ES2625735T3 - Análogos y derivados de GLP-1 - Google Patents

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ES2625735T3 ES10790788.3T ES10790788T ES2625735T3 ES 2625735 T3 ES2625735 T3 ES 2625735T3 ES 10790788 T ES10790788 T ES 10790788T ES 2625735 T3 ES2625735 T3 ES 2625735T3
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Christoph Kalthoff
Jesper Lau
Jane Spetzler
Patrick William Garibay
Jacob Kofoed
Lars Linderoth
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Novo Nordisk AS
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Abstract

Un análogo de GLP-1 que comprende un residuo de histidina en una posición correspondiente a la posición 31 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1), un residuo de glutamina en una posición correspondiente a la posición 34 de GLP 1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) y un máximo de ocho modificaciones de aminoácidos en comparación con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1); en el que el residuo de histidina se designa H31 y el residuo de glutamina se designa Q34; o una sal, una amida o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCION
Analogos y derivados de GLP-1 CAMPO DE LA INVENClON
La presente invencion se refiere a analogos y derivados del peptido similar a glucagon de tipo 1 (GLP-1) que com- prenden una histidina en la posicion 31 y una glutamina en la posicion 34, y a su uso farmaceutico.
incorporaciOn por referencia de la lista de secuencias
La Lista de Secuencias, titulada "LISTA DE SECUENCIAS", tiene 582 bytes, fue creada el 28-NOV-2010 y se incorpora en esta memoria por referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENClON
El documento WO 00/16797 se refiere al uso de GLP-1 o analogos en el tratamiento del accidente cerebrovascular e incluye una serie de propuestas para el diseno de analogos y derivados de GLP-1 con propiedades estimulantes de la insulina mejoradas o con una mayor resistencia a la degradacion en el plasma.
El documento WO 2006/096515 se refiere a protemas de fusion de transferrina de peptidos GLP-1, tales como GLP- 1 (7-37), que se ha modificado mediante la mutacion de K34 a Q, A o N (reivindicacion 16 en ese documento).
El documento WO 2009/030771 se refiere a peptidos, tales como GLP-1 derivatizado con A-B-C-D-, incluyendo algunos en los que K34 se ha mutado a Q (Ejemplos 68, 69, 71).
El documento de patente de EE.UU. n° 5.545.618 se refiere a analogos de GLP-1 utiles para el tratamiento de la diabetes e incluye una serie de propuestas para el diseno de analogos y derivados de GLP-1 con propiedades estimulantes de la insulina mejoradas o con una mayor resistencia a la degradacion en el plasma.
La liraglutida, un derivado de GLP-1 para administrar una vez al dfa que esta comercializado por Novo Nordisk A/S, se describe en el Ejemplo 37 del documento WO 98/08871.
La semaglutida, un derivado de GLP-1 para administrar una vez por semana que esta en desarrollo en Novo Nordisk A/S, se describe en el Ejemplo 4 del documento WO 06/097537.
COMPENDIO DE LA INVENClON
La invencion se refiere a analogos de GLP-1 y a derivados de los mismos.
En el analogo de GLP-1 de la invencion, los residuos de aminoacidos naturales en la posicion 31 asf como en la 34, es decir, W y K, respectivamente, se han sustituido por H y Q, respectivamente.
Se puede modificar en total un maximo de diez aminoacidos del analogo, en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) natural, incluyendo las sustituciones en la posicion 31 y 34.
Mas en particular, la invencion se refiere a un analogo de GLP-1 que comprende un residuo de histidina en una posicion correspondiente a la posicion 31 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) y un residuo de glutamina en una posi- cion correspondiente a la posicion 34 de GLP-1 (7-37).
Por lo tanto, se puede decir que el analogo comprende o tiene, H31 y Q34. El analogo tiene ademas, preferentemente, un maximo de diez modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
La invencion tambien se refiere a un derivado de este analogo, asf como a una sal, una amida o un ester farmaceu- ticamente aceptable del analogo y a una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del derivado.
La invencion describe el uso farmaceutico de estos compuestos, preferiblemente para el tratamiento y/o la preven- cion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos de la alimentacion, enfer- medades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedad cntica y/o smdrome de ovario poliqmstico; y/o para mejorar los parametros de lfpidos, mejorar la funcion de las celulas p y/o para retrasar o prevenir la progresion de una enfermedad diabetica.
La invencion se refiere al uso farmaceutico de estos compuestos, preferiblemente para el tratamiento y/o la preven- cion de todas las formas de diabetes, incluyendo trastornos de la alimentacion, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales y/o smdrome de ovario poliqmstico; y/o para retrasar o prevenir la progresion de una enfermedad diabetica.
La invencion se refiere ademas a productos intermedios en forma de cadenas laterales, que son relevantes para la preparacion de ciertos derivados de GLP-1 de la invencion.
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Los peptidos y los derivados de la invencion son biologicamente activos. Ademas o alternativamente, tienen un perfil farmacocinetico de accion prolongada. Ademas o alternativamente, son estables frente a la degradacion con enzi- mas gastrointestinales. Ademas o alternativamente, tienen una biodisponibilidad oral elevada. Estas propiedades son importantes en el desarrollo de compuestos de GLP-1 de nueva generacion para una administracion subcuta- nea, intravenosa y/o, en particular, oral.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La invencion describe un analogo de GLP-1 que comprende un residuo de histidina en una posicion correspondiente a la posicion 31 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1), un residuo de glutamina en una posicion correspondiente a la posicion 34 de GLP-1 (7-37) y un maximo de diez modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1); en donde el residuo H se designa H31 y el residuo Q se designa Q34; o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
La invencion se refiere a un analogo de GLP-1 que comprende un residuo de histidina en una posicion correspondiente a la posicion 31 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1), un residuo de glutamina en una posicion correspondiente a la posicion 34 de GLP-1 (7-37) y un maximo de ocho modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (737) (SEQ ID NO: 1); en donde el residuo de histidina se designa H31 y el residuo de glutamina se designa Q34; o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
La invencion tambien se refiere a un derivado de este analogo y a una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo; asf como al uso farmaceutico del derivado y del analogo.
Se describen dos productos intermedios (Chem. 67 y Chem. 68), en donde PG representa un grupo protector.
En lo que sigue, las letras griegas pueden estar representadas por su sfmbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; £ = epsilon; y = gamma; u> = omega; etc. Ademas, la letra griega p puede estar repre- sentada por "u", por ejemplo, en pl = ul o en pM = uM.
Un asterisco (*) en una formula qrnmica designa i) un punto de fijacion, ii) un radical y/o iii) un electron no comparti- do.
Analogos de GLP-1
La expresion "analogo GLP-1" o "analogo de GLP-1", tal como se usa en esta memoria, se refiere a un peptido o a un compuesto, que es una variante del peptido similar a glucagon de tipo 1 humano (GLP-1 (7 -37)), cuya secuencia se incluye en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 1. El peptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 tambien se puede designar GLP-1 "natural".
En la lista de secuencias, al primer residuo de aminoacido de SEQ ID NO: 1 (histidina) se le asigna el n° 1. Sin embargo, en lo sucesivo - de acuerdo con la practica establecida en la tecnica - este residuo de histidina se conoce como n° 7 y los residuos de aminoacidos posteriores se numeran en consecuencia, terminando con glicina n° 37. Por lo tanto, en general, cualquier referencia en este documento a un numero de residuo de aminoacido o a un numero de posicion de la secuencia de GLP-1 (7-37), es para la secuencia que comienza con His en la posicion 7 y termina con Gly en la posicion 37.
En una realizacion particular, el analogo de GLP-1 de la invencion se refiere a un peptido GLP-1 (7 -37) modificado en el que se ha cambiado una serie de residuos de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7- 37) natural (SEQ ID NO: 1). Estos cambios o modificaciones pueden representar, independientemente, una o varias sustituciones, adi- ciones y/o deleciones de aminoacidos.
Los analogos de GLP-1 de la invencion se pueden describir haciendo referencia a i) el numero del residuo de ami- noacido en GLP-1 (7-37) natural, que se corresponde con el residuo de aminoacido que esta modificado (es decir, la posicion correspondiente en GLP-1 natural) y a ii) la modificacion real. Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no limitantes de la nomenclatura de analogos adecuados, tal y como se usa en el presente documento.
El compuesto de la invencion es un analogo de GLP-1, GLP-1 (7-37), que comprende un residuo de histidina en una posicion correspondiente a la posicion 31 de GLP-1 (7-37), un residuo de glutamina en una posicion correspondiente a la posicion 34 de GLP-1 (7-37) y un maximo de diez modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7-37), en donde GLP-1 (7-37) se refiere a GLP-1 (7-37) natural que tiene la SEQ ID NO: 1.
Si, por ejemplo, el analogo de la invencion tuviera solo dos modificaciones de aminoacidos en total, a saber, las dos modificaciones a las que se hace referencia espedficamente, esto significa que la secuencia de aminoacidos del analogo es por lo demas identica a la de GLP-1 natural y tales analogos se pueden designar entonces, por ejemplo, (H31,Q34)-gLp-1(7-37). Esto representa la secuencia de aminoacidos de GlP-1 natural (SEQ ID NO: 1), en donde W en la posicion 31 se ha sustituido por H y K en la posicion 34 se ha sustituido por Q. Este analogo tambien se puede designar [His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido, [His31,Gln34]GLP-1(7-37) o simplemente (31 H, 34Q), en donde la referencia a GLP-1 (7- 37) esta implfcita.
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Otro ejemplo de un analogo de la invencion es [Aib8,His31,Gln34]GLP-1-(7-37) que tiene un total de 3 modificaciones de aminoacidos, en el que la alanina en la posicion 8 se ha sustituido por acido alfa-aminoisobutmco (Aib), ademas de las dos sustituciones en las posiciones 31 y 34, mencionadas anteriormente. Este analogo se puede designar simplemente (8Aib, 31 H, 34Q), en donde esta impKcita la referencia a GLP-1 (7-37).
A modo de otro ejemplo adicional, [Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36] GLP-1-(7-37)il-Glu designa otro analogo de GLP-1 (7-37) de la invencion, con un total de 6 modificaciones de aminoacidos, en el que la alanina en la posicion 8 se ha sustituido por acido aminoisobutmco (Aib), la alanina en la posicion 30 se ha sustituido por acido glutamico, el tripto- fano en la posicion 31 se ha sustituido por histidina, la lisina en la posicion 34 se ha sustituido por glutamina, la argi- nina en la posicion 36 se ha sustituido por lisina y se ha anadido un acido glutamico en el extremo C-terminal, en la posicion n° 38. Este analogo se puede designar simplemente (8Aib, 30E, 31 H, 34Q, 36K, 38E), en donde esta implf- cita la referencia a GLP-1 (7-37).
A modo de otro ejemplo adicional, des7 (o Des7) en relacion con un analogo de GLP-1 (7-37), se refiere a un analo- go, en el que el aminoacido correspondiente al aminoacido N-terminal de GLP 1 (7-37), histidina, se ha eliminado. Este analogo tambien se puede designar GLP-1 (8-37).
De manera similar, (des7+des8); (des7, des8); (des7-8); o (Des7,Des8) en relacion con un analogo de GLP-1 (7-37), se refiere a un analogo en el que se han eliminado los dos aminoacidos N-terminales, histidina y alanina. Este ana- logo tambien se puede designar GLP-1 (9-37).
A modo de otro ejemplo adicional, un analogo "que comprende Des7 o Imp7", se refiere a un analogo de GLP-1 (737), que, en comparacion con GLP-1 natural, comprende una delecion de histidina en la posicion 7 o una sustitucion de histidina en la posicion 7 por acido imidazopropionico (Imp), respectivamente.
Los analogos "que comprenden" ciertas modificaciones especificadas pueden comprender modificaciones adiciona- les, en comparacion con SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, ejemplos no limitantes de analogos de la invencion que comprenden Des7 o Imp7, son las partes peptfdicas de Chem. 31, Chem. 37, Chem. 40 y Chem. 41, de los cuales todos, excepto Chem. 40 son derivados de la invencion (Chem. 40 es un analogo de la invencion).
Ejemplos no limitantes de un analogo que comprende Des7, His31 y Gln34 son los siguientes: [Des7,His31,Gln34]GLP-1(7-37) peptido y W 3H-Imidazol-4-il-acetil][His31,Gln34]GLP-1(8-37)-peptido. En el ultimo compuesto, un mimetico monopeptido de His esta fijado al nuevo extremo N-terminal, Ala 8, a traves de un enlace amida.
Los mimeticos de His- o His-Ala adecuados que se pueden utilizar como un tipo de sustituto de los aminoacidos N- terminales delecionados, en su caso, comprenden una estructura de anillo aromatico heterodclico que contiene nitrogeno, por ejemplo, piridina o imidazol. Los mimeticos de His- o His-Ala preferidos son derivados de un imidazol o una piridina, aparte de His y His-Ala, en una realizacion tienen un sustituyente con un grupo acido carboxflico libre, el cual puede formar un enlace amida con un grupo amino del aminoacido N-terminal del peptido. El termino imidazol se refiere a imidazoles como una clase de heterociclos con una estructura de anillo parecida, pero con diferentes sustituyentes, y viceversa para piridina.
Como se desprende de los ejemplos anteriores, los residuos de aminoacidos se pueden identificar por su nombre completo, su codigo de una letra y/o su codigo de tres letras. Estas tres formas son totalmente equivalentes.
Las expresiones "una posicion equivalente a" o "posicion correspondiente" se pueden utilizar para caracterizar el sitio de la modificacion en una secuencia modificada de GLP-1 (7-37), haciendo referencia a GLP-1 (7-37) natural (SEQ ID NO: 1). Las posiciones equivalentes o correspondientes se deducen facilmente, al igual que el numero de modificaciones, por ejemplo, mediante simple escritura a mano e inspeccion visual; y/o se puede emplear un pro- grama convencional de alineamiento de protemas o peptidos, tal como "align", que es un alineamiento de Needle- man-Wunsch. El algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa align de Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, se puede utilizar la matriz de puntuacion por defecto BLOSUM50 y la matriz de identidad por defecto, y la penalizacion por el primer residuo en un hueco se puede fijar en -12 o preferiblemente en -10, y las penalizaciones por residuos adicionales en un hueco en -2 o preferi- blemente en -0,5.
A continuacion se ha insertado un ejemplo de un alineamiento de este tipo, en donde “sequence” n° 1 es SEQ ID NO: 1, y “sequence” n° 2 es el analogo (8Aib, 30E, 31 H, 34Q, 36K, 38E) de la misma:
n° 1: GLP-1 (7-37):
n° 2: GLP-1 (7-37) _Analogo
n° de matriz: EBLOSUM62
valor de la penalizacion por hueco: 10,0
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valor de la penalizacion por extension: 0,5
valor de la longitud: 32
n° de identidades: 26/32 (81,2%)
n° de similitudes: 28/32 (87,5%)
n° de huecos: 1/32 (3,1%)
n° de la puntuacion: 132,0
1: 1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG- 31
I . I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . . I I : I :
2: 1 HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEHLVQGKGE 32
En caso de incluir aminoacidos no naturales tales como Imp, N-metil-Ala y/o Aib en la secuencia, o en el caso de mimeticos de His-Ala, se pueden reemplazar por X con fines de alineamiento. Si se desea, X se puede corregir despues manualmente.
El termino "peptido", tal y como se emplea por ejemplo, en el contexto de los analogos de la invencion, se refiere a un compuesto que comprende una serie de aminoacidos interconectados por enlaces amida (o peptido).
En una realizacion particular, el peptido esta compuesto en gran medida o predominantemente por aminoacidos conectados entre sf por enlaces amida (por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 80% o al menos 90%, en masa molar). En otra realizacion particular, el peptido consiste en aminoacidos interconectados por enlaces peptidicos.
Los peptidos de la invencion comprenden al menos cinco aminoacidos constituyentes conectados por enlaces peptf- dicos. En realizaciones particulares, el peptido comprende al menos 10, preferiblemente al menos 15, mas preferi- blemente al menos 20, incluso mas preferiblemente al menos 25 o lo mas preferiblemente al menos 28 aminoacidos.
En realizaciones particulares, el peptido esta compuesto por al menos cinco aminoacidos constituyentes, preferiblemente esta compuesto por al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25 o lo mas preferiblemente esta compuesto por al menos 28 aminoacidos.
En realizaciones particulares adicionales, el peptido a) esta compuesto por o b) se compone de, i) 29, ii) 30, iii) 31 o iv) 32 aminoacidos.
En una realizacion aun mas particular, el peptido consiste en aminoacidos interconectados por enlaces peptfdicos.
Los aminoacidos son moleculas que contienen un grupo amino y un grupo acido carboxflico y, opcionalmente, uno o varios grupos adicionales, frecuentemente referidos como cadena lateral.
El termino "aminoacido" incluye aminoacidos proteogenicos (codificados por el codigo genetico, que incluyen ami- noacidos naturales y aminoacidos convencionales), asf como no proteogenicos (que no se encuentran en las protef- nas y/o no estan codificados por el codigo genetico convencional) y aminoacidos sinteticos. Por lo tanto, los aminoa- cidos se pueden seleccionar a partir del grupo de aminoacidos proteinogenos, aminoacidos no proteinogenos y/o aminoacidos sinteticos.
Ejemplos no limitantes de aminoacidos que no estan codificados por el codigo genetico son gamma- carboxiglutamato, ornitina y fosfoserina. Ejemplos no limitantes de aminoacidos sinteticos son los isomeros D de aminoacidos tales como D-alanina y D-leucina (en lo que sigue, a veces abreviados como "a", p. ej. "a8", que se refiere en consecuencia a D-Ala8) y D-leucina, Aib (acido a-aminoisobutrnco), p-alanina, N-metil-alanina y des- amino-histidina (desH, nombre alternativo acido imidazopropionico, abreviado Imp).
En lo que sigue, para todos los aminoacidos en los que no se indica el isomero optico, se entiende que es el isomero L (a menos que se especifique lo contrario).
Los analogos y derivados de GLP-1 de la invencion tienen actividad de GLP-1. Este termino se refiere a la capaci- dad de unirse al receptor de GLP-1 e iniciar una via de transduccion de senales que produce una accion insulinotro- pica u otros efectos fisiologicos, como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, los analogos y derivados de la invencion se pueden someter a ensayo para estudiar la actividad de GLP-1 usando el ensayo descrito en el Ejemplo 48 en el presente documento.
Derivados de GLP-1
El termino "derivado", tal y como se usa en el presente documento en el contexto de un peptido o analogo de GLP-1, significa un peptido GLP-1 o un analogo modificado qmmicamente, en el que uno o varios sustituyentes se han fijado covalentemente al peptido. El sustituyente tambien se puede denominar cadena lateral.
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En realizaciones particulares, la cadena lateral tiene al menos 10 atomos de carbono o al menos 15, 20, 25, 30, 35 o al menos 40 atomos de carbono. En otras realizaciones particulares, la cadena lateral puede incluir ademas al menos 5 heteroatomos, en particular, O y N, por ejemplo al menos 7, 9, 10, 12, 15, 17 o al menos 20 heteroatomos, tal como al menos 1, 2 o 3 atomos de N y/o al menos 3, 6, 9, 12 o 15 atomos de O.
Ejemplos no limitantes de derivados de GLP-1 incluyen protemas de fusion heterologas o conjugados de analogos de GLP-1, por ejemplo, con la porcion Fc de una inmunoglobulina tal como IgG, con albumina humana, con anti- cuerpos tales como una region variable de la cadena pesada de un anticuerpo que se une a glucagon o con frag- mentos o analogos de cualquiera de estos (veanse, por ejemplo, los documentos US 2007/0161087, WO 2005/058958 y WO 2007/124463 A2). Ejemplos adicionales incluyen peptidos GLP-1 PEGilados (veanse, por ejemplo, los documentos WO 2005/058954, WO 2004/093823 y WO 2006/124529), asf como peptidos GLP-1 acilados (veanse, por ejemplo, los documentos WO 98/08871, WO2005/027978, WO 2006/097537 y WO 2009/030771).
En una realizacion particular, la cadena lateral es capaz de formar agregados no covalentes con albumina, favore- ciendo con ello la circulacion del derivado con la corriente sangumea, y tambien tiene el efecto de prolongar el tiem- po de accion del derivado, debido al hecho de que el agregado del derivado de GLP-1 y la albumina se desintegran lentamente para liberar el principio activo farmaceutico. Por lo tanto, un sustituyente preferido, o una cadena lateral, como un todo, se puede denominar un resto que se une a albumina.
En otra realizacion particular, el resto que se une a albumina comprende una porcion que es particularmente rele- vante para la union a la albumina y, por lo tanto, la accion retardada, dicha porcion en consecuencia se puede denominar un resto de accion prolongada. El resto de accion prolongada puede estar en, o cerca de, el extremo opues- to al resto que se une a albumina, con respecto a su punto de fijacion al peptido.
En una realizacion aun mas particular, el resto que se une a albumina comprende una porcion entre el resto de accion prolongada y el punto de fijacion al peptido, dicha porcion se puede denominar un enlazador, un resto enlaza- dor, un espaciador o similares. La presencia de un enlazador es opcional; por lo tanto, si no esta presente un enlazador, el resto que se une a albumina puede ser identico al resto de accion prolongada.
En realizaciones particulares, el resto que se une a albumina y/o el resto de accion prolongada es lipofflico y/o esta cargado negativamente a pH fisiologico (7,4).
El resto que se une a albumina, el resto de accion prolongada o el enlazador pueden estar fijados covalentemente a un residuo de lisina del peptido GLP-1 mediante qmmica de conjugacion, tal como por alquilacion, acilacion, forma- cion de esteres o formacion de amidas; o a un residuo de cistema, tal como mediante acoplamiento a maleimida o haloacetamida (tal como bromo-/fluoro-/yodo-).
En una realizacion preferida, un ester activo del resto que se une a albumina y/o el resto de accion prolongada, op- cionalmente con un enlazador, se une covalentemente a un grupo amino de un residuo de lisina, preferiblemente el grupo amino epsilon de la misma, con formacion de un enlace amida (este proceso se conoce como acilacion).
A menos que se indique lo contrario, cuando se hace referencia a una acilacion de un residuo de lisina, se entiende que es el grupo amino epsilon del mismo.
En una realizacion, la invencion se refiere a un derivado que comprende, preferiblemente tiene, un resto que se une a albumina fijado a i) K12, ii) K16, iii) K18, iv) K22, v) K24, vi) K26, vii) K27, viii) K36 y/o ix) K37. Como se ha explicado ante- riormente, cada numero de residuo en forma de superrndice se refiere a la posicion correspondiente en GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1). Ademas, como tambien se ha explicado anteriormente, se puede utilizar una escritura ordinaria en lugar de superrndices para designar el numero de la posicion. Por ejemplo, "K12" es totalmente equivalente a "12K".
Los numeros de la posicion correspondiente se identifican preferiblemente mediante escritura a mano e inspeccion visual, o utilizando un programa de alineamiento adecuado, como se ha explicado anteriormente.
Para los presentes fines, las expresiones "resto que se une a albumina", "resto de accion prolongada" y "enlazador'' incluyen las formas sin reaccionar, asf como las formas que han reaccionado de estas moleculas. Si se refiere o no a una u otra forma, se entiende claramente por el contexto en el que se utiliza la expresion
En un aspecto, el resto que se une a albumina comprende, o consiste en, un resto de accion prolongada selecciona- do a partir de Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 y Chem. 4:
Chem. 1
: CHa-(CH2)x-CO-*
Chem. 2
: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 3
: HN4C-(CH2)x-CO-*
Chem. 4
: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-
en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-18, e y es un numero entero en el intervalo de 3-17.
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En una realizacion, *-(CH2)x-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferiblemente lineal, en el que x es un numero entero en el intervalo de 6-18.
En otra realizacion, *-(CH2)y-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferiblemente lineal, en el que y es un numero entero en el intervalo de 3-17.
En otro aspecto, el resto que se une a albumina comprende, o consiste en, un resto de accion prolongada seleccio- nado a partir de diacidos grasos y acidos grasos con un grupo fenilo o fenoxi distal (terminal), opcionalmente susti- tuido. Los sustituyentes opcionales del grupo fenilo y fenoxi tienen una masa molar no superior a 150 Da, preferiblemente no superior a 125 Da, mas preferiblemente no superior a 100 Da, incluso mas preferiblemente no superior a 75 Da o lo mas preferiblemente no superior a 50 Da. Ejemplos de sustituyentes incluyen, sin limitacion, alquilo C1- C5 inferior lineal o ramificado.
La masa molar (M) de una sustancia qrnmica es la masa de un mol de la sustancia. La masa molar se indica en Dalton, sfmbolo Da, con la definicion 1 Da = 1 g/mol.
La masa molar se puede calcular a partir de los pesos atomicos estandares y con frecuencia aparece en listados de catalogos qmmicos. La masa molar de un compuesto se determina por la suma de los pesos atomicos estandares de los atomos que forman el compuesto, multiplicada por la constante de masa molar, Mu que es igual a 1 g/mol. A modo de ejemplo, la masa molecular de terc. butilo (C4H9) es M(C4Hg) = ([4 x 12,01] + [9 x 1,008]) x 1 g/mol = 57 Da.
Los pesos atomicos estandares estan publicados por la Union Internacional de Qrnmica Pura y Aplicada (IUPAC) y tambien se han reeditado en una amplia variedad de libros de texto, catalogos comerciales, graficos murales, etc.
Para la fijacion al peptido GLP-1, el grupo acido del acido graso o uno de los grupos acidos del diacido graso, forma un enlace amida con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina en el peptido GLP-1, opcionalmente a traves de uno o varios enlazadores.
La expresion "acido graso" se refiere a acidos monocarboxflicos alifaticos que tienen de 4 a 28 atomos de carbono, preferiblemente no esta ramificado y/o tiene una numeracion par y puede estar saturado o insaturado.
La expresion "diacido graso" se refiere a acidos grasos como se han definido anteriormente pero con un grupo acido carboxflico adicional en la posicion omega. Por lo tanto, los diacidos grasos son acidos dicarboxflicos.
La nomenclatura es como es habitual en la tecnica, por ejemplo*-COOH, asf como HOOC-*, se refiere a carboxi; *- C6H4-* a fenileno; *-CO-*, asf como *-OC-*, a carbonilo (O=C<**); C6H5-O-* a fenoxi; y HN4C-* a cualquier radical tetrazolilo. En realizaciones particulares, los compuestos aromaticos, tales como los radicales fenoxi y fenileno, pue- den ser, independientemente, orto, meta o para. En otra realizacion particular, el radical tetrazolilo es 1H-tetrazol-5- ilo.
En una realizacion preferida, el resto enlazador, si esta presente, tiene de 5 a 30 atomos de C, preferiblemente de 5 a 25 atomos de C, mas preferiblemente de 5 a 20 atomos de Co lo mas preferiblemente de 5 a 17 atomos de C. En realizaciones preferidas adicionales, el resto enlazador, si esta presente, tiene de 4 a 20 heteroatomos, preferente- mente de 4 a 18 heteroatomos, mas preferiblemente de 4 a 14 heteroatomos o lo mas preferiblemente de 4 a 12 heteroatomos. Ejemplos particularmente preferidos de heteroatomos son atomos de N y O. Los atomos de H no son heteroatomos.
En otra realizacion, el enlazador comprende al menos una molecula de OEG y/o al menos un residuo de acido glutamico o mas bien los radicales correspondientes (OEG designa un dirradical de acido 8-amino-3,6- dioxaoctanico, es decir, este radical: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*).
El aminoacido acido glutamico comprende dos grupos de acido carboxflico. Su grupo gamma-carboxi se utiliza pre- ferentemente para la formacion de un enlace amida con el grupo amino epsilon de lisina o con un grupo amino de una molecula de OEG, si esta presente, o con el grupo amino de otro residuo de Glu, si esta presente. El grupo amino de Glu, a su vez, forma un enlace amida con el grupo carboxilo del resto de accion prolongada o con el grupo carboxilo de una molecula de OEG, si esta presente, o con el grupo carboxi gamma de otro Glu, si esta presente. A esta forma de inclusion de Glu se hace referencia ocasionalmente de forma breve como "gamma-Glu".
Los derivados de la invencion se pueden encontrar en diferentes formas estereoisomeras que tienen la misma formula molecular y secuencia de atomos unidos, pero que difieren solo en la orientacion tridimensional de sus atomos en el espacio. La estereoisomena de los derivados ejemplificados de la invencion se indica en la seccion experimental, en los nombres asf como en las estructuras, usando la nomenclatura convencional. Salvo que se indique lo contrario, la invencion se refiere a todas las formas estereoisomeras del derivado reivindicado.
La concentracion en plasma de los analogos y derivados de GLP-1 de la invencion se puede determinar usando cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, se puede emplear LC-MS (cromatograffa lfquida con espectroscopia de masas) o inmunoensayos, tales como RIA (radioinmunoensayo, del ingles “Radio Immuno Assay”), ELISA (ensayo por inmunoadsorcion ligado a enzimas, del ingles “Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay”) y LOCI (inmunoensayo
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luminiscente de canalizacion de ox^geno, del ingles “Luminescence Oxygen Channeling Immunoasssay”). Los protocols generales para los ensayos de RIA y ELISA adecuados se encuentran, por ejemplo, en el documento WO09/030738, en las pags. 116-118. Un ensayo preferido es el ensayo LOCI. Este ensayo se describe en el Ejemplo 51, Ejemplo 53 y Ejemplo 55 en el presente documento.
Sal, amida o ester farmaceuticamente aceptable
Los analogos, derivados y productos intermedios de la invencion pueden estar en forma de una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable.
Las sales se forman, por ejemplo, por una reaccion qmmica entre una base y un acido, por ejemplo: NH3 + H2SO4 ^ (NH4)2SO4.
La sal puede ser una sal basica, una sal de acido o puede ser ni una ni otra (es decir, una sal neutra). Las sales basicas producen iones hidroxido y las sales acidas iones hidronio en agua.
Las sales de los analogos y derivados de la invencion se pueden formar con cationes o aniones anadidos que reac- cionan con grupos anionicos o cationicos, respectivamente. Estos grupos pueden estar situados en el resto del peptido y/o en la cadena lateral de los compuestos de la invencion.
Ejemplos no limitantes de grupos anionicos de los compuestos de la invencion, incluyen grupos carboxflicos libres en la cadena lateral, en su caso, asf como en el resto del peptido. El resto del peptido frecuentemente incluye un grupo acido carboxflico libre en el extremo C-terminal y tambien puede incluir grupos carboxflicos libres en residuos de aminoacidos acidos internos, tales como Asp y Glu.
Ejemplos no limitantes de grupos cationicos en el resto del peptido incluyen el grupo amino libre en el extremo N- terminal, si esta presente, asf como cualquier grupo amino libre de residuos de aminoacidos basicos internos, tales como His, Arg y Lys.
El ester de los peptidos y derivados de la invencion, por ejemplo, puede estar formado por la reaccion de un grupo acido carboxflico libre con un alcohol o un fenol, lo que conduce a la sustitucion de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi
La formacion de un ester puede implicar al grupo carboxflico libre en el extremo C-terminal del peptido y/o a cualquier grupo carboxflico libre en la cadena lateral.
La amida de los peptidos y derivados de la invencion, por ejemplo, puede estar formada por la reaccion de un grupo acido carboxflico libre con una amina o una amina sustituida, o por la reaccion de un grupo amino libre o sustituido con un acido carboxflico.
La formacion de amidas puede implicar al grupo carboxflico libre en el extremo C-terminal del peptido, a cualquier grupo carboxflico libre en la cadena lateral, al grupo amino libre en el extremo N-terminal del peptido y/o a cualquier grupo amino libre o sustituido del peptido en el peptido y/o en la cadena lateral.
En una realizacion particular, el peptido o el derivado se encuentra en forma de una sal farmaceuticamente aceptable. En otra realizacion particular, el peptido o el derivado esta en forma de una amida farmaceuticamente aceptable, preferiblemente con un grupo amida en el extremo C-terminal del peptido. En una realizacion aun mas particular, el peptido o el derivado esta en forma de un ester farmaceuticamente aceptable.
Productos intermedios
Se describen dos productos intermedios (Chem. 67 y Chem. 68), en donde PG representa un grupo protector. Ejemplos no limitantes de grupos PG son -OH o grupos funcionalizados como un ester activado, por ejemplo, sin limita- cion, OPfp, OPnp y OSuc.
Otros esteres activados adecuados se pueden seleccionar, por ejemplo, de acuerdo con las ensenanzas de M. Bo- danszky, "Principles of Peptide Synthesis", 2a ed., Springer Verlag, 1993.
Propiedades funcionales
En un primer aspecto, los analogos y/o derivados de la invencion tienen una potencia buena. Ademas, o alternati- vamente, en un segundo aspecto, tienen un perfil farmacocinetico de accion prolongada. Ademas, o alternativamen- te, en un tercer aspecto, son estables frente a la degradacion con enzimas gastrointestinales. Ademas, o alternati- vamente, en un cuarto aspecto, tienen una afinidad de union a albumina relativamente baja. Ademas, o alternativa- mente, en un quinto aspecto, tienen una biodisponibilidad oral elevada.
Actividad biologica (potencia)
De acuerdo con el primer aspecto, los analogos y derivados son biologicamente activos o potentes.
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En una realizacion particular, la potencia y/o la actividad se refiere a la potencia in vitro, es dedr, el rendimiento en un ensayo de receptor de GLP-1 funcional, mas en particular, a la capacidad de estimular la formacion de AMPc en una lmea celular que expresa el receptor de GLP 1 humano clonado.
La estimulacion de la formacion de AMPc en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano preferentemente se puede determinar usando una lmea celular transfectada, estable tal como BHK467-12A (tk-ts13) y/o utilizando para la determinacion de AMPc un ensayo de receptor funcional, por ejemplo, basado en la competencia entre el AMPc formado endogenamente y el AMPc anadido exogenamente marcado con biotina, en donde en este ensayo el AMPc es capturado, mas preferiblemente usando un anticuerpo espedfico y/o en donde un ensayo incluso mas preferido es el ensayo de AMPc AlphaScreen, mas preferentemente el que se describe en el Ejemplo 48.
La expresion, concentracion efectiva semimaxima (CE50) se refiere generalmente a la concentracion que induce una respuesta que es la media entre el valor base y el maximo, haciendo referencia a la curva de respuesta frente a la dosis. La CE50 se utiliza como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentracion en la que se observa un 50% de su efecto maximo.
La potencia in vitro de los derivados de la invencion se puede determinar como se ha descrito anteriormente, y se determina la CE50 del derivado en cuestion. Cuanto menor sea el valor de CE50, mejor sera la potencia.
En una realizacion particular, el medio tiene la siguiente composicion (concentraciones finales en el ensayo): TRIS- HCl 50 mM; HEPES 5 mM; MgCh 10 mM, 6H2O; NaCl 150 mM; 0,01% de Tween; 0,1% de BSA; IBMX 0,5 mM; ATP 1 mM; GTP 1 uM; pH 7,4.
Un medio alternativo es: Tris-HCl 50 mM, EGTA 1 mM, MgSO4 1,5 mM, ATP 1,7 mM, GTP 20 mM, 3-isobutil-1- metilxantina (IBMX) 2 mM, 0,01% de Tween-20, pH 7,4.
En una realizacion particular adicional, los analogos y/o derivados de la invencion tienen una CE50 de 4500 pM o inferior, preferiblemente inferior a 4500 pM, mas preferiblemente inferior a 4000 pM, incluso mas preferiblemente inferior a 3500 pM o lo mas preferiblemente inferior a 3000 pM.
En otra realizacion particular, los analogos y/o derivados de la invencion son potentes in vivo, lo que se puede determinar como se conoce en la tecnica, en cualquier modelo animal adecuado, asf como en ensayos clfnicos.
El raton diabetico db/db es un ejemplo de un modelo animal adecuado y el efecto hipoglucemiante se puede determinar en tales ratones in vivo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 54 en el presente documento o como se describe en el Ejemplo 43 del documento WO09/030738.
Ademas o alternativamente, el efecto sobre la glucosa mediado por la secrecion de insulina in vivo se puede determinar en estudios farmacodinamicos en cerdos enanos (IVGTT), por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 55.
Ademas o alternativamente, el efecto sobre el consumo de alimento in vivo se puede determinar en estudios farma- codinamicos en cerdos, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 56.
Accion prolongada - union al receptor /albumina baja y alta
De acuerdo con el segundo aspecto, los analogos y/o derivados de la invencion tienen accion prolongada.
La capacidad de los analogos y/o derivados de la invencion para unirse al receptor de GLP-1 en presencia de una concentracion baja y alta de albumina, respectivamente, se puede determinar tal y como se describe en el Ejemplo 49 en el presente documento.
En general, la union al receptor de GLP-1 con una concentracion baja de albumina debe ser lo mejor que sea posi- ble, lo que se corresponde con un valor bajo de CI50.
El valor de CI50 con una concentracion alta de albumina es una medida de la influencia de la albumina sobre la union del derivado con el receptor de GLP-1. Como se sabe, los derivados de GLP-1 tambien se unen a la albumina. Este es un efecto deseable en general, que extiende su tiempo de vida en el plasma. Por lo tanto, el valor de CI50 con albumina alta, generalmente sera mas alto que el valor de CI50 con albumina baja, que se corresponde a una reduc- cion de la union al receptor de GLP-1, causada por una union de la albumina que compite con la union al receptor de GLP-1.
Una relacion alta (valor de CI50 (albumina alta) / valor de CI50 (albumina baja)), se puede tomar por tanto como una indicacion de que el derivado en cuestion se une bien a la albumina (puede tener una semivida larga) y tambien se une bien por sf mismo al receptor de GLP-1 (el valor de CI50 (albumina alta) es alto y el valor de CI50 (albumina baja) es bajo). Por otro lado, puede que no sea siempre deseable la union a albumina o que la union a albumina pueda llegar a ser demasiado fuerte. Por lo tanto, los intervalos deseables para CI50 (albumina baja) / CI50 (albumina alta) y la relacion entre alto/bajo pueden variar de un compuesto a otro, dependiendo del uso previsto y de las circunstan- cias que rodean a dicho uso, y de otras propiedades del compuesto de interes potencial.
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En una realizacion particular, la afinidad de la union al receptor de GLP-1 (CI50) en presencia de 0,005% de HSA (albumina baja) es inferior a 1000,00 nM, preferiblemente inferior a 600,00 nM, mas preferiblemente inferior a 100,00 nM o lo mas preferiblemente inferior a 50,00 nm.
Un ensayo adecuado para determinar la union al receptor con una concentracion alta y baja de albumina, se describe en el Ejemplo 49 en el presente documento.
Accion prolongada - semivida in vivo en ratas
De acuerdo con el segundo aspecto, los derivados de la invencion son de accion prolongada. En una realizacion particular, la accion prolongada se puede determinar como la semivida (Ty) in vivo en ratas despues de una administracion por via i.v. En realizaciones adicionales, la semivida es de al menos 4 horas, preferiblemente de al menos 5 horas, incluso mas preferiblemente de al menos 6 horas o lo mas preferiblemente de al menos 7 horas.
Un ensayo adecuado para determinar la semivida in vivo en ratas despues de una administracion por via i.v. se da a conocer en el Ejemplo 51 en el presente documento.
Accion prolongada - semivida in vivo en cerdos enanos
De acuerdo con el segundo aspecto, los derivados de la invencion son de accion prolongada. En una realizacion particular, la accion prolongada se puede determinar como la semivida (Ty) in vivo en cerdos enanos despues de una administracion por via i.v. En realizaciones adicionales, la semivida es de al menos 8 horas, preferiblemente de al menos 12 horas, mas preferiblemente de al menos 16 horas, aun mas preferiblemente de al menos 24 horas, incluso mas preferiblemente de al menos 36 horas o lo mas preferiblemente de al menos 48 horas.
Un ensayo adecuado para determinar la semivida in vivo en cerdos enanos despues de la administracion por via i.v. se da a conocer en el Ejemplo 52 en el presente documento.
Degradacion mediante enzimas gastrointestinales
De acuerdo con el tercer aspecto, los analogos y/o derivados de la invencion son estables o estan estabilizados frente a una degradacion con una o varias enzimas gastrointestinales.
Las enzimas gastrointestinales incluyen, sin limitacion, exo y endopeptidasas, tales como pepsina, tripsina, quimo- tripsina, elastasas y carboxipeptidasas. La estabilidad se puede someter a ensayo frente a estas enzimas gastrointestinales en forma de enzimas purificadas o en forma de extractos procedentes del sistema gastrointestinal.
En realizaciones particulares, el analogo o derivado de la invencion tiene una semivida in vitro (Ty2), en un extracto de intestino delgado de rata, dividida por la correspondiente semivida (Ty) de GLP-1 (7-37), de al menos 1, preferiblemente superior a 1,0, mas preferiblemente al menos 1,2, aun mas preferiblemente al menos 2,0, incluso mas preferiblemente al menos 3,0 o lo mas preferiblemente al menos 4,0. En otras palabras, una relacion (SI) se puede definir para cada derivado, a saber, como la semivida in vitro (Ty) del derivado en cuestion, en un extracto de intestino delgado de rata, dividida por la correspondiente semivida (Ty) de GLP-1 (7-37).
Un ensayo adecuado para determinar la semivida in vitro en un extracto de intestino delgado de rata, se describe en el Ejemplo 50 en el presente documento.
En realizaciones particulares adicionales, la estabilidad enzimatica de los derivados de la invencion, determinada utilizando un metodo adecuado, tal como el del Ejemplo 50, se mejora en comparacion con a) el compuesto del Ejemplo 68 del documento WO 2009/030771; b) el compuesto del Ejemplo 69 del documento wO 2009/030771; y/o c) el compuesto del Ejemplo 71 del documento Wo 2009/030771.
Afinidad de la union a albumina
De acuerdo con el cuarto aspecto, los derivados de la invencion tienen una afinidad de union a la albumina de suero humano, HSA, relativamente baja.
Aunque un cierto nivel de union a albumina es generalmente deseable desde un punto de vista de accion prolongada, la union a la albumina no debe ser demasiado estrecha, ya que esto podna influir de forma potencialmente nega- tiva en la union del derivado con el receptor de GLP-1, que es importante para la actividad biologica.
La afinidad de la union a HSA se puede determinar usando cualquier metodo adecuado, tal como el del Ejemplo 57 en el presente documento.
La afinidad de la union a HSA se puede expresar como Kd o Kd aparente, en donde Kd es una constante de disocia- cion que se refiere a la ecuacion de equilibrio qmmico que conduce al derivado unido a HSA.
Cuanto menor sea la constante de disociacion (Kd), mayor es la afinidad de union entre el derivado de GLP-1 y HSA.
Por tanto, segun este cuarto aspecto, la Kd o la aparente Kd de los derivados de la invencion puede ser relativamente
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alta, correspondiendose con una union a HSA relativamente baja.
Sorprendentemente, en una realizacion particular, estos derivados con una union relativamente baja a HSA tienen sin embargo un aumento de la estabilidad enzimatica, en particular frente a una degradacion con enzimas gastroin- testinales, en donde la estabilidad enzimatica se puede determinar como se describe en el Ejemplo 50 en el presente documento. Se hace tambien referencia espedficamente a la seccion titulada "Degradacion con enzimas gastroin- testinales", mas arriba.
La combinacion de una mayor estabilidad enzimatica con una afinidad de union a albumina baja, ofrece la posibili- dad de aumentar la fraccion libre del analogo o del derivado en el plasma y, por lo tanto, de aumentar la potencia in vivo. Tambien proporciona una gama de diseno mas amplia con respecto a la semivida en plasma, en comparacion con derivados de GLP-1 conocidos que generalmente tienen una afinidad de union a albumina elevada, como ha sido el objetivo hasta ahora principalmente en la prolongacion de la semivida.
Biodisponibilidad oral
De acuerdo con el quinto aspecto, los derivados de la invencion tienen una biodisponibilidad oral elevada.
La biodisponibilidad oral de los derivados comerciales de GLP-1 es muy baja. La biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1 en desarrollo para una administracion por via i.v. o s.c. tambien es baja.
Por consiguiente, existe una necesidad en la tecnica de derivados de GLP-1 con una biodisponibilidad oral mejora- da. Tales derivados podnan ser candidatos adecuados para la administracion oral, siempre y cuando su potencia sea generalmente satisfactoria y/o siempre que su semivida sea tambien generalmente satisfactoria.
Los presentes inventores han identificado una nueva clase de derivados de GLP-1, que tiene una biodisponibilidad oral sorprendentemente alta y al mismo tiempo una potencia satisfactoria, y/o semivida.
Sorprendentemente, en una realizacion particular, estos derivados que tienen una biodisponibilidad oral elevada tambien tienen una afinidad de union alta (es decir, un valor bajo de CI50) hacia el receptor de GLP-1 a una concen- tracion baja de albumina. Estas caractensticas son importantes con vistas a obtener una dosis oral diaria baja del principio activo farmaceutico, lo que es deseable por diversas razones, incluyendo, por ejemplo, una econoirna en la produccion, una probabilidad de posibles problemas de seguridad, asf como cuestiones de comodidad de la administracion y aspectos ambientales.
Sorprendentemente, en otra realizacion particular, estos derivados que tienen una biodisponibilidad oral elevada tambien presentan una union relativamente baja a la albumina de suero humano (HSA), en donde la union a HSA, por ejemplo, se puede determinar tal y como se describe en el Ejemplo 57 en el presente documento. Tambien se hace referencia espedficamente a la seccion titulada "Afinidad de la union a albumina", mas arriba.
La combinacion de una biodisponibilidad oral elevada con una afinidad de union a albumina baja, ofrece la posibili- dad de reducir la dosis del principio activo farmaceutico, lo que es deseable por diversas razones, incluyendo, por ejemplo, una economfa en la produccion, una probabilidad de posibles problemas de seguridad, asf como cuestiones de comodidad de la administracion y aspectos ambientales. Tambien proporciona una gama de diseno mas amplia con respecto a la semivida en plasma, en comparacion con derivados de GLP-1 conocidos que generalmente tienen una afinidad de union a la albumina alta.
En general, el termino biodisponibilidad de un analogo o derivado de la invencion se refiere a la fraccion de una dosis administrada del principio activo farmaceutico (API), tal como un analogo o un derivado de la invencion que llega a la circulacion sistemica sin una alteracion. Por definicion, cuando se administra un API por via intravenosa, su biodisponibilidad es del 100%. Sin embargo, cuando se administra un API a traves de otras vfas (por ejemplo, por via oral), su biodisponibilidad disminuye (debido a una absorcion incompleta y al metabolismo de primer paso). Un conocimiento sobre la biodisponibilidad es esencial para el calculo de las dosificaciones para las vfas de administracion no intravenosas.
Una biodisponibilidad oral absoluta compara la biodisponibilidad (estimada como el area bajo la curva o AUC) del API en la circulacion sistemica despues de una administracion oral, con la biodisponibilidad del mismo API despues de una administracion intravenosa. Es la fraccion del API absorbido a traves de una administracion no intravenosa, en comparacion con una administracion intravenosa correspondiente del mismo API. La comparacion debe estar normalizada a la dosis si se utilizan diferentes dosis; en consecuencia, cada AUC se corrige dividiendo la dosis correspondiente administrada.
Una concentracion de API en plasma frente a un grafico del tiempo se realiza despues de una administracion tanto oral como intravenosa. La biodisponibilidad absoluta (F) es la AUC-oral con la dosis corregida, dividida por la AUC- intravenosa.
Los derivados de la invencion tienen una biodisponibilidad oral absoluta que es mas alta que la de a) liraglutida) y/o b) semaglutida; preferiblemente al menos 10% mayor, mas preferiblemente al menos 20% mayor, incluso mas prefe-
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riblemente al menos 30% mayor o lo mas preferiblemente al menos 40% mayor. Antes de someter a ensayo la bio- disponibilidad oral, los analogos y/o derivados de la invencion se pueden formular convenientemente como se cono- ce en la tecnica de formulaciones orales de compuestos insulinotropicos, por ejemplo, utilizando una cualquiera o varias de las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.
Se ha desarrollado un ensayo, descrito en el Ejemplo 53, que se ha encontrado que es una prediccion muy buena de la biodisponibilidad oral. Segun este ensayo, despues de una inyeccion directa del derivado de GLP-1 en el lumen intestinal de ratas, se determina la concentracion (exposicion) del mismo en el plasma y se calcula la relacion de la concentracion plasmatica (pmol/l) dividida por la concentracion de la solucion de dosificacion (umol/l) para t = 30 min. Esta relacion es una medida de la biodisponibilidad intestinal y se ha mostrado que se correlaciona muy bien con los datos reales de la biodisponibilidad oral.
Las realizaciones particulares adicionales de los derivados de la invencion se describen en la seccion titulada "reali- zaciones particulares" antes de la seccion experimental.
PROCESOS DE PRODUCCION
La produccion de peptidos del tipo GLP-1 (7-37) y analogos de los mismos es bien conocida en la tecnica.
Los analogos de la invencion o fragmentos de los mismos, se pueden producir, por ejemplo, mediante smtesis clasi- ca de peptidos, por ejemplo, smtesis de peptidos en fase solida usando qmmica t-Boc o Fmoc u otras tecnicas bien establecidas, vease, por ejemplo, Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, "Organic Synthesis on solid Phase", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.
Ademas, o alternativamente, se pueden producir por metodos recombinantes, a saber, cultivando una celula hospe- dadora que contiene una secuencia de ADN que codifica el fragmento y es capaz de expresar el peptido en un medio nutritivo adecuado, en condiciones que permiten la expresion del peptido. Ejemplos no limitantes de celulas hos- pedadoras adecuadas para la expresion de estos peptidos son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, asf como lmeas celulares BHK o CHO de mairnfero.
Los derivados de la invencion que incluyen aminoacidos no naturales y/o un mimetico monopeptido o dipeptido fijado covalentemente al extremo N-terminal, por ejemplo, se pueden producir como se describe en la parte experimental. O, vease, por ejemplo, Hodgson et al.: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, n° 7 (2004), pags. 422-430; y el documento WO 2009/083549 A1 titulado "Semirecombinant preparation of GLP-1 analogues".
Ejemplos espedficos de metodos de preparacion de una serie de analogos y derivados de la invencion, se incluyen en la parte experimental.
COMPOSICIONES FARMACEUTICAS
Las composiciones farmaceuticas que comprenden un analogo o un derivado de la invencion o una sal, una amida o un ester del mismo farmaceuticamente aceptable, y un excipiente farmaceuticamente aceptable, se pueden preparar como se conoce en la tecnica.
El termino "excipiente" se refiere en sentido amplio a cualquier componente que no sea el o los principios activos terapeuticos. El excipiente puede ser una sustancia inerte. En otra realizacion es una sustancia inactiva y/o una sustancia que no es medicinalmente activa.
El excipiente puede servir para varios fines, por ejemplo, como un portador, vehmulo, diluyente, ayuda para la for- macion de comprimidos y/o para mejorar la administracion y/o la absorcion de la sustancia activa.
La formulacion de ingredientes farmaceuticamente activos con diversos excipientes se conoce en la tecnica, vease por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo, la edicion 19a (1995), y cualquier edicion posterior).
Ejemplos no limitantes de excipientes son: disolventes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes quelantes y estabilizadores.
Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones lfquidas, es decir, formulaciones acuosas, es decir, formulaciones que comprenden agua. Una formulacion lfquida puede ser una solucion o una suspension. Una formulacion acuosa comprende tfpicamente al menos 50% p/p de agua, o al menos 60%, 70%, 80% o incluso al menos 90% p/p de agua.
Alternativamente, la composicion farmaceutica puede ser una formulacion solida, por ejemplo, una composicion liofilizada o secada por pulverizacion, que se puede utilizar tal cual, o a la que el medico o el paciente anaden disolventes y/o diluyentes antes del uso.
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El pH en una formulacion acuosa puede tener cualquier valor entre pH 3 y pH 10, por ejemplo, desde aproximada- mente 7,0 a aproximadamente 9,5; o desde aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0.
Una composicion farmaceutica puede comprender un tampon. El tampon se puede seleccionar, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogeno fosfato de sodio, hidrogeno fosfato disodico, fosfato sodico y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, acido malico, succinato, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido aspartico y mezclas de los mis- mos.
Una composicion farmaceutica puede comprender un conservante. El conservante se puede seleccionar, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p- hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bendlico, clorobutanol, y tiomerosal, bronopol, acido benzoico, imidurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p- hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorofenoxipropano-1,2-diol) y mezclas de los mis- mos. El conservante puede estar presente en una concentracion de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml.
Una composicion farmaceutica puede comprender un agente isotonico. El agente isotonico se puede seleccionar, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azucar o alcohol de azu- car, un aminoacido (por ejemplo, glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, acido aspartico, triptofano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polieti- lenglicol (por ejemplo, PEG400) y mezclas de los mismos. Se puede utilizar cualquier azucar tal como mono-, di- o polisacaridos, o glucanos hidrosolubles, incluyendo por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, malto- sa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, HPCD alfa y beta, almidon soluble, hidroxietil almidon y carboximetilcelulosa-Na. Alcohol de azucar se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una realizacion, el alcohol de azucar es manitol.
Una composicion farmaceutica puede comprender un agente quelante. El agente quelante se puede seleccionar, por ejemplo, a partir de sales de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido dtrico y acido aspartico, y mezclas de los mismos.
Una composicion farmaceutica puede comprender un estabilizador. El estabilizador puede ser, por ejemplo, uno o varios inhibidores de la oxidacion, inhibidores de la agregacion, tensioactivos y/o uno o varios inhibidores de protea- sas. Ejemplos no limitantes de estos varios tipos de inhibidores se describen a continuacion.
La expresion "formacion de agregados" se refiere a una interaccion ffsica entre las moleculas de polipeptido, lo que da como resultado la formacion de oligomeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan desde la solucion. La formacion de agregados a traves de un polipeptido durante el almacenamiento de una composicion farmaceutica lfquida, puede afectar adversamente a la actividad biologica de ese polipeptido, dan- do como resultado la perdida de eficacia terapeutica de la composicion farmaceutica. Ademas, la formacion de agregados puede causar otros problemas, tales como el bloqueo de tubos, membranas o bombas, cuando la composicion farmaceutica que contiene el polipeptido se administra utilizando un sistema de infusion.
Una composicion farmaceutica puede comprender una cantidad de una base de aminoacidos suficiente para dismi- nuir la formacion de agregados del polipeptido durante el almacenamiento de la composicion. La expresion "base de aminoacidos" se refiere a uno o a varios aminoacidos (tales como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, acido aspartico, triptofano, treonina), o analogos de los mismos. Cualquier aminoacido puede estar presente ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Cualquier estereoisomero (es decir, L, D, o una mezcla de los mismos) de la base de aminoacidos puede estar presente.
La metionina (u otros aminoacidos sulfuricos o analogos de aminoacidos) se puede anadir para inhibir la oxidacion de residuos de metionina a sulfoxido de metionina, cuando el polipeptido que actua como agente terapeutico es un polipeptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a tal oxidacion. Se puede emplear cualquier estereoisomero de metionina (L o D) o combinaciones de los mismos.
Una composicion farmaceutica puede comprender un estabilizador seleccionado a partir del grupo de polfmeros de peso molecular elevado o compuestos de peso molecular bajo. El estabilizador se puede seleccionar, por ejemplo, a partir de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), poli(alcohol vimlico) (PVA), polivinilpirrolidona, car- boxi/hidroxicelulosa o derivados de los mismos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sus- tancias que contienen azufre tales como monotioglicerol, acido tioglicolico y 2-metiltioetanol, y diferentes sales (por ejemplo, cloruro de sodio).
Una composicion farmaceutica puede comprender agentes estabilizantes adicionales, tales como, pero no limitados a, metionina y EDTA, que protegen al polipeptido frente a una oxidacion de metionina, y un tensioactivo no ionico, que protege al polipeptido frente a una agregacion asociada con la congelacion-descongelacion o el cizallamiento mecanico.
Una composicion farmaceutica puede comprender uno o varios tensioactivos, preferentemente un tensioactivo, al
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menos un tensioactivo o dos tensioactivos diferentes. El termino "tensioactivo" se refiere a cualquier molecula o ion que se compone de una parte soluble en agua (hidrofila), y una parte soluble en grasa (lipofila). El tensioactivo se puede seleccionar, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en tensioactivos anionicos, tensioactivos cationicos, tensioactivos no ionicos y/o tensioactivos de ion hnbrido.
Una composicion farmaceutica puede comprender uno o varios inhibidores de proteasas, tales como, por ejemplo, EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) y/o benzamidinaHCl.
Los ingredientes adicionales, opcionales de una composicion farmaceutica incluyen, por ejemplo, agentes humec- tantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, iones metalicos, vehnculos oleaginosos, protemas (por ejemplo, albumina de suero humana, gelatina) y/o un ion tnbrido (por ejemplo, un aminoacido tal como betama, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).
Aun mas, una composicion farmaceutica se puede formular tal y como se conoce en la tecnica de formulaciones orales de compuestos insulinotropicos, por ejemplo, utilizando una cualquiera o varias de las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.
Una dosis administrada puede contener de 0,01 mg-100 mg del analogo o derivado, o de 0,01-50 mg, o de 0,01-20 mg, o de 0,01 mg-10 mg.
El derivado de la invencion se puede administrar en forma de una composicion farmaceutica. Se puede administrar a un paciente que lo requiere en varios sitios, por ejemplo, en sitios topicos, tales como la piel o sitios de la mucosa; en sitios en los que se evita una absorcion, tales como en una arteria, en una vena o en el corazon; y en sitios que implican una absorcion, tales como en la piel, debajo la piel, en un musculo o en el abdomen.
La via de administracion puede ser, por ejemplo, lingual; sublingual; bucal; en la boca; oral; en el estomago; en el intestino; nasal; pulmonar, tal como a traves de los bronquiolos, los alveolos o una combinacion de los mismos; parenteral, epidermica; dermica; transdermica; conjuntival; uretral; vaginal; rectal; y/u ocular. En una realizacion particular, la composicion es una composicion oral y la via de administracion es por via oral.
Una composicion se puede administrar en varias formas de dosificacion, por ejemplo, como una solucion; una suspension; una emulsion; una microemulsion; emulsiones multiples; una espuma; un unguento; una pasta; una tirita; una pomada; un comprimido; un comprimido recubierto; una goma de mascar; un enjuague; una capsula, tal como capsulas de gelatina dura o blanda; un supositorio; una capsula rectal; gotas; un gel; una pulverizacion; un polvo; un aerosol; un inhalante; gotas para los ojos; una pomada oftalmica; un enjuague oftalmico; un pesario vaginal; un anillo vaginal; una pomada vaginal; una solucion para inyeccion; una solucion de transformacion in situ, tal como en gelifi- cado, sedimentacion y precipitacion in situ, y cristalizacion in situ; una solucion para infusion; o como un implante. Una composicion puede ser un comprimido, opcionalmente recubierto, una capsula o una goma de mascar.
Una composicion se puede preparar ademas en un sistema portador de farmacos o de administracion de farmacos, por ejemplo, con el fin de mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la solubilidad. En una realizacion particular, una composicion se puede fijar a tal sistema a traves de interacciones covalentes, hidrofobas y/o electrostaticas. Los fines de tal preparacion pueden ser, por ejemplo, disminuir los efectos adversos, conseguir una cronoterapia y/o mejorar el cumplimiento del paciente.
Una composicion tambien se puede emplear en la formulacion de sistemas de administracion de farmacos de tipo controlada, sostenida, de accion retardada, retrasada y/o de liberacion lenta.
La administracion parenteral se puede realizar mediante una inyeccion subcutanea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa de tipo pluma, o por medio de una bomba de infusion.
Una composicion se puede administrar por via nasal en forma de una solucion, una suspension o un polvo; o se puede administrar por via pulmonar en forma de una pulverizacion lfquida o en polvo.
La administracion transdermica es otra opcion adicional, por ejemplo, mediante una inyeccion sin aguja, a partir de un parche tal como un parche iontoforetico, o por medio de una via transmucosal, por ejemplo, por via bucal.
Una composicion puede ser una formulacion estabilizada. La expresion "formulacion estabilizada" se refiere a una formulacion con una estabilidad ffsica y/o qmmica incrementadas, preferiblemente ambas. En general, una formula- cion debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con el uso recomendado y las condicio- nes de almacenamiento) hasta que se alcanza la fecha de caducidad.
La expresion "estabilidad ffsica" se refiere a la tendencia del polipeptido a formar agregados biologicamente inactivos y/o insolubles, como resultado de una exposicion a estres termomecanico y/o una interaccion con interfases y superficies desestabilizantes (tales como superficies hidrofobicas). La estabilidad ffsica de una formulacion de polipeptido acuoso se puede evaluar por medio de una inspeccion visual y/o por mediciones de la turbidez despues de la exposicion a un estres mecanico/ffsico (por ejemplo, agitacion) a diferentes temperaturas, durante diversos penodos de
tiempo. Alternativamente, la estabilidad ffsica se puede evaluar usando un agente espectroscopico o una sonda del estado conformacional del polipeptido, tal como por ejemplo, tioflavina T o sondas de "parche hidrofobo".
La expresion "estabilidad qmmica" se refiere a cambios qmmicos (en particular covalentes) en la estructura del polipeptido, que conducen a la formacion de productos de degradacion qmmica, que tienen potencialmente una poten- 5 cia biologica reducida y/o un aumento del efecto inmunogenico, en comparacion con el polipeptido intacto. La estabilidad qmmica se puede evaluar midiendo la cantidad de productos de degradacion qmmica en varios puntos de tiempo, despues de la exposicion a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo, mediante SEC-HPLC y/o RP- HPLC.
El tratamiento con un derivado de acuerdo con la presente invencion tambien se puede combinar con una o varias 10 sustancias farmacologicamente activas adicionales, por ejemplo, seleccionadas a partir de agentes antidiabeticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensores, agentes para el tratamiento y/o la prevencion de complicaciones resultantes o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o la prevencion de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad. Ejemplos de estas sustancias farmacologicamente activas son: insulina, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de glucosidasa, antagonistas 15 de glucagon, inhibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidasa-IV), inhibidores de enzimas hepaticas implicadas en la estimulacion de la gluconeogenesis y/o la glucogenolisis, moduladores de la captacion de glucosa, compuestos que modifican el metabolismo de los lfpidos, tales como agentes antihiperlipidemicos como los inhibidores de HMG CoA (estatinas), polipeptidos inhibidores gastricos (analogos de GIP), compuestos que reducen la ingesta de alimento, agonistas de RXR y agentes que actuan sobre el canal de potasio dependiente de ATP de las celulas p; colestirami- 20 na, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; betabloqueantes tales como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de ACE (enzima convertidora de angiotensina) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, ala- triopril, quinapril y ramipril, bloqueantes de los canales de calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradi- pina, nimodipina, diltiazem y verapamil, y alfabloqueantes tales como doxazosina, urapidil, prazosina y terazosina; 25 agonistas de CART (transcrito regulado por cocama y anfetamina), antagonistas de NPY (neuropeptido Y), agonistas de PYY, agonistas del receptor Y2, agonistas del receptor Y4, agonistas del receptor mixto Y2/Y4, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas de TNF (factor de necrosis tumoral), agonistas de CRF (factor liberador de corticotropina), antagonistas de CRF BP (protema que se une al factor liberador de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas de p3, oxintomodulina y analogos, agonistas de MSH (hormona estimulante de mela- 30 nocitos), antagonistas de MCH (hormona concentradora de melanocitos), agonistas de CCK (colecistoquinina), inhibidores de la recaptacion de serotonina, inhibidores de la recaptacion de serotonina y noradrenalina, compuestos mixtos de serotonina y noradrenergicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormona de crecimiento, compuestos liberadores de la hormona del crecimiento, agonistas de TRH (hormona liberadora de tireotropina), moduladores de UCP 2 o 3 (protema de desacoplamiento 2 o 3), agonistas de 35 leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inhibidores de lipasa/amilasa, moduladores de RXR (receptor retinoide X), agonistas de TR p; antagonistas de histamina H3, agonistas o antagonistas del polipeptido inhibidor gastrico (analogos de GIP), gastrina y analogos de gastrina.
El tratamiento con un derivado de acuerdo con esta invencion tambien se puede combinar con una cirugfa que influ- ye en los niveles de glucosa y/o la homeostasis de lfpidos, tal como la banda gastrica o derivacion gastrica
40 INDICACIONES FARMACEUTICAS
La presente invencion tambien se refiere a un analogo de la invencion y a un derivado de la invencion, para uso como un medicamento.
En realizaciones particulares, el analogo o derivado de la invencion se puede usar para los siguientes tratamientos medicos, todos relacionados con preferencia de una manera u otra con la diabetes:
45 (i) prevencion y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes de tipo 2, to-
lerancia alterada a la glucosa, diabetes de tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de la edad madura que se presenta en el joven), diabetes gestacional y/o para la reduccion de HbA1 C;
(ii) retraso o prevencion de la progresion de una enfermedad diabetica, tal como la progresion de la diabetes de tipo 2, retraso de la progresion de la tolerancia alterada a la glucosa (IGT) a diabetes de tipo 2 que requiere in-
50 sulina, y/o retraso de la progresion de la diabetes de tipo 2 que no requiere insulina a diabetes de tipo 2 que re-
quiere insulina;
(iii) mejora de la funcion de las celulas p, tal como disminuyendo la apoptosis de las celulas p, aumentando la funcion de las celulas p y/o la masa de las celulas p y/o para restaurar la sensibilidad a la glucosa de las celu- las p;
55 (iv) prevencion y/o tratamiento de trastornos cognitivos;
(v) prevencion y/o tratamiento de trastornos de la alimentacion, tales como la obesidad, por ejemplo, mediante la disminucion de la ingesta de alimentos, reduccion del peso corporal, supresion del apetito, induccion de sa-
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ciedad; tratamiento o prevencion del trastorno por atracon, bulimia nerviosa y/u obesidad inducida por la admi- nistracion de un antipsicotico o un esteroide; reduccion de la motilidad gastrica; y/o retraso del vaciado gastrico;
(vi) prevencion y/o tratamiento de complicaciones diabeticas, tales como neuropatia, incluyendo neuropatia pe- riferica; nefropatia; o retinopatia;
(vii) mejora de los parametros lip^dicos, tal como prevencion y/o tratamiento de la dislipidemia, reduccion de los lfpidos sericos totales; reduccion de HDL; reduccion de LDL pequena y densa; reduccion de VLDL:
reduccion de los trigliceridos; reduccion del colesterol; aumento de HDL; reduccion de los niveles plasmati- cos de lipoprotema a (Lp(a)) en un ser humano; inhibicion de la generacion de apolipoprotema a (apo(a)) in vitro y/o in vivo;
(viii) prevencion y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, como el smdrome X; aterosclerosis; infarto de miocardio; enfermedad coronaria; accidente cerebrovascular, isquemia cerebral; enfermedad cardiovascular temprana o cardiaca temprana, tal como hipertrofia ventricular izquierda; enfermedad de la arteria coronaria; hipertension esencial; emergencia por hipertension aguda; cardiomiopatfa; insuficiencia cardfaca; tolerancia al ejercicio; insuficiencia cardiaca cronica; arritmia; disritmia cardfaca; smcope; aterosclerosis; insuficiencia card- faca cronica leve; angina de pecho; reoclusion de una derivacion cardiaca; claudicacion intermitente (arterioes- clerosis obliterante); disfuncion diastolica; y/o disfuncion sistolica;
(ix) prevencion y/o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como smdrome de intestino inflamato- rio; smdrome del intestino delgado, o enfermedad de Crohn; dispepsia; y/o ulceras gastricas;
(x) prevencion y/o tratamiento de enfermedad cntica, tal como el tratamiento de un paciente con enfermedad cntica, una polinefropatfa del paciente cntico (CIPNP) y/o un paciente con CIPNP potencial; prevencion de la enfermedad cntica o el desarrollo de CIPNP; prevencion, tratamiento y/o curacion del smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS) en un paciente; y/o para la prevencion o reduccion de la probabilidad de que un paciente padezca bacteriemia, septicemia y/o choque septico durante una hospitalizacion; y/o
(xi) prevencion y/o tratamiento del smdrome de ovario poliqmstico (PCOS).
En una realizacion particular, la indicacion se selecciona a partir del grupo que consiste en (i)-(iii) y (v)-(viii), tal como las indicaciones (i), (ii) y/o (iii); o la indicacion (v), la indicacion (vi), la indicacion (vii) y/o la indicacion (viii).
En otra realizacion particular, la indicacion es (i). En una realizacion adicional particular, la indicacion es (v). En una realizacion aun mas particular, la indicacion es (viii).
Las siguientes indicaciones son particularmente preferidas: diabetes de tipo 2 y/u obesidad.
REALIZACIONES PARTICULARES
Las siguientes son realizaciones y descripciones particulares de la invencion:
1. Un analogo de GLP-1 que comprende un residuo de histidina (H) en una posicion correspondiente a la posicion 31 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1), un residuo de glutamina (Q) en una posicion correspondiente a la posicion 34 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) y un maximo de diez modificaciones de aminoacidos en compara- cion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1); en donde el residuo H se designa H31 y el residuo Q se designa Q34; o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
2. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de nueve modificaciones de aminoacidos.
3. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de ocho modificaciones de aminoacidos.
4. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de siete modificaciones de aminoacidos.
5. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de seis modificaciones de aminoacidos.
6. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de cinco modificaciones de aminoacidos.
7. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de cuatro modificaciones de aminoacidos.
8. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de tres modificaciones de aminoacidos.
9. El analogo de la realizacion 1, que tiene un maximo de dos modificaciones de aminoacidos.
10. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-9, que tiene un mmimo de dos modificaciones de ami- noacidos.
11. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-8, que tiene un mmimo de tres modificaciones de ami-
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noacidos.
12. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-7, que tiene un mmimo de cuatro modificaciones de aminoacidos.
13. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-6, que tiene un mmimo de cinco modificaciones de aminoacidos.
14. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-5, que tiene un mmimo de seis modificaciones de ami- noacidos.
15. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-4, que tiene un mmimo de siete modificaciones de ami- noacidos.
16. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-3, que tiene un mmimo de ocho modificaciones de ami- noacidos.
17. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-2, que tiene un mmimo de nueve modificaciones de aminoacidos.
18. El analogo de la realizacion 1, que tiene un mmimo de diez modificaciones de aminoacidos.
19. El analogo de la realizacion 1 que tiene dos modificaciones de aminoacidos.
20. El analogo de la realizacion 1 que tiene tres modificaciones de aminoacidos.
21. El analogo de la realizacion 1 que tiene cuatro modificaciones de aminoacidos.
22. El analogo de la realizacion 1 que tiene cinco modificaciones de aminoacidos.
23. El analogo de la realizacion 1 que tiene seis modificaciones de aminoacidos.
24. El analogo de la realizacion 1 que tiene siete modificaciones de aminoacidos.
25. El analogo de la realizacion 1 que tiene ocho modificaciones de aminoacidos.
26. El analogo de la realizacion 1 que tiene nueve modificaciones de aminoacidos.
27. El analogo de la realizacion 1 que tiene diez modificaciones de aminoacidos.
28. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-27, en el que las modificaciones de aminoacidos son, independientemente, sustituciones, adiciones y/o deleciones.
29. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-28, en el que las modificaciones de aminoacidos son sustituciones.
30. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-28, en el que las modificaciones de aminoacidos son deleciones.
31. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-28, en el que las modificaciones de aminoacidos son adiciones.
32. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-31, que tiene una amida C-terminal.
33. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-31, que tiene un grupo -COOH* C-terminal.
34. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-33, en el que las modificaciones de aminoacidos son en una o varias posiciones correspondientes a las siguientes posiciones en GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1): 7, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 34, 36, 37 y/o 38.
35. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-34, en el que las modificaciones de aminoacidos distin- tos de H31 y Q34 se seleccionan a partir de las siguientes: (Des7 o Imp7), (Des8, Aib8, N-metil-Ala8, D-Ala8, G8 o
S8), K12, K, K18, (E22 o K22), K24, I25, (R26 o H26), K27, E30, H31, Q34, K, (K37 o P37) y/o (E38 * o K38).
36. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-35, que comprende i) Des7 o ii) Imp7; preferiblemente ii) Imp7.
37. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-36 que comprende i) Des8, ii) Aib8, iii) D-Ala8, iv) N-
metil-Ala8, v) G8 o vi) S8; preferiblemente iii) D-Ala8, iv) N-metil-Ala8, v) G8, o vi) S8; mas preferiblemente v) G8 o
vi) S8; incluso mas preferiblemente iii) D-Ala8 o iv) N-metil-Ala8; o lo mas preferiblemente ii) Aib8.
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38. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-37, que comprende K12.

39. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-38, que comprende K16.

40. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-39, que comprende K18.
41. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-40 que comprende i) E o ii) K , preferiblemente i) E .

42. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-41, que comprende K24
43. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-42 que comprende I25.
44. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-43 que comprende i) R26 o ii) H26; preferiblemente i) R26.

45. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-44, que comprende K27.

46. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-45, que comprende E30.

47. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-46, que comprende K36.
48. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-47, que comprende i) K37 o ii) P37; preferiblemente i)
K37.

OQ OQ OQ
49. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-48 que comprende i) E o ii) K ; preferiblemente i) E .
50. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-49, que comprende, preferiblemente tiene, las siguien- tes modificaciones de aminoacidos: (i) (31 H, 34Q); (ii) (31 H, 34Q, 37K); (iii) (8G, 31 H, 34Q); (iv) (8Aib, 31 H, 34Q); (v) (8a, 31 H, 34Q); (vi) (des7, 31 H, 34Q); (vii) (8S, 31 H, 34Q); (viii) (8-N-metil-A, 31 H, 34Q); (ix) (des7- 8, 31 H, 34Q); (x) (8Aib, 31 H, 34Q, 38K); (xi) (8Aib, 12K, 31 H, 34Q); (xii) (8Aib, 31 H, 34Q, 37K); (xiii) (22K, 26R, 31 H, 34Q); (xiv) (22E, 24K, 26R, 31 H, 34Q); (xv) (12K, 22E, 26R, 31 H, 34Q); (xvi) (8Aib, 26R, 27K, 31 H, 34Q); (xvii) (7Imp, 22E, 26R, 31 H, 34Q, 37K); (xviii) (8Aib, 30E, 31 H, 34Q, 36K, 38E); (xix) (8Aib, 12K, 22E, 26R, 31 H, 34Q); (xx) (8Aib, 18K, 22E, 26R, 31 H, 34Q); (xxi) (8Aib, 18K, 22E, 26H, 31 H, 34Q); (xxii) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 31 H, 34Q); (xxiii) (8Aib, 22E, 24K, 26R, 31 H, 34Q); (xxiv) (8Aib, 25I, 26R, 27K, 31 H, 34Q); (xxv) (8Aib, 16K, 22E, 26R, 31 H, 34Q); o (xxvi) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 31H, 34Q, 37P); preferiblemente Chem. 20, Chem. 22, Chem. 41, Chem. 44 o Chem. 45.
51. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-50, en el que se ha delecionado al menos un residuo de aminoacido, en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
52. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-51, comprende des7 y/o des8, preferiblemente ambos.
53. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-52, en el que se ha delecionado un aminoacido en una posicion correspondiente a la posicion 7 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
54. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-53, en el que se ha delecionado un aminoacido en una posicion correspondiente a la posicion 8 del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
55. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-54, en el que se han delecionado dos aminoacidos en posiciones correspondientes a la posicion 7 y 8 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
56. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-55, que es un analogo de GLP-1 (8-37) (aminoacidos
2- 31 de SEQ ID NO: 1), que tiene hasta diez, nueve, ocho o seis modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
57. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-56, que es un analogo de GLP-1 (9-37) (aminoacidos
3- 31, respectivamente, de SEQ ID NO: 1), que tiene hasta diez, nueve, ocho o seis modificaciones de aminoa- cidos en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
58. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-57, en el que un mimetico de His distinto de His esta en una posicion correspondiente a la posicion 2 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
59. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-58, en el que un mimetico de His-Ala distinto de His-Ala esta en las posiciones correspondientes a la posicion 7 y 8 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
60. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 58-59, en el que el mimetico de His o el mimetico de His- Ala, comprende a) imidazol; o b) piridina. 61 *
61. El analogo de la realizacion 60, en el que el imidazol es un derivado de un imidazol que comprende un ex-
tremo *-CO, para un acoplamiento covalente a *-NH del aminoacido N-terminal del analogo, mediante la forma-
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cion de un enlace amida.
62. El analogo de la realizacion 60, en el que la piridina es un derivado de piridina que comprende un extremo *-CO, para un acoplamiento covalente a *-NH del aminoacido N-terminal del analogo, mediante la formacion de un enlace amida.
63. El analogo de la realizacion 61, en el que el derivado de imidazol esta monosustituido.
64. El analogo de la realizacion 62, en el que el derivado de piridina esta monosustituido.
65. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 61 y 63, en el que el derivado de imidazol esta sustituido con un grupo que comprende un radical de acido carboxflico de un alquilo inferior que tiene de uno a seis ato- mos de carbono.
66. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 62 y 64, en el que el derivado de piridina esta sustituido con un grupo que comprende un radical de acido carboxflico de un alquilo inferior que tiene de uno a seis ato- mos de carbono.
67. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 65-66, en el que el radical de acido carboxflico se selec- ciona a partir de acetilo; y propionilo, butirilo, pentanoflo lineal o ramificado; preferiblemente acetilo.
68. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-67, en el que el residuo de aminoacido en la posicion correspondiente a la posicion 8 del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) tiene 3H-imidazol-4-il-acetilo fijado a su atomo de N.
69. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-68, en el que el residuo de aminoacido en la posicion correspondiente a la posicion 8 de SEQ ID NO: 1 es alanina.
70. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 60-69, en el que el imidazol esta sustituido con (metilcar- bamoil)-2-metil-propionilo, (etilcarbamoil)-2-metil-propionilo, (propilcarbamoil)-2-metil-propionilo o (butilcarba- moil)-2-metil-propionilo; preferiblemente con (etilcarbamoil)-2-metil-propionilo.
71. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-70, en el que el residuo de aminoacido en la posicion correspondiente a la posicion 9 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) tiene {2-[2-(1H-imidazol-4-il)-etilcarbamoil]-2- metil-propionilo} fijado a su atomo de N.
72. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 60-71, en el que la piridina esta sustituida con (metilcar- bamoil)-2-metil-propionilo, (etilcarbamoil)-2-metil-propionilo, (propilcarbamoil)-2-metil-propionilo o (butilcarba- moil)-2-metil-propionilo; preferiblemente con (metilcarbamoil)-2-metil-propionilo.
73. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-72, en el que el residuo de aminoacido en la posicion correspondiente a la posicion 9 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) tiene [2,2-dimetil-3-oxo-3-(piridin-2- ilmetilamino)propanono] fijado a su atomo de N. 74 75 76 77 78 79
74. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-73, en el que el residuo de aminoacido en la posicion correspondiente a la posicion 9 del analogo de GLP-1 es acido glutamico.
75. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-74, que tiene un maximo de dos residuos de K.
76. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-75, que tiene un maximo de un residuo de K.
77. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-76, en el que
a) la posicion correspondiente a cualquiera de las posiciones indicadas de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) y/o
b) el numero de modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) se identifica/n por escritura manual e inspeccion visual.
78. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-77, en el que
a) la posicion correspondiente a cualquiera de las posiciones indicadas de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) y/o
b) el numero de modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) se identifica/n mediante el uso de un programa convencional de alineamiento de protemas o peptidos.
79. El analogo de la realizacion 78, en el que el programa de alineamiento es un alineamiento de Needleman- Wunsch.
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80. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 78-79, fecto y la matriz de identidad por defecto.
81. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 78-80,
82. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 78-81 un espacio es -10 (menos diez).
83. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 78-82, en el que las penalizaciones por residuos adicio- nales en un espacio es -0,5 (menos cero coma cinco).
84. El analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-83, en el que, en analogfa con la definicion de H31 y Q34 en la realizacion 1, un numero de residuo, preferiblemente cualquier numero de residuo, ya sea en forma de supermdice despues de un residuo de aminoacido o en forma de una escritura ordinaria antes o despues del residuo de aminoacido en cuestion, se refiere a la posicion correspondiente en GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
85. Un derivado de un analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-84 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
86. El derivado de la realizacion 85 que tiene un resto que se une a albumina fijado a un residuo de lisina del analogo, mas preferiblemente al grupo amino epsilon de la misma, a traves de un enlace amida.
87. El derivado de la realizacion 86, que tiene un resto que se une a albumina fijado a i) K , ii) K , iii) K , iv) K22, v) K24, vi) K26, vii) K27, viii) K36 y/o ix) K37, en el que cada numero de residuo en forma de supermdice se refiere a la posicion correspondiente en gLp-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1).
88. El derivado de la realizacion 87, que tiene un resto que se une a albumina fijado a i) K , iii) K , vi) K y/o vii) K27; preferiblemente vi) K26.
19 1 Q oA
89. El derivado de la realizacion 87, que tiene un resto que se une a albumina fijado a i) K , iii) K , v) K , vi)
K26 y/o vii) K27.
90. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 87-88, que tiene un resto que se une a albumina fijado a i) K12, vi) K26 y/o vii) K27.
91. El derivado de la realizacion 87, que tiene dos restos que se unen a albumina fijados, preferiblemente a K26
y K37.
92. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-91, en el que el resto que se une a albumina com- prende un resto de accion prolongada.
93. El derivado de la realizacion 92, en el que el resto de accion prolongada se selecciona a partir de Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 y Chem. 4:
Chem. 1
: CHa-(CH2)x-CO-*
Chem. 2
: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 3
: HN4C-(CH2)x-CO-*
Chem. 4
: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-
en el que se utiliza la matriz de puntuacion por de-
en el que la matriz de puntuacion es BLOSUM62.
, en el que la penalizacion por el primer residuo en
en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-18, preferiblemente 6-16, e y es un numero entero en el intervalo de 3-17.
94. El derivado de la realizacion 93, en donde el resto de accion prolongada es Chem. 1 o Chem. 2, y x es preferiblemente un numero par.
95. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93-94, en el que x es i) 10, ii) 12, iii) 14, iv) 16 o v) 18; preferiblemente iii) 14 o iv) 16; mas preferiblemente i) 10, ii) 12; o v) 18; o lo mas preferiblemente iv) 16.
96. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93-95, en el que el resto de accion prolongada es Chem. 1.
97. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93-96, en el que Chem. 1 esta representado por Chem. 1a:
5
10
15
20
25
imagen1
en donde x es como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 93-95.
98. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93-95, en el que el resto de accion prolongada es Chem. 2.
99. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93-95 y 98, en el que Chem. 2 esta representado por Chem. 2a:
0 *
Chem. 2a: ,
en donde x es como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 84-86.
100. El derivado de la realizacion 93, en el que el resto de accion prolongada es Chem. 3 y x es preferiblemen- te un numero impar.
101. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93 y 100, en el que x es i) 11, ii) 13, iii) 15, iv) 17 o v) 19; preferiblemente iii) 15.
102. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93 y 100-101, en el que Chem. 3 esta representado por Chem. 3a:
imagen2
en donde x es como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 93 y 100-101.
103. El derivado de la realizacion 93, en el que el resto de accion prolongada es Chem. 4, e y es preferente- mente un numero impar.
104. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93 y 103, en el que y es i) 5, ii) 7, iii) 9, iv) 11 o v) 13; preferiblemente iii) 9.
105. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 93 y 103-104, en el que Chem. 4 esta representado por Chem. 4a o Chem. 4b:
imagen3
Chem. 4b:
imagen4
preferentemente por Chem. 4a;
en donde y es como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 93 y 103-104.
106. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 86-105, en el que el resto que se une a albumina com- prende un resto de accion prolongada.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
107. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 86-105, en el que el resto que se une a albumina com- prende dos restos de accion prolongada.
108. El derivado de la realizacion 107, en el que los restos de accion prolongada estan fijados a uno y al mismo residuo de lisina, preferiblemente a traves de un enlazador.
109. El derivado de la realizacion 107, en el que los restos de accion prolongada estan fijados a dos residuos de lisina diferentes, preferiblemente a traves de un enlazador.
110. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 87-109, que comprende un enlazador.
111. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 87-110, en el que el resto que se une a albumina comprende un enlazador.
112. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 92-111, en el que el resto que se une a albumina comprende adicionalmente un enlazador.
113. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 110-112, en el que el enlazador es un dirradical que comprende un radical N y un radical CO, en donde
i) el radical N esta representado por un primer grupo *-NR1R2, en donde R1 y R2, independientemente, pue- den designar hidrogeno, carbono o azufre, opcionalmente sustituido; y
ii) el radical CO esta representado por un primer grupo -CO*,
y en el que, preferiblemente, el primer grupo *-NR1R2 es capaz de formar un enlace amida con un segundo grupo -CO* y el primer grupo -CO* es capaz de formar un enlace amida con un segundo grupo *-NR1R2, en donde el segundo grupo *-NR1R2 y el segundo grupo -CO* se definen como el primer grupo *-NR1R2 y el primer grupo -CO*, respectivamente y forman parte, de manera independiente, de la estructura del i) analogo, ii) el resto de accion prolongada y/o iii) otro enlazador.
114. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 86-113, que comprende al menos un enlazador selec- cionado a partir del grupo que consiste en Chem. 5, Chem. 6, Chem. 7, Chem. 8, Chem. 9 y Chem. 10:
Chem. 5
: *-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-’
Chem. 6
: *-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
Chem. 7
: *-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
Chem. 8
: *-NH-C6Hb-CO-*
Chem. 9
: *-NC5Hb-CO-*
Chem. 10
: *-NH-SO2-(CH2)b-CO-*
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5; y en donde Chem. 6 y Chem. 7 son dirradicales de Glu.
115. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 110-114, en el que el enlazador comprende Chem. 5 y en donde preferiblemente Chem. 5 es un primer elemento enlazador.
116. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-115, en el que k es 1.
117. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-116, en el que n es 1.
118. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-117, en el que Chem. 5 se incluye m veces, en donde m es un numero entero en el intervalo de 1-10.
119. El derivado de la realizacion 118, en el que m es un numero entero en el intervalo de 1-6; preferiblemente en el intervalo de 1-4; mas preferiblemente m es 1 o 2; incluso mas preferiblemente m es 1; o lo mas preferi- blemente, m es 2.
120. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 118-119, en el que, cuando m es diferente de 1, los elementos Chem. 5 estan interconectados mediante uno o varios enlaces amida.
121. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-120, en el que el enlazador consiste en uno o va- rios elementos Chem. 5.
122. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-121, en el que Chem. 5 esta representado por
Chem. 5a:
5
imagen5
Chem.
en donde k y n son como se han definido en una cualquiera de las realizaciones 114-117.
123. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-122, en el que el enlazador comprende un dirradi- cal Glu, tal como Chem. 6 y Chem. 7.
124. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-123, en el que Chem. 6 y Chem. 7, independien- temente, pueden estar representados por Chem. 6a y Chem. 7a, respectivamente:
imagen6
10
imagen7
15
20
lo mas preferiblemente por Chem. 6a.
125. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-124, en el que el dirradical Glu, tal como Chem. 6 y/o Chem. 7, independientemente, se incluye p veces, en donde p es un numero entero en el intervalo de 1-3.
126. El derivado de la realizacion 125, en el que p es 1, 2 o 3; preferiblemente 1 o 2, o lo mas preferiblemente 1.
127. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-126, en el que el dirradical Glu es un radical de L- Glu o D-Glu, preferiblemente de L-Glu.
128. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-127, en el que el enlazador consiste en un dirradical Glu, preferiblemente Chem. 6, mas preferiblemente Chem. 6a.
129. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-128, en el que el enlazador comprende Chem. 8.
130. El derivado de la realizacion 129, en el que Chem. 8 esta representado por Chem. 8a:
imagen8
preferentemente por Chem. 8b:
5
10
15
20
25
30
35
imagen9
131. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-130, que comprende Chem. 9.
132. El derivado de la realizacion 131, en el que Chem. 9 esta representado por Chem. 9a:
Chem. 9a:
imagen10
*
133. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-132, que comprende Chem. 10.
134. El derivado de la realizacion 133, en el que Chem. 10 esta representado por Chem. 10a:
imagen11
135. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en dos veces Chem. 5 interconectados a traves de un enlace amida, y conectado en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
136. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en Chem. 5, que esta conectado en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *- CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
137. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en Chem. 6, que esta conectado en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *- Co con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
138. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en dos veces Chem. 5 y una vez Chem. 6, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, estando conectado el enlazador en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
139. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en una vez Chem. 6 y dos veces Chem. 5 interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, estando conectado el enlazador en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
140. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en una vez Chem. 5, una vez Chem. 6 y una vez Chem. 5 interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, estando conectado el enlazador en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
141. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en una vez Chem. 6 y una vez Chem. 5 interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, estando conectado el enlazador en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
142. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en una vez Chem. 8, una vez Chem. 6, preferiblemente en la forma D y dos veces Chem. 5 interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, estando conectado el enlazador en su extremo *-NH con el extremo *- CO del resto de accion prolongada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
10
15
20
25
30
143. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en una vez Chem. 9, una vez Chem. 6 y dos veces Chem. 5 interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, estando conectado el enlazador en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolon- gada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
144. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 114-134, en el que el enlazador consiste en una vez Chem. 10 conectado en su extremo *-NH con el extremo *-CO del resto de accion prolongada y en su extremo *-CO con el grupo amino epsilon de un residuo de lisina del analogo de GLP-1.
145. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 110-144, en el que uno o varios enlazadores estan interconectados a traves de enlaces amida.
146. Un compuesto seleccionado a partir de los siguientes: Chem. 20, Chem. 21, Chem. 22, Chem. 23, Chem.
24, Chem. 25, Chem. 26, Chem. 27, Chem. 28, Chem. 29, Chem. 30, Chem. 31, Chem. 32, Chem. 33, Chem.
34, Chem. 35, Chem. 36, Chem. 37, Chem. 38, Chem. 39, Chem. 40, Chem. 41, Chem. 42, Chem. 43, Chem.
44, Chem. 45, Chem. 46, Chem. 47, Chem. 48, Chem. 49, Chem. 50, Chem. 51, Chem. 52, Chem. 53, Chem.
54, Chem. 55, Chem. 56, Chem. 57, Chem. 58, Chem. 59, Chem. 60, Chem. 61, Chem. 62, Chem. 63, Chem.
64, Chem. 65 y Chem. 66; o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable de los mismos.
147. Un compuesto caracterizado por su nombre y seleccionado a partir de una lista de cada uno de los nom- bres de los compuestos de los Ejemplos 1-47 en este documento; o una sal, una amida o un ester farmaceuti- camente aceptable del mismo.
148. El compuesto de la realizacion 147, que es un compuesto de la realizacion 146.
149. El compuesto de una cualquiera de las realizaciones 146-148, que es un analogo de una cualquiera de las realizaciones 1-84.
150. El compuesto de una cualquiera de las realizaciones 146-148, que es un derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-145.
151. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-150, que se selecciona entre los siguientes: N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido;
Chem. 21:
O O
GTFTSDVSSYLEGQA A-S^J^E F I A H L V Q G R G—'
imagen12
N,2-12-[2-[2-[2-[[2-[2-12-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
[Lys12,Glu,Arg,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido;
Chem. 46:
H °
h-H AEG T-N^JL-t SDVSSYLEEQAAREF IAHLVQGR G-°h
imagen13
N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino)-4(S)-
carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil]-N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-
Carboxifenoxi)decanoilamino)-4(S)-
carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1 (7-37)-peptido;
5
10
imagen14
N26[2-(2-{2-[2-(2-{2 -[(S) 4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Ser8,His31,Gln34] GLP-1(7-37)- peptido;
Chem. 32:
0
"—H SEGTFTSDVSSYLEGQA A——E F IAHLV0GR G—>
imagen15
Ne2e [2-(2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]
etoxi}etoxi)acetN][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido:
imagen16
N£26[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(2-{2-[2-(17-carboxi-
heptadecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Aib8His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido;
imagen17
N£26-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-
carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], N37-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-
[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-
[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido;
Chem. 56
5
10
15
20
imagen18
N24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17- boxiheptadecanoilairiino)butanc [Aib8Glu,Lys24Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido;
imagen19
N1
-2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
[Aib8,Lys16Glu22Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido;
imagen20
N12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butanoil]aiTiino]etoxi]etoxi]acetil]aiTiino]etoxi]etoxi]acetil]- [Lys12Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido; y
Chem. 65:
imagen21
152. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-150, que se selecciona a partir de los siguientes: N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxiletoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido;
Chem. 21:
imagen22
N12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-12-(17-carboxiheptadecanoilairiino)etoxi]etoxi]acetil]aiTimo]etoxi]etoxi]acetil]-
[Lys12Glu,Arg,His,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido;
5
10
15
20
imagen23
N26[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(2-{2-[2-(17-carboxi-heptadecanoilairiino)etoxi]etoxi}acetNaiTiino)butinl no]etoxi}etoxi)acetil] [Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido;
ami-
imagen24
[Aib°Glu2,Lys24Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido;
imagen25
N16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
[Aib°Lys1eGlu22Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido;
Chem. 62:
imagen26
N12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]- [Lys12Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido; y
imagen27
153. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-150, que se selecciona a partir de los siguientes: N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido;
5
10
Chem. 21
imagen28
N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-Carboxifenoxi)decanoNamino)-4(S)-
carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil]-W£^7-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-
carboxifenoxi)decanoNamino)-4(S)-
carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37) -peptido;
imagen29
N26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Ser8,His31,Gln34] GLP-1(7-37)- peptido;
Chem. 32:
0
"—H SEGTFTSDVSSYLEGQA A——E F IAHLV0GR G—>
imagen30
N26[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(2-{2-[2-(17-carboxi-heptadecanoNaiTiino)etoxi]etoxi}acetNaiTimo)butirN ami-
no]etoxi}etoxi)acetil] [Aib8His,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido; y
imagen31
preferiblemente seleccionado a partir de 15 N26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Ser8,His31,Gln34] GLP-1 (7- 37)-peptido;
Chem. 32:
0
"—H SEGTFTSDVSSYLEGQA E F IAHLVQGR G—
imagen32
5
10
15
20
25
30
35
40
y
N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido;
Chem. 21:
imagen33
154. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 21 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
155. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 32 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
156. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 35 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
157. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 38 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
158. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 46 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
159. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 47 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
160. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 56 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
161. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 60 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
162. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 62 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
163. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 151-153, que es Chem. 65 o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
164. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-163, que tiene actividad de GLP-1.
165. El analogo o el derivado de la realizacion 164, en el que la actividad de GLP-1 se refiere a la capacidad de activar el receptor de GLP-1 humano.
166. El analogo o el derivado de la realizacion 165, en el que la activacion del receptor de GLP-1 humano se mide en un ensayo in vitro, como la potencia de la produccion de AMPc.
167. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-166, que tiene una potencia correspon- diente a una CE50 de 4500 pM o inferior, preferiblemente inferior a 4500 pM, mas preferiblemente inferior a 4000 pM, incluso mas preferiblemente inferior a 3500 pM o lo mas preferiblemente inferior a 3000 pM.
168. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-167, que tiene una potencia correspon- diente a una CE50 inferior a 2500 pM, preferiblemente inferior a 2000 pM, mas preferiblemente inferior a 1500 pM, incluso mas preferiblemente inferior a 1000 pM o lo mas preferiblemente inferior a 800 pM.
169. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-168 que tiene una potencia correspon- diente a una CE50 inferior a 600 pM, preferiblemente inferior a 500 pM, mas preferiblemente inferior a 400 pM, incluso mas preferiblemente inferior a 300 pM o lo mas preferiblemente inferior a 200 pM.
170. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-169 que tiene una potencia correspon- diente a una CE50 inferior a 180 pM, preferiblemente inferior a 160 pM, mas preferiblemente inferior a 140 pM, incluso mas preferiblemente inferior a 120 pM o lo mas preferiblemente inferior a 100 pM.
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171. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-170 que tiene una potencia correspon- diente a una CE50 inferior a 80 pM, preferiblemente inferior a 60 pM, mas preferiblemente inferior a 50 pM, in- cluso mas preferiblemente inferior a 40 pM o lo mas preferiblemente inferior a 30 pM.
172. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-171, en el que la potencia se determina como la CE50 para la curva de respuesta frente a la dosis que muestra una formacion de AMPc dependiente de la dosis en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano, preferiblemente utilizando una lmea celular transfectada estable como BHK467-12A (tk-ts13) y/o utilizando para la determinacion del AMPc un ensayo de receptor funcional, por ejemplo, basado en la competencia entre el AMPc formado endogenamente y el AMPc anadido de forma exogena marcado con biotina, en dicho ensayo, el AMPc se captura mas preferiblemente usando un anticuerpo espedfico y/o en donde un ensayo incluso mas preferido es el ensayo de AMPc AlphaS- creen, lo mas preferiblemente el descrito en el Ejemplo 48.
173. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-172, cuya CE50 es menos de 10 veces la CE50 de semaglutida, preferiblemente menos de 8 veces la CE50 de semaglutida, mas preferiblemente menos de 6 veces la CE50 de semaglutida, incluso mas preferiblemente menos de 4 veces la CE50 de semaglutida o lo mas preferiblemente menos de 2 veces la CE50 de semaglutida.
174. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-173, cuya CE50 es menor que la CE50 de semaglutida, preferiblemente menos de 0,8 veces la CE50 de semaglutida, mas preferiblemente menos de 0,6 veces la CE50 de semaglutida, incluso mas preferiblemente menos de 0,4 veces la CE50 de semaglutida o lo mas preferiblemente, menos de 0,2 veces la CE50 de semaglutida.
175. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-174, cuya CE50 es menos de 10 veces la CE50 de liraglutida, preferiblemente menos de 8 veces la CE50 de liraglutida, mas preferiblemente menos de 6 veces la CE50 de liraglutida, incluso mas preferiblemente menos de 4 veces la CE50 de liraglutida o lo mas preferiblemente, menos de 2 veces la CE50 de liraglutida.
176. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-175, cuya CE50 es menor que la CE50 de liraglutida, preferiblemente menos de 0,8 veces la CE50 de liraglutida, mas preferiblemente menos de 0,6 veces la potencia de liraglutida, incluso mas preferiblemente menos de 0,5 veces la CE50 de liraglutida o lo mas preferiblemente menos de 0,4 veces la CE50 de liraglutida.
177. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-176, para el que la relacion [afinidad de la union al receptor de GLP-1 (CI50) en presencia de 2,0% de HSA (albumina alta), dividida por la afinidad de la union al receptor de GLP-1 (CI50) en presencia de 0,005% de HSA (albumina baja)] es de:
a) al menos 0,5, preferiblemente al menos 1,0, mas preferiblemente al menos 10, incluso mas preferiblemente al menos 20 o lo mas preferiblemente al menos 30;
b) al menos 40, preferiblemente al menos 50, mas preferiblemente al menos 60, incluso mas preferiblemente al menos 70 o lo mas preferiblemente al menos 80;
c) al menos 90, preferiblemente al menos 100, mas preferiblemente al menos 200, aun mas preferiblemente al menos 300, incluso mas preferiblemente al menos 400 o lo mas preferiblemente al menos 500;
d) al menos 600, preferiblemente al menos 700, mas preferiblemente al menos 800, incluso mas preferiblemente al menos 1000 o lo mas preferiblemente al menos 1300;
e) al menos 20% de la relacion de semaglutida, preferiblemente al menos 50% de la relacion de semaglutida, mas preferiblemente al menos 75% de la relacion de semaglutida, incluso mas preferiblemente al menos igual que la relacion de semaglutida o lo mas preferiblemente al menos dos veces la relacion de sema- glutida; o
f) al menos igual a la relacion de liraglutida, preferiblemente al menos dos veces la relacion de liraglutida, mas preferiblemente al menos tres veces la relacion de liraglutida, incluso mas preferiblemente al menos 5 veces la relacion de liraglutida o lo mas preferiblemente al menos 10 veces la relacion de liraglutida.
178. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-177, para el que la afinidad de la union con el receptor de GLP-1 (CI50) en presencia de 0,005% de HSA (albumina baja) es
a) inferior a 600,00 nM, preferiblemente inferior a 500,00 nM, mas preferiblemente inferior a 200,00 nM, incluso mas preferiblemente inferior a 100,00 nM o lo mas preferiblemente inferior a 50,00 nM; o
b) inferior a 20,00 nM, preferiblemente inferior a 10,00 nM, mas preferiblemente inferior a 5,00 nM, incluso mas preferiblemente inferior a 2,00 nM o lo mas preferiblemente inferior a 1,00 nM.
179. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-178, para el que la afinidad de la union con el receptor de GLP-1 (CI50) en presencia de 2,0% de HSA (albumina alta) es
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a) 1000.00 nM o inferior, preferiblemente inferior a 900 nM, mas preferiblemente inferior a 800 nM, incluso mas preferiblemente inferior a 700 nM o lo mas preferiblemente inferior a 600 nM; o
b) inferior a 400,00 nM, preferiblemente inferior a 300,00 nM, mas preferiblemente inferior a 200,00 nM, in- cluso mas preferiblemente inferior a 100,00 nM o lo mas preferiblemente inferior a 50,00 nM.
180. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-179, en el que la afinidad de la union con el receptor de GLP-1 se mide por medio del desplazamiento de 125I-GLP-1 desde el receptor, preferiblemente usando un ensayo de union a SPA.
181. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-180, en el que el receptor de GLP-1 se prepara utilizando una lmea celular transfectada estable, preferiblemente una lmea de celulas de hamster, mas preferiblemente una lmea de celulas de rinon de cna de hamster, tal como BHKtk-ts13.
182. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-181, en el que el valor de CI50 se deter- mina como la concentracion que desplaza el 50% de 125I-GLP-1 desde el receptor.
183. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-182, que tiene una biodisponibilidad oral, preferen- temente una biodisponibilidad oral absoluta, que es mas alta que la de liraglutida; y/o mayor que la de semaglu- tida.
184. El derivado de la realizacion 183, en el que la biodisponibilidad oral se mide in vivo en ratas, como la exposicion en plasma despues de una inyeccion directa en el lumen intestinal.
185. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-184, para el que la concentracion en plasma (pM) del derivado, determinada 30 minutos despues de la inyeccion de una solucion del derivado en el yeyuno de una rata, dividida por la concentracion (jM) de la solucion inyectada (exposicion corregida por la dosis a los 30 min) es al menos 15, preferiblemente al menos 30, mas preferiblemente al menos 48, todavfa mas preferiblemente al menos 62, incluso mas preferiblemente al menos 80 o lo mas preferiblemente al menos 100.
186. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-185, para el que la concentracion en plasma (pM) del derivado, determinada 30 minutos despues de la inyeccion de una solucion del derivado en el yeyuno de una rata, dividida por la concentracion (jM) de la solucion inyectada (exposicion corregida por la dosis a los 30 min) es al menos 110, preferiblemente al menos 120, mas preferiblemente al menos 130, aun mas preferiblemente al menos 140, incluso mas preferiblemente al menos 150 o lo mas preferiblemente al menos 160.
187. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-186, para el que la concentracion en plasma (pM) del derivado, determinada 30 minutos despues de la inyeccion de una solucion del derivado en el yeyuno de una rata, dividida por la concentracion (jM) de la solucion inyectada (exposicion corregida por la dosis a los 30 min) es al menos 180, preferiblemente al menos 210, mas preferiblemente al menos 240 o lo mas preferible- mente al menos 280.
188. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-187, en donde el derivado de GLP-1 se somete a ensayo con una concentracion de 1000 uM en mezcla por adicion de 55 mg/ml de caprato sodico.
189. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-188, en el que se usan ratas macho Sprague Daw- ley, de preferencia con un peso corporal a la llegada de aproximadamente 240 g.
190. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-189, en el que las ratas se mantienen en ayunas durante aproximadamente 18 horas antes del experimento.
191. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-190, en el que las ratas se someten a una anestesia general despues de haber ayunado y antes de la inyeccion del derivado en el yeyuno.
192. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-191, en donde el derivado se administra en la parte proximal del yeyuno (10 cm distal del duodeno) o en el intestino medio (50 cm proximal del ciego).
193. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-192, en donde 100 jl del derivado se inyectan en el lumen yeyunal a traves de un cateter con una jeringa de 1 ml y posteriormente se introducen 200 jl de aire en el lumen yeyunal con otra jeringa, que luego se deja conectada al cateter para evitar el retorno al cateter.
194. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-193, en el que se recogen muestras de sangre (200 ul) en tubos con EDTA, a partir de la vena de la cola a intervalos deseados, tales como en los tiempos 0, 10, 30, 60, 120 y 240 min y se centrifugan 5 minutos, 10000 g, a 4°C en 20 minutos.
195. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-194, en donde se separa el plasma (75 ul), se con- gela inmediatamente y se mantiene a -20°C hasta que se analiza la concentracion en plasma del derivado.
196. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-195, en el que el LOCI (inmunoensayo luminiscente
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de canalizacion de ox^geno) se utiliza para el analisis de la concentracion plasmatica del derivado.
197. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-196, que es eficaz en la reduccion de la glucosa en sangre in vivo en ratones db/db.
198. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-197, que es eficaz en la reduccion del peso corporal in vivo en ratones db/db.
199. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-198, en el que los ratones db/db son tra- tados, por via s.c., con un intervalo adecuado de dosis del analogo o derivado de GLP-1 y la glucosa en sangre y/o el peso corporal se determinan a intervalos apropiados.
200. El analogo o el derivado de la realizacion 199, en el que la dosis del analogo o derivado de GLP-1 es de
0. 3 nmol/kg, 1,0 nmol/kg, 3,0 nmol/kg, 10 nmol/kg, 30 nmol/kg y 100 nmol/kg, en donde kg se refiere al peso corporal del raton.
201. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 197-200, en el que un grupo de control se trata con vehnculo, por via s.c., preferiblemente el medio en el que se disuelve el analogo o el derivado de GLP-
1, por ejemplo, con la siguiente composicion: fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, 0,05% de Tween 80, pH 7,4.
202. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 197-201, en el que se determina la glucosa en sangre y/o los ratones se pesan, en el momento -1^h (media hora antes de la dosificacion (t = 0)), y en los momentos 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 y 96 h.
203. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 197-202, en el que la concentracion de glucosa se mide usando el metodo de la glucosa oxidasa.
204. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 197-203, en donde
(i) DE50 (peso corporal (PC)) se calcula como la dosis que da lugar a un efecto semimaximo sobre la va- riacion (por ejemplo, disminucion) del PC, 24 horas despues de una administracion subcutanea del analo- go o derivado; y/o
(ii) DE50 (glucosa en sangre (GS)) se calcula como la dosis que da lugar a un efecto semimaximo sobre la variacion (por ejemplo, disminucion) del AUC (Area Bajo la Curva) de la GS, 8 horas despues de la administracion subcutanea del analogo o el derivado.
205. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 197-204, en el que existe una relacion sigmoidea de dosis-respuesta, de preferencia con una definicion clara de la respuesta maxima.
206. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-205, que tiene mas perfil de accion prolongada que liraglutida.
207. El derivado de la realizacion 206, en el que la accion prolongada significa la semivida in vivo en una espe- cie animal pertinente, tal como ratones db/db, rata, cerdo y/o, preferiblemente, cerdo enano; en donde el derivado se administra i) por via s.c. y/o, preferiblemente, ii) por via s.c.
208. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 206-207, en el que la semivida terminal (Ty2) despues de una administracion por via i.v. en cerdos enanos es de
a) al menos 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, mas preferiblemente al menos 36 horas, incluso mas preferiblemente al menos 48 horas o lo mas preferiblemente al menos 60 horas; o
b) al menos 0,2 veces la semivida de semaglutida, preferiblemente al menos 0,4 veces la semivida de se- maglutida, mas preferiblemente al menos 0,6 veces la semivida de semaglutida, incluso mas preferiblemente al menos 0,8 veces la semivida de semaglutida o lo mas preferiblemente al menos la misma que la semi- vida de semaglutida.
209. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 207-208, en el que los cerdos enanos son cerdos enanos Gottingen machos.
210. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 207-209, en el que los cerdos enanos tienen una edad de 7-14 meses y preferiblemente un peso de 16-35 kg.
211. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 207-210, en el que los cerdos enanos se alojan indivi- dualmente y se alimentan una vez o dos veces al dfa, preferiblemente con dieta SDS para cerdos enanos.
212. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 207-211, en donde el derivado se dosifica, por via i.v., despues de al menos 2 semanas de aclimatacion.
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213. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 207-212, en el que los animales se mantienen en ayu- nas durante aproximadamente 18 h antes de la dosificacion y durante al menos 4 h despues de la dosificacion y tienen acceso al agua a voluntad durante todo el penodo.
214. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 207-213, en donde el derivado de GLP-1 se disuelve en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, 0,05% de Tween 80, pH 7,4 a una concentracion adecuada, preferiblemente 20-60 nmol/ml.
215. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 207-214, en el que las inyecciones intravenosas del derivado se proporcionan en un volumen correspondiente a 1-2 nmol/kg.
216. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-215, el cual incrementa la secrecion de insulina estimulada por glucosa en los cerdos enanos.
217. El analogo o el derivado de la realizacion 216, en la que los cerdos enanos son cerdos enanos Gottingen machos.
218. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-217, en el que los cerdos enanos tienen una edad de 7-14 meses.
219. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-218, en el que los cerdos enanos estan alojados en corrales individuales y se alimentan una o dos veces al dfa, preferiblemente con pienso SDS para cerdos enanos.
220. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-219, en el que una dosis unica, opcio- nalmente despues de un penodo de aumento de la dosis, se proporciona por via i.v. o s.c. en la fina piel detras de la oreja.
221. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-220, en el que los animales se mantienen en ayunas durante aproximadamente 18 h antes de la dosificacion.
222. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-221, en el que un grupo de referencia y una serie de grupos de dosis de derivados correspondientes a 2-6 niveles de concentracion plasmatica dife- rentes se someten a ensayo, en donde el grupo de referencia a) se trata con vehfculo o b) no se trata.
223. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-222, en el que el nivel de concentra- cion en plasma es 3000-80000 pM.
224. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-223, en el que se realiza una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa de 1 o 2 horas (IVGTT).
225. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-224, en el que se proporciona 0,3 g/kg de glucosa por via i.v. durante un periodo de 30 segundos y las muestras de sangre se toman en puntos de tiempo adecuados, tales como los siguientes puntos de tiempo (t = 0 se corresponde con el bolo de glucosa): - 10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 minutos.
226. El analogo o el derivado de la realizacion 225, en el que se determina la concentracion en plasma del ana- logo o derivado, de glucosa e insulina.
227. El analogo o el derivado de la realizacion 226, en el que la concentracion de analogo o derivado se mide en t = 0 min, y, opcionalmente, al final de la prueba (t = 60 min o t = 120 min).
228. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-227, en el que la glucosa se analiza utilizando el metodo de glucosa oxidasa.
229. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-228, en el que el area bajo la curva de insulina (AUCinsulina) se calcula y se utiliza como una medida de la secrecion de insulina.
230. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 216-229, en el que para al menos una concentracion del mismo, la AUCinsulina es mas alta que la AUCinsulina de referencia, preferiblemente al menos el 110% de la misma, mas preferiblemente al menos el 120% de la misma, incluso mas preferiblemente al menos el 130% de la misma o lo mas preferiblemente al menos el 140% de la misma.
231. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-230, el cual provoca un menor consumo de alimento en los cerdos con respecto a un control (preferiblemente tratado con vehfculo o sin tratar);
opcionalmente el consumo de alimento (0-24 h) puede ser del 90% o menor en relacion con el control tratado con vehfculo, preferiblemente del 80% o menor, mas preferiblemente del 70% o menor, incluso mas preferiblemente del 60% o menor o lo mas preferiblemente del 50% o menor;
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en donde el consumo de alimento (0-24 h) se refiere a las primeras 24 horas despues de la administracion del derivado o el vehnculo.
232. El analogo o el derivado de la realizacion 231, en donde los cerdos son cerdos Landrace Yorkshire Duroc (LYD) hembras.
233. El analogo o el derivado de la realizacion 232, en donde los cerdos LYD tienen 3 meses de edad y preferi- blemente tienen un peso de 30-35 kg.
234. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 231-233, en donde los animales se alojan en un grupo durante 1-2 semanas para la aclimatacion.
235. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 231-234, en donde durante el penodo experimental, los animales se colocan en jaulas individuales desde el lunes por la manana hasta el viernes por la tarde para la medicion de la ingesta de alimentos individual.
236. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 231-235, en donde los animales son ali- mentados a voluntad con pienso para cerdos (tal como Svinefoder, Antonio).
237. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 231-236, en donde la ingesta de alimentos se controla en lmea, registrando el peso del pienso cada 15 minutos, preferiblemente utilizando el sistema Mpigwin.
238. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 231-237, el cual se dosifica a 0,3, 1,0, 3,0, 10 o 30 nmol/kg, preferiblemente disuelto en un tampon fosfato (fosfato 50 mM, 0,05% de Tween 80, pH 8), mas preferiblemente a concentraciones de 12, 40, 120, 400 o 1200 nmol/ml.
239. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 231-238, en el que el tampon fosfato sirve como vehfculo.
240. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 231-239, en el que los animales se dosifi- can con una dosis unica subcutanea del derivado o el vehfculo (preferiblemente con un volumen de dosis de 0,025 ml/kg), en la manana del dfa 1 y la ingesta de alimentos se mide durante 4 dfas despues de la dosifica- cion.
241. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-240, que tiene una semivida in vitro (Ty), en un extracto de intestino delgado de rata, dividida por la correspondiente semivida (Ty) de GLP 1 (7-37), de al menos 1,0, preferiblemente al menos 2,0, aun mas preferiblemente al menos 4,0 o lo mas preferiblemente al menos 5,0.
242. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-241, que tiene una semivida in vitro (Ty2), en un extracto de intestino delgado de rata, dividida por una semivida correspondiente (Ty) de GLP 1 (7-37), de al menos 9,0, preferiblemente al menos 10,0, mas preferiblemente al menos 12,0, incluso mas preferiblemente al menos 14,0, aun mas preferiblemente al menos 16,0 o lo mas preferiblemente al menos 18,0; o incluso al menos 20,0.
243. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 241-242, en el que el extracto de intestino delgado de rata se prepara como se describe en el Ejemplo 50, el analogo o el derivado se incuba durante una hora a 37°C, la concentracion del extracto se valora de modo que la semivida de GLP-1 (7-37) esta en el inter- valo de 10-20 minutos, por ejemplo 1,4 ug/ml, las muestras resultantes se analizan por UPLC y/o MALDI-TOF, y/o se realiza la incubacion y el analisis como se describe en el Ejemplo 50.
244. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 241-243, para el cual una relacion [semivida (Ty) in vitro en el extracto de intestino delgado de rata, dividida por una semivida (Ty) in vitro en el extracto de intestino delgado de rata de GLP-1 (7-37)] es al menos 0,5 veces la relacion correspondiente de semagluti- da, preferiblemente al menos 2 veces la relacion de semaglutida, mas preferiblemente al menos 3 veces la relacion de semaglutida, incluso mas preferiblemente al menos 5 veces la relacion de semaglutida o lo mas preferiblemente al menos 7 veces la relacion de semaglutida.
245. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 241-244, para el cual una relacion [semivida (Ty) en el extracto de intestino delgado de rata, dividida por una semivida (Ty) en el extracto de intestino delgado de rata de GLP -1 (7-37)] es al menos 0,1 veces la relacion correspondiente de liraglutida, preferiblemente al menos 0,4 veces la relacion de liraglutida, mas preferiblemente al menos 0,8 veces la relacion de liraglutida, incluso mas preferiblemente al menos 1,2 veces la relacion de liraglutida o lo mas preferiblemente al menos 1,5 veces la relacion de liraglutida.
246. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-245, que tiene una semivida (Ty) in vivo en ratas despues de una administracion por via i.v. de al menos 4 horas, preferiblemente al menos 6 horas, incluso mas preferiblemente al menos 8 horas o lo mas preferiblemente al menos 10 horas.
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247. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-246, que tiene una semivida (Ty2) in vivo en ratas despues de una administracion por via i.v. de al menos 11 horas, preferiblemente al menos 12 horas, incluso mas preferiblemente al menos l3 horas o lo mas preferiblemente al menos 14 horas.
248. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-247, en el cual las ratas son ratas macho Sprague Dawley con un peso corporal de 300 a 600 g.
249. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-248, que tiene una semivida (Ty2) in vivo en ratas despues de una administracion por via i.v. que es al menos la misma que la semivida de semaglutida, preferiblemente al menos 2 veces la semivida de semaglutida, mas preferiblemente al menos 3 veces la semivida de semaglutida, incluso mas preferiblemente al menos 4 veces la semivida de semaglutida o lo mas preferiblemente al menos 5 veces la semivida de semaglutida.
250. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-249, que tiene una afinidad de union a HSA relati- vamente baja, preferiblemente una afinidad de union mas baja y/o una Kd mayor (o Kd aparente), que a) el compuesto del Ejemplo 68 del documento WO 2009/030771; b) el compuesto del Ejemplo 69 del documento WO 2009/030771; y/o c) el compuesto del Ejemplo 71 del documento Wo 2009/030771; en donde la afinidad de la union a HSA se puede expresar como la constante de disociacion (Kd, en pM); preferiblemente como la constante de disociacion aparente; y en donde, mas preferiblemente, la constante de disociacion o la constante de disociacion aparente es
i) 1 o superior; preferiblemente 5 o superior; incluso mas preferiblemente 10 o superior; o lo mas preferible- mente 20 o superior;
ii) 25 o inferior; preferiblemente inferior a 20; mas preferiblemente inferior a 10; aun mas preferiblemente inferior a 5,0; o lo mas preferiblemente inferior a 1,0; y/o
iii) dentro de un intervalo definido por los lfmites de i) y ii), tal como, por ejemplo, entre 1 y 5; entre 1 y 10; entre 1 y 20; entre 1 y 25; entre 5 y 10; entre 5 y 20; entre 5 y 25; entre 10 y 20; o entre 20 y 25.
251. El derivado de la realizacion 250, en el que la constante de disociacion se mide usando un ensayo de competencia de centelleo por proximidad (SPA), tal como el descrito en el Ejemplo 57.
252. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 250-251, en el que se incuban perlas de estreptavidina- SPA (tales como GE Healthcare RPNQ0009) con HSA biotinilada durante 5 horas
253. El derivado de la realizacion 252, en el que las perlas se lavan, preferiblemente con tampon, para eliminar la HSA no unida; y posteriormente se mezclan con un analogo de GLP-1 acilado marcado con 125I (tal como N- epsilon37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-tetrazol-5- il)hexadecanoilsulfamoil)butirilamino]dodecanoilamino)-4-carboxibutirilamino)-4-
carboxibutirilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,125l-Tyr19,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37] GLP-1(7-37)-NH2) en un
tampon que contiene Hepes 100 mM, NaCl 100 mM, MgSO410 mM, 0,025% de Tween-20, pH 7,4.
254. El derivado de la realizacion 253, en el que la mezcla de reaccion se retira pipeteando, por ejemplo, en los pocillos de una placa Optiplate-96 6005290 de Perkin Elmer, preferiblemente 100 pl por pocillo; y 100 pl de una serie de diluciones del derivado de GLP-1 que se va a medir se anaden, a continuacion, en el mismo tampon.
255. El derivado de la realizacion 254, en el que despues de 20 horas de agitacion suave a temperatura am- biente, las placas se centrifugan y se hace un recuento, por ejemplo, en un TopCounter; despues de lo cual las cpm unidas se representan graficamente como una funcion de la concentracion de derivado de GLP-1; y la Kd y/o la Kd aparente se pueden calcular como la concentracion molar del derivado de GLP-1 en cuestion, multipli- cada por la concentracion molar de HSA y dividida por la concentracion molar del complejo GLP-1-HSA.
256. El analogo o el derivado de una cualquiera de las realizaciones 1-255, que tiene una masa molecular inferior a 80 kDa; preferiblemente inferior a 60 kDa, tal como inferior a 40 kDa; incluso mas preferiblemente inferior a 20 kDa; todavfa mas preferiblemente inferior a 10 kDa; o lo mas preferiblemente inferior a 6 kDa.
257. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-256, que no es un compuesto del Ejemplo 18, preferiblemente no es Chem. 37.
258. El derivado de una cualquiera de las realizaciones 85-257, que no es un compuesto de los Ejemplos 28, 29, 34, 35, 36 y 37; preferiblemente no es Chem. 47, Chem. 48, chem. 53, Chem. 54, Chem. 55 ni Chem. 56.
259. Un producto intermedio que comprende, preferentemente que consiste en un compuesto seleccionado a partir de los siguientes:
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en donde PG representa un grupo protector y
en donde, opcionalmente, los grupos -COOH* distales de los restos de accion prolongada de Chem. 67 tam- bien estan protegidos como se conoce en la tecnica; preferiblemente con la formacion de un ester no reactivo; mas preferiblemente i) un ester de un alcohol con una cadena lateral voluminosa, tal como un ester de un fenol, opcionalmente sustituido; o ii) un ester de alquilo ramificado, preferiblemente un alquilo inferior; mas preferiblemente protegido como OtBu, OBz y similares;
o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
260. El producto intermedio de la realizacion 259, en donde PG es un grupo que hace que el producto interme- dio no sea reactivo de forma reversible y que se puede eliminar selectivamente.
261. El producto intermedio de una cualquiera de las realizaciones 259-260, en el que PG es i) -OH o ii) esta funcionalizado como un ester activado.
262. El producto intermedio de la realizacion 261, en el que el ester activado es un ester de p-nitrofenol; 2,4,5- triclorofenol; N-hidroxisuccinimida; N-hidroxisulfosuccinimida; 3,4-dihidro-3-hidroxi-1,2,3-benzotriazina-4-ona; 5- cloro-8-hidroxiquinolina; acido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxflico imida; pentafluorofenol; p- sulfotetrafluorofenol; N-hidroxiftalimida; 1-hidroxibenzotriazol; 1-hidroxi-7-azabenzotriazol; N-hidroximaleimida; acido 4-hidroxi-3-nitrobenceno sulfonico; o cualquier otro ester activado conocido en la tecnica.
263. Un analogo o un derivado de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-258, para uso como un medicamento.
264. Un analogo o un derivado de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-258, para uso en el trata- miento y/o la prevencion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos de la alimentacion, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeti- cas, enfermedad cntica y/o smdrome de ovario poliqmstico; y/o para mejorar los parametros de lfpidos, mejorar la funcion de las celulas p y/o para retrasar o prevenir la progresion de una enfermedad diabetica.
265. Uso de un analogo o un derivado de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-258 en la prepara- cion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos de la alimentacion, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedad cntica y/o smdrome de ovario poliqmstico; y/o para mejorar los parametros de lfpidos, mejorar la funcion de las celulas p y/o para retrasar o prevenir la progresion de una enfermedad diabetica.
266. Un metodo para tratar o prevenir todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos de la alimentacion, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedad cntica y/o smdrome de ovario poliqmstico; y/o para mejorar los parametros de lfpi- dos, mejorar la funcion de las celulas p y/o para retrasar o prevenir la progresion de una enfermedad diabetica - mediante la administracion de una cantidad farmaceuticamente activa de un analogo o un derivado de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-258.
EJEMPLOS
Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas, y continua con una seccion que incluye metodos generales para la smtesis y la caracterizacion de peptidos y derivados de la invencion. A continuacion, sigue una serie de ejemplos que se refieren a la preparacion de derivados de peptidos GLP-1 espedficos, y al final se ha in- cluido una serie de ejemplos relacionados con la actividad y las propiedades de estos peptidos y derivados (seccion titulada metodos farmacologicos).
Los ejemplos sirven para ilustrar la invencion.
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Abreviaturas
Las siguientes abreviaturas se utilizan a continuacion, en orden alfabetico:
Aib:
Acido aminoisobutmco (acido a-aminoisobutmco)
API:
Principio activo farmaceutico
AUC:
Area bajo la curva
BG:
Glucosa en sangre
BHK:
Rinon de cna de hamster
Boc:
f-butiloxicarbonilo
Bom:
benciloximetilo
PM:
Peso Molecular
Bzl:
Bencilo
Clt:
2-clorotritilo
colidina:
2,4,6-trimetilpiridina
cpm:
cuentas por minuto
DCM:
diclorometano
Dde:
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)etilo
DIC:
diisopropilcarbodiimida
DIPEA:
diisopropiletilamina
DMAP:
4-dimetilaminopiridina
DMEM:
Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)
EDTA:
acido etilendiaminotetracetico
EGTA:
acido etilenglicol tetraacetico
FCS:
Suero de ternera fetal
Fmoc:
9-fluorenilmetiloxicarbonilo
HATU:
(hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
HBTU:
(hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il-)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
HEPES:
acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico
HFIP:
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol
HOAt:
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt:
1-hidroxibenzotriazol
HPLC:
Cromatograffa Kquida de alto rendimiento
HSA:
Albumina de suero humano
IBMX:
3-isobutil-1-metilxantina
Imp:
acido imidazopropionico (tambien denominado des-amino histidina, DesH)
i.v.:
por v^a intravenosa
ivDde:
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)-3-metilbutilo
IVGTT:
Prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa
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LCMS:
Cromatograffa Lfquida con Espectroscopfa de Masas
LYD:
Raza Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS:
Vease MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS:
Espectroscopfa de masas laser de desorcion/ionizacion asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo
MeOH:
metanol
Mmt:
4-metoxitritilo
Mtt:
4-metiltritilo
NMP:
N-metil pirrolidona
OBz:
ester de benzoflo
OEG:
acido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico
OPfp:
pentafluorofenoxi
OPnp:
para-nitrofenoxi
OSu:
esteres de O-succinimidilo (esteres de hidroxisuccinimida)
OSuc:
2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilo
OtBu:
ester terc butilico
Pbf:
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo
PBS:
solucion salina tamponada con fosfato
PD:
Farmacodinamico
Pen/Strep:
Penicilina/estreptomicina
PK:
Farmacocinetico
RP:
Fase inversa
RP-HPLC:
Cromatograffa Kquida de alto rendimiento en fase inversa
TA:
Temperatura ambiente
Rt:
Tiempo de retencion
s.c.:
por via subcutanea
SD:
Desviacion estandar
SEC-HPLC:
Cromatograffa Uquida de alto rendimiento de exclusion por tamano
SEM:
Error estandar de la media
SPA:
Ensayo de centelleo por proximidad
SPPS:
Smtesis peptfdica en fase solida
tBu:
terc. butilo
TFA:
acido trifluoroacetico
TIS:
triisopropilsilano
TLC:
Cromatograffa en capa fina
Tos:
tosilato (o para-toluensulfonilo)
Tris:
tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
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Trt: trifenilmetilo o tritilo
Trx: acido tranexamico
UPLC: Cromatograffa Kquida de ultra-alta resolucion
METODOS DE PREPARACION
A. Metodos Generales
Esta seccion se refiere a metodos para la smtesis de peptidos unidos a resinas (metodos SPPS, incluyendo metodos para la desproteccion de aminoacidos, metodos para escindir el peptido de la resina y para su purificacion), asf como a metodos para detectar y caracterizar el peptido resultante (metodos LCMS, MALDI y UPLC). La smtesis de los peptidos se puede mejorar, en algunos casos, mediante el uso de dipeptidos protegidos en el enlace dipeptido ami- da con un grupo que se puede escindir en condiciones acidas, tal como pero no limitado a, 2-Fmoc-oxi-4- metoxibencilo o 2,4,6-trimetoxibencilo. En los casos en que en el peptido esta presente una serina o una treonina, se pueden emplear dipeptidos de seudoprolina (disponibles, por ejemplo, en Novabiochem, vease tambien W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Los derivados de aminoacidos protegidos utilizados eran Fmoc-aminoacidos con- vencionales (suministrados, por ejemplo, por Anaspec, IRIS o Novabiochem). El aminoacido N-terminal estaba pro- tegido con Boc en el grupo amino alfa (por ejemplo, Boc-His(Boc)-OH o Boc-His(Trt)-OH para peptidos con His en el extremo N-terminal). El grupo amino epsilon de las lisinas en la secuencia estaba protegido con Mtt, Mmt, Dde, ivD- de o Boc, dependiendo de la ruta para la fijacion del resto que se une a albumina y el espaciador. El resto que se une a albumina y/o el enlazador se puede fijar al peptido ya sea mediante acilacion del peptido unido a la resina o acilacion en solucion del peptido sin proteccion. En caso de fijacion del resto que se une a albumina y/o del enlazador a la peptidil resina protegida, la fijacion puede ser modular usando SPPS y componentes fundamentales protegidos de forma adecuada, tales como, pero no limitados a Fmoc-OEG-OH (acido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico), Fmoc-Trx-OH (acido Fmoc-tranexamico), Fmoc-Glu-OtBu, ester mono-terc-butflico de acido octadecanodioico, ester mono-terc-butflico de acido nonadecanodioico o ester terc-butflico de acido 4-(9-carboxinoniloxi)benzoico
1. Smtesis de peptido unido a la resina
Metodo A de SPPS
El metodo A de SPPS se refiere a la smtesis de una peptidil resina protegida utilizando qmmica de Fmoc en un sin- tetizador de peptidos Applied Biosystems 433 (tambien designado sintetizador ABI433A) a escala 0,25 mmol o 1,0 mmol, usando los protocolos FastMoc UV del fabricante que emplean acoplamientos en NMP mediados por HBTU o HATU y vigilancia con UV de la desproteccion del grupo protector Fmoc.
La resina de partida usada para la smtesis de amidas de peptidos era una resina Rink-amida adecuada (para ami- das de peptidos) o (para peptidos con un carboxi C-terminal) una resina Wang adecuada o una resina de clorotritilo adecuada. Las resinas adecuadas estan disponibles comercialmente, por ejemplo, en Novabiochem.
Metodo B de SPPS
El metodo B de SPPS se refiere a la smtesis de una peptidil resina protegida utilizando qmmica de Fmoc en un sintetizador de peptidos Liberty basado en microondas (cEm Corp., Carolina del Norte). Una resina adecuada es una resina Wang cargada previamente, de carga baja disponible en Novabiochem (por ejemplo, resina Fmoc-Lys(Mtt)- Wang de carga baja, 0,35 mmol/g). La desproteccion de Fmoc era con 5% de piperidina en NMP a hasta 70 o 75°C. La qmmica de acoplamiento era DIC/HOAt en NMP. Se anadieron soluciones de aminoacido/HOAt (0,3 M en NMP con 3-10 veces de exceso molar) a la resina, seguidas por el mismo equivalente molar de DIC (0,75 M en NMP). Por ejemplo, las siguientes cantidades de solucion de aminoacido/HOAt 0,3 M se utilizaron para cada acoplamiento, para las siguientes reacciones a escala: Escala/ml, 0,10 mmol/2,5 ml, 0,25 mmol/5 ml, 1 mmol/15 ml. Los tiempos de acoplamiento y las temperaturas eran generalmente desde 5 minutos a hasta 70 o 75°C. Los tiempos de acoplamiento mas largos se utilizaron para reacciones a mayor escala, por ejemplo 10 min. Los aminoacidos de histidina se acoplaron de forma doble a 50°C o de forma cuadruple si el aminoacido anterior estaba impedido estericamente (por ejemplo, Aib). Los aminoacidos arginina se acoplaron a TA durante 25 min, despues se calentaron a 70 o 75°C durante 5 min. Algunos aminoacidos estaban "doblemente acoplados", lo que significa que despues del primer acoplamiento (por ejemplo, 5 min a 75°C), la resina se drena y se anaden mas reactivos (aminoacido, HOAt y DIC) y la mezcla se calienta de nuevo (por ejemplo, 5 min a 75°C). Cuando se deseaba una modificacion qmmica de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporaba como Lys(Mtt). El grupo Mtt se eliminaba lavando la resina con DCM y suspendiendo la resina en hexafluoroisopropanol puro (sin diluir) durante 20 minutos, seguido de un lavado con DCM y NMP. La modificacion qmmica de la lisina se realizo por smtesis manual (vease el metodo D de SPPS) o por una o varias etapas automatizadas en el sintetizador de peptidos Liberty, como se ha descrito anteriormente, utilizando componentes fundamentales adecuadamente protegidos (vease Metodos generales), incluyendo opcional- mente un acoplamiento manual.
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Metodo D de SPPS
El metodo D de SPPS se refiere a la smtesis de una peptidil resina protegida utilizando qmmica de Fmoc manual. Esta se emplea tipicamente para la fijacion de los enlazadores y las cadenas laterales a la cadena principal del peptido. La qmmica de acoplamiento era DIC/HOAt/colidina en NMP con 4-10 veces de exceso molar. Las condicio- nes de acoplamiento eran 1-6 h a temperatura ambiente. La desproteccion de Fmoc se realizo con 20-25% de pipe- ridina en NMP (3 x 20 ml, cada vez 10 min) seguida de lavados con NMP (4 x 20 ml). La desproteccion de Dde o ivDde se realizo con 2% de hidrazina en NMP (2 x 20 ml, cada vez 10 min) seguida de lavados con NMP (4 x 20 ml). La desproteccion de Mtt o Mmt se realizo con 2% de TFA y 2-3% de TIS en DCM (5 x 20 ml, cada vez 10 min) seguida de DCM (2 x 20 ml), 10% de MeOH y 5% de DIPEA en DCM (2 x 20 ml) y lavados con NMP (4 x 20 ml) o por tratamiento con hexafluroisopropanol puro (5 x 20 ml, cada vez 10 min) seguido de lavados como anteriormente. El resto que se une a albumina y/o el enlazador se pueden fijar al peptido ya sea por acilacion del peptido unido a la resina o mediante acilacion en solucion del peptido sin proteccion (veanse las rutas descritas mas abajo). En caso de fijacion del resto que se une a albumina y/o del enlazador a la peptidil resina protegida, la fijacion puede ser modular usando SPPS y componentes fundamentales adecuadamente protegidos (vease Metodos generales).
Fijacion del peptido unido a la resina- Ruta /: El resto que se une a albumina o el enlazador activado (ester o anhf- drido simetrico activo) tal como mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) ester de acido octadecanodioico (Ebashi et al. docu- mento EP511600, 4 equivalentes molares en relacion con el peptido unido a la resina) se disolvio en NMP (25 ml), se anadio a la resina y se agito durante una noche a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se filtro y la resina se lavo a fondo con NMP, DCM, 2-propanol, metanol y eter dietflico.
Fijacion del peptido unido a la resina- Ruta //: El resto que se une a albumina se disolvio en NMP/DCM (1:1, 10 ml). El reactivo de activacion tal como HOBt (4 equivalentes molares en relacion con la resina) y DIC (4 equivalentes molares en relacion con la resina) se anadieron y la solucion se agito durante 15 min. La solucion se anadio a la resina y se anadio DIPEA (4 equivalentes molares en relacion con la resina). La resina se agito de 2 a 24 horas a temperatura ambiente. La resina se lavo con NMP (2 x 20 ml), NMP/DCM (1:1, 2 x 20 ml) y DCM (2 x 20 ml).
Fijacion del peptido en solucion- Ruta III: El resto que se une a albumina o el enlazador activado (ester o anhudrido simetrico activo) tal como mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) ester de acido octadecanodioico (Ebashi et al. documento EP511600) 1-1,5 equivalentes molares en relacion con el peptido, se disolvio en un disolvente organico tal como acetonitrilo, THF, dMf, DMSO o en una mezcla de agua/disolvente organico (1-2 ml) y se anadio a una solucion del peptido en agua (10-20 ml) junto con 10 equivalentes molares de DIPEA. En caso de grupos protectores en el resi- duo que se une a albumina, tales como terc-butilo, la mezcla de reaccion se liofilizo durante una noche y el peptido bruto aislado se desprotegio despues. En caso de grupos protectores de terc-butilo, la desproteccion se realizo di- solviendo el peptido en una mezcla de acido trifluoroacetico, agua y triisopropilsilano (90:5:5). Despues de 30 minu- tos, la mezcla se evaporo a vaco y el peptido bruto se purifico mediante HPLC preparativa como se describe mas adelante.
Metodo E de SPPS
El metodo E de SPPS se refiere a la smtesis de peptidos mediante qmmica de Fmoc en un sintetizador de peptidos en fase solida Prelude de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 EE.UU.). Una resina adecuada es una resina Wang cargada previamente de carga baja, disponible en Novabiochem (por ejemplo, resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de carga baja, 0,35 mmol/g). La desproteccion de Fmoc era con 25% de piperidina en NMP durante 2 x 10 min. La qmmica de acoplamiento era DIC/HOAt/colidina en NMP. Se anadieron soluciones de aminoacido/HOAt (0,3 M en NMP con 3-10 veces de exceso molar) a la resina, seguido por el mismo equivalente molar de DIC (3 M en NMP) y colidina (3 M en NMP). Por ejemplo, las siguientes cantidades de solucion de aminoacido/HOAt 0,3 M se utilizaron para cada acoplamiento para las siguientes reacciones a escala: Escala/ml, 0,10 mmol/2,5 ml, 0,25 mmol/5 ml. Los tiempos de acoplamiento eran generalmente 60 minutos. Algunos aminoacidos incluyendo, pero no limitados a la arginina y la histidina se "acoplaron de forma doble", lo que significa que despues del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), se drena la resina y se anaden mas reactivos (aminoacido, HOAt, DIC y colidina) y se permite que la mezcla reaccione de nuevo (por ejemplo, 60 min). Cuando se deseaba una modificacion qmmica de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporaba como Lys(Mtt). El grupo Mtt se eliminaba lavando la resina con DCM y sus- pendiendo la resina en hexafluoroisopropanol/DCM (75:25) durante 3 x 10 minutos, seguido de lavados con DCM, 20% de piperidina y NMP. La modificacion qmmica de la lisina se realizo mediante smtesis manual (vease el metodo D de SPPS) o a traves de una o varias etapas automatizadas en el sintetizador de peptidos Prelude como se ha descrito anteriormente, usando componentes fundamentales protegidos adecuadamente (vease Metodos Genera- les).
2. Escision del peptido de la resina y purificacion
Despues de la smtesis, la resina se lavo con DCM y el peptido se escindio de la resina mediante un tratamiento de 2-3 horas con TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5 o 92,5/5/2,5), seguido de precipitacion con eter dietflico. El peptido se disol- vio en un disolvente adecuado (tal como, por ejemplo, acido acetico al 30%) y se purifico por RP-HPLC convencional en una columna C18, 5 pM, usando acetonitrilo/agua/TFA. Las fracciones se analizaron mediante una combinacion de metodos UPLC, MALDI y LCMS y las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron.
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3. Metodos para la deteccion y caracterizacion Metodos LCMS
Metodo 1 de LCMS (LCMS1)
Se utilizo un espectrometro de masas LC/MSD TOF (G1969A) de Agilent Technologies para identificar la masa de la muestra despues de la elucion a partir de un sistema de HPLC de Agilent 1200 series. La deconvolucion de los es- pectros de protemas se calculo con el programa informatico de confirmacion de protemas de Agilent.
Eluyentes:
A: 0,1 % de acido trifluoroacetico en agua B: 0,1 % de acido trifluoroacetico en acetonitrilo Columna: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4,8x50 mm Gradiente: 25 % - 95 % de acetonitrilo durante 15 min Metodo 2 de LCMS (LCMS2)
Se uso un espectrometro de masas Sciex API 3000 de Perkin Elmer para identificar la masa de la muestra despues de la elucion de un sistema de HPLC Series 200 de Perkin Elmer.
Eluyentes:
A: 0,05 % de acido trifluoroacetico en agua B: 0,05 % de acido trifluoroacetico en acetonitrilo Columna: Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 pm Gradiente: 5 % - 90 % de acetonitrilo durante 7,5 min a 1,5 ml/min Metodo 3 de LCMS (LCMS3)
Se uso un espectrometro de masas Waters Micromass ZQ para identificar la masa de la muestra despues de la elucion desde un sistema de HPLC Alliance HT de Waters.
Eluyentes:
A: 0,1 % de acido trifluoroacetico en agua B: 0,1 % de acido trifluoroacetico en acetonitrilo Columna: Phenomenex, Jupiter C4 50 X 4,60 mm id 5 pm Gradiente: 10 % - 90 % de B durante 7,5 min a 1,0 ml/min Metodo 4 de LCMS (LCMS4)
LCMS4 se realizo con una configuracion que consistfa en un sistema de UPLC de Waters Acquity y un espectrometro de masas LCT Premier XE de Micromass. La bomba de UPLC estaba conectada a dos depositos de eluyente que conteman:
A: 0,1 % de acido formico en agua B: 0,1 % de acido formico en acetonitrilo
El analisis se realizo a TA inyectando un volumen apropiado de la muestra (preferiblemente 2-10 pl) en la columna que eluyo con un gradiente de A y B.
Las condiciones de la UPLC, los ajustes del detector y los ajustes del espectrometro de masas fueron:
Columna: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm
Gradiente: Lineal 5 % - 95 % de acetonitrilo durante 4,0 min (alternativamente 8,0 min) a 0,4 ml/min Deteccion: 214 nm (salida de analogo desde TUV (detector de UV sintonizable))
Modo de ionizacion MS: API-ES
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Barrido: 100-2000 amu (alternativamente 500-2000 amu), etapa 0,1 amu Metodos de UPLC y HPLC Metodo 05 B5 1
UPLC (metodo 05_B5_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones de UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C.
El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman:
A: Na2SO4 0,2 M, H3PO4 0,04 M, 10 % de CH3CN (pH 3,5)
B: 70 % de CH3CN, 30 % de H2O
Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 60 % de A, 40 % de B hasta 30 % de A, 70 % de B durante 8 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 05 B7 1
UPLC (metodo 05_B7_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman:
A: Na2SO4 0,2 M, H3PO4 0,04 M, 10 % de CH3CN (pH 3,5)
B: 70 % de CH3CN, 30 % de H2O
Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 80 % de A, 20 % de B hasta 40 % de A, 60 % de B durante 8 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 04 A2 1
UPLC (metodo 04_A2_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman:
A: 90 % de H2O, 10 % de CH3CN, bicarbonato de amonio 0,25 M B: 70 % de CH3CN, 30 % de H2O
Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 90 % de A, 10 % de B hasta 60 % de A, 40 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 04 A3 1
UPLC (metodo 04_A3_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman:
A: 90 % de H2O, 10 % de CH3CN, bicarbonato de amonio 0,25 M B: 70 % de CH3CN, 30 % de H2O
Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 75 % de A, 25 % de B hasta 45 % de A, 55 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 04 A4 1
UPLC (metodo 04_A4_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman:
A: 90 % de H2O, 10 % de CH3CN, bicarbonato de amonio 0,25 M B: 70 % de CH3CN, 30 % de H2O
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Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 65 % de A, 35 % de B hasta 25 % de A, 65 % de B durante 16 minutes con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 08 B2 1
UPLC (metodo 08_B2_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos deposi- tos de eluyente que conteman:
A: 99,95 % de H2O, 0,05 % de TFA
B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TFA
Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B hasta 40 % de A, 60 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 08 B4 1
UPLC (metodo 08_B4_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos deposi- tos de eluyente que conteman:
A: 99,95 % de H2O, 0,05 % de TFA
B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TFA
Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B hasta 95 % de A, 5 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 05 B10 1
UPLC (Metodo 05_B10_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C.
El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman:
A: Na2SO4 0,2 M, H3PO4 0,04 M, 10 % de CH3CN (pH 3,5)
B: 70 % de CH3CN, 30 % de H2O
Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 40 % de A, 60 % de B hasta 20 % de A, 80 % de B durante 8 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 09 B4 1
UPLC (Metodo 09_B4_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman: A: 99,95 % de H2O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TFA. Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B hasta 5 % de A, 95 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 09 B2 1
UPLC (Metodo 09_B2_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman: A: 99,95 % de H2O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TFA. Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B hasta 40 % de A, 60 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 10 B14 1
UPLC (Metodo 10_B14_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 50°C.
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El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman: 99,95 % de H2O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TFA. Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 70 % de A, 30 % de B hasta 40 % de A, 60 % de B durante 12 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 05 B8 1
UPLC (Metodo 05_B8_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman: A: Na2SO4 0,2 M, H3PO4 0,04 M, 10 % de CH3CN (pH 3,5); B: 70 % de CH3CN, 30 % de H2O. Se empleo el siguiente gradiente lineal: 50 % de A, 50 % de B hasta 20 % de A, 80 % de B durante 8 minu- tos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 07 B4 1
UPLC (Metodo 07_B4_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman: A: 99,95 % de H2O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TFA. Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B hasta 5 % de A, 95 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 04 A6 1
UPLC (Metodo 04_A6_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman: A: Tris 10 mM, sulfato de amonio 15 mM, 80 % de H2O, 20 % de CH3CN, pH 7,3; B: 80 % de CH3CN, 20 % de H2O. Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B hasta 10 % de A, 90 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,35 ml/min.
Metodo 05 B2 1
UPLC (Metodo 05_B2_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema de UPLC de Waters equipado con un detector de banda dual. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40°C. El sistema de UPLC estaba conectado a dos depositos de eluyente que conteman: A: 99,95 % de H2O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TFA. Se utilizo el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B hasta 40 % de A, 60 % de B durante 16 minutos con un caudal de 0,40 ml/min.
Metodo 02 B4 4
HPLC (Metodo 02_B4_4): El analisis RP se realizo utilizando un sistema Waters Alliance 2695 equipado con un detector de banda dual Waters 2487. Las detecciones con UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna Symmetry 300 C18, 5 um, 3,9 mm x 150 mm, 42°C. Se eluyo con un gradiente lineal de 5-95 % de acetonitrilo, 90-0 % de agua y 5 % de acido trifluoroacetico (1,0 %) en agua durante 15 minutos con un caudal de 1,0 ml/min.
Metodo 02 B5 1
HPLC (Metodo 02_B5_1): El analisis RP se realizo utilizando un sistema Waters Alliance 2695 equipado con un detector de banda dual Waters 2487. Las detecciones con UV se recogieron usando una columna Symmetry C18, 3,5 um, 3,0 mm x 100 mm. Se eluyo con un gradiente lineal de 10-95 % de acetonitrilo, 95-0 % de agua y 5 % de acido trifluoroacetico (1,0 %) en agua durante 8 minutos con un caudal de 1,0 ml/min.
Metodo MALDI-MS
Los pesos moleculares se determinaron utilizando espectroscopfa de masas laser de desorcion e ionizacion asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo, registrados en un Microflex o Autoflex (Bruker). Se utilizo una matriz de acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico.
Metodo de RMN
Los espectros de RMN protonicos se registraron usando un Brucker Avance DPX 300 (300 MHz) con tetrametilsilano como patron interno. Los desplazamientos qmmicos (8) se proporcionan en ppm y los patrones de division se desig- nan como sigue: s, singlete; d, doblete; dd, doble doblete; dt, doble triplete t, triplete, tt, triplete de tripletes; q, cuarte- to; quint, quinteto; sext, sexteto; m, multipleto y br = amplio.
B. Srntesis de compuestos intermedios
1. Sintesis de monoesteres de diacidos grasos
Someter a reflujo durante una noche los diacidos C12, C14, C16 y C18 con Boc-antndrido, DMAP y f-butanol en tolueno, proporciona predominantemente el ester mono-f-butilico, que se obtiene despues de preparar una mezcla de monoacido, diacido y diester. La purificacion se lleva a cabo mediante lavado, filtracion con tapon de s^lice corto y 5 cristalizacion.
2. Sintesis de 2-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-etil amina
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Diclorhidrato de histamina (20,47 g; 0,111 mol) y trietilamina (48 ml; 0,345 mol) en metanol absoluto (400 ml) se agitaron a temperatura ambiente durante 10 min. Ester etflico de acido trifluoroacetico (14,6 ml; 0,122 mol) en meta- 10 nol (30 ml) se anadio gota a gota durante 30 min a 0°C. La mezcla de reaccion se agito durante 3,5 horas a temperatura ambiente y luego se evaporo hasta sequedad a vach. El residuo se disolvio en diclorometano (450 ml) y se anadio trietilamina (31 ml; 0,222 mol). A continuacion, se anadio cloruro de tritilo (34,1 g; 0,122 mol) por partes y mezcla se agito durante una noche a temperatura ambiente. Cloroformo (400 ml) y agua (600 ml) se vertieron en la mezcla de reaccion. La capa acuosa se separo y se extrajo con cloroformo (3 x 400 ml). Las capas organicas com- 15 binadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se elimino y el solido de color beis se trituro con hexanos (1000 ml). La suspension se filtro para producir 2,2,2-trifluoro-N-[2-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-etil]- acetamida en forma de solido blanco.
Rendimiento: 45,54 g (91 %).
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCla, 8h): 8,44 (bs, 1 H); 7,43 (s, 1 H); 7,41 - 7,33 (m, 9 H); 7,19 - 7,10 (m, 6 H); 6,65 20 (s, 1 H); 3,66 (q, J=5,9 Hz, 2 H); 2,79 (t, J=5,9 Hz, 2 H).
La amida anterior (45,54 g; 0,101 mmol) se disolvio en tetrahidrofurano (1000 ml) y metanol (1200 ml). Se anadio una solucion de hidroxido de sodio (20,26 g; 0,507 mol) en agua (500 ml). La mezcla se agito durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se concentro a vach. El residuo se separo entre cloroformo (1200 ml) y agua (800 ml). La capa acuosa se extrajo con cloroformo (3 x 400 ml). Las capas organicas se combinaron y se secaron sobre 25 sulfato de magnesio anhidro. La evaporacion del disolvente produjo un aceite marron, que se seco durante 3 dfas a vach para proporcionar el producto del tftulo como un solido de color beis.
Rendimiento: 32,23 g (90 %).
Rendimiento total: 82 %.
P.f.: 111-113°C.
30 Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCla, 8h): 7,39 (d, J=1,3, 1 H); 7,38 - 7,32 (m, 9 H); 7,20 - 7,12 (m, 6 H); 6,61 (s, 1 H); 3,00 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 2,70 (t, J=6,5 Hz, 2 H); 1,93 (bs, 2 H).
3. Sintesis de acido 2,2-dimetil-N-[2-(1-tritiMH-imidazol-4-M)-etM]-malonamico
imagen36
Una mezcla de acido de Meldrum (5,52 g, 38,3 mmol), carbonato de potasio (26,5 g, 191 mmol) y yoduro de metilo 35 (7,15 ml, 115 mmol) en acetonitrilo (75 ml) se calento a 75°C en un tubo sellado durante 7 horas. La mezcla se enfrio
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a temperatura ambiente, se diluyo con diclorometano (300 ml), se filtro y el material filtrado se evaporo hasta seque- dad a vaco. Se anadio acetato de etilo (75 ml), hexanos (75 ml) y agua (50 ml) y las fases se separaron. La capa organica se lavo con solucion acuosa al 10% de tiosulfato de sodio (50 ml) y agua (50 ml); se seco sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se elimino a vado para proporcionar 2,2,5,5-tetrametil-[1,3]dioxano-4,6-diona en forma de solido blanco.
Rendimiento: 6,59 g (79%).
Rf (SiO2, cloroformo/acetato de etilo, 98:2): 0,60.
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCls, 5h): 1,76 (s, 6 H); 1,65 (s, 6 H).
Una solucion de 2-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-etil amina (5,00 g, 14,2 mmol) preparada como se ha descrito anterior- mente y trietilamina (9,86 ml, 70,7 mmol) en tolueno (80 ml) se anadio gota a gota durante 50 min a una solucion del compuesto de diona anterior (3,65 g, 21,2 mmol) en tolueno (40 ml) a 75°C. La mezcla se agito a esta temperatura durante 3 horas adicionales (hasta que se detecto la amina de partida en la TLC), despues se evaporo hasta seque- dad. El residuo se volvio a disolver en cloroformo (300 ml) y se lavo con solucion acuosa al 10% de acido dtrico (200 ml). La fase acuosa se extrajo con cloroformo (2 x 60 ml); las fases de cloroformo se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se elimino a vaco. El residuo se trituro con cloroformo caliente (140 ml); se anadieron hexanos (70 ml) y la suspension se agito a temperatura ambiente durante una noche. Los solidos se separaron por filtracion, se lavaron con una mezcla de cloroformo/hexanos (1:1, 2 x 50 ml) y se secaron a vaco para proporcionar el producto del tftulo.
Rendimiento: 6,73 g (88%).
P.f.: 161-162°C.
Rf (SiO2, cloroformo/metanol, 85:5): 0,40.
Espectro 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6, 5h): 12,45 (bs, 1 H); 7,66 (t, J=5,1 Hz, 1 H); 7,57-7,31 (m, 9 H); 7,26 (s, 1 H); 7,20-7,02 (m, 6 H); 6,66 (s, 1 H); 3,25 (m, 2 H); 2,57 (t, J=7,3 Hz, 2H); 1,21 (s, 6H).
4. Smtesis de acido 4-(4-ferc-butil-feml)-butmco
imagen37
Se anadio polvo de cloruro de aluminio (80,0 g, 600 mmol) en porciones a una mezcla agitada de ferc-butilbenceno (40,0 g, 300 mmol) y anhfdrido sucdnico (26,7 g, 267 mmol) y 1,1,2,2-tetracloroetano (100 ml). Despues de haber anadido todo el cloruro de aluminio, la mezcla se vertio en una mezcla de hielo (500 ml) y acido clorhfdrico concen- trado (100 ml). La capa organica se separo, se lavo con agua (500 ml) y el disolvente se separo por destilacion. El residuo solido se disolvio en solucion acuosa caliente al 15% de carbonato de sodio (1,000 ml), se filtro, se enfrio y el acido precipito con acido clorhfdrico (acidificado a pH = 1). El acido bruto se filtro, se seco al aire y recristalizo en benceno (500 ml) para proporcionar acido 4-(4-ferc-butil-fenil)-4-oxo-butmco en forma de cristales incoloros.
Rendimiento: 36,00 g (58%).
P.f.: 117-120°C.
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCla, 5h): 7,93 (dm, J=8,3 Hz, 2 H); 7,48 (dm, J=8,3 Hz, 2 H); 3,30 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 2,81 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 1,34 (s, 9 H).
Una mezcla del acido anterior (36,0 g, 154 mmol), hidroxido de potasio (25,8 g, 462 mmol), hidrato de hidrazina (20 ml, 400 mmol) y etilenglicol (135 ml) se calento a reflujo durante 3 horas y despues se destilo hasta que la temperatura del vapor se habfa elevado a 196-198°C. Despues de otras 14 horas de reflujo, la mezcla se dejo enfriar ligera- mente y despues se vertio en agua fna (200 ml). La mezcla se acidifico con acido clorlddrico concentrado (hasta pH = 1) y se extrajo con diclorometano (2 x 400 ml). Los extractos organicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, el disolvente se separo a vaco y el residuo se purifico por cromatograffa en columna (gel de sflice 60A, 0,060-0,200 mm; eluyente: hexanos/acetato de etilo 10:1-6:1) para proporcionar el producto del tftulo en forma de solido blanco.
Rendimiento: 16,25 g (48%).
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Rf (SO2, acetato de etilo): 0,60.
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCI3, 8h): 7,31 (dm, J=8,1 Hz, 2 H); 7,12 (dm, J=8,1 Hz, 2 H); 2,64 (t, J=7,6 Hz, 2 H); 2,38 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 1,96 (m, 2 H); 1,31 (s, 9 H).
5. Smtesis de acido 2,2-dimetM-W-(1-tritiMH-imidazol-4-MmetM)-malonamico
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Se anadio clorhidrato de hidroxilamina (15,9 g, 229 mmol) a una solucion de 4(5)-imidazolcarboxaldel"ndo (20,0 g, 209 mmol) y carbonato de sodio (12,1 g, 114 mmol) en agua (400 ml) y la solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se evaporo hasta 100 ml y se enfrio en un bano de hielo. Los solidos se separaron por filtracion y el filtrado se concentro hasta 40 ml. Despues de enfriar a 0°C, se obtuvo otra porcion de cristales. Los solidos (23 g) se combinaron y recristalizaron en etanol (aprox. 160 ml) para proporcionar imidazol- 4(5)-carbaldehndo oxima en forma de cristales incoloros.
Rendimiento: 15,98 g (69%).
Espectro 1H RMN (300 MHz, acetona-da+D2O, 8h): 7,78 (bs, 1 H); 7,74 (d, J=0,9 Hz, 1 H); 7,43 (s, 1 H).
Se anadio cloruro de acetilo (51,0 ml, 718 mmol) gota a gota a metanol (670 ml) a 0°C en atmosfera de argon. Despues de 30 min, el bano de refrigeracion se retiro y se anadio la oxima anterior (16,0 g, 144 mmol), seguida de pala- dio sobre carbono (5% en peso, 6,1 g). La mezcla se hidrogeno a presion atmosferica durante 17 horas, despues se filtro a traves de Celite y el disolvente se evaporo para proporcionar diclorhidrato de 4-(aminometil)-imidazol puro en forma de cristales incoloros.
Rendimiento: 23,92 g (98%).
Espectro 1H RMN (300 MHz, D2O, 8h): 8,72 (s, 1 H); 7,60 (s, 1 H); 4,33 (s, 2 H).
El diclorhidrato de amina anterior (18,9 g; 111 mmol) y trietilamina (93 ml; 667 mmol) en metanol (1000 ml) se agita- ron a temperatura ambiente durante 10 min. Se anadio gota a gota ester etflico del acido trifluoroacetico (13,3 ml; 111 mmol) en metanol (30 ml) durante 40 min a 0°C. La mezcla de reaccion se agito durante 18 horas a temperatura ambiente y despues se evaporo hasta sequedad a vach. El residuo se disolvio en diclorometano seco (2000 ml) y se anadio trietilamina (31 ml; 222 mmol). Despues se anadio cloruro de tritilo (31,6 g; 113 mmol) y la mezcla se agito durante una noche a temperatura ambiente. Cloroformo (1000 ml) y agua (1000 ml) se vertieron en la mezcla de reaccion. La capa acuosa se separo y se extrajo con cloroformo (2 x 300 ml). Las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se elimino y el solido de color beis se trituro con hexanos (1000 ml). La suspension se filtro para proporcionar 2,2,2-trifluoro-W-(1-tritil-1H-imidazol-4-ilmetil)-acetamida en forma de solido blanco.
Rendimiento: 46,59 g (96%).
Rf (SO2, diclorometano/metanol 95:5): 0,35.
Espectro 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6, 5h): 9,77 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 7,47-7,34 (m, 9 H); 7,33 (d, J=1,5 Hz, 1 H); 7,137,03 (m, 6 H); 6,80 (d, J=0,8 Hz, 1 H); 4,25 (d, J=5.7 Hz, 2 H).
La amida anterior (46,6 g; 107 mmol) se disolvio en tetrahidrofurano (600 ml) y etanol (310 ml). Se andio una solucion de hidroxido de sodio (21,4 g; 535 mmol) en agua (85 ml). La mezcla se agito durante 5 horas a temperatura ambiente y luego se concentro a vach. El residuo se separo entre cloroformo (1600 ml) y agua (800 ml). La capa acuosa se extrajo con cloroformo (4 x 200 ml). Las capas organicas se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. La evaporacion del disolvente proporciono (1-tritil-1H-imidazol-4-il)-metilamina como un solido blanquecino.
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40
Rendimiento: 36,30 g (100%).
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCI3, 5h): 7,38 (d, J=1,3, 1 H); 7,36-7,30 (m, 9 H); 7,18-7,10 (m, 6 H); 6,69 (m, 1 H); 3,77 (s, 2 H); 1,80 (bs, 2 H).
Se anadio gota a gota una solucion de la amina anterior (10,0 g, 29,5 mmol) y trietilamina (20,5 ml, 147 mmol) en tolueno (220 ml) durante 45 min a una solucion de 2,2,5,5-tetrametil-[1,3]dioxano-4,6-diona (3,65 g, 21,2 mmol) en tolueno (80 ml) a 75°C. La mezcla se agito a esta temperatura durante 3 horas adicionales (hasta que se detecto la amina de partida en la TLC), despues se evaporo hasta sequedad. El residuo se volvio a disolver en cloroformo (500 ml) y se lavo con solucion acuosa al 10% de acido cftrico (300 ml). La fase acuosa se extrajo con cloroformo (100 ml); las fases de cloroformo se combinaron, se lavaron con agua (150 ml) se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se elimino a vach. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de separacion rapida (gel de sflice Fluka 60, diclorometano/metanol 98:2 a 9:1) y cristalizo en una mezcla de cloroformo/hexanos para proporcionar el producto del tftulo como cristales de color beis.
Rendimiento: 9,80 g (73%).
P.f.: 174-175°C.
Rf (SO2, cloroformo/metanol, 85:15): 0,35.
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCla, 5h): 8,45 (t, J=5,8 Hz, 1 H); 7,53 (s, 1 H); 7,40-7,28 (m, 9 H); 7,14-7,01 (m, 6 H); 6,84 (s, 1 H); 4,39 (d, J=5,8 Hz, 2 H); 1,44 (s, 6 H).
6. Smtesis de 3-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-propil amina
imagen39
Se anadio gota a gota 3-(1-tritil-4-imidazolil)propionato de etilo (93,0 g, 223 mmol) en tetrahidrofurano/eter dietflico (1:1, 100 ml) a una suspension de hidruro de litio y aluminio (17,0 g, 446 mmol) durante 1 h. La mezcla se sometio a reflujo durante 3 horas, despues se trato con agua (100 ml), hidroxido de sodio al 20% (100 ml) y agua (100 ml), enfriando con hielo/agua, se filtro y el solido se lavo con tetrahidrofurano. La fase organica se seco sobre carbonato de potasio anhidro, se filtro y se evaporo para proporcionar 3-(1-tritil-4-imidazolil)propanol como un solido blanco.
Rendimiento: 68,0 g (82%).
P.f.: 127-129°C.
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCla, 6h): 7,40-7,24 (m, 10 H); 7,17-7,06 (m, 6 H); 6,55 (s, 1 H); 3,72 (t, J=5,3 Hz, 2 H); 2,68 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 1,86 (m, 2 H).
Se anadio cloruro de metanosulfonilo (8 ml, 104 mmol) gota a gota a una solucion del alcohol anterior (32,0 g, 86,8 mmol) en diclorometano (400 ml) y trietilamina (15,5 ml) a 0°C durante 1 h. La mezcla se agito sin enfriar durante 1 h adicional; A continuacion, se lavo con bicarbonato de sodio al 5% y se seco sobre sulfato de magnesio anhidro. El diclorometano se evaporo a 30°C a vaco y el mesilato aceitoso residual se uso directamente en la siguiente etapa.
Rendimiento: 31,2 g (80%).
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCls, 5h): 7,37-7,30 (m, 10 H); 7,16-7,09 (m, 6 H); 6,58 (s, 1 H); 4,24 (t, J=6,3 Hz, 2 H); 2,96 (s, 3 H); 2,67 (m, 2 H); 2,10 (m, 2 H).
Una mezcla del mesilato anterior (30,0 g, 67 mmol), ftalimida de potasio (18,0 g, 100 mmol), yoduro de sodio (4,0 g, 26,7 mmol) y dimetilformamida (200 ml) se agito durante una noche a temperatura ambiente y despues se trato con agua (2 L) y benceno (2 L). La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y el disolvente se evaporo, proporcionando un residuo que recristalizo en benceno produciendo 1-tritil-4-(3-ftalimidopropil)imidazol como un solido blanco.
Rendimiento: 17,2 g (52%).
P.f.: 211-214°C.
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCI3, 8h): 7,83 (m, 2 H); 7,72 (m, 2 H); 7,39-7,27 (m, 10 H); 7,18-7,07 (m, 6 H); 6,60 (d, J=0,9 Hz, 1 H); 3,72 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 2,60 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 1,99 (m, 2 H).
El derivado de imidazol anterior (26,6 g, 53,5 mmol) se disolvio en etanol (300 ml) y se anadio tetrahidrofurano (150 5 ml) a 60°C, hidrato de hidrazina (50 g, 1 mol) y la solucion se sometio a reflujo durante 6 horas y despues se calento a 70°C durante una noche. El solido se retiro por filtracion y el material filtrado se trato con solucion acuosa al 25% de amomaco (2,5 l) y diclorometano (2,5 L). La capa organica se seco sobre carbonato de potasio anhidro y se eva- poro para proporcionar un residuo, que se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (Fluka 60, cloro- formo saturado con amomaco/metanol) proporcionando el compuesto del tttulo como un solido blanco.
10 Rendimiento: 14,2 g (72%).
P.f.: 112-113°C.
Rf (SO2, cloroformo saturado con amoniaco/metanol 9:1): 0,30.
Espectro 1H RMN (300 MHz, CDCla, 8h): 7,37-7,28 (m, 10 H); 7,18-7,09 (m, 6 H); 6,53 (d, J=1,3 Hz, 1 H); 2,74 (t, J=6,9 Hz, 2 H); 2,59 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 1,95 (bs, 2 H); 1,78 (m, 2 H).
15 7. Sintesis de acido 2,2-dimetil-W-[3-(1-tritiMH-imidazol-4-M)-propil]-malonamico
imagen40
Una resina de cloruro de 2-clorotritilo (2,3 g, 3,0 mmol) se hincho en DCM durante 20 minutos y se filtro. Acido dime- tilmalonico (2 eq; 6,0 mmol; 793 mg) se disolvio en DCM:DMF 1:1 (10 ml) y se anadio a la resina, seguido de DIPEA (6 eq; 18,0 mmol; 3,14 ml) y DCM (10 ml). La resina se agito durante una noche a TA. La resina se filtro y se lavo 20 con DcM:MeOH:DIPEA (17:2:1), dCm, NMP o DCM (2 x 25 ml de cada uno). La resina se hincho en DmF durante 20 minutos y se filtro. Se anadio HOAt (3 eq; 9,0 mmol; 1,23 g), DIC (3 eq; 9,0 mmol; 1,40 ml) y DMF (25 ml) y la resina se agito durante 90 min a TA. La resina se filtro y se anadio 3-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-propil amina (1,8 eq; 5,40 mmol; 1,84 g), DIPEA (4 eq; 6,0 mmol; 2,09 ml) y DMF (10 ml). La resina se agito durante 2 dfas. La resina se filtro y se lavo con NMP (5 x 20 ml) y DCM (10 x 20 ml). Se anadio 2,2,2-trifluoroetanol/diclorometano 1:1 (20 ml) a la 25 resina y se agito durante 2 horas. La resina se lavo con 2,2,2-trifluoroetanol/diclorometano 1:1 (10 ml) y los materia- les filtrados combinados se recogieron y se concentraron a vaco para proporcionar el compuesto del tftulo.
Rendimiento: 600 mg (41%).
LCMS4: m/z = 482 (M+1)
UPLC (metodo 02_B4_4): Rt = 8,07 min
30 Espectro 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6, 8h): 7,36-7,44 (9H, m), 7,07-7,12 (6H, m), 6,62 (1 H, s), 3,02-3,09 (2H, q), 2,38-2,43 (2H, t), 1,61-1,69 (2H, m), 1,26 (6H, s).
8. Sintesis de acido 2,2-dimetil-N-[3-(1-tritiMH-imidazol-4-M)-propM]-malonamico Sintesis de acido 2,2-dimetil- N-piridm-2-ilmetilmalonamico
imagen41
35 Una resina de cloruro de clorotritilo (2,3 g, 3,0 mmol) se hincho en DCM durante 20 minutos y se filtro. El acido dime- tilmalonico (2 eq; 6,0 mmol; 793 mg) se disolvio en DCM:NMP 1:1 (10 ml) y se anadio a la resina seguido de DIPEA
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(6 eq; 18,0 mmol; 3,14 ml) y DCM (10 ml). La resina se agito durante una noche a TA. La resina se filtro y se lavo con DCM:MeOH:DIPEA (17:2:1), dCm, NMP o DCM (2 x 25 ml de cada uno). La resina se hincho en NMP durante 20 minutos y se filtro. Se anadio HOAt (3 eq; 9,0 mmol; 1,23 g), DIC (3 eq; 9,0 mmol; 1,40 ml) y NMP (25 ml) y la resina se agito durante 90 min a TA. La resina se filtro y se anadio 2-(aminometil)piridina (2 eq; 6 mmol; 659 mg), DIPEA (4 eq; 6,0 mmol; 2,09 ml) y NMP (10 ml). La resina se agito durante una noche. La resina se filtro y se lavo con NMP (5 x 20 ml) y DCM (10 x 20 ml). Se anadio TFA/TIS/agua (95:2,5:2,5; 30 ml) a la resina y se agito durante 1 h, se filtro y se concentro a vaco para proporcionar el compuesto del tftulo.
Rendimiento: 600 mg (41%).
LCMS4: m/z = 223 (M+1)
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 1,79 min
C. Srntesis de compuestos de la invencion
Ejemplo 1
[Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido
imagen42
UPLC (metodo 05_B2_1): Rt = 9,78 min (97%)
UPLC (metodo 04_A2_1): Rt = 13,48 min (93%)
LCMS4: (M/4)+1 = 830; (M/3)+1 = 1106; Masa exacta = 3320; Calculada = 3320 Ejemplo 2
N£26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido
Chem. 21:
imagen43
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS seguido de la eliminacion manual del grupo Mtt y el acoplamiento manual de Fmoc-OEG-OH, Fmoc-Glu-OtBu y ester mono-terc-butilico de acido octadecanodioico
HPLC (metodo 02_B4_4): Rt = 9,02 min (99%)
HPLC (metodo 02_B5_1): Rt = 13,15 min (98%)
LCMS4: (M/4)+1 = 1010; (M/3)+1 = 1346; Masa exacta = 4036; Calculada = 4036 Ejemplo 3
[Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36]GLP-1(7-37)yl-Glu38-peptido amida
5
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15
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imagen44
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 05_B2_1): Rt = 9,46 min (100%)
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 5,12 min (93%)
LCMS4: (M/4)+1 = 870; (M/3)+1 = 1160; Masa exacta = 3479; Calculada = 3479 Ejemplo 4
W£12(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-Carboxi-heptadecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil) [Aib8,Lys12,
Glu2Vrg26,His,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido
Chem. 23:
imagen45
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo B de SPPS usando una resina Wang (LL). Fmoc- Lys(Mtt)-OH se utilizo en la posicion 12 y Boc-His(Trt)-OH se utilizo en la posicion 7. El Mtt se elimino con HFIP manualmente. El producto final se caracterizo por UPLC y MALDI-MS.
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 8,2 min
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 9,85 min
MALDI-MS: 3986
Ejemplo 5
W£12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib,Lys,His,Gln]GLP-1(7-37)-
peptido
Chem. 24:
imagen46
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo B de SPPS usando una resina Wang (LL). Fmoc- Lys(Mtt)-OH se utilizo en la posicion 12 y Boc-His(Trt)-OH se utilizo en la posicion 7. El Mtt se elimino manualmente con HFIP. El producto final se caracterizo por UPLC y MALDI-MS.
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 7,9 min
UPLC (metodo 04_A4_1): Rt = 3,9 min
MALDI-MS: 4016,8
5
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15
20
25
hf12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carbox\-4-(17-
carboxiheptadecanoilami-
no)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8Lys12Glu22Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido
imagen47
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo B de SPPS usando una resina Wang (LL). Fmoc- Lys(Mtt)-OH se utilizo en la posicion 12 y Boc-His(Trt)-OH se utilizo en la posicion 7. El Mtt se elimino manualmente con HFIP. El producto final se caracterizo por UPLC y MALDI-MS.
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 7,9 min
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 7,1 min
MALDI-MS: 4114
Ejemplo 7
W£26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][His31,Gln34]GLP-1-(7-37)-peptido
Chem. 26:
imagen48
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 12,90 min (96%)
UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 6,34 min (91%)
LCMS4: (M/4)+1 = 1006; (M/3)+1 = 1341; Masa exacta = 4022; Calculada = 4023 Ejemplo 8
^8[2-(2-{2-[2-(2-(2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilami-
no)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8Lys18Glu22Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido Chem. 27:
imagen49
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo B de SPPS y el producto final se caracterizo mediante UPLC analttica y LC-MS, con la excepcion de que la eliminacion de Mtt y el acoplamiento del enlazador se realizaron por el metodo D.
UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 12,4 min UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 8,5 min
LCMS4: 4178,0 PM calculado = 4177,7 Ejemplo 9
W£26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
5 carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil}[Gly8,His31,Gln34] GLP-1 (7-37)-
peptido
Chem. 28:
imagen50
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo B de SPPS y el producto final se caracterizo mediante 10 UPLC analftica y LC-MS con la excepcion de que la eliminacion de Mtt y el acoplamiento del enlazador se realizaron por el metodo D.
UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 13,0 min UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 10,0 min LCMS4: 4008,0 15 PM calculado = 4008,49
Ejemplo 10
W£26[(S)-4-Carboxi-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-carboxi-heptadecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]-
etoxi}acetilamino)butiril][Aib8His,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido
imagen51
20 Se utilizo el metodo B de SPPS y el producto final se caracterizo por UPLC y LC-MS.
UPLC (metodo 04_A4_1): Rt = 6,08 min UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 8,61 min LCMS4: (1010 x 4) -4 =4036 PM calculado = 4036,5 25 Ejemplo 11
W£26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][D-Ala8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido
Chem. 30:
5
10
15
20
25
30
imagen52
Metodo de preparacion: Se utilizo el metodo B de SPPS y el producto final se caracterizo por UPLC y LC-MS. UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 10,33 min UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 8,80 min
LCMS4: (1005,97 x 4) -4 = 4019,9 PM calculado = 4022,5 Ejemplo 12
N 3H-Imidazol-4-il-acetil, N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(SM-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][His31,Gln34]GLP-1(8-37)-peptido
Chem. 31:
imagen53
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo B de SPPS y el producto final se caracterizo por UPLC analftica y LC-MS, con la excepcion de que los 2 equivalentes de DIEA se anadieron a la solucion de clorhidrato de acido imidazol-4-acetico y HOAt y la solucion se filtro antes del uso.
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 9,82 min
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 8,95 min
LCMS1: (999,26 x 4) -4 = 3393,0
PM calculado = 3393,5
Ejemplo 13
N26[2-(2-{2-[2-(2-(2-[(S)4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido
Chem. 32:
imagen54
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo B de SPPS y el producto final se caracterizo por UPLC analftica y LC-MS, con la excepcion de que la eliminacion de Mtt y el acoplamiento del enlazador se realizaron por el metodo D.
UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 12,8 min UPLC (metodo 04_A4_1): Rt = 4,5 min LCMS4: 4038,0 PM calculado = 4008,51
5
10
N25 26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-
carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
peptido
Chem. 33:
imagen55
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 09_B2_1): Rt = 12,48 min (91%)
UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 5,67 min (91%)
LCMS4: (M/4)+1 = 1002; (M/3)+1 = 1337; Masa exacta = 4008; Calculada = 4008 Ejemplo 15
N27 * * 30-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
^'^L'^LV/ ' 8 97 81 84
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil}-(Aib ,Arg ,Lys ,His ,Gln ) GLP-1 (7-37)-peptido
imagen56
15 Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo E de SPPS y el producto final se caracterizo mediante UPLC analftica y MALDI TOF-MS:
UPLC (metodo 07_B4_1): Rt = 8,3 min
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 11,2 min
MALDI -MS: 4062
20 PM calculado = 4064
Ejemplo 16
N26 [2-(2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP- 1(7-37)-peptido
imagen57
25 El peptido se sintetizo en una resina Gly-PHB Tentagel con una carga de 0,22 mmol/g. La smtesis se realizo en un
sintetizador Liberty en condiciones de microondas utilizando acoplamientos individuales de 5 min con DIC/HOAt a
hasta 70°C, a excepcion de histidina que se acoplo durante 20 minutos a hasta 50°C. Todos los aminoacidos se
protegieron con grupos protectores convencionales, excepto las lisinas que se iban a acilar (en este caso Lys26),
que se protegieron con Mtt. La desproteccion fue con 5% de piperidina en NMP a 50°C durante 3 minutos. Despues
30 de completarse la smtesis, el extremo N-terminal se bloqueo con 10 equivalentes de Boc-carbonato y 10 equivalen-
tes de DIPEA durante 30 minutos. Los grupos Mtt se eliminaron mediante tratamiento con hexafluoroisopropanol puro durante 20 minutos y las cadenas laterales se construyeron paso a paso en el Liberty, usando el mismo proto- colo que anteriormente, utilizando acido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico, Fmoc-Glu-OBut y ester mono-f-butilico de acido hexadecanodioico. El peptido se escindio con TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) durante 2 horas y se aislo por 5 precipitacion con eter dietilico.
El peptido bruto se purifico mediante HPLC preparativa en una columna de 20 mm x 250 mm rellena con sflice 5u o 7u C18. El peptido se disolvio en 5 ml de acido acetico al 50% y se diluyo hasta 20 ml con H2O y se inyecto en la
columna que luego se eluyo con un gradiente de 40-60% de CH3CN en 0,1% de TFA 10 ml/min durante 50 min a
40°C. Las fracciones que conteman el peptido se recogieron y la pureza de determino por MALDI y UPLC. El peptido 10 purificado se liofilizo despues de la dilucion del material eluido con agua.
La masa molecular teorica de 3863,3 se confirmo por MALDI.
El tiempo de retencion en UPLC (Metodo 08_B4_1) era de 8,32 minutos.
El tiempo de retencion en UPLC (Metodo 04_A3_1) era de 8,69 minutos.
Ejemplo 17
15 N2 [(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butiril][Aib8,His31,Gln34]GLP-1 (7-37)-peptido
imagen58
Este compuesto se preparo como en el Ejemplo 16.
La masa molecular teorica de 3716,2 se confirmo por MALDI.
El tiempo de retencion en UPLC (Metodo 08_B4_1) era de 8,48 minutos.
20 El tiempo de retencion en UPLC (Metodo 04_A3_1) era de 9,07 minutos.
Ejemplo 18
N9-{2-[2-(1H-Imidazol-4-il)-etilcarbamoil]-2-metil-propionil}-N£26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][His31,Gln34]GLP-1(9-37)-peptido
imagen59
25 Metodo de preparacion: metodo B de SPPS. Acido 2,2-dimetil-N-[2-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-etil]-malonamico, Fmoc- Oeg-OH, Fmoc-Glu-OtBu y ester mono-terc-butilico de acido octadecanodioico se acoplaron usando las mismas condiciones de acoplamiento que un aminoacido Aib.
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 10,16 min
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 8,76 min
30 LCMS4: Rt = 2,23 min, m/z = 1341 (m/3), 1006 (m/4)
Ejemplo 19
N£26[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(2-{2-[2-(17-carboxi-heptadecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)butiril ami-
no]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido
5
10
15
20
25
imagen60
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS. Fmoc-Oeg-OH, Fmoc-Glu-OtBu y ester mono-terc-butilico de acido octadecanodioico se acoplaron usando las mismas condiciones de acoplamiento que un aminoacido Aib.
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 11,9 min
UPLC (metodo 09_B4_1): Rt = 8,67 min
LCMS4: (1010 x 4) - 4 = 4036, (1346 x 3) - 3 = 4036,5
Masa calculada = 4036
Ejemplo 20
N27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
^'^L'^LV/ ' 8 99 9fi 97 81 84
carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil}-(Aib ,Glu ,Arg ,Lys ,His ,Gln ) GLP-1(7-37)-peptido
imagen61
Metodo de preparacion: El peptido se preparo por el metodo E de SPPS y el producto final se caracterizo por UPLC analftica y MaLdI TOF-MS:
UPLC (metodo 07_B4_1): Rt = 8,2 min
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 9,9 min
MALDI-MS: 4136
PM calculado = 4135
Ejemplo 21
[Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
imagen62
UPLC (metodo 05_B2_1): Rt = 9,50 min
UPLC (metodo 04_A2_1): Rt = 13,22 min
LCMS4 (M/4)+1 = 866; (M/3)+1 = 1154; Masa exacta = 4874
5
10
15
20
N£37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-carboxi-4-[[4-[(19-
carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
[Imp7,Glu22Arg26,His31,Gln,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
Chem. 41:
HN^
imagen63
O
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 05_B2_1): Rt = 14,15 min UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 11,41 min LCMS4 (M/5)+1 = 870; (M/4)+1 = 1087; Masa exacta = 4345 Ejemplo 23
N£36-[2-[2-[2-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetilHAib8Glu30,His31,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu
amida
Chem. 42:
imagen64
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 05_B2_1): Rt = 13,32 min UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 10,14 min LCMS4 (M/5)+1 = 785; (M/4)+1 = 981; Masa exacta = 3920 Ejemplo 24
Na([Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptidil)-Lisina
imagen65
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 9,30 min UPLC (metodo 04_A2_1): Rt = 15,55 min
5
10
15
20
LCMS4 (M/5)+1 = 690; (M/4)+1 = 863; Masa exacta = 3449 Ejemplo 25
[Aib8,His31 ,Gln34,Lys37]-GLP-1 -(7-37)-peptido
imagen66
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 9,28 min
LCMS4 (M/5)+1 = 679; (M/4)+1 = 849; Masa exacta = 3449 Ejemplo 26
W£26-[(4S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil], W£37-[(4S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil]-
[Aib8,His31 ,Gln34,Lys37]-GLP-1 -(7-37)-peptido
imagen67
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 11,76 min LCMS4 (M/5)+1 = 815; (M/4)+1 = 1018; Masa exacta = 4071 Ejemplo 27
W£,2-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]- [Lys12Glu22 ,Arg,His,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Chem. 46:
H °
H-H AEG T-N^^JLt SDVSSYLEEQAAREF I AHLVQGR G-™
imagen68
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS
UPLC (metodo 09_B4_1): Rt = 8,08 min
UPLC (metodo 04_A6_1): Rt = 6,01 min
LCMS4: Rt = 1,85 min, m/z: 3975; M/4 = 994; M/5 = 795
5
10
15
20
25
N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino)-4(S)-
carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil]-N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-
Carboxifenoxi)decanoilamino)-4(S)-
carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8His31Gln34Lys37]GLP-1(7-37)-peptido
imagen69
Preparacion: metodo A de SPPS, comenzando con resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de carga baja. Fmoc-Lys(Mtt)-OH se utilizo en la posicion 26 y Boc-His(Trt)-OH se utilizo en la posicion 7. El Mtt se elimino con HFIP y el acido 8-(9- fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente en Iris Biotech) se acoplo dos veces, seguido por Fmoc-Glu-OtBu y ester ferc-butilico de acido 4-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico (preparado como se describe en el Ejemplo 25, etapa 2 del documento WO 2006/082204) que se acoplaron usando el metodo A de SPPS.
UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 4,95 min (92%)
LCMS4: m/z = 4011, Calculada = 4011
Ejemplo 29
N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-
carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil], N37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4- (11-carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib ,His ,Gln ,Lys ]GLP-1 (7- 37)-peptido
imagen70
Metodo de preparacion: Como en el Ejemplo 16 excepto que se utilizo la resina Lys(Mtt)-Wang con una carga de 0,35 mmol/g. La masa molecular teorica de 4655,2 se confirmo por MALDI.
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt 7,72 min
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt 5,70 min
Ejemplo 30
N26-2,3-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-
carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]propanoil-[Aib8,His31,Gln34]- GLP-1 -(7-37)-peptido
5
10
15
20
25
imagen71
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 8,12 min
UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 7,12 min
LCMS4_4: Rt = 1,42 min, m/z: 4727; M/3 = 1575; M/4 = 1182
Ejemplo 31
N,s-18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[1-(19-carboxinonadecanoil)piperidina-4-
carbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilHAib8,Lys18Glu22,His26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-
37)-peptido
imagen72
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS LCMS4: Rt = 3,62 min, m/z: 4297,0 UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 12,25 min UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 10,68 min Ejemplo 32
N27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17- ep
[Aib°Glu22,Arg26,Lys27Glu30,His31,Gln34Pro37]-GLP-1-(7-37)-peptido
imagen73
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS
La masa molecular teorica de 4234 se confirmo por MALDI-MS (acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico); m/z: 4234 (1A)
UPLC (metodo 07_B4_1): Rt = 8,3 min UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 9,2 min Ejemplo 33
N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-
carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-
peptido
10
15
20
Chem. 52:
H ff H ff
h-haegtftsdvssylegqa a-n^e f i a h l v q g r-n^JLqh
imagen74
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS LCMS4: Rt = 1,94 min, m/z: 3994,5 UPLC (metodo 08_B2_1): Rt = 12,25 min UPLC (metodo 04_A3_1): Rt = 8,63 min Ejemplo 34
N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-
carboxifenoxi)decanoNamino]butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN], N37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-
carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoNamino]butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-
[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
Chem. 53;
imagen75
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS LCMS4 Rt: = 1,92 min m/z: 4797,3; M/4: 1199,8; M/3: 1599,4 UPLC (metodo 09_B4_1): Rt = 8,12 min UPLC (metodo: 05_B8_1): Rt = 2,03 min Ejemplo 35
N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-
carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-
carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[His31,Gln34,Lys37]- GLP-1 -(7-37)-peptido
imagen76
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS LCMS4: Rt = 1,99 min, m/z: 4697,0 UPLC (metodo 09_B2_1): Rt = 12,20 min UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 5,31 min
5
10
15
20
25
N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11 -
carboxiundecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetil], N37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-
carboxi-4-(11-carboxiundecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[His,Gln,Lys37]- GLP-1 -(7-37)-peptido
Chem. 55:
imagen77
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS LCMS4: Rt = 1,89 min, m/z: 4641,2
UPLC (metodo 09_B2_1): Rt= 11,20 min UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 4,00 min
Ejemplo 37
N26-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-
carboxifenoxi)decanoNamino]etoxi]etoxijacetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]butanoN], N37-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-
[[2-[2-[2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-
[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
imagen78
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS LCMS4 Rt = 1,97 min m/z: 4797,3; M/4: 1200,1; M/5: 1599,8 UPLC (metodo 09_B4_1): Rt = 8,24 min UPLC (metodo 05_B8_1): Rt = 2,88 min Ejemplo 38
N26-4-[16-(1H-tetrazol-5-N)hexadecanoNsulfamoN]butanoil-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Chem. 57:
imagen79
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 09_B2_1): Rt = 8,29 min UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 6,40 min LCMS4 m/z: 3762
5
10
15
20
25
30
N8-metil, N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilHHis31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-
peptido
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS
La masa molecular teorica de 4037 se confirmo por MALDI-MS (acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico); m/z: 4035 (1A)
UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 5,8 min UPLC (metodo 07_B4_1): Rt = 8,5 min Ejemplo 40
N22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilHLys,Arg,His,Gln]-GLP-1-
(7-37)-peptido
imagen80
LCMS4: Rt = 1,89 min, m/z: 4121,6 UPLC (metodo 09_B2_1): Rt = 11,97 min UPLC (metodo 05_B5_1): Rt = 5,30 min Ejemplo 41
N24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 7,9 min UPLC (metodo 05_B8_1): Rt = 3,11 min MALDI-MS (acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico): m/z: 4194 Ejemplo 42
N27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
[Aib°Glu,Lys24Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
imagen81
imagen82
5
10
15
20
carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]- [Aib8,Ne25,Arg26,Lys27,His31 ,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
imagen83
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS
La masa molecular teorica de 4106 se confirmo por MALDI-MS (acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico); m/z: 4105 (1A)
UPLC (metodo 07_B4_1): Rt = 8,5 min Ejemplo 43
N16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17- eptadecanoilamino)butano
[Aib°Lys,Glu22,Arg26,His31 ,Gln34]-GLP-1 -(7-37)-peptido
imagen84
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 8,06 min LCMS4: (M/5)+1 = 834; (M/4)+1 = 1042; Masa exacta = 4167 Ejemplo 44
N26-[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido Chem. 63:
H O H 0
™2-H AEGTFTSDVSSYLEGQA A-N^^J-E F I A H L V Q G Fi-N^JLoH
imagen85
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 10_B14_1): Rt = 6,66 min LCMS4 (M/4)+1 = 927; (M/3)+1 = 1235; Masa exacta = 3704 Ejemplo 45
N26-[(4S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido Chem. 64:
H O H °
nhj-H AEGTFTSDVSSYLEGQA A-N,__^-E F | A H L V Q G R-Nx_^U-OH
imagen86
5
10
15
20
25
30
35
Metodo de preparacion: Metodo A de SPPS UPLC (metodo 10_B14_1): Rt = 10,13 min LCMS4 (M/4)+1 = 913; (M/3)+1 = 1226; Masa exacta = 3675 Ejemplo 46
N12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
LLLLLLLLL'/ ' 12 22 26 31 34
carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Lys ,Glu ,Arg ,His ,Gln ]- GLP-1 -(7-37)-peptido
Chem. 65:
H P
"-H AEG SDVS3Y L EEQAARE F I AHLVQGR G-o i
imagen87
Metodo de preparacion: metodo B de SPPS UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 7,76 min MALDI-MS (acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico): m/z: 4102 Ejemplo 47
N24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
22 24 26 31 34
carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu ,Lys Arg ,His Gln ]- GLP-1 -(7-37)-peptido
imagen88
UPLC (metodo 08_B4_1): Rt = 7,78 min MALDI-MS (acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico): m/z: 4178 METODOS FARMACOLOGICOS Ejemplo 48: Potencia in vitro
Los fines de este ejemplo son someter a ensayo la actividad, o la potencia, de los compuestos de GLP-1 de la in- vencion in vitro.
Las potencias de los analogos y derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-47 se determinaron como se describe a continuacion, es decir, como la estimulacion de la formacion de AMP dclico (AMPc) en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GLP-1 humano.
Principio
Membranas plasmaticas purificadas procedentes de una lmea celular transfectada estable, BHK467-12A (tk-ts13), que expresaban el receptor de GLP-1 humano, se estimularon con el analogo de GLP-1 o un derivado en cuestion, y se midio la potencia de la produccion de AMPc usando el kit del ensayo de AMPc AlphaScreenTM de Perkin Elmer Life Sciences. El principio basico del ensayo AlphaScreen es una competencia entre el AMPc endogeno y el AMPc biotinilado anadido exogenamente. La captura del AMPc se consigue mediante el uso de un anticuerpo espedfico conjugado con perlas aceptoras.
Cultivo celular y preparacion de membranas
Se selecciono una lmea celular transfectada estable y un clon con expresion elevada para el escrutinio. Las celulas se cultivaron con 5% de CO2 en DMEM, 5% de FCS, 1% de Pen/Strep (penicilina/estreptomicina) y 0,5 mg/ml del marcador de seleccion G418.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Las celulas con aproximadamente un 80% de confluencia, se lavaron dos veces con PBS y se recogieron con Ver- sene (solucion acuosa de la sal tetrasodica de acido etilendiaminotetraacetico), se centrifugaron 5 min a 1000 rpm y se elimino el material sobrenadante. Las etapas adicionales se realizaron todas sobre hielo. El sedimento de las celulas se homogeneizo mediante un Ultrathurax durante 20-30 s en 10 ml de Tampon 1 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 10 mM, pH = 7,4), se centrifugo 15 min a 20.000 rpm y el sedimento se resuspendio en 10 ml de Tampon 2 (Na- HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH = 7,4). La suspension se homogeneizo durante 20-30 s y se centrifugo 15 min a 20.000 rpm. La suspension en Tampon 2, la homogeneizacion y la centrifugacion se repitieron una vez y las mem- branas se resuspendieron en Tampon 2. Se determino la concentracion de protema y las membranas se almacena- ron a -80°C hasta el uso.
El ensayo se realizo en placas de 96 pocillos de media area de fondo plano (Costar n° de cat.: 3693). El volumen final por pocillo era de 50 pL.
Soluciones y reactivos
Kit del ensayo de AMPc AlphaScreen de Perkin Elmer Life Sciences (n° de cat.: 6760625M); que contiene perlas aceptoras anti-AMPc (10 U/pL), perlas donantes de estreptavidina (10 U/pL) y AMPc biotinilado (133 U/pL).
Tampon de AlphaScreen, pH = 7,4: Tris-HCl 50 mM (Sigma, n° de cat.: T3253); HEPES 5 mM (Sigma, n° de cat.: H3375); MgCh 10 mM, 6H2O (Merck, n° de cat.: 5833); NaCl 150 mM (Sigma, n° de cat.: S9625); 0,01% de Tween (Merck, n° de cat.: 822184). Se anadio lo siguiente al tampon de AlphaScreen antes del uso (concentraciones finales indicadas): BSA (Sigma, n° de cat. A7906): 0,1%; IBMX (Sigma, n° de cat. I5879): 0,5 mM; ATP (Sigma, n° de cat. A7699): 1 mM; GTP (Sigma, n° de cat. G8877): 1 pM.
Patron de AMPc (factor de dilucion en el ensayo = 5): solucion de AMPc: 5 pL de una de solucion de reserva de AMPc 5 mM + 495 pL de tampon de AlphaScreen.
Se preparo una serie de diluciones adecuadas en tampon de AlphaScreen del patron de AMPc asf como del analogo o el derivado de GLP-1 que se iba a someter a ensayo, por ejemplo, las ocho concentraciones siguientes del com- puesto de GLP-1: 10-7, 10-8, 10-9, 10'1°, 10-11, 10-12, 10-13 y 10-14 M, y una serie de, por ejemplo, 10-6 a 3x10-11 de AMPc.
Membrana/perlas aceptoras
Uso de membranas hGLP-1 / BHK 467-12A; 6 pg/pocillo correspondiente a 0,6 mg/ml (la cantidad de membranas usadas por pocillo puede variar)
"Sin membranas": perlas aceptoras (15 pg/ml final) en tampon de AlphaScreen
"6 pg/pocillo de membranas": membranas + perlas aceptoras (15 pg/ml final) en tampon de AlphaScreen
Anadir 10 pL de "sin membranas" al patron de AMPc (por pocillo en duplicados) y los controles positivos y ne- gativos
Anadir 10 pL de "6 pg/pocillo de membranas" a GLP-1 y analogos (por pocillo por duplicado o triplicado)
Control pos.: 10 pL de "sin membranas" + 10 pL de tampon de AlphaScreen
Control neg.: 10 pL de "sin membranas" + 10 pL de solucion de reserva de AMPc (50 pM)
Como las perlas son sensibles a la luz directa, todas las manipulaciones se realizaron en la oscuridad (lo mas oscu- ro posible), o con luz verde. Todas las diluciones se realizaron sobre hielo.
Procedimiento
1. Preparar el tampon de AlphaScreen.
2. Disolver y diluir el GLP-1/analogos/patron de AMPc en tampon de AlphaScreen.
3. Preparar la solucion de perlas donantes e incubar 30 min a TA.
4. Anadir el AMPc/GLP-1/analogos a la placa: 10 pL por pocillo.
5. Preparar membrana/solucion de perlas aceptoras y anadirla a las placas: 10 pL por pocillo.
6. Anadir las perlas donantes: 30 pL por pocillo.
7. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en el agitador durante 3 horas (muy lentamente) a TA.
8. Recuento en AlphaScreen - cada placa se incuba previamente en AlphaScreen durante 3 minutos antes del
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recuento.
Resultados
Los valores de CE50 [pM] se calcularon utilizando el programa informatico Graph-Pad Prism (version 5). La potencia de todos los compuestos, analogos y derivados, se confirmo in vitro. Cuarenta y cuatro compuestos teman una buena potencia in vitro correspondiente a una CE50 de 2000 pM o inferior; 40 compuestos eran incluso mas potentes teniendo una CE50 de 1000 pM o inferior; 33 compuestos todavfa teman una potencia mejorada adicional, correspondiente a una CE50 a 500 pM o inferior; 21 compuestos eran muy potentes que se correspondfan con una CE50 de 200 pM o inferior; y 13 compuestos teman una potencia muy buena correspondiente a una CE50 de 100 pM o inferior. La CE50 de los cinco analogos estaba en el intervalo de 40-160 pM.
Si se desea, el numero de veces de la variacion en relacion a GLP-1 se puede calcular como CE50 (GLP-1)/CE50 (analogo) - 3693,2.
Ejemplo 49: Union al receptor de GLP-1
Los fines de este experimento son investigar la union al receptor de GLP-1 de los compuestos de GLP-1 de la inven- cion y la forma en que la union esta potencialmente influenciada por la presencia de albumina. Esto se hace en un experimento in vitro tal y como se describe a continuacion.
La afinidad de la union de los analogos y derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-47 con el receptor de GLP-1 huma- no se midio por medio de su capacidad para desplazar 125I-GLP-1 desde el receptor. Con el fin de someter a ensayo la union de los compuestos a la albumina, el ensayo se realizo con una concentracion baja de albumina (0,005% - correspondiente a la cantidad residual de la misma en el trazador), asf como con una concentracion elevada de albumina (2,0% anadido).
Un cambio en la afinidad de la union, CI50, es una indicacion de que el peptido en cuestion se une a la albumina y por lo tanto una prediccion de un perfil farmacocinetico potencial de accion prolongada del peptido en cuestion en modelos animales.
Condiciones
Especies (in vitro): Hamster Criterio de valoracion biologico: Union al receptor Metodo de ensayo: SPA Receptor: receptor de GLP-1 Lmea Celular: BHK tk-ts13 Cultivo celular y purificacion de la membrana
Se selecciono una lmea celular transfectada estable y un clon con expresion elevada para el escrutinio. Las celulas se cultivaron con 5% de CO2 en DMEM, 10% de FCS, 1% de Pen/Strep (penicilina/estreptomicina) y 1,0 mg/ml de marcador de seleccion G418.
Las celulas (aprox. 80% de confluencia) se lavaron dos veces en PBS y se recogieron con Versene (solucion acuosa de la sal tetrasodica de acido etilendiaminotetraacetico), despues de lo cual se separaron por centrifugacion a 1000 rpm durante 5 min. Las celulas/sedimento celular deben mantenerse sobre hielo en la medida de lo posible en las etapas subsiguientes. El sedimento celular se homogeneizo con Ultrathurrax durante 20-30 segundos en una cantidad adecuada de Tampon 1 (dependiendo de la cantidad de celulas, pero por ejemplo, 10 ml). El material homoge- neizado se centrifugo a 20000 rpm durante 15 minutos. El sedimento se resuspendio (homogeneizado) en 10 ml de Tampon 2 y se volvio a centrifugar. Esta etapa se repitio una vez mas. El sedimento resultante se resuspendio en Tampon 2 y se determino la concentracion de protema. Las membranas se almacenaron a menos 80°C.
Tampon 1: Na-HEPES 20 mM + EDTA 10 mM, pH 7,4
Tampon 2: Na-HEPES 20 mM + EDTA 0,1 mM, pH 7,4
Ensayo de union:
SPA:
Los compuestos del ensayo, las membranas, las partmulas de SPA y [125I]]-GLP-1(7-36)NH2 se diluyeron en tampon del ensayo. Se anadieron 25 ul (microlitros) de los compuestos del ensayo a la placa Optiplate. Se anadio HSA (experimento con "albumina alta", que contema 2% de HSA) o tampon (experimento con "albumina baja", que contema 0,005% de HSA (50 ul). Se anadieron 5-10 ug de protema/muestra (50 ul) que correspondfan a 0,1 - 0,2 mg de pro-
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tema/ml (para ser optimizada preferiblemente para cada preparacion de membrana). Las partfculas de SPA (perlas de SPA con aglutinina de germen de trigo, Perkin Elmer, n° RPNQ0001) se anadieron en una cantidad de 0,5 mg/pocillo (50 ul). La incubacion comenzo con [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 (concentracion final de 0,06 nM correspon- diente a 49,880 DPM, 25 ul). Las placas se sellaron con PlateSealer y se incubaron durante 120 minutos a 30°C con agitacion. Las placas se centrifugaron (1500 rpm, 10 min) y se hizo el recuento en un Topcounter.
Tampon del ensayo:
HEPES 50 mM
EGTA 5 mM
MgCl2 5 mM
0,005% de Tween 20
pH 7,4
HSA era SIGMA A1653 Calculos
El valor de CI50 se leyo a partir de la curva como la concentracion que desplaza el 50% de 125I-GLP-1 desde el receptor y se determino la relacion de [(Cl50/nM) HSA alta] / [(Cl50/nM) HsA baja].
En general, la union al receptor de GLP-1 con una concentracion baja de albumina debe ser la mejor posible, lo que se corresponde con un valor bajo de CI50.
El valor de CI50 con una concentracion alta de albumina es una medida de la influencia de la albumina sobre la union del compuesto al receptor de GLP-1. Como se sabe, los derivados de GLP-1 tambien se unen a la albumina. Este es un efecto deseable en general, que extiende su tiempo de vida en el plasma. Por lo tanto, para los derivados, el valor de CI50 con albumina alta generalmente sera mas alto que el valor de CI50 con albumina baja, correspondiente a una reduccion de la union con el receptor de GLP-1, causada porque la union de la albumina compite con la union al receptor de GLP-1.
Una relacion alta (valor de CI50 (albumina alta) / valor de CI50 (albumina baja)) se puede tomar por tanto como una indicacion de que el derivado en cuestion se une bien a la albumina (puede tener una semivida larga) y tambien se une por sf mismo al receptor de GLP-1 (el valor de CI50 (albumina alta) es alto, y el valor de CI50 (albumina baja) es bajo).
Resultados
Se obtuvieron los siguientes resultados, en donde "relacion" se refiere a [(Cl50/nM) HSA alta] / [(Cl50/nM) HSA baja]):
Excepto para los cinco analogos y dos de los derivados, todos los compuestos teman una relacion superior a 1,0; 35 derivados eran superiores a 10; 27 derivados eran superiores a 25; 23 derivados eran superiores a 50; 13 derivados superiores a 100; y 7 derivados teman una relacion superior a 250.
Por otra parte, en lo que respecta a CI50 (albumina baja), todos los compuestos teman una CI50 (albumina baja) inferior a 600 nM; todos menos uno inferior a 500 nM; todos menos tres eran inferiores a 100 nM; 39 eran inferiores a 50 nM; 34 compuestos eran inferiores a 25,00 nM; 27 compuestos eran inferiores a 10,00 nM; 21 compuestos eran inferiores a 5,00 nM; y 10 compuestos eran inferiores a 1,00 nM. Los cinco analogos teman una CI50 (albumina baja) en el intervalo de 2-15 nM.
Finalmente, en lo que respecta a la CI50 (albumina alta), todos los compuestos teman una CI50 (albumina alta) de 1000,00 nM o inferior; 41 compuestos eran inferiores a 1000,00 nM; 29 compuestos eran inferiores a 500,00 nM; 13 compuestos eran inferiores a 100,00 nM; y 10 compuestos eran inferiores a 50,00 nM. Los cinco analogos teman una un CI50 (albumina alta) en el intervalo de 0,35-2,97 nM.
Todos los compuestos, analogos, asf como los derivados, se unen bien al receptor de GLP-1 en presencia de albu- mina baja. Ademas, como se esperaba, principalmente es la union de los derivados al receptor la que esta influen- ciada por el aumento de la concentracion de albumina.
Ejemplo 50: Estabilidad frente a la degradacion con enzimas intestinales
Los fines de este Ejemplo son someter a ensayo la estabilidad de los compuestos de la invencion frente a la degradacion con enzimas intestinales.
GLP-1 (7-37) se utilizo en el ensayo como una especie de patron y liraglutida y semaglutida se incluyeron para com- parar.
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Los compuestos sometidos a ensayo eran los analogos y derivados de los Ejemplos 1-23, 27-30, 32-35, 38-39 y 4147.
Las actividades proteoltticas mas fuertes en el intestino son de origen pancreatico e incluyen las endopeptidasas de serina, tripsina, quimotripsina y elastasa, asf como varios tipos de carboxipeptidasas.
Se desarrollo un ensayo con un extracto de intestino delgado de ratas y se utilizo tal y como se describe a continua- cion.
Extractos de intestino delgado de rata
Los intestinos delgados se prepararon a partir de ratas y se lavaron con 8 ml de NaCl 150 mM, Hepes 20 mM pH 7,4. Las soluciones se centrifugaron durante 15 min a 4600 rpm en una centnfuga Heraeus Multifuge 3 S-R con un rotor 75006445. Se retiro el material sobrenadante y se filtro a traves de una membrana de PVDF de 0,22 pm de Millipore Millex GV. El material filtrado de varios animales se agrupo para promediar las diferencias individuales.
El contenido en protema de los extractos obtenidos se determino mediante un Ensayo de Bradford (vease, por ejemplo Analytical Biochemistry (1976), vol. 72, pag. 248-254 y Analytical Biochemistry (1996), vol. 236 pag. 302308).
Ensayo de degradacion
Se incubaron 2,5 nmol de los compuestos que se iban a someter a ensayo con el extracto intestinal en un volumen de 250 pl a 37°C, durante un penodo de una hora. Las muestras intestinales se sometieron a ensayo en presencia de Hepes 20 mM a pH 7,4. La concentracion del extracto intestinal se valoro en experimentos piloto de modo que la semivida (t1^) de gLP-1(7-37) estaba en el intervalo de 10-20 minutos. El extracto de intestino delgado se utilizo a una concentracion de 1,4 pg/ml. Todos los componentes excepto el extracto intestinal se mezclaron y se precalenta- ron durante diez minutos a 37°C. Inmediatamente despues de la adicion del extracto intestinal, se tomo una muestra de 50 pl y se mezclo con el mismo volumen de acido trifluoroacetico al 1% (TFA). Se tomaron mas muestras en consecuencia despues de 15, 30 y 60 minutos.
Analisis de las muestras
Analisis mediante UPLC
Se analizaron 10 pl de las muestras mediante UPLC usando un sistema Waters Acquity con una columna BEH C18 1,7 pm 2,1 x 50 mm y un gradiente de 30 a 65% de 0,1% de TFA y 0,07% de TFA en acetonitrilo, durante 5 minutos con un caudal de 0,6 ml/min. Despues de restar el valor de referencia, se determinaron las integrales de los picos de los compuestos intactos en el cromatograma de HPLC registrados a una longitud de onda de 214 nm.
Analisis MALDI-TOF
Se transfirio 1 pl de cada muestra se transfirio a una diana de Bruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDI. El analisis se realizo en un espectrometro de masas con desorcion e ionizacion con laser asistido por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) Bruker Autoflex, usando el metodo predefinido "PAC_measure" con un intervalo de deteccion prolon- gado de 500 a 5000 Da y el metodo de calibracion predefinido "PAC_calibrate".
Analisis de los datos
Las integrales de los picos de los cromatogramas de HPLC se representaron graficamente frente al tiempo. La semivida del compuesto respectivo se calculo ajustando los datos usando el programa informatico SigmaPlot 9.0 y una ecuacion para una disminucion exponencial de 2 parametros.
Para cada compuesto sometido a ensayo, la semivida relativa (T1^ relativa) se calculo como la semivida (T1^) del compuesto en cuestion, dividida por la semivida (T1^) de GLP-1 (7-37), determinada de la misma manera.
Resultados
La semivida relativa de los compuestos conocidos de liraglutida y semaglutida era de 4,8 y 1,2, respectivamente.
Los treinta y ocho analogos y derivados de GLP-1 sometidos a ensayo teman una semivida relativa de al menos 1; treinta y seis compuestos teman una semivida relativa de al menos 2; treinta compuestos teman una semivida de al menos 5, nueve compuestos teman una semivida de al menos 10; y tres compuestos teman una semivida de al menos 15. Treinta y siete compuestos teman una semivida relativa mas alta que la de semaglutida. Veinticinco compuestos teman una semivida relativa mas alta que la de liraglutida. La semivida relativa de los tres analogos que se sometieron a ensayo estaba en el intervalo de 3-6.
Ejemplo 51: Farmacocinetica en rata
Los fines de este ejemplo son investigar la semivida in vivo en ratas, de los derivados de la invencion.
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Se llevaron a cabo estudios farmacocineticos in vivo en ratas con los derivados de los Ejemplos 2, 7, 14, 16-17, 20, 30 y 38, como se describe a continuacion. La semaglutida se incluyo para comparar.
Ratas macho Sprague Dawley de la misma edad con un peso corporal de 400 a 600 g, se obtuvieron en Taconic (Dinamarca) y se asignaron a los tratamientos mediante una simple asignacion al azar por el peso corporal, aproxi- madamente 3-6 ratas por grupo, de modo que todos los animales en cada grupo teman un peso corporal similar.
Los derivados de GLP-1 (aproximadamente 6 nmol/ml) se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro sodico 145 mM, 0,05% de Tween 80, pH 7,4. Se administraron inyecciones intravenosas (1,0 ml/kg) de los compuestos a traves de un cateter implantado en la vena yugular derecha. Se tomaron muestras de sangre a partir de la vena sublingual durante 5 dfas despues de la dosificacion. Las muestras de sangre (200 jl) se recogieron en tampon EDTA (8 mM) y despues se centrifugaron a 4°C y 10000G durante 5 minutos. Las muestras de plasma se mantuvieron a -20°C hasta que se analizo la concentracion en plasma del compuesto GLP-1 respectivo.
Las concentraciones en plasma de los compuestos GLP-1 se determinaron usando un inmunoensayo luminiscente de canalizacion de oxfgeno (LOCI), generalmente como describen para la determinacion de la insulina Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, pag. 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoda un epttopo medio/C-terminal del peptido. Otro anticuerpo monoclonal, espedfico del extremo N-terminal, estaba biotini- lado. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un complejo inmune con dos sitios. La iluminacion del complejo liberaba atomos de oxfgeno singlete desde las perlas donantes, que se canalizaron en las perlas aceptoras y provocaron quimioluminiscencia que se midio en un lector de placas Envision. La cantidad de luz era propor- cional a la concentracion del compuesto.
Los perfiles en plasma de concentracion-tiempo se analizaron usando WinNonlin (vease, 5.0, Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE.UU.) y la semivida (T1^) se calculo utilizando perfiles de concentracion-tiempo en plasma indivi- duales de cada animal (media armonica).
Resultados
La semivida de semaglutida era de 4 horas.
Los ocho derivados sometidos a ensayo teman una semivida de al menos 5 horas y siete teman una semivida de al menos 10 horas.
Ejemplo 52: Farmacocinetica en cerdos enanos
Los fines de este estudio son determinar la accion prolongada in vivo de los derivados de GLP-1 de la invencion despues de la administracion por via i.v. a cerdos enanos, es decir, la prolongacion de su tiempo de accion.
Esto se realiza en un estudio farmacocinetico (PK), en el que se determina la semivida terminal del derivado en cuestion. Por semivida terminal generalmente se entiende el penodo de tiempo que se tarda en reducir a la mitad cierta concentracion plasmatica, medida despues de la fase de distribucion inicial. Cerdos enanos Gottingen machos obtenidos a partir de cerdos enanos Ellegaard Gottingen (Dalmose, Dinamarca), de aproximadamente 7-14 meses de edad y con un peso de aproximadamente 16-35 kg, se utilizaron en los estudios. Los cerdos enanos se alojaron individualmente y se alimentaron restrictivamente una vez o dos veces al dfa con una dieta SDS para cerdo enano (Special Diets Services, Essex, Reino Unido). Despues de al menos 2 semanas de aclimatacion, se implantaron dos cateteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudal o craneal en cada animal. Se permitio que los animales se recuperaran durante 1 semana despues de la cirugfa y luego se utilizaron para estudios farmacocineticos repetidos con un penodo de reposo farmacologico adecuado entre las dosificaciones.
Los animales se mantuvieron en ayunas durante aproximadamente 18 h antes de la dosificacion y durante al menos 4 h despues de la dosificacion, pero tuvieron acceso a voluntad al agua durante todo el penodo.
Los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 2, 7, 14-15 y 20 se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, 0,05% de Tween 80, pH 7,4 a una concentracion de por lo general 20-60 nmol/ml. Las inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente a por lo general 1-2 nmol/kg, por ejemplo 0,033 ml/kg) de los compuestos se administraron a traves de un cateter y se tomaron muestras de sangre en puntos de tiempo predefinidos hasta 13 dfas despues de la dosificacion (preferentemente a traves del otro cateter). Se recogieron muestras de sangre (por ejemplo 0,8 ml) en tampon EDTA (8 mM) y despues se centrifugaron a 4°C y 1942G durante 10 minutos. El plasma se pipeteo en tubos Micronic sobre hielo seco y se mantuvo a -20°C hasta que se analizo la concentracion plasmatica del respectivo compuesto de GLP-1, usando un ELISA o un ensayo similar basado en un anticuerpo o LC-MS. Los perfiles de la concentracion-tiempo plasmatica individuales se analizaron mediante un modelo no compartimen- talizado en WinNonlin v. 5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE.UU.) y las semividas terminales resultantes (media armonica) se determinaron.
Resultados
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Todos los derivados sometidos a ensayo teman una semivida de al menos 12 horas, cinco teman una semivida de al menos 24 horas, cuatro tema una semivida de al menos 36 horas y tres teman una semivida de al menos 48 horas.
Ejemplo 53: Estimacion de la biodisponibilidad oral
Los fines de este experimento son estimar la biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1 de la invencion.
Para este fin, la exposicion en plasma despues de una inyeccion directa en el lumen intestinal de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 2, 14-17, 20, 28-30, 38 y 41-47 se estudio in vivo en ratas, como se describe a continuacion.
Los derivados de GLP-1 se sometieron a ensayo con una concentracion de 1000 uM en una solucion de 55 mg/ml de caprato sodico.
Se obtuvieron 32 ratas macho Sprague Dawley con un peso corporal a la llegada de aproximadamente 240 g en Taconic (Dinamarca) y se asignaron a los diferentes tratamientos por simple asignacion al azar, 4 ratas por grupo. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante aproximadamente 18 horas antes del experimento y se sometieron a anestesia general (Hypnorm/Dormicum).
Los derivados de GLP-1 se administraron en el yeyuno, en la parte proximal (10 cm distal del duodeno) o en el intes- tino medio (50 cm proximal del ciego). Un cateter de PE50, de 10 cm de longitud se inserto en el yeyuno, se introdu- jo al menos 1,5 cm en el yeyuno y se aseguro antes de la dosificacion mediante una ligadura alrededor del intestino y el cateter con una sutura 3/0 distal de la punta para evitar una fuga o desplazamiento del cateter. El cateter se coloco sin jeringa ni aguja y se administraron 2 ml de solucion salina en el abdomen antes de cerrar la incision con grapas para heridas.
Se inyectaron 100 pl del derivado de GLP-1 respectivo en el lumen yeyunal a traves del cateter con una jeringa de 1 ml. Posteriormente, se introdujeron 200 pl de aire en el lumen yeyunal con otra jeringa para "purgar" el cateter. Esta jeringa se dejo conectada al cateter para evitar un flujo de retorno al cateter.
Se recogieron muestras de sangre (200 ul) de la vena de la cola a intervalos deseados (por lo general en los tiempos 0, 10, 30, 60, 120 y 240 min) en tubos con EDTA, y se centrifugaron 5 minutos, 10000G, a 4°C al cabo de 20 minu- tos. El plasma (75 ul) se separo en tubos Micronic, se congelo inmediatamente y se mantuvo a -20°C hasta que se analizo la concentracion en plasma del derivado de GLP-1 respectivo con LOCI (inmunoensayo luminiscente de canalizacion de oxfgeno), generalmente como describen para la determinacion de insulina Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, pag. 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidi- na, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoda un epftopo me- dio/C-terminal del peptido. Otro anticuerpo monoclonal, espedfico del extremo N-terminal, estaba biotinilado. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un complejo inmune de dos sitios. La iluminacion del complejo liberaba atomos de oxfgeno singlete desde las perlas donantes, que se canalizaron en las perlas aceptoras y provo- caron quimioluminiscencia que se midio en un lector de placas Envision. La cantidad de luz era proporcional a la concentracion del compuesto.
Despues de tomar las muestras de sangre, las ratas se sacrificaron bajo anestesia y se abrio el abdomen para verifi- car la colocacion correcta del cateter.
Las concentraciones plasmaticas (pmol/l) medias (n = 4) se determinaron como una funcion del tiempo. La relacion entre la concentracion plasmatica (pmol/l) dividida por la concentracion de la solucion de la dosificacion (pmol/l), se calculo para cada tratamiento y los resultados para t = 30 min (30 minutos despues de la inyeccion del compuesto en el yeyuno) se evaluaron (exposicion con correccion de dosis a los 30 min) como una medida indirecta de la biodisponibilidad intestinal. La exposicion con correccion de dosis se ha mostrado que se correlaciona significativamente con la biodisponibilidad real.
Se obtuvieron los siguientes resultados, en donde la exposicion con correccion de dosis a los 30 min se refiere a (la concentracion plasmatica 30 minutos despues de la inyeccion del compuesto en el yeyuno (pM)), dividida por (la concentracion del compuesto en la solucion de dosificacion (pM)):
Resultados:
Todos menos tres de los derivados sometidos a ensayo teman una exposicion con correccion de dosis a los 30 minutos superior a 48; ocho eran superiores a 100; tres eran superiores a 125; y uno era superior a 150.
Para comparar, los compuestos de los Ejemplos 69 y 71 del documento WO09030771 teman una exposicion con correccion de dosis a los 30 min de 48 y 20, respectivamente.
Ejemplo 54: Efecto sobre la glucosa en sangre y el peso corporal
El objetivo del estudio es verificar el efecto de los compuestos de GLP-1 de la invencion sobre la glucosa en sangre (GS) y el peso corporal (PC) en un entorno diabetico.
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Los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 2, 4, 7, 14 y 15 se sometieron a ensayo en un estudio de dosis-respuesta en un modelo de raton diabetico obeso (ratones db/db) como se describe a continuacion.
Cincuenta ratones db/db (Taconic, Dinamarca), alimentados desde el nacimiento con la dieta NIH31 (NIH 31M Rodent Diet, disponible comercialmente en Taconic Farms, Inc., EE.UU., vease
www.taconic.com), fueron incluidos en el estudio a la edad de 7-9 semanas, los ratones teman acceso libre a pienso estandar (por ejemplo, Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca) y agua corriente, y se mantuvieron a 24°C. Despues de 1-2 semanas de aclima- tacion, se determino la glucosa en sangre basal dos veces en dos dfas consecutivos (es decir, a las 9 am). Los 8 ratones con los valores de glucosa en sangre mas bajos se excluyeron de los experimentos. Basandose en los valo- res medios de glucosa en sangre, se seleccionaron los 42 ratones restantes para una experimentacion adicional y se asignaron a 7 grupos (n = 6) con niveles de glucosa en sangre parecidos. Los ratones se utilizaron en experimentos con una duracion de 5 dfas durante un maximo de 4 veces. Despues del ultimo experimento, los ratones se sometieron a eutanasia.
Los siete grupos recibieron un tratamiento del modo siguiente:
1: Vetnculo, s.c.
2: Derivado de GLP-1, 0,3 nmol/kg, s.c.
3: Derivado de GLP-1, 1,0 nmol/kg, s.c.
4: Derivado de GLP-1, 3,0 nmol/kg, s.c.
5: Derivado de GLP-1, 10 nmol/kg, s.c.
6: Derivado de GLP-1, 30 nmol/kg, s.c.
7: Derivado de GLP-1, 100 nmol/kg, s.c.
Vetnculo: fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, 0,05% de Tween 80, pH 7,4.
El derivado de GLP-1 se disolvio en el vetnculo, a concentraciones de 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 y 17,0 nmol/ml. Los animales fueron dosificados por via s.c. con una dosis-volumen de 6 ml/kg (es decir, 300 pl por 50 g de raton).
El dfa de la dosificacion, la glucosa en sangre se determino en el momento -1^h (8:30 am), despues de haber pesado los ratones. El derivado de GLP-1 fue dosificado aproximadamente a las 9 am (tiempo 0). El dfa de la dosificacion, la glucosa en sangre se determino en los momentos 1, 2, 4 y 8 h (10 am, 11 am, 1 pm y 5 pm).
Los siguientes dfas, la glucosa en sangre se determino en los momentos 24, 48, 72 y 96 horas despues de la dosificacion (es decir, a las 9 am del dfa 2, 3, 4, 5). Los ratones se pesaron cada dfa, despues de la toma de muestras de glucosa en sangre.
Los ratones se pesaron individualmente en una balanza digital.
Las muestras para la medicion de glucosa en sangre se obtuvieron de forma capilar a partir de la punta de la cola de ratones conscientes. Se recogieron 10 pl de sangre en capilares heparinizados y se transfirieron a 500 pl de tampon glucosa (solucion del sistema EKF, Eppendorf, Alemania). La concentracion de glucosa se midio usando el metodo de la glucosa oxidasa (analizador de glucosa Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Alemania). Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente un tiempo de hasta 1 h hasta el analisis. Si el analisis se tema que posponer, las muestras se mantuvieron a 4°C durante un maximo de 24 h.
DE50 es la dosis que da lugar a un efecto semimaximo en nmol/kg. Este valor se calcula basandose en la capacidad de los derivados para disminuir el peso corporal, asf como en la capacidad para disminuir la glucosa en sangre, como se explica a continuacion.
La DE50 para el peso corporal se calcula como la dosis que da lugar a un efecto semimaximo sobre los cambios del PC, 24 horas despues de la administracion subcutanea del derivado. Por ejemplo, si la disminucion maxima en el peso corporal despues de 24 horas es de 4,0 g, entonces la DE50 del peso corporal sena la dosis en nmol/kg que da lugar a una disminucion del peso corporal despues de 24 horas de 2,0 g. Esta dosis (DE50 de peso corporal) se pue- de interpretar a partir de la curva de dosis-respuesta.
La DE50 para la glucosa en sangre se calcula como la dosis que da lugar a un efecto semimaximo en el cambio de la GS en el AUC, 8 horas despues de la administracion subcutanea del analogo.
El valor de DE50 solo se puede calcular si existe una relacion dosis-respuesta sigmoidea adecuada, con una defini- cion clara de la respuesta maxima. Por lo tanto, si este no fuera el caso, el derivado en cuestion se volvena a anali- zar en un intervalo de dosis diferente hasta que se obtuviera la relacion dosis-respuesta sigmoidea.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los derivados sometidos a ensayo teman el efecto esperado sobre la glucosa en sangre, asf como sobre el peso corporal (una disminucion en ambos casos). Ademas, se obtuvo una curva de dosis-respuesta sigmoidea que permitfa el calculo de los valores de DE50 de la glucosa en sangre y del peso corporal, respectivamente, como se ha explicado anteriormente.
Ejemplo 55: Efecto de la secrecion de insulina mediada por glucosa
El objetivo de este ejemplo es someter a ensayo el efecto de los compuestos GLP-1 de la invencion sobre la secre- cion de insulina mediada por glucosa.
Esto se realiza en cerdos enanos Gottingen utilizando la prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGTT).
Cerdos enanos Gottingen machos (cerdos enanos Ellegaard Gottingen A/S, Dalmose, Dinamarca), de 7-14 meses de edad, se utilizan en los estudios. Los animales se alojan en jaulas individuales durante la aclimatacion y durante los experimentos. Despues de al menos 2 semanas de aclimatacion, se implantan dos cateteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudal o craneal en cada animal. Se permite que los animales se recuperen durante 1 semana despues de la cirugfa y luego se utilizan para estudios repetidos con un penodo de reposo farmacologico adecuado entre las dosificaciones.
Los cerdos se alimentan limitadamente 1-2 veces al dfa con pienso SDS para cerdos enanos (Special Diets Services, Essex, Reino Unido) y se les permite el acceso a voluntad al agua.
El efecto de los compuestos GLP-1 se analiza despues de una sola dosis o despues de un penodo con aumento de la dosis, para evitar los efectos adversos de dosis elevadas agudas. Los derivados de GLP-1 se administran por via i.v. o s.c. en la piel fina de detras de la oreja.
Para cada compuesto GLP-1 sometido a ensayo, hay un grupo de referencia tratado con vehnculo (o sin tratar) y 2-6 grupos de dosis de GLP-1 correspondientes a 2-6 diferentes niveles de concentracion en plasma, que son por lo general aproximadamente de 3000-80000 pM (n = 5-8).
Para cada compuesto GLP-1 se lleva a cabo una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa, de 1 o 2 horas. Los cerdos se mantienen en ayunas durante aproximadamente 18 h antes del experimento. Se comprueba la permeabi- lidad de los cateteres venosos centrales y se toman dos muestras de sangre de referencia. Despues de la muestra en el minuto 0, se administran 0,3 g/kg de glucosa (glucosa 500 g/L, SAD) por via por via i.v. durante un periodo de 30 segundos, y el cateter se lava con 10-20 ml de NaCl al 0,9% esteril. Las muestras de sangre se toman general- mente en los siguientes momentos en relacion con el bolo de glucosa: -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 minutos y despues de cada muestra de sangre, el cateter se lava con 4 ml de NaCl al 0,9% esteril con 10 U/ml de heparina. Las muestras de sangre para las concentraciones de insulina, glucosa y plasma de los derivados se transfieren a tubos recubiertos con EDTa. Los tubos se almacenan sobre hielo humedo hasta la centrifugacion al cabo de 1 hora (4°C, 3000 rpm, 10 min), el plasma se pipetea en tubos Micronic sobre hielo seco y se almacena a -20°C hasta el analisis. Dependiendo de la semivida del derivado de GLP-1, las concentraciones en plasma se miden a t = 0 min o at = 0 min y al final de la prueba (t = 60 min o t = 120 min). La glucosa se analiza usando el metodo de la glucosa oxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con 10 jl de plasma en 500 |jl de tampon (EBIO mas autoanalizador y solucion, Eppendorf, Alemania). La insulina se analiza empleando un ensayo inmunometrico adecuado (tal como LOCI, vease por ejemplo, Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, pag. 240-247). La concentracion plasmatica del derivado de GLP-1 se analiza usando ELISA o un ensayo similar basado en anticuerpos o LC-MS.
Para cada estudio se calcula el area bajo la curva de insulina (AUCinsulina) y se utiliza como una medida de la secrecion de insulina. Los diferentes grupos de dosis se comparan con el grupo vehnculo/referencia respectivo, usando ANOVA de una via u otro analisis estadfstico apropiado. Tambien se puede calcular una CE50 para AUCinsulina.
Ejemplo 56: Efecto sobre la ingesta de alimento
El objetivo de este experimento es investigar el efecto de los compuestos GLP-1 de la invencion sobre la ingesta de alimento en los cerdos. Esto se realiza en un estudio farmacodinamico (PD) como se describe a continuacion, en el que se mide la ingesta de alimento 1, 2, 3 y 4 dfas despues de la administracion de una sola dosis del derivado de GLP-1, en comparacion con un grupo de control tratado con vehfculo.
Se emplean cerdos hembra Landrace Yorkshire Duroc (LYD), de aproximadamente 3 meses de edad, peso aproxi- mado de 30-35 kg (n = 3-4 por grupo). Los animales se alojan en un grupo durante 1-2 semanas durante la aclimatacion a las instalaciones de los animales. Durante el periodo experimental, los animales se colocan en jaulas individuales desde la manana del lunes hasta el viernes por la tarde para medir la ingesta de alimento individual. Los animales se alimentan a voluntad con pienso para cerdos (Svinefoder, Antonio) en todo momento, tanto durante el periodo de aclimatacion como el experimental. La ingesta de alimentos se controla en lmea registrando el peso del pienso cada 15 minutos. El sistema utilizado es Mpigwin (Ellegaard Systems, Faaborg, Dinamarca).
Los derivados de GLP-1 se disuelven en un tampon fosfato (fosfato 50 mM, 0,05% de Tween 80, pH 8) a concentra-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ciones de 12, 40, 120, 400 o 1200 nmol/ml, correspondientes a dosis de 0,3, 1, 3, 10 o 30 nmol/kg. El tampon fosfato sirve como vehmulo. Los animales se dosifican con una dosis subcutanea unica derivado de GLP-1 o del vehmulo (volumen de la dosis 0,025 ml/kg) en la manana del dfa 1 y se mide la ingesta de alimento durante 4 dfas despues de la dosificacion. El ultimo d^a de cada estudio, 4 dfas despues de la dosificacion, se toma una muestra de sangre desde el corazon para medir la exposicion plasmatica del derivado de GLP-1, en animales anestesiados. Los animales se someten despues a eutanasia con una sobredosis intracardiaca de pentobarbital. El contenido en plasma de los derivados de GLP-1 se analiza usando ELISA o un ensayo similar basado en anticuerpos.
La ingesta de alimentos se calcula como la media ± SEM 24 h de la ingesta de alimentos en los 4 dfas.
Las comparaciones estadfsticas de la ingesta de alimento en 24 horas, del vehmulo frente al grupo de derivados de GLP-1 en los 4 dfas, se hacen usando mediciones repetidas de ANOVA de una sola via o de dos vfas, seguidas por una prueba posterior de Bonferroni.
Ejemplo 57: Afinidad de la union a albumina
El objetivo de este Ejemplo es medir la afinidad de los derivados de GLP-1 de la invencion hacia la albumina de suero humano (HSA).
La constante de disociacion (Kd) se usa comunmente para describir la afinidad entre un farmaco y una protema, es decir, con que firmeza se une el farmaco a la protema.
Las constantes de disociacion de los derivados de los Ejemplos 2, 4-9, 11-18, 20-21, 23-25 y 27-46 frente a HSA se determinaron por un ensayo de competencia de centelleo por proximidad (SPA) como se describe a continuacion.
Las perlas de estreptavidina-SPA (GE Healthcare RPNQ0009) se incubaron con HSA biotinilada durante 5 horas. Las perlas se lavaron con tampon para eliminar la HSA no unida. Las perlas se mezclaron con un trazador, a saber, un analogo de GLP-1 acilado marcado con 125I (N-epsilon37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-tetrazol-5- il)hexadecanoilsulfamoil)butirilamino]dodecanoilamino)-4-carboxibutirilamino)-4-
carboxibutirilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8, 125I-Tyr19,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37] GLP-1(7-37)-NH2) en un tampon que contema Hepes 100 mM, NaCl 100 mM, MgSO4 10 mM, 0,025% de Tween-20, pH 7,4. La mezcla se pipeteo en los pocillos de una placa Perkin Elmer Optiplate-96 6005290 (100 pl por pocillo) y 100 pl de una serie de diluciones del derivado de GLP-1 que se iba a medir, se anadieron en el mismo tampon. Despues de 20 horas de agitacion suave a temperatura ambiente, las placas se centrifugaron y se realizo un recuento en un TopCounter. Las cpm unidas se representaron como una funcion de la concentracion de derivado de GLP-1.
Este ensayo se basa en el supuesto de que los derivados sometidos a ensayo se unen al mismo sitio o sitios de union que el trazador.
La Kd se puede calcular como la concentracion molar del derivado de GLP-1 en cuestion, multiplicada por la concentracion molar de HSA y dividida por la concentracion molar del complejo GLP-1-HSA. Por lo tanto, la constante de disociacion tiene unidades molares (M), que se corresponden con la concentracion del derivado de GLP-1, en el que el sitio de union en la HSA esta medio ocupado, es decir, la concentracion del derivado de GLP-1, con la que la concentracion del complejo HSA-GLP-1 es igual a la concentracion de HSA sin derivado de GLP-1 unido. Cuanto menor sea la constante de disociacion, el derivado de GLP-1 estara unido mas estrechamente, o mayor sera la afinidad entre el derivado de GLP-1 y HSA.
Alternativamente, el valor de CE50 de la curva de competencia se puede usar como una medida de la afinidad del derivado hacia HSA (en el presente documento "Kd aparente").
Resultados:
Todos menos cinco de los derivados sometidos a ensayo teman una afinidad de union relativamente baja hacia la albumina, lo que se corresponde con una constante de disociacion aparente (Kd aparente, en pM) relativamente alta, con un valor de 1 o superior. Veintitres teman 5 o superior. En dieciocho era superior a 10 y en doce era superior a 20.
Aunque ciertas caractensticas de la invencion se han ilustrado y descrito en esta memoria, los expertos en la tecnica pueden realizar ahora muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Novo Nordisk A/S
<120> Analogos y derivados de GLP-1
<130> 8297.204-WO
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
< 211> 31
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens
<220>
< 221> PEPTIDO
< 222> (1)..(31)
< 223> GLP-1(7-37)
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    1. Un analogo de GLP-1 que comprende un residuo de histidina en una posicion correspondiente a la posicion 31 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1), un residuo de glutamina en una posicion correspondiente a la posicion 34 de GLP 1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) y un maximo de ocho modificaciones de aminoacidos en comparacion con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1); en el que el residuo de histidina se designa H31 y el residuo de glutamina se designa Q34; o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. Un derivado de un analogo segun la reivindicacion 1, o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente acepta- ble del mismo.
  3. 3. El derivado segun la reivindicacion 2, que tiene un resto que se une a albumina fijado a un residuo de lisina del analogo.
  4. 4. El derivado segun la reivindicacion 3, en el que el resto que se une a albumina comprende un resto de accion prolongada seleccionado a partir de Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 y Chem. 4:
    Chem. 1
    : CHa-(CH2)x-CO-*
    Chem. 2
    : HOOC-(CH2)x-CO-*
    Chem. 3
    : HN4C-(CH2)x-CO-*
    Chem. 4
    : HOOC-CaH4-O-(CH2)y-CO-’
    en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-18, e y es un numero entero en el intervalo de 3-17.
  5. 5. El derivado segun la reivindicacion 4, en el que el resto que se une a albumina comprende adicionalmente un enlazador seleccionado a partir de Chem. 5, Chem. 6, Chem. 7, Chem. 8, Chem. 9 y Chem. 10:
    Chem. 5
    : *-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-’
    Chem. 6
    : *-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
    Chem. 7
    : *-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
    Chem. 8
    : *-NH-CaH8-CO-*
    Chem. 9
    : *-NCsH8-CO-*
    Chem. 10
    : *-NH-SO2-(CH2)3-CO-*
    en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5.
  6. 6. Un analogo o un derivado de GLP-1 seleccionado a partir de lo que sigue:
    Chem. 20:
    imagen1
    Chem. 21:
    imagen2
    5
    imagen3
    imagen4
    Q A'J 'J'J o,
    Carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil)[Aib ,Lys ,Glu ,Arg ,His ,Gln ]GLP-
    N12(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17- Carboxiheptadec 1(7-37)-peptido,
    Chem. 24:
    10
    15
    imagen5
    N12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butinlammo]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib,Lys,His,Gln]GLP-
    1(7-37)-peptido,
    imagen6
    N12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilami-
    no)butinlamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,Lys12Glu22Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido,
    imagen7
    5
    10
    15
    imagen8
    N€l8[2-(2-{2-[2-(2-{2 -[(S)-4-Carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilami-
    no)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,Lys18,Glu22,Ar26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido,
    imagen9
    N£26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil}[Gly8,His31,Gln34]GLP-1 (7-37)- peptido,
    imagen10
    Chem. 30:
    CH-
    1 J O
    H-N'^X|pE GTFTSDVSSYL E G Q A A-N^J^ F IAHLVOGRG-
    imagen11
    N26-[2-(2-(2-[2-(2-(2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][D-Ala8,His31,Gln34]GLP-1(7-
    37)-peptido,
    imagen12
    imagen13
    5
    10
    15
    "—H segtftsdvssylegqa a—e f iahlvogr g—»
    imagen14
    N26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-Carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)- peptido,
    Chem. 33:
    imagen15
    N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-
    carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-
    peptido,
    imagen16
    N27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17- eptadecanoilamino)
    (Aib°Arg,Lys27,His31,Gln34)GLP-1(7-37)-peptido,
    imagen17
    N26[2-(2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15' carbox
    Chem
    carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido,
    imagen18
    N26 [(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butiril][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido,
    5
    10
    imagen19
    W9-{2-[2-(1H-Imidazol-4-il)-etilcarbamoil]-2-metil-propionil}-W£26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][His31,Gln34]GLP-1(9-37)-
    peptido,
    imagen20
    N£26[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(2-{2-[2-(17-carboxi-heptadecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)butiril
    no]etoxi}etoxi)acetil][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-peptido,
    ami-
    imagen21
    (Aib°Glu2,Arg26,Lys27His31,Gln34)GLP-1(7-37)-peptido,
    imagen22
    imagen23
    HN-^s
    imagen24
    O
    15 N£37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-carboxi-4-[[4-[(19-
    carboxinonadecanoilami-
    no)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
    [Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    5
    10
    imagen25
    N£36-[2-[2-[2-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetNHAib8,Glu3°His31,Gln34Lys36]-GLP-1-(7-37)- peptidil-Glu amida,
    imagen26
    Na([Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptidil)-Lisina,
    imagen27
    imagen28
    W£26-[(4S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil], W£37-[(4S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil]-
    [Aib8His,Gln34Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Chem. 46:
    H °
    h-H AEG T-N^^JI-T SDVSSYLEEQAAREF IAHLVQGR G-°h
    imagen29
    W£,2-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
    [Lys12Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen30
    5
    N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino)-4(S)-
    carboxibutirilaiTiino]etoxi)etoxi]acetilaiTimo)etoxi]etoxi)acetil]-N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-
    carboxifenoxi)decanoilamino)-4(S)-
    carboxibutmlaiTiino]etoxi)etoxi]acetilaiTimo)etoxi]etoxi)acetil][Aib8His31,Gln34Lys37]GLP-1(7-37)-peptido,
    Chem. 48:
    imagen31
    10
    15
    20
    N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-
    carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil], N37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-
    Carboxi-4-(11-
    ' Q RA RA R7
    carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Aib ,His ,Gln ,Lys ]GLP-1(7- 37)-peptido,
    Chem. 49:
    imagen32
    N26-2,3-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-
    carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]propanoil-
    [Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen33
    N,s-18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[1-(19-carboxinonadecanoil)pipendina-4-
    carbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Lys18,Glu22,His26,His31,Gln34]-GLP-
    1-(7-37)-peptido,
    5
    10
    15
    imagen34
    N27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17- ieptadecanoilamino)butanoil]amino] [Aib°Glu,Arg26,Lys27Glu,His31,Gln34Pro37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen35
    N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-
    carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-
    peptido,
    imagen36
    N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-
    carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-
    [[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
    [His3\Gln34Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen37
    N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-
    carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-
    carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
    [His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen38
    10
    N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11 -
    carboxiundecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]ammo]etoxi]etoxi]acetil], N37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-
    carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]ammo]etoxi]etoxi]acetil]-
    [His31,Gln34Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen39
    N26-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-
    carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi]etoxijacetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], N37-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-
    [2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-
    [His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Chem. 57:
    H
    w<z-H AEGTFTSDVSSYLEGQA A-N^J’-E F I AHLVQGR G-OH
    imagen40
    N26-4-[16-(1H-tetrazol-5-il)hexadecanoilsulfamoil]butanoil-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen41
    N8-metil, N26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S>4-carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilHHis31,Gln34]-GLP-1-(7-37)- 15 peptido,
    Chem. 59:
    imagen42
    20
    N22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Lys22Arg,His,Gln]- GLP-1 -(7-37)-peptido,
    Chem. 60:
    imagen43
    N24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
    [Aib8,Glu2,Lys24Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    5
    10
    imagen44
    N27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]- [Aib8,Ne25,Arg26,Lys27,His31 ,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Chem. 62:
    H 0 H °
    H-N^JI-E G T F T S D-N^^-S SYLEEQAAREF I AHLVQGR G-h
    imagen45
    N16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17- eptadecanoilamino)butano
    [Aib°Lysl6Glu22Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    imagen46
    N£26-[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Chem. 64:
    H ° H 0
    "Hj-H AEGTFTSDVSSYLEGQA A-N^^^U-E p , A H L V O G R-N^^JLqH
    imagen47
    N£26-[(4S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Chem. 65:
    imagen48
    N12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
    [Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Chem. 66:
    imagen49
    N24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-
    carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]- [Glu22,Lys24,Arg26,His31 ,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido;
    o una sal, una amida o un ester farmaceuticamente aceptable de los mismos.
    5 7. Un analogo o un derivado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso como un medicamento.
  7. 8. Un analogo o un derivado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso en el tratamiento y/o la pre- vencion de todas las formas de diabetes, incluyendo trastornos de la alimentacion, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales y/o smdrome de ovario poliqrnstico; y/o para retrasar o prevenir la progresion de una enfermedad diabetica.
    10 9. Uso de un analogo o un derivado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la preparacion de un medi
    camento para el tratamiento y/o la prevencion de todas las formas de diabetes, incluyendo trastornos de la alimentacion, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales y/o smdrome de ovario poliqrnstico; y/o para retrasar o prevenir la progresion de una enfermedad diabetica.
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