TWI708781B - Fgf21衍生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於在對應於成熟的人類FGF21之位置167、169、170、171、172、173、174、175且特別是位置180或位置181的位置具有半胱胺酸殘基的FGF21蛋白質之衍生物與其具有接附至此半胱胺酸的側鏈的衍生物。本發明之FGF21衍生物對FGF受體顯示高程度的效力。本發明亦係關於包含如此FGF21衍生物與醫藥上可接受的賦形劑的醫藥組成物、以及該FGF21衍生物之醫藥用途。

Description

FGF21衍生物及其用途
本發明係關於FGF21類似物之衍生物，尤其係關於在位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181具有側鏈的FGF21之類似物、以及其等的醫藥用途。 序列表之以參考方式納入
序列表（標題為「序列表」）係33 kb，係於2015年12月21日製作，且係以參考方式納入本文中。
FGF21屬於具有新陳代謝功效而非促細胞分裂功效的非典型的纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）之FGF19次家族。FGF21與FGF受體（FGFR1c、FGFR2c與FGFR3c）結合並活化之，但此僅在非傳訊性共受體貝他-klotho（BKL）存在下發生。BKL之組織專一性表現決定了FGF21之新陳代謝活性。FGF21基因轉殖小鼠對膳食誘發性肥胖有抗性且壽命變長。FGF21係一種能量消費（葡萄糖與脂質代謝）之新陳代謝調節子，其在逆轉具有糖尿病與異常血脂症的肥胖患者中的體重、高血糖症與異常血脂症方面具有很大的潛力。
FGF21的問題在於活體內不穩定，而此係導因於蛋白質水解，且高達一半的內源性循環性人類FGF21是不活性的。活性之喪失係導因於C端之降解，且此等代謝物大部分在P171而非S181終止。因此，對抗C端區域中的新陳代謝分解的保護對治療性FGF21分子而言是所欲的。改造C端區域可能提供對抗降解的保護，然而目前為止如此改造之代價為經改造的FGF21化合物之效力降低或喪失。FGF21之N端區域與FGFR結合而FGF21之C端區域與BKL結合。截短C端胺基酸導致效力顯著喪失。
於[180C]FGF21之位置180的PEG化導致試管內活性引人注目地降低（J. Xu et al, Bioconjugate Chemistry (2013), 24, 915-925）。透過將Fc接附至FGF21之C端而得的Fc融合蛋白質之效力遠比天然FGF21與FGF21之N端Fc融合之效力差（Hecht et al, PLoS One 2012, 7(11), e49345）。
本發明係關於在對應至相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181之一者的位置具有側鏈的FGF21衍生物。本發明係關於在對應至相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）的位置180或181之一者的位置具有側鏈的FGF21衍生物。更特別地，該側鏈係共價地接附至對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180的FGF21類似物之位置，或共價地接附至對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置181的FGF21類似物之位置。
更特別地，該側鏈係共價地接附至對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置170、174或175的FGF21類似物之位置，或共價地接附至對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、171、172或173的FGF21類似物之位置。
半胱胺酸係存在於FGF21類似物之側鏈接附位置。側鏈係共價地接附至其所接附的半胱胺酸殘基之硫原子。側鏈包含連接子與延伸子（protractor）。延伸子可為脂肪二酸。
連接子可包含數個連接子元件，諸如一或多個gGlu殘基、及／或一或多個Ado殘基（Ado係8-胺基-3,6-二氧辛酸）、及／或一或多個其他併入*-NH基團與*-CO基團的二基。延伸子與連接子係經由醯胺鍵連接。連接子係經由硫醚鍵連接至FGF21蛋白質之180Cys或181Cys之硫原子。
連接子可包含數個連接子元件，諸如一或多個gGlu殘基、及／或一或多個Ado殘基（Ado係8-胺基-3,6-二氧辛酸）、及／或一或多個Trx元件（Trx係傳明酸（tranexamic acid））、及／或一或多個*-NH-S(=O)2 -(CH2 )3 -CO-*及／或一或多個其他併入*-NH基團與*-CO基團的二基。延伸子與連接子是經由醯胺鍵連接，而連接子係經由在位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181的半胱胺酸之硫原子透過硫醚鍵與FGF21蛋白質連接。
在本發明之FGF21衍生物中併入的FGF21蛋白質係成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之類似物，而該類似物在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181之一者的位置包含半胱胺酸殘基。
相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1），本發明之衍生物之FGF21類似物可具有至多達總計30個胺基酸改變，其中在位置180或181之一者的半胱胺酸殘基算作一個胺基酸改變。該等最多29個其他改變可獨立地係一或多個延伸、一或多個插入、一或多個刪除、及／或一或多個取代。
特別地，在第一方面，本發明係關於FGF21蛋白質之衍生物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181的位置包含Cys殘基，其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子；其中該延伸子係選自以下者之群組： Chem. 1A：HOOC-(CH2 )X -CO-*、 Chem. 1B：HOOC-苯-O-(CH2 )x -CO-*與 Chem. 1C：HO-S(=O)2 -(CH2 )x -CO-*， 其中x係範圍在8-18的整數；且其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者之至少一者； 其中Chem. 2係選自： Chem. 2A：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 Chem. 2B：*-NH-S(=O)2 -(CH2 )3 -CO-*與 Chem. 2C：*-NH-CH2 -環已烷-CO-*， 其中Chem. 3係*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*，其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且 其中Chem. 4係選自： *-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*與 *-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*， 其中m係範圍在1-5的整數且 其中Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係彼此相連，而該彼此相連係經由醯胺鍵且係以所指示的順序，係於其*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181的位置的Cys殘基之硫原子，或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
更特別地，在第一方面，本發明係關於FGF21蛋白質之衍生物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置包含Cys殘基，且相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）包含最多30個胺基酸修飾；其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子；其中該延伸子係Chem. 1：HOOC-(CH2 )x -CO-*，其中x係範圍在10-18的整數；且其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者之至少一者： Chem. 2：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 Chem. 3：*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*、與 Chem. 4：*-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*， 其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且m係範圍在1-5的整數。Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係彼此相連，而該彼此相連係經由醯胺鍵且係以所指示的順序，係於其*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置的Cys殘基之硫原子。
被稱作化合物13至化合物24的較佳的本發明之FGF21衍生物係於實驗章節中揭示。
被稱作化合物13至化合物18的更佳的本發明之FGF21衍生物係於實驗章節中揭示。
被稱作化合物35至化合物41的更佳的本發明之FGF21衍生物係於實驗章節中揭示。
被稱作化合物43至化合物56的更佳的本發明之FGF21衍生物係於實驗章節中揭示。
在一個進一步的方面，本發明係關於FGF21類似物，其在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181的位置包含Cys殘基。較佳地，該類似物與人類FGF21（SEQ ID NO: 1）具有高程度的一致性。一致性之程度可藉由相較於人類FGF21（SEQ ID NO: 1）的胺基酸取代或修飾之數目來描述。
在一個進一步的方面，本發明係關於FGF21類似物，其在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置包含Cys殘基，且相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）包含最多個30個胺基酸修飾。
在第三方面，本發明係關於本發明之FGF21衍生物與類似物之醫藥用途，例如用於治療及／或預防所有類型的糖尿病與相關的疾病，諸如飲食疾患、心血管疾病、糖尿病併發症；及／或用於改善脂質參數、改善β-細胞功能；及／或用於延遲或預防糖尿病疾病進展；及／或用於治療及／或預防肝臟脂肪變性與非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）。
本發明之FGF21衍生物係生物活性的。例如其等係非常有效的，且（亦或是供選擇地）其等與FGF受體極佳地結合。此外（或供選擇地），其等具有延長的藥物動力學輪廓。例如，當i.v.投予至小鼠及／或迷你豬時，其等具有極長的最終半生期。良好效力與長半生期之特殊組合可能是高度所欲的。
在對應於成熟的人類FGF21之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180與181之一者的位置包含側鏈的FGF21衍生物皆保留效力是另人感興趣的。
此外（或供選擇地），已注意到在對應於成熟的人類FGF21之位置180與181之一者（且特別是位置180）的位置包含側鏈的FGF21衍生物已保留高效力。
於隨後的部分，希臘字母可以其等之符號或相對應書面名稱（例如：α=阿爾法；β=貝他；ε=艾普西龍；γ=伽瑪；ω=奧米伽；等等）來表示。此外，希臘字母μ可以「u」表示（例如於μl=ul，或於μM=uM）。
化學式中的星號（*）指明接附點。
在第一方面，本發明係關於FGF21蛋白質之衍生物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181的位置包含Cys殘基，其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子；其中該延伸子係選自以下者之群組： Chem. 1A：HOOC-(CH2 )x -CO-*、 Chem. 1B：HOOC-苯-O-(CH2 )x -CO-*與 Chem. 1C：HO-S(=O)2 -(CH2 )x -CO-*， 其中x係範圍在8-18的整數；且其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者之至少一者； 其中Chem. 2係選自： *-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -CO-*、 *-NH-S(=O)2 -(CH2 )m -CO-*與 *-NH-(CH2 )m -環已烷-CO-*， 其中m係獨立地選自範圍在1-5的整數， 其中Chem. 3係*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*，其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且 其中Chem. 4係選自： *-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*與 *-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*， 其中m係範圍在1-5的整數。
在進一步的具體態樣中，Chem. 2係選自： *-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 *-NH-S(=O)2 -(CH2 )3 -CO-*與 *-NH-CH2 -環已烷-CO-*。
在進一步的具體態樣中，Chem. 2係*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*。
在一個進一步的具體態樣中，Chem. 2係*-NH-S(=O)2 -(CH2 )3 -CO-*。
在一個進一步的具體態樣中，Chem. 2係*-NH-CH2 -環已烷-CO-*。
如以上所提及的，該衍生物包含經由醯胺鍵彼此相連的Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4之各者之至少一者。此外，該連接子元件係以所指示的順序連接。Chem. 2係於其*-NH端連接至該延伸子之CO-*端，且Chem. 4係於其CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181的位置的Cys殘基之硫原子，或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
在一個進一步的方面，本發明係關於FGF21蛋白質之衍生物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置包含Cys殘基，且相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）包含最多個30個胺基酸修飾；其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子；其中該延伸子係Chem. 1：HOOC-(CH2 )x-CO-*，其中x係範圍在10-18的整數；且其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者之至少一者： Chem. 2：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 Chem. 3：*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*、與 Chem. 4：*-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*， 其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且m係範圍在1-5的整數。Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連，係於其*-NH端連接至該延伸子之CO-*端，且係於其CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置的Cys殘基的巰基。 FGF21蛋白質與類似物
在性質上，天然的FGF21蛋白質係以具有用於分泌的28個胺基酸的訊息胜肽的形式合成。由剩下的181的胺基酸所組成的成熟的FGF21多肽係以SEQ ID NO: 1包含在序列表中。
本發明之衍生物之FGF21蛋白質現在與以下可被稱為衍生物之「骨架」或「蛋白質骨架」或被稱為「FGF21類似物」。
用於本文，術語「FGF21蛋白質」意指一種人類FGF21（FGF21（1-181））之類似物或變異物，其序列係以SEQ ID NO: 1包含在序列表中。具有SEQ ID NO: 1之序列的蛋白質亦可被稱為「天然的」FGF21、「成熟的」FGF21、及／或「成熟的人類」FGF21。
於序列表中，SEQ ID NO: 1之成熟的人類FGF21之第一個胺基酸殘基（組胺酸）被指定為no. 1。
FGF21類似物之一個實例係具有N端甲硫胺酸的SEQ ID NO: 1之蛋白質，其亦被命名為MetFGF21（SEQ ID NO: 2）。當成熟的人類FGF21在大腸桿菌中表現時，N端Met被加入，參見例如WO 2006/050247，表6。位於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置1的組胺酸之前的附加的N端胺基酸殘基被指定為位置no. -1。用於SEQ ID NO: 2之MetFGF21的適合命名法的非限制性實例為MetFGF21、[Met]FGF21或[-1M]FGF21。
MetFGF21顯示可與SEQ ID NO: 1之成熟的人類FGF21相比的生物活性，且基於實用的理由往往係使用其而非SEQ ID NO: 1之成熟的人類FGF21作為參考化合物。MetFGF21之胺基酸序列係以SEQ ID NO: 2包含在序列表中。
於本文中，本發明之FGF21蛋白質可藉由參考以下者來描述：i) 對應於被改變的胺基酸殘基的成熟的人類FGF21（1-181）中的胺基酸殘基之編號，（即，在成熟的人類FGF21中的對應位置），與ii)實際的改變。
本發明之一個方面係關於一種FGF21蛋白質（FGF21類似物），其包含其中野生型胺基酸殘基係以半胱胺酸殘基取代的胺基酸取代。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180與181之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174與175之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置167、170、171、172、173、174、175與180之一者的位置包含Cys殘基。
在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置169、170、173、174、175、180與181之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173、174、175與180之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173、174、175、180與181之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173、174、175與180之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173、174與175之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173、174、180與181之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173、174與180之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173與174之一者的位置包含Cys殘基。在一個具體態樣中，該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置180與181之一者的位置包含Cys殘基。
例如，本發明之FGF21蛋白質被定義以在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置180位置或在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置181的位置包含Cys殘基。本發明之FGF21蛋白質之此等Cys殘基可分別被命名為Cys180與Cys181。例如，在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置181的位置具有Cys殘基的本發明之FGF21蛋白質可被稱為Cys181 FGF21及／或被稱為181C FGF21，供選擇地被稱為[Cys181]FGF21及／或被稱為[181C]FGF21。
以下者為適合的類似物命名法之非限制性實例。
Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21指明一種成熟的人類FGF21之類似物，其中丙胺酸被加至N端（即Ala位於對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置-1的位置），在位置121天然存在的天門冬醯胺酸已被麩醯胺酸取代，在位置168天然存在的甲硫胺酸已被白胺酸取代，且在位置180天然存在的丙胺酸已被半胱胺酸取代。
以下者為用於FGF21類似物之衍生物的適合命名法之非限制性實例。S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21指明一種成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之類似物之衍生物，其中Ala[Gln121,Leu168,Cys180]指明相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）的胺基酸改變（其中數字指出成熟的FGF21之相對應位置），且其中該取代基[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙基胺基]-2-側氧基乙基]-係共價地接附至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180的位置的半胱胺酸之硫原子。
相較於FGF21（SEQ ID NO: 1），本發明之FGF21蛋白質可具有另外的胺基酸改變，然而其限於最多30個胺基酸改變。此等改變亦係相較於成熟的人類FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1），且其等可獨立地代表一或多個胺基酸取代、插入、延伸、及／或刪除。
在一個特殊的具體態樣中，胺基酸改變係位於一或多個對應於FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置-1、121、與168之一或多者的位置。
在一個具體態樣中，本發明之FGF21蛋白質除了半胱胺酸胺基酸取代外包含-1Ala、121Gln與168Leu。
在一個具體態樣中，本發明之FGF21蛋白質除了167Cys、170Cys、171Cys、172Cys、173Cys、174Cys、175Cys、180Cys與181Cys之任一者之外包含-1Ala、121Gln、與168Leu。特殊的本發明之FGF21蛋白質（其亦被併入實驗章節中揭示的本發明之特殊的衍生物中）係序列表之SEQ ID NO: 8、10、12、14、15、16、17、18、19與20。
在另一個特殊的具體態樣中，本發明之FGF21蛋白質除了180Cys或181Cys之任一者之外包含-1Ala、121Gln、與168Leu。
特殊的本發明之FGF21蛋白質（其亦被併入實驗章節中揭示的特殊的本發明之衍生物中）係序列表之SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 10。
當與成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）比較時，「包含」某種指定的改變的蛋白質可包含另外的改變。
如自以上實例可清楚瞭解的，胺基酸殘基可藉由其等之全名、其等之單字母代碼、及／或其等之三字母代碼識別。此三種方法是完全相等的。
術語「等同於…的位置」或「相對應位置」可用於藉由參考成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）來表示在變異物FGF21序列中的改變之位置。等同或相對應位置（以及改變的數目）可被輕易推演（例如藉由簡單書寫與目視）；及／或可使用標準蛋白質或胜肽排比程式（諸如基於Needleman-Wunsch演算法的「排比」）。此演算法係於以下者描述：Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453，與"Optimal alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17中的Myers及W. Miller之排比程式。關於排比，可使用預設的計分矩陣BLOSUM62與預設的一致性矩陣，且對於空隙中的第一個殘基而言罰分可設為-12，或較佳地設為-10，而對於空隙中額外的殘基而言罰分可設為-2，或較佳地設為-0.5。
一個如此排比之實例係如下，其中序列no. 1為成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1），而序列no. 2為類似物Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21 (SEQ ID NO: 10)。所計算得的一致性因此為97.8%。 # 1: FGF21 # 2: Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21 # 矩陣：EBLOSUM62 # 空隙_罰分：10.0 # 延伸_罰分：0.5 # 長度：182 #一致性：178/182 (97.8%) # 類似性：179/182 (98.4%) # 空隙：1/182 ( 0.5%) # 分數：952.0 1 1 -HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSP 49 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2 1 AHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSP 50 1 50 ESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELL 99 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2 51 ESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELL 100 1 100 LEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEP 149 |||||||||||||||||||||.|||||||||||||||||||||||||||| 2 101 LEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGQKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEP 150 1 150 PGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS 181 ||||||||||||||||||:||||||||||||. 2 151 PGILAPQPPDVGSSDPLSLVGPSQGRSPSYAC 182
在進一步的具體態樣中，FGF21蛋白質或類似物或FGF衍生物之FGF21骨架與人類FGF21（SEQ ID NO: 1）具有至少80%一致性，諸如至少85 %一致性，諸如至少90 %一致性，諸如至少92、93、94、95、96、97、98或99 %一致性，相較於人類FGF21（SEQ ID NO: 1）。
術語「蛋白質」意指一種化合物，其包含一連串藉由醯胺（或胜肽）鍵彼此相連的胺基酸。
本發明之蛋白質包含至少151個藉由胜肽鍵連接的構成性胺基酸。在特殊的具體態樣中，該蛋白質包含至少160個，較佳至少170個，更佳至少180，甚至更佳至少181，或最較佳至少182個。在另外的特殊的具體態樣中，該蛋白質係a)包含181或182個胺基酸，或b)由181或182個胺基酸所組成。
在又進一步的特殊的具體態樣中，蛋白質係由藉由胜肽鍵彼此相連的胺基酸所組成。
胺基酸可被定義成一種化合物，其包含一胺基團與一羧酸基團，且視需要包含一或多個往往被稱為側鏈其他基團。該胺基團可（例如）係一級或二級胺基。
胺基酸殘基係胺基酸之基被併入胜肽或蛋白質中的形式。
在一個特殊的具體態樣中，本發明之蛋白質之胺基酸係阿爾法胺基酸，其中一級或二級胺基基團之氮原子係與阿爾法-碳原子結合。
在另一個特殊的具體態樣中，本發明之蛋白質之胺基酸係選自編碼胺基酸與非編碼胺基酸。
在一個具體態樣中，本發明之蛋白質之所有胺基酸皆係編碼胺基酸。
編碼胺基酸可如IUPAC（國際理論與應用化學聯合會（INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY））之推薦之章節3AA-1之表1中定義（參見http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/），其給出了20個編碼胺基酸之結構、俗名、系統標準名、單字母符號與三字母符號。
術語「非編碼胺基酸」意指所有其他胺基酸。非編碼胺基酸之非限制性實例為編碼胺基酸之D-異構物，諸如D-丙胺酸與D-白胺酸。
於以下部分，當未提及是何種光學異構物時，所有的特別胺基酸均應被理解成意謂L-異構物（除非另有指明），例如當提及麩醯胺酸之特別胺基酸，此係意欲意指L-麩醯胺酸，除非另有指明。另一方面，當胺基酸係藉由更一般的式（諸如分子式或結構式）來描述時且當未顯示立體化學時，此等式係意欲涵蓋所有立體異構物。
根據技術領域中的一般慣例，本發明之FGF21蛋白質係以N端在左邊且C端在右邊的方式顯示。 FGF21衍生物
用於本文，當在FGF21蛋白質或類似物之前後文中時，術語「衍生物」意指一種經化學修改的FGF21蛋白質或類似物，其中已充分界定數字的取代基已被共價地接附至該蛋白質之一或多個特別的胺基酸殘基。該（等）取代基可被稱為側鏈。
在一個特殊的具體態樣中，側鏈能夠與白蛋白形成非共價的聯系，藉此促進衍生物在血流中的循環，且亦具有延長衍生物有作用的時間之功效，而其係因為以下事實：FGF21衍生物與白蛋白之聯系僅緩慢地崩解以釋放活性醫藥成分。
側鏈包含於本文中被稱為延伸子的部分。
延伸子可位於（或靠近）側鏈之遠端（相對於延伸子與蛋白質的接附點）。
在又進一步的特殊的具體態樣中，側鏈包含位於延伸子與和蛋白質的接附點之間的部分，而該部分可被稱為連接子。連接子可由一或多個連接子元件所組成。
於特殊的具體態樣中，側鏈及／或延伸子於生理pH（7.4）係親脂性的及／或帶負電的。
側鏈可藉由烷基化共價地接附至FGF21蛋白質之半胱胺酸殘基。
在一個較佳的具體態樣中，側鏈係以鹵乙醯胺基團之形式合成與以鹵乙醯胺基團活化，而其與半胱胺酸殘基之巰基團反應，且此係在亦被稱為硫醚鍵的共價的巰基-碳鍵形成下（此程序被稱為Cys-烷基化）。因此，巰基基團並未出現在衍生物中，而側鏈係透過硫原子聯結。在關係到衍生物而提及巰基基團的情況下，其必須被了解成在Cys-烷基化之前是半胱胺酸之巰基基團之一部份的硫原子。
在另一個具體態樣中，側鏈係以順丁烯二醯亞胺基團活化，其在共價的巰基-碳鍵之形成下與半胱胺酸殘基之巰基基團反應。
為了本發明之目的，術語延伸子、與連接子可包含此等分子之未經反應形式以及經反應形式。當該術語被使用時，其意謂哪種形式可自前後文明確得知。
在一個方面，各延伸子包含式Chem. 1之延伸子，或係由式Chem. 1之延伸子所組成： Chem. 1：HOOC-(CH2 )x -CO-*， 其中x係範圍在10-18的整數。
在可供選擇的具體態樣中，延伸子Chem. 1係選自由Chem. 1A、Chem. 1B與Chem. 1C所定義的延伸子之群組： Chem. 1A：HOOC-(CH2 )x -CO-* 其中x係範圍在8-18的整數、 Chem. 1B：HOOC-苯-O-(CH2 )x -CO-* 其中x係範圍在8-18的整數、與 Chem. 1C：HO-S(=O)2 -(CH2 )x -CO-* 其中x係範圍在8-18的整數。
對於各個不同的Chem. 1結構，藉由x定義的碳鏈之長度範圍可在8-18，而如以下所描述的，不同種類的延伸子元件可能偏好較長或較短的版本。
在一個1A之特殊的具體態樣中，*-(CH2 )x -*意指直鏈伸烷基，其中x係範圍在10-18的整數，諸如14-18或諸如14-16。
在另一個1A之特殊的具體態樣中，*-(CH2 )x -*意指直鏈伸烷基，其中係16。此延伸子可簡短地稱為C18二酸，即具有18個碳原子的脂肪二羧酸。當x=16時，此連接子元件之結構對應於Chem. 1a： Chem. 1a：HOOC-(CH2 )16 -CO-*。
在一個具體態樣中，延伸子係Chem. 1B。在一個1B之具體態樣中，*-(CH2 )x -*意指直鏈伸烷基，其中x係範圍在8-14的整數。於x=9之特殊的具體態樣中，此連接子元件之結構對應於Chem. 1b： Chem. 1b：HOOC-苯-O-(CH2 )9 -CO*。
在一個具體態樣中，延伸子係Chem. 1C。在一個1C之具體態樣中，*-(CH2 )x -*意指直鏈伸烷基，其中x係範圍在10-18的整數，諸12-18或14-18。在一個x=15的1C之特殊的具體態樣中，此連接子元件之結構對應於Chem. 1c： Chem. 1c：HO-S(=O)2 -(CH2 )15 -CO-*。
本案之命名法係與技術領域中通常的命名法相同，例如在以上的式中，*-CO-*意指羰基（*-C(=O)-*）。例如，在本文之任何式(R-CO-*)中（其中R係如由各式所定義者），R-CO-*意指R-C(=O)-*。苯意指在Chem. 1B中於C1及C4分別被O-(CH2 )x-*與–COOH取代的環結構。HO-S(=O)2 描述磺酸。
本發明之衍生物之連接子包含至少一個以下的連接子元件Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4。元件Chem. 2與chem3皆具有-NH-與CO-端，而該等端允許其等藉由醯胺鍵彼此連結以及與延伸子或Chem. 4之-CO-或-NH-連結。
Chem. 4具有-NH-端（其能夠與Chem. 2或Chem. 3形成醯胺鍵）以及-NH-CO-CH2 -端，其於未經反應的形式係能夠與FGF21類似物之半胱胺酸之巰基基團反應的鹵乙醯胺。
本發明之衍生物之連接子包含以下的連接子元件Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之至少一者， 其中Chem. 2係選自： *-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -CO-*、 *-NH-S(=O)2 -(CH2 )m -CO-*、與 *-NH-(CH2 )m -環已烷-CO-*， 其中m係獨立地選自範圍在1-5的整數。 其中Chem. 3係：*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*，其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且 其中Chem. 4係選自： *-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*與 *-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*， 其中m係獨立地選自範圍在1-5的整數。
在一個具體態樣中，Chem. 2係*-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -CO-*，其中m係1、2或3。在一個具體態樣中，m係2或3。
在其中m係2的具體態樣中，連接子元件Chem. 2可被稱為Chem. 2a，即*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*。連接子元件*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*可被簡稱為gGlu、伽瑪Glu、或γ-Glu。於gGlu中，用於與另一個連接子元件連接的是胺基酸麩胺酸之伽瑪羧基基團。在一個特殊的具體態樣中，（各）gGlu連接子元件係L-型。
在一個具體態樣中，Chem. 2係*-NH-S(=O)2 -(CH2 )m -CO-*，其中m係1、2或3。在一個具體態樣中，m係2或3。連接子元件*-NH-S(=O)2 -(CH2 )m -CO-*係磺酸衍生物，其中羧基基團係用於與另一個連接子元件連接。在一個具體態樣中，m係3且連接子元件Chem. 2可被稱為Chem. 2b：*-NH-S(=O)2 -(CH2 )3 -CO-*。
在一個具體態樣中，Chem. 2係*-NH-(CH2 )m -環已烷-CO-*，其中m係1、2或3。在一個具體態樣中，m係2或3。在Chem. 2結構中，環已烷環因此係於C1與C4分別以NH-CH2和CO取代。
在一個具體態樣中，m係1且連接子元件Chem2可被稱為Chem. 2c：*-NH-CH2 -環已烷-CO-*。此連接子元件可進一步被稱為Trx。
於Chem. 3之連接子元件中，「k」與「n」範圍皆可為1至5。當k=n=1，此連接子元件之結構對應於Chem. 3a。
在一個具體態樣中，Chem. 3係Chem. 3a：*-NH-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -O-CH2 -CO-*。由於其係其二基團，Chem. 3a之連接子元件可被簡稱為Ado（8-胺基-3,6-二氧辛酸）。
於Chem. 4連接子元件中，「m」範圍可在1至5。在一個具體態樣中，Chem. 4係*-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*，其中m係1、2、3或4。在一個具體態樣中，m係2或3。
在一個具體態樣中，當Chem. 4係*-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*且m=2時，此連接子元件之結構對應於Chem. 4a：*-NH-(CH2 )2 -NH-CO-CH2 -*。
在一個具體態樣中，Chem. 4係*-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*，其中m係1、2、3或4。在一個具體態樣中，m係2或3。在一個具體態樣中，m係4或5。
當Chem. 4係*-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*且m=4時，此連接子元件之結構對應於Chem. 4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )4 -NH-CO-CH2 -*。
本發明之衍生物之連接子可包含一或多個此等三個不同類型的連接子元件，且其亦可包含一或多個各個單獨連接子元件。在一個具體態樣中，該連接子僅包含一個Chem. 4元件。在一個具體態樣中，該連接子包含一或多個Chem2與Chem. 3之各者和僅僅一個Chem. 4元件。
作為一個非限制性實例，連接子可由一個Chem. 2元件、兩個Chem. 3a元件、與一個Chem. 4元件所組成，其等係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連，係於*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其CO-*端連接至位於FGF21蛋白質之位置180或181之任一者的Cys殘基之硫原子。因此，Chem. 4元件將Chem.2／Chem.3元件之-CO-*端連結至FGF21半胱胺酸類似物之硫原子。
在一個進一步的實例中，連接子可由兩個Chem. 2元件（諸如兩個Chem. 2a元件）、兩個Chem. 3a元件、與一個Chem. 4元件所組成，其等係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連。Chem. 2元件係於其等之*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且Chem4係於其CH2 -*端連接至FGF21蛋白質之Cys殘基之硫原子。
在一個具體態樣中，連接子係連接至位於FGF21蛋白質之位置167、169、170、171、172、173、173、174、175、180或181的cys之巰基基團。在進一步的具體態樣中，連接子係連接至位於位置180或181的Cys之硫原子。
不用說，僅僅為了良好排列之理由：術語「以所指示的順序」意謂首先提及的連接子元件（在此為Chem. 2）之*-NH端係連接至延伸子之CO-*端，且最後提及的連接子元件（在此為Chem. 4）之CO-*端係連接至所討論的FGF21蛋白質之Cys殘基之巰基基團。
在一個具體態樣中，本發明之衍生物係選自由以下者所組成的群組： a.化合物13-24 b.化合物35-41及／或 c.化合物43-56。
在一個進一步的具體態樣中，該衍生物係選自化合物13-24。
在一個具體態樣中，該衍生物係選自化合物13-18。在一個的具體態樣中，該衍生物係選自化合物20-24。
在一個具體態樣中，該衍生物係選自化合物35-41。
在一個具體態樣中，該衍生物係選自化合物43-56。在一個具體態樣中，該衍生物係選自化合物43-44與46-54。在一個具體態樣中，該衍生物係選自化合物44、47與50-54。
替代Chem. 4，可使用衍生自順丁烯二醯亞胺的連接子元件，其中p與q範圍可在1與5之間：
Figure 02_image001
當p=q=2時，此連接子元件之結構對應於N-(2-胺基乙基)-3-(-2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基)丙醯胺：
Figure 02_image003
。
本發明之衍生物可以不同的立體異構物的形式存在，其等具有相同的分子式與鍵結的原子之順序，但僅在其等之原子於空間中的三維方向不同。本發明之例示性衍生物之立體異構性係於實驗章節中使用標準命名法以其等之名稱以及結構指示。除非另加指出，本發明係關於所請衍生物之所有立體異構物形式。 功能性質
本發明之FGF21衍生物係生物活性的。例如其等係非常有效的，且（亦或選擇性地）其等與FGF受體之結合性非常好。此外（或選擇性地），其等具有延長的藥物動力學輪廓。例如，當i.v.投予至小鼠及／或迷你豬時，其等具有非常長的最終半生期。良好的效力與長半生期之特殊組合可是高度所欲的。
此外（或選擇性地），令人意外地，在對應於成熟的人類FGF21之位置167、169、170、171、172、173、173、174、175、180與181之一者的位置包含本發明之側鏈的FGF21衍生物具有高效力。
根據第一個方面，該FGF21衍生物具有FGF21活性。例如，本發明之FGF21衍生物對人類FGF受體具有令人意外地高的效力。
在第一個特殊的具體態樣中，效力及／或活性意指試管內效力，即於功能性FGF受體分析中的表現，更特別係是意指活化人類FGF受體的能力。
試管內效力可（例如）於使用表現人類FGF受體（FGFR1c、FGFR2c或FGFR3c）與BKL的完整的細胞的分析中測定。例如，人類FGF受體之反應可使用過度表現人類貝他-klotho（BKL）的HEK（人類胚胎腎臟細胞，Human Embryonic Kidney cell）來測量。HEK293細胞內源性地表現數種FGF受體，包含FGFR1c與FGFR3c。此等細胞對FGF21是非反應性的，直到其等被以共受體BKL轉染。FGF受體／BKL複合物之活化導致MAPK／ERK傳訊途徑之活化與ERK之磷酸化。於給定時間點的經磷酸化的ERK（pERK）之水平隨著FGF21之濃度的增加而增加。一個如此分析之非限制性實例係於實施例6描述。
試管內效力亦可於使用小鼠3T3-L1脂肪細胞的分析中測定。例如，可測試FGF21類似物與衍生物增加葡萄糖被吸收到脂肪細胞中的量的能力。經分化的3T3-L1脂肪細胞內源性地表現FGFR1c與BKL。3T3-L1細胞對FGF21是非反應性的，直到其分化後，而此係因為分化會導致共受體BKL之表現。FGFR1c受體／BKL複合物之活化會增加葡萄糖轉運子1（glucose transporter 1，GLUT1）之表現且因此FGF21類似物會以劑量反應性的方式導致被吸收至脂肪細胞中的葡萄糖之量增加。
EC50值通常被用作為藥物之效力之度量。其意指所關注的化合物誘發在基線與最大值之間之一半的反應的濃度，其係藉由參考劑量反應曲線。一般地說，EC50表示觀察到最大功效之50%時的濃度。本發明之衍生物之試管內效力可如以上所描述的測定，且所關注的衍生物之EC50經測定。EC50值越低，效力越好。
作為一個非限制性實例，使用過度表現人類貝他-klotho的HEK293細胞測量時，本發明之FGF21衍生物具有對應於在0% HSA EC50低於60 nM，較佳地低於20 nM，或更佳地低於10 nM的效力（例如如於實施例6中所描述的測定）。
作為一個非限制性實例，使用在3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖吸收測量時，本發明之FGF21衍生物具有對應於低於60 nM，較佳地低於20 nM，或更佳地低於10 nM的EC50的效力（例如如於實施例7中所描述的測定）。
作為一個非限制性實例，當使用在3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖吸收測量時，本發明之FGF21衍生物具有至少50%，較佳地至少80%，或更佳地至少90%的效力Emax（例如如於實施例7中所描述的測定）。
作為一個非限制性實例，當使用在3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖吸收測量時，本發明之FGF21衍生物具有對應於低於60 nM，較佳地低於20 nM，或更佳地低於10 nM的EC50的效力（例如如於實施例7中所描述的測定），且當使用在3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖吸收測量時，具有至少80%，或更佳地至少90%的效力Emax（例如如於實施例7中所描述的測定）。
在第二個特殊的具體態樣中，效力及／或活性意指活體內效力。本發明之蛋白質與衍生物係活體內有效的，其可如技術領域中已知於任何適合的動物模型中、以及於臨床試驗中測定。
之前已有人顯示在瘦的小鼠中由FGF21誘發的重量喪失對在肥胖小鼠中的功效有預測性且因此瘦的小鼠被認為是良好的篩選模型。瘦的C57BL小鼠係一個適合的動物模型的實例，且體重減輕性功效可於如此小鼠活體內測定（如於（例如）實施例7中所描述的測定）。
根據第二個方面，本發明之衍生物係延長的。延長可試管內地估計，及／或從藥物動力學活體內研究測定。在血清白蛋白存在下，試管內效力（EC50值）之增加指示對血清白蛋白有親和性且表示用以預測在動物模型中測試物質之延長的藥物動力學輪廓的方法。延長可以（例如）在i.v.投予至（例如）小鼠或迷你豬後的最終半生期（t½）之形式測定。
作為一個非限制性實例，在i.v.投予至小鼠後，本發明之衍生物具有至少1小時，更佳地至少3小時，或最較佳地至少10小時的最終半生期（如於（例如）實施例8中所描述的測定）。
作為另一個非限制性實例，在i.v.投予至迷你豬後，本發明之衍生物具有至少2小時，更佳地至少10小時，甚至更佳地至少20小時或最佳地至少50小時的最終半生期（如於（例如）實施例8中所描述的測定）。
根據第三個方面，本發明之衍生物係延長的且同時具有非常好的效力。良好的效力／結合與長半生期之特殊組合可是高度所欲的。
根據第四個方面，本發明之衍生物具有良好的生物物理學性質。此等性質包含但不限於物理穩定性及／或溶解度。此等與其他生物物理學的性質可使用蛋白質化學之技術領域中已知的標準方法測量。在一個特殊的具體態樣中，此等性質相較於成熟的人類FGF21被改善。
本發明之衍生物之其他特殊的具體態樣係於實驗章節前標題為「特殊的具體態樣」之章節描述。 FGF21化合物之生產與純化
蛋白質（例如，FGF21）之生產在技術領域中是廣為人知的。FGF21類似物可藉由包含以下者的方法生產：培養含有編碼該分子的DNA序列並在允許該FGF21類似物之表現的條件下於適合的營養培養基中能夠表現FGF21類似物的宿主細胞。數種重組方法可被用於生產FGF21與其類似物。可被用於在微生物（諸如（例如）大腸桿菌與啤酒釀母菌）中生產FGF21的方法之實例係（例如）於WO12010553中揭示。
製備許多本發明之衍生物之方法之特殊實例係包含在實驗部分中。簡言之，FGF21類似物係在半胱胺酸殘基藉由烷基化衍生。因此，巰基反應性側鏈（諸如以鹵乙醯胺製備的側鏈）可與FGF21類似物反應。FGF類似物可使用保護半胱胺酸之巰基基團的胱胺製備。若如此，在該類似物與巰基反應性側鏈反應之前，該類似物係以（例如）還原劑（諸如膦）還原。
本發明之FGF21類似物與衍生物可藉由各種各樣技術領域中已知的程序來純化，而該等程序包含（但不限於）色層分析法（例如，離子交換、親和性、疏水性、色層聚焦（chromatofocusing）、與粒徑篩析）、電泳程序（例如，製備性等電集聚（isoelectric focusing，IEF）、差異溶解度（例如，硫酸鋁沈澱）、或萃取（參見（例如）Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989）。 投予模式
除非另加指示或與前後文明顯矛盾，術語「治療」意欲包含所指疾病、疾患、或病況之預防以及最小化兩者（即，「治療」意指本發明之FGF21衍生物或包含本發明之FGF21衍生物的組成物之預防性與治療性投予兩者）。
投予之途徑可為任何有效地將本發明之化合物運輸至所欲的或適當的身體內位置的途徑，諸如非經腸的（例如，皮下的、肌肉內的或靜脈內的）。選擇性地，本發明之化合物可口服地、肺臟地、直腸地、穿皮地、頰地、舌下地或鼻地投予。 醫藥組成物
包含本發明之衍生物或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯、與醫藥上可接受的賦形劑的醫藥組成物可如技術領域中已知的製備。
術語「賦形劑」概括地意指任何除了活性治療性成分外的組份。賦形劑可為惰性物質、不活性的物質、及／或非醫藥活性的物質。
賦形劑可用於各種的目的，例如作為載劑、媒劑、稀釋劑、錠劑助劑（tablet aid），及／或以改善活性物質之投予、及／或吸收。
使用各種賦形劑調配醫藥活性成分係技術領域中已知的，參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例如第19版(1995)、以及任何之後的版本）。
包含本發明之FGF21化合物的可注射的組成物可使用醫藥工業之習用技術製備，其包含適當地溶解成分並混合之以得到所欲的終產物。因此，根據一個程序，本發明之FGF21化合於適合的pH被溶解在適合的緩衝劑中以最小化沈澱或避免沈澱。可注射的組成物係（例如）藉由滅菌過濾滅菌地製造。亦可將抗微生物劑加至該組成物。
組成物可為經穩定的調配物。術語「經穩定的調配物」意指一種調配物，其物理及／或化學穩定性增加，較佳為兩者皆增加。大體上，調配物必須在使用與儲存（依從推薦的使用與儲存條件）期間穩定直到到達截止日期。
術語「物理穩定性」意指一種物理狀態與關於此點的改變，其沒有改變共價鍵且因此未改變蛋白質由於暴露至熱-機械壓力、及／或與去穩定性介面與表面（諸如疏水性表面）交互作用而形成生物學上不活性及／或不溶解的聚集體及／或纖維體（fibrillate）的傾向。一水性蛋白質調配物之物理穩定性可於不同的溫度在暴露至機械／物理壓力（例如攪動）各種時間段後藉由目視檢查之手段、及／或藉由混濁測量及／或藉由濃度測量而評估。選擇性地，物理穩定性可使用分光鏡劑或蛋白質之構形性狀態之探針（諸如例如硫代黃素T或「疏水性小塊（hydrophobic patch）」探針）評估。
術語「化學穩定性」意指在蛋白質結構中的共價鍵之化學的（特別是共價的）改變，其導致形成化學降解產物，該產物相較於完整的蛋白質可能具有減少的生物效力、及／或增加的致免疫性效果。化學穩定性可藉由在暴露至不同的環境條件後的各種時間點測量化學降解產物之量而評估，例如藉由SEC-HPLC、RP-HPLC、LCMS、及／或胜肽定位（peptide mapping）。
在一個方面，本發明提供具有改善的物理穩定性的FGF21衍生物。在一個方面，本發明提供具有改善的化學穩定性的FGF21衍生物。 組合治療
根據本發明的使用FGF21衍生物的治療亦可與一或多個其他醫藥活性物質（例如選自抗糖尿病劑、抗肥胖劑、食慾調節劑、降血壓劑、用於治療及／或預防由糖尿病造成或與糖尿病有關的併發症的藥劑以及用於治療及／或預防由肥胖造成或與肥胖有關的併發症與疾患的藥劑）組合。
此等醫藥活性物質之實例為：GLP-1受體促效劑、胰島素、第IV型二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）抑制劑、澱粉素促效劑與瘦素受體促效劑。 醫藥適應症
本發明亦係關於用作為醫藥品的本發明之衍生物。
於特別地的具體態樣中，本發明之衍生物可用於以下的醫學治療： (i)預防及／或治療所有形式的糖尿病，諸如高血糖症、第2型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、第1型糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病、年輕人之成年肇始性糖尿病（maturity onset diabetes of the young，MODY）、妊娠糖尿病，及／或用於減少HbA1C； (ii)延遲或預防糖尿病疾病進展，諸如第2型糖尿病之進展、延遲受損的葡萄糖耐受性（impaired glucose tolerance，IGT）進展成胰島素需要型第2型糖尿病、延遲或預防胰島素抗性、及／或延遲非胰島素需要型第2型糖尿病進展成胰島素需要型第2型糖尿病； (iii)改善β細胞功能，諸如減少β細胞凋亡、增加β細胞功能及／或β細胞質量、及／或用於恢復β細胞的葡萄糖敏感性； (iv)預防及／或治療飲食疾患，諸如肥胖，例如藉由減少食物攝取、增加能量消費、減少體重、抑制食慾、誘發飽足感；治療或預防暴食疾患、心因性暴食症、及／或由投予抗精神病藥或類固醇誘發的肥胖；及／或預防及／或治療肥胖之共生病症，諸如骨關節炎及／或小便失禁； (v)預防及／或治療糖尿病併發症，諸如腎病變； (vi)改善脂質參數，諸如預防及／或治療異常血脂症、降低血清總脂質；增加HDL；降低小型、稠密的LDL；降低VLDL；降低三酸甘油酯；降低膽固醇；於人類降低脂蛋白質a（Lp(a)）之血漿水平；試管內及／或活體內抑制脂蛋白元a（apo(a)）之產生； (vii)預防及／或治療心血管疾病，諸如症候群X、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠狀動脈心臟病、再灌注損害、中風、大腦缺血、早期心臟疾病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠狀動脈疾病、高血壓、原發性高血壓、急性高血壓急症（acute hypertensive emergency）、心肌病變、心臟功能不全（heart insufficiency）、運動耐受力缺乏（exercise intolerance）、急性及／或慢性心臟衰竭、心律不整、心律異常、暈厥、心絞痛、心臟繞道及／或支架再閉塞、間歇性跛行（閉塞性動脈硬化）、舒張功能障礙、及／或收縮功能障礙；及／或減低血壓，諸如減低收縮壓； (viii)預防及／或治療肝臟脂肪變性與非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）；及／或 (ix)預防及／或治療重大疾病（critical illness），諸如治療危重病（critically ill）患者、重大疾病多發性腎病變（critical illness poly-nephropathy，CIPNP）患者、及／或可能的CIPNP患者；預防重大疾病或CIPNP之發展；預防、治療及／或治癒患者之全身性發炎反應症候群（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）；預防或減少患者在住院治療期間罹患菌血症、敗血症、及／或敗血性休克之可能性。
在一個特殊的具體態樣中，適應症係選自由(i)-(vii)所組成的群組。在另一個特殊的具體態樣中，適應症係選自由(i)、(iv)、(vi)及／或(vii)所組成的群組。以下的適應症係特佳的：第2型糖尿病、及／或肥胖。在一個具體態樣中，本發明之化合物係用於治療第2型糖尿病。在一個具體態樣中，本發明之化合物係用於治療肥胖。特殊的具體態樣
以下者為本發明之特殊的具體態樣。
1.一種FGF21蛋白質之衍生物， 其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181的位置包含Cys殘基， 其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子； 其中該延伸子係選自由以下者所組成的群組： Chem. 1A：HOOC-(CH2 )x -CO-*、 Chem. 1B：HOOC-苯-O-(CH2 )x -CO-*與 Chem. 1C：HO-S(=O)2 -(CH2 )x -CO-*， 其中x係範圍在8-18的整數；且 其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者的至少一者： 其中Chem. 2係選自： *-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -CO-*、 *-NH-S(=O)2 -(CH2 )m -CO-*與 *-NH-(CH2 )m -環已烷-CO-*， 其中m係範圍在1-5的整數， 其中Chem. 3係*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*，其中k係範圍在1-5的整數且n係範圍在1-5的整數，且 其中Chem. 4係選自： *-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2 -*與 *-NH-CH(COOH)-(CH2 )m -NH-CO-CH2-*， 其中m係範圍在1-5的整數；且 其中Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連，係於其*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181的位置的Cys殘基之硫原子，或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
2.根據具體態樣1的衍生物，其中該蛋白質包含在位置170、171、172、173、174、175、180或位置181的Cys殘基。
3.根據具體態樣1的衍生物，其中該蛋白質包含在位置170、173、174、175、180或位置181的Cys殘基。
4.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中Chem 2係選自由以下者所組成的群組： Chem. 2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 Chem. 2b：*-NH-S(=O)2 -(CH2 )3 -CO-*與 Chem. 2c：*-NH-CH2 -環已烷-CO-*。
5.根據具體態樣1的衍生物，其中Chem. 4係選自： Chem. 4a：*-NH-(CH2 )2 -NH-CO-CH2 -*與 Chem. 4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )4 -NH-CO-CH2-*。
6.一種FGF21蛋白質之衍生物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置包含Cys殘基，且相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）包含最多個30個胺基酸修飾； 其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子； 其中該延伸子係選自由以下者所組成的群組： Chem. 1A：HOOC-(CH2 )x -CO-*， 其中x係範圍在10-18的整數、 Chem. 1B：HOOC-苯-O-(CH2 )x ， 其中x係範圍在8-18的整數、 與 Chem. 1C；HO-S(=O)2 -(CH2 )x ， 其中x係範圍在10-18的整數， 其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者的至少一者： Chem. 2：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 Chem. 3：*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*、與 Chem. 4：*-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2-*， 其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且m係範圍在1-5的整數； 且 其中Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連，係於其*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其-CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置的Cys殘基之硫原子，或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
7.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中Chem. 1係選自由以下者所組成的群組： Chem. 1a：HOOC-(CH2 )16 -CO-*、 Chem. 1b：HOOC-苯-O-(CH2 )9 -CO-*與 Chem. 1c：HO-S(=O)2 -(CH2 )15 -CO-*。
8.一種FGF21蛋白質之衍生物， 其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置包含Cys殘基，其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子； 其中該延伸子係： Chem. 1：HOOC-(CH2 )x -CO-*， 其中x係範圍在10-18的整數；且 其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者的至少一者： Chem. 2：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 Chem. 3：*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*、與 Chem. 4：*-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2-*， 其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且m係範圍在1-5的整數； 其中Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連，係於其*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置的Cys殘基之硫原子，或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
9.一種FGF21蛋白質之衍生物， 其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置包含Cys殘基，且相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）包含最多個30個胺基酸修飾； 其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子； 其中該延伸子係： Chem. 1：HOOC-(CH2 )x -CO-*， 其中x係範圍在10-18的整數；且 其中該連接子包含Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4之各者的至少一者： Chem. 2：*-NH-CH(COOH)-(CH2 )2 -CO-*、 Chem. 3：*-NH-(CH2 )2 -[O-(CH2 )2 ]k -O-[CH2 ]n -CO-*、與 Chem. 4：*-NH-(CH2 )m -NH-CO-CH2-*， 其中k係範圍在1-5的整數，n係範圍在1-5的整數，且m係範圍在1-5的整數； 其中Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連，係於其*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其CH2 -*端連接至在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180或位置181的位置的Cys殘基之巰基基團，或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
10.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置180的位置包含Cys殘基。
11.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）具有最多30個，諸如25個，諸如20個，諸如15個，諸如10個，諸如8個，諸如最多5個胺基酸修飾。
12.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）具有4或5個胺基酸修飾。
13.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質相較於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）具有4個胺基酸修飾。
14.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該FGF蛋白質與成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）具有至少80 %，諸如85 %，諸如90 %，諸如95 %一致性。
15.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該FGF蛋白質與成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）具有至少96 %，諸如97 %，諸如98 %，諸如99 %一致性。
16.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該胺基酸改變係位於對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之位置121、168、180、或181之一或多者的位置之一或多者。
17.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該胺基酸改變之一者係在對應於成熟的人類FGF21（SEQ ID NO: 1）之N端的位置加入Ala殘基。
18.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質在該蛋白質之N端末端包含Ala。
19.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質包含121Q。
20.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質包含168L。
21.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質包含SEQ ID NO: 8或10之胺基酸序列。
22.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該蛋白質具有SEQ ID NO: 8、10、12、15、16、17、18、19或20之胺基酸序列。
23.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中x係範圍在12-18的整數。
24.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中x係範圍在14-18的整數。
25.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中x係範圍在14-16的整數。
26.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中x係16。
27.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中k係範圍在1-2的整數。
28.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中k係1。
29.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中n係範圍在1-2的整數。
30.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中n係1。
31.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中Chem. 4之m係範圍在1-2的整數。
32.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中Chem. 4之m係2。
33.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該延伸子包含Chem. 1a：HOOC-(CH2 )16 -CO-*。
34.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該延伸子係由Chem. 1a：HOOC-(CH2 )14 -CO-*所組成。
35.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該連接子包含Chem. 3a：*-NH-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -O-CH2 -CO-*。
36.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該連接子包含Chem. 4a：*-NH-(CH2 )2 -NH-CO-CH2 -*。
37.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該連接子係由至少一個Chem. 2元件、兩個Chem. 3元件、與一個Chem. 4元件所組成。
38.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該連接子係由一個Chem. 2元件、兩個Chem. 3元件、與一個Chem. 4元件所組成。
39.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該連接子係由兩個Chem. 2元件、兩個Chem. 3元件、與一個Chem. 4元件所組成。
40.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該連接子係由一個Chem. 2元件、兩個Chem. 3a元件、與一個Chem. 4a元件所組成。
41.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係以下者之一者： S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物13）
Figure 02_image005
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物14）
Figure 02_image007
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物15）
Figure 02_image009
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物16）
Figure 02_image011
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物17）
Figure 02_image013
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21（化合物18）
Figure 02_image015
； S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物19）
Figure 02_image017
； S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物20）
Figure 02_image019
； S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物21）
Figure 02_image021
； S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物22）
Figure 02_image023
； S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物23）
Figure 02_image025
； S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Met[Cys181]FGF21（化合物24）
Figure 02_image027
。
42.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係以下者之一者： S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物13）
Figure 02_image005
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物14）
Figure 02_image007
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物15）
Figure 02_image009
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物16）
Figure 02_image011
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物17）
Figure 02_image013
； S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21（化合物18）
Figure 02_image015
。
43.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係選自由化合物13-24與43至56所組成的群組。
44.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係選自由化合物35-41所組成的群組。
45.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係選自由化合物13-24、35-41與43至56所組成的群組。
46.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物13。
47.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物14。
48.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物15。根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物16。
49.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物17。
50.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物18。
51.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物19。
52.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物20。
53.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物21。
54.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物22。
55.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物23。
56.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物24。
57.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物35。
58.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物36。
59.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物37。
60.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物38。
61.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物39。
62.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物40。
63.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物41。
64.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物43。
65.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物44。
66.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物45。
67.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物46。
68.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物47。
69.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物48。
70.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物49。
71.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物50。
72.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物51。
73.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物53。
74.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物54。
75.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物55。
76.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物係化合物56。
77.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物具有FGF21活性。
78.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中該衍生物能夠活化FGF受體。
79.根據前述具體態樣中任一項的衍生物，其中在i.v.投予至迷你豬後的最終半生期（t½）比成熟的人類FGF21之最終半生期（t½）高至少20倍。
80.一種根據具體態樣1-79項中任一項的衍生物，其係用作為醫藥品。
81.一種根據具體態樣1-79項中任一項的衍生物，其係用於供以下者之用的方法：用於治療及／或預防所有形式的糖尿病與相關的疾病之任一者，諸如肥胖、飲食疾患、心血管的疾病、糖尿病併發症；及／或用於改善脂質參數、改善β細胞功能；及／或用於延遲或預防糖尿病疾病進展；及／或用於治療及／或預防肝臟脂肪變性與非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。
82.一種根據具體態樣1-79項中任一項的衍生物之用途，其係用於製造用於供以下者之用的醫藥品：用於治療及／或預防所有形式的糖尿病與相關的疾病，諸如肥胖、飲食疾患、心血管的疾病、糖尿病併發症；及／或用改善脂質參數、改善β細胞功能；及／或用於延遲或預防糖尿病疾病進展；及／或用於治療及／或預防肝臟脂肪變性與非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。
83.一種供以下者之用的方法：用於治療或預防所有形式的糖尿病與相關的疾病，諸如肥胖、飲食疾患、心血管的疾病、糖尿病併發症；及／或用於改善脂質參數、改善β細胞功能；及／或用於延遲或預防糖尿病疾病進展；及／或用於治療及／或預防肝臟脂肪變性與非酒精性脂肪肝病（NAFLD），其係藉由投予醫藥活性量的根據的具體態樣1-79中任一項的衍生物。
84.一種FGF21蛋白質，其在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180與181之一者的位置包含野生型胺基酸被半胱胺酸殘基取代的胺基酸取代。
85.根據具體態樣83的FGF21蛋白質，其中該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173、174、180與181之一者的位置包含Cys殘基。
86.根據具體態樣83的FGF21蛋白質，其中該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置170、173與174之一者的位置包含Cys殘基。
87.根據具體態樣83的FGF21蛋白質，其中該FGF21蛋白質在對應於FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置180與181之一者的位置包含Cys殘基。
88.根據具體態樣83的FGF21蛋白質，其中該FGF21蛋白質除了變異Cys殘基之外包含-1Ala、121Gln及／或168Leu。
89.根據具體態樣83的FGF21蛋白質，其中該FGF21蛋白質除了在FGF21（1-181）（SEQ ID NO: 1）之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180與181之一者的半胱胺酸之外包含-1Ala、121Gln及／或168Leu。實施例 縮寫表
AcOD：氘代丙酮 Ado：8-胺基-3,6-二氧辛酸 BSPP：雙(對-磺酸根基苯基)苯基膦二水合物二鉀鹽 DCM：二氯甲烷 DMSO：二甲基亞碸 DPBS：Dulbecco氏磷酸鹽緩衝食鹽水 EDAC：(3-二甲基胺基丙基)乙基碳二醯亞胺 ELSD：蒸發光散射偵測器 Fmoc：9H-茀-9-基甲氧基羰基 Fc：片段，可結晶的 GLP-1：類升糖素胜肽-1 gGlu：伽瑪麩胺酸 GLUT1：葡萄糖轉運子1 HATU：2-(7-氮-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯 HEPES：4-(2-羥基乙基)-1-哌口井乙磺酸 HPLC：高效液相色層分析法 IgG4：免疫球蛋白G4 IBMX：3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 IPTG：異丙基β-D-1-硫代半乳哌喃糖苷 LCMS：液相色層分析法質譜術 Mtt：4-甲基三苯甲基 NMR：核磁共振 OtBu：第三丁基酯 PBS：磷酸鹽緩衝食鹽水 RF：阻滯因數 Rt：滯留時間 RT：室溫 tBu：第三丁基 TCTU：O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯 TFA：三氟乙酸 Tris：參(羥基甲基)胺基甲烷或2-胺基-2-羥基甲基丙-1,3-二醇 Trx：傳明酸 UPLC：極致效能液相色層分析法 ZOSu：N-(苯甲基氧基羰基氧基)琥珀醯亞胺材料與方法 偵查與定特徵之一般方法 LCMS 方法 1
將樣本稀釋至約0.2 mg/ml並注射至LCMS系統，例如3-5 uL。LCMS儀器係由UPLC系統與質譜儀所組成。除去類似物之鹽分且可能於逆相管柱（例如C4、C8、C18管柱或前置管柱）分離之並使用在0.02-0.05% TFA（三氟乙酸）中的乙腈之線性梯度來分析。應校準儀器且若可能應使用鎖定質量噴霧。產生跨越主要色層分析波峰的MS光譜並使用反摺積演算法重建完整的質量。
LCMS儀器設定之實例（Synapt）： 正離子模式 3000 V毛細電壓， 30V錐電壓 110 °C來源溫度， 250 °C去溶劑溫度 25L/h之錐氣流（N2）。 m/z範圍200-3000 給出反褶積質量LCMS 方法 2
系統：安捷倫（Agilent）1290無限（infinity）系列　UPLC管柱：Aeris WIDEPORE 3.6µ XB-C18 2,1 x 50mm　偵測器：安捷倫科技（Agilent Technologies）LC/MSD TOF 6230（G6230A）　偵測器設置　離子化方法：安捷倫噴流來源　掃描範圍：m/z min. 100，m/z max. 3200線性反射器模式正模式
條件：線性梯度：5 %至95 % B　梯度運行時間：10分鐘0-8 min 5-95% B，8-9 min 95% B，9-9.5 min 95-5% B 9.5-10 min 5% B　流率：0.40 ml/min固定　管柱溫度：40°C
溶析液　溶劑A：99.90 % H2O，0.02% TFA　溶劑B：99.90 % CH3CN，0.02% TFA　溶劑C：NA
結果詳述與確認：所找到的質量對m＜4000的化合物係化合物之m/z ((m+z)/z)或係如反摺積之結果的質量（平均），使用質量獵人（Masshunter）工作站軟體版本B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1（安捷倫）。計算值質量係所欲化合物之平均分子量計算值m/z係所欲化合物之分子量(m+z)/z。LCMS 方法 3
系統：安捷倫1290無限系列　UPLC管柱：Phenomenex Aeris widepore 3,6µ C4 50x2,1 mm　偵測器：安捷倫科技LC/MSD TOF 6230（G6230A）
偵測器設置　離子化方法：安捷倫噴流來源　掃描範圍：m/z min. 100，m/z max. 3200線性反射器模式正模式
條件：台階梯度：5 %至90 % B　梯度運行時間：10分鐘：0-1 min 5-20% B，1-7 min 20-90 % B，7-8 min 90% B 8-8.5 min 90-5 %B 8.5-10 min 5% B　流率：0.40 ml/min固定　管柱溫度：40°C
溶析液　溶劑A：99.90 % H2O，0.02% TFA　溶劑B：99.90 % CH3CN，0.02% TFA　溶劑C：NA
結果詳述與確認：所找到的質量對於m＜4000的化合物係化合物之m/z ((m+z)/z)或如反摺積之結果的質量（平均），使用質量獵人工作站軟體版本B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1（安捷倫）。計算值質量係所欲化合物之平均分子量計算值m/z係所欲化合物之分子量(m+z)/z。LCMS 方法 4
系統：沃特斯（Waters）自動純化系統
管柱：Kinetex C18 4.6 mm x 50 mm
偵測器：UV：PDA，ELSD，MS Micromss Quatro micro
偵測器設置：離子化方法：ES+，掃描範圍100-1000，Cone 30 V，毛細300 kV，掃描時間1.3 s；PDA：210-400 nm；ELSD：噴霧器加熱器-冷卻器70 %，漂移管57.0 °C
條件：線性梯度乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA，梯度運行時間：4.0 min，總運行時間：6.0 min，流率：1.1 ml/min，管柱溫度：23 °C本發明之化合物之製備 實施例1：人類成熟的FGF21之選殖與表現
人類FGF21之DNA與胺基酸序列已被（例如）Nishimuraet al. 於Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203-206 (2000)中揭示。其等之序列亦可自公開的資料庫分別以登錄號EMBL:AB021975與UNIPROT:Q9NSA1獲得。
選殖成熟的人類FGF21蛋白質並將其於大腸桿菌中以胞內蛋白質且無訊息胜肽但於N端添加甲硫胺酸之形式表現。更特別地，對編碼成熟的人類FGF21（於N端添加Met）的基因序列之密碼子作最優化以於大腸桿菌中表現並將其選殖在載體pET11c之NdeI與BamHI位置間。此使FGF21基因在噬菌體T7啟動子之控制下。將表現構築體轉型至大腸桿菌BL21（DE3）中。挑出單一菌落並在LB + Amp 100 ug/mL中生長之至0.5的OD450 。於37℃使用0.3 mM IPTG誘發表現4個小時。藉由音振處理製作細胞之粗萃取物以分析FGF21表現。經考馬斯染色的SDS-PAGE顯示FGF21成功地被表現，其主要於沉澱小丸部分中辨識到。雖然由此表現的MetFGF21之計算值MW係19.5 kD，其在凝膠上呈25 kD蛋白質而移動，而此可能係因為該蛋白質脯胺酸含量高，延遲其移動。
於本案中，使用MetFGF21作為參考化合物。當FGF21係藉由使用大腸桿菌表現系統生產時，FGF21之N端被導入一個甲硫胺酸。然而，此不會被認為會影響生物活性，且因此FGF21與MetFGF21兩者皆通常被用作為參考化合物。 實施例2：FGF21類似物之選殖與表現
表1（實施例3）中的類似物之表現構築體係藉由對於實施例1中描述的FGF21成熟的表現構築體作突變誘發而製造。使用Stratagene多位置突變誘發套組。亦應用與於實施例1中描述者相同的表現條件。經考馬斯藍染色的SDS-PAGE顯示類似物成功地被表現。該類似物係以於FGF21序列之N端包含二胜肽Met-Ala之方式表現，而此允許具有Ala作為N端胺基酸殘基的FGF21類似物之表現，而此係因為大腸桿菌酵素切裂該Met。 實施例3：成熟的FGF21與FGF21類似物之純化
為了純化於實施例1-2中描述的成熟的FGF21與FGF21類似物，使用以下的程序或類似的技術。
將大腸桿菌細胞沉澱小丸再懸浮於10 mM鉀磷酸鹽pH 6.0，並在800巴下藉由均質機瓦解兩次。將包涵體藉由離心（10,000 x g，30分鐘）沉澱成小丸，再溶解於50 mM Tris pH 8.0中，並視需要地添加2M尿素及／或5mM半胱胺，並於4℃將漿液攪拌過夜。在加至管柱前，將漿液於10,000 x g再次離心30分鐘。將上清液用於離子交換色層分析法（Q Sepharose快速流動樹脂（Q Sepharose Fast Flow resin），GE醫療（GE Healthcare））並使用50-250 mM NaCl溶析。將0.4M硫酸銨加至溶析池，接著將其加至於20 mM Tris pH 8.0，0.4M硫酸銨中平衡的苯基FF管柱（GE醫療）。將管柱以20mM Tris pH 8.0，1.5 M氯化鈉洗滌，接著以10% Tris-氯化物緩衝劑（20mM Tris pH 8.0，1.5M氯化鈉）溶析。可使用30Q管柱以進一步純化。終產物係藉由SDS-PAGE或其他相關的技術來分析。對於化合物3及5-10，導入半胱胺酸的半胱胺保護在醫藥測試期間被保留。
FGF21類似物係如以上描述的製備。提供該等化合物藉由LCMS（使用LCMS方法1）測定完整的質量。 表1A. FGF21類似物1至10。
Figure 108144310-A0304-0001
 表1B. FGF21類似物25至32
Figure 108144310-A0304-0002
 實施例4：用於FGF21類似物之衍生化的試劑之製備
用於衍生化的代表性試劑之製備係於實施例4.1中給出。實施例4.2-4.4之試劑係藉由於實施例4.1中提供的方法製備。實施例4.5-4.17之試劑係藉由如以下描述的類似的方法製備。實施例 4.1 ：15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十五烷酸之製備
Figure 02_image029
固相合成方法：
將N-(苯甲基氧基羰基氧基)琥珀醯亞胺（ZOSu，100 g，401 mmol）在二氯甲烷（500 mL）中的溶液在2個小時的期間逐滴加至乙二胺（1, 189 mL，2.81 mol）於二氯甲烷（750 mL）中的溶液。在30分鐘後，過濾懸浮液並以二氯甲烷洗滌固體。將濾液蒸發至乾並以甲苯（1.00 L）與水（0.50 L）稀釋殘留物。過濾所得的混合物並分離濾液以提供兩個相。水相含有產物；因此將其以二氯甲烷（2 x 250 mL）萃取。將所有的有機相結合，以無水硫酸鈉乾燥，過濾並在真空內濃縮。將殘餘物以甲苯（750 mL）稀釋並以2 M氫氯酸水溶液（500 mL）與1 M氫氯酸水溶液（100 mL）萃取。將酸性的水相結合並以氫氧化鈉（60.0 g，1.50 mol）於水（90 mL）中的溶液鹼化。將所得的混合物以二氯甲烷（4 x 200 mL）萃取，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，在真空內濃縮並以已烷（200 mL）稀釋。將在乙醚中的氯化氫之4 M溶液（100 mL，400 mmol）加至該溶液，將所得的懸浮液在真空內濃縮並以已烷（1.00 L）稀釋。過濾沉澱出的固體，以已烷洗滌之並在真空內乾燥之以得到呈白色粉末的(2-胺基-乙基)-胺甲酸苯甲基酯氫氯化物。
產率：62.62 g（68%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇4:1）：0.25（自由鹼）。
1H NMR光譜（300 MHz，AcOD-d4，80 °C，dH）：7.42-7.26 (m, 5 H); 5.16 (s, 2 H); 3.60 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 3.32 (t, J=5.7 Hz, 2 H)。
將2-氯三苯甲基樹脂100-200篩目1.7 mmol/g（3, 40.1 g，68.1 mmol）放在乾燥二氯甲烷（250 mL）中20分鐘以使之膨脹。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-Ado-OH，17.5 g，45.4 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（30.1 mL，173 mmol）在乾二氯甲烷（50 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃5個小時。將樹脂過濾並以N,N-二異丙基乙基胺（15.8 mL，90.8 mmol）在甲醇／二氯甲烷混合物（4:1，250 mL，2 x 5 min）中的溶液處理。接著將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 250 mL）、二氯甲烷（2 x 250 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 250 mL）洗滌。藉由以於二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 250 mL）來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 250 mL）、2-丙醇（2 x 250 mL）與二氯甲烷（300 mL，2 x 250 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-Ado-OH，26.3 g，68.1 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，24.2 g，68.1 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（21.4 mL，123 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（140 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。將樹脂過濾並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 250 mL）、二氯甲烷（2 x 250 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（250 mL）洗滌。藉由以於二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 250 mL）來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 250 mL）、2-丙醇（2 x 250 mL）與二氯甲烷（300 mL，2 x 250 mL）洗滌樹脂。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-Glu-OtBu，29.0 g，68.1 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，24.2 g，68.1 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（21.4 mL，123 mmol）於N,N-二甲基甲醯胺（140 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。將樹脂過濾並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 250 mL）、二氯甲烷（2 x 250 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（250 mL）洗滌。藉由以於二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 250 mL）來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 250 mL）、2-丙醇（2 x 250 mL）與二氯甲烷（300 mL，2 x 250 mL）洗滌樹脂。將16-(第三丁氧基)-16-側氧基十六烷酸（23.3 g，68.1 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，24.2 g，68.1 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（21.4 mL，123 mmol）於N,N-二甲基甲醯胺／二氯甲烷混合物（4:1，200 mL）中的溶液加至樹脂。將樹脂搖晃1個小時，過濾並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 250 mL）、二氯甲烷（2 x 250 mL）、甲醇（2 x 250 mL）與二氯甲烷（350，6 x 250 mL）洗滌。藉由以2,2,2-三氟乙醇（250 mL）處理18個小時來將產物自樹脂分離。濾出樹脂並以二氯甲烷（2 x 250 mL）、2-丙醇／二氯甲烷混合物（1:1，2 x 250 mL）、2-丙醇（250 mL）與二氯甲烷（3 x 250 mL）洗滌。將溶液結合；將溶劑蒸發並將粗產物藉由快速管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0.060 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇1:0-9:1）純化。純的(S)-22-(第三丁氧基羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四側氧基-3,6,12,15,40-五氧基-9,18,23-三疊氮基四十烷酸係在真空內乾燥並以淺黃色濃稠黃色油之形式獲得。
產率：30.88 g（83%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇4:1）：0.30。
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.36 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 7.02 (t, J=5.4 Hz, 1 H); 6.55 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 4.46 (m, 1 H); 4.18 (s, 2 H); 4.02 (s, 2 H); 3.83-3.36 (m, 16 H); 2.44-2.12 (m, 7 H); 2.02-1.86 (m, 1 H); 1.60 (m, 4 H); 1.47 (s, 9 H); 1.45 (s, 9 H); 1.36-1.21 (m, 20 H)。
LC-MS方法4：
純度：100%
Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：3.60 min。
測定值m/z，z=1：818.7 (M+H)+
將2-(7-氮-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU，11.4 g，30.1 mmol）與三乙基胺（8.77 mL，62.9 mmol）依序加至(S)-22-(第三丁氧基羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四側氧基-3,6,12,15,40-五氧基-9,18,23-三疊氮基四十烷酸（22.4 g，27.4 mmol）於乾二氯甲烷（110 mL）中的溶液。將三乙基胺（5.72 mL，41.0 mmol）加至(2-胺基-乙基)-胺甲酸苯甲基酯氫氯化物（6.94 g，30.1 mmol）在乾二氯甲烷（165 mL）中的懸浮液並將所得的混合物加至以上的溶液。將混合物於室溫攪拌過夜，並接著將其蒸發至乾。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯（500 mL）中；以1 M氫氯酸水溶液（2 x 200 mL）、5%碳酸鈉水溶液（2 x 200 mL，相分離程度非常低）、1 M氫氯酸水溶液（8 x 200 mL）與滷水洗滌；以無水硫酸鈉乾燥並在真空內蒸發至乾。將殘餘物藉由快速管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0.060 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇95:5）純化以提供呈淺黃色濃稠油的15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-苯甲基氧基羰基胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-第三丁氧基羰基-丙基胺甲醯基]-十五烷酸第三丁基酯。
產率：23.84 g（88%）
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇9:1）：0.35
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.39-7.26 (m, 6 H); 7.19 (t, J=6.3 Hz, 1 H); 6.91 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 6.52 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.83 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 5.09 (s, 2 H); 4.41 (ddd, J=12.3, 4.6與4.3 Hz, 1 H); 3.99 (s, 2 H); 3.97 (s, 2 H); 3.71-3.30 (m, 20 H); 2.33-2.08 (m, 7 H); 1.97-1.83 (m, 1 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.35-1.20 (m, 20 H)。
LCMS方法4
純度：100%
Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：4.18 min
測定值m/z，z=1：994.9 (M+H)+
將在碳上的鈀（10%，1.27 g，1.20 mmol）加至以上化合物（23.8 g，24.0 mmol）在甲醇（350 mL）中的溶液並將所得的混合物在正常壓力下氫化4個小時。濾出催化劑並將濾液蒸發至乾。將殘餘物自二氯甲烷蒸發數次以移除殘餘的甲醇並在真空內乾燥以得到呈濃稠無色油的第三丁基(S)-1-胺基-25-(第三丁氧基羰基)-4,13,22,27-四側氧基-6,9,15,18-四氧基-3,12,21,26-四疊氮基四十烷-42-酸。
產率：20.50 g（99%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇9:1）：0.05。
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.54 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 7.41 (t, J=5.6 Hz, 1 H); 7.14 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 6.68 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.25 (bs, 2 H); 4.39 (td, J=8.3與4.2 Hz, 1 H); 4.01 (s, 4 H); 3.74-3.39 (m, 18 H); 2.96 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 2.34-2.06 (m, 7 H); 1.97-1.83 (m, 1 H); 1.68-1.50 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.43 (s, 9 H); 1.37-1.19 (m, 20 H)。
LCMS方法4
純度：100%
Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：1.43 min
測定值m/z，z=1：860.8 (M+H)+
於-30 °C在氬下將N,N-二異丙基乙基胺（4.98 mL，28.6 mmol）加至以上的胺（6, 20.5 g，23.8 mmol）於乾二氯甲烷（290 mL）的溶液。逐滴加入溴乙醯溴（2.48 mL，28.6 mmol）並在-30 °C將所得的溶液攪拌3個小時。移除冷卻浴，於室溫將混合物攪拌1個小時，並接著在真空內移除溶劑。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯（450 mL）中並以5%檸檬酸水溶液（300 mL）洗滌。各相在1個小時內分離。以水（300 mL）洗滌有機層並靜置所得的乳化液過夜以分離得到3個相。移除清澈的水層並將飽和的溴化鉀水溶液（100 mL）加入剩下的2個相與搖晃之。靜置各相過夜以分離，接著移除水層並以無水硫酸鈉乾燥有機層。在真空內移除溶劑並將藉由快速管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0.060 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇95:5）純化殘餘物以提供呈無色固體的第三丁基(S)-1-溴-28-(第三丁氧基羰基)-2,7,16,25,30-五側氧基-9,12,18,21-四氧基-3,6,15,24,29-五氮四十五烷-45-酸。
產率：19.46 g（83%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇9:1）：0.25
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.46 (m, 1 H); 7.33 (t, J=5.9 Hz, 1 H); 7.21 (t, J=5.1 Hz, 1 H); 6.92 (t, J=5.2 Hz, 1 H); 6.50 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 4.41 (ddd, J=12.2, 4.5與4.2 Hz, 1 H); 4.01 (s, 4 H), 3.85 (s, 2 H); 3.75-3.40 (m, 20 H), 2.36-2.08 (m, 7 H); 1.99-1.84 (m, 1 H); 1.68-1.51 (m, 4 H), 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.38-1.19 (m, 20 H)
LCMS方法4
純度：100%
Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：3.51 min。
測定值：m/z，z=1：980.9, 982.9 (M+H)+
將以上化合物（19.5 g，19.8 mmol）溶解於三氟乙酸（120 mL）中並於室溫將所得的溶液攪拌1.5個小時。在真空內移除三氟乙酸並將殘餘物自二氯甲烷（6 x 200 mL）蒸發。將二乙醚（200 mL）加至油狀殘餘物並將混合物攪拌過夜以得到懸浮液。過濾固體產物，以二乙醚與已烷洗滌之並在真空內乾燥之以提供呈白色粉末的標題產物15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十五烷酸。
產率：16.74 g（97%）。
1H NMR光譜（300 MHz，AcOD-d4，dH）：4.61 (dd, J=8.8與4.8 Hz, 1 H); 4.12 (s, 2 H), 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77 -3.39 (m, 20 H), 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-1.04 (m, 1 H); 1.71-1.56 (m, 4 H), 1.30 (bs, 20 H)
LCMS方法4：
純度：100%
Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：3.51 min
理論值m/z，z=1：869,8，測定值：m/z，z=1：868.7, 870.7實施例 4.2 ：11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十一烷酸之製備
Figure 02_image031
11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十一烷酸係藉由與實施例4.1中描述者相同的方法製備，而所得者為濃稠的橙色油。
1H NMR光譜（300 MHz，AcOD-d4，dH）：4.61 (dd, J=8.9與4.9 Hz, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.79-3.38 (m, 20 H); 2.50-2.16 (m, 7 H); 2.16-2.00 (m, 1 H); 1.72-1.56 (m, 4 H); 1.42-1.24 (m, 12 H)
LCMS方法4：
純度：100%（ELSD）
Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：2.74 min
理論值，m/z，z=1：813,8，實際值m/z，z=1：812.0, 814.0實施例 4.3 ：13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十三烷酸之製備
Figure 02_image033
13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十三烷酸係藉由與實施例4.1中描述者相同的方法製備，而所得者為濃稠的黃色油。
1H NMR光譜（300 MHz，AcOD-d4，dH）：4.61 (dd, J=8.9與4.9 Hz, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.11 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77-3.40 (m, 20 H); 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-2.07 (m, 1 H); 1.70-1.56 (m, 4 H); 1.31 (bs, 16 H)。
LCMS方法4：
純度：100%（ELSD）
Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：2.94 min
理論值m/z，z=1：841.9，實際值：m/z，z=1：841.7, 843.7實施例 4.4 ：19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基-胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十九烷酸之製備
Figure 02_image035
19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十九烷酸係藉由與實施例4.1中描述者相同的方法製備，而所得者為淺褐色粉末。
1H NMR光譜（300 MHz，AcOD-d4，dH）：4.65-4.57 (m, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77-3.43 (m, 20 H); 2.49-2.40 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 2.39-2.23 (m, 5 H); 2.17-2.07 (m, 1 H); 1.68-1.57 (m, 4 H); 1.30 (bs, 28 H)
LCMS方法4：
純度：100%（ELSD）
Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：2.17 min
理論值質量：926.0，測定值m/z: 926 (M+H)+實施例 4.5 ：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸之製備
Figure 02_image037
溶液相合成方法： 步驟1：苯甲基18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-苯甲基氧基羰基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸酯
在75 min的期間將苯甲基18-[[(1S)-1-苯甲基氧基羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸酯（26 g）之溶液（如於WO10029159中描述的製備，於DCM（320 ml）中）逐滴加至乙二胺（8.5 ml ml）在DCM（80 ml）與三乙基胺（5.2 ml）之0 °C溶液。在攪拌2 h後，將沉澱物濾出。將水（200 ml）與異丙醇（50 ml）加至濾液。萃取混合物。將有機層使用MgSO4乾燥。將MgSO4藉由過濾移除並在真空內乾燥濾液以得到標題化合物20,07 g（81%）LCMS：理論值質量：956.2；測定值m/z，z=1：957.0 步驟2：苯甲基18-[[(1S)-1-苯甲基氧基羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸酯
將氯乙酸（0,19 g）溶解於DCM（15 ml）中。加入N-羥基琥珀醯亞胺（0.22 g）與EDAC HCl（0.42 g）。在攪拌2.5h後，加入在DCM（5 ml）中的苯甲基18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-苯甲基氧基羰基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸酯（1.5 g）。於RT攪拌過夜後，將混合物以1M HCl（2x20 ml）及水／滷水2:1（30 ml）萃取。將有機層乾燥（MgSO4），過濾並在真空內濃縮以得到清澈的油，1.37 g（84 %）
LCMS：理論值質量：1032.7；測定值m/z，z=1：1033.1 步驟3：18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸
在充氮氣後，將10% PD/C（1.0 g）加至苯甲基18-[[(1S)-1-苯甲基氧基羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸酯（10,5 g）在丙酮（140 ml）中的溶液。在氫化6h後，在過濾前將混合物加熱至40-50°C。將在冷濾液中的沉澱物分離並以丙酮洗滌以及乾燥以得到標題化合物，7.42 g（85%）。 步驟4：8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸。
將溴化鈉（5 eq，1.21 g）加至18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸在丙酮（60 ml）中的懸浮液。於RT在黑暗中攪拌混合物。在2h後，添加更多溴化鈉（10 eq，2.41 g）。在2天後，添加更多溴化鈉（5 eq，1.21 g）。在5天後，濃縮混合物。將DCM（30 ml）、10%抗壞血酸（20 ml）與水30 ml加至殘餘物之一半。將異丙醇（50 ml）與水（30 ml）加至所得的乳化液。將有機相分離並以10%抗壞血酸（20 ml）與異丙醇（10 ml）之混合物洗滌兩次。將有機層乾燥（MgSO4），過濾並濃縮以提供固體油，將其於丙酮中結晶化並藉由過濾分離以提供混有起始材料，0.80 g的標題化合物（72%）。
LCMS：理論值質量：896.9。測定值m/z，z=1：898.9 (M+1)實施例 4.6 ：12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-12-側氧基-十二烷酸之製備
Figure 02_image039
固相合成方法：
將2-氯三苯甲基樹脂100-200篩目1.8 mmol/g（1, 11.9 g，21.4 mmol）放置在乾二氯甲烷（80 mL）中20分鐘以使之膨脹。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，5.50 g，14.3 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（9.44 mL，54.2 mmol）在乾二氯甲烷（70 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃4個小時。過濾樹脂並以N,N-二異丙基乙基胺（4.97 mL，28.5 mmol）在甲醇／二氯甲烷混合物（4:1，2 x 5 min，2 x 57 mL）中的溶液處理之。接著將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，11.0 g，28.5 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，10.1 g，28.5 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（9.93 mL，57.0 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃2小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）洗滌之。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu，9.11 g，21.4 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，7.60 g，21.4 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.71 mL，38.5 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）洗滌之。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌。將4-[(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)甲基]環已烷羧酸（Fmoc-Trx-OH，9.11 g，21.4 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，7.60 g，21.4 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.71 mL，38.5 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌。將十二烷二酸單第三丁基酯（C12(OtBu)-OH，6.13 g，21.4 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，7.61 g，21.4 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.71 mL，38.5 mmol）在二氯甲烷／N,N-二甲基甲醯胺混合物（4:1，80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（6 x 80 mL）、二氯甲烷（4 x 80 mL）、甲醇（4 x 80 mL）與二氯甲烷（7 x 80 mL）洗滌。藉由以2,2,2-三氟乙醇（80 mL）處理18個小時來將產物自樹脂分離。濾出樹脂並以二氯甲烷（4 x 80 mL）、二氯甲烷／2-丙醇混合物（1:1，4 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（6 x 80 mL）洗滌。結合溶液；蒸發溶劑並將粗產物藉由管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0-063 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇1:0-9:1）純化。純產物(2)係在真空內乾燥且係以油的形式獲得。
產率：5.40 g（42%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇9:1）：0.30。
1H NMR光譜（300 MHz；CDCl3，dH）：7.45-7.31 (m, 1 H); 7.10-6.97 (m, 1 H); 6.71-6.60 (m, 1 H); 5.70-5.58 (m, 1 H); 4.43-4.31 (m, 1 H); 4.15 (s, 2 H); 4.01 (s, 2 H); 3.79-3.31 (m, 16 H); 3.13-3.08 (m, 2 H); 2.28-1.79 (m, 11 H); 1.71-1.51 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (bs, 12 H); 1.05-0.88 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%。
LC-MS Rt（Sunfire 4.6 mm x 100 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：2.16 min。
LC-MS m/z：903.0 (M+H)+。
依序將2-(7-氮-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU，2.46 g，6.48 mmol）與三乙基胺（1.89 mL，13.6 mmol）加至以上油（2 , 5.31 g，5.89 mmol）在乾二氯甲烷（23 mL）中的溶液。將三乙基胺（1.36 mL，9.72 mmol）加至(2-胺基-乙基)-胺甲酸苯甲基酯氫氯化物（3, 1.49 g，6.48 mmol）在乾二氯甲烷（35 mL）中的懸浮液並將所得的混合物加至以上溶液。於室溫將混合物攪拌過夜，並接著將其在乾燥中蒸發。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯（70 mL）中；以1 M氫氯酸水溶液（1 x 70 mL）、5%碳酸鈉水溶液（2 x 70 mL）、1 M氫氯酸水溶液（4 x 70 mL）與滷水（70 mL）洗滌；以無水硫酸鈉乾燥與蒸發。將殘餘物藉由快速管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0-063 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇95:5至92:8）純化以提供濃稠的黃色油。
產率：2.81 g（44%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇9:1）：0.25。
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.41-7.29 (m, 6 H); 7.22-7.13 (m, 1 H); 6.93-6.81 (m, 1 H); 6.62-6.58 (m, 1 H); 5.90-5.81 (m, 1 H); 5.68-5.55 (m, 1 H); 5.09 (s, 2 H); 4.42-4.33 (m, 1 H); 4.01-3.95 (m, 4 H); 3.75-3.30 (m, 20 H); 3.14-3.06 (m, 2 H); 2.31-2.01 (m, 11 H); 1.97-1.76 (m, 1 H); 1.65-1.52 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.27 (bs, 12 H); 1.04-0.87 (m, 2 H)。
將在碳上的鈀（10%，0.15 g，0.13 mmol）加至以上化合物（2.81 g，2.60 mmol）在甲醇（43 mL）中的溶液並在正常壓力下將所得的混合物氫化2.5個小時。濾出催化劑並將濾液蒸發至乾。將殘餘物以甲苯共蒸發四次並在真空內乾燥以獲得化合物5。
產率：2.01 g（81%）。
1H NMR光譜（300 MHz；CDCl3，dH）：7.51-7.36 (m, 2 H); 7.04-6.96 (m, 1 H); 6.76-6.66 (m, 1 H); 5.93-5.85 (m, 1 H); 4.41-4.29 (m, 1 H); 4.03-3.99 (m, 4 H); 3.73-3.25 (m, 18 H); 3.13-2.97 (m, 4 H); 2.34-1.78 (m, 11 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.30 (m, 12 H); 1.04-0.88 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水70:30至100:0 + 0.1% TFA）：0.67 min。
LC-MS m/z：945.0 (M+H)+。
於-30 °C在氬下將N,N-二異丙基乙基胺（0.40 mL，2.28 mmol）加至以上胺（5 , 1.79 g，1.90 mmol）在乾二氯甲烷（30 mL）中的溶液。逐滴添加溴乙醯溴（0.20 mL，2.28 mmol）並將所得的溶液於-30 °C攪拌3個小時。移除冷卻浴，將混合物於室溫攪拌另外1個小時，並接著將其蒸發至乾。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯（50 mL）中，以5%檸檬酸水溶液（3 x 50 mL，相分離非常緩慢）、1 M氫氯酸水溶液（4 x 50 mL）與滷水（50 mL）洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾及蒸發。將殘餘物藉由快速管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0-063 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇95:5至93:7）純化以提供黃色油。
產率：1.63 g（80%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇95:5）：0.25。
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.56-7.48 (m, 1 H); 7.43-7.34 (m, 1 H); 7.04-6.95 (m, 1 H); 6.62 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 5.74-5.63 (m, 1 H); 4.43-4.33 (m, 1 H); 4.02 (s, 4 H); 3.85 (s, 2 H); 3.73-3.40 (m, 20 H); 3.14-3.09 (m, 2 H); 2.34-2.04 (m, 9 H); 1.97-1.76 (m, 4 H); 1.68-1.51 (m, 7 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.27 (m, 12 H); 1.07-0.90 (m, 2 H).
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：2.16 min。
LC-MS m/z：1066.0 (M+H)+。
將以上化合物（1.53 g，1.44 mmol）溶解於三氟乙酸（25 mL）中並放置1.5個小時。在真空內移除三氟乙酸並將殘餘物以甲苯共蒸發三次以及以二氯甲烷共蒸發十次以提供黃色油狀固體。
產率：810 mg（59%）。
1H NMR光譜（300 MHz，AcOD-d4，dH）：4.64-4.54 (m, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.11 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.78-3.40 (m, 20 H); 3.13-3.10 (d, J=6.6 Hz, 2 H); 2.51-2.19 (m, 9 H); 1.94-1.77 (m, 4 H); 1.68-1.41 (m, 7 H); 1.31 (bs, 12 H); 1.10-0.92 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：2.82 min。
LC-MS m/z：952.0 (M+H)+。實施例 4.7 ：16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸之製備
Figure 02_image041
固相合成方法：
將2-氯三苯甲基樹脂100-200篩目1.8 mmol/g（1, 11.9 g，21.4 mmol）放置於乾二氯甲烷（80 mL）中20分鐘以使之膨脹。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，5.50 g，14.3 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（9.44 mL，54.2 mmol）在乾二氯甲烷（70 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃4個小時。過濾樹脂並以N,N-二異丙基乙基胺（4.97 mL，28.5 mmol）在甲醇／二氯甲烷混合物（4:1，2 x 5 min，2 x 57 mL）中的溶液處理。接著將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，11.0 g，28.5 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，10.1 g，28.5 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（9.93 mL，57.0 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃2個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu，9.11 g，21.4 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，7.60 g，21.4 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.71 mL，38.5 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺中的溶液（80 mL）加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌。將Fmoc-傳明酸(Fmoc-Trx-OH，9.11 g，21.4 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，7.60 g，21.4 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.71 mL，38.5 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）、二氯甲烷（2 x 80 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 80 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（100 mL，2 x 80 mL）洗滌。將十六烷二酸單第三丁基酯（C16(OtBu)-OH，7.33 g，21.4 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，7.61 g，21.4 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.71 mL，38.5 mmol）在二氯甲烷／N,N-二甲基甲醯胺混合物（4:1，80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（6 x 80 mL）、二氯甲烷（4 x 80 mL）、甲醇（4 x 80 mL）與二氯甲烷（7 x 80 mL）洗滌。藉由以2,2,2-三氟乙醇（80 mL）處理18個小時來將產物自樹脂分離。濾出樹脂並以二氯甲烷（4 x 80 mL）、二氯甲烷／2-丙醇混合物（1:1，4 x 80 mL）、2-丙醇（2 x 80 mL）與二氯甲烷（6 x 80 mL）洗滌。結合溶液；蒸發溶劑並將粗產物藉由管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0-063 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇1:0-9:1）純化。中間物(2)係在真空內乾燥且係以油之形式獲得。
產率：8.20 g（80%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇9:1）：0.20。
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.44-7.33 (m, 1 H); 7.07-6.97 (m, 1 H); 6.72-6.63 (m, 1 H); 5.70-5.59 (m, 1 H); 4.44-4.33 (m, 1 H); 4.15 (s, 2 H); 4.01 (s, 2 H); 3.76-3.32 (m, 16 H); 3.14-3.07 (m, 2 H); 2.38-1.77 (m, 11 H); 1.71-1.50 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (bs, 20 H); 1.05-0.87 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%。
LC-MS Rt（Sunfire 4.6 mm x 100 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：3.56 min。
LC-MS m/z：959.0 (M+H)+。
依序將2-(7-氮-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU，3.55 g，9.34 mmol）與三乙基胺（2.72 mL，19.5 mmol）加至中間物2（8.13 g，8.49 mmol）在乾二氯甲烷（34 mL）中的溶液。將三乙基胺（1.78 mL，12.7 mmol）加至(2-胺基-乙基)-胺甲酸苯甲基酯氫氯化物（2.15 g，9.34 mmol）在乾二氯甲烷（51 mL）中的懸浮液並將所得的混合物加至以上溶液。將混合物於室溫攪拌過夜，並接著在乾燥中蒸發之。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯（150 mL）中；以1 M氫氯酸水溶液（1 x 100 mL）、5%碳酸鈉水溶液（2 x 100 mL）、1 M氫氯酸水溶液（4 x 100 mL）與滷水洗滌；以無水硫酸鈉乾燥並蒸發。將殘餘物藉由快速管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0-063 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇95:5至92:8）純化以提供呈濃稠的黃色油的化合物4。
產率：5.59 g（58%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇9:1）：0.20。
1H NMR光譜（300 MHz；CDCl3，dH）：7.41-7.31 (m, 6 H); 7.21-7.12 (m, 1 H); 6.92-6.83 (m, 1 H); 6.58-6.52 (m, 1 H); 5.89-5.79 (m, 1 H); 5.62-5.51 (m, 1 H); 5.10 (s, 2 H); 4.43-4.32 (m, 1 H); 4.05-3.92 (m, 4 H); 3.75-3.30 (m, 20 H); 3.15-3.07 (m, 2 H); 2.33-2.03 (m, 11 H); 1.97-1.68 (m, 1 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.26 (bs, 20 H); 1.05-0.87 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水70:30至100:0 + 0.1% TFA）：1.41 min。
LC-MS m/z：1136.0 (M+H)+。
將在碳上的鈀（10%，0.27 g，0.24 mmol）加至以上化合物（4 , 5.59 g，4.93 mmol）在甲醇（85 mL）中的溶液並將所得的混合物在正常壓力下氫化2.5個小時。濾出催化劑並將濾液蒸發至乾。將殘餘物以甲苯共蒸發四次並在真空內乾燥以產生化合物5。
產率：3.45 g（70%）。
1H NMR光譜（300 MHz；CDCl3，dH）：7.43-7.33 (m, 2 H); 7.05-6.94 (m, 1 H); 6.72-6.65 (m, 1 H); 5.69-5.59 (m, 1 H); 4.44-4.33 (m, 1 H); 4.03-3.98 (m, 4 H); 3.72-3.39 (m, 18 H); 3.15-3.07 (m, 2 H); 2.96-2.90 (m, 2 H); 2.34-1.78 (m, 13 H); 1.71-1.51 (m, 7 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (m, 20 H); 1.07-0.93 (m, 1 H)。
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水70:30至100:0 + 0.1% TFA）：0.76 min。
LC-MS m/z：1001.0 (M+H)+。
於-30 °C在氬下將N,N-二異丙基乙基胺（0.73 mL，4.14 mmol）加至以上胺（5 , 3.45 g，3.45 mmol）在乾二氯甲烷（55 mL）中的溶液。逐滴加入溴乙醯溴（0.36 mL，4.14 mmol）並將所得的溶液於-30 °C攪拌3個小時。移除冷卻浴，將混合物於室溫攪拌另外1個小時並接著將其蒸發至乾。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯（100 mL）中，以5%檸檬酸水溶液（3 x 100 mL，相分離非常緩慢）、1 M氫氯酸水溶液（4 x 100 mL）與滷水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥、過濾並蒸發。將殘餘物藉由快速管柱色層分析法（Silicagel 60，0.040-0-063 mm；溶析液：二氯甲烷／甲醇95:5至93:7）純化以提供呈黃色油的化合物6。
產率：1.63 g（44%）。
RF（SiO2，二氯甲烷／甲醇95:5）：0.15。
1H NMR光譜（300 MHz，CDCl3，dH）：7.55-7.46 (m, 1 H); 7.43-7.33 (m, 1 H); 6.99-6.89 (m, 1 H); 6.58 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.72-5.59 (m, 1 H); 4.44-4.32 (m, 1 H); 4.02 (s, 4 H); 3.85 (s, 2 H); 3.74-3.40 (m, 20 H); 3.14-3.09 (m, 2 H); 2.33-2.05 (m, 9 H); 2.01-1.76 (m, 4 H); 1.67-1.53 (m, 7 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (m, 20 H); 1.07-0.89 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水50:50至100:0 + 0.1% FA）：3.47 min。
LC-MS m/z：1122.0 (M+H)+。
將以上化合物（6 , 1.63 g，1.53 mmol）溶解於三氟乙酸（25 mL）中並靜置1.5個小時。在真空內移除三氟乙酸並將殘餘物以甲苯共蒸發三次。將二乙醚（120 mL）加至油狀殘餘物並將混合物攪拌1個小時。接著濾出沉澱物並在真空內乾燥殘餘物以提供白色粉末。
產率：1.55 g（90%）。
1H NMR光譜（300 MHz，AcOD-d4，dH）：4.65-4.56 (m, 1 H); 4.14 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.98 (s, 2 H); 3.78-3.44 (m, 20 H); 3.14-3.10 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 2.48-2.21 (m, 8 H); 2.18-2.10 (m, 1 H); 1.97-1.79 (m, 4 H); 1.70-1.46 (m, 7 H); 1.32 (bs, 20 H); 1.11-0.93 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex，4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：3.32 min。
LC-MS m/z：1008.0 (M+H)+。實施例 4.8 ：18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-18-側氧基-十八烷酸之製備
Figure 02_image043
合成方法：
將Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26 mmol/g（1, 11.7 g，3.05 mmol）放置在二氯甲烷（100 mL）中45分鐘以使之膨脹。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 90 mL）移除Fmoc基團。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，2.35 g，6.09 mmol）、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，2.17 g，6.09 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（2.12 mL，12.2 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌之。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 90 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，2.35 g，6.09 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，2.17 g，6.09 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（2.12 mL，12.2 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌之以獲得中間物1 。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 90 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu，1.94 g，4.57 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，1.62 g，4.57 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（1.43 mL，8.23 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌之。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 90 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將4-[(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)甲基]環已烷羧酸（Fmoc-Trx-OH，1.73 g，4.57 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，1.62 g，4.57 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（1.43 mL，8.23 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌之以獲得中間物2 。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 50 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 50 mL）、2-丙醇（3 x 50 mL）與二氯甲烷（3 x 30 mL）洗滌樹脂。將十八烷二酸單第三丁基酯（C18(OtBu)-OH，0.85 g，2.28 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，0.81 g，2.28 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（0.72 mL，4.11 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（50 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 50 mL）、二氯甲烷（3 x 50 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 50 mL）洗滌之。藉由以在二氯甲烷中的80% 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇處理（2 x 10 min，2 x 30 min，4 x 50 mL）移除Mtt基團。以二氯甲烷（6 x 50 mL）洗滌樹脂。將溴乙酸（4.24 g，30.5 mmol）與N,N´-二異丙基碳二醯亞胺（DIC，4.01 mL，25.9 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（50 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃45分鐘。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（5 x 50 mL）與二氯甲烷（10 x 50 mL）洗滌之。藉由以三氟乙酸（50 mL）處理1個小時來將產物自樹脂分離。濾出樹脂並以三氟乙酸（1 x 25 mL）與二氯甲烷（2 x 30 mL）洗滌。結合溶液並蒸發溶劑至乾以獲得呈濃稠的褐色油的化合物。
產率：2.18 mg（64%）。
1H NMR光譜（300 MHz；AcOD-d4，80°C，dH）：4.72-4.55 (m, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.80-3.62 (m, 12 H); 3.58-3.44 (m, 4 H); 3.32 (t, J=6.8 Hz, 2 H); 3.15 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 2.51-2.07 (m, 8 H); 2.01-1.77 (m, 6 H); 1.72-1.44 (m, 11 H); 1.33 (bs, 24 H); 1.13-0.95 (m, 2 H)。
LC-MS純度：96%。
LC-MS Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：3.68 min。
LC-MS m/z：1124.1 (M+H)+。實施例 4.9 ：16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸之製備
Figure 02_image045
合成程序類似於實施例4.8，除了在合成步驟中在中間物2 之後使用十六烷二酸單第三丁基酯（C16(OtBu)-OH）而不是十八烷二酸單第三丁基酯（C18(OtBu)-OH）。獲得呈濃稠的褐色油的產物。
產率：2.05 mg（62%）。
1H NMR光譜（300 MHz；AcOD-d4, 80°C，dH）：4.71-4.55 (m, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.79-3.62 (m, 12 H); 3.58-3.44 (m, 4 H); 3.32 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 3.15 (d, J=6.6 Hz, 2 H); 2.49-2.07 (m, 8 H); 2.01-1.77 (m, 6 H); 1.72-1.44 (m, 11 H); 1.33 (bs, 20 H); 1.13-0.97 (m, 2 H)。
LC-MS純度：92%。
LC-MS Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：3.38 min。
LC-MS m/z：1096.0 (M+H)+。實施例 4.10 ：4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]磺醯基胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸之製備
Figure 02_image047
合成程序類似於實施例4.8，除了在合成步驟中在中間物1 之後使用標準Fmoc保護／去保護合成程序首先將3-羧基丙烷磺醯胺偶合至樹脂且接著將10-(4-第三丁氧基羰基苯氧基)癸酸偶合至樹脂。在合成步驟之後，如實施例4.8中例示地切裂與處理得到白色固體。
LC-MS m/z：998.54 (M1+)。
UPLC5：方法09_B4_1，Rt=8.3004 min (pH 2.3)；98%純度。實施例 4.11 ：4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸之製備
Figure 02_image049
合成程序類似於實施例4.8，除了在合成步驟中在中間物1 之後使用標準Fmoc保護／去保護合成程序首先將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu）偶合至樹脂且接著將10-(4-第三丁氧基羰基苯氧基)癸酸偶合至樹脂。在合成步驟之後，如實施例4.8中例示地切裂與處理得到白色固體。
LC-MS m/z：978,55(M1+)。
UPLC5：方法09_B4_1，Rt=7.573 min (pH 2.3)；99%純度。實施例 4.12 ：20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸之製備
Figure 02_image051
合成程序類似於實施例4.8，除了在合成步驟中在中間物1 之後使用標準Fmoc保護／去保護合成程序首先將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu）偶合至樹脂兩次，接著將20-第三丁氧基-20-側氧基-花生酸（C20(OtBu)-OH）偶合至樹脂。在合成步驟之後，如實施例4.8中例示地切裂與處理得到白色固體。
LC-MS m/z：1141.2 (M+H)+。實施例 4.13 ：20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸之製備
Figure 02_image053
合成程序類似於實施例4.8，除了在合成步驟中在中間物1 之後使用標準Fmoc保護／去保護合成程序首先將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu）偶合至樹脂，接著將20-第三丁氧基-20-側氧基-花生酸（C20(OtBu)-OH）偶合至樹脂。在合成步驟之後，如實施例4.8中例示地切裂與處理得到白色固體。
LC-MS m/z：1012.0 (M+H)+。實施例 4.14 ：(2S,25S)-2-(4-(2-溴乙醯胺基)丁基)-4,13,22-三側氧基-25-(15-磺酸基十五烷醯胺基)-6,9,15,18-四氧基-3,12,21-三氮二十六烷二酸之製備
Figure 02_image055
合成方法：
將Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26 mmol/g（1, 36.7 g，9.55 mmol）放置在二氯甲烷（200 mL）中45分鐘以使之膨脹。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，7.36 g，19.1 mmol）、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，6.79 g，19.1 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.66 mL，38.2 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、二氯甲烷（2 x 150 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，7.36 g，19.1 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，6.79 g，19.1 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.66 mL，38.2 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、二氯甲烷（2 x 150mL）與N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu，6.10 g，14.3 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，5.09 g，14.3 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（4.49 mL，25.8 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、二氯甲烷（2 x 150mL）與N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。將樹脂分成三個部分，將16-磺酸基-十六烷酸鈉（3, 2.28 g，6.37 mmol）、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽（PyBOP，3.31 g，6.37 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（2.22 mL，12.8 mmol）在二甲基亞碸（80 mL）中的溶液加至一類以上樹脂並將混合物搖晃2個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺：水混合物（3:1，3 x 80 mL）、N,N-二甲基甲醯胺（3 x 80 mL）、二氯甲烷（3 x 80 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（2 x 80 mL）洗滌。藉由以在二氯甲烷中的80% 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇處理（3 x 10 min，2 x 30 min，5 x 80 mL）移除Mtt基團。以二氯甲烷（6 x 80 mL）洗滌樹脂。將溴乙酸（6.64 g，47.8 mmol）與N,N´-二異丙基碳二醯亞胺（DIC，5.26 mL，34.0 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（80 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃45分鐘。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（4 x 80 mL）與二氯甲烷（10 x 80 mL）洗滌。藉由以三氟乙酸（100 mL）處理1個小時來將產物自樹脂分離。濾出樹脂並以三氟乙酸（1 x 40 mL）與二氯甲烷（3 x 50 mL）洗滌。結合溶液並將溶劑蒸發至乾以得到濃稠的褐色油。將該油溶解於水：乙腈混合物（4:1，25 mL）中並使溶液通過呈H+形式的Dowex 50WX4（50-100篩目；溶析液：水）之管柱（7 x 10 cm）。結合具有酸性pH的部分並冷凍乾燥以獲得白色粉末。
產率：2.17 g（68%）。
1H NMR光譜（300 MHz；AcOD-d4。80 °C，dH）：4.74-4.56 (m, 2 H); 4.16 (d, J=5.3 Hz, 4 H); 3.95 (s, 2 H); 3.82-3.64 (m, 12 H); 3.61-3.47 (m, 4 H); 3.33 (t, J=6.9 Hz, 2 H); 3.17-3.07 (m, 2 H); 2.54 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 2.38 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 2.34-2.09 (m, 2 H); 2.01-1.93 (m, 1 H); 1.93-1.78 (m, 3 H); 1.74-1.57 (m, 4 H); 1.57-1.29 (m, 24 H)。
LC-MS純度：100%。
LC-MS Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：2.86 min。
LC-MS m/z：1003.9 (M+H)+。實施例 4.15 ：12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸之製備
Figure 02_image057
合成方法：
將Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26 mmol/g（1, 36.7 g，9.55 mmol）放置於二氯甲烷（200 mL）中45分鐘以使之膨脹。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，7.36 g，19.1 mmol）、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，6.79 g，19.1 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.66 mL，38.2 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、二氯甲烷（2 x 150 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，7.36 g，19.1 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，6.79 g，19.1 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（6.66 mL，38.2 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、二氯甲烷（2 x 150mL）與N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu，6.10 g，14.3 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，5.09 g，14.3 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（4.49 mL，25.8 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 150 mL）、二氯甲烷（2 x 150mL）與N,N-二甲基甲醯胺（150 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 150 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）、2-丙醇（2 x 150 mL）與二氯甲烷（2 x 150 mL）洗滌樹脂。將樹脂分成三個部分，將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu，2.03 g，4.78 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，1.70 g，4.78 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（1.50 mL，8.60 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（70 mL）中的溶液加至一類以上樹脂(2)並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（2 x 70 mL）、二氯甲烷（2 x 70mL）與N,N-二甲基甲醯胺（70 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 30 min，2 x 70 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 70 mL）、2-丙醇（2 x 70 mL）與二氯甲烷（2 x 70 mL）洗滌樹脂。將十二烷二酸單第三丁基酯（C12(OtBu)-OH，1.37 g，4.78 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，1.70 g，4.78 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（1.50 mL，8.60 mmol）在二氯甲烷／N,N-二甲基甲醯胺混合物（4:1，70 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5 hr。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）、二氯甲烷（3 x 150 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 150 mL）洗滌。藉由以在二氯甲烷中的80% 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇處理（3 x 10 min，2 x 30 min，4 x 70 mL）移除Mtt基團。以二氯甲烷（6 x 70 mL）洗滌樹脂。將溴乙酸（6.60 g，47.8 mmol）與N,N´-二異丙基碳二醯亞胺（DIC，5.30 mL，34.0 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（90 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃30分鐘。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（4 x 70 mL）與二氯甲烷（10 x 70 mL）洗滌。藉由以三氟乙酸（100 mL）處理1個小時來將產物自樹脂分離。濾出樹脂並以三氟乙酸（1 x 40 mL）與二氯甲烷（2 x 40 mL）洗滌。結合溶液並將溶劑蒸發至乾以得到濃稠的褐色油。
產率：2.94 mg（90%）。
1H NMR光譜（300 MHz；AcOD-d4，dH）：4.74-4.53 (m, 3 H); 4.17 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.81-3.40 (m, 16 H); 3.31 (t, J=6.8 Hz, 2 H); 2.57-2.20 (m, 10 H); 2.16-2.04 (m, 3 H); 1.89-1.75 (m, 1 H); 1.72-1.54 (m, 6 H); 1.52-1.41 (m, 2 H); 1.32 (bs, 12 H)。
LC-MS純度：100%。
LC-MS Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：2.64 min。
LC-MS m/z：1028.0 (M+H)+。實施例 4.16 ：12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸之製備
Figure 02_image059
合成程序與實施例4.8相同，除了在合成步驟中在以下的中間物1之後使用標準Fmoc保護／去保護合成程序首先將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu）偶合至樹脂且接著將12-第三丁氧基-12-側氧基-十二烷酸偶合至樹脂。在合成步驟之後，如實施例4.8中例示地切裂與處理得到呈濃稠的褐色油的化合物。
產率：97%
1H NMR光譜（300 MHz；AcOD-d4，dH）：4.73-4.55 (m, 2 H); 4.17 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.80-3.42 (m, 16 H); 3.31 (t, J=6.78 Hz, 2 H); 2.49-2.17 (m, 7 H); 2.01-1.92 (m, 2 H); 1.87-1.76 (m, 1 H); 1.70-1.54 (m, 6 H); 1.52-1.41 (m, 2 H); 1.32 (bs, 12 H)。
LC-MS純度：100%。
LC-MS Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：2.72 min。
LC-MS m/z：900.0 (M+H)+。實施例 4.17 ：20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-20-側氧基-花生酸之製備
Figure 02_image061
合成方法：
將Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26 mmol/g（1, 11.2 g，2.90 mmol）放置在二氯甲烷（100 mL）中45分鐘以使之膨脹。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 100 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，2.23 g，5.80 mmol）、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，2.06 g，5.80 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺(2.02 mL，11.6 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 100 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（Fmoc-OEG-OH，2.23 g，5.80 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，2.06 g，5.80 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺(2.02 mL，11.6 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 100 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-第三丁基酯（Fmoc-LGlu-OtBu，1.85 g，4.35 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，1.55 g，4.35 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（1.36 mL，7.82 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃1.5個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 100 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將4-[(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)甲基]環已烷羧酸（Fmoc-Trx-OH，1.65 g，4.35 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，1.55 g，4.35 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（1.36 mL，7.82 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃2個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌。藉由以在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理（1 x 5 min，1 x 10 min，1 x 30 min，3 x 100 mL）移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、2-丙醇（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將二十烷二酸單第三丁基酯（C20(OtBu)-OH，1.73 g，4.35 mmol）、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸酯（TCTU，1.55 g，4.35 mmol）與N,N-二異丙基乙基胺（1.36 mL，7.82 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃2個小時。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）、二氯甲烷（3 x 90 mL）、N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）與二氯甲烷（3 x 90 mL）洗滌。藉由以在二氯甲烷中的80% 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇處理（2 x 10 min，2 x 30 min，4 x 100 mL）移除Mtt基團。以二氯甲烷（6 x 90 mL）與N,N-二甲基甲醯胺（3 x 90 mL）洗滌樹脂。將將溴乙酸（8.06 g，58.0 mmol）與N,N´-二異丙基碳二醯亞胺（DIC，7.60 mL，49.3 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（100 mL）中的溶液加至樹脂並將混合物搖晃40分鐘。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺（5 x 90 mL）與二氯甲烷（12 x 90 mL）洗滌。藉由以三氟乙酸（100 mL）處理1個小時來將產物自樹脂分離。濾出樹脂並以三氟乙酸（1 x 50 mL）與二氯甲烷（7 x 70 mL）洗滌。結合溶液並將溶劑蒸發至乾以得到濃稠的褐色油。
產率：3.28 g（98%）。
1H NMR光譜（300 MHz；AcOD-d4，80 °C，dH）：4.68 (dd, J=8.0 and 5.4 Hz, 1 H); 4.60 (dd, J=7.9 and 5.3 Hz, 1 H); 4.16 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.94 (s, 2 H); 3.81-3.61 (m, 12 H); 3.59-3.44 (m, 4 H); 3.32 (t, J=6.8 Hz, 2 H); 3.14 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 2.49-1.79 (m, 15 H); 1.73-1.43 (m, 11 H); 1.33 (s, 28 H); 1.11-0.96 (m, 2 H)。
LC-MS純度：100%（ELSD）。
LC-MS Rt（Kinetex 4.6 mm x 50 mm，乙腈／水20:80至100:0 + 0.1% FA）：4.04 min。
LC-MS m/z：1151.3 (M+H)+。 實施例5：FGF21衍生物之製備
代表性FGF21衍生物之製備係於實施例5.1中給出（化合物21）。實施例5.2-5.14之FGF21衍生物（化合物11-20與22-14）係藉由實施例5.1中提供的方法製備。實施例5.15-5.37之FGF21衍生物係藉由實施例5.1中提供的方法製備或如以下所描述地製備。 實施例5.1：化合物21 S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 02_image021
此化合物係SEQ ID NO: 10之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物。
化合物21係如下製備：
SEQ ID NO: 10之S{貝他-181}-2-胺基乙基氫硫基-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21類似物（如實施例1-3中一般地描述的製備）中位於位置181C的Cys殘基係以實施例4.1中製備的試劑在位於位置181C的Cys殘基之巰基基團修改：
Figure 02_image029
將在水中的Tris加至半胱胺經保護的Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（70 mg，0.0036 mmol）（於Tris與NaCl-緩衝劑（1.35 mg/ml）中）以將pH調整至8.0。添加溶解於水中的BSPP（雙(對-磺酸根基苯基)苯基膦二水合物二鉀鹽，12 mg）並於室溫輕輕地攪拌4個小時。添加於乙醇（0.5 mL）中的15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十五烷酸（19 mg，0.022 mmol）。在輕輕地攪拌過夜後，添加MiliQ水（150 mL）以將傳導度降低至2.5 mS/cm。將混合物使用陰離子交換在MonoQ 10/100 GL管柱上使用以下者純化：A-緩衝劑：20 mM Tris，pH 8.0；B-緩衝劑：20 mM Tris，500 mM NaCl，pH 8.0，流6 mL與跨過60 CV的0-80%B之梯度。產率：37 mg，51%。
LCMS方法2：
理論值質量：20279.9；測定值：20280.4 實施例5.2：化合物11 S{貝他-178}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21
Figure 02_image063
此化合物係SEQ ID NO: 6之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十五烷酸製備。
LCMS方法2
理論值質量：20279.9；測定值：20280.2 實施例5.3：化合物12 S{貝他-179}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21
Figure 02_image065
此化合物係SEQ ID NO: 7之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十五烷酸製備。
LCMS方法3
理論值質量：20203.8；測定值：20204.2 實施例5.4：化合物13 S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image005
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.2之試劑11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十一烷酸製備。
LCMS方法2
理論值質量：20239.8；測定值：20240.1實施例 5.5 ：化合物14 S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image007
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.3之試劑13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十三烷酸製備。
LCMS方法3；
理論值質量：20267.8；測定值：20268.1 實施例5.6：化合物15 S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image009
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十五烷酸製備。
LCMS方法2：
理論值質量：20295.9；測定值：20296.2 實施例5.7：化合物16 S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image011
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.5之試劑17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十七烷酸製備。
LCMS方法3
理論值質量：20323.9；測定值：20324.5實施例 5.8 ：化合物17 S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image013
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.4之試劑19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十九烷酸製備。
LCMS方法3
理論值質量：20352.0；測定值：20352.0 實施例5.9：化合物18 S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21
Figure 02_image015
此化合物係SEQ ID NO: 9之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.5之試劑17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十七烷酸製備。
LCMS方法2：
理論值質量：20236.8；測定值：20237.0 實施例5.10：化合物19 S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 02_image017
此化合物係SEQ ID NO: 1之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.2之試劑11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十一烷酸製備。
LCMS方法2：
理論值質量：20223.8；測定值：20224.4。 實施例5.11：化合物20 S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 02_image019
此化合物係SEQ ID NO: 10之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.3之試劑13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基-胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十三烷酸製備。
LCMS方法2：
理論值質量：20251.8；測定值：20252.2 實施例5.12：化合物22 S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 02_image023
此化合物係SEQ ID NO: 10之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.5之試劑17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十七烷酸製備。
LCMS方法2：
理論值質量：20307.9；測定值：20308.6。 實施例5.13：化合物23 S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 02_image025
此化合物係SEQ ID NO: 10之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.4之試劑19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基-胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十九烷酸製備。
LCMS方法2：
理論值質量：20336.0；測定值：20336.2實施例 5.14 ：化合物24 S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Met[Cys181]FGF21
Figure 02_image027
此化合物係SEQ ID NO: 11之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.5之試劑17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十七烷酸製備。
LCMS方法3：
理論值質量：20372.2；測定值：20372.2。實施例 5.15 ：化合物34 S{貝他-168}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Cys168]FGF21
Figure 02_image068
此化合物係SEQ ID NO:13 之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.3之試劑13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十三烷酸製備。
LCMS方法1
理論值質量：20225.；測定值：20226.7實施例 5.16 ：化合物35 S{貝他-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21
Figure 02_image070
此化合物係SEQ ID NO: 14之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十五烷酸製備。
LCMS方法3
理論值質量：20267.8；測定值：20268.2實施例 5.17 ：化合物36 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21
Figure 02_image072
此化合物係SEQ ID NO: 15之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.5之試劑18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸製備。實施例 5.18 ：化合物37 S{貝他-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21
Figure 02_image074
此化合物係SEQ ID NO: 18之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十五烷酸製備。
LCMS方法3
理論值質量：20238.8；測定值：20239.3實施例 5.19 ：化合物38 S{貝他-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure 02_image076
此化合物係SEQ ID NO: 19之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.3之試劑13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十三烷酸製備。
LCMS方法1
理論值質量：20281.9；測定值：20281.9實施例 5.20 ：化合物39 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure 02_image078
此化合物係SEQ ID NO:19 之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.5之試劑18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸製備。實施例 5.21 ：化合物40 16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-16-側氧基-十六烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure 02_image080
此化合物係SEQ ID NO: 19之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-16-側氧基-十六烷酸製備。實施例 5.22 ：化合物41 S{貝他-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21
Figure 02_image082
此化合物係SEQ ID NO: 20之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十五烷酸製備。
LCMS方法3
理論值質量：20210.8；測定值：20211.4實施例 5.23 ：化合物42 S{貝他-176}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys176]FGF21
Figure 02_image084
此化合物係SEQ ID NO: 4之FGF21類似物（參見實施例3）衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.1之試劑15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯基胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)-乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}十五烷酸製備。
LCMS方法3
理論值質量：20279.9；測定值：20280.4實施例 5.24 ：化合物43 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image086
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.11之試劑4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸製備。實施例 5.25 ：化合物44 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]磺醯基胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image088
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.10之試劑4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]磺醯基胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸製備。實施例 5.26 ：化合物45 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image090
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.12之試劑20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸製備。實施例 5.27 ：化合物46 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image092
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.13之試劑20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸製備。實施例 5.28 ：化合物47 (2S)-6-乙醯胺基-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺酸基十六烷醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]十六烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image094
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.14之試劑(2S)-6-[(2-溴乙醯基)胺基]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺酸基十六烷醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]已酸製備。實施例 5.29 ：化合物48 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image096
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.16之試劑12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸製備。實施例 5.30 ：化合物49 12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image098
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.15之試劑12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸製備。實施例 5.31 ：化合物50 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙醯胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-20-側氧基-花生酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image100
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.17之試劑20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-20-側氧基-花生酸製備。實施例 5.32 ：化合物51 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image102
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.7之試劑16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸製備。實施例 5.33 ：化合物52 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙醯胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image104
此化合物係SEQ ID NO:8 之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.9之試劑16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸製備。實施例 5.34 ：化合物53 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙醯胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-18-側氧基-十八烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image106
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.8之試劑18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-18-側氧基-十八烷酸製備。實施例 5.35 ：化合物54 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-12-側氧基-十二烷酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 02_image108
此化合物係SEQ ID NO: 8之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.6之試劑12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-12-側氧基-十二烷酸製備。實施例 5.36 ：化合物55 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 02_image110
此化合物係SEQ ID NO:10 之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.11之試劑4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸製備。實施例 5.37 ： 化合物56 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]磺醯基胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 02_image112
此化合物係SEQ ID NO: 10之FGF21類似物（參見實施例3）之衍生物，其係藉由實施例5.1中描述的方法使用實施例4.10之試劑4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]磺醯基胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸製備。醫藥方法
本發明之FGF21類似物或其衍生物作為在哺乳類動物（諸如人類）中減少增重及治療肥胖與糖尿病的醫藥活性劑的實用性可藉由該FGF21促效劑於以下描述的習用分析及試管內與活體內分析中的活性展示。
此等分析亦提供一種方法，藉其本發明之FGF21化合物之活性可與已知化合物之活性相比較。 實施例6：在過度表現人類BKL的HEK293中於Erk磷酸化分析中的FGF受體效力
此實施例之目的係為試管內測試FGF21衍生物之活性（或效力）。試管內效力係在全細胞分析中FGF受體活化之度量。
實施例5之FGF21衍生物之效力係如以下進一步描述地於過度表現人類貝他-klotho（BKL）的HEK（人類胚胎腎臟細胞，Human Embryonic Kidney cells）中測定。
為了測試FGF21衍生物與白蛋白之結合，該分析係在缺乏血清白蛋白下以及在人類血清白蛋白（human serum albumin，HSA）（0.1%最終分析濃度）的存在下進行。對FGF21衍生物而言，在血清白蛋白的存在下EC50值增加（效力減低）會象徵與血清白蛋白結合且表示一種在動物模型中預測測試物質之延長的藥物動力學輪廓的方法。
對FGF21類似物的結果係於表2顯示且對FGF21衍生物的結果係於表3顯示。將MetFGF21（SEQ ID NO: 2）包含在內作為參考。分析原理
HEK293細胞內源性地表現數種FGF受體，包含FGFR1c、FGFR3c與FGFR4。在以共受體貝他-klotho（BKL）轉染前，此等細胞對FGF21係非反應性的。FGF受體/BKL複合物之活化導致MAPK／ERK傳訊途徑之活化與ERK之磷酸化。在給定時間點經磷酸化的ERK（pERK）之水平隨著FGF21之濃度增加而增加。如以下描述的，pERK之水平係於以某範圍的FGF21類似物濃度刺激12分鐘後測量。分析描述
將HEK293/貝他-klotho細胞以30.000個細胞/槽孔接種在96槽孔盤，其係在DMEM（BioWhittaker #BE12-604F/U1）中，而DMEM係以10% FCS（Gibco #16140-071）、1%青黴素／鏈黴素（Gibco #15140）、100 µg/ml濕黴素B（Calbiochem，# 400052）補充。兩天後，且在加入化合物前2個小時前，將細胞培養基換成100 µl基礎培養基（DMEM（BioWhittaker #BE12-604F/U1））。將FGF21類似物以分析培養基（DMEM（BioWhittaker #BE12-604F/U1），以0.02% Tween20補充）稀釋，加熱至37 °C，加至細胞（100 µl）並於37 °C培養12分鐘。亦在0.1% HSA（Sigma – A1887）的存在下測試FGF21衍生物。將所有的培養基快速地移除並對每槽孔加入50 µl溶胞緩衝劑。將盤搖晃5分鐘而溶胞產物就準備好用於測量pERK。pERK係於384槽孔盤中以AlphaScreen SureFire套組（PerkinElmer #TGRES10K）測量。此套組係基於偶合至供體與接受體珠粒的ERK與pERK專一性抗體。pERK之存在會使接受體與供體珠粒彼此靠近且產生被EnVision讀取的訊號。數據係使用GraphPad Prism分析且FGF21蛋白質之效力係以絕對EC50 值的形式描述。 表2A.於HEK293／BKL細胞中FGF21類似物之效力
Figure 108144310-A0304-0003
如可自表2中的結果看到的，相較於MetFGF21，在位置176、177、178或179導入半胱胺酸顯著地使效力減低。然而，令人意外地，相較於MetFGF21，在位置180或在位置181導入半胱胺酸並未導致效力減低（180C）或適度地使效力減低（181C）。化合物7（其在位置180具有半胱胺酸）顯示MetFGF21與化合物2（其除了在位置180的半胱胺酸外與化合物8具有相同的胺基酸改變）兩者皆類似的效力。
相較於MetFGF21以及化合物2（其除了在位置181的半胱胺酸外與化合物9具有相同的胺基酸改變），在位置181具有半胱胺酸的化合物9之效力僅稍微減低。 表2B.於HEK293／BKL細胞中其他FGF21類似物之效力
Figure 108144310-A0304-0004
可以看到具有C168胺基酸取代的化合物#26效力減低，而在位置167、169、170、171、172、173、174與175具有半胱胺酸的類似物令人意外地效力類似於MetFGF21。 表3A.在缺乏0.1 % HSA下或在0.1 % HSA的存在下於HEK293／BKL細胞中FGF21衍生物之效力。
Figure 108144310-A0304-0005
如可自表3A中的結果看到的，令人意外地發現相較於不具側鏈的化合物（參見表2），將本發明之側鏈接附至在位置178-181之任一者的半胱胺酸不會導致效力減低。化合物11、12、15與21皆包含相同的側鏈，其中延伸子元件係C16二酸（Chem. 1a）（連接子元件係一個Chem. 2元件、兩個Chem. 3a元件、與一個Chem. 4a元件）。當與相對應FGF21類似物（化合物5、6、7、與9，參見表2）之效力比較時，可以看到此等FGF21衍生物之效力與相對應FGF類似物（即不具有側鏈）類似。
已探究對具有不同脂肪酸鏈長度的延伸子元件的化合物之效力的功效。在缺乏HSA下，在位置180具有半胱胺酸的FGF衍生物之效力與具有C12二酸、C14二酸、C16二酸或C18二酸作為延伸子元件的FGF21衍生物之效力類似。在缺乏HSA下，在位置181具有半胱胺酸的FGF衍生物之效力與具有C14二酸、C16二酸、C18二酸或C20二酸作為延伸子元件的FGF21衍生物類似。
增加HSA濃度對包含C12、C14或C16側鏈的衍生物之效力無功效或僅有適度的功效，而在0.1% HSA的存在下具有C18或C20側鏈的化合物之效力減低。
如可自表3A看到的，對FGF21衍生物而言，相較於沒有血清白蛋白的EC50值，在0.1%血清白蛋白的存在下EC50值之增加與延伸子之長度之增加一致。此與此等FGF21衍生物之半生期之增加對應良好（參見實施例8）。 表3B.在缺乏0.1 % HSA下或在0.1 % HSA的存在下於HEK293／BKL細胞中其他FGF21衍生物之效力。
Figure 108144310-A0304-0006
具有如以上所描述的不同FGF21骨架的FGF21衍生物之效力被進一步測試，且發現在位置169、170、171、172、173、174與175具有半胱胺酸的衍生物當以脂肪酸延伸子衍生化時皆維持了效力。注意到在Cys 169的衍生化稍微減低效力。 表3C.在缺乏0.1 % HSA下或在0.1 % HSA的存在下於HEK293／BKL細胞中其他FGF21衍生物之效力。
Figure 108144310-A0304-0007
為比較其他保護性元件，測試了不同的延伸子與連接子之組合。所有皆被共軛至Cys 180或Cys 181，且觀察到所獲得的FGF21衍生物之功能性頗類似，證明當共軛至FGF21 Cys（諸如Cys 180或Cys 181）時可使用各種各樣的保護子元件。 實施例7：於3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖吸收
對C端經修改的類似物測試其等於3T3-L1小鼠脂肪細胞中增加葡萄糖吸收的能力。使用以下的分析以測定本發明之FGF21類似物與衍生物之生物活性（或效力）。分析原理
試管內效力亦可藉由對FGF21類似物與衍生物測試其等增加葡萄糖被吸收至脂肪細胞中的量的能力在使用小鼠3T3-L1脂肪細胞的分析中測定。經分化的3T3-L1脂肪細胞內源性地表現FGFR1c與BKL。3T3-L1細胞對FGF21係非反應性的，直到其分化後，而此係因為分化會導致共受體BKL之表現。FGFR1受體／BKL複合物之活化會增加葡萄糖轉運子1（GLUT1）之表現且因此FGF21促效劑會導致葡萄糖被攝入脂肪細胞中的量以劑量反應性的方式增加。分析描述
將小鼠3T3-L1纖維母細胞（例如可自ATCC獲得，目錄編號CL-173）維持在基礎培養基（DMEM（4500 mg/l葡萄糖），具有10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）與1%青黴素／鏈黴素）中。不讓細胞達到匯合且應在細胞達到大約60%的匯合度（藉由目視檢查）之前將細胞繼代（移至新的小瓶）。
對於葡萄糖吸收分析，細胞係以15.000個細胞/槽孔種在96槽孔盤（BIO塗覆）中，且當細胞達到匯合（高密度，看到有經分化的脂肪細胞）時，將培養基自基礎培養基換成含有曲格列酮（Troglitazone）、IBMX、地塞米松（可自（例如）Sigma商業上購得）與人類胰島素（可自（例如）諾和諾德公司（Novo Nordisk A/S）商業上購得）的基礎培養基。細胞係於開始分化後7-9日後使用。將細胞在基礎培養基中以漸增濃度（0-300 nM）的本發明之FGF21類似物或衍生物刺激20個小時。在加入3H-去氧-葡萄糖（以下稱為示跡劑）之前，將細胞在溫暖的（大約37℃）分析緩衝劑（PBS，其具有1 mM MgCl2與2 mM CaCl2）、HEPES與0.1%人類血清白蛋白）中洗滌並將細胞以示跡劑培養1個小時。此培養係藉由在冰冷的分析緩衝劑中洗滌兩次來終止。將細胞以Triton X-100溶胞並將溶胞產物轉移至96槽孔盤，添加microscint-40（可自（例如）珀金埃爾默（Perkin Elmer）商業上購得）且在TOP-計數器（例如來自珀金埃爾默的Packard top-計數器）中計數示跡劑之量。計算所關注的FGF21化合物之EC50與Emax。以下表4-5中顯示的結果分別象徵FGF21類似物與衍生物之EC50（效力）與Emax（效力）。 表4：FGF21類似物之在3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖吸收
Figure 108144310-A0304-0008
 表5.FGF21衍生物之在3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖吸收
Figure 108144310-A0304-0009
由於FGF21衍生物之側鏈結合至白蛋白，且由於在基礎分析培養基中存在血清而因此存在白蛋白，FGF21衍生物（表5）相較於相對應FGF21類似物（表4）具有較低的效力。效力之減低與延伸子元件之長度相互關連。 實施例8：在迷你豬與小鼠中的藥物動力學研究
此研究之目的係去測定FGF21衍生物在i.v.投予至迷你豬與小鼠後的活體內延長，即其等在體內的時間之延長與藉此其等之作用時間之延長。此係在藥物動力學（PK）研究中完成，其中測定了所關注的類似物之最終半生期。最終半生期意指在最終清除相中某個血漿濃度減半所需的時間。在迷你豬中的研究
將年齡大約7-14個月且重量大約16-35 kg的獲自Ellegaard Göttingen Minipigs（Dalmose，丹麥）的雌性哥丁根（Göttingen）迷你豬用於研究。使迷你豬獨居（具有永久性導管的豬）或群居並以SDS迷你豬膳食（Special Diets Services，艾色克斯（Essex），UK）限制性地每日餵食一次或兩次。
在馴化至少2週後，將兩個永久性中樞靜脈導管植入各動物之尾側腔靜脈或頭側腔靜脈中。手術後，給予動物1週以恢復，接著將動物反復地用於藥物動力學研究，在成功地給藥間有適合的洗除期。
透過一個導管或透過插管（venflon）靜脈內注射（體積對應於例如0.050-0.125 mL/kg）化合物，並在預定的時間點採取血液樣本直到給藥後11天（較佳係透過另外的導管或藉由靜脈穿刺）。
以經EDTA（8mM）塗覆的管子收集血液樣本（例如0.8 mL）並接著於4°C與1942G將其離心10分鐘。血液樣本被適當地收集以覆蓋API之整個血漿濃度-時間輪廓。在實施例中，血液樣本係於t= 給藥前、給藥後0.0833、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、30、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264個小時收集。
將血漿以移液管移至在乾冰上的Micronic管，並將其保存於-20°C直到使用ELISA分析個別FGF-1類似物之血漿濃度。個別的血漿濃度-時間輪廓係藉由Phoenix v. 6.3（Pharsight Inc，Mountain View，CA，USA）、或其他用於PK分析的相關軟體中的非腔室（non-compartmental）藥物動力學方法分析，並測定所得的最終的半生期（調和平均）。FGF21衍生物之最終半生期係兩個使用不同劑量的測量之算術平均數，如以上所解釋的。在小鼠中的研究
FGF21類似物之藥物動力學輪廓係於正常的瘦的57bl小鼠，n = 2-3（大約30公克）中測試。FGF21化合物係以20 mg/kg（大約5 mL/kg）的單一靜脈內劑的形式給藥。
FGF21化合物之血漿水平係使用纖維母細胞生長因子-21人類ELISA（可自BioVendor獲得，目錄編號RD191108200R）測定。使用基於PC的軟體（得自Pharsight Corportion，Cary N.C.的WinNonLin第6.3版）以用於藥物動力學計算。結果於表6中提供。 表6：FGF21類似物之藥物動力學特徵。
Figure 108144310-A0304-0010
如可自表6看到的，在迷你豬與小鼠兩者中，血漿半生期皆隨著延伸子元件之脂肪酸鏈之長度增加。 實施例9：瘦的小鼠中的體重減少
為了測定FGF21衍生物之活體內效力，對體重的功效係在瘦的C57BL小鼠中於皮下（s.c.）投予後研究。先前已有人顯示由FGF21誘發的在瘦的小鼠中的重量喪失對在肥胖小鼠中的功效有預測性且因此瘦的小鼠被認為是良好的篩選模型。
將化合物以1 mg/kg每日s.c.投予一次（QD）或兩次（BID）共7天（n=7-8），其係在10mM磷酸鹽、2%（w/vol）甘油、500ppm（=0.05%）聚山梨醇酯80，pH=8.15，（2 mL/kg）。各自的媒劑處理組（對照組）係以10mM磷酸鹽、2%（w/vol）甘油、500ppm（=0.05%）聚山梨醇酯80，pH=8.15，（2 mL/kg）s.c.每天處理兩次共7天（n=6-8）。體重係在給藥前測量並在處理7天後再次測量。結果可於表7中看到。 表7：自第1天至第7天體重自基線的改變（版分比）
Figure 108144310-A0304-0011
 *p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001單因子ANOVA事後Dunnet氏測試（One-way ANOVA post hoc Dunnet´s test），比較化合物對個別的媒劑，n=6-8
以體重之喪失之形式測量的在位置180具有側鏈的FGF21衍生物之活體內效力比在位置181具有相同的側鏈的衍生物之活體內效力高。因此，活體內效力與試管內效力相互有關。對體重減低的功效係取決於血漿半生期。若血漿半生期短則每日給藥兩次會增加效力。
雖然本發明之某些特徵已於本文舉例說明與描述，所屬技術領域中具有通常知識者現可想到許多修飾、取代、改變、與等同物。因此，應瞭解所附申請專利範圍意欲涵蓋所有落入本發明之真正精神的如此修飾與改變。
無
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
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Figure 12_A0101_SEQ_0013
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Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
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Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024

Claims (19)

  1. 一種醫藥組成物，其包含FGF21蛋白質之衍生物或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯，以及醫藥上可接受的賦形劑，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21(SEQ ID NO：1)之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181的位置包含Cys殘基，其中該衍生物包含經由連接子接附至該Cys殘基的延伸子(protractor)；其中該延伸子係選自以下者之群組：Chem. 1A：HOOC-(CH2)x-CO-*、Chem. 1B：HOOC-苯-O-(CH2)x-CO-*與Chem. 1C：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*其中x係範圍在8-18的整數；且其中該連接子對於Chem. 2、Chem. 3與Chem. 4各包含至少一個；其中Chem. 2係選自：*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*、*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*與*-NH-(CH2)m-環已烷-CO-*，其中m係範圍在1-5的整數，其中Chem. 3係*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，其中k係範圍在1-5的整數且n係範圍在1-5的整數，且其中Chem. 4係選自*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*與*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*其中m係範圍在1-5的整數；且其中Chem. 2、Chem. 3、與Chem. 4係經由醯胺鍵且以所指示的順序彼此相連， 係於其*-NH端連接至延伸子之CO-*端，且係於其CH2-*端連接至在對應於成熟的人類FGF21(SEQ ID NO：1)之位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181的位置的Cys殘基之硫原子。
  2. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中在該衍生物中，該延伸子係選自以下者之群組：Chem. 1a：HOOC-(CH2)16-CO-*、Chem. 1b：HOOC-苯-O-(CH2)9-CO-*與Chem. 1c；HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*。
  3. 根據申請專利範圍第1項或第2項的醫藥組成物，其中在該衍生物中，該Chem. 2係選自以下者之群組：Chem. 2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、Chem. 2b：*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*與Chem. 2c：*-NH-CH2-環已烷-CO-*。
  4. 根據申請專利範圍第1項或第2項的醫藥組成物，其中在該衍生物中，Chem. 4係選自：Chem. 4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*與Chem. 4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*。
  5. 根據申請專利範圍第3項的醫藥組成物，其中在該衍生物中，Chem. 4係選自：Chem. 4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*與Chem. 4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*。
  6. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21(SEQ ID NO：1)之位置167、170、171、172、173、174、175、180或181的位置包含Cys殘基。
  7. 根據申請專利範圍第6項的醫藥組成物，其中該蛋白質在對應於成熟的人類FGF21(SEQ ID NO：1)之位置180或181的位置包含Cys殘基。
  8. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中該蛋白質在一或多個對應於成熟的人類FGF21(SEQ ID NO：1)之位置121或168之一或多者的位置包含胺基酸改變。
  9. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中該蛋白質包含在對應於成熟的人類FGF21(SEQ ID NO：1)之N端的位置加入Ala殘基。
  10. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中該蛋白質包含121Q與168L之一或多者。
  11. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中該蛋白質具有SEQ ID NO：8、10、12、15、16、17、18、19或20之胺基酸序列。
  12. 根據申請專利範圍第11項的醫藥組成物，其中該蛋白質包含SEQ ID NO：8或10之胺基酸序列。
  13. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中在該衍生物中，該延伸子包含Chem. 1a：HOOC-(CH2)16-CO-*。
  14. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中在該衍生物中，該連接子包含以下者之一、二或三者：Chem. 2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、Chem. 3a：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*與Chem. 4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*。
  15. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中該連接子係由一個Chem. 2元件、兩個Chem. 3元件與一個Chem. 4元件所組成。
  16. 根據申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中該衍生物係以下者之一： S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物13)
    Figure 108144310-A0305-02-0178-1
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物14)
    Figure 108144310-A0305-02-0178-2
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物15)
    Figure 108144310-A0305-02-0179-3
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物16)
    Figure 108144310-A0305-02-0179-4
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物17)
    Figure 108144310-A0305-02-0180-5
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180,des 181]FGF21(化合物18)
    Figure 108144310-A0305-02-0180-6
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物19)
    Figure 108144310-A0305-02-0181-7
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物20)
    Figure 108144310-A0305-02-0181-8
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物21)
    Figure 108144310-A0305-02-0182-9
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物22)
    Figure 108144310-A0305-02-0182-10
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物23)
    Figure 108144310-A0305-02-0183-12
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Met[Cys 181]FGF21(化合物24)
    Figure 108144310-A0305-02-0183-13
     S{貝他-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 169]FGF21(化合物35)
    Figure 108144310-A0305-02-0184-14
     18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 170]FGF21(化合物36)
    Figure 108144310-A0305-02-0184-15
     S{貝他-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 173]FGF21(化合物37)
    Figure 108144310-A0305-02-0185-16
     S{貝他-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 174]FGF21(化合物38)
    Figure 108144310-A0305-02-0185-17
     18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 174]FGF21(化合物39)
    Figure 108144310-A0305-02-0186-18
     16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-16-側氧基-十六烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 174]FGF21(化合物40)
    Figure 108144310-A0305-02-0186-19
     S{貝他-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 175]FGF21(化合物41)
    Figure 108144310-A0305-02-0187-20
     4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物43)
    Figure 108144310-A0305-02-0187-21
     4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧 基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]磺醯基胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物44)
    Figure 108144310-A0305-02-0188-22
     20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物45)
    Figure 108144310-A0305-02-0189-23
     20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-花生酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物46)
    Figure 108144310-A0305-02-0190-24
     (2S)-6-乙醯胺基-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺酸基十六烷醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]十六烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物47)
    Figure 108144310-A0305-02-0190-25
     12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物48)
    Figure 108144310-A0305-02-0191-26
     12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物49)
    Figure 108144310-A0305-02-0192-28
     20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙醯胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-20-側氧基-花生酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物50)
    Figure 108144310-A0305-02-0193-29
     16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物51)
    Figure 108144310-A0305-02-0193-30
     16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙醯胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧 基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-16-側氧基-十六烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物52)
    Figure 108144310-A0305-02-0194-31
     18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙醯胺基]-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-18-側氧基-十八烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物53)
    Figure 108144310-A0305-02-0195-32
     12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙醯胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺甲醯基]環己基]甲基胺基]-12-側氧基-十二烷酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物54)
    Figure 108144310-A0305-02-0196-33
     4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物55)
    Figure 108144310-A0305-02-0197-34
     4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙醯胺基-1-羧基-戊基]胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基-丁基]磺醯基胺基]-10-側氧基-癸氧基]苯甲酸-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物56)
    Figure 108144310-A0305-02-0197-35
  17. 一種醫藥組成物，其包含FGF21蛋白質之衍生物或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯，以及醫藥上可接受的賦形劑，其中該衍生物係以下者之一：S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物13)
    Figure 108144310-A0305-02-0198-36
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物14)
    Figure 108144310-A0305-02-0198-37
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基) 丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物15)
    Figure 108144310-A0305-02-0199-38
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物16)
    Figure 108144310-A0305-02-0199-39
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180]FGF21(化合物17)
    Figure 108144310-A0305-02-0200-40
     S{貝他-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 180,des 181]FGF21(化合物18)
    Figure 108144310-A0305-02-0200-41
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物19)
    Figure 108144310-A0305-02-0201-42
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物20)
    Figure 108144310-A0305-02-0201-43
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物21)
    Figure 108144310-A0305-02-0202-44
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物22)
    Figure 108144310-A0305-02-0202-45
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Ala[Gln 121,Leu 168,Cys 181]FGF21(化合物23)
    Figure 108144310-A0305-02-0203-46
     S{貝他-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷醯基-胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-乙基胺基]-2-側氧基乙基]-Met[Cys 181]FGF21(化合物24)
    Figure 108144310-A0305-02-0203-47
  18. 一種根據申請專利範圍第1-17項中任一項的醫藥組成物之用途，其係用於製造用於以下者的醫藥品：治療及/或預防所有形式的糖尿病與相關的疾病之任一者；及/或用於改善脂質參數、改善β細胞功能；及/或用於延遲或預防糖尿病疾病進展；及/或用於治療及/或預防肝臟脂肪變性與非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
  19. 根據申請專利範圍第18項的醫藥組成物之用途，其中糖尿病與 相關的疾病包括飲食疾患、心血管疾病、及/或糖尿病併發症。
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Xu J et al., "Polyethylene glycol modified FGF21 engineered to maximize potency and minimize vacuole formation", Bioconjugate Chemistry, vol.24, no.6, p.915-925, 2013/06/19 Hecht R et al., "Rationale-Based Engineering of a Potent Long-Acting FGF21 Analog for the Treatment of Type 2 Diabetes", PLOS ONE, vol.7, issue 7, e49345, p.1-14 *

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