ES2887370T3 - Nuevo agonista del receptor de amilina y calcitonina - Google Patents
Nuevo agonista del receptor de amilina y calcitonina Download PDFInfo
- Publication number
- ES2887370T3 ES2887370T3 ES15766071T ES15766071T ES2887370T3 ES 2887370 T3 ES2887370 T3 ES 2887370T3 ES 15766071 T ES15766071 T ES 15766071T ES 15766071 T ES15766071 T ES 15766071T ES 2887370 T3 ES2887370 T3 ES 2887370T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mimilin
- peptide
- seq
- amino acid
- glp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Obesity (AREA)
- Neurology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Un péptido de mimilina que comprende una secuencia que es al menos 66 % idéntica a EASELSTAALGRLSAELHELATLPRTETGPESP (SEQ ID NO: 1) y no comprende ninguna N; en donde el péptido es un agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina.
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevo agonista del receptor de amilina y calcitonina
Campo técnico
La presente invención se refiere a péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (EASELSTAALGRLSAELHELATLPRTETGPESP), análogos y derivados de estos, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos y derivados y su uso como medicamentos.
Antecedentes
Se conoce desde hace mucho tiempo que cuando la insulina tradicional se usa para tratar la diabetes, se asocia con un aumento en el peso corporal. La insulina debe inyectarse por vía subcutánea hasta varias veces por día. Por tanto, un enfoque terapéutico antidiabético no solo debe reducir los niveles de glucosa en sangre en ayunas y posprandial, sino que también óptimamente debe inducir la pérdida de peso. La diabetes tipo 2 se trata generalmente en las primeras fases con dieta y ejercicio. A medida que la afección progresa, se añaden diversos agentes antidiabéticos orales. Ahora surgen nuevas terapias basadas en hormonas para la diabetes tipo 2 que se asemejan a un modo de acción endógeno, tal como el péptido similar al glucagón (GLP)-1 y los análogos de amilina. Estos agentes no solo mejoran la homeostasis de la glucosa, sino que también muy prometedoramente ejercen efectos beneficiosos sobre el peso corporal. En individuos obesos, las concentraciones de amilina en ayunas están elevadas junto con hiperinsulinemia y en pacientes con diabetes tipo 2, la amilina, como la insulina, es relativamente deficiente en dependencia de la gravedad de la insuficiencia secretora de las células p. Los agonistas del receptor de amilina son útiles para reducir la ingestión de alimentos y tratar la obesidad.
La amilina humana es un polipéptido de 37 aminoácidos de longitud que tiene propiedades fisico-químicas que hacen que su uso como un fármaco sea problemático. En particular, tiene una tendencia a la fibrilogénesis, es decir, la formación de fibrillas, in vitro y/o ex vivo y se vuelve ineficaz debido a la precipitación. La pramlintida es un producto farmacológico comercializado por Amylin Pharmaceuticals como Symlin® y un análogo de amilina humana y agonista del receptor usado en el tratamiento de la diabetes como un complemento de la insulina. La pramlintida es inestable químicamente a pH neutro y, por lo tanto, se proporciona en una solución ácida.
El receptor de calcitonina se encuentra en muchos tejidos en todo el cuerpo y se cree que está implicado en la regulación del metabolismo óseo. La calcitonina de salmón se vende actualmente con el nombre comercial de Miacalcic®. El producto se usa contra la hipercalcemia, la osteoporosis (lo que incluye la osteoporosis postmenopáusica y la osteoporosis relacionada con los glucocorticoides), la osteítis deformante (enfermedad de Paget) y se administra una vez al día ya sea por inyección o por vía nasal. La calcitonina se une a receptores específicos en la membrana del esqueleto, los riñones y en el sistema nervioso central (CNS). La pramlintida es inestable químicamente a pH neutro y, por lo tanto, se proporciona en una solución ácida.
Los polipéptidos con actividad tanto en el receptor de amilina y calcitonina como en el receptor de amilina pueden ser ventajosos; sin embargo, la vida media aumentada de los agonistas del receptor de amilina y de calcitonina aumentaría en gran medida la facilidad de uso y la conveniencia para el uso como un medicamento en el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente. Un inconveniente adicional del grupo actualmente conocido de péptidos de calcitonina y de amilina es que solo son estables químicamente en solución cuando se manipulan en un estrecho intervalo de pH ácido, lo que los hace molestos de manipular en circunstancias en las que se desea un intervalo de pH más amplio. Por tanto, los polipéptidos que son agonistas del receptor de amilina y/o calcitonina con perfiles de solubilidad más flexibles aumentarían la facilidad de uso en productos medicinales.
Resumen
La invención actualmente reivindicada se refiere a un agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina que comprende un péptido de mimilina, en donde la secuencia de aminoácidos del péptido de mimilina es al menos 66 % idéntica a EASELSTAALGRLSAELHELATLPRTETGPESP (SEQ ID NO: 1) y en donde el péptido de mimilina no comprende ninguna N. El agonista del receptor de amilina y/o un agonista 20 del receptor de calcitonina descritos en la presente descripción pueden usarse en un medicamento.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina descritos en la presente descripción pueden usarse para el tratamiento de sujetos que padecen sobrepeso, obesidad, diabetes tipo I, diabetes tipo II, osteoporosis y/o dolor neuropático.
Los inventores descubrieron sorprendentemente que los péptidos de mimilina son agonistas de los receptores de amilina y calcitonina y muestran un perfil de solubilidad favorable en toda la escala de pH completa, especialmente a pH neutro y superior, es decir, de aproximadamente pH 6,0 y superior, preferentemente, de aproximadamente pH 7,0
y superior. Además, los péptidos de la presente invención son péptidos muy estables y, por lo tanto, potencialmente muy útiles para su uso en medicamentos. Además, la mimilina tiene una Puntuación de Riesgo de Inmunogenicidad (IRS) baja. Sorprendentemente, se encontró que los compuestos de mimilina de esta invención pueden combinarse con compuestos GLP-1 en formulaciones conjuntas en donde ambos permanecen estables. Sorprendentemente, se encontró que los compuestos de mimilina de esta invención pueden combinarse con compuestos GLP-1 en formulaciones a un pH entre aproximadamente 7,0 y 8,5, en donde ambos permanecen estables. Aún más sorprendente, se encontró que la administración conjunta en ratas DIO de un compuesto de acuerdo con esta invención y liraglutatida potenció la pérdida de peso lograda por el tratamiento con liraglutida sola, lo que supera un efecto de complementación. Sorprendentemente, se encontró que los compuestos de acuerdo con la invención no afectan el perfil de PK de la liraglutida y, sorprendentemente, la liraglutida no afecta el perfil de PK de los compuestos de esta invención cuando se administra como formulaciones conjuntas a cerdos LYD. Sorprendentemente, se encontró que el compuesto de ejemplo 2 o 46 de esta invención no afecta el perfil de PK de la liraglutida y, sorprendentemente, la liraglutida no afecta el perfil de PK del compuesto de ejemplo 2 o 46 de esta invención cuando se administra como formulaciones conjuntas a cerdos LYD.
La invención puede también resolver problemas adicionales que resultarán evidentes a partir de la descripción de las modalidades y aspectos ilustrativos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el peso corporal relativo (% del inicial) en ratas DIO durante el período de tratamiento con liraglutida (QD) y el compuesto del Ej. #2. Los datos son la media ± SEM, n=10.
Descripción
En la presente descripción se describen péptidos de mimilina que comprenden una secuencia de aminoácidos que es un análogo de mimilina (EASELSTAa Lg RLSAELHELATLp Rt ETGPESP) o análogos o derivados de estos que muestran todos efectos agonistas sobre el receptor de amilina. También se describen derivados, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos de mimilina y el uso de dichos péptidos de mimilina como medicamentos.
En algunas modalidades, los péptidos de mimilina descritos en la presente descripción son agonistas del receptor de calcitonina. En algunas modalidades, el péptido de mimilina descrito en la presente descripción agoniza los receptores de amilina humana y calcitonina humana y muestra solubilidad en toda la escala de pH completa, preferentemente, pH neutro y superior.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende hasta 11 modificaciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende hasta 11 modificaciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1, en donde en una o más de las posiciones 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 32, en donde la numeración de aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia que tiene al menos 66 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 1 y un grupo amida c-terminal.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia que tiene al menos 66 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 1 y ningún puente disulfuro. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia que tiene al menos 66 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 1 y no comprende cisteínas, preferentemente, en la posición 2 y/o 8, en donde la numeración de aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 50 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 20 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 19 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 18 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 17 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 16 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 15 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de
aproximadamente 14 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 13 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 12 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 11 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 10 pM o menos. En algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene una EC50 en un ensayo funcional del receptor de amilina humana (ensayado como se describe en el Ensayo IIb) de aproximadamente 5 pM o menos.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina es un péptido que comprende la SEQ ID NO: 1A;
X(-1)-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34 (SEQ ID NO: 1A),
en donde X representa aminoácidos y en donde
X(-1) es E o ningún aminoácido,
X1 se selecciona del grupo que consiste en E o A o ningún aminoácido,
X2 se selecciona del grupo que consiste en L, A o P,
X3 se selecciona del grupo que consiste en S o P
X4 se selecciona del grupo que consiste en E, P, K, Q o G
X5 se selecciona del grupo que consiste en L, V o I,
X6 es S, T o H,
X7 es T,
X8 se selecciona del grupo que consiste en L o A,
X9 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I, S o T,
X10 se selecciona del grupo que consiste en L, A, I, H o V,
X11 es G,
X12 se selecciona del grupo que consiste en R, H o K,
X13 es L,
X14 se selecciona del grupo que consiste en S, T o E,
X15 se selecciona del grupo que consiste en A, Q, E, e o T,
X16 se selecciona del grupo que consiste en R, E, K o Q,
X17 se selecciona del grupo que consiste en L o I,
X18 se selecciona del grupo que consiste en H o A,
X19 se selecciona del grupo que consiste en E, R o K,
X20 se selecciona del grupo que consiste en L, I o V,
X21 se selecciona del grupo que consiste en A, Q, S, E o T,
X22 es T,
X23 se selecciona del grupo que consiste en T, Y o L,
X24 es P,
X25 se selecciona del grupo que consiste en R, P, H o K,
X26 es T,
X27 se selecciona del grupo que consiste en E, Q, G o K,
X28 se selecciona del grupo que consiste en T o P,
X29 es G,
X30 se selecciona del grupo que consiste en P, S o T,
X31 se selecciona del grupo que consiste en E, Q, G, A, P o K,
X32 se selecciona del grupo que consiste en T, S, H, P o A y
X33 es P, Y, H, F, L, S, G o A y
X34 es G o ningún aminoácido
En algunas modalidades, el péptido de mimilina es un péptido que comprende la SEQ ID NO: 1B;
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36 (SEQ ID NO: 1B)
en donde X representa aminoácidos y en donde
XI se selecciona del grupo que consiste en E o A o ningún aminoácido,
X2 se selecciona del grupo que consiste en L, A o P,
X3 se selecciona del grupo que consiste en S o P
X4 se selecciona del grupo que consiste en E, P, K, Q o G
X5 se selecciona del grupo que consiste en L, V o I,
X6 es S, T o H,
X7 es T,
X8 se selecciona del grupo que consiste en L o A,
X9 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I, S o T,
X10 se selecciona del grupo que consiste en L, A, I, H o V,
X I I es G,
X12 se selecciona del grupo que consiste en R, H o K,
X13 es L,
X14 se selecciona del grupo que consiste en S, T o E,
X15 se selecciona del grupo que consiste en A, Q, E, e o T,
X16 se selecciona del grupo que consiste en R, E, K o Q,
X17 se selecciona del grupo que consiste en L o I,
X18 se selecciona del grupo que consiste en H o A,
X19 se selecciona del grupo que consiste en E, R o K,
X20 se selecciona del grupo que consiste en L, I o V,
X21 se selecciona del grupo que consiste en A, Q, S, E o T,
X22 es T,
X23 se selecciona del grupo que consiste en T, Y o L,
X24 es P,
X25 se selecciona del grupo que consiste en R, P, H o K,
X26 es T,
X27 se selecciona del grupo que consiste en E, Q, G o K,
X28 se selecciona del grupo que consiste en T o P,
X29 es G,
X30 se selecciona del grupo que consiste en P, S o T,
X31 se selecciona del grupo que consiste en E, Q, G, A, P o K,
X32 se selecciona del grupo que consiste en T, S, H, P o A,
X33 es P, Y, H, F, L, S, G o A
X34 es G o ningún aminoácido
X35 es T o ningún aminoácido y
X36 es Y o ningún aminoácido.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina es un péptido que comprende la SEQ ID NO: 1C;
X1-X2-X3-X4-X5-X6-T-X8-X9-X10-G-X12-L-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-T-X23-P-X25-T-X27-X28-G-X30-X31-X32-X33 (SEQ ID NO: 1C),
en donde X representa aminoácidos y en donde
X1 se selecciona del grupo que consiste en E o A o ningún aminoácido,
X2 se selecciona del grupo que consiste en L, A o P,
X3 se selecciona del grupo que consiste en S o P
X4 se selecciona del grupo que consiste en E, P, K, Q o G
X5 se selecciona del grupo que consiste en L, V o I,
X6 es S, T o H,
X8 se selecciona del grupo que consiste en L o A,
X9 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I, S o T,
X10 se selecciona del grupo que consiste en L, A, I, H o V,
X12 se selecciona del grupo que consiste en R, H o K,
X14 se selecciona del grupo que consiste en S, T o E,
X15 se selecciona del grupo que consiste en A, Q, E, e o T,
X16 se selecciona del grupo que consiste en R, E, K o Q,
X17 se selecciona del grupo que consiste en L o I,
X18 se selecciona del grupo que consiste en H o A,
X19 se selecciona del grupo que consiste en E, R o K,
X20 se selecciona del grupo que consiste en L, I o V,
X21 se selecciona del grupo que consiste en A, Q, S, E o T,
X23 se selecciona del grupo que consiste en T, Y o L,
X25 se selecciona del grupo que consiste en R, P, H o K,
X27 se selecciona del grupo que consiste en E, Q, G o K,
X28 se selecciona del grupo que consiste en T o P,
X30 se selecciona del grupo que consiste en P, S o T,
X31 se selecciona del grupo que consiste en E, Q, G, A, P o K,
X32 se selecciona del grupo que consiste en T, S, H, P o A y
X33 es P, Y, H, F, L, S, G o A.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina es un péptido de SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde se añade un aminoácido adicional al N-terminal. En algunas modalidades, el péptido de mimilina puede ser un péptido de SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde se añade un aminoácido adicional al N-terminal, en donde dicho aminoácido adicional es E.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina puede describirse de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde dicho péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral en el grupo alfa amino del aminoácido N-terminal, en donde dicha cadena lateral comprende un resto prolongador como se define en la presente invención y opcionalmente comprende un enlazador.
Para algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene un sustituyente en un residuo de aminoácido, cuyo residuo de aminoácido es el residuo de aminoácido en el residuo N-terminal o el residuo de aminoácido es una lisina, en donde dicha lisina puede estar en cualquiera de las posiciones 1-33 de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1.
Para algunas modalidades, el péptido de mimilina tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo a(alfa)-amino del residuo de aminoácido N-terminal.
Para algunas modalidades, el residuo de aminoácido N-terminal es lisina y el péptido de mimilina tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo s(épsilon)-amino del residuo amino de lisina.
Para algunas modalidades, el péptido de mimilina se extiende mediante la adición de un residuo de lisina en el N-terminal y el péptido de mimilina tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo s-amino del residuo amino de lisina.
Para algunas modalidades, el péptido de mimilina se extiende mediante la adición de un residuo de ácido glutámico en el N-terminal y el péptido de mimilina tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo a-amino del residuo amino de lisina.
Para algunas modalidades, el péptido de mimilina se extiende mediante la adición de un residuo de aminoácido en el N-terminal y el péptido de mimilina tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo a-amino del residuo de aminoácido N-terminal.
En algunas modalidades, se produce un derivado de amilina mediante la derivatización de un péptido de mimilina con una cadena lateral unida en el N-terminal de dicho péptido de mimilina. En algunas modalidades, se produce un derivado de amilina mediante la derivatización de un péptido de mimilina con una cadena lateral unida a una K (Lys) dentro de la secuencia de dicho péptido de mimilina. En algunas modalidades, dicha unión en una K (Lys) puede estar en la posición 4, 12, 16, 23, 18, 27 o 34.
En algunas modalidades las SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C son análogas de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es hasta 11 aminoácidos diferente de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es hasta 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, preferentemente, 1,2 o 3, con mayor preferencia, 4, 3 o 5 aminoácidos diferente de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es hasta 5 aminoácidos diferente de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es hasta 4 aminoácidos diferente de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es hasta 3 aminoácidos diferente de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es hasta 2 aminoácidos diferente de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es 1 aminoácido diferente de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 22 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 23 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 24 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 25 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 26 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 27 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 28 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 29 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1.En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos
30 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 31 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde la secuencia es al menos 32 aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C y un grupo amida C-terminal. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es E. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es E y el péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral unida al péptido de mimilina en el N-terminal. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es E y el péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral unida al péptido de mimilina en el N-terminal, en donde dicha cadena lateral comprende un resto prolongador y un enlazador. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es E y el péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral unida al péptido de mimilina en el N-terminal, en donde dicha cadena lateral comprende un resto prolongador y sin enlazador.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es A. En algunas modalidades, un péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es A y el péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral unida al péptido de mimilina en el N-terminal. En algunas modalidades, un péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es A y el péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral unida al péptido de mimilina en el N-terminal, en donde dicha cadena lateral comprende un resto prolongador y un enlazador.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es cualquier aminoácido excepto E. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es cualquier aminoácido excepto E y el péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral unida al péptido de mimilina en el N-terminal. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X1 es cualquier aminoácido excepto E y el péptido de mimilina se derivatiza con una cadena lateral unida al péptido de mimilina en el N-terminal, en donde dicha cadena lateral comprende un resto prolongador y un enlazador. En modalidades particulares, la cadena lateral y/o el resto prolongador es lipófilo, y/o cargado negativamente a pH fisiológico (pH aproximadamente 7,4).
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X2 es L. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X2 es A. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X2 es P.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X3 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X3 es P.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X4 es L. En algunas modalidades, un péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X4 es A.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X5 es L. En algunas modalidades, un péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X5 es I. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X5 es V.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X7 es T.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X8 es L. En algunas modalidades, un péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X8 es A.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X9 es A. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X9 es V. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X9 es I. En algunas modalidades, el péptido de mimilina
comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X9 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X9 es T. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X9 es L.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X10 es L. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X10 es A. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X10 es V. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X10 es I.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X12 es R. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X12 es H. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X12 es K.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X15 es A. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X15 es Q. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X15 es E. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X15 es e, donde e es la isoforma d del ácido glutámico. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X15 es T.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X19 es E. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X19 es R. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X19 es K.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X20 es L. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X20 es I. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X20 es V.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X21 es A. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X21 es Q. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X21 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X21 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X21 es E. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X21 es T.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X23 es Y. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X23 es L.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X27 es E. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X27 es Q. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X27 es G. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X27 es K.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X30 es P. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X20 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X30 es T.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X31 es E. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X31 es Q. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X31 es G. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X31 es A. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X31 es P. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X31 es K.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X32 es T. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X32 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X32 es H. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X32 es P. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X32 es A.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X33 es Y. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X33 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X16 es H. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X33 es F. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X16 es L. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X33 es S. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X33 es G. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X33 es A.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A o 1B, en donde X34 es R. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A o 1B, en donde X34 está eliminado.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde uno o todos de X5, X10, X13, X17, X20 y X23 son L. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde al menos cuatro de X5, X10, X13, X17, X20 y X23 son L. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde al menos tres de X5, X10, X13, X17, X20 y X23 son L.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde X12 y/o X25 es R. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, en donde uno o todos de X5, X10, X13, X17, X20 y X23 son L y en donde X12 y/o X25 es R.
En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, que no comprende ninguna N. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, que no comprende ninguna Q. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, que no comprende ninguna C. En algunas modalidades, el péptido de mimilina comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1A, 1B o 1C, que no comprende ningún puente disulfuro.
En algunas modalidades, el derivado de mimilina está representado por los compuestos enumerados en la Tabla 1. Los nombres de los compuestos, como se usan en la presente, se enumeran en la Tabla 1 que indica las modificaciones con relación a la SEQ ID NO: 1 (también denominada mimilina en la presente descripción) y la cadena lateral así como también el sitio de unión de la cadena lateral al péptido de mimilina. La Tabla 1 describe el número del compuesto (Ej. #) y el nombre del compuesto. La Tabla 2 indica las modificaciones con relación a la mimilina en los péptidos de mimilina, es decir, los péptidos de mimilina, que se derivatizan con una cadena lateral con respecto a los derivados de mimilina enumerados en la Tabla 1. El Ej. #1 en la Tabla 1 es la SEQ ID NO: 1 y no está derivatizado como también lo indica el nombre.
T l 1- D riv mimilin m m l
En algunas modalidades, el péptido de mimilina está representado por los compuestos enumerados en la Tabla 2, en donde la Tabla 2 indica las modificaciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1, también denominada mimilina. La Tabla 2 indica las modificaciones con relación a la mimilina en los péptidos de mimilina, es decir, los péptidos de mimilina, que se derivatizan con una cadena lateral para formar los derivados de mimilina enumerados en la Tabla 1. La Tabla 2 representa los análogos de mimilina que se han derivatizado, lo que da como resultado el derivado de mimilina correspondiente representado en la Tabla 1. Por tanto, el compuesto en el Ej. #8 en la Tabla 1 o 3, respectivamente, es un derivado de un análogo de mimilina que se ha modificado con los aminoácidos como se indica en la Tabla 2 o 4 como Ej. # 8cp
Tabla 2- péptidos de mimilina (cadenas principales)
En algunas modalidades, el derivado de mimilina que comprende un péptido de mimilina con hasta 11 modificaciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1 (mimilina) está representado por los compuestos enumerados en la Tabla 3. Las Tablas 2 y 4, respectivamente, representan los análogos de mimilina que se han derivatizado, lo que da como resultado el derivado de mimilina correspondiente representado en la Tabla 1 o 3 respectivamente. Por tanto, el compuesto en el Ej. #8 en la Tabla 1 o 3, respectivamente, es un derivado de un análogo de mimilina que se ha modificado con los aminoácidos como se indica en la Tabla 2 o 4 como el Ej. #8cp.
Tabla 3- Derivados de mimilina (compuestos de mimilina) que comprenden cadenas principales de mimilina con hasta 11 modificaciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1
En algunas modalidades, el péptido de mimilina con hasta 11 modificaciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1 (mimilina) está representado por los compuestos enumerados en la Tabla 4. Por tanto, el compuesto en el Ej. #8 en la Tabla 1 o 3, respectivamente, es un derivado de un análogo de mimilina que se ha modificado con los aminoácidos como se indica en la Tabla 2 o 4 como el Ej. #8cp.
Tabla 4: péptidos de mimilina (cadenas principales (cp)) con hasta 11 modificaciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1
En una modalidad, los derivados de mimilina de esta invención pueden presentarse por su fórmula de estructura como se presenta en la Tabla 5.
Tabla 6- estructura nombres de las cadenas laterales
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina que comprende hasta 11, preferentemente, 10, 9, 8 o 7, con la máxima preferencia, 6, 5, 3, 2 o 1 de los siguientes aminoácidos o modificaciones con relación a la SEQ ID NO: 1:
a. E o ningún aminoácido en la posición -1,
b. E, A o ningún aminoácido en la posición 1,
c. A, L o P en la posición 2,
d. S o P en la posición 3,
e. E, P, K, Q o G en la posición 4,
f. L, V, I o H en la posición 5,
g. S, T o H en la posición 6,
h. T en la posición 7,
i. L o A en la posición 8,
j. A, V, I, S o T en la posición 9,
k. L, A, I, H o V en la posición 10,
l. G en la posición 11,
m. R, H o K en la posición 12,
n. L en la posición 13,
o. S, T o E en la posición 14,
p. A, Q, E, e o T en la posición 15,
q. E, R, K o Q en la posición 16,
r. L o I en la posición 17,
s. H o A en la posición 18,
t. E, R o K en la posición 19,
u. L, I o V en la posición 20,
v. A, Q, S, E o T en la posición 21,
w. T en la posición 22,
x. L o Y en la posición 23,
y. P en la posición 24,
z. R, P, H o K en la posición 25,
aa. T en la posición 26,
bb. E, Q, G o K en la posición 27,
cc. T o P en la posición 28,
dd. G en la posición 29,
ee. P, S o T en la posición 30,
ff. E, Q, G, A, P o K en la posición 31,
gg. T, S, H, P o A en la posición 32,
hh. P, Y, H, F, L, S, G o A en la posición 33,
ii. G o K en la posición 34 o ningún aminoácido.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina que comprende hasta 11, preferentemente, 10, 9, 8 o 7, con la máxima preferencia, 6, 5, 3, 2 o 1 de los siguientes aminoácidos o modificaciones con relación a la SEQ ID NO: 1:
a. E o ningún aminoácido en la posición -1,
b. E en la posición 1,
c. A, L o P en la posición 2,
d. S o P en la posición 3,
e. E, P, K, Q o G en la posición 4,
f. L, V, I o H en la posición 5,
g. S en la posición 6,
h. T en la posición 7,
i. A en la posición 8,
j. A, V o I en la posición 9,
k. L o I en la posición 10,
l. G en la posición 11,
m. R, H o K en la posición 12,
n. L en la posición 13,
o. S, T o E en la posición 14,
p. A en la posición 15,
q. E en la posición 16,
r. L o I en la posición 17,
s. H o A en la posición 18,
t. E en la posición 19,
u. L en la posición 20,
v. A en la posición 21,
w. T en la posición 22,
x. L o Y en la posición 23,
y. P en la posición 24,
z. R en la posición 25,
aa. T en la posición 26,
bb. E en la posición 27,
cc. T o P en la posición 28,
dd. G en la posición 29,
ee. P, S o T en la posición 30,
ff. E o G en la posición 31,
gg. T o S en la posición 32,
hh. P o Y en la posición 33,
ii. G o K en la posición 34 o ningún aminoácido.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina, en donde el residuo de aminoácido en la posición 30 es S y el residuo de aminoácido en la posición 31 es G, en donde la numeración de aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina en donde el residuo de aminoácido en la posición 9 es V y/o el residuo de aminoácido en la posición 1 es E, en donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina en donde el residuo de aminoácido en la posición 33 es P, en donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina con una amida C-terminal.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina que se derivatiza en el aminoácido N-terminal o cualquier K dentro de dicha secuencia del péptido de mimilina.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina que no comprende un puente disulfuro entre los aminoácidos en las posiciones 2 y 8, en donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de 5 mimilina que se derivatiza con una cadena lateral que comprende un resto prolongados y un enlazador, en donde dicho enlazador se selecciona, preferentemente, de la lista de gGlu, gGlu-OEG, gGlu-OEG-OEG, gGlu-OEG-OEG-OEG, gGlu-OEG-OEG-OEG-OEG, gGlu-OEG-OEG-OEG- OEG-OEG.
El agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina puede comprender un péptido de mimilina 10 que se derivatiza con una cadena lateral que comprende un resto prolongador, en donde dicho resto prolongador es un ácido graso o diácido que comprende, preferentemente, entre 14 y 20 átomos de carbono.
El compuesto de mimilina puede seleccionarse de los compuestos enumerados en la siguiente tabla (Tabla 16), en donde la mimilina es la SEQ ID NO: 1:
El compuesto de mimilina puede seleccionarse de los compuestos enumerados en la siguiente tabla (Tabla 9), en donde mimilina es la SEQ ID NO: 1:
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método para el control del peso que hace uso de un péptido de mimilina o derivado o una formulación farmacéutica, coformulación o cotratamiento de uno cualquiera de los aspectos numerados no limitantes de esta invención. En algunas modalidades, la invención se refiere a un método para la reducción del apetito que hace uso de un péptido de mimilina o derivado o una formulación farmacéutica, coformulación o cotratamiento de uno cualquiera de los aspectos numerados no limitantes de esta invención. En algunas modalidades, la invención se refiere a un método para la reducción de la ingestión de alimentos que hace uso de un péptido de mimilina o derivado o una formulación farmacéutica, formulación conjunta o tratamiento conjunto de uno cualquiera de los aspectos numerados no limitantes de esta invención.
En la presente descripción se describe el uso de un péptido o derivado de mimilina, o una formulación farmacéutica que lo comprende para el tratamiento o la prevención de la obesidad. En algunas modalidades, el sujeto que padece de obesidad es un ser humano, tal como un adulto o un menor (que incluye lactantes, niños y adolescentes). Un sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >30; este sujeto puede referirse, además, como obeso. En algunas modalidades el sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >35 o un IMC en el intervalo de >30 a <40. En algunas modalidades la obesidad es obesidad severa u obesidad mórbida, en donde el sujeto humano puede tener un IMC de >40.
En la presente descripción se describe el uso de un péptido o derivado de mimilina, o una formulación farmacéutica que lo comprende para el tratamiento o la prevención del sobrepeso, opcionalmente, en presencia de al menos una comorbilidad relacionada con el peso. En algunas modalidades el sujeto que padece de sobrepeso es un ser humano, tal como un ser humano adulto o un ser humano pediátrico (que incluye bebés, niños y adolescentes). En algunas modalidades, el sujeto humano que padece de sobrepeso puede tener un IMC de >25, tal como un IMC de >27. En algunas modalidades, el sujeto humano que padece de sobrepeso tiene un IMC en el intervalo de 25 a <30 o en el intervalo de 27 a <30. En algunas modalidades la comorbilidad relacionada con el peso se selecciona del grupo que consiste en hipertensión, diabetes (tal como diabetes tipo 2), dislipidemia, colesterol alto y apnea obstructiva del sueño.
En la presente descripción se describe el uso de un péptido o derivado de mimilina, o una formulación farmacéutica que lo comprende para la reducción del peso corporal. Un ser humano que va a someterse a una reducción del peso corporal puede tener un IMC >25, tal como un IMC de >27 o un IMC de >30. En algunas modalidades el ser humano que va a someterse a una reducción del peso corporal puede tener un IMC de >35 o un IMC de >40. El término "reducción del peso corporal" puede incluir el tratamiento o la prevención de la obesidad y/o el sobrepeso.
Definiciones
Un agonista del receptor puede definirse como un péptido o análogo que se une a un receptor e induce una respuesta típica del ligando natural. Un agonista completo puede definirse como uno que induce una respuesta de la misma magnitud que el ligando natural (ver, por ejemplo, “Principles of Biochemistry“, AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Segunda edición, Worth Publishers, 1993, página 763).
Por tanto, por ejemplo, un “agonista del receptor de amilina’’ puede definirse como un compuesto que es capaz de unirse al receptor de amilina y es capaz de activarlo. Y un agonista del receptor de amilina "completo" puede definirse como un agonista del receptor de amilina que es capaz de inducir una magnitud de la respuesta del receptor de amilina que es similar a la amilina nativa. Un agonista del receptor de amilina también será a menudo un agonista del receptor de calcitonina. Ejemplos de agonistas del receptor de amilina son amilina, pramlintida y calcitonina humanas.
El término “amilina humana”, como se usa en la presente, se refiere al polipéptido de amilina humana que tiene la secuencia
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO: 2)
cuya estructura puede mostrarse como
El término “pramlintida” como se usa en la presente se refiere al péptido que tiene la secuencia
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 3)
cuya estructura puede mostrarse como
La pramlintida tiene un puente disulfuro entre los dos residuos de Cys y un grupo amida C-terminal.
El término “calcitonina” significa calcitonina de salmón o calcitonina humana.
El término “calcitonina de salmón” o “sCT” significa la secuencia de proteína nativa de la calcitonina de salmón como se describe en Niall y otros (1969), Biochemistry vol 64, Figura 2. La calcitonina de salmón es un polipéptido que consiste de 32 aminoácidos y la secuencia
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO: 4)
cuya estructura puede mostrarse como
Tiene un puente disulfuro entre el primer y el séptimo aminoácido en el extremo amino terminal de la cadena polipeptídica y un grupo de prolinamida en el aminoácido carboxilo terminal que es esencial para su actividad biológica.
El término “calcitonina humana” significa la secuencia de proteína nativa de la calcitonina humana como se describe en Niall y otros (1969), Biochemistry vol 64, Figura 2. La calcitonina humana es un polipéptido que consiste de 32 aminoácidos y la secuencia
CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO: 5)
cuya estructura puede mostrarse como
Tiene un puente disulfuro entre el primer y el séptimo aminoácido en el extremo amino terminal de la cadena polipeptídica, donde el puente disulfuro es esencial para su actividad biológica y un grupo de prolinamida en el aminoácido carboxilo terminal.
El término “mimilina” como se usa en la presente se refiere a la proteína con la secuencia EASELSTAALGRLSAELHELATLPRTETGPESP (SEQ ID NO: 1)
La mimilina es un nuevo agonista del receptor de amilina y calcitonina, con menos del 60 % de identidad de secuencia con respecto a la calcitonina de salmón y no tiene puentes disulfuro.
El término “análogo” como se usa en la presente describe un péptido que comprende una o más modificaciones de aminoácidos, tales como, pero no limitado a, sustitución y/o una o más deleciones y/o una o más adiciones de uno cualquiera de los residuos de aminoácidos por cualquier aminoácido natural o no natural, aminoácidos sintéticos o peptidomiméticos y/o la unión de una cadena lateral a uno cualquiera de los aminoácidos naturales o no naturales, aminoácidos sintéticos o peptidomiméticos en cualquier posición disponible. La adición o deleción de residuos de aminoácidos puede tener lugar en el N-terminal del péptido y/o en el C-terminal del péptido.
Por tanto, el término “análogo de mimilina” como se usa en la presente se refiere a un péptido, en donde uno o más aminoácidos se han modificado con relación a la SEQ ID NO: 1. El término “péptido de mimilina” como se usa en la presente se refiere al grupo de compuestos que comprenden mimilina o un análogo de la misma. Por lo tanto, el término “péptido de mimilina” también cubrirá el término “cadena principal" y “polipéptidos".
Cuando se usa en la presente descripción el término “aminoácido natural” es un aminoácido (con los habituales códigos de tres letras y códigos de una letra entre paréntesis) seleccionados del grupo que consiste en: Glicina (Gly y G), prolina (Pro y P), alanina (Ala y A), valina (Val y V), leucina (Leu y L), isoleucina (ile y I), metionina (Met y M), cisteína (Cys y C), fenilalanina (Phe y F), tirosina (Tyr y Y), triptófano (Trp y W), histidina (His y H), lisina (Lys y K), arginina (Arg y R), glutamina (Gln y Q), asparagina (Asn y N), ácido glutámico (Glu y E), ácido aspártico (Asp y D), serina (Ser y S) y treonina (Thr y T). Si en alguna parte de esta invención se hace referencia a un péptido, análogo o
derivado de mimilina o péptidos que comprenden o no comprenden G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, H, K, R, Q, N, E, D, S o T, se entiende, sin especificar más, aminoácidos. Si no se indica de cualquier otra manera, los aminoácidos indicados con un código de una sola letra en mayúsculas indican la isoforma L; sin embargo, si el aminoácido se indica con una letra minúscula, este aminoácido se usa/aplica como su forma D.
Si, debido a errores de escritura, hay desviaciones de los códigos de uso común, se aplican los códigos usados comúnmente. Los aminoácidos presentes en los péptidos de mimilina descritos en la presente descripción son, preferentemente, aminoácidos que pueden codificarse por un ácido nucleico.
Si el análogo contiene más de 33 residuos de aminoácidos o menos de 33 residuos de aminoácidos, el experto aún puede alinear esa secuencia con la secuencia de la mimilina (SEQ ID NO: 1) para determinar el número de colocación del respectivo residuo de aminoácido correspondiente. Un método para la determinación de la “identidad de secuencia” entre dos análogos, los dos péptidos mimilina y [23Y, 30S, 31G]mimilina (es decir, Ej.# 24cp) se alinean. La identidad de secuencia del análogo de mimilina con relación a la mimilina viene dada por el número de residuos idénticos alineados menos el número de residuos diferentes dividido por el número total de residuos en la mimilina (es decir, SEQ ID NO: 1) En consecuencia, en dicho ejemplo la identidad de secuencia es (33-3)/33. Puede ensayarse un programa de alineamiento adecuado con un programa de alineamiento adecuado como "needle", que es un alineamiento de Needleman-Wunsch. El algoritmo para este programa de alineamiento se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453.
En la secuencia de numeración de la SEQ ID NO: 1, y de acuerdo con la práctica establecida en la técnica, al residuo de aminoácido en el ácido glutámico (E) N-terminal se le asigna el núm. 1 y los residuos de aminoácidos subsecuentes se numeran consecutivamente, con el final en el C-terminal donde a la prolina (P) se le asigna el núm. 33. Por lo tanto, generalmente, cualquier referencia en la presente descripción al número de la posición de un residuo de aminoácido proporciona su ubicación en una secuencia de 33 aminoácidos; donde dicha secuencia de 33 aminoácidos es un análogo de mimilina. Por ejemplo, una referencia a un análogo modificado en la posición 14 puede referirse a un análogo en donde se ha modificado el 14to residuo amino de los 33 aminoácidos en el análogo.
En otras palabras, la numeración de la secuencia de aminoácidos del análogo proporciona la posición de cada análogo con respecto a una secuencia de 33 aminoácidos, en donde la numeración es consecutiva y ascendente en la dirección del N-terminal al C-terminal.
Los análogos pueden describirse por referencia al número del residuo de aminoácido en la mimilina (SEQ ID NO: 1) que se modifica, es decir, por su posición, y la naturaleza de la modificación. Los siguientes son ejemplos no limitantes de nomenclatura apropiada de los análogos.
Por ejemplo:
[I9]-mimilina designa un análogo de mimilina (mimilina) en donde el cambio de mimilina es la sustitución de la posición 9 de A por I, como en el ejemplo del compuesto 10. Un ejemplo también puede ser la designación des1 en relación con un análogo de mimilina, que se refiere a un análogo en el que se ha eliminado el aminoácido N-terminal ácido glutámico. Un análogo de mimilina, donde se ha eliminado el aminoácido N-terminal, también puede designarse des1 mimilina.
[des1, 4K, 30S, 31G]mimilina designa un análogo de mimilina (mimilina), en el que la E en la posición 1 se ha eliminado y la E en la posición 4 se ha sustituido por K, P en la posición 30 con S y E en la posición 31 con G.
Si se añade un aminoácido adicional, tal como el ácido glutámico (E) al N-terminal en la posición antes de la posición 1, el cambio de aminoácido se indicará como -1E, porque no existe la posición 0. En los aspectos esto puede describirse con el término que no hay aminoácido presente en la posición -1, por lo que el término “ningún aminoácido” como se usa en la presente es equivalente al término “ausente”, lo que significa que la posición a la que se hace referencia simplemente no comprende ningún residuo de aminoácido.
Por tanto, el análogo del derivado del compuesto 83 (Ej. #83) se denomina como sigue: [-1E, 1A, 23Y, 30S, 31G]mimilina y, por lo tanto, describe una secuencia en la que E se añade al aminoácido N-terminal, el aminoácido N-terminal se modifica de un E a A, P de la posición 30 en la SEQ ID NO: 1 se sustituye con S y E en la posición 31 de la SEQ ID NO: 1 se sustituye con G.
En péptidos de mimilina, tal como Ej. #130cp la indicación de 23aQ, 23bT, 23cY significa que QTY se ha insertado entre la posición 23 y la posición 24 del aminoácido con respecto a la numeración de la SEQ ID NO: 1 y el aminoácido en la posición 23 es el aminoácido original; L. La secuencia del péptido de mimilina 1300cp es por lo tanto; ASGLSTAVLGRLSQELHELQTLQTYPRTETGSQTY (SEQ ID NO: 130).
Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, los residuos de aminoácidos pueden identificarse por su nombre completo, su código de una letra y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son totalmente equivalentes.
Las expresiones "conforme a” , "corresponde a” , "una posición equivalente a” o "posición correspondiente", como se usa en la presente, pueden usarse para caracterizar el sitio de modificación en un análogo de mimilina por referencia a la SEQ ID NO: 1. Las posiciones equivalentes, idénticas o correspondientes se deducen fácilmente, por ejemplo, por simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptido de mimilina, tal como "needle" que se basa en un alineamiento de Needleman-Wunsch. El algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa align por Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -0.5.
La denominación de los derivados en la presente descripción se realizó de la siguiente manera:
[Y(C)aa1X(S)aa2]P (Fórmula 1), en donde P es el péptido (tal como, por ejemplo, mimilina), aa1 y aa2 describen una, más o ninguna modificación de aminoácidos de dicho péptido, (S) describe la cadena lateral que está unida al péptido y X describe el sitio de unión. Por tanto, X en la fórmula 1 puede indicar N-terminal, cuando la cadena lateral (S) está unida en el N-terminal o en una posición específica tal como K4, que después ejemplificada para un derivado de mimilina se referiría a una sustitución del aminoácido E con K en la posición 4 correspondiente a la SEQ ID NO: 1, a la que se une la cadena lateral (S). Y(C) en la fórmula 1 puede colocarse a lo largo de la secuencia, siempre que sea relevante e indica si están presentes modificaciones adicionales de la secuencia de aminoácidos de naturaleza química; Y indica la colocación, por lo que “c-terminal (-)” indica que el cambio químico está presente en el c-terminal. El (-) de “c-terminal (-) significa “ácido””, por tanto “c-terminal(-)” significa ácido c-terminal. Si se menciona “N-
terminal(acetil)” en la denominación, esto significa que un acetil está presente en el N-terminal en lugar del grupo alfa amino regular. Si C es “c-terminal (-)”, el extremo c-terminal del péptido es un ácido c-terminal en lugar de una amida c-terminal. Si no se hace ninguna indicación de “c-terminal (-)” en el nombre del derivado, el cterminal de los derivados son amidas c-terminales.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de nomenclatura apropiada de los análogos.
[N-terminal(diácido C18-gGlu)]mimilina designa un derivado de mimilina, en donde mimilina en el extremo N-terminal con una cadena lateral comprende un diácido C18 como resto prolongador y gGlu como enlazador.
[N-terminal(diácido C18-gGlu) 2P, 9V]mimilina designa un derivado de mimilina, en donde un análogo de mimilina que comprende la modificación 2P y 9V, con relación a la numeración de la SEQ ID NO: 1 se derivatiza en el N-terminal con una cadena lateral que comprende un diácido C18 como resto prolongador y gGlu como enlazador.
El péptido de mimilina puede comprender una o más cadenas laterales en uno o más de los residuos de aminoácidos. Dichos péptidos de mimilina también pueden denominarse derivados de mimilina o derivados de calcitonina de salmón.
El término "derivado” como se usa en la presente se refiere a un péptido modificado químicamente, en el que una o más cadenas laterales se han unido covalentemente al péptido. El término "cadena lateral” puede también referirse a un "sustituyente”. Por tanto, un derivado que comprende dichas cadenas laterales será un péptido "derivatizado” o análogo "derivatizado”.
El término “compuesto de mimilina”, como se usa en la presente, se refiere a los análogos y derivados que comprenden una cadena principal que hace referencia a la cadena principal de mimilina. Tales como, pero no limitado a, los compuestos de la Tabla 1 y 4.
En una modalidad particular, la cadena lateral es capaz de formar agregados no covalentes con la albúmina y por tanto también puede denominarse como "resto de unión a albúmina” , lo que promueve de esta manera la circulación del derivado con la corriente sanguínea, y también tiene el efecto de prolongar el tiempo de acción del derivado, debido al hecho de que el agregado del derivado de mimilina y la albúmina se desintegran solo lentamente para liberar el ingrediente farmacéutico activo. Por tanto, "sustituyente” o "cadena lateral” como un todo, se denomina, preferentemente, como un "resto de unión a albúmina”.
El término “resto de unión a albúmina” como se usa en la presente se refiere a cualquier grupo químico capaz de unirse no covalentemente a la albúmina, es decir tiene afinidad de unión por la albúmina. En algunas modalidades el resto de unión a albúmina comprende un grupo acilo.
En otra modalidad particular la cadena lateral comprende una porción que es particularmente relevante para la unión a albúmina y de esta manera la prolongación, cuya porción puede referirse en consecuencia como un "resto de prolongación” o "prolongador”. El resto de prolongación puede estar cerca del, preferentemente en el, extremo terminal (o distal, o libre) del resto de unión a albúmina, con relación a su punto de unión al péptido.
En aún otra modalidad particular adicional, el resto de unión a albúmina comprende una porción entre la porción de prolongación y el punto de unión al péptido, cuya porción puede referirse como un “enlazador”, "resto enlazador”, "espaciador” o similar. El enlazador puede ser opcional y, por lo tanto, en ese caso la cadena lateral puede ser idéntica al resto de prolongación.
El resto de unión a albúmina, el resto de prolongación o el enlazador pueden unirse covalentemente a un residuo de lisina del péptido de mimilina por acilación, es decir, mediante un enlace amida formado entre un grupo de ácido carboxílico de este (del resto de unión a albúmina, el resto de prolongación o el enlazador) y un grupo amino del residuo de lisina o residuo de aminoácido en el N-terminal. La conjugación química adicional o alternativa incluye la alquilación, formación de éster o formación de amida, o acoplamiento a un residuo de cisteína, tal como por acoplamiento de maleimida o haloacetamida (tal como bromo-/fluoro-/yodo-).
En una modalidad preferida, un éster activo del resto de unión a albúmina, que comprende, preferentemente, un resto de prolongación y un enlazador, se une covalentemente a un grupo amino de un residuo de lisina, preferentemente, el grupo épsilon amino de este, bajo la formación de un enlace de amida, como se explicó anteriormente.
A menos que se indique de cualquier otra manera, cuando se hace referencia a una acilación de un residuo lisina o aminoácido N-terminal, se entiende que es al grupo épsilon-amino de dicho residuo de lisina o grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal.
El término “grupo épsilon amino” o “grupo £-amino”, usado en la presente descripción en relación con la lisina, se refiere al grupo amino en la posición 6, mediante el uso de las convenciones de numeración estándar de IUPAC. El término “grupo alfa amino” o “grupo a-amino” se refiere al grupo amino en la posición 2, mediante el uso de las convenciones de numeración estándar de IUPAC. Nos referimos a la siguiente estructura.
grupo épsilon amino
grupo alfa a mino
El término “enlazador” como se usa en la presente incluye cadenas laterales adecuadas que pueden unir un resto, tal como un resto químico, al péptido de mimilina, tal como la cadena principal del péptido de mimilina. Por tanto, el enlazador y el resto químico se convierten en una cadena lateral juntos. El resto unido al enlazador puede ser cualquier resto adecuado. Los ejemplos incluyen un resto de unión a albúmina.
Un enlazador como se usa en la presente proporciona un puente o enlace entre un grupo amino en la cadena principal del péptido de mimilina y un grupo acilo en el resto, tal como un resto de unión a albúmina. El enlazador puede estar unido o cerca del residuo de aminoácido N terminal. Preferentemente, el enlazador está unido al aminoácido en la posición 1 del análogo de mimilina.
Otro ejemplo de un enlazador es una combinación de al menos un aminoácido y una amina.
La fórmula de otro enlazador adecuado, OEG, se muestra más abajo:
El enlazador puede contribuir a y/o potenciar el efecto de unión del resto (por ejemplo, el resto de unión a albúmina), por ejemplo, un enlazador que comprende yGlu puede potenciar el efecto de unión a albúmina del péptido de mimilina.
Al usar el término “yGlu” o “gGlu” o “gammaGlu” o “gamma-L-Glu” se entiende un aminoácido con la siguiente estructura y usados indistintamente en la presente descripción (también se muestra en la Figura 2):
Al usar el término “yGlu-OEG” se entiende un resto con la siguiente estructura:
Al usar el término “yGlu-OEG-OEG” se entiende un resto con la siguiente estructura:
El término "ácido graso" se refiere a ácidos monocarboxílicos alifáticos que tienen de 4 a 28 átomos de carbono, es preferentemente no ramificado, y puede ser saturado o insaturado. En la presente invención se prefieren los ácidos grasos que comprenden de 10 a 16 aminoácidos.
El término "diácido graso" se refiere a ácidos grasos como se definió anteriormente, pero con un grupo ácido carboxílico adicional en la posición omega. Por tanto, los diácidos grasos son ácidos dicarboxílicos. En la presente invención se prefieren los ácidos grasos que comprenden de 14 a 20 aminoácidos.
El término “sustituyante” o “cadena lateral”, como se usa en la presente, significa cualquier resto adecuado unido, en particular unido covalentemente, a un residuo de aminoácido, en particular a cualquier posición disponible en un residuo de aminoácido. Típicamente, el resto adecuado es un resto químico.
La “afinidad de unión a albúmina” puede determinarse por varios métodos conocidos en la técnica. En un método, el compuesto a evaluar se radiomarca con, por ejemplo, 125I o 3H y se incuban con albúmina inmovilizada (Kurtzhals y otros, Biochem.J., 312, 725-731 (1995)). Se calcula la unión del compuesto con relación a un estándar. En otro método, un compuesto relacionado se radiomarca y su unión a la albúmina inmovilizada en, por ejemplo, perlas de SPA, compite con una serie de diluciones del compuesto a probar. El valor de EC50 para la competencia es una medida de la afinidad del compuesto. En un tercer método, la afinidad o potencia del receptor de un compuesto se mide a diferentes concentraciones de albúmina, y el cambio en la afinidad o potencia relativa del compuesto en función de la concentración de albúmina refleja su afinidad por la albúmina.
El término “puente disulfuro” puede usarse indistintamente para el término “enlace disulfuro” .
Los péptidos de mimilina descritos en la presente descripción exhiben una buena potencia. El término “potencia” se usa para describir el efecto de un compuesto dado en ensayos donde se ha establecido una relación sigmoidal entre la concentración logarítmica y el efecto de un compuesto. Además, la respuesta debe ser variable de 0 a 100 %. La EC(concentración efectiva)50 puede usarse para describir la concentración de un compuesto dado que produce una respuesta del 50 % en el ensayo, tal como en el ensayo funcional.
Los péptidos de mimilina descritos en la presente descripción exhiben una buena actividad. El término “actividad” se refiere a la capacidad de reducir el apetito y/o aumentar la saciedad. La actividad puede medirse por la capacidad de reducir el apetito como, por ejemplo, se describe en el Ensayo (I) en la presente descripción.
Los péptidos de mimilina descritos en la presente descripción exhiben una buena estabilidad física. El término “estabilidad física” de un péptido de mimilina de acuerdo con la invención, o una formulación de este se refiere a la tendencia del péptido de mimilina a no formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles como un resultado de exponer a estrés termomecánico y/o a la interacción con interfaces y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies e interfaces hidrófobas. La estabilidad física de las formulaciones de péptidos de mimilina acuosas puede evaluarse por medio de inspección visual, ensayo de fibrilación de ThT (a veces denominado ensayo de fibrilogénesis ThT) y/o mediciones de turbidez como se describe en otra parte en la presente descripción. La inspección visual de las formulaciones se realiza en una luz nítida enfocada con un fondo oscuro. La turbidez de la formulación se caracteriza por una puntuación visual que clasifica el grado de turbidez, por ejemplo, en una escala de 0 a 3 (una formulación que no muestra turbidez corresponde a una puntuación visual de 0 y una formulación que muestra turbidez visual a la luz del día corresponde a una puntuación visual de 3). Una formulación se clasifica como inestable físicamente con respecto a la agregación de proteínas, cuando muestra turbidez visual a la luz del día. Alternativamente, la turbidez de la formulación puede evaluarse mediante mediciones simples de turbidez bien conocidas por el experto.
Los péptidos de mimilina descritos en la presente descripción exhiben una buena estabilidad química. El término “estabilidad química” de un péptido de mimilina de acuerdo con la invención o de una formulación de este se refiere a la ausencia de cambios covalentes químicos en la estructura del péptido de mimilina, lo que evita por lo tanto la formación de productos de degradación química con potencialmente menor potencia y/o propiedades inmunogénicas potencialmente aumentadas en comparación con la estructura del péptido de mimilina parental (natural). Pueden formarse diversos productos de degradación química en dependencia del tipo y la naturaleza del péptido de mimilina parental y del entorno al que se expone el péptido de mimilina. La degradación química puede probablemente no evitarse completamente y a menudo se observan cantidades aumentadas de productos de degradación química durante el almacenamiento y el uso de las formulaciones peptídicas como se conoce bien por el experto en la técnica. La mayoría de los péptidos son propensos a la desamidación, un proceso en el que se hidroliza el grupo amida de cadena lateral en residuos glutaminilo o asparaginilo para formar un ácido carboxílico libre. Otras rutas de degradación implican la formación de productos de transformación de alto peso molecular donde dos o más moléculas peptídicas se unen covalentemente entre sí mediante transamidación y/o interacciones disulfuro que conducen a la formación de productos de degradación de dímeros, oligómeros y polímeros unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. y Manning M.C., Plenum Press, Nueva York 1992). La oxidación (de, por ejemplo, residuos de metionina) puede mencionarse como otra variante de degradación química. La estabilidad química de la formulación de péptido de mimilina puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos puntos temporales después de la exposición a diferentes condiciones ambientales (a menudo la formación de productos de degradación puede acelerarse, por ejemplo, mediante el aumento de la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual a menudo se determina por separación de los productos de degradación en dependencia del tamaño de la molécula y/o la carga mediante el uso de diversas técnicas de cromatografía (por ejemplo, SEC-HPLC y/o RP-HPLC).
Aunque determinadas características de la invención se han ilustrado y descrito en la presente descripción, muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes serán evidentes para los expertos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de compuesto de GLP-1 incluyen un GLP-1 natural, un análogo de GLP-1 o un derivado de GLP-1. En su sentido más amplio, el término "GLP-1 natural" se refiere a una molécula de origen natural de la familia de péptidos del glucagón o de la familia de las exendinas. La familia de péptidos del glucagón está codificada por el gen de preproglucagón y abarca tres péptidos pequeños con un alto grado de homología, es decir, glucagón (1 -29), GLP-1 (1-37) y GLP-2 (1-33). El término “GLP-1 natural” también se refiere al GLP-1(7-37) humano, cuya secuencia se describe como SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2006097537 y se incluye en la presente descripción como referencia, y al GLP-1(7-36)NH2 humano. Las exendinas son péptidos expresados en lagartos y, como el GLP-1, son insulinotrópicas. Ejemplos de exendinas de origen natural son la exendina-3 y la exendina-4.
En una modalidad particular, el término "GLP-1 natural" se refiere a glucagón (1-29), GLP-1 (1-37) y GLP-2 (1-33), el GLP-1 (7-37) humano), el GLP-1(7-36)NH2 humano, exendina-3 y exendina-4.
En una modalidad particular, el término “compuesto GLP-1” no incluye el GLP-1 (7-36) NH2 humano. En una modalidad particular, el término “compuesto de GLP-1” no incluye el GLP-1(7-37) humano.
En una modalidad particular, el término “compuesto de GLP-1” no incluye el glucagón.
En una modalidad particular, el término “compuesto de GLP-1” no incluye el GLP-1(7-36)NH2 humano y el glucagón 0 no incluye GLP-1(7-36)NH2 humano, GLP-1(7-37) humano y glucagón.
En una modalidad más particular, el término “GLP-1 natural” solo se refiere al GLP-1(7-37) humano.
En su sentido más amplio, el término “análogo de GLP-1” “análogo a GLP-1” como se usa en la presente se refiere a un análogo de un GLP-1 natural. No incluye un GLP-1 natural tal como se define en la presente descripción. En particular, el término “análogo de GLP-1” no incluye glucagón (1-29), GLP-1 (1-37) y GLP-2 (1-33), el GLP-1(7-37) humano), el GLP-1(7-36)NH2 humano, exendina-3 y exendina-4.
En una modalidad particular, el término “análogo de GLP-1” o “análogo de GLP-1” como se usa en la presente se refiere a un análogo de GLP-1(7-37) o GLP-1(7-36)NH2 humano. Ejemplos no limitantes de análogos de GLP-1 comprenden exenatida y taspoglutida. En una modalidad particular, los “análogos de GLP-1” comprenden análogos con un máximo de 17 modificaciones de aminoácidos (es decir, se han modificado hasta 17 aminoácidos en total, donde los cambios pueden ser sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos) en comparación con un GLP-1 natural de referencia o, en particular, en comparación con GLP-1-(7-36)NH2 o GLP-1(7-37) humanos.
Debe entenderse que todos los aminoácidos para los que no se indica el isómero óptico son el isómero L.
En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o análogo de GLP-1 comprende un máximo de 17 aminoácidos que se han modificado (sustituidos, eliminados, añadidos o cualquier combinación de estas) con respecto a un GLP-1 natural de referencia o, en particular, en relación con GLP-1-(7-36)NH2 o GLP-1(7-37) humanos. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 15 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP
1 comprende un máximo de 10 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 8 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 7 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 6 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 5 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 4 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 3 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, un compuesto de GLP-1 o un análogo de GLP-1 comprende un máximo de 2 aminoácidos que se han modificado. En modalidades de la invención, se ha modificado 1 aminoácido con relación a un GLP-1 natural de referencia o, en particular, con respecto a GLP-1-(7-36)NH2 o GLP-1 (7-37) humanos. En una modalidad particular, las modificaciones de aminoácidos de este párrafo son con relación al GLP-1(7-37) humano.
En una modalidad particular, los análogos de GLP-1 comprenden una sustitución del residuo de aminoácido en la posición 34 de Lys a Arg, es decir, Arg34, en comparación con GLP-1(7-37) o GLP-1-(7-36)NH2. En una modalidad particular, los análogos de GLP-1 tienen una sustitución del residuo de aminoácido en la posición 8 de Ala a Aib (ácido alfa-amino-isobutírico), es decir, Aib8. En una modalidad particular, los análogos de GLP-1 tienen la sustitución Arg34, la sustitución Aib8, o tanto las sustituciones Arg34 como Aib8, y posiblemente una modificación de aminoácido más en comparación con GLP-1(7-37) o GLP-1-(7-36)NH2. En una modalidad particular, las modificaciones de aminoácidos de este párrafo son con relación al GLP-1(7-37) humano.
En su sentido más amplio, el término “derivado de GLP-1” como se usa en la presente se refiere a un derivado de un péptido parental seleccionado de un GLP-1 natural o un análogo de este. No incluye un GLP-1 natural tal como se define en la presente descripción. En particular, el término “derivado de GLP-1” no incluye glucagón (1-29), GLP-1 (1 37) y GLP-2 (1-33), el GLP-1(7-37))humano, el GLP-1(7-36)NH2 humano, exendina-3 y exendina-4.
En una modalidad particular, el término “derivado de GLP-1” se refiere a un derivado de un péptido parental seleccionado de GLP-1(7-37) o GLP-1(7-36)NH2 humano o un análogo de este.
En una modalidad particular, el término “derivado de GLP-1” como se usa en la presente se refiere a un derivado de un péptido parental seleccionado de un análogo de GLP-1, donde dicho análogo comprende un máximo de 17 modificaciones de aminoácidos en comparación con un GLP-1 natural de referencia o, en particular, en comparación con GLP-1-(7-36)NH2 o GLP-1(7-37) humanos, o, en particular, en comparación con GLP-1(7-37) humano. En una modalidad, el “derivado de GLP-1”, en particular cuando se define en comparación con GLP-1(7-37), no incluye GLP-1(7-36)NH2.
Las modificaciones típicas son amidas, carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres, grupos polietilenglicol (PEG), grupos de sialilación, grupos de glicosilación y similares de un péptido parental. En una modalidad, el péptido parental es un análogo de GLP-1 como se definió anteriormente.
En modalidades particulares, la cadena lateral tiene al menos 10 átomos de carbono, o al menos 15, 20, 25, 30, 35 o al menos 40 átomos de carbono. En modalidades particulares adicionales, la cadena lateral puede además incluir al menos 5 heteroátomos, en particular O y N, por ejemplo, al menos 7, 9, 10, 12, 15, 17, o al menos 20 heteroátomos, tales como al menos 1,2, o 3 átomos de N, y/o al menos 3, 6, 9, 12, o 15 átomos de O.
En una modalidad, el término “derivado de GLP-1” se refiere al péptido parental GLP-1 acilado. En una modalidad particular, el término “derivado de GLP-1” se refiere a un péptido parental GLP-1 acilado en el que el péptido parental se selecciona de un análogo de GLP-1 que comprende un máximo de 17 modificaciones de aminoácidos en comparación con un GLP-1 natural de referencia o, en particular, en comparación con el GLP-1(7-36)NH2 o GLP-1(7-37) humanos.
La cadena lateral puede estar unida covalentemente a un residuo de lisina del péptido parental GLP-1 mediante acilación. La conjugación química adicional o alternativa incluye la alquilación, formación de éster o formación de amida, o acoplamiento a un residuo de cisteína, tal como mediante acoplamiento de maleimida o haloacetamida (tal como bromo-/fluoro-/yodo-).
Para la preparación, un éster activo de la cadena lateral se une covalentemente a un grupo amino de un residuo de lisina, preferentemente, al grupo épsilon amino de esta, con la formación de un enlace amida (este proceso se denomina como acilación).
Las cadenas laterales preferidas incluyen, por ejemplo, ácidos grasos y diácidos grasos. El término ácido graso se refiere a ácidos monocarboxílicos alifáticos que tienen de 4 a 28 átomos de carbono. El ácido graso puede ser ramificado o no ramificado. Preferentemente, el ácido graso tiene un número par. El ácido graso puede ser saturado o insaturado. El término "diácido graso" se refiere a ácidos grasos como se definió anteriormente pero con un grupo ácido carboxílico adicional en la posición omega. Por tanto, los diácidos grasos son ácidos dicarboxílicos.
En una modalidad particular, la(s) cadena(s) lateral(es) es(son) un ácido graso que tiene de 10 a 20 átomos de carbono, y preferentemente, de 14 a 20 o de 16 a 18 átomos de carbono, opcionalmente con un espaciador.
En una modalidad particular, la(s) cadena(s) lateral(es) es(son) un ácido graso de fórmula Quím.1: HOOC(CH2)m CO, en donde m es un número entero de 8 a 18, opcionalmente con un enlazador. En una modalidad particular, m es un número entero de 12 a 18 o de 14 a 16.
En una modalidad particular, la(s) cadena(s) lateral(es) se selecciona(n) del grupo que consiste en HOOC(CH2)14CO-, HOOC(CH2 )16CO-, HOOC(CH2 )22 CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3(CH2)16CO- y CH3(CH2)1s CO-.
En una modalidad, el término “derivado de GLP-1” comprende o se refiere a péptido parental GLP-1 monoacilado, es decir, un péptido parental GLP-1 que comprende sólo una acilación como se definió anteriormente.
En una modalidad particular, la cadena lateral es un ácido graso o un diácido graso del cual un grupo ácido forma un enlace amida con el grupo amino épsilon de un residuo de lisina en el compuesto GLP-1, preferentemente, a través de un espaciador. En una modalidad, dicho residuo de lisina es Lys26, especialmente cuando el péptido parental es GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2 humanos o un análogo de GLP-1.
En una modalidad particular, la cadena lateral está unida al péptido parental por medio de un enlazador. En una modalidad particular, el enlazador comprende un y-ácido glutámico (y-Glu) y/o 1, 2 o 3 moléculas de OEG. En yGIu, el grupo gamma carboxi del aminoácido ácido glutámico se usa para la conexión a otro elemento enlazador, o al grupo épsilon amino de la lisina. Una molécula de OEG también se denomina di-radical de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctánico, y/o puede estar representada por la fórmula Quím. 2: -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-.
El enlazador puede incluir uno o más yGIu y/o uno o más OEG. Más en particular, los elementos enlazadores yGIu y OEG pueden, independientemente, usarse p veces donde p es cero o un número entero en el intervalo de 1-3. Ejemplos de enlazadores preferidos son yGIu, yGIu-2xOEG y YGlu-3xOEG donde en todos los casos el grupo alfaamino de Glu forma un enlace amida con el grupo carboxi del resto prolongador.
En una modalidad particular, el derivado de GLP-1 es un derivado de un análogo de GLP-1 que comprende la sustitución Arg34 o las sustituciones Arg34 y Aib8 en comparación con GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2 humanos y que comprende una cadena lateral unida a Lys26. En una modalidad particular, dicha cadena lateral es un ácido graso como se definió anteriormente, especialmente un ácido graso de fórmula Quím.1, donde m es un número entero de 8 a 18, opcionalmente, con un enlazador que es yGIu.
En una modalidad, el derivado de GLP-1 es como se definió en las solicitudes de patente WO 98/08871 y WO 06/097537, incluidas en su totalidad en la presente descripción como referencia. En esas solicitudes pueden encontrarse ejemplos no limitantes de derivados de GLP-1 monoacilados. Ejemplos no limitantes de derivados de GLP-1 también incluyen:
- NE37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoilo]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]et oxi]acetil]-[Imp7 ,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido;
- NE26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8 ,Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido, también llamado semaglutida;
- NE26-[(4S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil]-[Arg34]-GLP-1 -(7-37)-péptido, también llamado liraglutida;
- NE26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido;
- NE26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[12-(3-carboxifenoxi)dodecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[12-(3-carboxifenoxi)dodecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8 ,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido;
- lixisenatida;
- albiglutida;
- dulaglutida.
En una modalidad particular, el derivado de GLP-1 es liraglutida o semaglutida. Los derivados modificados químicamente de GLP-1 natural pueden prepararse, por ejemplo, como se describió en la patente de Estados Unidos 6,451,762 o en Knudsen y otros (2000) J Med Chem 43, 1664-1669.
Cuando se usan términos tales como "aproximadamente” y "cerca de” en relación con los valores numéricos, el experto en la técnica debe reconocer inmediatamente que cualquier efecto o resultado, que pueda estar asociado con los valores dados, puede obtenerse dentro de una cierta tolerancia a partir de los valores particulares. El término "aproximadamente” como se usa en la presente significa, por tanto, en una cercanía razonable del valor numérico indicado, tal como más o menos el 10 %.
Ejemplos
Materiales y métodos
Abreviaturas
Algunas de las abreviaturas usadas en los Ejemplos son las siguientes:
Acm: acetamidometilo
BHK: Riñón de hámster recién nacido
CHO: Ovario de hámster chino
HATU: (hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
HBTU: (hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3 tetrametiluronio)
Fmoc: 9 H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo
Boc: tercbutiloxicarbonilo
Mtt: 4-metiltritilo
DCM: diclorometano
TIPS: triisopropilsilano
TFA: ácido trifluoroacético
NMP: 1-metil-pirrolidin-2-ona
HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol
DIC: Diisopropilcarbodiimida
Trt: trifenilmetilo
Células BHK tk'ts 13: Esta línea es un mutante deficiente en timidina quinasa de un ts 13, un mutante de BHK 21 sensible a la temperatura.
Métodos generales de preparación
La producción de péptidos como la mimilina se conoce bien en la técnica.
Los análogos de mimilina/péptido de mimilina de la invención pueden producirse, por ejemplo, mediante síntesis clásica de péptidos, por ejemplo, síntesis de péptidos en fase sólida mediante el uso de las química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, ver, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid pHase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000 y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.
También, o alternativamente, pueden producirse mediante métodos recombinantes, respectivamente, mediante el cultivo de una célula hospedera que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresar el péptido en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido. Los ejemplos de células hospederas adecuadas para la expresión de estos péptidos no limitantes son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también líneas celulares de mamíferos BHK o CHO.
Los péptidos, análogos o derivados de la invención que incluyen aminoácidos no naturales y/o un mono- o dipéptido mimético N-terminal unido covalentemente pueden producirse, por ejemplo, como se describió en la parte experimental. O ver, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), páginas 422-430; y el documento WO 2009/083549 A1 titulado "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues".
Preparaciones de péptidos y derivados
Las secuencias de péptidos de mimilina se prepararon de acuerdo con la síntesis de péptidos de mimilina mencionada más abajo y los compuestos tal como se presentan en las Tablas (por ejemplo, Tabla 1 o Tabla 2) se prepararon de acuerdo con la síntesis mencionada más abajo.
Un método de síntesis de péptidos de mimilina fue mediante la química de Fmoc en un sintetizador de péptidos Liberty basado en microondas (CEM Corp., Carolina del Norte). La resina era Tentagel S RAM con una carga de aproximadamente 0,25 mmol/g o PAL-ChemMatrix con una carga de aproximadamente 0,43 mmol/g o matriz PAL AM con una carga de 0,5-0,75 mmol/g. La química de acoplamiento fue DIC/HOAt o DIC/Oxima en NMP o DMF mediante el uso de soluciones de aminoácidos de 0,3 M y un exceso molar de 6-8 veces. Las condiciones de acoplamiento fueron de 5 minutos a hasta 70 °C. La desprotección se realizó con piperidina al 10 % en NMP a hasta 70 °C. Los aminoácidos protegidos usados fueron aminoácidos-Fmoc estándar (suministrados, por ejemplo, de Anaspec o Novabiochem o Protein Technologies).
Otro método de síntesis de péptidos de mimilina fue mediante la química de Fmoc en un sintetizador de péptidos Prelude (Protein Technologies, Arizona). La resina era Tentagel S RAM con una carga de aproximadamente 0,25 mmol/g o PAL-ChemMatrix con una carga de aproximadamente 0,43 mmol/g o matriz PAL AM con una carga de 0,5 0,75 mmol/g. La química de acoplamiento fue DIC/HOAt o DIC/Oxima en NMP o DMF mediante el uso de soluciones de aminoácidos de 0,3 M y un exceso molar de 6-8 veces. Las condiciones de acoplamiento fueron acoplamientos simples o dobles durante 1 o 2 horas a temperatura ambiente. La desprotección fue con piperidina al 20 % en NMP. Los aminoácidos protegidos usados fueron aminoácidos-Fmoc estándar (suministrados, por ejemplo, de Anaspec o Novabiochem o Protein Technologies).
La unión N-terminal de ácidos grasos, enlazadores, etc. se realizaba usualmente mediante la inclusión de los bloques de construcción relevantes en la síntesis de péptidos estándar.
Cuando se deseaba una modificación química de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporó como Lys(Mtt) y el aminoácido N-terminal se incorporó a la secuencia como un aminoácido-Boc o, si el aminoácido N-terminal se incorporó como un aminoácido-Fmoc, el grupo Fmoc se eliminó y el N-terminal se protegió mediante tratamiento con 6 equivalentes de carbonato de Boc y 6 equivalentes de DIPEA en NMP durante 30 minutos. La resina se lavó con NMP y DCM y el grupo Mtt se eliminó mediante la suspensión de la resina en hexafluoroisopropanol puro o HFIP/DCM 3:1 durante 20 minutos seguido de lavado con DCM y NMP. La modificación química de la lisina se realizó mediante la adición de uno o más de los bloques de construcción enumerados más abajo mediante los mismos métodos usados para la síntesis de péptidos de mimilina, es decir, mediante una o más etapas automatizadas en el Liberty o mediante una o más etapas manuales de acoplamiento a temperatura ambiente. Después de la síntesis la resina se lavó con DCM y se secó, y el péptido de mimilina se escindió de la resina mediante un tratamiento de 2 horas con TFA/TIPS/agua (92,5/5/2,5 o 95/2,5/2,5) seguido por precipitación con 4 volúmenes de dietiléter, lavado adicional con dietiléter y secado.
Purificación: El péptido de mimilina crudo se purificó mediante HPLC semipreparativa en una columna de 20 mm x 250 mm empaquetada con sílice C-18 ya sea de 5 um o 7 um. Las soluciones de péptidos de mimilina se bombearon sobre la columna de HPLC y los péptidos de mimilina precipitados se disolvieron en 5 ml de ácido acético al 50 % H2O y diluyeron a 20 ml con H2 O e inyectaron en la columna que después se eluyó con un gradiente de 40-60 % de CH3 CN en t Fa al 0,1 % 10 ml/min durante 50 min a 40 o C. Se recolectaron las fracciones que contenían los péptidos de mimilina. El péptido de mimilina purificado se liofilizó después de la dilución del eluato con agua.
El análisis de las fracciones de HPLC y el análisis del producto final por RP-HPLC se realizó mediante el uso de detección UV a 214 nm y, por ejemplo, una columna de sílice C-18 Vydac 218TP54 de 4,6 mm x 250 mm 5 pm (The Separations Group, Hesperia, EE. UU.) y se eluyó a, por ejemplo, 1 ml/min a 42 o C. Muy a menudo se usó una de cuatro condiciones de elución diferentes:
A1: Equilibración de la columna con un tampón que consiste de (NH4)2SO40,1 M, que se ajustó a pH 2,5 con H2 SO4 concentrado y elución mediante un gradiente de 0 % a 60 % de CH3 CN en el mismo tampón durante 50 min.
B1: Equilibración de la columna con TFA al 0,1 %/H2 O y elución mediante un gradiente de 0 % CH3 CN / 0,1 % TFA / H2 O a 60 % CH3 CN / 0,1 % TFA / H2 O durante 50 min.
B6: Equilibración de la columna con TFA al 0,1 % / H2 O y elución mediante un gradiente de 0 % CH3 CN / 0,1 % TFA / H2 O a 90 % CH3 CN / 0,1 % TFA / H2 O durante 50 min.
Alternativamente, el análisis de RP-HPLC se realizó mediante el uso de detección UV a 214 nm y una columna de sílice C-18 Symmetry300, 3,6 mm x 150 mm, 3,5 um (Waters) que se eluyó a 1 ml/min a 42 o C.
B4: Equilibración de la columna con TFA al 0,05 % /H2 O y elución mediante un gradiente de 5 % CH3 CN / 0,05 % TFA / H2 O a 95 % CH3 CN / 0,05 % TFA / H2 O durante 15 min.
La identidad del péptido de mimilina se confirmó por MALDI-MS en un Bruker Microflex.
Ejemplo de síntesis:
Síntesis de mimilina, SEQ ID NO: 1 (Ejemplo #1) un ejemplo de un péptido de mimilina
Se hincharon 400 mg de resina PAL AM (0,61 mmol/g) en DCM/NMP y se realizó la síntesis en un sintetizador de péptidos Prelude mediante el uso de acoplamientos de 1 hora en DMF como se describió anteriormente. Después de la escisión con el cóctel de escisión de TFA, el péptido se precipitó con éter y se secó para producir 800 mg de mimilina
cruda con una pureza de aproximadamente 50 %. La purificación por HPLC (como se describió anteriormente) dio aproximadamente 200 mg de mimilina con una pureza de >90 %
Síntesis del compuesto [N-terminal(diácido C18)]mimilina (Ejemplo #2) un ejemplo de un derivado de mimilina
Se hincharon 600 mg de resina PAL ChemMatrix (0,43 mmol/g) en DCM/NMP y se realizó la síntesis en un sintetizador de péptidos Liberty mediante el uso de acoplamientos de 5 min en NMP a 70 °C como se describió anteriormente. Como última etapa de la síntesis, se acopló diácido-C18-mono-t-butiléster en las mismas condiciones. Después de la escisión, el péptido se precipitó con éter y se secó para producir 700 mg de [N-terminal(diácido C18)]mimilina bruta con una pureza de aproximadamente 55 %. La purificación por HPLC dio aproximadamente 150 mg de [N-terminal(diácido C18)]mimilina con una pureza de >90 %
Síntesis alternativa del compuesto [N-terminal(diácido C18)]mimilina (Ejemplo #2)
La mimilina se sintetiza y purifica como se describió anteriormente, se disuelve en agua o una mezcla adecuada de agua y un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, NMP, DMF, DMSO o acetonitrilo. Se añade una solución de diácido C18 activado, por ejemplo, diácido C18 de succinimidil éster y se purifica la solución resultante del Ejemplo 2.
Observaciones
Todas las referencias, lo que incluye las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas en la presente descripción, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad y en la misma medida en que si cada referencia se indicara de manera individual y específicamente que se incorporara como referencia, y se expusieran en su totalidad en la presente descripción (hasta el máximo grado permitido por la ley).
Todos los encabezamientos y subencabezamientos se usan en la presente descripción solo por conveniencia y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera.
El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en la presente descripción, tiene simplemente la intención de iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique de cualquier otra manera. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.
La citación e incorporación de documentos de patente en la presente descripción se hace sólo para conveniencia y no refleja ninguna visión de la validez, patentabilidad, y/o aplicabilidad de dichos documentos de patente.
En los siguientes ejemplos se hace referencia a los siguientes Ensayos:
Tabla 7- lista de ensa os
ENSAYO (I) - Protocolo experimental para probar la eficacia sobre el apetito mediante el uso de un modelo de rata alimentada ad libitum
Se usan ratas Sprague Dawley (SD) de Taconic Europe, Dinamarca, para los experimentos. Las ratas tienen un peso corporal de 200-250 g al inicio del experimento. Las ratas llegan al menos 10-14 días antes del inicio del experimento para permitir la aclimatación a los ambientes experimentales. Durante este período, los animales se manipulan al menos 2 veces. Después de la llegada, las ratas se alojan individualmente durante una semana en una fase de luz/oscuridad invertida (lo que significa que las luces se apagan durante el día y se encienden durante la noche) durante dos semanas. Dado que las ratas normalmente son activas y comen la mayor parte de su ingestión de alimentos diaria durante el período de oscuridad, las ratas se administran por la mañana justo antes de que se apaguen las luces. Esta configuración da como resultado la variación de datos más baja y la sensibilidad de prueba más alta. El experimento se lleva a cabo en las jaulas de alojamiento de las ratas y las ratas tienen acceso libre a alimentos y agua durante todo el período de aclimatación y el período del experimento. Cada dosis de derivado se prueba en un grupo de 5-8 ratas. Se incluye un grupo de vehículo de 6-8 ratas en cada conjunto de pruebas. Las ratas se administran una vez de acuerdo con el peso corporal con una solución de 0,01-3 mg/kg administrada por vía intraperitoneal (ip), oral (po) o subcutánea (sc). El tiempo de dosificación se registra para cada grupo.
Después de la administración, las ratas se devuelven a sus cajas de alojamiento, donde después tienen acceso a comida y agua. El consumo de alimentos se registra individualmente continuamente mediante el registro en línea o manualmente cada hora durante 7 horas, y luego después de 24 h y a veces de 48 h. Al final de la sesión experimental, los animales se sacrifican. Los datos individuales se registran en hojas de Microsoft Excel. Los valores atípicos se excluyen después de aplicar la prueba de evaluación estadística de Grubbs para valores atípicos, y el resultado se presenta gráficamente mediante el uso del programa GraphPad Prism.
Ensayo (II)a - Ensayo de receptor de calcitonina y amilina humanas
1. Esquema del ensayo de luciferasa
La activación de los receptores de calcitonina y amilina (expresión conjunta de receptor de calcitonina y proteínas modificadoras de la actividad del receptor (RAMp )) conduce a un aumento de las concentraciones intracelulares de cAMP. En consecuencia, la transcripción se activa por promotores que contienen múltiples copias del elemento de respuesta a cAMP (CRE). Por lo tanto, es posible medir la actividad de amilina mediante el uso de un gen indicador de luciferasa CRE introducido en células BHK que también expresan receptores de calcitonina o amilina.
2. Construcción de la línea celular receptor de calcitonina (a) y amilina 3(a)/CRE-luc.
Una línea celular BHK570 se transfectó de manera estable con el receptor de calcitonina humana y un gen indicador de luciferasa que responde a CRE. La línea celular se transfectó adicionalmente con RAMP-3 mediante el uso de métodos estándar. Esto convierte el receptor de calcitonina en un receptor de amilina 3(a). El metotrexato, la neomicina y la higromicina son marcadores de selección para la luciferasa, el receptor de calcitonina y RAMP-3, respectivamente.
3. Ensayos de luciferasa
Para realizar ensayos de actividad, se sembraron células BHK receptor de amilina 3(a) o receptor de calcitonina (a)/CRE-luc en placas de cultivo blancas de 96 pocillos a una densidad de aproximadamente 20 000 células/pocillo. Las células estaban en 100 gl de medio de crecimiento (DMEM con FBS al 10 %, Pen/Estrep al 1 %, Na-piruvato 1 mM, Metotrexato 250 nM, Neomicina 500 gg/ml e Higromicina 400 gg/ml). Después de la incubación durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 %, el medio de crecimiento se reemplazó por 50 gl/pocillo de medio de ensayo (DMEM (sin rojo fenol), Glutamax™, FBS al 10 % y Hepes 10 mM, pH 7,4). Además, se añadieron 50 gl/pocillo de estándar o muestra en tampón de ensayo.
Después de 3 horas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 %, se eliminó el medio de ensayo con estándar o muestra y se reemplazó por 100 gl/pocillo de PBS. Además, se añadió 100 gl/pocillo de LucLite™. Las placas se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, la luminiscencia se probó en un TopCounter (Packard) en modo SPC (conteo de fotones individuales).
ENSAYO(II)a - Ensayo del receptor de calcitonina y amilina humana sin albúmina
1. Esquema del ensayo de luciferasa
La activación de los receptores de calcitonina y amilina (expresión conjunta de receptor de calcitonina y proteínas modificadoras de la actividad del receptor (RAMp )) conduce a un aumento de las concentraciones intracelulares de cAMP. En consecuencia, la transcripción se activa por promotores que contienen múltiples copias del elemento de respuesta a cAMP (CRE). Por lo tanto, es posible medir la actividad de amilina mediante el uso de un gen indicador de luciferasa CRE introducido en células BHK que también expresan receptores de calcitonina o amilina.
2. Construcción de la línea celular receptor de calcitonina (a) y amilina 3(a)/CRE-luc.
Se transfectó de forma estable una línea celular BHK570 con el receptor de calcitonina humano y un gen indicador de luciferasa que responde a CRE (línea celular Hollex-1, obtenida de ZymoGenetics descrita en la patente de Estados Unidos 5622839). La línea celular se transfectó adicionalmente con RAMP-3 mediante el uso de métodos estándar. Esto convierte el receptor de calcitonina en un receptor de amilina 3(a). El metotrexato, la neomicina y la higromicina son marcadores de selección para la luciferasa, el receptor de calcitonina y RAMP-3, respectivamente. Para preparar los lotes de células congeladas usadas en el ensayo de luciferasa descrito en la sección más abajo, las células se cultivaron en medio de crecimiento (DMEM con FBS al 10 %, Pen/Estrep al 1 % y Napiruvato 1 mM). Se usaron metotrexato (250 nM) y neomicina (500 gg/ml) como marcadores de selección para la expresión del indicador de luciferasa y el receptor de calcitonina, respectivamente. Las células a aproximadamente 80-90 % de confluencia se lavaron con PBS y se desprendieron de las placas con Versene. Después de la centrifugación (2 min, 1300 rpm, en un centrífuga Centrion Scientific serie C2 con una cabeza de rotor BRK 5510), el sedimento celular se disolvió en DMSO al 10 %, FBS al 30 % y medio de crecimiento al 60 % y se congeló (-80 °C) hasta su utilización.
3. Ensayos de luciferasa
El día antes del experimento, las células BHK receptor de calcitonina (a) o receptor de amilina 3(a)/CRE-luc se descongelaron, se lavaron dos veces y se sembraron en 40 gl de medio de crecimiento en placas de cultivo blancas de 384 pocillos (4000 células/pocillo). El día del ensayo, las células se lavaron 3 veces en medio de ensayo (medio Dulbecco sin rojo fenol, 500 ml (Gibco, 11880-028); ovoalbúmina al 0,1 %; Hepes 10 mM pH 7,4; Glutamina 1x; Pen/Estrep al 1 %). A continuación, se añadieron 30 gl/pocillo de muestra diluida en tampón de ensayo. Después de 3 horas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 %, la reacción se terminó mediante la adición de 30 gl/pocillo de SteadyLite plus™. Las placas se agitaron a 300 rpm durante 5 min a TA. A continuación, las placas se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, la luminiscencia se probó en un TopCounter (Packard) en modo SPC (conteo de fotones individuales).
Los valores de EC50 se calcularon en GraphPad Prism mediante el uso de una regresión no lineal con pendiente=1.
Comentario adicional con respecto al uso de datos recuperados a través de este método
Este ensayo proporciona la confirmación de la actividad biológica y confirma que todos los péptidos o derivados de mimilina como se describieron en la presente descripción son agonistas del receptor de amilina y calcitonina. Debido a la presencia de HSA, se debe señalar que los derivados de mimilina con diferentes restos prolongadores no deben compararse en relación con su valor de EC50 , porque diferentes cadenas laterales se unen a HSA con diferentes afinidades y por tanto influyen en la EC50 y por tanto desplazar la EC50 hacia valores más altos cuando el resto
prolongador se une más eficientemente a HSA. Por las mismas razones, las mediciones realizadas en el Ensayo lia no deben compararse en el Ensayo llb.
ENSAYO (ll)c - Ensayos de receptor de calcitonina de rata y amilina de rata
Esquema del ensayo de cAMP
La activación de los receptores de calcitonina y amilina (expresión conjunta de receptor de calcitonina y proteínas modificadoras de la actividad del receptor (RAMp )) conduce a un aumento de las concentraciones intracelulares de cAMP. Para cuantificar los niveles de cAMP en las células transfectadas transitoriamente, se usó el Ensayo de Activación de Adenil Ciclasa FlashPlate® de Perkin Elmer. El principio básico del Ensayo FlashPlate® es una competencia entre cAMP radiactivo y no radiactivo generado por las células para un número fijo de sitios de unión.
Construcción de células con receptor de calcitonina(a) de rata y amilina 3(a) de rata.
Las células BHK tk'ts 13 se transfectaron transitoriamente con receptor de calcitonina (a) o receptor de amilina 3 (a) de rata (receptor de calcitonina(a) de rata+ RAMP3 de rata) mediante el uso de FuGENE® 6 (Roche), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Ensayo de cAMP
24 horas después de la transfección transitoria se añadieron las células (células con receptor de calcitonina(a) de rata o amilina 3(a) de rata) (100000 células/pocillo) a las FlashPlates® de 96 pocillos con muestras o estándar en tampón de estimulación FlashPlate con lBMX y se incubaron durante 30 min. La mezcla de detección se creó de acuerdo con el protocolo del fabricante y se midió el centelleo después de 3 h de incubación en TopCounter™ (Packard).
ENSAYO (lll) - Fibrilación ThT - Determinación de la estabilidad física de formulaciones de proteínas
La baja estabilidad física de un péptido de mimilina puede conducir a la formación de fibrillas amiloides, que se observan como estructuras macromoleculares similares a hilo en la muestra, bien ordenadas, que eventualmente dan como resultado la formación de gel. Esto se ha evaluado tradicionalmente por inspección visual de la muestra. Sin embargo, ese tipo de medición es muy subjetiva y depende del observador. Por lo tanto, la aplicación de una sonda indicadora de molécula pequeña es mucho más ventajosa. La tioflavina T (ThT) es una sonda de este tipo y tiene una firma de fluorescencia distintiva cuando se une a las fibrillas [Naiki y otros (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 09, 274-284].
El curso del tiempo para la formación de las fibrillas puede describirse mediante una curva sigmoidea con la siguiente expresión [Nielsen y otros (2001) Biochemistry 40, 6036-6046]:
F = f . + M it + f f + m f t
1 e -[(t - t0 ) / r ]
Ec. (1)
Aquí, F es la fluorescencia de ThT en el tiempo t. La constante tü es el tiempo necesario para alcanzar el 50 % de fluorescencia máxima. Los dos parámetros importantes que describen la formación de la fibrilla son el tiempo de retardo calculado por t0 - 2t y la constante de tasa aparente ka p p = 1/t .
Se sugiere la formación de un intermediario parcialmente plegado del péptido de mimilina como un mecanismo de iniciación general para la formación de fibrillas. Algunos de esos intermediarios se nuclean para formar una plantilla sobre la cual los intermediarios posteriores pueden ensamblarse y se procede a la formación de fibrillas. El tiempo de retraso corresponde al intervalo en el cual se acumula la masa crítica de núcleos y la constante de tasa aparente es la tasa con la que se forma la propia fibrilla.
Preparación de la muestra
Las muestras se prepararon poco antes de cada ensayo. Cada composición de muestra se describe en cada ejemplo. El pH de la muestra se ajustó al valor deseado mediante el uso de las cantidades apropiadas de NaOH y HClO4 o HCl concentrados. Se añadió tioflavina T a las muestras de una solución madre en H2 O hasta una concentración final de 1 pM. Se colocaron alícuotas de 200 pl en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Packard OptiPlate™-96, poliestireno blanco). Usualmente, se colocaron cuatro u ocho réplicas de cada muestra (que corresponden a una condición de prueba) en una columna de pocillos. La placa se selló con Scotch Pad (Qiagen).
Incubación y medición de la fluorescencia
La incubación a una temperatura dada, la agitación y la medición de la emisión de fluorescencia de ThT se realizaron en un lector de placas de fluorescencia Fluoroskan Ascent FL o un lector de placas Varioskan (Thermo Labsystems). La temperatura se ajustó a 37 °C. La agitación orbital se ajustó a 960 rpm con una amplitud de 1 mm en todos los datos presentados. La medición de la fluorescencia se realizó mediante el uso de excitación mediante un filtro de 444 nm y la medición de la emisión mediante un filtro de 485 nm.
Cada ejecución se inició mediante la incubación de la placa a la temperatura del ensayo durante 10 min. La placa se midió cada 20 minutos durante un período de tiempo deseado. Entre cada medición, la placa se agitó y se calentó como se describió.
Manejo de los datos
Los puntos de medición se guardaron en formato de Microsoft Excel para el procesamiento posterior y el dibujo y el ajuste de las curvas se realizó mediante el uso de GraphPad Prism. La emisión de fondo a partir de la ThT en ausencia de fibrillas fue insignificante. Los puntos de datos son típicamente una media de cuatro u ocho muestras y se muestran con barras de error de desviación estándar. Solo los datos obtenidos en el mismo experimento (es decir las muestras en la misma placa) se presentan en el mismo gráfico lo que asegura una medida de la formación de fibrillas relativa entre los experimentos.
El conjunto de datos puede ajustarse a la Ec. (1). Sin embargo, dado que las curvas sigmoideas completas en este caso no siempre se logran durante el tiempo de medición, el grado de fibrilación se expresa como fluorescencia de ThT tabulada como la media de las muestras y se muestra con la desviación estándar en diversos puntos temporales.
Medición de las concentraciones iniciales y finales
La concentración del péptido de mimilina en cada una de las formulaciones probadas se midió tanto antes de la aplicación en el ensayo de fibrilación ThT (“Inicial”) como después de la terminación de la fibrilación ThT (“Después del ensayo ThT”). Las concentraciones se determinaron mediante métodos de HPLC inversa mediante el uso de un estándar de pramlintida como referencia. Antes de la medición después de la terminación, se recolectaron 150 |jl de cada una de las réplicas y se transfirieron a un tubo Eppendorf. Estos se centrifugaron a 30000 G durante 40 min. Los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,22 jm antes de la aplicación en el sistema de HPLC.
ENSAYO (Illa) - Fibrilación ThT - Determinación de la estabilidad física de las formulaciones de proteínas
La preparación de la muestra, la incubación y las mediciones de fluorescencia se realizaron de acuerdo con los principios descritos en el ENSAYO (III).
Manejo de los datos
Las mediciones de fluorescencia para cada pocillo de la placa de microtitulación se representaron gráficamente frente al tiempo y el tiempo de retardo (tiempo hasta que se observó un aumento en la fluorescencia de ThT) se estimó basado en el intercepto entre la fase de retardo inicial lineal y la primera parte de la fase de crecimiento exponencial posterior.
Medición de la recuperación de péptidos de las formulaciones de mimilina
Realizada de acuerdo con los principios descritos anteriormente en el Ensayo III; sin embargo, se usó el Ensayo (XII) para la cuantificación de la concentración de péptidos antes y después de la incubación.
Medición de la recuperación de péptidos de las formulaciones conjuntas de mimilina/GLP-1
La RP-UPLC se realizó mediante el uso de una columna Acquity UPLC BEH C18 de 1,7 jm (2,1 x 30 mm) (Eluyente A: TFA al 0,1 % v/v en agua; Eluyente B: TFA al 0,1 % v/v en acetonitrilo) con gradiente de elución (0 min: 95 % A; 2 min: 20 % A; 2,3 min: 20 % A; 2,4 min: 95 % A) en un régimen de flujo de 0,9 ml/min y una temperatura de columna de 30 °C. Se usó la detección UV a 215 nm para evaluar la recuperación total de péptidos (de forma individual si se separaban) mientras que se usó la detección a 280 nm para determinar la recuperación del componente GLP-1 (sin absorción UV-280 nm del componente mimilina).
ENSAYO (IV) - Determinación de la solubilidad
El péptido de mimilina se disolvió en agua a ~500 nmol/ml y se mezcló 1:1 con una serie de tampones (glicilglicina 100 mM pH 3,0, glicilglicina 100 mM pH 4,0, glicilglicina 100 mM pH 5,0, bistrispropano 100 mM pH 6,0, bistrispropano 100 mM pH 6,5, bistrispropano 100 mM pH 7,0, bistrispropano 100 mM pH 7,5, bistrispropano 100 mM pH 8,0). Después de 18 horas a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron y la concentración del péptido de mimilina se determinó por UPLC.
ENSAYO (V) - Determinación de la unión al receptor de amilina humana
El ensayo de unión se realizó mediante el uso de perlas de ensayo de proximidad de centelleo (SPA) (RPNQ0001) de PerkinElmer y se usaron membranas celulares a partir de las células Amilina 3(a)/CRE-luc (como se describió en el Ensayo (II)). Las membranas se prepararon de la siguiente manera; las células se lavaron con PBS y se incubaron con Versene durante aproximadamente 5 min antes de la cosecha. Las células se purgaron con PBS y la suspensión celular se centrifugó durante 5 min a 1000 rpm. Las células se homogeneizaron (ultrathurrax) en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 10 mM (pH 7,4) y se centrifugaron a 20000 rpm durante 15 min. El sedimento resultante se resuspendió, se homogeneizó y se centrifugó (20 000 rpm, 15 min) en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 0,1 mM (pH 7,4, tampón 2). El sedimento resultante se resuspendió en tampón 2 y se midió la concentración de proteínas (ensayo de proteína BCA, Pierce). El homogenado se mantuvo frío durante todo el procedimiento. Las membranas se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. El ensayo se realizó en un Optiplate de 384 pocillos (PerkinElmer) en un volumen total de 40 ul. Las membranas se mezclaron con perlas de SPA. La concentración final de las membranas 35 ng/pl final y las perlas de SPA fue de 0,05 mg/pocillo. Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO y se diluyeron posteriormente en tampón de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7,4, CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM, OA al 0,1 % y Tween20 al 0,02 %). El radioligando amilina de rata-I125 (NEX448 PerkinElmer) se disolvió en tampón de ensayo y se añadió al Optiplate a una concentración final de 50 pM/pocillo (aproximadamente 20000 cpm/10 ul). La mezcla final se incubó con agitación a 400 rpm durante 120 min a 25 °C antes de la centrifugación (1500 rpm, 10 min). Las muestras se analizaron en un TopCounter™ (Packard). La IC50 se calculó mediante el uso de (análisis de competencia de unión a un sitio) GraphPad Prism5 como una medida de afinidad por el receptor.
ENSAYO (Va) - Determinación de la unión al receptor de amilina humana (unión en célula completa)
El ensayo de unión se realizó mediante el uso de una línea celular BHK tk'ts 13 que se transfectó de forma estable con el receptor de calcitonina humana, el RAMP3 humano y un gen indicador de luciferasa que responde a CRE.
El día antes del ensayo, las células se sembraron en placas BD BioCoat, blanco opaco 384W recubiertas con poli-D-lisina (10000 células/pocillo) y se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %, 95 % de humedad. A continuación, las células se lavaron en h BSs (4 °C) y se incubaron durante la noche a 4 °C en un tampón de unión que contenía compuestos de prueba, [125I]-amilina de rata 50 pM, medio Dulbecco sin rojo fenol, 500 ml, ovoalbúmina al 0,1 % (5 ml de ovoalbúmina al 10 %), Hepes 10 mM (5 ml 1 M) Glutamina 1x (5 ml 100x) P/E al 1 % (5 ml 100 %) Complete (1 tableta/50 ml)
Pluronic F68® al 0,1 %. A la mañana siguiente, las placas se lavaron tres veces en HBSS (4 °C) y se lisaron en tampón de lisis (NaOH 0,1 M (VWR # 1.09136.1000), SDS al 1 %. Después se añadió MicroScint40 y se agitaron las placas a 500 rpm durante un período corto. A continuación, la placa se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora y se leyó en un TopCounter. Se calculó la IC50 mediante el uso de (análisis de competición de unión de un sitio) GraphPad Prism5 como una medida de la afinidad del receptor.
ENSAYO (VI) - Determinación de la unión al receptor de amilina de rata (membrana)
El ensayo se realizó como se describió anteriormente (Ensayo (V) - Determinación de la unión al receptor de amilina humana) con la excepción de que usamos membranas preparadas a partir de células BHK tk'ts 13 que se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata RAMP 3 en una relación equimolar (1:2). Las células BHK tk'ts 13 se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata mediante el uso de FuGENE® 6 (Roche), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se cultivaron en DMEM con FBS al 10 % y Pen/Estrep al 1 %. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, se cosecharon las células y se prepararon las membranas.
ENSAYO (VII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina humana (membrana)
El ensayo de unión se realizó mediante el uso de perlas de ensayo de proximidad de centelleo (SPA) (RPNQ0001) de PerkinElmer y membranas celulares preparadas a partir de una línea celular BHK tk'ts 13 que se transfectó de manera estable con el receptor de calcitonina humana y un gen indicador de luciferasa que responde a CRE. Las membranas se prepararon de la siguiente manera; las células se lavaron con PBS y se incubaron con Versene durante aproximadamente 5 min antes de la cosecha. Las células se purgaron con PBS y la suspensión celular se centrifugó durante 5 min a 1000 rpm. Las células se homogeneizaron en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 10 mM (pH 7,4) y se centrifugaron a 20000 rpm durante 15 min. El sedimento resultante se resuspendió, se homogeneizó y se centrifugó (20000 rpm, 15 min) en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 0,1 mM (pH 7,4, tampón 2). El sedimento resultante se resuspendió en tampón 2 y se midió la concentración de proteínas (ensayo de proteína BCA, Pierce). El homogenado se mantuvo frío durante todo el procedimiento. Las membranas se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. El ensayo se realizó en un Optiplate de 384 pocillos (PerkinElmer®) en un volumen total de 40 ul. Las membranas se mezclaron con perlas de SPA. La concentración final de las membranas 35 ng/pl final y la concentración final de las perlas de SPA fue de 0,05 mg/pocillo. Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO y se diluyeron posteriormente en tampón de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7,4, CaCl2 1 mM, MgCl25 mM, OA al 0,1 % y Tween20 al 0,02 %). El radioligando 125I-calcitonina se disolvió en tampón de ensayo y se añadió al Optiplate a una
concentración final de 75 pM/pocillo (aproximadamente 30000 cpm/10 ul). La mezcla final se incubó durante 120 min con agitación a 400 rpm a 25 °C antes de la centrifugación (1500 rpm, 10 min). Las muestras se analizaron en un TopCounter™ (Packard). La IC50 se calculó mediante el uso de (análisis de competencia de unión a un sitio) GraphPad Prism5 como una medida de afinidad por el receptor.
Ensayo (VIIa) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina humana (ensayo de célula completa)
El ensayo de unión se realizó mediante el uso de una línea celular BHK tk'ts 13 que se transfectó de forma estable con el receptor de calcitonina humana y un gen indicador de luciferasa que responde a CRE. El día antes del ensayo, las células se sembraron en placas BD BioCoat, blanco opaco 384W recubiertas con poli-D-lisina (10 000 células/pocillo) y se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %, 95 % de humedad. A continuación, las células se lavaron en HBSS (4 °C) y se incubaron durante la noche a 4 °C en un tampón de unión que contenía compuestos de prueba, 50 pM de [125l]-calcitonina humana, medio sin rojo fenol, 500 ml de ovoalbúmina al 0,1 % (5 ml ovoalbúmina al 10 %) Hepes 10 mM (5 ml 1 M) Glutamina 1x (5 ml 100x) P/E al 1 % (5 ml 100 %) Complete (1 tableta/50 ml) Pluronic F68® al 0,1 %. A la mañana siguiente, las placas se lavaron tres veces en HBSs (4 °C) y se lisaron en tampón de lisis (NaOH 0,1 M), SDS al 1 %. Se añadió un cóctel de centelleo (MicroScint40®) y las placas se agitaron a 500 rpm durante un breve período. La placa se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora y se leyó en un TopCounter™ (Packard). La IC50 se calculó mediante el uso de (análisis de competencia de unión a un sitio) GraphPad Prism5 como una medida de afinidad por el receptor.
ENSAYO (VIII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina de rata
El ensayo se realizó como se describió anteriormente (Ensayo (VII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina humana) con la excepción de que usamos membranas preparadas a partir de células BHK tk’ ts 13 que se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata. Las células BHK tk'ts 13 se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata mediante el uso de FuGENE® 6 (Roche), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se cultivaron en DMEM con FBS al 10 % y Pen/Estrep al 1 %. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, se cosecharon las células y se prepararon las membranas.
ENSAYO (IX) - pK - Determinación del T14 en minicerdo
Se llevaron a cabo estudios farmacocinéticos (PK) en minicerdos Gottingen con el fin de determinar el T% del compuesto de mimilina de acuerdo con los Ejemplos como se indica después de la administración i.v.
Los valores de T% de los análogos de amilina de la invención se determinan mediante estudios farmacocinéticos en minicerdos Gottingen machos de Ellegaard Gottingen Minipigs ApS y se siguen los principios del cuidado de animales de laboratorio.
Se permitió un período de aclimatación de aproximadamente 6-10 días antes de que los animales ingresaran al estudio. Al comienzo del período de aclimatación, los minicerdos tenían aproximadamente de 5 a 12 meses de edad y en el intervalo de peso de 15-35 kg. Los minicerdos tenían dos catéteres venosos centrales insertados que se usaron para la obtención de las muestras de sangre.
Los estudios se realizaron en una sala de animales que se iluminó para dar un ciclo de aproximadamente 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales se alojaron individualmente.
Los animales tuvieron acceso libre a agua potable de calidad doméstica durante el estudio y no se aplicaron restricciones alimentarias para los estudios de PK. Los animales se pesaron al llegar y en los días de administración.
En los presentes estudios, las sustancias de prueba se administraron por vía intravenosa en dosis de aproximadamente 5 nmol/kg. Los animales recibieron una única inyección intravenosa en un catéter venoso central y, cuando fue posible, se obtuvieron las muestras de sangre del otro catéter. Cada sustancia de prueba se administró típicamente a tres, pero en algunos casos a dos o cuatro animales.
Se obtuvo un perfil completo de concentración plasmática-tiempo de cada animal, al emplear 12-16 puntos de muestreo. En el ejemplo, las muestras de sangre se recolectaron de acuerdo con el siguiente programa:
Después de la administración intravenosa:
Predosis (0), 0,5, 1,2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168 y 240 horas después de la inyección. En algunos casos, se tomaron también muestras de sangre adicionales hasta 288 horas después de la inyección.
En cada tiempo de obtención de muestras, se extrajeron 0,5 a 2 ml de sangre de cada animal. Las muestras de sangre se tomaron a través del catéter venoso central.
Las muestras de sangre de 0,8 ml se colectaron en tubos de ensayo con EDTA (EDTA 8 mM). Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo durante un máximo de 20 min antes de la centrifugación. El plasma se separó mediante el uso de centrifugación (es decir, a 4 °C, 10 min, 2000 G) y se transfirió inmediatamente a tubos Micronic en hielo seco. Se transfirieron aproximadamente 200 gl de plasma a cada tubo Micronic. El plasma se almacenó a -20 °C hasta que se analizó. Las muestras de plasma se ensayaron para determinar el contenido del compuesto mediante el uso de LCMS.
Los perfiles de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un análisis farmacocinético no compartimental (NCA) mediante el uso de Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos). El NCA se realizó mediante el uso de los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo de cada animal. T1^ es la vida media terminal = ln2/Az y se determinó a partir de Az , la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva, estimada por regresión lineal de tiempo frente a concentración logarítmica.
Método MS para la cuantificación de amilina y mimilina
Se diluyen 40 gl de plasma con 120 gl de EtOH al 66,67 % HCOOH al 1 % y se mezclan. Se centrifuga durante 20 min a 13000 rpm, 4 °C. El sobrenadante se analiza mediante un método LC-MS en un Sciex API 3000 y se cuantifica con un estándar constituido en plasma
ENSAYO (X) - pK - Determinación de T% en rata
Se realizaron estudios farmacocinéticos (PK) en ratas para determinar la T% del péptido de mimilina después de la administración i.v. y s.c.
Los valores de T14 de los derivados de mimilina de la invención se determinan mediante estudios farmacocinéticos en ratas machos Sprague Dawley, de Taconic Europe, y se siguen los principios del cuidado de animales de laboratorio.
Se permitió un período de aclimatación de aproximadamente 7 días antes de que los animales ingresaran al estudio. Al comienzo del período de aclimatación, las ratas estaban en el intervalo de peso de 250-400 g.
Los estudios se realizaron en una sala de animales que se iluminó para dar un ciclo de aproximadamente 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales se alojaron en grupo y se les dio comida y agua ad lib. Los animales se pesaron en los días de administración.
En los presentes estudios, las sustancias de prueba se administraron por vía subcutánea o intravenosa en dosis de aproximadamente 20 nmol/kg. Los animales recibieron una única inyección subcutánea en el cuello para la administración subcutánea o directamente en la vena de la cola para administración intravenosa. Cada sustancia de prueba se administró típicamente a tres, pero en algunos casos a dos o cuatro animales.
Se obtuvo un perfil completo de concentración plasmática-tiempo de cada animal, al emplear 8-10 puntos de muestreo. En el ejemplo, las muestras de sangre se recolectaron de acuerdo con el siguiente programa:
Después de la administración subcutánea o intravenosa:
Predosis (0), 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 12, 24, 48 y 72 horas después de la inyección.
En cada tiempo de muestreo, se extrajeron 0,08 a 0,10 ml de sangre de cada animal. Las muestras de sangre se tomaron en la vena sublingual mediante punción venosa y el uso de un tubo capilar.
Las muestras de sangre se estabilizaron con EDTA. Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo durante un máximo de 20 min antes de la centrifugación. El plasma se separó mediante centrifugación (es decir, a 4 °C, 10 min, 1500 G) y se transfirió inmediatamente a tubos Micronic o placas de PCR. Aproximadamente 40 gl de plasma se transfirieron y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. Las muestras de plasma se analizaron para determinar el contenido de compuesto de mimilina mediante LCMS
Los perfiles de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un análisis farmacocinético no compartimental (NCA) mediante el uso de Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos). El NCA se realizó mediante el uso de los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo de cada animal. T1^ es la vida media terminal = ln2/Az y se determinó a partir de Az , la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva, estimada por regresión lineal de tiempo frente a concentración logarítmica.
ENSAYO (XI) - Determinación de los posibles sitios de unión al MHC Clase II
El estudio in-silico investigó si las secuencias de los nuevos péptidos que son el resultado de la modificación genética de proteínas para generar análogos de mimilina podrían dar como resultado secuencias de péptidos capaces de unirse al complejo principal de histocompatibilidad clase II (MHC-II), también conocido como HLA-II en seres humanos. Dicha unión es un requisito previo para la presencia de epítopos de células T. El software de predicción de unión de péptidos/HLA-II usado en este estudio se basó en dos algoritmos, NetMHCIIpan 2.1 (Nielsen y otros, 2010), que realiza predicciones de HLA-DR, y NetMHCII 2.2 (Nielsen y otros, 2009) que realiza predicciones HLA-DP/DQ.
Se debe señalar que hay ciertas consideraciones que deben tenerse en cuenta al analizar secuencias para péptidos de unión al MHC de clase II solos, en particular que este método no tendrá en cuenta el procesamiento de antígenos, el reconocimiento del receptor de células T del complejo MHC de clase II péptido o tolerancia de las células T a cualquier péptido que no sea de la línea germinal. De hecho, por estas razones, cualquier análisis de secuencias mediante el uso de herramientas predictivas de unión a MHC de clase II dará como resultado una predicción excesiva del número de epítopos de células T reales.
Cualquiera de los péptidos de unión a HLA-II identificados en este análisis tiene el potencial de ser un epítopo activo de células T CD4+ aunque, a partir de la literatura, se conoce que solo una minoría de dichos péptidos serán epítopos de células T reales cuando se prueben en células T humanas
Sin embargo, cualquier péptido de unión a HLA-II promiscuo que no sea de la línea germinal individual tiene el riesgo de ser un epítopo activo de células T CD4+
Por lo tanto, se recomienda realizar una evaluación adicional mediante el uso de ensayos de células T ex vivo para evaluar su inmunogenicidad. Los resultados de este análisis ex vivo pueden compararse con datos de referencia sobre productos terapéuticos proteicos existentes para generar una evaluación preclínica más precisa del potencial de inmunogenicidad.
Tanto la calcitonina de salmón de tipo salvaje como el péptido de mimilina de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 no mostraron predicción de unión para péptidos MHC de clase II.
ENSAYO (XII) - SEC-HPLC
SEC-HPLC se realizó mediante el uso de una columna Waters Insulin HMWP con elución isocrática (NaCl 0,5 M, NaH2PO4 10 mM y H3PO45 mM, isopropanol al 50 % (v/v)) con un régimen de flujo de 0,5 ml/min, una temperatura de columna de 50 °C con detección UV a 215 nm. La carga típica de la columna fue nmol/inyección de un dígito. El área del pico de péptido total se usó como una medida de la “concentración de péptido total” y la concentración de péptido total absoluta se estimó mediante el uso de coeficientes de extinción molar UV calculados basado en la estructura primaria de los péptidos individuales. El área total del pico del péptido que eluye antes del pico principal monomérico se denominó HMWP (proteína de alto peso molecular) y se proporcionó en una escala de porcentaje con relación al área total del pico del péptido. El área total del pico del péptido que eluye posterior al pico principal monomérico se denominó postmonomérica y se proporcionó en una escala de porcentaje con relación al área total del pico del péptido.
ENSAYO (XIII) - Estabilidad de almacenamiento en reposo de las formulaciones
Antes, durante y después de la incubación a las temperaturas especificadas, se realizan uno o más de los siguientes exámenes de forma regular para evaluar la estabilidad de almacenamiento en reposo.
SEC-HPLC
La “concentración total de péptidos”, HMWP (proteina de alto peso molecular) y la postmonoméríca se determinaron de acuerdo con el ENSAYO (1).
RP-UPLC
La pureza del péptido se midió mediante UPLC mediante el uso de una columna CSH 1,7 pm, 150x2,1 mm (60 °C) con detección UV a 215 nm. Se usaron el eluyente A (0,09 di-fosfato de amonio pH 3,6, 10 % MeCN v/v%) y eluyente B (80 % MeCN v/v%) en un régimen de flujo total de 0,3 ml/min (inicial: 45 % B; 2 min: 45 % B; 27 min: 65 % B; 28 min: 95 % B; 31 min: 95 % B; 32 min: 45 % B; 35 min: 45 % B). La pureza se proporcionó en % basado en la relación de área relativa entre el pico principal y el área de pico relacionada con el péptido total.
ENSAYO (XIV) - Protocolo experimental para probar el efecto sobre el peso corporal mediante el uso del modelo de rata DIO (Efectos subcrónicos del análogo de GLP-1 liraglutida, un análogo de amilina (Ej. # 2) y combinación de liraglutida y Ej. # 2 en ratas DIO)
Animales y dieta
Todos los protocolos animales se aprobaron por un Comité Institucional de Uso y Cuidado Animal y un Comité de Revisión Ética de Novo Nordisk. Se obtuvieron ratas Sprague Dawley macho obesas inducidas por la dieta (DIO) mantenidas con una dieta alta en grasas (45 % kcal de grasa, RD12451, Research Diets, New Brunswick, NJ, EE. UU.) de Vital River (Beijing, China) y se alojaron en un ambiente de temperatura (23 ± 2 °C) y luz controlada (ciclo luz/oscuridad 12 h:12 h, luces encendidas a las 1800 h) con acceso ad libitum a alimentos y agua. A su llegada, se permitió que las ratas se aclimataran y se monitorearon los pesos corporales dos veces por semana durante este período.
Tampones de formulación
Se formuló liraglutida en fosfato 8 mM, propilenglicol 184 mM, fenol 58 mM, pH=8,15. Ej. # 2 se formuló en fosfato 10 mM, glicerol 250 mM, polisorbato 20 al 0,025 %, pH=7,4; los animales tratados con vehículo se administraron con el último tampón de formulación.
Asignación de grupos, administración de las dosis y mediciones del peso corporal
Antes del inicio del estudio, los animales se alojaron individualmente y se aclimataron a los procedimientos de manipulación durante 7 días. Las ratas DIO se distribuyeron en grupos (n=10/grupo) de manera que las variaciones estadísticas en la media y las desviaciones estándar de la masa grasa y el peso corporal se redujeron al mínimo entre los grupos. Se administró a los animales una vez al día, por vía subcutánea a las 16:00 con vehículo (días 0-28; Grupo A), liraglutida (0,1 mg/kg días 0-28, Grupo B), compuesto de Ej. #2 (3,7 pg/kg días 0-28, Grupo C), o una combinación de liraglutida y compuesto de Ej. #2 (0,1 mg/kg de liraglutida días 0-28, y 3,7 ug/kg del compuesto del Ej. #2 días 15 28; Grupo D). Los pesos corporales se midieron inmediatamente antes de la administración de las dosis cada día.
Terminación
Los animales se sacrificaron el día 28. Los animales se anestesiaron con O2/N2 O/isoflurano, y la sangre se extrajo mediante punción cardíaca en tubos con EDTA, se mantuvo en hielo y se centrifugó dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Todas las muestras de plasma con EDTA se almacenaron a -80 °C a partir de entonces, hasta que se analizaron. También se recolectaron y almacenaron muestras de hígado y cerebro a -80 °C para su posterior análisis
ENSAYO (XV) - Determinación de la PK del derivado de mimilina subcutánea en cerdos LYD cuando se formula conjuntamente con liraglutida
Para determinar si la formulación conjunta con liraglutida cambiaría las propiedades farmacocinéticas de los derivados de mimilina o liraglutida, se realizaron estudios de formulación conjunta en cerdos Landrace Yorkshire Duroc mestizos (LYD) y se compararon con estudios de administración conjunta.
Los estudios se realizaron en cerdos hembras LYD de origen SPF suministrados por Lars Jonson, Hillerodvej 70, Lynge.
Al comienzo del período de aclimatación, el peso corporal de los cerdos estaba en el intervalo de 55 - 70 kg y los cerdos tenían aprox. 5 meses de edad.
Antes de que llegaran los animales, las habitaciones de los animales y los corrales se limpiaron y desinfectaron con Virkon S. Durante el estudio, las habitaciones de los animales se limpiaron y lavaron regularmente.
Los cerdos se alojaron en grupo durante el período de aclimatación. A los cerdos se les colocó un catéter venoso central mientras estaban con anestesia y después del alojamiento individual después del cateterismo en corrales > 3,1 m2 con paja como encamado. La temperatura en las habitaciones se fijó en 20-23 °C y la humedad relativa en 30-70 %. Las habitaciones se iluminaron para dar un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La luz estuvo encendida de 07.00 a 19.00 h.
Las formulaciones subcutáneas usadas para la administración conjunta contenían liraglutida 1,6 mM o derivado de mimilina 1,6 mM en fosfato 8 mM, fenol 58 mM, propilenglicol 14 mg/ml, pH 8,2. La formulación conjunta contenía liraglutida 1,6 mM y derivado de mimilina 1,6 mM en fosfato 8 mM, fenol 58 mM, propilenglicol 14 mg/ml, pH 8,2. Las formulaciones se prepararon de manera similar y se llenaron en cartuchos en todos los casos.
Los animales se administraron por vía subcutánea como sigue.
La administración de las dosis s.c. se realizó a 4 mm de profundidad, en un sitio de inyección previamente asegurado por ultrasonido para evitar tejido muscular o vascularización abundante. La administración de las dosis se realizó mediante el uso de NovoPen®4 y aguja Novofine 28 G y un tapón de aguja para asegurar una profundidad de inyección de 4 mm. La aguja se mantuvo en el subcutis durante 10 segundos después de la inyección para asegurar la deposición del compuesto. Para la administración conjunta, los animales recibieron dos inyecciones separadas en
diferentes lados del cuello de liraglutida y Compuesto 2. La formulación conjunta se administró como una inyección. El estudio se realizó como un estudio cruzado con un periodo de reposo farmacológico adecuado entre las dosis. En todos los estudios, los animales recibieron una dosis de 2 nmol/kg de liraglutida y 2 nmol/kg de derivado de mimilina. Obtención de muestras de sangre
Se obtuvieron muestras de sangre en puntos temporales predefinidos por hasta 15 días después de la administración de la dosis para cubrir adecuadamente el perfil completo de concentración plasmática-tiempo del derivado de mimilina. Se extrajeron muestras de sangre de un catéter venoso central a la vena yugular hecha a través del catéter que después se purgó con 10 ml de NaCl al 0,9 %.
Para cada punto temporal de obtención de muestras de sangre se recolectaron aproximadamente 0,8 ml de sangre total en un tubo de 1,5 ml recubierto con EDTA, y el tubo se volteó suavemente para permitir la mezcla de la muestra con el anticoagulante. Las muestras de sangre (por ejemplo, 0,8 ml) se recolectaron en tampón de EDTA (8 mM) y después se centrifugaron a 4 °C y 2000 G durante 10 minutos. El plasma se pipeteó en tubos Micronic en hielo seco y se mantuvo a -20 °C hasta su análisis.
Análisis
La concentración plasmática del derivado de mimilina respectivo se analizó mediante el uso de LC-MS y la liraglutida por LOCI. Los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un modelo no compartimental en Phoenix WinNonlin versión 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE.UU.).
El área bajo la curva de la concentración en plasma frente al tiempo (AUC, [tiempo x concentración]) se calculó (mediante el programa Pharsight) después de la administración subcutánea,, típicamente hasta 240-288 horas después de la administración de la dosis, o hasta la última concentración medida. El AUC se calculó y se proporcionó como AUCinf-pred y se normalizó para la dosis. Sin embargo, en los casos en que el área extrapolada en el perfil excedió el 20 %, entonces se usó el AUCú lt im o para calcular el AUC y normalizar la dosis.
Los resultados de los estudios de formulación conjunta en cerdos LYD se resumen más abajo
ENSAYO (XVI) - Determinación de T14 y biodisponibilidad subcutánea en cerdos LYD
Se llevaron a cabo estudios farmacocinéticos (PK) en cerdos Landrace Yorkshire Duroc mestizos (LYD) para determinar a) la prolongación del derivado de mimilina después de la administración i.v. y b) la biodisponibilidad del derivado de mimilina después de la administración s.c.
Los cerdos LYD se suministraron, trataron y aclimataron como se describió en el ENSAYO XV anteriormente.
En los estudios i.v. y s.c., el derivado de mimilina se disolvió en fosfato 50 mM, cloruro de sodio 70 mM y polisorbato 80 al 0,05 %, pH=8,0 hasta una concentración de aproximadamente 100 nmol/ml. Los animales se administraron con 2 nmol/kg s.c. y 5 nmol/kg i.v.
Los animales se administraron por vía subcutánea o intravenosa como sigue.
La administración de las dosis s.c. se realizó a 4 mm de profundidad, en un sitio de inyección previamente asegurado por ultrasonido para evitar tejido muscular o vascularización abundante. La administración de las dosis se realizó mediante el uso de NovoPen®4 y aguja Novofine 28 G y un tapón de aguja para asegurar una profundidad de inyección de 4 mm. La aguja se mantuvo en el subcutis durante 10 segundos después de la inyección para asegurar la deposición del compuesto.
La administración intravenosa se realizó ya sea por una vena de la oreja o mediante un venflon.
Obtención de muestras de sangre
Se tomaron muestras de sangre en puntos temporales predefinidos por hasta 10-12 días después de la administración de la dosis para cubrir adecuadamente el perfil total de concentración plasmática-tiempo del derivado de mimilina. El resto siguió el protocolo descrito en la obtención de muestras de sangre del ENSAYO (XV) anterior,
Análisis
La concentración plasmática del derivado de mimilina respectivo se analizó mediante el uso de LC-MS. Los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un modelo no compartimental en Phoenix WinNonlin versión 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE. UU.).
La vida media terminal resultante se determinó basado en la administración intravenosa. T'A es la vida media terminal = ln2/Az y se determinó a partir de Az , la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva, estimada por regresión lineal de tiempo frente a concentración logarítmica.
La biodisponibilidad absoluta (F) se calculó como sigue:
El área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo (AUC, [tiempo x concentración]) se calculó (mediante el programa Pharsight) después de la administración subcutánea y la administración intravenosa, típicamente hasta 240-288 horas después de la administración de la dosis, o hasta la última concentración medida. El AUC se calculó al extrapolar al infinito y normalizar para la dosis. A continuación, se calculó la biodisponibilidad absoluta (F%) basado en los valores de a Uc corregidos por la dosis, es decir, como AUC/Ds c dividido por AUC/D ¡v x 100, donde Dsc es la dosis subcutánea por kg, y D¡v la dosis por kg administrada por vía intravenosa.
ENSAYO (XVII) - Determinación de y biodisponibilidad subcutánea en perros Beagle
Los estudios farmacocinéticos (PK) en perros Beagle se llevaron a cabo para determinar a) la prolongación del derivado de mimilina después de la administración i.v. y b) la biodisponibilidad de los derivados de mimilina después de la administración s.c.
Por prolongación se entiende la prolongación del tiempo en el cuerpo y de esta manera el tiempo de acción de los derivados de mimilina. Esto se hizo en estudios farmacocinéticos PK, donde se determinó la vida media terminal del derivado en cuestión después de la administración i.v. Por vida media terminal se entiende generalmente el período de tiempo que se tarda en reducir a la mitad una determinada concentración plasmática, medida después de la fase de distribución inicial.
El compuesto de mimilina se sometió a estudios de PK como se describe más abajo.
Para los estudios con el derivado de mimilina compuesto 2, los perros Beagle tenían entre 1 y 5 años de edad y pesaban aproximadamente 10-12 kg al comienzo de los estudios. Los perros se alojaron en grupos en jaulas (12 horas de luz: 12 horas de oscuridad), y se alimentaron individualmente y de forma restringida una vez al día con Royal Canin Medium para perros adultos (Royal Canin Products, sucursal China o Brogaarden A/S, Dinamarca). Se permitió el ejercicio y socialización en grupos diariamente, siempre que fue posible. Los perros se usaron para estudios farmacocinéticos repetidos con un adecuado período de reposo farmacológico entre las dosificaciones sucesivas. Se proporcionó un período de aclimatación apropiado antes de iniciar el primer estudio farmacocinético. Toda la manipulación, administración de la dosis y obtención de muestras de sangre de los animales se realizó por personal capacitado y experto. Antes de los estudios, los perros se mantuvieron en ayunas durante toda la noche y de 0 a 4 horas después de la administración de la dosis. Además, se limitó el agua a los perros 1 hora antes de la administración de la dosis hasta 4 horas después de la administración de la dosis, pero de cualquier otra manera tuvieron acceso a voluntad al agua durante todo el período.
Administración intravenosa y subcutánea
En los estudios i.v. y s.c., el derivado de mimilina disuelto en fosfato 10 mM; glicerol 250 mM; polisorbato 20 al 0,025 %, pH=7,4, hasta una concentración de aproximadamente 10 nmol/ml (i.v.) y 50 nmol/ml (s.c.), se administró a los perros mediante inyecciones intravenosas o subcutáneas (el volumen correspondiente a 1-5 nmol/kg, por ejemplo, 0,1-0,2 ml/kg) en la región cefálica o por vía subcutánea en la parte dorsal del cuello.
Obtención de muestras de sangre
Se tomaron muestras de sangre en puntos temporales predefinidos por hasta 10-12 días después de la administración de la dosis para cubrir adecuadamente el perfil total de concentración plasmática-tiempo del derivado de mimilina.
Para cada punto temporal de obtención de muestras de sangre se recolectaron aproximadamente 0,8 ml de sangre total en un tubo de 1,5 ml recubierto con EDTA (8 mM), y el tubo se volteó suavemente para permitir la mezcla de la muestra con el anticoagulante, y después se centrifugó a 4 °C y 1942 G durante 4 minutos. El plasma se pipeteó en tubos Micronic en hielo seco y se mantuvo a -20 °C hasta su análisis.
Las muestras de sangre se toman según sea apropiado, por ejemplo, a) de la vena yugular mediante el uso de una aguja estándar 21G y una jeringuilla, o b) de un venflon en la vena cefálica en la parte delantera de la pata durante las primeras 2 horas y después con jeringa de la vena yugular durante el resto de los puntos temporales (las primeras gotas se dejan drenar del venflon para evitar la presencia de la solución salina de heparina del venflon en la muestra).
Análisis
La concentración plasmática del derivado de mimilina respectivo se analizó mediante el uso de LC-MS. Los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un modelo no compartimental en Phoenix WinNonlin versión 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE. UU.).
La vida media terminal resultante se determinó basado en la administración intravenosa. T14 es la vida media terminal = ln2/Az y se determinó a partir de Az , la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva, estimada por regresión lineal de tiempo frente a concentración logarítmica.
La biodisponibilidad absoluta (F) se calculó como sigue:
El área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo (AUC, [tiempo x concentración]) se calculó (mediante el programa Pharsight) después de la administración subcutánea y la administración intravenosa, típicamente hasta 240-288 horas después de la administración de la dosis, o hasta la última concentración medida. El AUC se calculó al extrapolar al infinito y normalizar para la dosis. A continuación, se calculó la biodisponibilidad absoluta (F%) basado en los valores de AUC corregidos por la dosis, es decir, como AUC/Dsc dividido por AUC/D ¡v x 100, donde Dsc es la dosis subcutánea por kg, y D¡v la dosis por kg administrada por vía intravenosa.
Resultados
Tabla 8 - compuesto de mimilina 3 nmol/kg y efectos sobre la reducción de la ingestión de alimentos en el lapso de tiempo de 0-24 horas des ués de la administración de 24-48 horas des ués de la administración (Ensayo I)
Tabla 9 - compuesto de mimilina 3 nmol/kg y efectos sobre la reducción de la ingestión de alimentos por encima de 0 n l rí h-24 h l mini r i n En I
Tabla 10 - compuesto de mimilina 3 nmol/kg y efectos sobre la reducción de la ingestión de alimentos de 10 o más
-
Tabla 11 - compuesto de mimilina 3 nmol/kg y efectos sobre la reducción de la ingestión de alimentos por encima de n l rí 24 h-4 h l mini r i n En I
Tabla 12 - com puesto de m im ilina 3 nm ol/kg y efectos sobre la reducción de la ingestión de alim entos de 10 o más n l rí 24 h-4 h l m ini r i n En I
Tabla 13- EC50 (pM) de los compuestos de mimilina en el ensayo del receptor de amilina y calcitonina humana funcional sin HSA Ensao IIb
Tabla 14- EC50 (pM) de compuestos de mimilina en ensayo de receptor de amilina y calcitonina humana funcional con SA Ensa o lia
Tabla 15 - Estabilidad de com uestos de m im ilina seleccionados Ensa o III
Tabla 16 - Solubilidad de com uestos de mimilina Ensa o IV
T l 17 - R r m ilin l i nin I M r m m im ilin En V V il
Tabla 1 - T1 2 m m im ilin n m ini r En ayo IX)
T l 1 - T12 m mimilin n r En X
Tabla 20 - PK del derivado de mimilina subcutáneo en cerdos LYD formulado o administrado conjuntamente con lir l i En XV
Tabla 21 - T1^ biodis onibilidad subcutánea en cerdos LYD Ensa o XVI
* la vida media terminal (t%) es la media armónica, n=3
Tabla 22 - Evaluación farmacocinética in vivo en perros Beagle después de la administración intravenosa y subcutánea Ensa o XVII
* la vida media terminal (t%) es la media armónica, n=2
Ejemplo A- Preparación de las formulaciones
Las formulaciones acuosas se preparan mediante la mezcla de soluciones madre acuosas que contienen concentraciones bien definidas de excipientes (agente antimicrobiano, agente de tonicidad, tampón de pH) con una solución madre acuosa que contiene una concentración bien definida de péptido de mimilina y/o un compuesto GLP-1. Alternativamente, el péptido de mimilina se disuelve directamente en una solución acuosa que contiene concentraciones bien definidas de excipientes y un compuesto GLP-1. Después del ajuste del pH, cada formulación se filtra de forma estéril (filtro de 0,22 qm) a recipientes de vidrio estériles.
Ejem plo B- Estabilidad de form ulaciones que com prenden com puestos de Ej. #40 y Ej. #46
Las formulaciones que contienen compuesto 0,8 mM del Ej. # 40 o compuesto 0,8 mM del Ej. # 46 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían fosfato 8 mM y se ajustaron a pH 8,2. Se preparó un conjunto adicional de formulaciones que también contenían fenol 58 mM y propilenglicol 14 mg/ml. Cada formulación se probó de acuerdo con el Ensayo ( Illa).
Tabla 23- E ^ 40 y Ej. #46
Cada formulación se probó de acuerdo con el Ensayo (XIII), y los resultados se presentan más abajo.
Ta l 24- E ili f rm l i n m r n n m l E. 4 E. 46
* Concentración de péptidos después de 8 semanas a 37 °C con relación al valor inicial
£ HMWP después de 8 semanas a 37 °C
$ Postmonómero después de 8 semanas a 37 °C menos el valor inicial
n Pérdida de pureza en %/mes a 37 °C
Ejemplo C- Solubilidad de formulaciones que comprenden compuestos de Ej. #40 y Ej. #46
Las formulaciones que contienen 0,5 mM de compuesto de Ej. # 40 o compuesto 0,5 mM de Ej. # 46 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían fosfato 10 mM y se ajustaron el pH a pH 7,4 o pH 8,2. Se preparó un conjunto adicional de formulaciones que también contenían NaCl 50 mM y/o fenol 50 mM. La concentración de péptido total se midió después de 4-5 días de almacenamiento a 5 °C o a temperatura ambiente.
Tabla 25- Solubilidad de form ulaciones que com prenden com puestos de Ej. # 40 y Ej. #46
Ejemplo D- Estabilidad de formulaciones de compuestos de Ej. #46
Cuatro formulaciones que contienen 0,3 mM o 0,03 mM del compuesto de Ej. # 46 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían 16 mg/ml de glicerol y el pH se ajustó a pH 7,4. Además de eso, dos de las formulaciones contenían fenol 19 mM, m-cresol 19 mM, fosfato 5 mM, NaCl 20 mM y las otras dos formulaciones contenían m-cresol 28 mM. Todas las formulaciones se probaron de acuerdo con el Ensayo ( Illa).
Tabla 26-^ Estabilidad de formulaciones de com uestos de E. #46
Ejemplo E- Estabilidad de formulaciones que comprenden el compuesto de Ej. #40
Las formulaciones que contienen 0,2 mM del compuesto de Ej. # 40 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían fosfato 8 mM. El pH se ajustó a pH 8,2. Además de eso, cuatro de las formulaciones contenían una concentración creciente de propilenglicol (10-20-50-100 mg/ml) mientras que otras cuatro formulaciones contenían una concentración creciente de glicerol (10-20-50-100 mg/ml). Todas las formulaciones se probaron de acuerdo con el Ensayo (XII) antes y después de 4 semanas de almacenamiento a 5 °C y 37 °C.
Tabla 27- Estabilidad del E analó ico. #40^
Ejemplo F- Estabilidad de formulaciones que comprenden el compuesto de Ej. #2
Las formulaciones que contienen el compuesto de Ej. # 2 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A y se probaron de acuerdo con el Ensayo (Illa).
T l 2 - E ili l f rm l i n m r n l m E. 2
Ejemplo G- Estabilidad de las formulaciones que comprenden el compuesto del Ej. #2
Las formulaciones que contienen concentraciones variables del compuesto de Ej. # 2 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían propilenglicol 14 mg/ml, fenol 58 mM y fosfato 8 mM. El pH se ajustó a niveles específicos entre pH 6,6 y pH 8,6. Todas las formulaciones se probaron de acuerdo con el Ensayo (XIII).
T l 2 - E ili l f rm l i n m r n n l m l E. 2
* Concentración de péptidos después de 11 semanas a 37 °C con relación al valor inicial
£ % de HMWP después de 11 semanas a 37 °C (Formulación F74-F79) o tasa de formación de HMWP (%/mes) a 37 °C (Formulación F80-F85)
$ Postmonómero después de 11 semanas a 37 °C menos el valor inicial
n Pérdida de pureza en %/mes a 37 °C
Ejemplo H- Estabilidad de formulaciones que comprenden el compuesto de Ej. #2
Las formulaciones que contienen de 0,05 a 2 mM del compuesto de Ej. # 2 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían propilenglicol 14 mg/ml, fenol 58 mM y fosfato 8 mM, pH 8,2. Todas las formulaciones se probaron de acuerdo con el Ensayo (XIII).
Tabla 30- Estabilidad de las formulaciones ue com renden el com uesto del E. #2
* Concentración de péptidos después de 8 semanas a 37 °C con relación al valor inicial £ HMWP después de 8 semanas a 37 °C
$ Postmonómero después de 8 semanas a 37 °C menos el valor inicial (nd = no es posible detectar) n Pérdida de pureza en %/mes a 37 °C
Ejemplo I- Estabilidad de formulaciones que comprenden el compuesto del Ej. #2
Las formulaciones que contienen de 0,01 a 0,5 mM de compuesto de Ej. #2 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían propilenglicol 14 mg/ml, fenol 58 mM y fosfato 8 mM, pH 8,2. Todas las formulaciones se probaron de acuerdo con el Ensayo (XIII).
Tabla 31- Estabilidad de las form ulaciones que com prenden el com puesto del Ej. #2
* Concentración de péptidos después de 8 semanas a 37 °C con relación al valor inicial
n Pérdida de pureza en %/mes a 37 °C
Ejemplo J- Estabilidad de la formulación que comprende el compuesto de Ej. #2
Las formulaciones que contienen de 2,7 pM a 2,7 mM de compuesto de Ej. # 2 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A. Todas las formulaciones contenían propilenglicol 14 mg/ml, fenol 58 mM y fosfato 8 mM, pH 7,4. Todas las formulaciones se probaron de acuerdo con el Ensayo (XIII).
T l 2- E ili ^ l f rm l i n m r n n l m l E. 2
* Concentración de péptidos después de 11 semanas a 37 °C con relación al valor inicial
£ HMWP después de 11 semanas a 37 °C
n Pérdida de pureza en %/mes a 37 °C
Ejemplo K- Estabilidad de unas formulaciones que comprenden el compuesto de EX. #2
Las formulaciones que contienen un compuesto del Ej. #2 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A y se probaron de acuerdo con el ENSAYO (XIII).
T l - E ili ^ f rm l i n m r n n l m l E. 2
* Concentración de péptidos después de un mes a 37 °C con relación al valor inicial
£ HMWP después de un mes a 37 °C
$ Postmonómero después de un mes a 37 °C menos el valor inicial
Ejemplo L- Estabilidad de formulaciones conjuntas que comprenden el compuesto de Ej. #2 En combinación con liraglutida
Las formulaciones conjuntas que contienen un compuesto de Ej. # 2 y liraglutida se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A junto con monoformulaciones que contienen la misma cantidad de los dos componentes peptídicos. Todas las formulaciones (mono y conjuntas) se probaron de acuerdo con ENSAYO ( Illa) y ENSAYO (XIII).
Tabla 34- Estabilidad de las formulaciones conjuntas que comprenden el compuesto de Ej. # 2 en combinación con liraglutida
a 1 mg/ml Ej. # 2 ~ 0,27 mM; 1 mg/ml de liraglutida ~ 0,27 mM
* Concentración de péptidos después de doce semanas a 37 °C con relación al valor inicial
£ Tasa de formación de HMWP a 37 °C (%/mes)
# Detección UV-215 nm; la línea de base no separada de la liraglutida
n Detección UV-280 nm
Ejemplo M- Estabilidad de formulaciones conjuntas que comprenden el compuesto de Ej. # 2 en combinación con semaglutida
Las formulaciones conjuntas que contienen el compuesto de Ej. # 2 y semaglutida se prepararon de acuerdo con el Ejemplo A junto con monoformulaciones que contienen la misma cantidad de los dos componentes peptídicos. Todas las formulaciones (mono y conjuntas) se probaron de acuerdo con ENSAYO ( Illa) y ENSAYO (XIII).
Tabla 35- Estabilidad de las formulaciones conjuntas que comprenden el compuesto de Ej. # 2 en combinación con sema lutida
a 1 mg/ml Ej. # 2 ~ 0,27 mM; 1 mg/ml semaglutida ~ 0,24 mM
* Concentración de péptidos después de doce semanas a 37 °C con relación al valor inicial
£ Tasa de formación de HMWP a 37 °C (%/mes)
$ La recuperación de péptidos totales refleja la recuperación de Ej. # 2 y semaglutida en total (Ej. # 2 eluye conjuntamente con semaglutida)
h Detección UV-280 nm de semaglutida
Ejemplo N- Compuesto Ej. # 2 cuando se formula conjuntamente con liraglutida: Efecto sobre el peso corporal mediante el uso del modelo de rata DIO ENSAYO (XIV)
La monoterapia con liraglutida y compuesto de Ej. #2 indujo una reducción del 5,9 % y del 10,9 % en el peso corporal a las dosis dadas, respectivamente. La adición del compuesto Ej. #2 en el día 15 al régimen de tratamiento con liraglutida provocó una reducción adicional del peso corporal del 9,7 % en el día 28 con relación a la monoterapia con liraglutida. Ver la Figura 1 y la Tabla 36.
Tabla 36- Efectos sobre la reducción del peso corporal con liraglutida y compuesto de Ej. # 2 a las dosis dadas
ENSAYO XIV
a-d p<0.05, ANOVA unidireccional y prueba de comparaciones múltiples de Tukey para cada día; los grupos no conectados por la misma letra (en cada columna) son significativamente diferentes entre sí. Resultados expresados como media ± SEM, n=10.
T l 7- R r milin l i nin I M r m mimilin En V VlI
Claims (16)
1. Un péptido de mimilina que comprende una secuencia que es al menos 66 % idéntica a EASELSTAALGRLSAELHELATLPRTETGPESP (SEQ ID NO: 1) y no comprende ninguna N; en donde el péptido es un agonista del receptor de amilina y/o un agonista del receptor de calcitonina.
2. El péptido de mimilina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho péptido de mimilina comprende hasta 11, preferentemente, 10, 9, 8 o 7, con la máxima preferencia, 6, 5, 3, 2 o 1 de los siguientes aminoácidos o modificaciones con relación a la SEQ ID NO: 1:
a. E o ningún aminoácido en la posición -1,
b. E, A o ningún aminoácido en la posición 1,
c. A, L o P en la posición 2,
d. S o P en la posición 3,
e. E, P, K, Q o G en la posición 4,
f. L, V, I o H en la posición 5,
g. S, T o H en la posición 6,
h. T en la posición 7,
i. L o A en la posición 8,
j. A, V, I, S o T en la posición 9,
k. L, A, I, H o V en la posición 10,
l. G en la posición 11,
m. R, H o K en la posición 12,
n. L en la posición 13,
o. S, T o E en la posición 14,
p. A, Q, E, e o T en la posición 15,
q. E, R, K o Q en la posición 16,
r. L o I en la posición 17,
s. H o A en la posición 18,
t. E, R o K en la posición 19,
u. L, I o V en la posición 20,
v. A, Q, S, E o T en la posición 21,
w. T en la posición 22,
x. L o Y en la posición 23,
y. P en la posición 24,
z. R, P, H o K en la posición 25,
aa. T en la posición 26,
bb. E, Q, G o K en la posición 27,
cc. T o P en la posición 28,
dd. G en la posición 29,
ee. P, S o T en la posición 30,
ff. E, Q, G, A, P o K en la posición 31,
gg. T, S, H, P o A en la posición 32,
hh. P, Y, H, F, L, S, G o A en la posición 33,
ii. G o K en la posición 34 o ningún aminoácido.
3. El péptido de mimilina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho péptido de mimilina comprende hasta 11, preferentemente, 10, 9, 8 o 7, con la máxima preferencia, 6, 5, 3, 2 o 1 de los siguientes aminoácidos o modificaciones con relación a la SEQ ID NO: 1:
a. E o ningún aminoácido en la posición -1,
b. E en la posición 1,
c. A, L o P en la posición 2,
d. S o P en la posición 3,
e. E, P, K, Q o G en la posición 4,
f. L, V, I o H en la posición 5,
g. S en la posición 6,
h. T en la posición 7,
i. A en la posición 8,
j. A, V o T en la posición 9,
k. L, o I en la posición 10,
l. G en la posición 11,
m. R, H o K en la posición 12,
n. L en la posición 13,
o. S, T o E en la posición 14,
p. A en la posición 15,
q. E en la posición 16,
r. L o I en la posición 17,
s. H o A en la posición 18,
t. E en la posición 19,
u. L en la posición 20,
v. A en la posición 21,
w. T en la posición 22,
x. L o Y en la posición 23,
y. P en la posición 24,
z. R en la posición 25,
aa. T en la posición 26,
bb. E en la posición 27,
cc. T o P en la posición 28,
dd. G en la posición 29,
ee. P, S o T en la posición 30,
ff. E o G en la posición 31,
gg. T o S en la posición 32,
hh. P o Y en la posición 33,
ii. G o K en la posición 34 o ningún aminoácido.
4. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el residuo de aminoácido en la posición 30 es S y el residuo de aminoácido en la posición 31 es G, en donde la numeración de aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
5. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el residuo de aminoácido en la posición 9 es V y/o el residuo de aminoácido en la posición 1 es E, en donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
6. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el residuo de aminoácido en la posición 33 es P, en donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
7. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho péptido tiene una amida c-terminal.
8. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho péptido de mimilina se derivatiza en el aminoácido N-terminal o cualquier K dentro de dicha secuencia del péptido de mimilina.
9. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho péptido de mimilina no comprende un puente disulfuro entre los aminoácidos en las posiciones 2 y 8, en donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO: 1.
10. Un derivado de mimilina, en donde un péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores se derivatiza con una cadena lateral que comprende un resto prolongador y un enlazador, en donde dicho enlazador preferentemente se selecciona de la lista de gGlu, gGlu-OEG, gGlu-OEG-OEG, gGlu-OEG-OEG-OEG, gGlu-OEG-OEG-OEG-OEG, gGlu-OEG-OEG-OEG-OEG-OEG.
11. El derivado de mimilina de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho resto prolongador es un ácido graso o diácido que comprende, preferentemente, entre 14 y 20 átomos de carbono.
12. El derivado de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, que es un agonista del receptor de amilina y calcitonina.
13. El compuesto de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que se selecciona de los compuestos enumerados en la Tabla 16, en donde la mimilina es la SEQ ID NO: 1:
Tabla 16
14. El compuesto de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que se selecciona de los compuestos enumerados en la Tabla 9, en donde mimilina es la SEQ ID NO: 1:
Tabla 9
15. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el derivado de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, para su uso en un medicamento.
16. El péptido de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el derivado de mimilina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, para su uso en el tratamiento de sujetos que padecen
sobrepeso, obesidad, diabetes tipo I, diabetes tipo II, osteoporosis y/o dolor neuropático.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14183551 | 2014-09-04 | ||
| PCT/EP2015/069996 WO2016034604A1 (en) | 2014-09-04 | 2015-09-02 | Novel amylin and calcitonin receptor agonist |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2887370T3 true ES2887370T3 (es) | 2021-12-22 |
Family
ID=51483301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15766071T Active ES2887370T3 (es) | 2014-09-04 | 2015-09-02 | Nuevo agonista del receptor de amilina y calcitonina |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9593149B2 (es) |
| EP (1) | EP3189071B1 (es) |
| JP (3) | JP6728141B2 (es) |
| CN (1) | CN106687474A (es) |
| AR (1) | AR101742A1 (es) |
| ES (1) | ES2887370T3 (es) |
| TW (1) | TW201625671A (es) |
| WO (1) | WO2016034604A1 (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11201707286UA (en) | 2015-03-18 | 2017-10-30 | Zealand Pharma As | Amylin analogues |
| US10071140B2 (en) | 2016-09-09 | 2018-09-11 | Zealand Pharma A/S | Amylin analogues |
| JP7076442B2 (ja) | 2016-11-07 | 2022-05-27 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | Ｐｅｇ化合物のｄｃｈｂｓ活性エステル及びその使用 |
| CN109248323B (zh) * | 2017-07-14 | 2023-09-08 | 杭州先为达生物科技有限公司 | 酰化的glp-1衍生物 |
| US11274158B2 (en) | 2018-01-30 | 2022-03-15 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods and compositions for treating inflammatory or autoimmune diseases or conditions using calcitonin receptor activators |
| AU2019357621A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-05-27 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Human amylin analog polypeptides and methods of use |
| CN110467666A (zh) * | 2019-09-17 | 2019-11-19 | 湖北强耀生物科技有限公司 | 一种新型胰岛淀粉样多肽的合成方法 |
| AR124295A1 (es) | 2020-12-18 | 2023-03-15 | Lilly Co Eli | Agonistas duales del receptor de amilina y calcitonina y usos de los mismos |
| EP4144362A1 (en) | 2021-09-06 | 2023-03-08 | Adocia | Compositions comprising short-acting hormones for treating or preventing obesity and pumps comprising said composition |
| WO2022248419A2 (en) | 2021-05-22 | 2022-12-01 | Adocia | Compositions comprising short-acting hormones for treating or preventing obesity and pumps comprising said composition |
| EP4129324A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-08 | Adocia | Compositions comprising at least an amylin receptor agonist and a glp-1 receptor agonist |
| WO2024050289A1 (en) | 2022-08-29 | 2024-03-07 | Eli Lilly And Company | Compositions for oral delivery |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4414149A (en) | 1983-03-04 | 1983-11-08 | Armour Pharmaceutical Company | Glycine8 -D-arginine24 calcitonin |
| US4495097A (en) | 1983-04-04 | 1985-01-22 | Armour Pharmaceutical Company | Des-serine2 -glycine8 calcitonin |
| US4659804A (en) | 1984-11-01 | 1987-04-21 | Armour Pharmaceutical Company | (Bis-1,7-S-acetamidomethyl-L-cysteine)salmon calcitonin |
| US4622386A (en) * | 1985-03-28 | 1986-11-11 | Armour Pharmaceutical Company | [1,7-di-alanine]calcitonin |
| EP0297159A1 (en) * | 1987-07-01 | 1989-01-04 | Armour Pharmaceutical Company | [N-Acyl, 1,7-Di-Aline] calcitonins, method for their preparation, pharmaceutical compositions and use |
| US5153308A (en) | 1988-06-16 | 1992-10-06 | Teijin Limited | S-sulfonated calcitonin derivatives |
| US6143718A (en) * | 1995-06-07 | 2000-11-07 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of Type II diabetes mellutis with amylin agonists |
| CN1064051C (zh) | 1997-04-30 | 2001-04-04 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 |
| US8076288B2 (en) * | 2004-02-11 | 2011-12-13 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Hybrid polypeptides having glucose lowering activity |
| EP1912666A2 (en) | 2005-07-22 | 2008-04-23 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Use of amylin and amylin agonists as cardioprotective or myoprotective agents |
| EP2293811A1 (en) * | 2008-06-25 | 2011-03-16 | Novo Nordisk A/S | Derivatised hybrid peptides of amylin and salmon calcitonin |
| AU2010206614B2 (en) | 2009-01-22 | 2015-03-26 | Keybioscience Ag | Treatment for obesity |
| AU2010223329B2 (en) | 2009-03-12 | 2016-07-21 | Keybioscience Ag | Treatment of diabetes and metabolic syndrome |
| DK3241558T3 (da) * | 2010-09-28 | 2021-04-26 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Højopløselige leptiner |
| SG194998A1 (en) * | 2011-05-25 | 2013-12-30 | Amylin Pharmaceuticals Llc | Amylin peptides and derivatives and uses thereof |
| MY161773A (en) * | 2011-06-10 | 2017-05-15 | Novo Nordisk As | Amylin analogues and pharmaceutical compositions thereof |
-
2015
- 2015-09-02 ES ES15766071T patent/ES2887370T3/es active Active
- 2015-09-02 EP EP15766071.3A patent/EP3189071B1/en active Active
- 2015-09-02 AR ARP150102805A patent/AR101742A1/es unknown
- 2015-09-02 TW TW104128938A patent/TW201625671A/zh unknown
- 2015-09-02 WO PCT/EP2015/069996 patent/WO2016034604A1/en active Application Filing
- 2015-09-02 CN CN201580046850.8A patent/CN106687474A/zh active Pending
- 2015-09-02 JP JP2017512822A patent/JP6728141B2/ja active Active
-
2016
- 2016-05-10 US US15/151,093 patent/US9593149B2/en active Active
-
2017
- 2017-01-27 US US15/417,671 patent/US10174082B2/en active Active
-
2020
- 2020-07-01 JP JP2020114038A patent/JP7095027B2/ja active Active
-
2022
- 2022-06-22 JP JP2022100480A patent/JP2022130522A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017530108A (ja) | 2017-10-12 |
| US20160272683A1 (en) | 2016-09-22 |
| EP3189071B1 (en) | 2021-07-28 |
| JP6728141B2 (ja) | 2020-07-22 |
| US20170145059A1 (en) | 2017-05-25 |
| US10174082B2 (en) | 2019-01-08 |
| TW201625671A (zh) | 2016-07-16 |
| CN106687474A (zh) | 2017-05-17 |
| AR101742A1 (es) | 2017-01-11 |
| JP2020169197A (ja) | 2020-10-15 |
| US9593149B2 (en) | 2017-03-14 |
| EP3189071A1 (en) | 2017-07-12 |
| JP2022130522A (ja) | 2022-09-06 |
| WO2016034604A1 (en) | 2016-03-10 |
| JP7095027B2 (ja) | 2022-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2887370T3 (es) | Nuevo agonista del receptor de amilina y calcitonina | |
| TWI694082B (zh) | 選擇性ｐｙｙ化合物及其用途 | |
| TWI809515B (zh) | 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途 | |
| TWI810937B (zh) | 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途 | |
| EP3068421B1 (en) | Selective pyy compounds and uses thereof | |
| KR102066987B1 (ko) | 폴리펩티드 | |
| ES2805326T3 (es) | Coagonistas estables del receptor de GLP-1/glucagón basados en GLP-1 | |
| JP2017525656A (ja) | 医療用のｇｌｐ−１／グルカゴン受容体コアゴニスト | |
| WO2016124687A1 (en) | Selective pyy compounds and uses thereof | |
| ES2754048T3 (es) | Coagonistas de receptores de GLP-1/glucagón prolongados y estables para uso médico | |
| ES2732015T3 (es) | Compuestos de PYY selectivos y sus usos | |
| ES2772223T3 (es) | Polipeptidos |