合物。具体而言，与它们相应的裸多肽相比和/或与以前记载的Apelin生物缀合物相比，本发明的生物缀合物既保留了APJ激动活性，还呈现出对经由肽酶作用的蛋白水解降解的更强的抗性。本发明还涉及制备所述组合物的方法和使用所述组合物作为药物活性剂来治疗心血管疾病的方法。
发明背景：
在西方世界，心力衰竭的发病率占65岁以上成分的约1/100。最常见的病状为心肌收缩力长期不足和由此心输出量(即，任一心室随时间射出的有效血液体积)长期不足。患有慢性心力衰竭的患者在心肌收缩力进一步下降时可以发生代偿失调急性发作，即心脏不能维持足够的血液循环。仅在美国，每年有约50万人因“急性代偿失调性心力衰竭”(ADHF)住院。
目前用于ADHF的疗法包括利尿剂、血管舒张剂和影响收缩力的物质(inotropes)(其直接增加心脏收缩力)。现有的静脉内的影响收缩力的物质(多巴酚丁胺、多巴胺、米力农、左西孟旦)用于急性情况，尽管它们与不良事件如心律失常和长期死亡率增加相关。这些倾向已经阻止了它们在慢性心力衰竭中的应用。地高辛是一种口服的影响收缩力的物质，但其受限于窄的治疗指数、增加的致心律失常可能性和在肾功能不全中的禁忌证。
增加心肌收缩力而没有致心律失常或死亡倾向的心力衰竭疗法是ADHF迫切需要的，而且还可以解决慢性心力衰竭中的大量未满足的医学需要。
Apelin是以前的孤儿G-蛋白-偶联受体(GPCR)、APJ(还称为apelin受体)、血管紧张素样-1受体、血管紧张素II样-1受体等的内源性配体。Apelin/APJ通路广泛地表达于心血管系统中，并且apelin已经在临床前模型中显示出主要的有益的心血管作用。给人急性施用apelin引起外周和冠状血管舒张和增加心输出量(Circulation.2010；121:1818-1827)。结果，APJ激动正在成为心力衰竭患者的重要治疗靶标。apelin受体APJ的激活被认为增加心肌收缩力和提供心脏保护并且没有目前疗法的倾向性。然而，天然apelin显示出极短的半衰期和体内作用持续时间。由于快速的血清清除率和经由肽酶作用的蛋白水解降解，极短的半衰期被公认是递送这类治疗性内源性肽的主要困难。
目前用于克服这一缺点的一种方式是给患者施用大剂量的感兴趣的治疗肽，以便即使一些治疗肽被降解，但是仍然保留为治疗有效的。然而，这种方法对于患者是不适的。因为大部分治疗肽不能口服施用，所以治疗肽必须通过静脉内注射来恒定输注、频繁灌注或通过不方便的皮下注射途径频繁施用。频繁施用的需求还导致许多潜在的肽治疗具有不可接受的高的预计治疗成本。降解肽的大量存在还可产生不期望的副作用。
施用中的不适和高成本是为何大多数具有吸引人的生物活性性质的治疗肽未能开发成候选药物的两个原因。
因此，延长肽半衰期的一种方法是以减慢它们的降解同时仍然保持生物活性的方式修饰治疗肽。这种合成修饰的多肽已经记载在美国专利号8,673,848(代理人案卷号PAT054961-US-NP)中。另一种方法包括通过将肽缀合至一种或多种可以阻止它们通过肾清除的分子如脂肪酸部分来降低清除速率。这类脂肪酸缀合物的实例已经记载在美国临时申请号62/082327(PAT056274-US-PSP2)、美国专利申请号14/336,290(PAT055781-US-NP)和美国专利申请号14/336,262(PAT055418-US-NP)中。
然而，这类生物缀合物对蛋白酶活性可能仍然是敏感的，或者可能不再像它们的非缀合类似物一样具有活性。
因此，需要这样的经修饰的治疗肽：具有增加的半衰期以提供较长的体内作用持续时间，同时维持低毒性和保留经修饰的肽的治疗优点。
附图简述：
图1表示在皮下给药后实施例1和4的化合物的小鼠血浆暴露性质。
发明简述：
本发明涉及通过对感兴趣的治疗肽或多肽、即APJ激动剂进行修饰来克服肽在体内降解的问题。
因此，本发明的目标是提供新的缀合物或其可药用盐，所述缀合物包含a)具有下式(I)的肽：
a.具有下式(I)的APJ激动剂肽：
Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(Nle)-C*-F (I)；或其酰胺或酯，或基本上与之等同的肽；其中标有“*”的两个半胱氨酸氨基酸在它们侧链的硫醇官能团之间形成二硫键；和
b.脂肪酸，选自：
其中所述脂肪酸经由其羧酸官能团之一、任选地经由聚乙二醇连接基共价连接至肽的N-末端。
在一个实施方案中，本发明的缀合物相对于野生型apelin和/或相对于裸(未缀合)apelin类似物(例如Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(Nle)-C*-F)和/或相对于以前描述的apelin缀合物具有以下改进中的至少一种：增加的半衰期；施用后和/或溶解后对降解更强的免疫性；在APJ受体处更强的激动活性。因此，本发明的apelin缀合物特别可用于治疗或预防心血管疾病如心力衰竭、与心力衰竭相关的障碍和病症以及对APJ受体活性的激活有响应的障碍和病症。
任一个上文列出的式I的氨基酸残基可以以保守形式被取代，条件是本发明的缀合物仍然保留功能活性和结构性质(例如半衰期延长、免于降解的保护、构象限制)。本文进一步解释了可允许的保守氨基酸替换的原则和实例。
作为半衰期延长部分的脂肪酸以这样的方式连接，只要增加和/或不干扰本发明的缀合物的组成部分的生物功能。例如，脂肪酸部分经由其羧酸官能团之一连接至肽的N-末端的氨基官能团(当不存在连接基时)，形成酰胺键。或者，脂肪酸部分经由其羧酸官能团之一连接至PEG连接基的氨基官能团(当存在连接基时)。
在一个实施方案中，本发明的缀合物特别可用于治疗或预防与心力衰竭相关的障碍或病症或对APJ受体活性的激活(或激动)有响应的障碍。在另一个实施方案中，本发明的缀合物可用于治疗急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
在一个优选的实施方案中，本发明的apelin缀合物可用于治疗急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)。在另一个优选的实施方案中，所述apelin缀合物可用于治疗慢性心力衰竭。
在另一个实施方案中，本发明涉及在需要该治疗的受治疗者中治疗对APJ受体激活有响应的障碍或疾病的方法，该方法包括给所述受治疗者施用有效量的本发明的缀合物，以便治疗受治疗者中对APJ受体激活有响应的障碍或疾病。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备如本文所述的缀合物的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的缀合物和一种或多种可药用载体。
在另一个实施方案中，本发明涉及组合产品，其包含本发明的缀合物和一种或多种治疗活性剂的药物组合。
在另一个实施方案中，本发明涉及在需要其的受治疗者中激活APJ受体的方法，该方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物。
本发明的这些和其它方面将在下文的发明详述中进行阐述。
发明详述
定义
为了解释本说明书的目的，除非另有指定，否则适用下述定义，并且无论何时适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用的“对调节APJ受体有响应的障碍或疾病”、“对调节APJ有响应的障碍和病症”、“对调节APJ受体活性有响应的障碍和病症”、“对APJ受体活性的激活(或激动)有响应的障碍”等术语包括急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
术语“APJ”(也称为“apelin受体”、“血管紧张素样-1受体”、“血管紧张素II样-1受体”等)表示其基因定位于人11号染色体的长臂上的具有380个残基、7个跨膜结构域的Gi偶联受体(NCBI参考序列号：NP_005152.1，并由NCBI参考序列号NM_005161编码)。APJ在1993年采用简并寡核苷酸引物由基因组人DNA首次克隆(O'Dowd等人,Gene,136:355-60,1993)，并与1型血管紧张素II受体具有显著同源性。但是，尽管具有该同源性，血管紧张素II不结合APJ。尽管作为孤儿多年，但是已经分离出内源性配体并命名为apelin(Tatemoto等人,Biochem Biophys Res Commun 251,471-6(1998))。
如本文所用的“APJ受体活性的激活”指APJ受体活性的增加。APJ受体活性的激活也称为APJ受体的“激动”，例如通过施用本发明的缀合物。
术语“apelin”表示具有77个残基的前蛋白(NCBI参考序列号：NP_0059109.3，并由NCBI参考序列号NM_017413.3编码)，其被加工为apelin肽的生物活性形式，例如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12。全长成熟肽称为“apelin-36”，包含36个氨基酸，但是最强效的同工型为apelin的13mer(apelin-13)的焦谷氨酸盐形式，称为“Pyr-1-apelin-13或Pyr1-apelin-13”。不同的apelin形式记载于例如美国专利6,492,324B1中。
术语“APJ激动剂肽”或“apelin肽”可互换使用，包括已经被修饰以使降解最小和增加血清稳定性以及提供更好的可开发性质的如上定义的“apelin”。在一些实施方案中，“APJ激动剂肽”或“Apelin肽”包括式(I)肽。
如本文所用的术语“肽”或“多肽”可互换使用，指连接在一起的两个或多个氨基酸。使用本领域公认的三字母缩写或一字母缩写来表示构成本发明的肽或多肽的氨基酸残基。除了当以“D”开头时，氨基酸是L-氨基酸。当所述一字母缩写为大写字母时，其指L-氨基酸。当所述一字母缩写为小写字母时，其指D-氨基酸。基团或字符串或氨基酸缩写用于表示肽。应指出肽的左侧为N-末端，且序列从N-末端至C-末端书写。
本发明的肽含有非天然氨基酸(即在自然界中不存在的化合物)，可以供选地采用本领域已知的其它氨基酸类似物。
某些非天然氨基酸可以通过如下文献中记载的技术引入：Deiters等人,J AmChem Soc 125:11782-11783,2003；Wang和Schultz,Science 301:964-967,2003；Wang等人,Science 292:498-500,2001；Zhang等人,Science 303:371-373,2004或美国专利7,083,970。简言之，这些表达系统中的一些涉及位置特异性诱变以将无义密码子如琥珀型TAG引入编码本发明的多肽的可读框中。然后，这些表达载体被引入可利用对所引入无义密码子特异的tRNA的宿主中，并加载所选择的非天然氨基酸。
本领域技术人员将理解，在本文所述的任意多肽的序列中进行各种氨基酸替换、例如保守氨基酸替换，并且没有必然地降低其活性。如本文所用的“常用作其取代基的氨基酸”包括保守替换(即用具有相当的化学特性的氨基酸替换)。对于保守替换的目的，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性(亲水性)天然氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。氨基酸替换的实例包括用相应的D-氨基酸替换L-氨基酸、用高半胱氨酸或其它具有含硫醇侧链的非天然氨基酸替换半胱氨酸、用高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或其它具有含氨基侧链的非天然氨基酸替换赖氨酸或用正缬氨酸替换丙氨酸等。
如本文所用的术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸模拟物，均为它们的D和L立体异构体形式，如果它们的结构允许这样的立体异构形式的话。氨基酸在本文中通过它们的名称、公知的三字母符号或IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission(生物化学命名委员会)推荐的一字母符号来称呼。
术语“天然存在”指在自然界中发现的和未经过人处理的材料。类似地，如本文所用的“非天然存在”、“非天然”等指没有在自然界中发现和已经被人类进行结构修饰或合成的材料。当用于与氨基酸联系时，术语“天然存在”指20种常规氨基酸(即丙氨酸(A或Ala)、半胱氨酸(C或Cys)、天门冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)、苯丙氨酸(F或Phe)、甘氨酸(G或Gly)、组氨酸(H或His)、异亮氨酸(I或Ile)、赖氨酸(K或Lys)、亮氨酸(L或Leu)、甲硫氨酸(M或Met)、天冬酰胺(N或Asn)、脯氨酸(P或Pro)、谷氨酰胺(Q或Gln)、精氨酸(R或Arg)、丝氨酸(S或Ser)、苏氨酸(T或Thr)、缬氨酸(V或Val)、色氨酸(W或Trp)和酪氨酸(Y或Tyr)。
如本文所用的术语“非天然氨基酸”和“非天然的氨基酸”可互换使用，表示无法使用来自任意生物体的未经修饰或经修饰的基因(无论相同或不同)在任意生物体中以生物合成方式产生的氨基酸结构。这些术语指在天然存在(野生型)apelin蛋白质序列或本发明的序列中不存在的氨基酸残基。这些包括但不限于不是20种天然存在的氨基酸之一的经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-赖氨酸(Pcl，例如描述于PCT专利公开WO2010/48582)。此类非天然氨基酸残基可通过替换天然存在的氨基酸和/或通过将非天然氨基酸插入天然存在(野生型)Apelin蛋白质序列或本发明的序列中而引入。还可掺入非天然氨基酸残基以赋予apelin分子以预期的功能，例如，连接官能部分(例如PEG)的能力。当与氨基酸联用时，符号“U”应当指如本文所用的“非天然氨基酸”或“非天然的氨基酸”。
另外，可以理解，这类“非天然氨基酸”需要经修饰的tRNA和经修饰的tRNA合成酶(RS)用于掺入蛋白质。这些“经选择”的正交tRNA/RS对通过如Schultz等人开发的选择方法或通过随机或靶向突变生成。作为举例，吡咯啉-羧基-赖氨酸是“天然氨基酸”，因为它通过从一种生物体转入宿主细胞的基因以生物合成方式生成，并且因为它通过采用天然tRNA和tRNA合成酶基因被并入蛋白质，而对氨基苯丙氨酸(参见Generation of a bacteriumwith a 21amino acids genetic code,Mehl RA,Anderson JC,Santoro SW,Wang L,Martin AB,King DS,Horn DM,Schultz PG.J Am Chem Soc.2003年1月29日；125(4)：935-9)是“非天然氨基酸”，因为尽管它以生物合成方式生成，但是其通过“经选择”的正交tRNA/tRNA合成酶对被并入蛋白质中。
经修饰的编码的氨基酸包括但不限于羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、氮杂环丁烷甲酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌可酸和硫代脯氨酸。术语“氨基酸”还包括这样的天然存在的氨基酸：它们是某些生物体中的代谢物，但是没有通过遗传密码编码用于掺入蛋白质。这类氨基酸包括但不限于鸟氨酸、D-鸟氨酸和D-精氨酸。
如本文所用的术语“氨基酸类似物”指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(仅作为实例，结合氢、羧基、氨基和R基团的α-碳)的化合物。氨基酸类似物包括可逆或不可逆地被化学阻断的天然和非天然氨基酸，或者它们的C-末端羧基、它们的N-末端氨基和/或它们的侧链官能团被化学修饰。这类类似物包括但不限于甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧基甲基)-半胱氨酸、S-(羧基甲基)-半胱氨酸亚砜、S-(羧基甲基)-半胱氨酸砜、天冬氨酸-(β-甲基酯)、N-乙基甘氨酸、丙氨酸甲酰胺、高丝氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸甲基锍。
如本文所用的术语“酰胺”指C-末端的羧酸基团的酰胺衍生物(例如-C(O)NH2、-C(O)NH-C1-6烷基、-C(O)NH-C1-2烷基苯基、-C(O)NH-NHBn或-C(O)N(C1-6alkyl)2)。
术语“酰胺”还指N-末端的氨基的衍生物(例如与apelin肽的N-末端的氨基官能团形成酰胺键的脂肪酸的-羧酸官能团)。
如本文所用的术语“酯”指其中C-末端的羧酸基团的酯衍生物(例如-COOR)，其中所述酯的R表示C1-6烷基基团如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等，C3-8环烷基基团如环戊基、环己基等，C6-10芳基基团如苯基、α-萘基等，C6-10芳基-C1-6烷基基团、例如苯基-C1-2烷基基团如苄基、苯乙基、二苯甲基等，和α-萘基-C1-2烷基基团如α-萘基甲基等。还可以提及新戊酰氧基甲基酯等，其通常用作用于口服施用的酯。当式I的APJ激动剂肽在除C-末端以外的位置具有额外的羧基或羧酸酯基团时，其中这些基团被酰胺化或酯化的那些多肽也落入本发明的多肽的范围内。在此种情形下，这些酯可以例如与上文提及的C-末端酯属于相同种类的酯。
术语“缀合物”和“生物缀合物”可互换使用，意欲指APJ激动剂多肽或式I多肽与脂肪酸部分经由任选的聚乙二醇(PEG)连接基共价连接形成的实体。
术语“半衰期增加”或“增加血清半衰期”或“延长半衰期”指经修饰的生物活性分子(例如apelin 13或类似物)相对于其未经修饰的形式(或肽的裸形式)的循环半衰期的正向改变。血清半衰期通过在施用生物活性分子后的不同时间点采集血样并测定每个样品中该分子的浓度来测定。测定血清浓度随时间的改变能够计算经修饰分子(例如缀合分子)的血清半衰期。通过比较经修饰分子(例如缀合分子)与未经修饰分子(例如apelin 13或其类似物)的血清半衰期，可以确定血清半衰期或t1/2的相对增加。该增加预期为至少约2倍，但是较小的增加可以是有用的。
本发明的缀合物
本文描述了本发明的各种实施方案。应当认识到，在每个实施方案中指定的特征可以与其它指定特征组合以提供其它实施方案。
在实施方案1中，本发明因此提供了缀合物或其可药用盐，其包含：
a.具有下式(I)的APJ激动剂肽：
Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(Nle)-C*-F (I)；或其酰胺或酯，或基本上与之等同的肽；其中标有“*”的两个半胱氨酸氨基酸在它们侧链的硫醇官能团之间形成二硫键；和
b.脂肪酸，选自：:
其中所述脂肪酸经由其羧酸官能团之一、任选地经由聚乙二醇连接基共价连接至肽的N-末端。
在实施方案1A中，本发明涉及缀合物或其可药用盐，其包含：
a.具有下式(I)的APJ激动剂肽：
Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(Nle)-C*-F (I)；其中标有“*”的两个半胱氨酸氨基酸在它们侧链的硫醇官能团之间形成二硫键；和
b.脂肪酸，选自：
其中所述脂肪酸经由其羧酸官能团之一、任选地经由聚乙二醇连接基共价连接至肽的N-末端。
实施方案1或1A中描述的脂肪酸已经记载在美国临时申请号62/082327(PAT056274-US-PSP2)中。
任意聚乙二醇连接基基团都是可选的。连接基在性质上是聚合的，为含有两个反应活性基团/官能团的聚乙二醇部分，其中一个反应活性基团/官能团可以与式I多肽反应，且另一个与脂肪酸部分反应。
在实施方案2中，本发明涉及根据实施方案1或1A的缀合物，其中存在聚乙二醇(PEG)连接基并且其具有式(III)：
其中y为1-30，其中PEG连接基的羰基官能团与式(I)肽的N-末端的氨基官能团形成酰胺键，并且其中PEG连接基的氨基官能团与脂肪酸的羧酸官能团之一形成酰胺键。
在实施方案3中，本发明涉及根据实施方案1、1A或2的缀合物，其中聚乙二醇连接基具有式(III)，且y为2至25。
在实施方案4中，本发明涉及根据上述实施方案任一项的缀合物，其中所述脂肪酸为：
在实施方案5中，本发明涉及根据上述实施方案任一项的缀合物，其中脂肪酸经由其孪位羧酸官能团之一连接至PEG连接基的氨基官能团或者如果不存在PEG连接基的话连接至肽的N-末端的氨基官能团。这由显示了与连接基或与肽的N-末端的连接点的下式表示：
在实施方案6中，本发明涉及根据上述实施方案1-4任一项的缀合物，其中脂肪酸经由其孪位羧酸官能团连接至PEG连接基的氨基官能团或者如果不存在PEG连接基的话连接至肽的氨基官能团。这由显示了与连接基或与肽的N-末端的连接点的下式表示：
在实施方案7中，本发明涉及根据实施方案1或1A的缀合物，选自下述：
和或其可药用盐。
除非另外指明，否则术语“多肽”或“肽”、“APJ肽激动剂”等指式(I)多肽或其酰胺、酯或可药用盐。
在实施方案7A中，本发明的缀合物表现出：1.与野生型apelin、apelin-13、pyr-1-apelin-13和/或相应的裸(非缀合)的式(I)的apelin肽或其类似物相比基本上等同或改善的活性；和/或2.相对于野生型apelin、apelin-13、pyr-1-apelin-13和/或相对于相应的裸(非缀合)的式(I)的apelin肽或其类似物的改善的血浆稳定性。
在实施方案7B中，本发明的缀合物表现出：1.相对于美国专利申请号14/336,293(PAT055781-US-NP)中描述的apelin缀合物和/或相对于美国申请号14/336 262(PAT055418-US-NP)中描述的apelin脂肪酸缀合物的基本上等同或改善的活性；和/或2.相对于apelin缀合物、更特别是相对于美国专利申请号14/336,293(PAT055781-US-NP)中描述的apelin缀合物和/或相对于美国申请号14/336 262(PAT055418-US-NP)中描述的apelin脂肪酸缀合物的等同或改善的血浆稳定性。
在实施方案7A和7B的一个方面，血浆稳定性的改善为至少2倍。
在实施方案7C中，本发明的脂肪酸缀合物具有至少30分钟的血浆稳定性。在另一个实施方案中，本发明的脂肪酸缀合物具有至少60分钟的血浆稳定性。在另一个实施方案中，本发明的脂肪酸缀合物具有至少5小时、优选至少10小时、更优选至少12小时的血浆稳定性。
在实施方案7D中，本发明的apelin脂肪酸缀合物具有小于400nM的EC50。在另一个实施方案中，本发明的apelin脂肪酸缀合物具有小于300nM、优选小于200nM、更优选小于160nM的EC50。在另一个实施方案中，本发明的apelin脂肪酸缀合物具有小于100nM的EC50。
本发明的apelin脂肪酸缀合物还涵盖与之基本上等同的apelin脂肪酸缀合物。本发明的apelin脂肪酸缀合物还涵盖含有与式I肽至少约95％相同的apelin肽或其酰胺、酯或盐的缀合物。
如本文所用的短语“同源氨基酸序列”或其变通形式指以在氨基酸水平上至少特定百分比的同源性为特征的序列，可以与“序列一致性”互换使用。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸替换并且多肽具有相同结合和/或活性的那些氨基酸序列。在某些实施方案中，如果氨基酸序列与比较序列具有至少60％或更高、直到99％一致性，则其为同源的。在一些实施方案中，如果氨基酸序列与比较序列共享一个或多个、直至60个氨基酸替换、添加或缺失，则其为同源的。在一些实施方案中，同源氨基酸序列具有不超过5个或不超过3个保守氨基酸替换。
同源性还可以是多肽水平上的。本发明的肽或多肽或其部分与不同氨基酸序列的一致性程度或百分比如下计算：将两个序列排列中精确匹配的数目除以“本发明的序列”或“外来序列”的长度，无论哪一个是最短的。结果表示为一致性百分数。
包含具有与式I氨基酸序列约80-99.9％、优选90-99.9％同源的氨基酸序列的多肽并且具有优于apelin-13和/或pyr-1-apelin-13和/或相应的未缀合肽的血浆稳定性的缀合物落入本发明的缀合物的范围内。
具有相对于apelin-13和/或pyr-1-apelin-13和/或相应的未缀合肽稍微降低的活性水平的缀合物变体虽然可以被认为是功能和生物学变体，但是理想地，生物学活性缀合物具有相对于apelin-13和/或pyr-1-apelin-13和/或相应的未缀合肽而言相似或增加的生物学性质。
术语“基本上等同”指受体-结合活性、信号转导活性等性质是同等的。因此，可允许存在甚至是例如受体结合活性强度和多肽分子量的等级之间的差异。
如本文所述的多肽或其通过替换、删除、添加或插入一个或多个氨基酸的基本等同物可以称为上述意义上的含有氨基酸序列基本等同物的多肽。如本文所述的多肽或其通过1至5个、优选1至3个、更优选1或2个氨基酸被天然或非天然氨基酸替换的基本同等物可以称为上述意义上的含有氨基酸序列基本同等物的多肽。优选地，形成二硫桥的2个半胱氨酸没有被取代。进一步的修饰和改变可以包括用D-氨基酸替代L-氨基酸或其它变化、包括但不限于磷酸化、羧化、烷基化等，只要包含这类肽的缀合物的APJ激动活性被保持和血浆稳定性相对于apelin-13的焦谷氨酸化形式而言改善和/或相对于相应的未缀合肽而言改善。
式I肽的制备：
式I的apelin肽可以通过合成化学方法或通过重组方法或两种方法的联合来产生。Apelin肽和/或肽-连接基构建体可以制备成全长的或者可以合成为非全长片段并连接。本发明的肽可以通过对肽合成而言本身已知的方法来产生。肽合成方法可以是固相合成和液相合成中的任一者。因此，感兴趣的肽和多肽可以如下来产生：将能够构成蛋白质的部分肽或氨基酸与其剩余部分缩合，当产物具有保护基时分离保护基，由此可以生产预期的肽。已知的缩合和脱保护方法包括以下文献(1)至(5)中记载的操作。
(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti,Peptide Synthesis,IntersciencePublishers,纽约,1966；
(2)Schroeder和Luebke,The Peptide,Academic Press,纽约,1965；
(3)Nobuo Izumiya等人,Fundamentals and Experiments in PeptideSynthesis,Maruzen,1975；
(4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara,Biochemical Experiment Series1,Protein Chemistry IV,205,1977，和
(5)Haruaki Yajima(编辑),Development of Drugs-Continued,14,PeptideSynthesis,Hirokawa Shoten。
反应后，肽可以通过常规纯化技术如溶剂萃取、柱色谱法、液相色谱法和重结晶的联合来进行纯化和分离。当如上所分离的肽为游离化合物时，可通过已知方法将其转化成适宜的盐。相反地，如果所分离的产物是盐，则可通过已知方法将其转化成游离肽。
可通过采用适于酰胺化的用于肽合成的树脂来获得多肽的酰胺。所述树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苄醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟基甲基甲基苯基乙酰氨基甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-羟甲基)苯氧基树脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基树脂、2-氯三苯甲基氯树脂等。采用这类树脂，通过本身已知的各种缩合技术，根据目标肽的序列使其中侧链的α-氨基和官能基团已经适当保护的氨基酸在该树脂上缩合。在系列反应结束时，从树脂移除肽或被保护的肽，除去保护基团，并且在需要时形成二硫键，以获得目标多肽。
对于上述被保护的氨基酸的缩合，可使用多种用于肽合成的活化试剂，例如HATU、HCTU或例如碳二亚胺。碳二亚胺包括DCC、N,N'-二异丙基碳二亚胺和N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。对于利用这类试剂的活化，可使用外消旋化抑制剂添加剂，例如HOBt或Oxyma Pure。被保护的氨基酸可与活化试剂及外消旋化抑制剂一起直接添加至树脂中，或者可预先活化为对称的酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加至树脂中。用于被保护的氨基酸的活化或与树脂缩合的溶剂可适当地选自已知可用于肽缩合反应的溶剂。例如，可提及的是N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯啶酮、氯仿、三氟乙醇、二甲亚砜、DMF、吡啶、二烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯或它们的适宜的混合物。
反应温度可选自迄今已知可用于肽键形成的范围，通常选自约-20℃-50℃的范围。活化的氨基酸衍生物通常以1.5-4倍过量的比例使用。若通过利用茚三酮反应的测试发现缩合不充分，则可在不去除保护基的情况下重复缩合反应以实现充分缩合。如果重复缩合仍无法提供足够程度的缩合，则可用乙酸酐或乙酰基咪唑使未反应的氨基乙酰化。
用于起始材料氨基酸的氨基的保护基包括Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷基氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚磺酰基、二苯基硫膦基(diphenylphosphinothioyl)或Fmoc。可使用的羧基保护基包括但不限于上述的C1-6烷基、C3-8环烷基和C6-10芳基-C1-2烷基以及2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基、苄氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基和三苯甲基酰肼基。
丝氨酸和苏氨酸的羟基可通过酯化或醚化来保护。适于所述酯化的基团包括碳衍生的基团，例如低级烷酰基(例如乙酰基等)、芳酰基(例如苯甲酰基等)、苄氧羰基和乙氧基羰基。适于所述醚化的基团包括苄基、四氢吡喃基和叔丁基。用于酪氨酸的酚羟基的保护基包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。
用于组氨酸的咪唑保护基包括Tos、4-甲氧基-2,3,6-三乙基苯磺酰基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
起始氨基酸的活化羧基包括相应的酸酐、叠氮化物和活性酯，例如与诸如五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt等的醇形成的酯。起始氨基酸的活化氨基包括相应的磷酰胺。
消除保护基的方法包括在催化剂如钯黑或披钯碳的存在下使用氢气催化还原，用无水氢氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这类酸的混合物进行酸处理，用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪进行碱处理，在液氨中用金属钠还原。通过上述酸处理的消除反应通常在-20℃-40℃的温度下进行，并且可通过添加阳离子受体有利地进行，所述阳离子受体诸如苯甲醚、苯酚、苯甲硫醚、间甲酚、对甲酚、二甲硫、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇。用于保护组氨酸的咪唑基团的2,4-二硝基苯基可通过用硫酚处理来消除，而用于保护色氨酸的吲哚基团的甲酰基可通过用稀氢氧化钠溶液或稀氨水碱处理以及在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇存在下通过上述酸处理来消除。
用于保护不应参与起始原料反应的官能基团的方法、可使用的保护基、去除保护基的方法和活化欲参与反应的官能基团的方法可全部从已知基团和方法中有判断地选择。
另一种获得多肽的酰胺形式的方法包括：首先使C-末端氨基酸的-羧基酰胺化，然后向N-侧延长肽链直至期望的链长度，然后选择性地脱保护C-末端肽的α-氨基和待形成目标多肽的剩余部分的氨基酸或肽的α-羧基，在混合溶剂(例如提及上文所的那些)中缩合所述两个片段，其中该两个片段的α-氨基和侧链官能基团已经用上文所述的适宜保护基进行了保护。该缩合反应的参数可以与上文所述相同。通过上述方法，从通过缩合获得的被保护的肽中去除所有保护基，从而提供期望的粗肽。可通过已知纯化方法来纯化该粗肽，将主要级分冷冻干燥，以提供目标酰胺化多肽。为获得多肽的酯，使C-末端氨基酸的α-羧基与期望的醇缩合，得到氨基酸酯，然后进行上文对制造酰胺所述的程序。
脂肪酸部分的合成
流程1描述了实施方案1的脂肪酸部分的合成。
流程1
其中P1和P2是羧酸保护基如甲基、乙基、叔丁基、甲氧基苄基、苄基、苄基氧基、甲氧基甲基、甲基硫甲基、四氢吡喃基、苯甲酰基甲基、N-苯邻二甲酰亚胺、肉桂基、三苯基甲基、9-蒽基甲基、胡椒基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或2-烷基1,3噁唑啉；其中LG是离去基如卤素(例如Br、Cl、I)或三氟甲磺酰基氧基，和其中R1为CH3且p为10，或R1为CH＝CH2且p为9，并且其中m为10且R2为CO2H；如实施方案1中所述。
在碱(例如氢化钠、碳酸钾或碳酸铯、氢氧化钠、二异丙基氨基锂、双(三甲基甲硅烷基)氨基钠、双(三甲基甲硅烷基)氨基钾、四甲基哌啶锂(lithiumtertamethylpiperidide)、1,8-二氮杂环十一碳-7-烯、N,N-二异丙基乙基胺或2,6-二叔丁基putridine)的存在下、在溶剂如DMF、THF或二甲基乙酰胺中用烷基化剂(1B)使被保护的丙二酸(1A)烷基化，产生了被保护的二元酸部分(1C)。
在如上所述的碱性条件下，被保护的二元酸部分(1C)用烷基化剂(1D)进行第二次烷基化，以得到二烷基化的被保护的产物(1E)。采用适当的脱保护方法通过脱保护获得实施方案1的脂肪酸。标准方法可以应用于采用选自但不限于NaOH、KOH或LiOH的碱或选自但不限于TFA、HCl或BCl3的酸进行的中间体(1E)的水解。当P1或P2为苄基或甲氧基苄基时，优选的脱保护方法是在催化剂例如但不限于披钯碳的存在下氢化。
两个烷基化步骤的顺序可以逆转。另外，当R2为CO2H时，可能需要在烷基化步骤之前保护该官能团。用于羧基酸的保护基是本领域已知的(例如苄基)。
更具体的脂肪酸合成实例已经记载在下文试验部分和临时申请号62/082327(PAT056274-US-PSP2)中。
脂肪酸(FA)-PEG连接基构建体的合成：
流程2描述了具有末端CO2H官能团的脂肪酸-PEG连接基构建体的合成。
流程2
其中FA为下式的脂肪酸：
或其被保护的形式，且y为1至30。用于羧酸的保护基已经记载在上述流程1中。
可以在存在或不存在诸如1-羟基苄并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑或二甲基氨基吡啶的试剂的情况下、采用肽缩合剂将脂肪酸(2B)与含PEG的连接基(2A)连接，所述肽缩合剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl)、苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷子基-磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)或苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-磷鎓六氟磷酸盐(BOP)。优选地，在与PEG连接基(2A)的氨基官能团反应之前，采用NHS化学将(2B)的酸官能团转化为其活化形式。
在脂肪酸和PEG连接基两者上存在另外的羧酸官能团时，可以在偶联反应之前引入保护基以控制反应位点。用于羧酸的保护基在上文流程1中有记载。或者，可以采用NHS化学获得羧酸的选择性活化。
脂肪酸-PEG构建体合成的更具体的实例已经记载在下文试验部分和临时申请号62/082327(PAT056274-US-PSP2)中。
缀合物的制备
流程3描述了脂肪酸或脂肪酸-PEG构建体与式I的Apelin肽的N-末端的氨基官能团的缀合：
采用偶联条件经由直接连接的缀合
流程3
其中P为式I的apelin肽，脂肪酸或脂肪酸-PEG构建体连接至生物分子的N-末端，并且其中FA如上文流程2中所定义。
采用标准酰胺偶联方法，使脂肪酸-连接基构建体(3B)或脂肪酸(3B’)经由其羧酸反应活性基团连接至肽(3A)的氨基残基(N-末端的氨基官能团)。已知的偶联方法已经详细记载在上文流程2中。优选地，采用NHS化学使脂肪酸(3B’)或脂肪酸-PEG构建体(3B)上的酸官能团活化。
更详细的实验条件已经记载在下文试验部分和美国临时申请号62/082327(PAT056274-US-PSP2)中。
药物组合物
本发明的缀合物可以以多种方式中的任一种施用，包括皮下、肌内、静脉内、腹腔内、吸入、鼻内、口服等。本发明的特别优选的实施方案使用本发明的缀合物或其酰胺、酯或盐的连续静脉内施用。本发明的另一个优选的实施方案使用本发明的缀合物或其酰胺、酯或盐的皮下施用。
本发明的缀合物可作为推注或作为连续输注在一段时间内施用。可以使用可植入泵。在本发明的某些实施方案中，间歇或连续缀合物施用持续1天至数天(例如2-3天或更多天)或更长时间段，例如数周、数月或数年。在一些实施方案中，提供间歇或连续缀合物施用至少约3天。在其它实施方案中，提供间歇或连续缀合物施用至少约1周。在其它实施方案中，提供间歇或连续缀合物施用至少约2周。在施用期间或在施用多个剂量之间维持平均血浆缀合物浓度高于特定阈值可能是所期望的。可例如基于受治疗者的生理状况、疾病严重性等来确定期望浓度。这些期望值可通过实施标准临床试验来确定。或者，肽及其缀合物可通过FcRn机制被口服递送(Nat Rev Immunol.7(9),715-25,2007；Nat Commun.3；3:610,2012,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304:G262–G270,2013)。
另一个方面，本发明提供了包含本发明的缀合物或和其酰胺、酯或盐以及一或多种可药用载体的药物组合物。该药物组合物可被配制用于特定施用途径如口服施用、胃肠外施用和直肠施用等。此外，本发明的药物组合物可以以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、冻干物、粉剂或栓剂)或以液体形式(包括但不限于溶液剂、混悬剂或乳剂)制备。可对药物组合物进行常规医药操作(例如无菌生产、灭菌)和/或可含有常规惰性稀释剂、饼成形剂(cake forming agents)、张度剂、润滑剂或缓冲剂以及辅助剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。
在一些实施方案中，药物组合物用于皮下施用。适用于皮下施用蛋白质/多肽的制剂组分和方法是本领域已知的。参见例如已公开的美国专利申请号2011/0044977和美国专利号8,465,739和美国专利号8,476,239。通常，用于皮下施用的药物组合物含有适宜的稳定剂(例如氨基酸如甲硫氨酸和或糖如蔗糖)、缓冲剂和张力剂(tonicifying agents)。
适于注射的药物组合物通常包括无菌水溶液(当可溶于水时)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
对于静脉内施用而言，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情形下，组合物均应当是无菌的，并且应当是以易于注射的程度流动的。优选的药物制剂在制造和储存条件下是稳定的，而且必须在抵抗微生物(例如细菌和真菌)污染作用的情况下保存。一般而言，相关载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散剂的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂如糖、多元醇(例如甘露醇)、氨基酸、山梨醇、氯化钠是优选的。可通过将可延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶纳入组合物中来延长可注射组合物的吸收。
某些可注射组合物是等渗水溶液或混悬液，栓剂有利地从脂肪乳液或混悬液制备。所述组合物可被灭菌和/或含有辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物分别根据常规混和、制粒或包衣方法来制备，并且含有约0.1-75％或含有约1-50％的活性成分。
无菌可注射溶液可通过以下方式制备：将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一种或组合掺入适当溶剂中，如需要的那样，随后过滤灭菌。通常，分散体通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自那些上文所列举的所需其它成分的无菌载体中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和来自先前经灭菌过滤的其溶液的任意另外的期望成分的粉末。
本发明还提供了药物组合物和剂型，其包含一种或多种可降低作为活性成分的本发明的化合物的分解速率的物质。本文称作“稳定剂”的此类物质包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。
如本文所用的术语“可药用盐”指保持了本发明的缀合物的生物有效性和性质并且其通常在生物上或在其它方面不是不期望的盐。在许多情形下，本发明的缀合物能够借助氨基和/或羧基或与之类似的基团的存在形成酸和/或碱盐。
可使用无机酸和有机酸来形成可药用的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、chlortheophyllonate、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可由其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可由其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可与无机碱和有机碱来形成可药用的碱加成盐。
可由其衍生盐的无机碱包括例如铵盐和周期表第I族至第XII族的金属。在某些实施方案中，所述盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；尤其适宜的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。
可由其衍生盐的有机碱可包括例如伯、仲和叔胺、取代胺包括天然存在的取代胺、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙基胺、苄星(benzathine)、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪及氨丁三醇。
本发明的可药用盐可通过惯用化学方法从母体化合物、碱性或酸性部分来合成。通常，这些盐可通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量的适当碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)进行反应来制备，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量的适当酸进行反应来制备。这些反应通常是在水或有机溶剂或二者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，使用非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是期望的。其它适宜的盐的列表可例如在“Remington's Pharmaceutical Sciences”,第20版,Mack出版公司,伊斯顿,Pa.,(1985)；和Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,Weinheim,德国,2002)中找到。
如本文所用的术语“可药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合，如对本领域技术人员而言是已知的那样(例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Mack Printing Company,1990,第1289-1329页)。除了其与活性成分不相容以外，在治疗或药物组合物中考虑使用任何常规载体。
本发明的方法:
Apelin肽家族是唯一已知的G蛋白偶联APJ受体的天然配体家族。Apelin基因编码77个氨基酸的多肽，后者被加工成apelin肽的生物活性形式如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12和apelin-13的焦谷氨酸盐修饰形式(Pyr1-apelin-13)。这些apelin肽中的任一者当结合至APJ受体时经由Gi和Gq蛋白质来转导信号。在心肌细胞中，Gi或Gq偶联引起细胞内pH、PLC活化及IP3生成的变化，从而增强肌丝钙敏感性并最终增加心肌收缩力。Gi偶联抑制活化的Gs、腺苷酰环化酶和cAMP生成，并增加pAkt水平，实现心脏保护。在血管内皮细胞中，经由Gi、pAKT的APJ激活增加一氧化氮(NO)生成，后者增加平滑肌松弛，使得整体血管舒张。
慢性稳定性心力衰竭患者具有代偿失调的偶然急性发作，其中心肌收缩力进一步下降且症状恶化。这些加重称为急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)。目前用于ADHF的疗法包括利尿剂、血管舒张剂和影响收缩力的物质(其直接增加心脏收缩力)。现有的静脉内的影响收缩力的物质(多巴酚丁胺、多巴胺、米力农、左西孟旦)的不良事件是熟知的，例如心律失常和长期死亡率增加。本发明的合成apelin脂肪酸缀合物类似物提供了用于ADHF的疗法，其增加心肌收缩力而没有致心律失常或死亡倾向性并且解决了慢性心力衰竭中的大量未满足的医学需要。
确实，人的急性apelin治疗(5分钟)导致冠状血管舒张和心输出量改善。然而，天然apelin显示出极短的t1/2(数秒)和体内作用持续时间(数分钟)。与天然apelin相比和/或与以前描述的合成apelin肽和/或合成apelin脂肪酸缀合物如分别在美国专利号8,673,848(代理人案卷号PAT054961-US-NP)和美国专利申请号14/336,293(PAT055781-US-NP)中记载的那些相比，本发明的强效的合成缀合物APJ激动剂具有更长的半衰期。
心肌细胞中APJ受体的激活a)经由Gi/Gq、PLC和Ca2+改善心肌收缩力和b)经由Gi、pAkt活化提供心脏保护，但不增加cAMP(如使用其它影响收缩力的物质所看到的那样)。另外，内皮细胞中的APJ激动导致动脉血管舒张，其通过卸载左心室的工作而进一步有益于心力衰竭。总之，本发明的缀合物可改善整体心脏功能、减少心律失常发生和提供存活益处。
最近，已经存在大量临床前研究出版物聚焦于Apelin在糖尿病和胰岛素抵抗中的可能参与。Apelin已经被证明1)通过改善肌肉、脂肪和心脏中的葡萄糖吸收来降低血糖水平，2)保护胰β细胞免于ER应激和随后的凋亡，3)降低β细胞中的胰岛素分泌，和4)调节脂肪组织中的儿茶酚胺引起的脂解(lypolysis)。pAKT通路的激活已经牵涉在这些过程中。
包含游离形式或可药用盐形式的式I多肽的缀合物显示出有价值的药理学性质，例如APJ受体激动性质，例如如以下部分中提供的体外和体内测试所显示的那样，因此被指示用于疗法。
本发明的缀合物或其可药用盐可用于治疗选自如下的适应证：急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
因此，作为进一步的实施方案，本发明提供了本文所述的缀合物或其可药用盐在治疗与APJ受体活性相关的疾病中的用途。在进一步的实施方案中，疗法选自对APJ受体的激动有响应的疾病。在另一个实施方案中，疾病选自上述名单，适宜地是急性代偿失调性心力衰竭。在该实施方案的另一个子集中，本发明提供了如本文所述的缀合物或其可药用盐在制备用于治疗与APJ受体活性相关的疾病的药物中的用途。
因此，作为进一步的实施方案，本发明提供了缀合物或其可药用盐在疗法中的用途。在进一步的实施方案中，疗法选自可通过APJ受体的激活(激动)来治疗的疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗对APJ受体的激动有响应的疾病的方法，该方法包括施用治疗可接受量的实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐。在进一步的实施方案中，疾病选自上述名单，适宜地是急性代偿失调性心力衰竭。
在该实施方案的另一个子集中，本发明提供了治疗与APJ受体的活性相关的疾病的方法，该方法包括施用治疗可接受量的实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐。
治疗上使用的本发明的药物组合物或组合的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平因此将部分地根据所递送的分子、使用该缀合物的适应证、施用途径以及患者的尺寸(体重、体表或器官尺寸)和情况(年龄及健康状况)而改变。因此，临床医师可递增剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。根据上述因素，典型剂量可以是约0.1μg/kg至高达约100mg/kg的范围或更高。在其它实施方案中，剂量范围可以是0.1μg/kg直至约100mg/kg；或1μg/kg直至约100mg/kg。
给药频率将取决于所用制剂中的双重功能蛋白的药物动力学参数。通常，临床医师将施用组合物直至达到可实现期望效果的剂量。因此，组合物可作为单一剂量施用，随时间以两个或更多个剂量施用(各剂量可以或不可以含有相同量的期望分子)，或通过植入装置或导管以连续输注方式施用。适当剂量的进一步细分由本领域技术人员以常规方式进行，这在他们所实施的常规任务的范围内。可通过使用适当剂量-反应数据来确定适当剂量。
术语本发明的缀合物的“治疗有效量”指本发明的缀合物引起受治疗者的生物学或医学响应的量，所述响应例如是症状改善、病症缓解、疾病进程延缓或延迟或者预防疾病等。在一个非限制性的实施方案中，术语“治疗有效量”指当施用于受治疗者时有效地发挥如下作用的本发明的生物缀合物的量：(1)至少部分缓解、抑制、预防和/或改善(i)通过APJ受体的激活而改善的或(ii)与APJ受体的活性相关的或(iii)以APJ受体的异常活性为特征的病症、障碍或疾病或其症状；或者(2)激活APJ受体。
在另一个非限制性的实施方案中，术语“治疗有效量”指当施用于细胞或组织或非细胞生物材料或介质时有效地至少部分激活APJ受体的本发明的生物缀合物的量。如本领域普通技术人员将理解的那样，具体活性剂的绝对有效量可根据诸如预期生物学终点、待递送的活性剂、靶组织等的因素而变化。本领域普通技术人员理解，“治疗有效量”可以以单一剂量施用或者可通过多个剂量的施用来实现。例如，在治疗心力衰竭的活性剂的情况下，有效量可以是足以产生患者临床改善的量，例如，增加的运动耐受/能力、增加的血压、减少的流体滞留和/或改善的心脏功能定量实验的结果如射血分数、运动能力(至衰竭的时间)等。
如本文所用的术语“受治疗者”指动物。通常，动物是哺乳动物。受治疗者还指例如灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在一些实施方案中，受治疗者是灵长类。在其它实施方案中，受治疗者是人。
如本文所用的术语“抑制”指减轻或抑制给定的病症、症状或障碍或疾病或者显著降低生物学活性或过程的基线活性。
在一项实施方案中，如本文所用的术语“治疗”任意疾病或障碍指改善该疾病或障碍(即减缓或阻止或减轻该疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一项实施方案中，“治疗”指缓解或改善至少一个身体参数，包括患者不能感受到的那些。在另一个实施方案中，“治疗”指在身体方面调控疾病或障碍(例如稳定可感受到的症状)或在生理学方面调控疾病或障碍(例如稳定身体参数)或二者。在另一个实施方案中，治疗指阻止或延迟疾病或障碍的发作或发展或进程。
如本文所用的术语“预防”、“阻止”等指由施用疗法(例如治疗剂)或施用疗法组合(例如治疗剂的组合)来阻止受治疗者的障碍的一种或多种症状的复发、发作或发展。
如本文所用，如果“受治疗者”将在生物学上、医学上或生活质量上受益于治疗，则该受治疗者“需要”该治疗。
如本文所用，除非本文另外指明或上下文明显矛盾，否则在本发明的上下文(尤其是权利要求的上下文)中所用的术语“一个”、“一种”、“该”、“所述”和类似术语被解释为包括单数和复数。
除非本文另外指明或上下文另外明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任意适宜的顺序实施。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对要求保护的本发明的范围施加任何限制。
本发明的缀合物的活性可以通过下文描述的如下方法进行评价。
hAPJ钙流测定：
将Chem-5APJ稳定细胞(Millipore#HTS068C)以10,000个细胞/孔以384-孔模式铺板在25ul生长培养基中，然后在37℃组织培养温育箱中生长24小时。在试验前1小时，加入25ul/孔FLIPR钙4染料(Molecular Devices R8142)和2.5mM丙磺舒，将细胞在37℃组织培养温育箱中温育1小时。将生物缀合物溶于HBSS、HEPES&0.1％BSA缓冲液中，一式三份从50uM至5pM连续稀释10倍。使用FLIPR Tetra将生物缀合物加入到具有染料的细胞中(1:5，最终生物缀合物浓度为10uM至1pM)。细胞内的FLIPR染料在结合至钙后发射荧光，而来自细胞外部的荧光被遮蔽。在FLIPR Tetra上使用470-495激发波长和515-575发射波长测量了荧光。在加入生物缀合物之前10秒开始进行读数，总计3分钟。针对每个生物缀合物浓度计算最大-最小值并作图，对于生物缀合物对钙流的刺激使用GraphPad prism软件在曲线拐点处计算EC50值。
血浆稳定性试验：
材料：
工作溶液：在Milli-Q水中制备1mg/mL测试制品
萃取溶液：含0.1％甲酸和400ng/mL格列本脲的甲醇:乙腈:水(1:1:1)。
血浆：雄性Sprague-Dawley大鼠血浆(含肝素钠)，购自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。
全血：雄性Sprague Dawley全血(含肝素钠)，购自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。
肺匀浆物：雄性大鼠Sprague Dawley肺购自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。在加入5x体积的1XPBS后，使用polytron匀浆器将肺均化。将匀浆物于4℃以9000rpm离心10分钟。将上清液以3000rpm再次离心30分钟以制得澄清的上清液。使用市售试剂盒(Pierce,Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。
样品制备方法：(肽)
在下述生物基质之一中制备测试制品：肝素化大鼠血浆、肝素化大鼠全血或肺匀浆物。通过将5uL 1mg/mL工作溶液加入到995uL大鼠血浆或全血中制备5000ng/mL的血浆或全血样品。通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将肺匀浆物稀释至1mg/ml蛋白质浓度、随后将5uL工作溶液加入到995uL稀释的肺匀浆物中制备肺匀浆物样品。将样品在水浴温育箱中于37℃在轻柔振摇(65～75rpm)下进行温育。在0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和240分钟的时间，将25uL等分试样的温育样品转入96-孔培养板并立即使用150uL萃取溶液沉淀蛋白质。在温育实验完成后，将样品培养板于4℃以4000rpm离心10分钟。此后，使用移液装置(Tecan Temo)将上清液转入另一块板，向所有样品中加入50uL水。将板涡旋，然后进行LC-MS分析。
样品制备方法：(缀合物)
通过将5uL 1mg/mL工作溶液加入到495uL大鼠血浆中制备50,000ng/mL的试验制品。在水浴温育箱中，将样品于37℃在轻柔振摇(65～75rpm)下进行温育。在0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时的时间，将50uL等分试样的温育样品转入96-孔板，向每份样品中加入100uL的40mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦)。将反应混合物于37℃温育1小时。在反应完成后，使用300uL乙腈进行蛋白质沉淀。将样品培养板于4℃以4000rpm离心10分钟。此后，使用移液装置(Tecan Temo)将125uL上清液转入另一块板，向所有样品中加入50uL水。将板涡旋，然后进行LC-MS分析。
样品稳定性的LC-MS分析
HPLC：带有自动进样器的Agilent 1290HPLC
柱子：MAC-MOD ACE C18,3μm,30mm x 2.1mm i.d.
流动相A：甲酸在乙腈中的0.1％溶液
流动相B：甲酸在水中的0.1％溶液
梯度程序：
质谱仪：Agilent Q-TOF 6530
数据采集模式：使用100–1000m/z质量范围的全扫描
数据采集和分析软件：MassHunter
数据分析：
稳定性试验：通过将每个时间点的峰面积转化为相对于初始(t＝0)峰面积的保留百分比测定了稳定性半衰期(t1/2)值。
保留百分比＝100x(样品峰面积)÷(t＝0峰面积)
计算保留百分比值的自然对数并针对样品时间绘图(Microsoft Excel)。通过线性回归测定该线的斜率k(Microsoft Excel)。然后通过公式t1/2＝0.693÷k计算稳定性半衰期。
基于替代物活性的血浆稳定性试验：
遵循上述钙流方案，其中进行如下改变。将肽也用5％大鼠血浆(Bioreclamation#RATPLNAHP-M,经肝素Na处理)进行温育。在37℃组织培养温育箱中温育后，在t0和t24小时时间点采集读数。通过计算下述值评价以分钟计的肽血浆半衰期：
1)LN((t0的EC50)/(t24小时的EC50))，
2)计算上述值的斜率；和
3)t1/2＝0.693/(斜率^2)。
表1：缀合物的活性和稳定性
表2：血浆稳定性试验与基于替代物活性的血浆稳定性试验之间的相关性：
经由SC给药的体内药物动力学评价的方案和数据
制剂、给药和样品采集：
将实施例1和实施例4溶于在PBS中的30％(w/v)PEG300和5％(w/v)葡萄糖中至0.1mg/mL浓度。给C57/B6小鼠(～20周龄)通过皮下(SC)注射到侧腹给予溶解的化合物(对每种化合物而言n＝4)。注射体积为10ml/kg。在给药后3小时和6小时以及在给药后1、2、4、7和10天，从隐静脉取血样。将血样以4000xg立即离心10分钟。将血浆上清液(10μl)转移到96孔板，于-80℃冷冻直到分析。
将WO2013/111110的实施例8溶于灭菌注射用水(Hospira)中至1mg/mL浓度。给C57/B6J小鼠(～22周龄)通过SC注射给予溶解的化合物(n＝4)。在注射后15、30、60和120分钟从尾静脉取血样。将这些血样立即离心，然后将血浆上清液转移到96孔板，于-80℃冷冻直到分析。
用于生物分析的样品的制备：
获得每种化合物的预称重样品(1-3mg)，在DMSO中溶解至1mg/mL。将这些样品在小鼠血浆(BioReclamation)中系列稀释至最终浓度为10,000、5,000、1,000、500、100、50、10、5和1ng/mL以制备标准分析曲线。
将来自PK研究的血浆样品解冻，通过添加小鼠血浆稀释至25μL的总体积。
将每种样品和标准曲线样品的25μl等分试样安排在96孔板上。向每种样品中加入含100ng/mL格列苯脲的150μL乙腈作为内标，将样品涡旋30秒。然后，将样品以4000xg离心10分钟。然后，将125μl上清液转移到新的96孔板。加入50μl水，涡旋混合30秒。
LC/MS生物分析(Agilent 1290)：
使用CTC PAL自动采样器将样品(10μL)转移到HPLC。LC柱为ACE C18 30x2.1mm,3.0μm珠。使用二元溶剂系统，其含有由甲酸在水中的0.1％溶液组成的溶剂A和由甲酸在乙腈中的0.1％溶液组成的溶剂B。将样品上样到在95％溶剂A(0-0.5min)中的柱上，用5％至50％溶剂B(0.5至1.8分钟)的历经1.8至2.3分钟的50％至98％溶剂B的梯度洗脱。在2.3至2.9分钟将柱子在98％溶剂B中保持，历经2.9-3.0分钟返回至95％溶剂A，在3.0-3.5分钟用95％溶剂A平衡柱子。溶剂流速为700μl/分钟，柱温为50℃。
结果：图1显示了在s.c.给药后实施例1和4的化合物的小鼠血浆暴露曲线；表3总结了半衰期；
表3
本发明的物缀合物可以具有与apelin-13或pyr-1-apelin-13相似的APJ受体效力。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物具有小于400nM的EC50。在另一个实施方案中，本发明的apelin脂肪酸缀合物具有小于300nM、优选小于200nM、更优选小于160nM的EC50。在另一个实施方案中，本发明的生物缀合物具有小于100nM的EC50。
本发明的缀合物具有优于apelin-13或pyr-1-apelin-13和/或优于非缀合的类似物Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(Nle)-C*-F(或pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH)和/或优于以前记载的apelin-脂肪酸缀合物(美国专利申请号14/336,290(PAT055781-US-NP)的实施例20)的血浆稳定性。在一个实施方案中，血浆稳定性的改善是至少2倍。在另一个实施方案中，血浆稳定性的改善是至少10倍。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物具有至少30分钟或至少60分钟的血浆稳定性。在另一个实施方案中，本发明的脂肪酸缀合物具有至少5小时、优选至少10小时、更优选至少12小时的血浆稳定性。
本发明的缀合物可在一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后施用。本发明的缀合物可通过相同或不同施用途径与其它活性剂分开施用，或在同一药组合物中与其它活性剂一起施用。
在一个实施方案中，本发明提供了产品，其包含实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐以及至少一种其它治疗剂，其用作在治疗中同时、分开或依序使用的组合制剂。在一个实施方案中，该疗法是对APJ受体的激活有响应的疾病或病症的治疗。
作为组合制剂提供的产品包括组合物，所述组合物在同一个药物组合物中一起包含实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐以及其它治疗剂，或以分开的形式(例如以药盒形式)包含实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐以及其它治疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐以及另外的治疗剂。任选地，该药物组合物可包含如上文所述的可药用赋形剂。
在一个实施方案中，本发明提供了包含两种或更多种分开的药物组合物的药盒，所述药物组合物的至少之一含有实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐。在一个实施方案中，该药盒包含用于独立地保持所述组合物的装置，例如容器、分离式瓶或分离式箔片包。此类药盒的实例有例如常用于包装片剂、胶囊剂等的泡罩包装。
本发明的药盒可用于施用不同剂型(例如口服及胃肠外)，用于以不同的剂量间隔施用独立的组合物，或用于相互之间调整独立组合物的剂量。为有助于依从性，本发明的药盒通常包含用于施用的说明书。
在本发明的组合疗法中，本发明的缀合物及其它治疗剂可由相同或不同制造商制造和/或配制。此外，可将本发明的缀合物与其它治疗剂如下一起带入组合治疗中：(i)在发放组合产品给医师之前(例如在包含本发明的缀合物和其它治疗剂的药盒的情况下)；(ii)在临施用前由医师自身(或在医师指导下)；(iii)由患者自己，例如在依序施用本发明的缀合物与其它治疗剂期间。
因此，本发明提供了实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐用于治疗对APJ受体的激动有响应的疾病或病症的用途，其中药剂被制备成与其它治疗剂一起施用。本发明还提供其它治疗剂用于治疗对apelin受体的激动有响应的疾病或病症的用途，其中药剂与实施方案1至7D任一种的缀合物或其可药用盐一起施用。
本发明还提供了用于治疗对APJ受体的激动有响应的疾病或病症的方法中的实施方案1至7任一项的缀合物，其中所述缀合物被制备成与其它治疗剂一起施用。本发明还提供了用于治疗对APJ受体的激动有响应的疾病或病症的方法中的其它治疗剂，其中所述其它治疗剂被制备成与实施方案1至7D任一种的缀合物或其可药用盐一起施用。
本发明还提供了实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐用于治疗对AJP受体的激动有响应的疾病或病症的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用其它治疗剂进行过治疗。本发明还提供了其它治疗剂用于治疗对AJP受体的激动有响应的疾病或病症的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐进行过治疗。
在一个实施方案中，其它治疗剂选自影响收缩力的物质、β肾上腺素能受体阻断剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻滞剂(CCB)、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、利尿剂、ApoA-I模拟物、抗糖尿病剂、减肥剂、醛固酮受体阻断剂、内皮素受体阻断剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝剂、松弛素、BNP(奈西立肽)和NEP抑制剂。
术语与第二种活性剂或治疗“组合”包括共同施用本发明的缀合物(例如实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐或本文以其他方式描述的缀合物)与第二种活性剂或治疗；首先施用本发明的化合物，随后施用第二种活性剂或治疗；以及首先施用第二种活性剂或治疗，随后施用本发明的缀合物。
术语“第二种活性剂”包括本领域已知可用于治疗或预防本文所述的疾病或障碍或者减轻其症状的任意活性剂，所述疾病或障碍例如是对APJ受体的激活有响应的障碍或疾病，例如急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
第二种活性剂的实例包括影响收缩力的物质、β肾上腺素能受体阻断剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻滞剂(CCB)、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、利尿剂、ApoA-I模拟物、抗糖尿病剂、减肥剂、醛固酮受体阻断剂、内皮素受体阻断剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝剂、松弛素、BNP(奈西立肽)和/或NEP抑制剂。
如本文所用的影响收缩力的物质包括例如多巴酚丁胺、异丙肾上腺素、米力农、氨力农(amirinone)、左西孟旦、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和地高辛。
如本文所用的β肾上腺素能受体阻断剂包括例如醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
如本文所用的抗凝剂包括达肝素、达那肝素、依诺肝素、肝素、亭扎肝素、华法林。
术语“HMG-Co-A还原酶抑制剂”(也称为β-羟基-β-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶抑制剂)包括可用于降低血液中脂质水平、包括胆固醇的活性剂。其实例包括阿托伐他汀、西立伐他汀、康帕丁(compactin)、达伐他汀、二氢康帕丁(dihydrocompactin)、氟多他汀(fluindostatin)、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、雷司他汀(rivastatin)、辛伐他汀和维洛他汀或其可药用盐。
术语“ACE-抑制剂”(也称为血管紧张素转化酶抑制剂)包括中断血管紧张素I酶降解为血管紧张素II的分子。这类化合物可用于调节血压和治疗充血性心力衰竭。其实例包括阿拉普利、贝那普利、贝那普利拉、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、伊那普利拉(enaprilat)、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、莫昔普利、莫维托普利(moveltopril)、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利和群多普利或其可药用盐。
术语“内皮素拮抗剂”包括波生坦(参见EP526708A)、替唑生坦(参见WO96/19459)或其可药用盐。
术语“肾素抑制剂”包括地替吉仑(化学名称：[1S-[1R*,2R*,4R*(1R*,2R*)]]-1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-L-脯氨酰基-L-苯基丙氨酰基-N-[2-羟基-5-甲基-1-(2-甲基丙基)-4-[[[2-甲基-1-[[(2-吡啶基甲基)氨基]羰基]丁基]氨基]羰基]己基]-N-α-甲基-L-组氨酸酰胺)；特拉吉仑(化学名：[R-(R*,S*)]-N-(4-吗啉基羰基)-L-苯基丙氨酰基-N-[1-(环己基甲基)-2-羟基-3-(1-甲基乙氧基)-3-氧代丙基]-S-甲基-L-半胱氨酸酰胺)；阿利吉仑(化学名：(2S,4S,5S,7S)-5-氨基-N-(2-氨甲酰基-2,2-二甲基乙基)-4-羟基-7-{[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基}-8-甲基-2-(丙-2-基)壬酰胺)和占吉仑(化学名：[1S-[1R*[R*(R*)],2S*,3R*]]-N-[1-(环己基甲基)-2,3-二羟基-5-甲基己基]-α-[[2-[[(4-甲基-1-哌嗪基)磺酰基]甲基]-1-氧代-3-苯基丙基]-氨基]-4-噻唑丙酰胺)或其盐酸盐或由Speedel开发的SPP630、SPP635和SPP800，或式(A)和(B)的RO 66-1132和RO66-1168：
或其可药用盐。
若无特别定义，则术语“阿利吉仑”应理解为游离碱及其盐，尤其是其可药用盐，最优选其半富马酸盐。
术语“钙通道阻滞剂(CCB)”包括二氢吡啶化合物(DHP)和非DHP化合物(例如地尔硫卓型和维拉帕米型CCB)。其实例包括氨氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、瑞司啶(ryosidine)、伊拉地平、拉西地平、尼卡地平、硝苯地平、尼古地平、尼鲁地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、维拉帕米和尼伐地平(nivaldipine)，优选是选自下述的非-DHP代表物：氟桂利嗪、普尼拉明、地尔硫卓、芬地林、戈洛帕米、米贝拉地尔、阿尼帕米、噻帕米和维拉帕米或其可药用盐。CCB可以用作抗高血压药、抗心绞痛药或抗心律失常药。
术语“利尿剂”包括噻嗪衍生物(例如氯噻嗪、氢氯噻嗪、甲基氯噻嗪和氯噻酮)。
术语“ApoA-I模拟物”包括D4F肽(例如式D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F)。
血管紧张素II受体拮抗剂或其可药用盐应理解为与血管紧张素II受体的AT1-受体亚型结合但不导致该受体激活的活性成分。作为AT1-受体抑制的结果，这些拮抗剂可以例如用作抗高血压药或用于治疗充血性心力衰竭。
AT1受体拮抗剂类别包括具有不同结构特征的化合物，尤其优选的是非肽类化合物。例如，可提及选自如下的化合物：缬沙坦、氯沙坦、坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、沙普立沙坦、他索沙坦、替米沙坦、具有下式的命名为E-1477的化合物：
具有下式的命名为SC-52458的化合物：
以及具有下式的命名为ZD-8731的化合物
或其各自的可药用盐。
优选的AT1-受体拮抗剂是坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙坦、缬沙坦。还优选的是已经上市的那些活性剂，最优选是缬沙坦或其可药用盐。
术语“抗糖尿病剂”包括促进胰岛素从胰β-细胞分泌的胰岛素分泌增强剂。其实例包括双胍衍生物(例如二甲双胍)、磺酰脲(SU)(例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、4-氯-N-[(1-吡咯啶基氨基)羰基]-苯磺酰胺(格列吡脲(glycopyramide))、格列苯脲(格列本脲)、格列齐特、1-丁基-3-间氨基苯磺酰脲、氨磺丁酰、格列波脲(glibonuride)、格列吡嗪、格列喹酮、格列帕特(glisoxepid)、格列噻唑、格列丁唑(glibuzole)、格列已脲、格列嘧啶、格列平脲、苯磺丁脲和甲苯基环拉酰胺(tolylcyclamide)或其可药用盐。其它实例包括苯丙氨酸衍生物(例如具有下式的那格列胺[N-(反式-4-异丙基环己基羰基)-D-苯丙氨酸](参见EP196222和EP526171)
瑞格列奈[(S)-2-乙氧基-4-{2-[[3-甲基-1-[2-(1-哌啶基)苯基]丁基]氨基]-2-氧代乙基}苯甲酸](参见EP589874、EP147850A2，特别是第61页实施例11，和EP207331A1)；(2S)-2-苄基-3-(顺式-六氢-2-异二氢吲哚基羰基)-丙酸钙二水合物(例如米格列奈(参见EP507534))和格列美脲(参见EP31058)。
可以与本发明的缀合物组合使用的第二种活性剂的其它实例包括DPP-IV抑制剂、GLP-1和GLP-1激动剂。
DPP-IV负责使GLP-1去活化。更具体而言，DPP-IV产生GLP-1受体拮抗剂，由此缩短对GLP-1的生理学响应。GLP-1是胰腺胰岛素分泌的主要剌激物，对葡萄糖处置具有直接有益作用。
DPP-IV(二肽基肽酶IV)抑制剂可以是肽化合物或优选是非肽化合物。例如在WO98/19998、DE 196 16 486 A1、WO 00/34241和WO 95/15309中，特别是在其各自的化合物权利要求和实施例的终产物中，概括地和具体地公开了DPP-IV抑制剂，这些文献的终产物、药物制剂和权利要求的主题在此处引入本申请作为公开内容的参考。优选分别具体地公开在WO98/19998的实施例3和WO00/34241的实施例1中的那些化合物。
GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是促胰岛素蛋白质，其例如由W.E.Schmidt等人在Diabetologia,28,1985,704-707中和在US5,705,483中公开。
术语“GLP-1激动剂”包括GLP-1(7-36)NH2的变体和类似物，其具体公开在US5,120,712、US5,118666、US5,512,549、WO91/11457中和C.Orskov等人的J.Biol.Chem.264(1989)12826中。其它实例包括GLP-1(7-37)，在该化合物中，Arg36的羧基末端酰胺官能团被GLP-1(7-36)NH2分子的37位的Gly替代，及其变体和类似物，包括GLN9-GLP-1(7-37)、D-GLN9-GLP-1(7-37)、乙酰基LYS9-GLP-1(7-37)、LYS18-GLP-1(7-37)和尤其是GLP-1(7-37)OH、VAL8-GLP-1(7-37)、GLY8-GLP-1(7-37)、THR8-GLP-1(7-37)、MET8-GLP-1(7-37)和4-咪唑并丙酰基-GLP-1。特别优选Greig等人在Diabetologia 1999,42,45-50中描述的GLP激动剂类似物艾塞那肽-4(exendin-4)。
“抗糖尿病剂”的定义还包括胰岛素敏感性增强剂，其恢复受损的胰岛素受体功能以降低胰岛素抗性和因此增强胰岛素敏感性。其实例包括降血糖的噻唑烷二酮衍生物(例如格列酮(glitazone)、(S)-((3,4-二氢-2-(苯基-甲基)-2H-1-苯并吡喃-6-基)甲基-噻唑烷-2,4-二酮(恩格列酮)、5-{[4-(3-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-1-氧代丙基)-苯基]-甲基}-噻唑烷-2,4-二酮(达格列酮)、5-{[4-(1-甲基-环己基)甲氧基)-苯基]甲基}-噻唑烷-2,4-二酮(环格列酮)、5-{[4-(2-(1-吲哚基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2,4-二酮(DRF2189)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-乙氧基)]苄基}-噻唑烷-2,4-二酮(BM-13.1246)、5-(2-萘基磺酰基)-噻唑烷-2,4-二酮(AY-31637)、双{4-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)甲基]苯基}甲烷(YM268)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-2-羟基乙氧基]苄基}-噻唑烷-2,4-二酮(AD-5075)、5-[4-(1-苯基-1-环丙烷羰基氨基)-苄基]-噻唑烷-2,4-二酮(DN-108)5-{[4-(2-(2,3-二氢吲哚-1-基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2,4-二酮、5-[3-(4-氯苯基])-2-丙炔基]-5-苯基磺酰基)噻唑烷-2,4-二酮、5-[3-(4-氯苯基])-2-丙炔基]-5-(4-氟苯基-磺酰基)噻唑烷-2,4-二酮、5-{[4-(2-(甲基-2-吡啶基-氨基)-乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2,4-二酮(罗西格列酮)、5-{[4-(2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基)苯基]-甲基}噻唑烷-2,4-二酮(吡格列酮)、5-{[4-((3,4-二氢-6-羟基-2,5,7,8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)甲氧基)-苯基]-甲基}-噻唑烷-2,4-二酮(曲格列酮)、5-[6-(2-氟-苄基氧基)萘-2-基甲基]-噻唑烷-2,4-二酮(MCC555)、5-{[2-(2-萘基)-苯并噁唑-5-基]-甲基}噻唑烷-2,4-二酮(T-174)和5-(2,4-二氧代噻唑烷-5-基甲基)-2-甲氧基-N-(4-三氟甲基-苄基)苯甲酰胺(KRP297))。
其它抗糖尿病剂包括胰岛素信号传导通路调节剂，如蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)抑制剂、抗糖尿病非小分子模拟物化合物和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰氨基转移酶(GFAT)抑制剂；影响失调的肝葡萄糖产生的化合物，如葡萄糖-6-磷酸酶(G6P酶)抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶(F-1,6-Bp酶)抑制剂、糖原磷酸化酶(GP)抑制剂、胰高血糖素受体拮抗剂和磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)抑制剂；丙酮酸脱氢酶激酶(PDHK)抑制剂；胃排空抑制剂；胰岛素；GSK-3抑制剂；类视色素X受体(RXR)激动剂；β-3AR激动剂；解偶联蛋白(UCP)激动剂；非格列酮型PPARγ激动剂；双重PPARα/PPARγ激动剂；抗糖尿病的含钒化合物；肠降血糖素激素，如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和GLP-1激动剂；β-细胞咪唑啉受体拮抗剂；米格列醇；α2-肾上腺素能拮抗剂；及其可药用盐。
在一个实施方案中，本发明提供了组合、特别是药物组合，其包含治疗有效量的实施方案1至7D任一项的缀合物或其可药用盐以及一种或多种选自以下的治疗活性剂：β-肾上腺素能受体阻断剂，例如醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔；血管紧张素II受体拮抗剂，例如AT1阻断剂；抗糖尿病剂，例如DPPIV抑制剂(例如维格列汀)和GLP-1肽激动剂。
术语“减肥剂”包括脂肪酶抑制剂(例如奥利司他)和食欲抑制剂(例如西布曲明和芬特明)。
醛固酮合酶抑制剂或其可药用盐应理解为是具有抑制醛固酮产生的性质的活性成分。醛固酮合酶(CYP11B2)是催化肾上腺皮质中的醛固酮产生的最后步骤(即，11-脱氧皮质酮向醛固酮的转化)的线粒体细胞色素P450酶。用所谓的醛固酮合酶抑制剂抑制醛固酮产生已知是治疗低钾血、高血压、充血性心力衰竭、心房纤维性颤动或肾衰竭的成功变体。该醛固酮合酶抑制活性容易由本领域技术人员按照标准分析(例如US2007/0049616)进行测定。
醛固酮合酶抑制剂类别包含甾族和非甾族醛固酮合酶抑制剂，后者是最优选的。
优选的是市售可获得的醛固酮合酶抑制剂或已经被卫生当局批准的那些醛固酮合酶抑制剂。
醛固酮合酶抑制剂类别包含具有不同结构特征的化合物。非甾族醛固酮合酶抑制剂的实例是下式的法倔唑盐酸盐的(+)-对映异构体(US专利4617307和4889861)
或者如果适合的话其可药用盐。
可用于所述组合的醛固酮合酶抑制剂是在例如US2007/0049616中、特别是在化合物权利要求和实施例的终产物中概括地和具体地公开的化合物和类似物，该文献的终产物、药物制剂和权利要求的主题在此处引入本申请作为公开内容的参考。适用于本发明的优选的醛固酮合酶抑制剂包括但不限于4-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-3-甲基苄腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸(4-甲氧基苄基)甲基酰胺；4'-氟-6-(6,7,8,9-四氢-5H-咪唑并[1,5-a]氮杂卓-5-基)联苯-3-甲腈；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸丁基酯；4-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲氧基苄腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸4-氟苄基酯；5-(4-氰基-2-三氟甲氧基苯基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸甲酯；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸2-异丙氧基乙基酯；4-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲基苄腈；4-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-3-氟苄腈；4-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲氧基苄腈；3-氟-4-(7-亚甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)苄腈；顺式-3-氟-4-[7-(4-氟-苄基)-5,6,7,8-四氢-咪唑并[1,5-a]吡啶-5-基]苄腈；4'-氟-6-(9-甲基-6,7,8,9-四氢-5H-咪唑并[1,5-a]氮杂卓-5-基)联苯-3-甲腈；4'-氟-6-(9-甲基-6,7,8,9-四氢-5H-咪唑并[1,5-a]氮杂卓-5-基)联苯-3-甲腈或其各自的(R)或(S)对映异构体；或如果合适的话其可药用盐。
术语醛固酮合酶抑制剂还包括公开在WO2008/076860、WO2008/076336、WO2008/076862、WO2008/027284、WO2004/046145、WO2004/014914、WO2001/076574中的化合物和类似物。
此外，醛固酮合酶抑制剂还包括在下述文献中公开的化合物和类似物：美国专利申请US2007/0225232、US2007/0208035、US2008/0318978、US2008/0076794、US2009/0012068、US20090048241和PCT申请WO2006/005726、WO2006/128853、WO2006128851、WO2006/128852、WO2007065942、WO2007/116099、WO2007/116908、WO2008/119744和欧洲专利申请EP1886695。适用于本发明的优选的醛固酮合酶抑制剂包括但不限于由Speedel研发的8-(4-氟苯基)-5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c1[1,4]噁嗪；4-(5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2-氟苄腈；4-(5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2,6-二氟苄腈；4-(5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2-甲氧基苄腈；3-(5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)酞腈；4-(8-(4-氰基苯基)-5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)萘-1-甲腈；8-[4-(1H-四唑-5-基)苯基1-5,6-二氢-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪；或其各自的(R)或(S)对映异构体；或如果合适的话其可药用盐。
可用于所述组合的醛固酮合酶抑制剂是在例如WO2009/156462和WO2010/130796中、特别是在化合物权利要求和实施例的终产物中和终产物、药物制剂和权利要求的主题中概括地和具体地公开的化合物和类似物。适用于本发明的组合的优选的醛固酮合酶抑制剂包括3-(6-氟-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚-1-基甲基)-苄腈盐酸盐、1-(4-甲磺酰基-苄基)-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚、2-(5-苄氧基-吡啶-3-基)-6-氯-1-甲基-1H-吲哚、5-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-烟酸乙酯、N-[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺酰胺、吡咯烷-1-磺酸5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基酯、N-甲基-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺酰胺、6-氯-1-甲基-2-{5-[(2-吡咯烷-1-基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-2-[5-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-3-基]-1-甲基-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-1-甲基-2-{5-[(1-甲基-哌啶-4-基氨基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、吗啉-4-甲酸[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-酰胺、N-[5-(6-氯-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺酰胺、C,C,C-三氟-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺酰胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-4-三氟甲基-苯磺酰胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-1-苯基-甲磺酰胺、N-(5-(3-氯-4-氰基苯基)吡啶-3-基)丁烷-1-磺酰胺、N-(1-(5-(4-氰基-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)乙基)乙磺酰胺、N-((5-(3-氯-4-氰基苯基)吡啶-3-基)(环丙基)甲基)乙磺酰胺、N-(环丙基(5-(1H-吲哚-5-基)吡啶-3-基)甲基)乙磺酰胺、N-(环丙基(5-萘-1-基-吡啶-3-基)甲基)乙磺酰胺、乙磺酸[5-(6-氯-1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-吡啶-3-基甲基]-酰胺和乙磺酸{[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-环丙基-甲基}-乙基-酰胺。
术语“内皮素受体阻断剂”包括波生坦和安立生坦。
术语“CETP抑制剂”指抑制胆固醇酯转移蛋白(CETP)所介导的各种胆固醇酯和甘油三酯从HDL向LDL和VLDL的转运的化合物。这类CETP抑制活性容易由本领域技术人员按照标准分析(例如美国专利号6,140,343)进行测定。实例包括在美国专利号6,140,343和美国专利号6,197,786中公开的化合物(例如[2R,4S]4-[(3,5-双-三氟甲基-苄基)-甲氧基羰基-氨基]-2-乙基-6-三氟甲基-3,4-二氢-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(托彻普(torcetrapib))；在美国专利号6,723,752中公开的化合物(例如(2R)-3-{[3-(4-氯-3-乙基-苯氧基)-苯基]-[[3-(1,1,2,2-四氟-乙氧基)-苯基]-甲基]-氨基}-1,1,1-三氟-2-丙醇)；在美国专利申请序列号10/807,838中公开的化合物；在美国专利号5,512,548中公开的多肽衍生物；分别在J.Antibiot.,49(8)：815-816(1996)和Bioorg.Med.Chem.Lett.；6:1951-1954(1996)中公开的胆固醇酯的玫瑰酮内酯衍生物和含磷酸盐类似物。此外，CETP抑制剂还包括在WO2000/017165、WO2005/095409、WO2005/097806、WO2007/128568、WO2008/009435、WO2009/059943和WO2009/071509中公开的那些。
术语“NEP抑制剂”指抑制中性内肽酶(NEP)EC3.4.24.11的化合物。其实例包括坎沙曲、坎沙曲拉、右卡多曲、依卡曲尔、消旋卡多曲、山帕曲拉、法西多曲、奥马曲拉、吉莫曲拉(Gemopatrilat)、达格鲁曲(Daglutril)、SCH-42495、SCH-32615、UK-447841、AVE-0848、PL-37和(2R,4S)-5-联苯-4-基-4-(3-羧基-丙酰基氨基)-2-甲基-戊酸乙酯或其可药用盐。NEP抑制剂还包括如在美国专利US5,155,100中公开的膦酰基/联芳基取代的二肽衍生物。NEP抑制剂还包括如在PCT申请WO2003/104200中公开的N-巯基酰基苯丙氨酸衍生物。NEP抑制剂还包括如在PCT申请WO2008/133896、WO2009/035543或WO2009/134741中公开的双重作用抗高血压药。其它实例包括美国专利申请号12/788,794、12/788,766和12/947,029中公开的化合物。NEP抑制剂还包括在WO2010/136474、WO2010/136493、WO2011/061271和美国临时申请号61/414171和61/414163中公开的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了激活受治疗者的APJ受体的方法，其中所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的前述实施方案任一项的缀合物或其可药用盐。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗受治疗者的对APJ受体的激活有响应的障碍或疾病的方法，其中所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的前述实施方案任一项的缀合物或其可药用盐。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗受治疗者的对APJ受体的激活(激动)有响应的障碍或疾病的方法，其中所述障碍或疾病选自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
在一个实施方案中，本发明提供了用作药物的前述实施方案任一项的缀合物或其可药用盐。
在一个实施方案中，本发明提供了前述实施方案任一项的缀合物或其可药用盐在制备用于治疗对APJ受体的激活有响应的障碍或疾病的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了前述实施方案任一项的缀合物或其可药用盐在制备用于治疗对APJ受体的激活有响应的障碍或疾病的药物中的用途，其中所述障碍或疾病特别选自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
本发明的示例：
方法
分析方法A：
●Acquity BEH 1.7μm 2.1x50mm
●洗脱液：A：水(0.1％甲酸)；B：CAN(0.1％甲酸)
●流速：1mL/min
●梯度：0分钟2％B；1.76分钟内，2％至98％B；2.06分钟，98％B；2.16分钟，2％B
●质谱仪：Single Quadrupole ESI扫描范围120-1600
●HPLC：waters Acquity
●温度：50℃
分析方法B：
●Acquity BEH 1.7μm 2.1x50mm
●洗脱液：A：水(0.1％甲酸)；B：CAN(0.1％甲酸)
●流速：1mL/min
●梯度：0分钟40％B；1.40分钟内，40％至98％B；2.05分钟98％B；2.1分钟，40％B
●质谱仪：Single Quadrupole ESI扫描范围120-1600
●HPLC：waters Acquity
●温度：50℃
分析方法C：
●Hilic 2.1x100mm
●洗脱液：A：CO2；B：MeOH
●流速：2mL/min
●梯度：0.15分钟2％B；1.65分钟内2％至50％B；2.1分钟50％B；2.25分钟2％B；2.5分钟2％B
●质谱仪：Single Quadrupole ESI
●SCF：waters Acquity
●温度：55℃
分析方法D：
●Sunfire C18 3.5μm 3.0x3.0mm
●洗脱液：A：水(0.05％三氟乙酸)；B：ACN
●流速：2mL/min
●梯度：0分钟5％B；4.3分钟内，5％至80％B；4.70分钟95％B；5.00分钟95％B；5.10分钟5％B
●质谱仪：Waters micromass ZQ；Single Quadrupole ESI扫描范围120-1600
●HPLC：Agilent 1100系列
●温度：40℃
分析方法E：
●Xbridge C18柱,3.5μM,3.0x3.0mm
●洗脱液：A：水+5mM氢氧化铵；B：ACN
●流速：2mL/min
●梯度：0.0分钟2％B；1.70分钟内，2％至95％B；2.00分钟95％B；2.10分钟5％B；
●质谱仪：Single Quadrupole ESI
●HPLC：Agilent 1100系列
●温度：40℃
脂肪酸-连接基构建体#_1的制备：
步骤1：2-十一烷基丙二酸1-苄基酯3-叔丁基酯
在N2下，在0℃下，向NaH(160mg,4.0mmol)在DMF(8mL)中的混悬液中加入在DMF(2mL)中的丙二酸苄基酯叔丁基酯(1.0g，4.0mmol)。将混合物搅拌50分钟，然后加入在DMF(2mL)中的1-溴十一碳烷。另外搅拌1小时后，使反应物温热至室温。保持反应过夜。加入Et2O(100mL)和水(20mL)以分配反应物。水相用Et2O(100mL)萃取，合并的有机物经Na2SO4干燥。蒸发溶剂，残余物经快速柱(C18 12g,40-100％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到呈无色油状的标题化合物(1.14g，2.82mmol,71％)：
LCMS方法B Rt＝1.58min,M+Na 427.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm0.84-0.96(m,3H)1.28(br.s,12H)1.31(m,J＝3.90Hz,6H)1.41(s,9H)1.88(q,J＝7.38Hz,2H)3.29(t,J＝7.58Hz,1H)5.19(q,J＝12.27Hz,2H)7.30-7.42(m,5H)。
步骤2：二十二烷-1,11,11-三甲酸1,11-二苄基酯11-叔丁基酯
在N2下，在0℃下，将2-十一烷基丙二酸1-苄基酯3-叔丁基酯(650mg,1.61mmol)在DMF(1mL)中的溶液缓慢加入NaH(70.7mg,1.77mmoL)在DMF(6mL)中的溶液中。搅拌该混合物40分钟，然后加入在DMF(1mL)中的11-溴十一酸苄基酯(571mg,1.61mmol)。当加入时，允许反应物温热至室温，搅拌过夜。将反应物用Et2O(100mL)稀释，用水(20mL)萃取。用Et2O(100mL)萃取水相，合并的有机相经Na2SO4干燥。蒸发溶剂。通过快速柱(二氧化硅80g，0-10％EtOAc/HEP)纯化残余物，得到呈无色油状的标题化合物(823mg,1.21mmol，75％)：
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-0.94(m,3H)1.12(m,J＝6.60Hz,4H)1.19-1.33(m,28H)1.35(s,9H)1.66(quin,J＝7.40Hz,2H)1.85(t,J＝8.44Hz,4H)2.37(t,J＝7.52Hz,2H)5.14(s,2H)5.16(s,2H)7.30-7.42(m,10H)。
步骤3：13-(苄氧基)-2-((苄氧基)羰基)-13-氧代2-十一烷基十三烷酸
向来自步骤2的化合物(200mg,0.295mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入TFA(0.6mL)，将反应物于室温搅拌3小时。蒸发溶剂，通过快速柱(二氧化硅12g，0-15％EtOAc/HEP)纯化残余物，得到标题化合物(177mg,0.284mmol，96％)：
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.87-0.94(m,3H)0.94-1.05(m,2H)1.19(br.s.,14H)1.23-1.37(m,16H)1.65(quin,J＝7.40Hz,2H)1.78-1.91(m,2H)1.93-2.05(m,2H)2.37(t,J＝7.52Hz,2H)5.14(s,2H)5.27(s,2H)7.31-7.44(m,10H)。
步骤4：二十二烷-1,11,11-三甲酸1,11-二苄基酯11-(2,5-二氧代环戊基)酯
在N2下，将DCC(58.6mg,0.284mmol)在DCM(1mL)中的溶液加入到来自步骤3的酸(177mg,0.284mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(32.7mg,0.284mmol)在DCM(2mL)和THF(0.3mL)中的溶液中。将反应物于室温搅拌4小时。蒸发溶剂，通过快速柱(二氧化硅12g，0-35％EtOAc/HEP)纯化残余物，得到呈无色油状的标题化合物(153mg,0.213mmol,75％)：
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H)1.12-1.21(m,2H)1.21-1.37(m,30H)1.66(quin,J＝7.40Hz,2H)1.89-2.07(m,4H)2.37(t,J＝7.58Hz,2H)2.84(br.s.,4H)5.13(s,2H)5.25(s,2H)7.30-7.47(m,10H)。
步骤5:
将来自步骤4(145mg,0.201mmol)的中间体在THF(1.5mL)和DCM(1.5mL)中的溶液加入到装有氨基-PEG24-甲酸的小瓶中。加入DIPEA(88mL,0.504mmol)，在搅拌器板上搅拌该反应物15小时。蒸发溶剂，通过超临界流体色谱法(Waters HILIC 20x150mm；15-25％MeOH/CO2)纯化残余物，得到期望的偶联化合物(151mg,0.086mmol,43％)：LCMS方法C；Rt＝1.30min,[M+2H]+2876.4；
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H)0.93-1.04(m,2H)1.19(br.s.,15H)1.23-1.37(m,15H)1.61-1.68(m,2H)1.78(td,J＝12.44,4.34Hz,2H)1.92-2.05(m,2H)2.37(t,J＝7.58Hz,2H)2.62(t,J＝6.05Hz,2H)3.49(dd,J＝6.72,2.32Hz,2H)3.52-3.59(m,2H)3.59-3.73(m,92H)3.80(t,J＝6.05Hz,2H)5.13(s,2H)5.18(s,2H)7.31-7.42(m,10H)8.09(t,J＝5.26Hz,1H)。
步骤6：
将在DCM(0.265mL)中的DCC(22mg,0.103mmol)加入到来自步骤5的化合物(150mg,0.086mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺在DCM(1.5mL)中的溶液中。搅拌该反应物1.5小时。加入另外的在THF(0.5mL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(10mg)和在DCM(0.265mL)中的DCC(22mg)，搅拌该反应物过夜。蒸发溶剂，通过快速柱(二氧化硅12，0-5％甲醇/DCM)纯化残余物，得到呈白色固体的活化的NHS化合物(159mg,定量)：LCMS方法B；Rt＝1.55min,[M+H3O+H]+2 933.9。
步骤7:
向来自步骤6的化合物(159mg,0.086mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入10％披钯碳(4.6mg,4.3μmol)在THF(1mL)中的混悬液。将反应物置于氢气下并搅拌40分钟。再加入披钯碳(7mg,6.5μmol)，在氢气下搅拌另外1小时。使反应物通过膜滤器，蒸发滤液。通过HPLC(Sunfire C1830x50mm,45-70％CAN/水+0.1％TFA)纯化残余物，得到脱保护的化合物(83mg,0.047mmol,54％)：LCMS方法B Rt＝1.03min,[M+2H]/2835.2；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-0.94(m,3H)1.17(br.s.,2H)1.21-1.39(m,30H)1.57-1.68(m,2H)1.69-1.80(m,2H)1.97-2.10(m,2H)2.34(t,J＝7.21Hz,2H)2.86(s,4H)2.92(t,J＝6.48Hz,2H)3.51-3.73(m,96H)3.87(t,J＝6.48Hz,2H)7.45(t,J＝4.46Hz,1H)。
类似于脂肪酸-连接基构建体#_1，通过用适当的氨基-PEGn-甲酸代替氨基-PEG24-甲酸，制得下述化合物。
脂肪酸-连接基构建体#_2的制备：
使用氨基-PEG12-甲酸制得脂肪酸-连接基构建体#_2，分离为无色油状物；LCMS:方法A：CAD：Rt 1.64分钟MS m/z 1138.0[M-H]-；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.36(1H,br t),3.76(2H,t),3.61-3.47(46H,br m),3.46-3.40(2H,br m),2.81(2H,t),2.74(4H,br s),2.24(2H.t),1.93(2H,br t),1.68-1.57(2H,br m),1.56-1.50(2H,br m),1.26-1.08(34H,br m),0.78(3H,t)。
脂肪酸-连接基构建体#_3的制备：
使用氨基-PEG8-甲酸制得脂肪酸-连接基构建体#_3，分离为2种级分，各自具有稍不同的杂质并且各自为无色油状物。
LCMS：方法A CAD：Rt 1.65分钟MS m/z 963.8[M+H]+；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.27(1H,br m),3.70(2H,t),3.56-3.41(30H,br m),3.41-3.34(2H,br m),2.75(2H,t),2.69(4H,br s),2.19(2H.t),1.87(2H,br t),1.63-1.52(2H,br m),1.52-1.43(2H,br m),1.22-1.02(32H,br m),0.78(3H,t)。
LCMS:方法B:CAD:Rt 1.65分钟MS m/z 963.8[M+H]+；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.48(1H,m),3.85(2H,t),3.71-3.56(30H,br m),3.56-3.49(2H,br m),2.90(2H,t),2.84(4H,br s),2.38-2.32(2H,m),2.02(2H,br t),1.78-1.58(4H,br m),1.38-1.16(32H,m),0.88(3H,t)。
脂肪酸-连接基构建体#_4的制备：
使用氨基-PEG4-甲酸制得脂肪酸-连接基构建体，分离为浅黄色油状物；
LCMS：方法A：CAD：Rt 1.66分钟MS m/z 787.6[M+H]+；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.24(1H,br t),3.85(2H,t),3.71-3.57(14H,br m),3.56-3.48(2H,br m),2.90(2H,t),2.84(4H,br s),2.35(2H,t),2.10-1.99(2H,br m),1.74-1.58(4H,br m),1.38-1,18(32H,br m),0.88(3H,t)。
H2N-Q(Trt)-R(Pbf)-P-R(Pbf)-L-C(Trt)-H(Trt)-K(Boc)-G-P-(Nle)-C(Trt)-F- CO OH的制备
步骤1：中间体1a的制备
在自动肽合成仪(LIBERTY BLUE)上使三批H-Phe-2-ClTrt树脂(Novabiochem,324mg,0.25mmol,0.73mmol/g)进行固相肽合成，对于Arg残基采用常规的双Arg。氨基酸制备为在DMF中的0.2M溶液。
偶联循环定义如下：
●氨基酸偶联：AA(4.0eq.)、HATU(4.0eq.)、DIEA(25eq.)
●洗涤：DMF(3x7mL,每次1分钟)。
●Fmoc脱保护：哌啶/DMF(1:4)(7mL,75℃3分钟)。
●洗涤：DMF(3x7mL,每次1min)。
在肽组装后，将树脂用DMF(3×10mL)、DCM(3×10mL)洗涤。将肽树脂在真空下于室温干燥，得到中间体1a(2.347g,0.75mmol)。
步骤2：中间体1b,
H2N-Q(Trt)-R(Pbf)-P-R(Pbf)-L-C(Trt)-H(Trt)-K(Boc)-G-P-(Nle)-C(Trt)-F-COOH的制备
向中间体1a(2.347g,0.75mmol)中加入24mL 20％HFIP/DCM溶液，将所得混合物于室温振摇20分钟，然后过滤，用DCM(3×10mL)洗涤过滤物。进行上述方法4次以完全裂解。将合并的滤液真空浓缩，得到粗中间体1b(2.09g,68％)，将其未经纯化直接用于下一步反应。LC/MS方法E：保留时间：1.74分钟；MS M/2+1：实测值：1565.9,计算值：1564.458。
实施例1：脂肪酸-连接基#1-Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(Nle)-C*-F(C6-C12二硫桥)
步骤1：
向中间体1b(300mg,0.096mmol)在THF(100mL)中的溶液中加入在THF(35mL)和水(15mL)中的脂肪酸-连接基构建体#_1(960mg,0.575mmol)。将反应混合物于室温搅拌。当完成时，将反应物在局部真空下浓缩，作为粗物质进入下一步，假定产率定量。(产物MW：4681.870)
步骤2：脱保护：
向TFA(4.75mL)、TIPS(0.125mL)和水(0.125mL)中的溶液中加入DTT(296mg,1.920mmol)。然后，将预混合的混合物加入到步骤1的化合物(449mg,0.096mmol)中，于室温搅拌。当完成时，将反应物在局部真空下浓缩。用冷乙醚处理残余物，得到浑浊的反应混合物，将其静置于室温下。通过倾析出乙醚而分离出所形成的所得胶状物，再次用冷乙醚洗涤。将胶状物溶于水(最少量)中，上样到55g C-18柱上进行反相色谱法。经20分钟时间，使用100％水(0.1％TFA)至100％ACN的溶剂梯度纯化得到脱保护的化合物，为浅黄色油状物(160mg,产率54％)；
LCMS：方法D：ELSD：Rt 2.62分钟MS m/z 1555.2[(M/2)+H]+；
步骤3：环化-二硫键形成
向步骤2的脱保护的化合物(160mg,0.051mmol)在水(2mL)中的溶液中加入碘(在AcOH中的50mM溶液)(1.339mL,0.067mmol)。将反应混合物于室温搅拌。当完成时，将反应混合物上样到55g C18(55ug)柱上进行反相色谱法。经15分钟时间，使用100％水(0.1％TFA)至100％ACN的溶剂梯度，将LCMS的适当级分合并，蒸发掉溶剂。将所得残余物冻干，得到呈白色固体的标题化合物(实施例1)；
LCMS：方法D：ELSD：Rt 2.64分钟；MS m/z 1554.3[(M/2)+H]+；
类似于实施例1，通过用适当的脂肪酸-连接基构建体#_2至#_4代替脂肪酸-连接基构建体#_1，制得下述实施例。
实施例2：含有脂肪酸-连接基构建体#_2的缀合物
LCMS：方法D：ELSD：Rt 2.56分钟；MS m/z 1289.9[(M/2)+H]+；
实施例3：含有脂肪酸-连接基构建体#_3的缀合物
LCMS：方法D：ELSD：Rt 2.52分钟；MS m/z 1201.8[(M/2)+H]+；
实施例4：含有脂肪酸-连接基构建体#_4的缀合物
LCMS：方法D：ELSD：Rt 2.49分钟；MS m/z 1113.6[(M/2)+H]+；
已经发现上述实施例中的缀合物对于APJ受体效力而言具有约0.01nM至约1100nM的EC50值。已经发现上述实施例中的缀合物具有高于30分钟、高于60分钟、高于5小时、高于10小时、高于12小时的血浆稳定性。
可以看出，本发明的缀合物可用作APJ受体的激动剂，因此可用于治疗对APJ受体的激活有响应的疾病和病症、例如本文公开的疾病。
已经如此描述了本发明的示例性实施方案，应当被本领域技术人员注意的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。

Claims (15)

1.缀合物或其可药用盐，包含
a.具有下式(I)的APJ激动剂肽：
Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(Nle)-C*-F(I)；或其酰胺或酯；
其中标有“*”的两个半胱氨酸氨基酸在它们侧链的硫醇官能团之间形成二硫键；和
b.脂肪酸，选自：
其中所述脂肪酸经由其羧酸官能团之一、任选地经由聚乙二醇连接基共价连接至肽的N-末端。
2.根据权利要求1的缀合物，其中存在聚乙二醇(PEG)连接基并且其具有式(III)：
其中y为1-30，其中PEG连接基的羰基官能团与式(I)肽的N-末端的氨基官能团形成酰胺键，并且其中PEG连接基的氨基官能团与脂肪酸的羧酸官能团之一形成酰胺键。
3.根据权利要求1或2的缀合物，其中聚乙二醇连接基具有式(III)，且y为2至25。
4.权利要求1-3任一项的缀合物，其中所述脂肪酸为
5.根据权利要求1至4任一项的缀合物，其中脂肪酸经由其孪位羧酸官能团之一连接至PEG连接基的氨基官能团或者如果不存在PEG连接基的话连接至肽的N-末端的氨基官能团。
6.根据权利要求1-4任一项的缀合物，其中脂肪酸经由其孪位羧酸官能团连接至PEG连接基的氨基官能团或者如果不存在PEG连接基的话连接至肽的氨基官能团。
7.根据权利要求1的缀合物，选自：
或其可药用盐。
8.在需要其的受治疗者中治疗或预防对APJ受体的激动有响应的疾病或障碍的方法，该方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的权利要求1至7任一项的缀合物或其可药用盐。
9.权利要求8的方法，其中所述疾病或障碍选自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
10.根据权利要求1至7任一项的缀合物或其可药用盐，用作药物。
11.根据权利要求1至7任一项的缀合物或其可药用盐，用于治疗或预防对APJ受体的激动有响应的疾病或障碍。
12.根据权利要求1至7任一项的缀合物或其可药用盐，用于治疗急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂缺血性发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。
13.组合产品，包含治疗有效量的权利要求1至7任一项的缀合物或其可药用盐以及一种或多种具有治疗活性的共用物质。
14.根据权利要求13的组合产品，其中所述共用物质选自影响收缩力的物质、β肾上腺素能受体阻断剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻滞剂(CCB)、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、利尿剂、ApoA-I模拟物、抗糖尿病剂、减肥剂、醛固酮受体阻断剂、内皮素受体阻断剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝剂、松弛素、BNP(奈西立肽)和NEP抑制剂。
15.药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1至7任一项的缀合物或其可药用盐以及一种或多种可药用载体。
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