KR20180093059A - 아밀린 및 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법과 용도 - Google Patents

아밀린 및 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법과 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20180093059A
KR20180093059A KR1020187020206A KR20187020206A KR20180093059A KR 20180093059 A KR20180093059 A KR 20180093059A KR 1020187020206 A KR1020187020206 A KR 1020187020206A KR 20187020206 A KR20187020206 A KR 20187020206A KR 20180093059 A KR20180093059 A KR 20180093059A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amylin
insulin
group
seq
disease
Prior art date
Application number
KR1020187020206A
Other languages
English (en)
Inventor
로차 이 리마 루이스 마우리시오 트람바올리 다
루이스 헨리크 게레이로 로사도
마리아나 페르난데스 데 아빌라 네토 구테레스
브루노 멜로 비에라 곤칼베스 페레이라
Original Assignee
유니베르시다데 페데랄 도 리오 데 자네이로
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니베르시다데 페데랄 도 리오 데 자네이로 filed Critical 유니베르시다데 페데랄 도 리오 데 자네이로
Publication of KR20180093059A publication Critical patent/KR20180093059A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

본 발명은 하나 이상의 아실 단위를 포함하는 아밀린, 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이의 제조 방법 및 이용 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 비-응집성 아밀린 바이오접합체는, 췌장 또는 뇌와 같은 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 야기하는, 천연적인 아밀린 생산 결핍 및/또는 세포외 아밀로이드 섬유 침착 또는 축적과 관련된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

아밀린 및 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법과 용도
본 발명은 일반적으로 아밀린 및 아밀린-모방 화합물의 새로운 비-응집성 바이오접합체, 및 이를 포함하는 조합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이의 제조 방법 및 이용 방법을 제공한다.
CAS RN: 106602-62-4로 식별되는 아밀린은, 췌도 아밀로이드 폴리펩타이드 (Islet Amyloid Polypeptide)로도 알려져 있으며, 췌장의 랑게르한스 섬의 베타 세포에 의해 생산되는 37개의 아미노산으로 된 폴리펩타이드 호르몬이다. 생리학적 조건 하에 아밀린 및 인슐린이 생성되고, 상대적으로 낮은 pH 환경에서 동일한 분비 과립내에 저장된다. 이들 호르몬은 음식물 섭취에 반응하여 인슐린:아밀린 15:1의 비율로 함께 분비되며, 아밀린은 인슐린 경로와 독립적인 포도당 항상성 유지에 중요한 생리학적 역할을 담당한다.
당뇨병 및 비만에서 아밀린의 유익한 활성들은 알려져 있다: 포만감 증가로 인한 식품 섭취 감소 및 그에 따른 체중 감소; 느린 위 배출, 식후 피크들을 보이는 개선된 포도당 대사 프로파일, 및 당뇨병 환자에서 글루카곤 수준 저하 (Hay et al. Pharmacological reviews, v. 67, n. 3, p. 564-600, 2015).
1형 당뇨병 환자는 실질적으로 아밀린을 정상적으로 생산하지 못하지만, 장기간 지속적인 2형 당뇨병을 앓고 있는 환자는 건강한 개체 보다는 낮은 수준으로 아밀린을 생산한다. 당뇨병 환자에서는 음식물 섭취에 대한 아밀린 반응이 없거나 또는 심각하게 손상되어 있기 때문에, 아밀린모방체 및 인슐린 또는 기타 항-당뇨병 약물의 몇 가지 조합은, 당뇨병 치료의 주 목적인, 환자의 생리현상을 회복시키기 위한 후보 약물이다. 또한, 현재 인슐린에 기초한 약물 치료를 받고 있는 당뇨병 환자에서 포도당 조절은 일반적으로 차선책이며, 항상 중대한 부작용 (예, 체중 증가 및 고 위험성의 저혈당증)을 유발한다.
현 상황에서 아밀린 대체 치료는 포만감 유도, 느린 위 배출 또는 식후 혈당증 피크 수 저하를 가능하게 하여, 장기적으로는 체중 감소 및 개선된 포도당 농도 조절로 이어질 수 있다. 그러나, 약제 성분으로서 구조적으로 비-변형된 아밀린의 사용은 이러한 아밀린의 고유한 물리화학적 특성 (즉, 난용성, 아밀로이드 섬유를 형성하는 경향 및 낮은 혈장 안정성)으로 인해 불가능하다. 이러한 제한된 수 용해성으로 인해, 용해성이 높은 아밀린-모방 화합물, 즉, 아미노산 25, 27 및 28번이 프롤린으로 치환된 프람린타이드 (pramlintide) (Symlin®)가 개발되게 되었다.
프람린타이드는 용해성이 인간 아밀린 보다 높기는 하지만, 중성 pH에서 안정성이 양호하지 않아 그 제품 Symlin®은 산성 용액으로 제공된다. 그리고, 이 제품은 아밀린의 식후 수준을 높이기 위해, 식사 직전에 피하 주사제로서 투여하여야 한다. 프람린타이드 주사제는, 혈장 반감기가 10-15분으로 짧아, 혈류 아밀린 농도를 연속 피크로서 증가시키고, 따라서 환자의 생리학적 상태를 회복시키지 못한다. 과학 문헌에 따르면, 프람린타이드는 중증 인슐린-유발성 저혈당증의 위험성 증가 및 구역질, 구토, 식욕부진 및 피로 등의 기타 부작용과 관련되어 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 하나 이상의 아실 단위를 포함하는 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체의 비-응집성 바이오접합체를 제공한다. 일 구현예에서, 하나의 아실 단위는 서열번호 1의 1번 라이신 잔기에 공유 결합된다.
다른 구현예에서, 인간 아밀린의 비-응집성 바이오접합체는 식 I로 표시된다:
식 I: (R1-X)m-R2
상기 식에서, R1은 아세틸, 바이오틴, 유비퀴틴, 글리칸, 지방산 쇄 및 천연 또는 합성 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아실 모이어티 및 다양한 평균 몰 질량의 기능성 스페이서 (functional spacer)이고,
R2는 서열번호 1이고
X는 NH, CO 또는 O이고,
m은, 3, 4, 5 또는 6번 위치들 중 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 가진 인간 아밀린 유사체 (서열번호 2) 등의, 서열번호 1의 아실화로부터 수득되는 서열번호 1(R2)에 접합된 아실 기 (R1) 단위의 개수이다.
다른 구현예에서, 아실 기는 PEG, 아세틸 기, 팔미토일 및 미리스토일로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아실화제를 이용해 형성된다. 또 다른 구현예에서, PEG는 1 kDa 내지 40 kDa이다.
다른 측면에서, 본원은 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체의 비-응집성 아실화된 바이오접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 조성물은 인슐린, 인슐린 유사체 및/또는 GLP-1 수용체 작용제 유사체; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 NPH, 속효성 인슐린 (regular insulin), Glargine, Detemir, Degludec, Aspart, Lispro 및 Glulisine으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, GLP-1 수용체 작용제 유사체는 세마글루타이드 (semaglutide), 엑세나타이드 (exenatide), 릭시세나타이드 (lixisenatide), 리라글루타이드 (liraglutide), 알비글루타이드 (albiglutide) 및 둘라글루타이드 (dulaglutide)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 조성물은 항-염증제를 더 포함한다.
일 구현예에서, 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체의 비-응집성 아실화된 바이오접합체를 포함하는 조성물은 췌장염, 고칼슘혈증, 통증, 골다공증, 만성 염증성 질환, 만성 소화 장애, 건선, 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 유발하는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 유도되는 질환 또는 병태, 및 혈압 증가로 인한 장애 및 혈관 질환의 치료에 사용된다.
다른 구현예에서, 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 유발하는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 유도되는 질환 또는 문제는 고혈당증, 당뇨병, 낮은 내당성 또는 포도당 대사 결함, 비만, 대사 증후군, 중추 신경계-관련 또는 말초-관련 식이 장애 및 알츠하이머 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 혈압 증가로 인한 문제 및 혈관 질환은 죽상동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 관상동맥 심장 질환, 고혈압 및 심장병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 아밀린의 비-응집성 바이오접합체, 인슐린 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체의 비-응집성 아실화된 바이오접합체를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 하나의 아실 단위가 서열번호 1의 1번 라이신 잔기에 공유 결합된, 인간 아밀린의 비-응집성 바이오접합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 의약제를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 치료가 필요한 환자에게 인슐린, 인슐린 유사체 및/또는 GLP-1 수용체 작용제 유사체; 및 약제학적으로 허용가능한 담체의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 아밀린의 결핍 또는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되는 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 질환은 당뇨병 및/또는 비만이다.
다른 측면에서, 본 발명은 아밀린 폴리펩타이드 쇄의 1번 라이신 잔기의 α 및/또는 ε-아민 모이어티에 아실화제를 결합시키는 단계를 포함하는 아밀린-모방 화합물을 안정화하는 방법을 제공한다.
도 1은 인간 아밀린과 mPEG 5000 Da (hAmyPEG5k)의 반응에 의해 수득된 모노페길화된 아밀린의 크로마토그램이다.
도 2는 hAmyPEG5k의 특징을 보여주는 질량 분광분석이다.
도 3은 인간 아밀린과 mPEG 20000 Da (hAmyPEG20k)의 반응에 의해 수득된 모노페길화된 아밀린의 크로마토그램이다.
도 4는 hAmyPEG20k의 특징을 보여주는 질량 분광분석이다.
도 5 및 도 6은 유리형 (free) 및 정제된 모노페길화된 인간 아밀린의, 공동-수용체 결합 상호작용에 대한 각각의 RAMP2 및 RAMP3 분석 결과를 도시한 것이다.
도 7 A -C는 hAmyPEG5k 및 hAmyPEG20k의 시험관내 생물학적 활성을 도시한 것이다.
도 8은 아밀로이드 응집 분석 결과를 도시한 것이다.
도 9A-C는 유리형 아밀린 (9A - hAmy) 및 모노페길화된 인간 아밀린 (9B - hAmyPEG5k; 9C - hAmyPEG20k)의 생체내 혈장 안정성을 비교 도시한 것이다.
도 10A는 인간 아밀린의 아세틸화 유도체 (AcO-hAmy)의 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 도시한 것이다.
도 10B는 hAmyPEG5k의 등전점 전기영동을 도시한 것이다.
도 11은 인간 아밀린 (A) 또는 hAmy-PEG5k (B)의 응집율에 대한 산성 pH 또는 염기성 pH의 단기 효과를 도시한 것이다.
도 12A는 인간 아밀린의 응집율에 대한 pH의 단기 효과를 도시한 것이다.
도 12B는 AcO-hAmy의 응집율에 대한 pH의 단기 효과를 도시한 것이다.
도 13은 hAmyPEG5k의 응집율에 대한 pH의 장기 효과를 도시한 것이다.
도 14A-D는 재조합 인슐린과의 인간 아밀린 또는 이의 모노페길화된 유도체의 단기 안정성을 도시한 것이다: 인간 아밀린 및 hAmyPEG5k의 응집 카이네틱스 (A), 선택 인슐린 유사체 (B), 인슐린 유사체와 인간 아밀린의 조합 (C) 및 인슐린 유사체와 hAmyPEG5k의 조합 (D).
도 15는 Tht 및 DLS에 의해 측정된, hAmyPEG5k와 GLP-1 유사체 리라글루타이드의 조합물의 단기 안정성을 도시한 것이다.
도 16은 Tht 및 DLS에 의해 측정된, hAmyPEG20k와 GLP-1 유사체 리라글루타이드의 조합물의 단기 안정성을 도시한 것이다.
도 17A-B는 6개월간 DLS에 의해 측정된 hAmyPEG5k와 인슐린 유사체의 조합물의 장기 안정성을 도시한 것이다.
도 18A-B는 6개월간 Tht에 의해 측정된 hAmyPEG5k와 인슐린 유사체의 조합물의 장기 안정성을 도시한 것이다.
도 19A-C는 6개월간 HPLC에 의해 측정된 hAmyPEG5k와 인슐린 글라진의 조합물의 장기 안정성을 도시한 것이다.
도 20A-C는 6개월간 HPLC에 의해 측정된 hAmyPEG5k와 인슐린 디터머의 조합물의 장기 안정성을 도시한 것이다.
도 21 A -C는 건강한 랫에 피하 투여 후 식품 섭취 및 체중 증가를 감소시키는 hAmyPEG20k의 효과를 도시한 것이다.
도 22 A -B는 건강한 랫에 피하 투여 후 식품 섭취에 대한 hAmyPEG20k 및 리라글루타이드의 상승적인 효과를 도시한 것이다.
도 23 A -B는 건강한 랫에 피하 투여 후 hAmyPEG20k의 위 배출율을 감소 효과를 도시한 것이다.
도 24 A -B는 건강한 랫에 피하 투여 후 hAmyPEG20k의 식후 포도당 감소 효과를 도시한 것이다.
약제 성분으로서 구조적으로 비-변형된 아밀린의 사용은, 난용성, 낮은 혈장 안정성 및 아밀로이드 섬유화 경향과 같은 고유한 생리화학적 특성으로 인해, 불가능하다. 후술한 바와 같이, 본 발명자들은 아밀린이 약제 성분으로서 뿐만 아니라 인슐린과 같은 다른 화합물과 접합체 아밀린으로서 사용할 수 있는 방법, 조성물 등을 개발하였다.
본 발명자들은, 인간 아밀린에 아실화제의 접합이, 아밀린 펩타이드의 중성 pH의 용액에서의 안정성을 개선하여, 따라서 아밀린 바이오접합체를 인슐린 및 GLP-1 유사체와 같은 다른 화합물과 혼합할 수 있다는, 놀라운 사실을 발견하게 되었다. 동시에, 본 발명자들은, 아실화제를 선택함으로써, 아밀린 펩타이드의 약동학적 특징을 조절할 수 있다는 것을 알게 되었다.
후술한 바와 같이, 본 발명자들은, 인간 아밀린의 등전점 (pI) 조절이, 아밀린 펩타이드가 응집하는 pH 존을 변화시켜, 아밀린을 인슐린 및 GLP-1 유사체와 같은 다른 화합물과 조합시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 지금까지, 수용액에서 아밀린 또는 아밀린 유사체와 다른 화합물의 혼합은 pI 비-양립성 (incompatibility)으로 인해 불가능하였다. 예를 들어, 대부분의 인슐린계 제품 및 GLP-1 유사체는 거의 생리학적 pH, 약 pH 7.2에서 제형화되지만, 인간 아밀린 및 이의 유사체들은 이러한 pH 범위에서 완전히 불안정하다. 심지어 pH 4.0인 인슐린 글라진도, 부적절한 분자 상호작용으로 인해 아밀린 유사체 (즉, 프람린타이드)와 성공적으로 혼합할 수 없다. 예를 들어, 미국 특허출원 공개번호 2009-0018053을 참조한다.
이에, 본 발명은, 아밀린 올리고머 및 클러스터의 형성과 관련된 독성을 유발하지 않고, 아밀로이드 응집체의 세포외 형성을 저해하거나 또는 아밀린의 생리학적 수준을 회복시키는 방향으로, 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체를 아실화제와 접합하는, 이의 제조 방법과 수득된 바이오접합체의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 아밀린 또는 정해진 범주의 아밀린 유사체 및 아실화제의 접합체를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 아밀린 바이오접합체, 및 인슐린, GLP-1 유사체 또는 다른 화합물로 된 조합물, 이의 제조 방법과 용도를 제공하며, 다른 화합물로는 항-당뇨병성 화합물 및/또는 항-염증성 화합물이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 항-염증성 화합물은 스테로이드계 및 비-스테로이드계 항-염증제 (NSAID)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 스테로이드계 항-염증제는 프레드니손 (prednisone), 덱사메타손 (dexamethasone) 및 하이드로코르티손 (hydrocortisone)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 스테로이드계 항-염증제는, 프레드니솔론 (prednisolone), 프레드니손 (prednisone), 메드롤 (medrol), 베클로메타손 (beclomethsone), 부데소니드 (budesonide), 플루니솔리드 (flunisolide), 플루티카손 (fluticasone) 및 트리암시놀론 (triamcinolone)으로부터 선택되는 코르티코스테로이드이다. 일부 구현예에서, 항-염증성 화합물은 덱사메타손, 모메타손 (mometasone) 및 트리암시놀론으로부터 선택되는 코르티코스테로이드이다. 일부 구현예에서, NSAID는 셀레콕십 (celecoxib), 디클로페낙 (diclofenac), 디플루니살 (diflunisal), 에토돌락 (etodolac), 페노프로펜 (fenoprofen), 플루르비로펜 (flurbirofen), 이부프로펜 (ibuprofen), 인도메타신 (indomethacin), 케트로프로펜 (ketroprofen), 케토롤락 (ketorolac), 메페남산 (mefenamic acid), 멜록시캄 (meloxicam), 나부메톤 (nabumetone), 나프록센 (naproxen), 옥사프로진 (oxaprozin), 피록시캄 (piroxicam), 설린닥 (sulindac) 및 톨메틴 (tolmetin)으로부터 선택된다.
본원에서, 아밀린은 CAS RN: 106602-62-4로 식별되는, 췌도 아밀로이드 폴리펩타이드를 지칭한다. 아밀린은 췌장의 랑게르한스 섬의 베타 세포에 의해 생산되는 37개의 아미노산으로 된 폴리펩타이드 호르몬이다. 달리 언급되지 않은 한, 아밀린은 천연, 합성 또는 바이오-반-합성 수단에 의해 생산된, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 망라한다.
아밀린 -모방 화합물 또는 아밀린모방체는 천연적으로 생성되는 아밀린의 기능을 수행하거나 또는 모방하는 약물을 지칭한다. 아밀린 및 아밀린-모방체는 천연적으로, 합성으로 또는 바이오-반-합성으로 생성되는 인간 아밀린과 상호 호환적으로 사용된다. 아밀린-모방체는 염, 이성질체, 수화물, 용매화물, 프로드럭, 대사산물, 다형체 및 또는 동배체 (isostere)와 같은 아밀린-모방 화합물의 활성 유도체를 포함한다. 아밀린-모방 화합물에 대한 언급은 천연, 합성 또는 바이오-반-합성 수단에 의해 생산된, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포괄한다. 프람린타이드는 서열번호 3에 기재된 서열을 가진 상업적으로 입수가능한 아밀린-모방 화합물이다.
아실화는 임의의 아실 물질의 삽입에 의해 아민 기의 양 전하를 퀀칭하는 과정을 의미한다. 아실화제 또는 아실 물질은 아세틸, 바이오틴, 유비퀴틴, 글리칸, 지방산 쇄 및 천연 또는 합성 폴리머와 같은 비-하전된 유기 라디칼을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 아실 물질의 일예이다.
비-응집성은 본원에서 본 아밀린 및 아밀린-모방 화합물이 응집되지 않거나, 중합되지 않거나 또는 클러스터를 형성하지 않는 것을 의미한다. 비-응집성 아밀린은 공유 결합된 하나 이상의 아실 단위를 가진 아밀린을 지칭한다.
생체접합은 하나 이상이 생체분자인 2개의 분자들 간에 안정적인 공유 결합을 형성하는 화학 전략이다. 바이오접합체는 2개의 분자로부터 형성된 제조 산물이다. 본원 전체에서, 몇몇 용어들은, 혼합, 결합, 조합, 커플링, 연결, 접합 등의, 바이오접합체를 형성하는 것을 의미한다. 이들 용어는 상호 호환적으로 사용되며, 각각 생체접합을 의미한다.
유사체 (Analog 또는 Analogue)는 비슷한 물리적, 화학적, 생화학적 및/또는 약리학적 특성을 가진 화합물을 지칭한다. 유사체는, 다른 원자, 기 또는 하부구조로 치환되어, 하나 이상의 원자, 관능기 또는 하부구조에 차이가 있을 수 있다. 이러한 개념에서, 인슐린은 수종의 유사체가 존재하며, 예를 들어 NPH, Glargine, Detemir, Aspart, Lispro, Glulisine 또는 Degludec가 있다.
인슐린은 천연, 합성, 바이오-반-합성 인슐린 또는 재조합 인슐린 등의 임의 타입의 인슐린을 망라하지만, 이들로 한정되지 않는다. 인슐린에 대한 비-제한적인 예로는 속효성 인슐린 (regular insulin), NPH, Glargine, Detemir, Aspart, Lispro, Glulisine 또는 Degludec 등이 있다.
본원에서, 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 일으키는 아밀린 분비 결핍 또는 파괴 또는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되는 질환 또는 병태로는, 고혈당증, 당뇨병, 낮은 내당성 또는 포도당 대사 결함, 비만, 대사 증후군, 중추 신경계-관련 또는 말초-관련 식이 장애 및 알츠하이머 질환 등이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
과학 용어 및 기술 용어들은 당해 기술 분야에서의 통상적이고 통례적인 의미를 가진다. 약학 제제 등은 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15th Edition, Mack Publishing Co., New Jersey (1991)에서 찾아볼 수 있다. 구체적인 제형, 부형제 등은 약학 분야의 실무에서 원하는 투여 경로에 따라 선택된다.
A. 아밀린의 변형
전술한 바와 같이, 본 발명자들은, 아밀린 또는 아밀린-모방체가 약제 성분으로서 작용할 뿐만 아니라 아밀린을 아실화제 및/또는 인슐린 및/또는 GLP-1 유사체 등의 다른 화합물과 조합 또는 혼합할 수 있는, 방법, 조성물 등을 개발하였다.
본 발명자들은, 인간 아밀린에 아실화제의 접합이 중성 pH 용액에서 아밀린 펩타이드의 안정성을 개선시켜, 아밀린 바이오접합체를 인슐린 및 GLP-1 유사체와 같은 다른 화합물과 혼합할 수 있다는, 놀라운 사실을 발견하게 되었다. 동시에, 본 발명자들은, 아실화제를 선택하여, 아밀린 펩타이드의 약동학적 특성을 조절할 수 있다는 것을, 알게 되었다.
이와 관련하여, 아밀린의 pI 변화는 아밀린 폴리펩타이드 쇄의 1번 라이신 잔기의 α 아민 모이어티에 아실화제를 결합시켰을 때 달성되었다. Bjellqvist (1993)에 따르면, 인간 아밀린의 pI는 이의 1차 서열로부터 쉽게 추정할 수 있으며, 그 결과 pI 8.9이다. Bjellqvist, et al., (1993)을 참조한다. 고정된 pH 농도구배에서 폴리펩타이드의 포커싱 위치는 그 아미노산 서열로부터 예측할 수 있다. Electrophoresis, 14(1), 1023-1031.
본원에서, 본 발명자들은, 아실화제를 인간 아밀린에 lys-1의 α 아민에 커플링하면, pI가 9.2에 가까운 수치로 상향 이동한다는 것을 확인하였다. 아실화 인간 아밀린의 pI는 약 8.9 내지 약 9.2 범위일 수 있으며, 약 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8 및 9.9 값을 가질 수 있다.
이에, 일 구현예에서, 본 발명은 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체와 아실화제의 접합, 이러한 아밀린 바이오접합체의 제조 방법, 및 수득되는 바이오접합체의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 예시적인 아밀린 바이오접합체는 아밀린의 생리학적 수준을 회복시키거나 또는 아밀로이드 응집체의 세포외 형성을 저해하는 용도를 가지며, 아밀린 올리고머 및 클러스터의 형성과 관련된 독성은 유발하지 않는다.
B. 비-응집성 아밀린 : 아밀린에 아실화제 접합
일 구현예에서, 본 발명은 인간 아밀린 또는 정해진 범주의 아밀린 유사체를 아실화제와 접합하여, 비-응집성 아밀린을 제조하는 것에 관한 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은, 서열 KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (서열번호 1)을 가진 인간 아밀린, 또는 서열 KCXAA1XAA2XAA3XAA4CATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (서열번호 2)을 가진 아밀린-모방 화합물과 아실화제로 된 새로운 비-응집성 바이오접합체를 제공한다. 프람린타이드는 서열 KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-(NH2) (서열번호 3)을 가진 상업적으로 입수가능한 또 다른 아밀린-모방 화합물이다.
바이오접합체는, 예를 들어, 아밀린 폴리펩타이드 쇄의 1번 라이신 잔기의 α 또는 ε-아민 모이어티 (측쇄)에 존재하는 질소 원자(들)에 공유 결합된, 하나 이상의 폴리에틸렌글리콜 단위를 포함할 수 있다 (즉, 단일접합 또는 다중접합된 화합물이 수득될 수 있음). 아울러, 당해 기술 분야의 당업자라면, 또한, 아미노산 XAA1, XAA2, XAA3 및/또는 XAA4를 다른 비-하전된 또는 양으로 하전된 아미노산으로 치환하여, Lys1 아실화만 존재하는 화합물에 비해 pI가 더 높은 아실화 아밀린 유사체를 제조할 수 있을 것이다.
C. 아밀린 -모방 화합물의 안정화
본 발명은, 아밀린 폴리펩타이드 쇄의 1번 라이신 잔기의 α 및/또는 ε-아민 모이어티 (측쇄)에 아실화제를 결합시키는 단계를 포함하는 아밀린-모방 화합물의 안정화 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체는 식 I로 표시되며, 식 II의 화합물이다:
식 I: (R1-COX)m-R2
상기 식에서,
R1은 아실화제이고;
R2는 아밀린 (서열번호 1) 또는 아밀린-모방 화합물 (서열번호 2)이고;
X는 NH, CO 또는 O이고;
m은, 1차 아민 또는 하이드록시 관능성 모이어티의 반응에 의한 아미드 또는 에스테르 결합을 통해 아실화제를 아밀린-모방 화합물과 접합시켜 수득되는, 아밀린-모방 화합물 (R2)에 접합된 아실화제 (R1) 단위의 개수이다. 아밀린-모방체는 3, 4, 5 또는 6번 위치의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산 또는 비-하전된 아미노산으로 치환된 유사체를 포함한다.
식 II: (R1-X)m-R2
상기 식에서,
R1은 아실화제 모이어티 및 다양한 평균 몰 질량의 기능성 스페이서이고;
R2는 아밀린 (서열번호 1) 또는 아밀린-모방체 (서열번호 2) 화합물이고;
X는 NH, CO 또는 O이고;
m은 아밀린-모방 화합물에 아실화제의 접합으로 수득되는, 아밀린-모방 화합물 (R2)에 접합된 아실화제 (R1) 단위의 개수이다.
물론, 바이오접합체 아밀린-모방 화합물은 염, 이성질체, 수화물, 용매화물, 프로드럭, 대사산물, 다형체 및 동배체 등의 아밀린-모방 화합물의 활성 유도체를 모두 포괄하는 것으로 이해된다.
아밀린-모방 화합물에 대한 언급이, 천연, 합성 또는 바이오-반-합성의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 모두 포괄한다는 점에 유념하여야 한다.
본원에서, 용어 "알킬"은 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 1-35개의 탄소 원자를 가진 직쇄 또는 분지쇄의 지방족 탄화수소를 지칭한다. 알킬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, n-펜틸, t-부틸 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 알킬 기는 하나 이상의 적절한 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
본원에서, 용어 "알케닐"은 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 2-35개의 탄소 원자를 가진 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄의 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 알케닐의 예로는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 이소-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 알케닐 기는 하나 이상의 적절한 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
본원에서, 용어 "알키닐"은 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 2-35개의 탄소 원자를 가진 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄의 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 알키닐의 예로는 에티닐, 프로피닐 및 부티닐 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 알키닐 기는 하나 이상의 적절한 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "사이클로알킬"은, 정의에 의해 제한되지 않은 한, 하나의 사이클릭 고리 또는 복수의 축합된 고리, 예를 들어 융합된 또는 스피로 시스템을 가진 탄소 원자 3-20개로 구성된 사이클릭 알킬 기를 지칭한다. 이러한 사이클로알킬 기로는, 예를 들어, 단환식 구조, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로옥틸 등 또는 다환식 구조, 예를 들어, 아다만틸 및 바이사이클로[2.2.1]헵탄, 또는 아릴 기, 헤테로아릴 기, 헤테로사이클릴 기 또는 다른 사이클로알킬 기와 융합된 사이클릭 알킬, 예를 들어, 인단 등이 있다. 사이클로알킬 기는 하나 이상의 적절한 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "사이클로알케닐"은 선택적으로 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있는 전술한 바와 같이 정의되는 사이클로알킬 기를 지칭한다.
용어 "사이클로알키닐"은 선택적으로 하나 이상의 삼중 결합을 가질 수 있는 전술한 바와 같이 정의되는 사이클로알킬 기를 지칭한다.
용어 "헤테로사이클릴"은, 달리 언급되지 않은 한, 5-15개의 탄소 원자로 구성되며, N, O, S 또는 P로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 이종원자(들)를 가진, 완전 또는 부분 불포화된, 비-방향족 단환식 또는 다환식 사이클로알킬 기를 지칭한다. 질소, S 및 P 이종원자는 선택적으로 산화될 수 있다. 질소 원자는 선택적으로 4급화될 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 임의의 이용가능한 위치에서 하나 이상의 적절한 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 헤테로사이클릴 기의 예로는 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 다이하이드로푸라닐, 다이하이드로피리디닐, 다이하이드로이소옥사졸릴, 다이하이드로벤조푸릴, 아자바이사이클로헥실, 다이하이드로인도닐, 피페리디닐 또는 피페라지닐 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "아릴"은 5-15개의 탄소 원자로 구성되며, 선택적으로 하나 이상의 적절한 치환기로 치환된, 모노- 또는 폴리-카보사이클릭 방향족 기, 예를 들어, 페닐 또는 나프틸 고리를 지칭한다. 아릴 기는 선택적으로 사이클로알킬 기, 헤테로아릴 기, 헤테로사이클릴 기 또는 다른 아릴 기와 융합될 수 있다. 융합된 기는 하나 이상의 적절한 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은, 달리 명시되지 않은 한, 5-15개의 탄소 원자로 구성되며, N, O, S 또는 P로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 이종원자를 가진, 방향족 단환식 또는 다환식 고리 구조를 지칭한다. 질소, S 및 P 이종원자는 선택적으로 산화될 수 있다. 질소 원자는 선택적으로 4급화될 수 있다. 또한, "헤테로아릴"은, 헤테로아릴 고리가 아릴 고리, 사이클로알킬 고리, 사이클로알케닐 고리, 헤테로사이클릴 고리 및 또 다른 단환식 헤테로아릴 고리로부터 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 고리와 융합된, 이환식 또는 삼환식 고리를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 헤테로아릴 기의 예로는 옥사졸릴, 이미다졸릴, 피롤릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 옥사다이아졸릴, 벤조이미다졸릴, 티아다이아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 티에닐, 이속사졸릴, 트리아지닐, 푸라닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 이미다조[1,2-a]피리미딘, 이미다조[1,2-a]피라진, 테트라하이드로퀴놀린 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 헤테로아릴 기는 임의의 이용가능한 위치에서 하나 이상의 적절한 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "PEG"는, 달리 언급되지 않은 한, 폴리에틸렌 글리콜을 지칭하며, 본원에서 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 의미한다. 용어 PEG는 n이 2-1000 또는 2-500 또는 2-250 또는 2-125 또는 2-50 또는 2-25 또는 2-12 범위의 정수인, 구조 -(CH2CH2O)n-를 포함한다. 일반적으로 사용되는 PEG는 말단-캡핑된 PEG (end-capped PEG)이며, 여기서 PEG 말단 중 하나는 알콕시와 같이 상대적으로 비활성 기로 말단-캡핑되고, 다른 말단은 링커 모이어티에 의해 추가로 변형될 수 있는 하이드록시 기이다. 자주 사용되는 캡핑 기는 메톡시이고, 대응되는 말단-캡핑된 PEG는 종종 mPEG로 지칭된다. 그래서, mPEG는 CH3O(CH2CH2O)n-이며, 여기서 n은 전체 PEG 모이어티에 대해 표시된 평균 분자량가 되는데 충분한 2-1000의 정수이며, 예를 들어 mPEG Mw 2,000의 경우 n은 약 44±10이다.
구체적인 PEG 형태는 분지형, 선형, 포크형 (forked), 덤벨형 (dumbbell) PEG 등이며, PEG 기는 일부 구현예에서 약 1.05 미만의 낮은 다분산 지수 (polydispersity index)를 가진 다분산성 (polydisperse)을 나타낸다. 소정의 분자량에 있어 PEG 모이어티는 전형적으로 다양한 범위의 에틸렌글리콜 (또는 에틸렌옥사이드) 모노머로 구성된다. 예를 들어, 분자량 2000의 PEG 모이어티는 전형적으로 44±10개의 모노머로 구성될 것이며, 평균적으로 약 모노머 44개일 것이다. 평균 분자량 (및 모노머 개수)은 전형적으로 일부 배치-배치 간 편차가 존재할 것이다.
다른 구체적인 PEG 형태는 물론 분지형, 선형, 포크형 또는 덤벨 형상일 수 있는 단분산성을 나타낸다. 단분산성은 PEG 폴리머의 길이 (또는 분자량)가 구체적으로 한정되며, 다양한 길이 (또는 분자량)를 가진 혼합물이 아니라는 것을 의미한다.
용어 알콕시는, 알킬이 전술한 바와 같이 정의되는, "알킬-O-"을 포함한다. 대표적인 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 (예, 1-프로폭시 및 2-프로폭시), 부톡시 (예, 1-부톡시, 2-부톡시 및 2-메틸-2-프로폭시), 펜톡시 (1-펜톡시 및 2-펜톡시), 헥속시 (1-헥속시 및 3-헥속시) 등이 있다.
D. 예시적인 아밀린 -모방 화합물
예시적인 아밀린-모방 화합물은, 라이신-1의 α 및/또는 ε-아미노산이 하기로부터 선택되는 아실 모이어티 Q로 치환되는 수소 원자를 가진, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 가진 화합물로부터 선택된다:
-C(=Y)-R1; 및
-C(=Y)-R2-PEG,
상기에서,
Y은 O 또는 S이고;
R1, R2 및 PEG는 본원에 정의된 바와 같이 정의된다.
일부 구현예에서, Y는 0이다. 일부 구현예에서, Y는 S이다.
일부 구현예에서, 아밀린-모방 화합물은, 라이신-1의 α 또는 ε-아미노산은 아실 모이어티 Q로 치환되는 수소를 가진, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 가진 화합물로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아밀린-모방 화합물은, 라이신-1의 α 및 ε-아미노산 둘다 아실 모이어티 Q로 치환되는 수소 원자를 가진, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 가진 화합물로부터 선택된다.
타입 -C(=Y)-R 1
일부 구현예에서, Q는 아실 모이어티 -C(=Y)-R1이고;
여기서,
R1은 C1-35 알킬, C2-35 알케닐, C2-35 알키닐, C3-20 사이클로알킬, C3-20 사이클로알케닐, C6-20 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴이고; 이들 각각은 선택적으로 임의의 이용가능한 위치에서 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알케닐, C6-8 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, =O, -CN, -COCN, -N3, -NO2, -OCN, -NCO, -SCN, -NCS, -OCONH2, -ONO2, -F, -Cl, -Br, -I, -CHO, -CHS, -COOH, -COSH, -CONH2, -CONHNH2, -CSNHNH2, -CSNH2, -NH2, -NHCONH2, -NHCSNH2, -N(C=NH)NH2, -NHNH2, -NHCHO, -NHCHS, -NHCOOH, -NHCSOH, -OH, -SH, -SO3H, -CH(=NOH), -CH(=NCN), -CORa, -CSRa, -COORa, -CSORa, -COSRa, -CONRaRb, -CSNRaRb, -COCORa, -CONRaNRbRc, -CSNRaNRbRc, -CSNRaRb, -NRaRb, -NRaSO2Rb, -NRaCONRbRc, -NRaCSNRbRc, -NRa (C=NRb)NRcRd, -NRaNRbRc, -NRaCORb, -NRaCSRb, -NRaCOORb, -NRaCSORb, =NORa, -ORa, -OCORa, -OCOORa, -OCONRaRb, -OCSRa, -OCSORa, -ONO2, -OCSNRaRb, -SRa, -S(O)Ra, -S(O)2Ra, -SO2NRaRb, -CRa (=NORb), -CRa (=NCOORb), -CRa (=NSORb), -CRa (=NSO2Rb), -C(=NRa)-NRbRc, -C(=NORa)-NRbRc, -CRa (=NCN), -NCRa, -P(O)RaRb, -P(O)ORaORb, -P(O)RaORb, -P(O)NRaORb, -P(O)NRaRb, -OP(O) RaRb, -NHP(O) RaRb로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있으며;
Ra, Rb, Rc 및 Rd는 독립적으로 -H, C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알케닐, C6-8 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, =O, -CN, -COCN, -N3, -NO2, -OCN, -NCO, -SCN, -NCS, -OCONH2, -ONO2, -F, -Cl, -Br, -I, -CHO, -CHS, -COOH, -COSH, -CONH2, -CONHNH2, -CSNHNH2, -CSNH2, -NH2, -NHCONH2, -NHCSNH2, -N(C=NH)NH2, -NHNH2, -NHCHO, -NHCHS, -NHCOOH, -NHCSOH, -OH, -SH, -SO3H, -CH(=NOH), -CH(=NCN)으로부터 선택되거나; 또는
Ra 및 Rb는 함께 연결되어 C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알케닐, C6-8 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴을 형성하거나; 또는
Rb 및 Rc는 함께 연결되어 C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알케닐, C6-8 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴을 형성하거나; 또는
Rc 및 Rd는 함께 연결되어 C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알케닐, C6-8 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴을 형성한다.
일부 구현예에서, R1은 C10-30 알킬, C10-30 알케닐, C10-30 알키닐, C5-12 사이클로알킬, C5-12 사이클로알케닐, C8-16 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴이며; 이들 각각은 전술한 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, R1은 C12-18 알킬, C12-18 알케닐, C12-18 알키닐, C6-10 사이클로알킬, C6-10 사이클로알케닐, C10-14 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴이며; 이들 각각은 전술한 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, R1은 임의의 이용가능한 위치에서 전술한 치환기로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 C1-6 알킬이고 선택적으로 상기한 바와 같이 선택적으로 치환된, 아실 모이어티로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는 아세틸이고, 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 C1-35 알킬, C10-30 알킬 및 C12-18 알킬이고 선택적으로 상기와 같이 치환된, 아실 모이어티로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는 라우르산 (CH3(CH2)10CO-), 미리스트산 (CH3(CH2)12CO-), 팔미트산 (CH3(CH2)14CO-), 스테아르산 (CH3(CH2)16CO-) 및 아라키드산 (CH3(CH2)18CO-)의 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 C2-35 알케닐, C10-30 알케닐 및 C12-18 알케닐이고 선택적으로 상기와 같이 치환된, 아실 모이어티로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는 팔미트올레산 (CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7CO-), 올레산 (CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO-), 리놀레산 (CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO-), 리놀렌산 (CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO-) 및 아라키돈산 (CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4(CH2)2CO-)의 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 C2-35 알키닐, C10-30 알키닐 및 C12-18 알키닐이고 선택적으로 상기와 같이 치환된, 아실 모이어티로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는, R1이 에티닐, 프로피닐 및 부티닐인 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 C3-20 사이클로알킬, C5-12 사이클로알킬 및 C6-10 사이클로알킬이고 선택적으로 상기와 같이 치환된, 아실 모이어티로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는, R1이 하나의 고리 구조, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로옥틸; 다중 고리 구조, 예를 들어, 아다만틸 및 바이사이클로[2.2.1]헵탄인, 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 C3-20 사이클로알케닐, C5-12 사이클로알케닐 및 C6-10 사이클로알케닐이고 선택적으로 상기와 같이 치환된, 아실 모이어티로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 사이클로알케닐은 1, 2 또는 3개의 이중 결합을 가지며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 C6-20 사이클로알키닐, C8-16 사이클로알키닐 및 C10-14 사이클로알키닐이고, 선택적으로 상기와 같이 치환된, 아실 모이어티로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 사이클로알키닐은 1, 2 또는 3개의 삼중 결합을 가지며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는 R1이 5-15개 또는 8-12개의 탄소 원자로 구성되며; N, O, S 또는 P로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이종 원자를 가지며; N, P 및 S 이종원자가 선택적으로 산화될 수 있으며, 질소 원자가 선택적으로 4급화될 수 있는, 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는, R1이 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 다이하이드로푸라닐, 다이하이드로피리디닐, 다이하이드로이소옥사졸릴, 다이하이드로벤조푸릴, 아자바이사이클로헥실, 다이하이드로인도닐, 피페리디닐 및 피페라지닐로부터 선택되는 헤테로사이클릴인, 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 5-15개 또는 6-10개의 탄소 원자로 구성된 아릴인 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는, R1이 페닐 및 나프틸로부터 선택된 아릴인, 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, Q는, R1이 5-15개 또는 8-12개의 탄소 원자로 구성되며; N, O, S 또는 P로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이종 원자를 가지며; N, P 및 S 이종원자가 선택적으로 산화될 수 있으며; 질소 원자가 선택적으로 4급화될 수 있는 헤테로아릴인, 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Q는, R1이 옥사졸릴, 이미다졸릴, 피롤릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 옥사다이아졸릴, 벤조이미다졸릴, 티아다이아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 티에닐, 이속사졸릴, 트리아지닐, 푸라닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 이미다조[1,2-a]피리미딘, 이미다조[1,2-a]피라진 및 테트라하이드로퀴놀린으로부터 선택되는 헤테로아릴인, 아실 모이어티로부터 선택되며, 아실 모이어티는 선택적으로 상기와 같이 치환된다.
일부 구현예에서, R1은 임의의 이용가능한 위치에서 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 5-15개 또는 8-12개의 탄소 원자로 구성되며; N, O, S 또는 P로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이종 원자를 가지며; N, P 및 S 이종원자가 선택적으로 산화될 수 있으며; 질소 원자가 선택적으로 4급화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 다이하이드로푸라닐, 다이하이드로피리디닐, 다이하이드로이소옥사졸릴, 다이하이드로벤조푸릴, 아자바이사이클로헥실, 다이하이드로인도닐, 피페리디닐 및 피페라지닐로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R1은 아릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의의 이용가능한 위치에서 선택적으로 치환된다. 일부 구현예에서, 아릴은 5-15개 또는 6-10개의 탄소 원자로 구성된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 아릴은 페닐 및 나프틸로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R1은 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의의 이용가능한 위치에서 선택적으로 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 5-15개의 탄소 원자 또는 8-12개의 탄소 원자로 구성되며, N, O, S 또는 P로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이종 원자를 가지며, N, P 및 S 이종원자는 선택적으로 산화될 수 있으며, 질소 원자는 선택적으로 4급화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 옥사졸릴, 이미다졸릴, 피롤릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 옥사다이아졸릴, 벤조이미다졸릴, 티아다이아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 티에닐, 이속사졸릴, 트리아지닐, 푸라닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 이미다조[1,2-a]피리미딘, 이미다조[1,2-a]피라진 및 테트라하이드로퀴놀린으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 모이어티 Q는, R1이 아세틸인 아실 모이어티, 바이오틴 (5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다조l-4-일]펜탄산)의 아실 모이어티로부터 선택된다.
아밀린-모방 화합물은, 일부 구현예에서, 도터 아밀린 (서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3)으로부터 제조된다. Q 모이어티는, 라이신-1의 α-아미노 기 및/또는 ε-아미노기에서, 예를 들어, Q 모이어티의 OSu-활성화된 에스테르로의 친핵성 치환 (아실화)에 의해 공격받거나, 또는 Q 모이어티는 Q-알데하이드 시약 및 환원제, 예를 들어 소듐 시아노보로하이드라이드를 이용해 라이신-1의 α-아미노기 및/또는 ε-아미노기에서의 환원성 알킬화에 의해 부착될 수 있다.
E. 아밀린에 인슐린 또는 기타 펩타이드의 접합
상업적으로 이용가능한 아밀린-모방 화합물 프람린타이드가 존재하지만, 인슐린과 혼용가능하게 제형화되지 않는다 (Weyer et al., 2005). 예를 들어, 미국 특허 제 6,410,511은 투여 직전에 동일 시린지에서 프람린타이드와 여러가지 인슐린을 혼합하기 위한 시도를 기술하고 있지만, 제형의 단기 안정성에 유념하여야 한다. 미국 특허 공개된 출원번호 2010/0222251은 장기간 작용하는 인슐린 및 아밀린 펩타이드, 특히 프람린타이드를 동일 용액에서 조합하기 위한 전략을 개시하고 있다. 공동-제형은 높은 응집 프로파일을 가지고 있어, 인슐린과 아밀린 유사체를 혼합하는 기술적인 실현불가성을 오히려 부각시킨다.
프람린타이드는, 물리화학적 비-호환성 외에도, 임상 실험에서 함께 투여시 양쪽 화합물의 약동학적 특성에 문제를 일으켜 인슐린과 조합할 수 없는 것으로 확인되었다. Symlin (Pramlintide acetate) New Drug Application. Division of Pharmaceutical Evaluation-II Office of Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics. Available in: http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/01/briefing/3761b1_05_Pharmacology.pdf를 참조한다.
즉, 아밀린 바이오접합체와 인슐린 또는 기타 항-당뇨병성 (GLP-1 유사체) 및/또는 항-염증성 화합물의 조합물, 이의 제조 방법 및 용도를 성공적으로 개발한 사람이 본 발명자들이다.
이에, 본 발명은, 바이오접합체가 아밀린 폴리펩타이드 쇄의 1번 라이신 잔기에 공유 결합된 (임의의 다른) 폴리에틸렌 글리콜, 아세틸, 팔미토일, 미리스토일 또는 기타 합성 폴리머 (이로 제한되지 않음)와 같은 하나 이상의 아실화제 분자를 포함하며 (즉, 단일접합체 또는 다중접합체 화합물이 수득될 수 있음), 인슐린 유사체가 예를 들어 속효성 인슐린 (regular insulin), NPH, 글라진 (Glargine), 디터머 (Detemir), 아스파르트 (Aspart), 리스프로 (Lispro), 글루리신 (Glulisine) 또는 디글루덱 (Degludec)인, 아밀린 또는 아밀린-모방 화합물의 바이오접합체와 인간 인슐린 유사체의 새로운 비-응집성 조합물에 관한 것이다. 물론, 다른 인슐린 유사체도 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 아밀린 또는 아밀린-모방 화합물의 새로운 비-응집성 바이오접합체는 세마글루타이드 (semaglutide), 엑세나타이드 (exenatide), 리라글루타이드 (liraglutide), 릭시세나타이드 (lixisenatide), 알비글루타이드 (albiglutide) 및 둘라글루타이드 (dulaglutide) 등의 하나 이상의 글루카곤-유사 펩타이드-1 (GLP-1) 수용체 작용제와 조합된다. 물론, 다른 GLP-1 수용체 작용제도 사용될 수 있다.
후술한 바와 같이, 본 발명은, 1형 및 2형 진성 당뇨병을 치료하기 위한, 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 및 상기한 바이오접합체와 인슐린 유사체를 포함하는 조합물의 용도에 관한 것이다.
아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 및 이러한 바이오접합체와 GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 조성물은, 비만과 1형 및 2형 진성 당뇨병의 임상 치료에 사용될 수 있다.
F. 조성물, 약제 및 이용 방법
본 발명의 아밀린 및/또는 아밀린-모방 화합물의 바이오접합체는, 아밀로이드 섬유의 응집/침착과 직접 또는 간접적으로 관련된 다양한 병태들을 관리하는 치료학적 또는 예방학적 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-배타적인 예로, 일반적으로, 췌장염, 고칼슘혈증, 통증, 골관절염, 골다공증, 염증, 만성 소화 장애, 건선, 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 일으키는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 유도되는 질환 또는 문제, 예를 들어, 고혈당증, 당뇨병, 낮은 내당성 또는 포도당 대사 결함, 비만, 대사 증후군, 중추 신경계-관련 또는 말초-관련 식이 장애 및 알츠하이머 질환, 그리고 간접적으로, 혈압 증가로 인한 문제 및 혈관 질환, 예를 들어 죽상동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 관상동맥 심장 질환, 고혈압, 심장병 등이 있다 (예, Young. Amylin: physiology and pharmacology. Gulf Professional Publishing, 2005; Zhu et al. Molecular psychiatry, v. 20, n. 2, p. 252-262, 2015).
이런 방식으로, 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 및 이를 포함하는 조합물은, 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 일으키는, 아밀린 분비 결핍 또는 파괴, 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 이에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료에 사용가능한, 제품, 의약제, 조성물 및 연합체 (association)를 제조하는데 이용할 수 있다.
예를 들어, 비-배타적으로, 본원의 바이오접합체, 특히 인간 아밀린의 바이오접합체는 하기와 같은 다양한 이점을 제공할 수 있다:
(1) 프람린타이드와 같은 아밀린 및 아밀린모방체 물질과 비교해 혈장 반감기 증가, 따라서 혈류에서 긴 지속성 제공;
(2) 천연 아밀린의 작용을 모방하기 위한 저용량 또는 적은 횟수의 주사;
(3) 기저 및 식후 혈당, 음식물 섭취, 위 배출 및 체중 증가에 대한 양호한 조절;
(4) 인간 아밀린에 비해 높은 용해성;
(5) 증가된 안정성.
이런 방식으로, 인간 아밀린의 바이오접합체는, 췌장 베타-세포에서 응집 (문헌에서는 중합으로 언급됨), 침착 및 소섬유 형성 (fibrillation)을 감소 또는 방지하여, 결과적으로 인간 유기체에 대한 췌장 베타-세포 요인의 세포자살 또는 파괴와 같은 해로운 작용은 방지함으로써, 인간 아밀린 및 아밀린-모방 화합물에 의해 유발되는 전형적인 독성을 회피하는 것을 목표로 한다.
본 발명은 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 하나 이상을 치료학적 유효량으로 그리고 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은, 경구, 장, 비경구, 혀, 설하, 코, 진피, 표피, 경피, 점막, 질, 직장, 눈 등과 같은 모든 다양한 투여 형태로 적합하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 하나 이상을 치료학적 유효량으로; 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제; 및 치료학적 유효량의 하나 이상의 인슐린으로 구성된 조합물을 포함하는 저 독성의 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 경구, 장, 비경구, 혀, 설하, 코, 진피, 표피, 경피, 점막, 질, 직장, 눈 등과 같은 모든 다양한 투여 형태로 적합하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기한 조성물의 제조 방법도 고려된다. 구체적으로, 본 조성물은 그자체적으로 용액제, 현탁제, 유제, 마이크로유제, 폼 (foam), 페이스트제, 크림제, 정제, 캡슐제 (경질 또는 연질, 좌제), 볼루스, 겔, 산제, 에어로졸, 스프레이제 등과 같은 임의의 필요한 또는 적절한 투약 형태로 제공된다.
본 조성물에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 부형제는, 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15th edition, Mack Publishing Co., New Jersey (1991)에 기술된 등의, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 알려진 바와 같이, 구체적인 부형제는 약학 분야의 실무에서 바람직한 투여 경로에 따라 선택된다.
약학적 조성물은 부가적으로 인간 아밀린과 구별되는, 하나 이상의 활성 성분, 예를 들어, 인슐린 유사체, 이온 (예, 아연 및 소듐), GLP-1 수용체 작용제, 항-당뇨병제, 항생제, 항-염증제, 항-고혈압제, 항-레트로바이러스제 등을 포함할 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 조성물은 즉시 방출, 지연성 방출 또는 느린 방출성 조성물일 수 있으며, 또한 인간 아밀린의 새로운 바이오접합체의 투여가 다른 활성 성분과 동시에 또는 순차적으로 이루어질 가능성도 포함한다.
또 다른 측면은, 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 일으키는 아밀린 분비 결핍 또는 파괴, 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 이로 인해 유도되는 질환을 예방 또는 치료하는데 보강제로서 인간 아밀린의 비-응집성 바이오접합체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면은 하나 이상의 인간 아밀린의 바이오접합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제에 관한 것이다.
또 다른 측면은 인간 아밀린의 바이오접합체 뿐만 아니라 의학 요법에서의 용도를 특징으로 하는, 이를 포함하는 제품, 의약제, 조성물 및 조합물에 관한 것이다.
또 다른 측면은 환자에게 아밀린-모방 화합물, 특히 인간 아밀린의 하나 이상의 바이오접합체를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 유도되는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 1형 및 2형 진성 당뇨병을 치료하기 위한, 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 및 이러한 바이오접합체와 인슐린 유사체를 포함하는 조합물의 용도에 관한 것이다. 또한, 당뇨병은 아밀로이드 섬유의 응집/침착과 직접 또는 간접적으로 관련된 기타 질환 및 기능 장애를 포괄한다.
다른 측면에서, 본 발명은 비만의 임상 요법에 있어 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체 및 상기한 바이오접합체와 GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 조합물의 용도에 관한 것이다.
실시예
하기 실시예들은 구체적인 구현예들에 관한 것으로, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위 또는 사상을 제한하는 것은 아니다. 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명 및 실시예를 이용해, 동일한 또는 유사한 결과를 획득하기 위한 명확하게 언급되지 않더라도 동일한 또는 유사한 기능을 수행하는 등가의 구현예들을 구현할 수 있으며, 따라서 이 역시 본 발명의 범위 및 사상에 포함된다.
실시예 1: 여러가지 아실화된 접합체의 제조
10 mM PBS (포스페이트 완충제 용액) pH 7.4 존재 하, 1:5 비율의, 5 mg/mL 인간 아밀린 용액 및 몰 과량의 mPEG 5000 Da 또는 20000 Da의 25℃에서 2시간 반응.
반응은 30% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산 (수중)을 동량으로 첨가하여 퀀칭시킨 다음 C18 Kromasil 역상 컬럼에서 4 mL/min 속도로 220 nm로 설정된 검출기를 사용해 크로마토그래피를 수행하였다 (Kromasil은 스웨덴 아크조노벨 지사인 Separation Products 그룹에서 시판한 제품 라인임). hAmy-PEG5k 및 hAmy-PEG20k의 크로마토그램은 각각 도 1 및 도 3에 도시된다. hAmy-PEG5k 크로마토그램에서 12분에 모노페길화된 아밀린 피크가 관찰된다. hAmy-PEG20k의 피크는 약 13분에 관찰된다.
매트릭스에 의한 레이저 탈착 및 이온화-비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS)을 수행하여 모노페길화된 인간 아밀린의 특징을 규명하였다. 도 2는 9 KDa 위치에서의 hAmy-PEG5k 피크를 도시한 것이고, hAmy-PEG20k에 대한 m/z 비는 도 4에 도시한다.
실시예 2: 인간 아밀린 및 모노페길화된 인간 아밀린의 수용체 결합 분석
정제된 모노페길화된 인간 아밀린으로, RAMP2 및 RAMP3 공동-수용체 결합 상호작용을 분석하였다.
RAMP (receptor activity modifying protein, 수용체 활성 변형성 단백질)를 PBS (소 태아 혈청) pH 7.4 중에 1시간 동안 4℃에서 플루오레세인 이소티오시아네이트로 표지한 후, 세파로스 G25 (아가로스계 크로마토그래피 매질, GE Healthcare 미국 회사에 의해 제공됨)에서 동일 완충제를 사용해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 정제하였다. 표지는 A280 및 A490에서 UV 흡광도를 측정하여 검증하였으며, 약 0.5 플루오레세인/RAMP 분자에 기초하여 커플링 효율 (coupling efficiency)을 추정하였다. 결합은, 유리형 뮤라인 아밀린, hAmy-PEG5k의 함수로서 RAMP-FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트)의 형광 이방성 (fluorescence anisotropy)을 측정하고, 관련성이 없는 단백질인 암탉 난백의 리소자임 (HEWL)을 비-특이적인 결합을 위한 대조군으로 사용하여, 수행하였다.
도 5 및 6에 따르면, 결합 분석은, 두플리케이트 분석 (모노페길화된 인간 아밀린 C#1과 C#2; 및 유리형 아밀린 #1과 #2)에서, 공동-수용체 RAMP2 및 RAMP3에 대해 유리형 및 정제된 hAmy-PEG5k 2종 모두 비슷한 겉보기 결합 친화성을 나타내는데, 이는 PEG 모이어티가 공동-수용체 친화성을 간섭하지 않는다는 것을 의미한다. HEWL을 이용한 대조군 분석에서는 공동-수용체에 대한 비-특이적인 결합성이 확인된다.
실시예 3: 인간 아밀린 및 모노페길화된 인간 아밀린의 생물학적 활성 분석
인간 아밀린 및 이의 페길화된 유사체의 생물학적 활성을 인간 아밀린 수용체를 천연적으로 발현하는 MCF-7 세포를 이용한 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 생산 분석으로 측정하였다. 본 분석은 96웰 플레이트의 절반에서 수행하였으며, 전체 반응 부피는 20 ㎕/웰이었다. 간략하게는, 웰 당 세포 4000개 (막 해동됨)를, 아밀린 (기준 화합물), hAmyPEG5k, hAmyPEG20k 또는 대조군 (무처리)의 존재 하에, 20 mM HEPES (pH 7.4), 0.1 % BSA 및 IBMX (포스포다이에스테라제 저해제) 500 ㎕가 첨가된 HBSS에서 30분간 37℃에서 현탁액 중에 인큐베이션하였다.
인큐베이션한 후, 세포용해 후, 형광 어셉터 (D2-표지된 cAMP) 및 도너 (유로퓸 크립테이트로 표지된 항-cAMP 항체)를 첨가하였다. 아밀린 또는 클라이언트 화합물로 자극 후 세포에 의해 생산된 cAMP는 표지된 cAMP와 경쟁하였으며, 따라서 표지된 cAMP 및 항체 각각에서 D2와 크립테이트 간의 FRET (형광 공면 에너지 전달)가 사라졌다. 실온에서 60분간 인큐베이션한 후, 형광을 측정하였으며 (337 nm에서 여기, 620 vs 665 nm에서 방출), cAMP 농도는 665 nm에서의 신호를 620 nm에서의 신호로 나누어 결정하였다. 결과는 인간 아밀린의 최고 효과에 대한 대조군 반응의 %로서 나타내었다. 표준 기준 작용제는 인간 아밀린이었으며, 이는 여러가지 농도로 각 실험에서 테스트하여 농도-반응 곡선을 구하였으며, 이로부터 EC50을 계산하였다.
도 7은, 아밀린 (EC50 = 41 nM; 도 7A) 또는 이의 페길화된 유도체 hAmyPEG5k (EC50 = 130 nM; 도 7B) 및 hAmyPEG20k (EC50 = 4.9 μM; 도 7C)가 cAMP 생산을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여주며, 이로써 아밀린 유사체의 생물 활성 프로파일이 검증되었다.
실시예 4: 인간 아밀린의 응집 프로파일에 대한 페길화 효과
실시예 1의 정제된 모노페길화된 인간 아밀린을 DMSO에 재현탁하고, PBS pH 7.4로 희석하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 아밀로이드 발색 프로브 티오플라빈 T (ThT)를 이용해 아밀로이드 응집을 샘플에서 평가하였다. 아밀로이드 원섬유 형성을 측정하기 위한 ThT 결합 프로토콜의 적용은 이미 당해 기술 분야에서 확립되어 있다 (예, Levine, 1999). 단백질을 10 mM NaH2PO4 pH 7.4 중에 25℃에서 인큐베이션함으로써, 아밀린 (유리형 또는 hAmy-PEG5k 50 μM) 응집 카이네틱스를 수행하였다. 응집 후, 티오플라빈 T (ThT)에 아밀로이드 원섬유를 결합시키고, 샘플 160 ㎕를 100 μM ThT 40 ㎕와 함께 첨가한 다음 450 nm에서 여기시키고 482 nm에서 방출을 24시간 측정하여 형광을 모니터링하였다.
도 8은 그 결과를 도시한다. 유리형 인간 아밀린은 매우 신속하게 응집하였다. 3일간, 거의 모든 유리형 인간 아밀린이 아밀로이드 형태로 응집되었다. hAmy-PEG5k에서는, 7일째에도 여전히 응집 신호가 관찰되지 않았다. 본 분석은, 페길화 공정이 인간 아밀린의 응집을 저해할 수 있다는 것을 입증해준다.
실시예 5: 페길화된 인간 아밀린 산물의 약동학적 특성
hAmy-PEG5k 및 hAmy-PEG20k의 약동학 특성을 할런 스프라그 다울리 수컷 랫을 이용해 생체내에서 규명하였다. 동물은 명-야 12시간 주기의 온도-제어된 공간에서 사육하였다. 물과 사료는 자유롭게 접근가능하게 하였다. 3개의 그룹, 즉 대조군 (유리형 인간 아밀린, 페길화되지 않음), hAmy-PEG5k 및 hAmy-PEG20k를 구성하였다. 유리형 인간 아밀린 또는 정제된 모노페길화된 인간 아밀린 유도체인 인간 아밀린 펩타이드 100 ㎍이 포함된 식염수 500 ㎕를 동물에 공급하였다. 랫의 안와 후방에서 채혈하고 (각 시간 간격 당 n = 랫 3마리), 혈장을 대상으로 인간 아밀린에 대한 ELISA 분석을 제조자의 지침에 따라 실시하였다 (Millipore, Cat Number EZHA-52K).
도 9A는 유리형 아밀린의 빠른 혈장 감소 (plasma decay)를 보여주며, hAmy-PEG5k (도 9B) 및 hAmy-PEG20k (도 9C)는 혈장에서 장기간 동안 안정적으로 유지된다. 본 분석은, 인간 아밀린의 페길화 공정이 이의 반감기를 조절할 수 있음을 입증해준다.
실시예 6: 인간 아밀린 pI에 대한 여러가지 아실화제의 효과
아세틸화된 인간 아밀린 (AcO-hAmy) 또는 hAmyPEG5k 60 ㎍을 8 M 우레아, 2% CHAPS 및 0.002% 브로모페놀 블루 완충제에 최종 부피 125 ㎕로 용해하였다. 샘플을 7 cm pH 3-10 선형의 고정된 pH 농도구배 스트립에서 밤새 인큐베이션한 후, 등전점 전기영동 (isoelectric focalization, IEF)을 수행하였다. IEF는 20℃에서 MultiPhor II (Pharmacia Biotech) 장치에서 하기 조건 하에 수행하였다: 200 V (1분), 3500 V까지 증가 (90분) 및 3500 V (60분). 마지막으로, 스트립을 0.20 % 글루타르알데하이드 (/30 % 에탄올, 0.2 M 소듐 아세테이트)로 실온에서 60분간 고정한 다음, 30분간 코마시 블릴리언트 블루 R-250 (0.025% / 40% 메탄올, 7% 아세트산)로 펩타이드 식별을 위해 염색하였다. 백그라운드 가시화가 없어질 때까지 0.1% 아세트산과 함께 인큐베이션하여 과잉의 코마시를 제거하였다. 스트립에서의 배치와 pH 간의 상관성으로 IEF를 쉽게 계산할 수 있다. 도 10에 도시된 바와 같이, AcO-hAmy에 존재하는 Lys1의 아세틸화 (도 10A) 및 hAmy-PEG5k에 존재하는 동일 부위에서의 페길화 (도 10B)가 인간 아밀린의 pI에 비슷한 효과를 발휘하여, pI는 약 9.2로 증가하였다.
실시예 7: 시간 및 pH-의존적인 조건에서 인간 아밀린의 응집 프로파일에 대한 여러가지 아실화제의 효과
첫번째 조건에서, 유리형 인간 아밀린, hAmyPEG5k 및 AcO-hAmy를 ThT의 존재 하에 여러가지 pH (3.0-10.0)의 완충제 수용액에서 인큐베이션하였다. 아밀로이드 섬유에의 ThT 결합으로부터 유래되는 형광 방출을 25℃에서 24시간 모니터링하였다. 유리형 인간 아밀린의 응집 카이네틱스는 당해 기술 분야에서 입수가능한 사실과 비슷하였다 (도 11A 및 12A). 그러나, 인간 아밀린의 페길화된 유도체와 아세틸화된 유도체 둘다 개선된 수 안정성 패턴을 나타내었으며, 아밀로이드 섬유 형성이 적거나 또는 없었다 (각각 도 11B 및 12B). 이러한 사실은, 인간 아밀린의 아실화된 유도체가 수용액, 특히 생리 pH 범위에서 증가된 안정성을 가진다는 것을 뒷받침해준다.
또 다른 실험 조건에서, hAmyPEG5k 안정성에 대한 pH 영향을 장기간 (최대 16일) 그리고 높은 에너지 환경 (37℃)에서 조사하였다. 도 13은 25℃에서 7일 후, 그리고 37℃에서 다시 9일 후 (즉, 총 16일), hAmy-PEG5k에 대한 pH 효과를 보여준다. 본 분석은 hAmy-PEG5k가 여러가지 pH에서, 심지어 고온에서 수일 경과 후에도 비-응집된 상태로 유지된다는 증거를 제시해준다.
실시예 8: hAmy - PEG5k과 인슐린 유사체의 조합물의 단기 안정성
인간 아밀린 또는 이의 페길화된 유도체 (hAmy-PEG5k 또는 hAmy-PEG20k)의, 인슐린 R, 인슐린 디터머, 인슐린 글라진, 인슐린 리스프로 또는 GLP-1 유사체 리라글루타이드와의 조합시, 응집율을 ThT 결합 분석으로 조사하였다. 이들 조합물 (화합물 각각 10 μM)을 10 mM NaH2PO4 pH 7.4와 함께 10 μM ThT의 존재 하에 25℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 아밀로이드 섬유 형성을 의미하는 형광 변화는 450 nm 여기 및 482 nm 방출을 측정함으로써 모니터링하였다.
도 14A는 hAmy는 응집하지만 hAmy-PEG5k는 응집하지 않는다는 것을 보여준다.
도 14B는 인슐린 R 글라진 및 디터머가 무시할 수준의 응집성을 나타냄을 보여준다.
도 14C는 인간 아밀린과 인슐린의 조합이 응집됨을 나타낸 것이고, 도 14D는 hAmy-PEG5k와 인슐린의 조합이 응집되지 않음을 나타낸 것이다.
도 15는 리라글루타이드 용액에 첨가된 인간 아밀린이 아밀로이드 응집을 유도하지만, hAmy-PEG5k와 리라글루타이드를 포함하는 용액은 명확하게 아밀로이드 응집 트레이서를 나타내지 않는다는 것을 보여준다.
도 16은, 리라글루타이드 용액에 첨가된 인간 아밀린이 아밀로이드 응집을 유도하지만, hAmy-PEG20k와 리라글루타이드를 포함하는 용액은 명확하게도 아밀로이드 응집 트레이서를 나타내지 않는다는 것을 보여준다.
또한, 본 분석은, hAmy-PEG5k와 여러가지 인슐린 유사체 또는 GLP-1 유사체의 조합이 24시간 안정적인 상태로 유지됨을, 입증해준다.
실시예 9: monoPEG - hAmy5k 및 인슐린 유사체의 조합물의 장기 안정성.
본 실험 조건에서, 페길화된 인간 아밀린 (0.2 mg/mL 또는 1.0 mg/mL)을 각각의 선택한 인슐린계 제품 (글라진 및 디터머)의 오리지날 제형에 첨가하여, 인슐린 레귤러 비히클에서의 주요한 간섭을 방지하였다. 이들 조합물을 무균 환경 하에 조작하였으며, 냉장 조건 (4℃)에서 6개월간 보관하였다. 용액의 안정성을 ThT-결합 분석, 다이나믹 광 산관 및 투과전자현미경에 의해 측정하였다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피로 샘플을 분석하여, 활성 성분의 온전성 (integrity)을 검증하였다.
도 17은 다이나믹 광 산란에 의한 hAmy-PEG5k 및 인슐린 (글라진 및 디터머)의 장기간 안정성 결과를 도시한 것이다. 이 분석으로 이들 조합이 6개월간 안정적으로 유지된다는 것이 입증되었다.
도 18은 티오플라빈 T 결합에 의한 hAmy-PEG5k 및 인슐린 (글라진 및 디터머)의 장기간 안정성 결과를 도시한 것이다. 이 분석으로 이들 조합이 6개월간 응집되지 않는다는 것이 확인되며, 따라서 이 조합이 6개월간 안정적으로 유지됨이 입증된다.
도 19는 HPLC에 의한 hAmy-PEG5k 및 인슐린 (글라진)의 장기간 안정성 결과를 도시한 것이다. 이 분석으로 인슐린이 6개월간 안정적으로 유지됨이 입증된다.
도 20은 HPLC에 의한 hAmy-PEG5k 및 인슐린 (디터머)의 장기간 안정성 결과를 도시한 것이다. 이 분석으로 인슐린이 6개월간 안정적으로 유지됨이 입증된다
실시예 9.1: ThT -결합 분석
인간 아밀린 또는 이의 페길화된 유도체가 인슐린 레버미어 (levemir) 또는 인슐린 글라진과의 조합시 응집되는 속도를 4℃에서 인큐베이션하여 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12 및 24주 테스트하였다. 이들 조합물을 10 mM NaH2PO4 pH 7.4와 함께 10 μM ThT의 존재 하에 24시간 25℃에서 인큐베이션하였다. 아밀로이드 섬유 형성을 의미하는 형광 변화를 여기 450 nm 및 방출 482 nm에서 측정하여 모니터링하였다.
실시예 9.2: 다이나믹 광 산란 분석
단독으로, 또는 혼합시, 인간 인슐린 글라진 (90 U/mL) 및 hAmyPEG5k (농도: 0.2 - 1.0 mg/mL)의 입자 크기 분포를 DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, USA)에서 다이나믹 광 산란에 의해 평가하였다. 658 nm 레이저 파장을 사용해 고정각 90°에서 역산란 광을 검출하였다. 실험 내내 셀 홀더를 25℃로 유지하였다. 데이타는 인큐베이션 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12 및 24주 후에 수집하였다. 최종 데이타는 3번의 독립적으로 측정한 결과의 평균이다. 입자 크기는 제조사의 소프트웨어로 계산하였다.
실시예 9.3: 고 성능 액체 크로마토그래피
조합물내 인슐린 글라진과 hAmyPEG5k의 프리-분획들을, Thermo Scientific C18 컬럼 (ODS Hypersil, 250x4.6 mm, SN 0593286M lot 9418, 입자 크기 5 ㎛)에서 유속 4 mL/min으로 Jasco LC-2000 HPLC (Jasco Inc, USA)를 사용한 C18-역상 고 성능 액체 크로마토그래피 (C18-RP-HPLC)에 의해 분석하였다. 샘플을 4℃에서 0, 3 및 6개월 인큐베이션한 후 분석하였다. 각 샘플 약 20 ㎕를 50% H2O, 50% CH3CN, 0.1% TFA 용액 80 ㎕과 주입 직전에 20 ㎕ 스테인리스 스틸 주사 관 루프에서 혼합하였다. 정제 농도 구배는 다음과 같이 수행하였다: 50% CH3CN / 물+0.1% TFA를 이용한 5분간 등용매 흐름, 물+0.1% TFA 중에서의 CH3CN의 15분간의 선형적인 농도 구배, 50%->80%로 진행 후, 100% CH3CN / 0.1% TFA로의 10분간 등용매 흐름. 샘플 용출은 220 nm에서 흡광도를 추적하여 모니터링하였다. 유리-분획의 양을 곡선하 면적으로 계산하였다. 출발 농도에서 최종 펩타이드 프리-양을 감산하여 응집물의 양을 추정하였다.
실시예 10: 건강한 랫에서 음식물 섭취 ( FI )에 대한 PEG- hAmy20k 효과
본 분석은 Hansen et al (2014)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게는, 건강한 랫을 전처리 FI 및 체중으로 무작위 분류하여, MANI-feedwin 시스템 (FI, 물 섭취 및 운동 활동 허용) 레지스트레이션으로 이동시켜, 1주일간 적응시켰다. 그런 후, 동물에 비히클, PEG-hAmy20k (1.0 mg/Kg, 2.0 mg/Kg 또는 4.0 mg/Kg) 또는 양성 대조군 (리라글루타이드 0.2 mg/Kg)을 실험 개시 30분 전에 피하 주사하였다. 그런 후, 사료와 물 섭취, 체중 및 운동 활동을 모니터링하였고, 최대 120시간 기록하였다. 그 결과는 도 21에 나타낸다.
예상된 바와 같이, 양성 대조군은 처리 후 즉각적으로 FI를 현저하게 감소시켰으며 최대 48시간 지속되었다. 동일한 시간대에, PEG-hAmy20k (1 - 4 mg/Kg)는 농도-의존적인 방식으로 무처리 대조군 랫과 비교해 누적 (도 21A) 및 총 FI (도 21B)를 최대 38% 감소시켰다 (p < 0.05). FI 감소와 일관되게, PEG-hAmy20k는 또한 농도 의존적인 방식으로 체중 증가율을 감소시켰다. 도 21C에서, 4 mg/Kg 투여 동물에서는 5일간 현저한 긍정적인 효과가 나타났으며, 2 mg/Kg 처리한 경우 테스트 첫 24시간 이내에 현저하게 낮은 수준의 체중 증가만 나타났다 (* p < 0.05; *** 또는 +++ p < 0.001, 모든 사례들에서 비히클 대비).
다른 설정으로, 건강한 랫에 비히클과 저용량의 PEG-hAmy20k (1.0 mg/kg) 리라글루타이드 (0.1 mg/kg)를 별개로 또는 동시에 처리하고, 24시간 FI를 모니터링하였다. 또다시, 처리군과 양성 대조군 둘다 투여 후 24시간 동안 명확한 누적 사료 섭취 (도 22A) 및 총 사료 섭취 (도 22B)에 감소가 관찰되었다. 아울러, 공동-처리한 경우, 건강한 랫의 사료 섭취에 주목할만한 상가 효과 (additive effect)가 관찰되었다 (비히클/비히클 대비 *** p < 0.001; 리라글루타이드 0.1 mg/kg 대비 ### p < 0.001; PEG-hAmy20k 대비 $$$ p < 0.001).
본 실험은, PEG-hAmy20K이 인간 아밀린의 FI에 대한 생체내 효과를 유지시킨다는 것을 입증해주며, 즉 이는 당뇨병 및/또는 비만 치료에에서의 이의 용도를 뒷받침해준다. 또한, 저용량의 PEG-hAmy20K 및 리라글루타이드 공동-처리시 현저한 상승 작용이 나타났으며, 이는 조합의 약리학적 이점을 보여주는 것이다.
실시예 11: 건강한 랫의 위 배출율에 대한 PEG- hAmy20k 효과
분석은 Dalboge et al (2015)에 언급된 바와 같이 수행하였다. 간략하게는, 8주령의 스프레그 다울리 수컷 랫 30마리를 5일간 적응시켰다. 세미-금식시킨 랫에 비히클, PEG-hAmy20k (0.5 mg/Kg, 1.0 mg/Kg, 2.0 mg/Kg 또는 4.0 mg/Kg) 또는 양성 대조군 (리라글루타이드 0.2 mg/Kg)을 실험 개시하기 60분 전에 피하 투여하였다. 위 배출 및 포도당 항상성을 아세트아미노펜 및 포도당을 포함하는 용액을 경구 투여하여 분석하였다. 혈장내 혈당증 및 아세트아미노펜 출현을 -60분 및 0분 (포도당 단독) 및 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 및 180분 (포도당과 아세트아미노펜)에 채혈한 혈액 샘플에서 측정하였다. 그 결과는 도 24에 도시한다.
도 23A 및 B에 도시된 바와 같이, 아세트아미노펜의 경구 흡수로 측정한 위 배출은 GLP-1 유사체인 리라글루타이드에 의해 상당히 저하되었다. 또한, hAmy-PEG20k는 혈장내 아세트아미노펜 출현의 양 (모든 용량에서) 및 속도 (1 - 4 mg/Kg) 모두 현저하게 저하하였다 (비히클 대비 *, +, $, #, ^ p < 0.05; 비히클 대비 *** p < 0.001). 아울러, 도 24 (A 및 B)는 시험 화합물이 경구 포도당 투여 후 혈당증에 유의하지만 가벼운 방해를 야기하는 반면, 양성 대조군이 훨씬 강력한 효과를 발휘함을 보여준다 (비히클 대비 *, +, $, #, ^ p < 0.05; 비히클 대비 ** p < 0.01).
본 실험에서, PEG-hAmy20K가 GE에 대한 생체내 인간 아밀린 효과를 유지하여, 당뇨병 및/또는 비만-관련 장애를 치료하기 위한 이의 용도를 뒷받침하는 것으로, 입증되었다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO <120> NON-AGGLOMERATING BIOCONJUGATES OF AMYLIN AND AMYLIN-MIMETIC COMPOUNDS, COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, AND MAKING AND USE THEREOF <150> BR1020150312830 <151> 2015-12-14 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> PROTEIN <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amylin <400> 1 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 2 <211> 37 <212> PROTEIN <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amylin-Mimetic <400> 2 Lys Cys XAA1 XAA2 XAA3 XAA4 Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 3 <211> 37 <212> PROTEIN <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amylin-Mimetic <400> 3 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35

Claims (18)

  1. 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체의 비-응집성 바이오접합체 (non-agglomerating bioconjugate)로서,
    상기 바이오접합체가 하나 이상의 아실 단위 (acyl unit)를 포함하는, 비-응집성 바이오접합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하나의 아실 단위가 서열번호 1의 1번 라이신 잔기에 공유 결합된, 비-응집성 바이오접합체.
  3. 제1항에 있어서,
    식 I을 가진, 비-응집성 바이오접합체:
    식 I: (R1-X)m-R2
    상기 식에서,
    R1은 아세틸, 바이오틴, 유비퀴틴, 글리칸, 지방산 쇄 및 천연 또는 합성 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아실 모이어티 및 다양한 평균 몰 질량을 가진 기능성 스페이서이고;
    R2는 서열번호 1이고;
    X는 NH, CO 또는 O이고;
    m은, 3, 4, 5 또는 6번 위치들 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 인간 아밀린 유사체 (서열번호 2)를 비롯하여, 서열번호 1의 아실화로부터 수득되는 서열번호 1 (R2)에 접합된 아실 기 (R1) 단위의 개수임.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 아실 기가 PEG, 아세틸기, 팔미토일 및 미리스토일로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아실화제 (acylating agent)를 이용해 형성되는, 비-응집성 바이오접합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 PEG가 1 kDa 내지 40 kDa인, 비-응집성 바이오접합체.
  6. 인간 아밀린 또는 아밀린 유사체의 아실화된 비-응집성 바이오접합체를 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    인슐린, 인슐린 유사체 및/또는 GLP-1 수용체 작용제 유사체; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인슐린 또는 인슐린 유사체가 NPH, 속효성 인슐린 (regular insulin), 글라진 (Glargine), 디터머 (Detemir), 디글루덱 (Degludec), 아스파르트 (Aspart), 리스프로 (Lispro) 및 글루리신 (Glulisine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 GLP-1 수용체 작용제 유사체가 세마글루타이드 (semaglutide), 엑세나타이드 (exenatide), 릭시세나타이드 (lixisenatide), 리라글루타이드 (liraglutide), 알비글루타이드 (albiglutide) 및 둘라글루타이드 (dulaglutide)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 조성물이 췌장염, 고칼슘혈증, 통증, 골다공증, 만성 염증성 질환, 만성 소화 장애 (coeliac disease), 건선, 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 야기하는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 유도되는 질환 또는 병태, 및 혈압 증가로 인한 장애 및 혈관 질환의 치료에 사용되는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 전신 장기의 기능 장애 또는 부전을 야기하는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되거나 또는 유도되는 질환 또는 병태가 고혈당증, 당뇨병, 낮은 내당성 (low tolerance to glucose) 또는 포도당 대사 결함, 비만, 대사 증후군, 중추 신경계-관련 식이 장애, 말초-관련 식이 장애 및 알츠하이머 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 혈압 증가로 인한 장애 및 혈관 질환이 죽상동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 관상동맥 심장 질환, 고혈압 및 심장병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  13. 제6항에 있어서,
    항-염증제를 더 포함하는, 조성물.
  14. 제1항에 따른 인간 아밀린의 비-응집성 바이오접합체, 인슐린 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 것을 포함하는, 조성물의 제조 방법.
  15. 제2항에 따른 인간 아밀린의 비-응집성 바이오접합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 의약제.
  16. 제7항에 따른 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는,
    아밀린 결핍 또는 아밀로이드 침착 또는 축적에 의해 유발되는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 질환이 당뇨병 및/또는 비만인, 방법.
  18. 아밀린 폴리펩타이드 쇄의 1번 라이신 잔기의 α 및/또는 ε-아민 모이어티에 아실화제를 결합시키는 것을 포함하는, 아밀린-모방 화합물의 안정화 방법.
KR1020187020206A 2015-12-14 2016-12-14 아밀린 및 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법과 용도 KR20180093059A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR102015031283A BR102015031283A2 (pt) 2015-12-14 2015-12-14 Bioconjugado de amilina humana ou de análogos de amilinanão agregantes, composição, métodos para a preparação deuma composição, para o tratamento de uma doença oucondição e para estabilizar um composto amilino-mimético, e,medicamento
BRBR1020150312830 2015-12-14
PCT/BR2016/050330 WO2017100896A1 (en) 2015-12-14 2016-12-14 Non-agglomerating bioconjugates of amylin and amylin-mimetic compounds, compositions comprising the same, and making and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180093059A true KR20180093059A (ko) 2018-08-20

Family

ID=59055492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187020206A KR20180093059A (ko) 2015-12-14 2016-12-14 아밀린 및 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법과 용도

Country Status (8)

Country Link
JP (1) JP2019501963A (ko)
KR (1) KR20180093059A (ko)
CN (1) CN108431031A (ko)
AU (1) AU2016371260A1 (ko)
BR (2) BR102015031283A2 (ko)
CA (1) CA3008182A1 (ko)
MX (1) MX2018007236A (ko)
WO (1) WO2017100896A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110467666A (zh) * 2019-09-17 2019-11-19 湖北强耀生物科技有限公司 一种新型胰岛淀粉样多肽的合成方法
JP7554928B2 (ja) 2020-12-18 2024-09-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ－１およびアミリン受容体の共作動薬

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2556226A1 (en) * 2004-02-11 2006-08-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Amylin family peptides and methods for making and using them
JP5252435B2 (ja) * 2006-03-15 2013-07-31 ノボ・ノルデイスク・エー／エス アミリン誘導体
EP2036923A1 (en) * 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Improved derivates of amylin
US20090104210A1 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 Tota Michael R Peptide compounds for treating obesity and insulin resistance
PE20140969A1 (es) * 2011-01-20 2014-07-24 Zealand Pharma As Combinacion de analogos del glucagon acilados con analogos de insulina
US20140249076A1 (en) * 2011-10-18 2014-09-04 Astrazeneca Pharmaceuticals Lp Amylin-calcitonin chimeric peptides conjugated to duration enhancing moieties
BR102013017626A2 (pt) * 2013-06-14 2015-02-10 Univ Rio De Janeiro Bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, uso de bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, composições farmacêuticas de baixa toxicidade, adjuvante para a prevenção ou tratamento das doenças, medicamento, método de tratamento ou prevenção de doenças.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017100896A1 (en) 2017-06-22
CN108431031A (zh) 2018-08-21
AU2016371260A1 (en) 2018-06-21
BR102015031283A2 (pt) 2018-09-18
JP2019501963A (ja) 2019-01-24
CA3008182A1 (en) 2017-06-22
BR112018011903A2 (pt) 2018-11-27
MX2018007236A (es) 2019-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI792596B (zh) 新穎脂肪酸及其於共軛至生物分子之用途
KR102497726B1 (ko) 인슐린 저항성에 대한 개선된 펩티드 제약
TWI681966B (zh) Ｆｇｆ２１衍生物及其用途
JP2019196354A (ja) 改善されたペプチド製剤
BR112015011478B1 (pt) Produtos de peptídeo, seus usos e composição farmacêutica
KR102505628B1 (ko) 글루카곤 및 glp-1 수용체의 장기-작용성 공-효능제
US20200392197A1 (en) Antibody peptide conjugates that have agonist activity at both the glucagon and glucagon-like peptide 1 receptors
JP2022172128A (ja) インスリン抵抗性のための改善されたペプチド医薬品
AU2017322277A1 (en) Amylin analogues
AU2018276434B2 (en) Long-acting GIP peptide analogues
TW200944237A (en) Use of pegylated IGF-I variants for the treatment of neuromuscular disorders
KR20220020821A (ko) 이중 glp1/2 아고니스트의 약학적 비경구 조성물
Li et al. Disulfide bond prolongs the half-life of therapeutic peptide-GLP-1
CN111194223B (zh) 与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子
KR20180093059A (ko) 아밀린 및 아밀린-모방 화합물의 비-응집성 바이오접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법과 용도
US20160184401A1 (en) Non-agglomerating bioconjugates of amylin and amylin-mimetic compounds, compositions comprising the same, and making and use thereof
EP3468610A1 (en) Long-acting oxyntomodulin formulation and methods of producing and administering same
EP3394090A1 (en) Non-agglomerating bioconjugates of amylin and amylin-mimetic compounds, compositions comprising the same, and making and use thereof
WO2024137820A1 (en) Insulin receptor antagonist