JP2013144684A - 二重アシル化ｇｌｐ−１誘導体 - Google Patents

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Abstract

【課題】経口投与に適した、例えば全ての型の糖尿病及び関連疾患の治療及び/又は予防における使用できるGLP-1アナログの誘導体を提供する。
【解決手段】GLP-1(7-37)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、前記誘導体はそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【選択図】なし

Description

本発明はグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)の誘導体及びその医薬的使用、すなわち26位及び37位においてアシル化された二重アシル化GLP-1誘導体及びその医薬的使用に関する。
配列表の参照による組み込み
「配列表」と題する配列表は584バイトであり、2010年11月17日に作成されたもので、参照により本明細書に組み込まれる。
Journal of Medicinal Chemistry(2000)、vol.43、no.9、1664〜669ページは、K26,34において二重アシル化されたGLP-1(7-37)の誘導体を開示する。表1を参照。
WO98/08871は、K26,34において二重アシル化されたいくらかの誘導体を包含するGLP-1誘導体をいくつか開示する。実施例3、7、17、24、32、33及び36を参照。2009年の時点でNovo Nordisk A/Sにより販売されている1日1回投与のためのモノアシル化GLP-1誘導体であるリラグルチドもまたWO98/08871に開示される(実施例37)。
WO99/43706は、いくらかのK26,37誘導体を包含するモノアシル化及び二重アシル化GLP-1誘導体をいくつか開示する(148〜178ページを参照)。
WO2005/027978は、全く同一の残基K37において二重アシル化された少数の誘導体を包含するGLP-1誘導体をいくつか開示する。実施例8及び9を参照。
WO2009/030738は、K31、Dap34における二重アシル化された誘導体を1つ包含するGLP-1誘導体をいくつか開示する。実施例37を参照。
Journal of Controlled Release(2010)、vol.144、10〜16ページはアシル化エキセンディン-4アナログに関し、中でも、二重アシル化エキセンディン-4(K12,27-diLUA-エキセンディン-4)を開示する(LUAはラウリン酸、C12である)。
WO06/097537は、Novo Nordisk A/Sにより開発中の週1回投与のためのモノアシル化GLP-1誘導体であるセマグルチド(実施例4)を包含するGLP-1誘導体をいくつか開示する。
Angewandte Chemie International Edition 2008、vol.47、3196〜3201ページは、マウス血清アルブミン(MSA)及びヒト血清アルブミン(HSA)の両者との安定な非共有結合相互作用を呈するといわれる、ある種の4-(p-ヨードフェニル)酪酸誘導体の発見及び性質決定を報告する。
WO98/08871 WO99/43706 WO2005/027978 WO2009/030738 WO06/097537 WO2008/145728 WO2009/083549A1 EP511600 WO2006/082204 WO07128817 WO07128815
Journal of Medicinal Chemistry(2000)、vol.43、no.9、1664〜669ページ Journal of Controlled Release(2010)、vol.144、10〜16ページ Angewandte Chemie International Edition 2008、vol.47、3196〜3201ページ Needleman,S.B.及びWunsch,C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453ページ Myers及びW.Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(computer applications in the biosciences) (1988) 4:11〜17ページ Chemoinformatics:A textbook、Johann Gasteiger及びThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003 J.Chem.Inf.Model.2008、48、542〜549ページ J.Chem.Inf.Comput.Sci.2004、44、170〜178ページ J.Med.Chem.2004、47、2743〜2749ページ J.Chem.Inf.Model.2010、50、742〜754ページ M.Bodanszky、「Principles of Peptide Synthesis」、第2版、Springer Verlag、1993 Greene及びWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999 Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000 「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W.C.Chan及びP.D.White編、Oxford University Press、2000 Hodgsonら、「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、vol.33、no.7(2004)、422〜430ページ Remington、「The Science and Practice of Pharmacy」、第19版(1995) W.R.Sampson(1999)、J.Pep.Sci.5、403ページ Poulsen及びJensen、Journal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページ Analytical Biochemistry(1976)、vol.72、248〜254ページ Analytical Biochemistry(1996)、vol.236、302〜308ページ
本発明はGLP-1ペプチドの誘導体に関する。
誘導体は26位の野生型リジンにおいて、同様に37位の野生型グリシンが置換されたリジンにおいてアシル化されている。側鎖はアルブミン結合部分である。誘導体は持続時間延長性部分を含み、この持続時間延長性部分は好ましくは脂肪二酸、及び遠位のフェニル基、フェノキシ基又はチオフェン基を有する脂肪酸から選択され、全て任意選択で置換されている。脂肪酸又は脂肪二酸のカルボキシ基は、任意選択でGLP-1ペプチドのリジン残基、好ましくはそのイプシロン-アミノ基へのリンカーを通じて、アシル化される。GLP-1ペプチドは、GLP-1(7-37)と比較して合計10個までの、例えば1つ若しくは複数の付加、1つ若しくは複数の欠失及び/又は1つ若しくは複数の置換といったアミノ酸の相違を持つGLP-1(7-37)(配列番号1)のアナログであり得る。
より詳細には、本発明はGLP-1アナログの誘導体であって、前記アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、
前記誘導体はそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、
前記アルブミン結合部分は化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含み、
前記持続時間延長性部分が化学式1である場合は前記アルブミン結合部分が化学式5
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)のリンカーをさらに含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルに関する。
本発明はまた薬剤としての使用のための、とりわけ全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防における使用のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、かかる誘導体に関する。
本発明はそのうえGLP-1ペプチド及び側鎖の形の中間生成物に関するものであり、これら中間生成物はある特定の本発明のGLP-1ペプチド及び誘導体の調製に関連する。
本発明の誘導体は生物学的に活性がある。さらに又は或いは、本発明の誘導体は持続時間が延長された薬物動態学的プロファイルを持つ。さらに又は或いは、本発明の誘導体は胃腸の酵素による分解に対して安定である。さらに又は或いは、本発明の誘導体は経口での高い生物学的利用能がある。これらの性質は皮下、静脈内及び/又はとりわけ経口投与のための次世代GLP-1化合物の開発において重要である。
本発明はGLP-1ペプチドの誘導体に関する。誘導体は26位の野生型リジンにおいて、同様に37位の野生型グリシンが置換されたリジンにおいてアシル化されている。側鎖はアルブミン結合部分である。誘導体は持続時間延長性部分を含み、この持続時間延長性部分は好ましくは脂肪二酸、及び遠位又は末端のフェニル基、チオフェン基又はフェノキシ基を有する脂肪酸から選択され、全て任意選択で置換されている。脂肪酸又は脂肪二酸のカルボキシ基は、任意選択でGLP-1ペプチドのリジン残基、好ましくはそのイプシロン-アミノ基へのリンカーを通じて、アシル化される。GLP-1ペプチドは、GLP-1(7-37)と比較して合計10個までの、例えば1つ若しくは複数の付加、1つ若しくは複数の欠失及び/又は1つ若しくは複数の置換といったアミノ酸の相違を持つGLP-1(7-37)(配列番号1)のアナログであり得る。
より詳細には、第一の態様において、本発明はGLP-1アナログの誘導体であって、前記アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、前記誘導体はそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、前記アルブミン結合部分は化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含み、前記持続時間延長性部分が化学式1である場合は前記アルブミン結合部分が化学式5
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)のリンカーをさらに含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルに関する。
それ故に、第一の態様において、本発明はGLP-1アナログの誘導体であって、前記GLP-1アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、前記誘導体はそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、前記アルブミン結合部分は化学式2、化学式3及び化学式4
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルに関する。
第二の態様において、本発明はGLP-1アナログの誘導体であって、前記GLP-1アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、前記誘導体はそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、前記アルブミン結合部分はi)化学式1
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数)の持続時間延長性部分、及びii)化学式5
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)のリンカーをさらに含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルに関する。
第三の態様において、本発明はGLP-1アナログの誘導体であって、前記GLP-1アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、前記誘導体はそれぞれK26及びK37にリンカーを通じて付着された2つの持続時間延長性部分を含み、前記持続時間延長性部分は化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含み、前記リンカーが化学式5
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)を含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルに関する。
本発明はまた、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して以下の改変(i)(8Aib、31H、34Q、37K); (ii)(des7-8、34R、37K、38E); (iii)(des7-8、34R、37K); (iv)(8Aib、9G、34R、37K); (v)(8Aib、23R、34R、37K); (vi)(31H、34Q、37K); (vii)(9Q、34R、37K); (iix)(30E、34R、37K); (ix)(34R、37K、38G); (x)(34R、36G、37K);又は(xi)(34R、37K、38E)を含むGLP-1アナログの形の中間生成物又は薬学的に許容されるそのアナログのいずれかの塩、アミド若しくはエステルに関する。
本発明はまた、化学式2c、化学式3b及び化学式4b
化学式2c: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-PG
化学式3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
化学式4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数、*-CO-PGは活性化エステル)から選択される持続時間延長性部分を含み、持続時間延長性部分の遠位の*-COOH基が、存在する場合は任意選択で非反応性エステルとして官能化されている、中間生成物又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルに関する。
そして最後に本発明はまた、とりわけ全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防における使用のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、本発明のアナログ及び誘導体の医薬的使用に関する。
以下において、ギリシャ文字はシンボル又は相当する書記名称により表され得るものであり、例えばα=アルファ、β=ベータ、ε=イプシロン、γ=ガンマ、ω=オメガなどである。またギリシャ文字のμは例としてμl=ul、μM=uMにおいて、「u」により表され得る。
化学式中のアスタリスク(*)は、i)付着点、ii)ラジカル及び/又はiii)非共有電子を示す。
GLP-1アナログ
本明細書で用いられる用語「GLP-1アナログ」又は「GLP-1のアナログ」は、ヒトグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1(7-37))の変異体であるペプチド又は化合物をいい、その配列は配列番号1として配列表に包含される。配列番号1の配列を持つペプチドはまた「野生型」GLP-1として示され得る。
配列表において、配列番号1の一番目のアミノ酸残基(ヒスチジン)は1番を割り当てられる。しかしながら以下において、当該技術分野において確立された慣行によると、このヒスチジン残基は7番と呼ばれ、続くアミノ酸残基はそれに合うように番号を付けられ、グリシンの37番で終わる。それ故、一般に、本明細書におけるGLP-1(7-37)配列のアミノ酸残基番号又は位置番号の参照はいずれも、7位のHisで始まって37位のGlyで終わる配列に対するものである。
本発明の誘導体のGLP-1アナログは、i)改変されるアミノ酸残基に相当する野生型GLP-1(7-37)におけるアミノ酸残基の番号(すなわち野生型GLP-1中の相当する位置)、及びii)実際の改変への参照により記述され得る。以下は適切なアナログ命名法の限定されない例である。
本発明の誘導体のGLP-1アナログの限定されない例は、GLP-1(7-37)の37位に相当する位置における第一のリジン残基を含むように改変されるだけのアナログである。このアナログのアミノ酸配列はその他の点で野生型GLP-1のそれと同一であり、このアナログはK37-GLP-1(7-37)で示され得る。この命名は37位のグリシンがリジンで置換された野生型GLP-1のアミノ酸配列を表す。
この本発明の誘導体のGLP-1アナログは、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のリジン残基をそのうえ含む。このアナログのアミノ酸配列はその他の点で野生型GLP-1のそれと同一であり、かかるアナログはなおK37-GLP-1(7-37)で示されるが、その理由はK26は配列番号1の野生型GLP-1(7-37)の参照により含蓄されるためである。
従って、K37-GLP-1(7-37)は自然に存在する37位のグリシンがリジンで置換されたGLP-1(7-37)アナログを示す。
用語「K37-GLP-1(7-37)のアナログ」は、GLP-1(7-37)と比較して改変K37及び少なくとも1つの付加的な改変を含むGLP-1(7-37)のアナログをいう。
本発明の誘導体の一部を形成するGLP-1アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示される。言い換えれば、このGLP-1アナログは、野生型GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較した場合にいくつかのアミノ酸残基が変化している改変GLP-1(7-37)ペプチドである。これらの変化又は改変は、1つ若しくは複数のアミノ酸置換、付加及び/又は欠失を独立して表し得る。
本発明の誘導体のアナログの別の限定されない例は[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)であり、これは8位のアラニンがα-アミノイソ酪酸(Aib)で置換され、34位のリジンがアルギニンで置換され、37位のグリシンがリジンで置換されているGLP-1(7-37)アナログを示す。このアナログはまた(8Aib,R34,K37)GLP-1(7-37)とも示され得る。
本発明の誘導体のアナログの付加的な限定されない例は「34E、34Q又は34Rを含む」アナログであるが、これは野生型GLP-1(配列番号1)の34位に相当する位置にグルタミン酸(E)、グルタミン(Q)又はアルギニン(R)のいずれかを持つGLP-1アナログをいい、配列番号1と比較してさらなる改変を含んでもよい。
本発明の誘導体のアナログのなおさらなる限定されない例は「(8Aib、31H、34Q、37K)」で簡単に示されるGLP-1(7-37)(配列番号1)のアナログである。この命名はこれら4つの置換以外は配列番号1と同一であるアナログ、すなわち8位のアラニンがα-アミノイソ酪酸(Aib)で置換され、31位のトリプトファンがヒスチジンで置換され、34位のリジンがグルタミンで置換され、37位のグリシンがリジンで置換されているアナログをいう。このアナログは配列番号1と比較してさらなる改変を含まない。
本発明の誘導体のアナログのなおさらなる限定されない例はdes7(又はDes7)を含むアナログであり、N末端アミノ酸であるヒスチジンが欠失しているGLP-1(7-37)のアナログをいう。このアナログはまたGLP-1(8-37)で示され得る。
同様に、GLP-1(7-37)のアナログに関する(des7+des8)、(des7、des8)、(des7-8)又は(Des7、Des8)は、GLP-1(7-37)の参照が含蓄され得るもので、野生型GLP-1の2つのN末端アミノ酸に相当するアミノ酸であるヒスチジン及びアラニンが欠失しているアナログをいう。このアナログはまたGLP-1(9-37)で示され得る。
本発明の誘導体のアナログのなおさらなる限定されない例はImp7及び/又は(Aib8若しくはS8)を含む、GLP-1(7-37)アナログを参照するアナログであり、このアナログは野生型GLP-1と比較した場合に7位ヒスチジンのイミダゾプロピオン酸(Imp)での置換及び/又は8位アラニンのα-アミノイソ酪酸(Aib)若しくはセリンでの置換を含む。
ある特定の指定された改変を「含む」アナログは配列番号1と比較した場合にさらなる改変を含んでもよい。Imp7及び/又は(Aib8若しくはS8)を含み、本発明の誘導体の一部を形成するアナログの限定されない2つの例は、化学式47及び化学式58のペプチド部である。
(des7+des8)、Arg34、Lys37及びGlu38を含むGLP-1(7-37)のアナログの限定されない例は、[Des7,Des8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-Glu38ペプチド及びN9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピニル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)Glu38ペプチドである。後者の化合物において、野生型GLP-1のN末端(His-Ala)のジペプチド模倣物が新しいN末端であるGlu9にアミド結合を通じて付着される。
欠失N末端アミノ酸の置換の一種として用いられ得る適切なHis又はHis-Ala模倣物は、もしあるならば、例としてピリジン又はイミダゾールといった複素環式の窒素含有芳香環構造を含む。好ましいHis又はHis-Ala模倣物はHis及びHis-Ala以外のイミダゾール又はピリジンの誘導体であり、これは1つの実施形態において遊離のカルボン酸基を有する置換基を持ち、このカルボン酸基はペプチドのN末端アミノ酸のアミノ基とアミド結合を形成することができるものである。用語イミダゾールは類似の環構造を有するが置換基が変化している複素環の一種としてのイミダゾールをいい、ピリジンについて逆もまた同様である。
上の例から明らかなように、アミノ酸残基はその正式名称、1文字表記及び/又は3文字表記により同定され得る。これらの3つの方法は完全に等価である。
表現「に対応する位置」又は「相当する位置」は、改変されたGLP-1(7-37)配列中の改変部位を野生型GLP-1(7-37)(配列番号1)の参照により特徴づけるのに用いられ得る。対応する又は相当する位置、同様に改変の数は、例として単なる筆記及び視認により容易に推論され、及び/又はNeedleman-Wunschアラインメントである「align」などの標準的なタンパク質又はペプチドアラインメントプログラムが用いられてもよい。アルゴリズムはNeedleman,S.B.及びWunsch,C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453ページに記載されており、alignプログラムはMyers及びW.Millerにより「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(computer applications in the biosciences) (1988) 4:11〜17ページに記載されている。アラインメントのため、デフォルトのスコア行列であるBLOSUM50及びデフォルトの同一性行列を用いることが可能であり、ギャップ中の第一の残基についてのペナルティを-12、又は好ましくは-10に設定し、ギャップ中の付加的な残基についてのペナルティを-2、又は好ましくは-0.5に設定することが可能である。
かかるアラインメントの例は下に挿入されるが、配列の1番は配列番号1、配列の2番はそのアナログ(des7-8、34R、37K、38E)である。
#1:GLP-1(7-37)
#2:GLP-1(7-37)_アナログ
#行列:EBLOSUM62
#ギャップ_ペナルティ:10.0
#伸長_ペナルティ:0.5
#長さ:32
#同一性:27/32(84.4%)
#類似性:28/32(87.5%)
#ギャップ:3/32(9.4%)
#スコア:138.0
1 1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG- 31
| | |||| || ||||| || | |||||| | || : || .
2 1 ----EG TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRKE 30
配列中にImp及び/又はAibなどの非天然アミノ酸が包含される場合、又はHis-Ala模倣物の場合、これらはアラインメントの目的のためにXで置き換えられてもよい。所望の場合、Xを後で手動で修正することができる。
例として、本発明の誘導体のGLP-1アナログの文脈において用いられる用語「ペプチド」は、アミド(又はペプチド)結合により相互連結された一連のアミノ酸を含む化合物をいう。
特定の実施形態において、ペプチドはかなりの程度まで、又は主に、アミド結合により相互連結されたアミノ酸から構成される(例としてモル質量で少なくとも50%、60%、70%、80%又は少なくとも90%)。別の特定の実施形態において、ペプチドはペプチド結合により相互連結されたアミノ酸からなる。
本発明のペプチドは、ペプチド結合により連結された少なくとも5個の構成アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペプチドは少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも20個、一層より好ましくは少なくとも25個、又は最も好ましくは少なくとも28個のアミノ酸を含む。
特定の実施形態において、ペプチドは少なくとも5個の構成アミノ酸から構成され、好ましくは少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、又は最も好ましくは少なくとも28個のアミノ酸から構成される。
付加的な特定の実施形態において、ペプチドは、i)29個、ii)30個、iii)31個又はiv)32個のアミノ酸からa)構成される、又はb)なる。
なおさらなる特定の実施形態において、ペプチドはペプチド結合により相互連結されたアミノ酸からなる。
アミノ酸はアミン基及びカルボン酸基、さらに任意選択で1つ又は複数の、しばしば側鎖と呼ばれる付加的な基を含有する分子である。
用語「アミノ酸」はタンパク新生のアミノ酸(天然アミノ酸及び標準的なアミノ酸を包含する遺伝暗号によりコードされるアミノ酸)、同様に非タンパク新生のアミノ酸(タンパク質中に見出されない、及び/又は標準的な遺伝暗号でコードされないアミノ酸)並びに合成アミノ酸を包含する。それ故に、アミノ酸はタンパク新生アミノ酸、非タンパク新生アミノ酸、及び/又は合成アミノ酸の群から選択され得る。
遺伝暗号によりコードされないアミノ酸の限定されない例はガンマ-カルボキシグルタミン酸、オルニチン及びホスホセリンである。合成アミノ酸の限定されない例はD-アラニン(以下において、例えば「a8」において「a」と略されることもあり、従ってD-Ala8をいう)及びD-ロイシンなどのアミノ酸のD-異性体、Aib(α-アミノイソ酪酸)、β-アラニン並びにdes-アミノ-ヒスチジン(desH、別名イミダゾプロピオン酸、略してImp)である。
以下において、光学異性体が述べられない全てのアミノ酸は、(他に指定されない限り)L-異性体を意味すると理解されるものである。
本発明のGLP-1誘導体及びアナログはGLP-1活性を持つ。この用語は、GLP-1受容体に結合してシグナル伝達経路を惹起することで当該技術分野で知られているインスリン分泌性作用又は他の生理的効果をもたらす能力をいう。例えば、本発明のアナログ及び誘導体は、本明細書の実施例50に記載のアッセイを用いてGLP-1活性を試験することができる。
GLP-1誘導体
本明細書でGLP-1ペプチド又はアナログの文脈において用いられる用語「誘導体」は、化学的に改変されたGLP-1ペプチド又はアナログを意味し、この中で1つ又は複数の置換基がペプチドに共有結合で付着されている。置換基はまた側鎖とも呼ばれ得る。
特定の実施形態において、側鎖はアルブミンと非共有結合性の凝集物を形成する能力があり、それによって血流に伴う誘導体の循環を促進するが、また誘導体の作用時間を延長する効果も持ち、これはGLP-1-誘導体とアルブミンとの凝集物は医薬品有効成分を放出するのにゆっくりとしか崩壊しないという事実に起因する。それ故に、置換基又は側鎖は全体として好ましくはアルブミン結合部分と呼ばれる。
特定の実施形態において、側鎖は少なくとも10個の炭素原子、又は少なくとも15個、20個、25個、30個、35個、又は少なくとも40個の炭素原子を持つ。さらなる特定の実施形態において、側鎖は少なくとも5個のヘテロ原子、とりわけO及びNをさらに包含してもよく、例えば少なくとも1個、2個若しくは3個のN原子及び/又は少なくとも3個、6個、9個、12個若しくは15個のO原子などの、少なくとも7個、9個、10個、12個、15個、17個又は少なくとも20個のヘテロ原子をさらに包含してもよい。
別の特定の実施形態において、アルブミン結合部分はアルブミンの結合及びそれによる持続時間延長にとりわけ関連する部分を含み、この部分は従って持続時間延長性部分と呼ばれ得る。持続時間延長性部分は、ペプチドへの付着点に対してアルブミン結合部分の反対側の端又はその近傍にあり得る。
なおさらなる特定の実施形態において、アルブミン結合部分は持続時間延長性部分とペプチドへの付着点との中間の部分を含み、この部分はリンカー、リンカー部分、スペーサー等と呼ばれ得る。リンカーは任意選択であり得るもので、故にその場合アルブミン結合部分は持続時間延長性部分と同一であってもよい。
特定の実施形態において、アルブミン結合部分及び/又は持続時間延長性部分は親油性であり、及び/又は生理的pH(7.4)において負の電荷を持つ。
アルブミン結合部分、持続時間延長性部分又はリンカーは、GLP-1ペプチドのリジン残基にアシル化により共有結合で付着され得る。さらなる又は代わりの結合化学としては、アルキル化、エステル形成若しくはアミド形成、又はマレイミド若しくは(臭化、フッ化、ヨウ化などの)ハロゲン化アセトアミドカップリングなどによるシステイン残基へのカップリングが挙げられる。
好ましい実施形態において、アルブミン結合部分の活性エステルは、好ましくは持続時間延長性部分及びリンカーを含み、リジン残基のアミノ基、好ましくはそのイプシロンアミノ基にアミド結合の形成下で共有結合で結びつけられる(このプロセスはアシル化と呼ばれる)。
他に述べられない限り、リジン残基のアシル化への参照がなされる場合、そのイプシロン-アミノ基に対するものと理解される。
K26及びK37に任意選択でリンカーを通じて付着された2つの持続時間延長性部分を含む誘導体は、それぞれGLP-1(7-37)の26位及び37位に相当する位置のリジン残基のイプシロン-アミノ基で2回アシル化、二重アシル化又は二元アシル化されている誘導体と呼ばれ得る。
本目的のために、用語「アルブミン結合部分」、「持続時間延長性部分」及び「リンカー」はこれら分子の未反応型、同様に反応型を包含し得る。どちらの型が意味されるかは、用語が用いられる文脈から明白である。
1つの態様において、各持続時間延長性部分は化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から独立して選択される持続時間延長性部分を含む、又は持続時間延長性部分からなる。
1つの実施形態において、*-(CH2)x-*は直鎖又は分枝の、好ましくは直鎖のアルキレンをいい、式中xは6〜18の範囲の整数である。
別の実施形態において、*-(CH2)y-*は直鎖又は分枝の、好ましくは直鎖のアルキレンをいい、式中yは3〜17の範囲の整数である。
第3の実施形態において、*-(CH2)z-*は直鎖又は分枝の、好ましくは直鎖のアルキレンをいい、式中zは1〜5の範囲の整数である。
なおさらなる実施形態において、*-(CH2)w-*は直鎖又は分枝の、好ましくは直鎖のアルキレンをいい、式中wは6〜18の範囲の整数である。
別の態様において、アルブミン結合部分は、脂肪二酸、及びいずれも任意選択で置換されている遠位(末端)のフェニル基又はフェノキシ基を有する脂肪酸から選択される持続時間延長性部分を含む、又は持続時間延長性部分からなる。フェニル基及び/又はフェノキシ基への任意選択の置換基は150Da以下、好ましくは125Da以下、より好ましくは100Da以下、一層より好ましくは75Da以下、又は最も好ましくは50Da以下のモル質量を持つ。置換基の例としては、カルボキシ、ヒドロキシル、メチル及びtert-ブチルなどの直鎖又は分枝のC1〜C5低級アルキル、並びにヨウ素などのハロゲンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
GLP-1ペプチドへの付着のため、脂肪酸の酸性基、又は脂肪二酸の酸性基のうちの1つは、GLP-1ペプチド中のリジン残基のイプシロンアミノ基と、好ましくはリンカーを通じてアミド結合を形成する。
用語「脂肪酸」は4個から28個までの炭素原子を持つ脂肪族モノカルボン酸をいい、好ましくは分枝しておらず、及び/又は偶数であり、飽和であっても不飽和であってもよい。
用語「脂肪二酸」は上で定義された脂肪酸であるがオメガ位において付加的なカルボン酸基を有するものをいう。それ故に、脂肪二酸はジカルボン酸である。
好ましい実施形態において、持続時間延長性部分はHOOC-(CH2)n-CO-*、HOOC-C6H4-O-(CH2)m-CO-*、及びR1-C6H4-(CH2)p-CO-*から選択され、式中nは8〜16の範囲の整数、mは7〜17の範囲の整数、pは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基である。
命名法は当該技術分野で通常のものであり、例えば上の式において*-COOH、同様にHOOC-*はカルボキシ、*-C6H4-*はフェニレン、*-CO-*、同様に*-OC-*はカルボニル(O=C<**)、C6H5-O-*はフェノキシ、C4H4S又はC4SH4はチオフェン、*-C4SH2-*はそのジラジカル(任意のチオフェニレン)をいう。特定の実施形態において、フェノキシラジカル及びフェニレンラジカルなどの芳香族化合物は独立してオルト、メタ又はパラであってもよい。別の実施形態において、チオフェニレンジラジカルは2,3-、2,4-、又は2,5-であってもよい。
化学物質(R1基など)のモル質量(M)はその物質1モルの質量である。モル質量はダルトンで、シンボルはDaで引用され、定義は1Da=1g/molである。
モル質量は標準的な原子量から計算可能であり、しばしば化学カタログに収載される。化合物のモル質量は、化合物を形成する原子の標準的な原子量を1g/molと等しいモル質量定数Muで乗算したものの合計により与えられる。例として、tert-ブチル(C4H9)の分子量はM(C4H9)=([4×12.01]+[9×1.008])×1g/mol=57Daである。
標準的な原子量はInternational Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)により公開されていて、また幅広い種々の教科書、市販カタログ、掛図等において転載もされている。
上で説明されるように、本発明のGLP-1誘導体は二重アシル化されている、すなわち2つのアルブミン結合部分がGLP-1ペプチドに共有結合で付着されている。付着点はGLP-1(7-37)の26位に相当する位置の野生型リジン残基、及びGLP-1(7-37)の37位に相当する位置の野生型グリシン残基が置換されたリジン残基である。
特定の実施形態において、2つのアルブミン結合部分(すなわち全側鎖)は類似しており、好ましくは実質的に同一、又は最も好ましくは同一である。
別の特定の実施形態において、2つの持続時間延長性部分は類似しており、好ましくは実質的に同一、又は最も好ましくは同一である。
なおさらなる特定の実施形態において、2つのリンカーは類似しており、好ましくは実質的に同一、又は最も好ましくは同一である。
用語「実質的に同一である」は、1つ若しくは複数の塩、エステル及び/若しくはアミドの形成;好ましくは1つ若しくは複数の塩、メチルエステル及び単純アミドの形成;より好ましくは2つ以下の塩、メチルエステル及び/若しくは単純アミドの形成;一層より好ましくは1つ以下の塩、メチルエステル及び/若しくは単純アミドの形成;又は最も好ましくは1つ以下の塩の形成に起因する同一性からの差を包含する。
アルブミン結合部分、持続時間延長性部分及びリンカーなどの化合物の文脈において、類似性及び/又は同一性は、当該技術分野で知られている任意の適切なコンピュータープログラム及び/又はアルゴリズムを用いて決定され得る。
例えば、2つの持続時間延長性部分、2つのリンカー及び/又は2つの全側鎖の類似性は分子フィンガープリントを用いて適切に決定され得る。フィンガープリントは化学構造を表す数学的方法である(例としてChemoinformatics:A textbook、Johann Gasteiger及びThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003を参照)。
適切なフィンガープリントの例としてはUNITYフィンガープリント、MDLフィンガープリント、及び/又はECFP_6フィンガープリントなどのECFPフィンガープリント(ECFPは拡張連結性フィンガープリント(extended-connectivity fingerprint)の略語である)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態において、2つの持続時間延長性部分、2つのリンカー及び/又は2つの全側鎖は、a)ECFP_6フィンガープリント、b)UNITYフィンガープリント、及び/又はc)MDLフィンガープリントとして表される。
Tanimoto係数は、a)、b)又はc)のいずれが用いられても2つのフィンガープリントの類似性を計算するのに好ましく用いられる。
特定の実施形態において、a)、b)又はc)のいずれが用いられても、2つの持続時間延長性部分、2つのリンカー及び/又は2つの全側鎖は、それぞれ少なくとも0.5(50%)、好ましくは少なくとも0.6(60%)、より好ましくは少なくとも0.7(70%)若しくは少なくとも0.8(80%)、一層より好ましくは少なくとも0.9(90%)、又は最も好ましくは1.0(100%)の類似性などの少なくとも0.99(99%)の類似性を持つ。
UNITYフィンガープリントはプログラムSYBYL(Tripos、1699 South Hanley Road、St.Louis、MO63144-2319 USAから入手可能)を用いて計算可能である。ECFP_6及びMDLフィンガープリントはプログラムPipeline Pilot(Accelrys Inc.、10188 Telesis Court、Suite 100、San Diego、CA92121、USAから入手可能)を用いて計算可能である。
より詳細については、例えばJ.Chem.Inf.Model.2008、48、542〜549ページ;J.Chem.Inf.Comput.Sci.2004、44、170〜178ページ;J.Med.Chem.2004、47、2743〜2749ページ;J.Chem.Inf.Model.2010、50、742〜754ページ;同様にSciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide、March 2008、SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection、2008-いずれもAccelrys Software Inc.、San Diego、USから入手可能、並びに手引きhttp://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf、及びhttp://vvvvvv.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdfを参照されたい。
類似性計算の例は下に挿入されるが、ここで化学式23の全側鎖はそのメチルエステル、すなわちグルタミンリンカー部分のモノメチルエステル(化学式23a)と比較された。
化学式23a:
a)ECFP_6フィンガープリントを用いると類似性は0.798、b)UNITYフィンガープリントを用いると類似性は0.957、MDLフィンガープリントを用いると類似性は0.905である。
2つの側鎖(アルブミン結合部分)が同一の場合、誘導体は対称的に示され得る。
特定の実施形態において、類似性係数は少なくとも0.80、好ましくは少なくとも0.85、より好ましくは少なくとも0.90、一層より好ましくは少なくとも0.95、又は最も好ましくは少なくとも0.99である。
本発明の誘導体の2つのリンカーの各々は以下の第一のリンカー構成成分(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)を含み得る。
化学式5:
特定の実施形態において、k=1及びn=1の場合、このリンカー構成成分はOEG若しくは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカルで示されてもよく、及び/又は以下の式により表されてもよい。
化学式5a:
*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*
別の特定の実施形態において、本発明の誘導体の各リンカーは独立して第二のリンカー構成成分、好ましくは化学式6及び/又は化学式7などのGluジラジカルをさらに含み得るが、ここでGluジラジカルはp回包含されることが可能であり、pは1〜3の範囲の整数である。
化学式6:
化学式7:
化学式6はまたガンマ-Glu、又は短縮してgGluとも呼ばれ得るが、これは別のリンカー構成成分又はリジンのイプシロン-アミノ基への連結のためにここで用いられるのがアミノ酸であるグルタミン酸のガンマカルボキシ基であるという事実に起因する。上で説明されるように、他のリンカー構成成分は例えば別のGlu残基又はOEG分子であり得る。Gluのアミノ基は今度は持続時間延長性部分のカルボキシ基、又は存在する場合は例としてOEG分子のカルボキシ基、又は存在する場合は例として別のGluのガンマ-カルボキシ基とアミド結合を形成する。
化学式7はまたアルファ-Glu、又は短縮してaGlu、又は単にGluとも呼ばれ得るが、これは別のリンカー構成成分又はリジンのイプシロン-アミノ基への連結のためにここで用いられるのがアミノ酸であるグルタミン酸のアルファカルボキシ基であるという事実に起因する。
上の化学式6及び化学式7の構造はGluのL型、同様にD型に及ぶ。特定の実施形態において、化学式6及び/又は化学式7は独立して、a)L型、又はb)D型である。
別の特定の実施形態において、本発明の誘導体の各リンカーは独立して以下の第三のリンカー構成成分をさらに含み得るが、ここでqは2〜12の範囲の整数であり、R2は水素(H)又はアミノ(NH2)である。
化学式8:
*-NH-(CH2)q-CHR2-CO-*
化学式8において、*-(CH2)q-*基は直鎖又は分枝の、好ましくは直鎖のアルキレンを表すことが可能で、qは2〜12の範囲の整数である。
なおさらなる特定の実施形態において、リンカーは、a)5個から41個までのC原子、及び/又はb)4個から28個までのヘテロ原子を持つ。特定の限定されないヘテロ原子の例はN原子及びO原子である。H原子はヘテロ原子ではない。
或いは、リンカー部分は存在する場合、5個から30個までのC原子、好ましくは5個から25個までのC原子、より好ましくは5個から20個までのC原子、又は最も好ましくは5個から17個までのC原子を持つ。付加的な好ましい実施形態において、リンカー部分は存在する場合、4個から20個までのヘテロ原子、好ましくは4個から18個までのヘテロ原子、より好ましくは4個から14個までのヘテロ原子、又は最も好ましくは4個から12個までのヘテロ原子を持つ。
或いは、リンカーは少なくとも1つのOEG分子及び/又は少なくとも1つのグルタミン酸残基、厳密にいえば相当するラジカルを含む。
特定の実施形態において、各リンカーは化学式6が1回、化学式5が2回、指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結されたものからなり、リンカーはその遊離アミノ末端において持続時間延長性部分の遊離カルボニル基に連結され、その遊離カルボニル末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結される。
別の特定の実施形態において、各リンカーは化学式5が2回、化学式6が1回、指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結されたものからなり、リンカーはその遊離アミノ末端において持続時間延長性部分の遊離カルボニル基に連結され、その遊離カルボニル末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結される。
本発明の誘導体は、同じ分子式及び結合原子の配列を持つがそれら原子の空間における3次元配向のみにおいて相違する、異なる立体異性型で存在し得る。例示された本発明の誘導体の立体異性は、実施例の節において、名称、同様に構造が標準的な命名法を用いて指し示される。他に述べられない限り、本発明は特許請求の範囲に記載される誘導体の全ての立体異性型に関する。
本発明のGLP-1誘導体の血漿中の濃度は任意の適切な方法を用いて決定され得る。例えばLC-MS(液体クロマトグラフィー質量分析)が用いられてもよく、又はRIA(ラジオイムノアッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)及びLOCI(蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ)などのイムノアッセイが用いられてもよい。適切なRIA及びELISAアッセイのための一般的なプロトコールは、例えばWO09/030738の116〜118ページに見出される。好ましいアッセイは本明細書の実施例52、55及び58に記載されるLOCIアッセイである。
薬学的に許容される塩、アミド又はエステル
本発明の誘導体、アナログ及び中間生成物は、薬学的に許容される塩、アミド又はエステルの形であり得る。
塩は例として塩基と酸との間の化学反応、例としてNH3+H2SO4→(NH4)2SO4により形成される。
塩は塩基性塩、酸性塩であってもよく、又はどちらでもないもの(すなわち中性塩)であってもよい。塩基性塩は水中で水酸化物イオンを生み出し、酸性塩はヒドロニウムイオンを生み出す。
本発明の誘導体の塩は、それぞれアニオン基又はカチオン基と反応する追加されたカチオン又はアニオンを伴って形成され得る。これらの基はペプチド部分の中に、及び/又は本発明の誘導体の側鎖の中に置かれ得る。
本発明の誘導体のアニオン基の限定されない例としては、側鎖中の遊離カルボキシル基、もしあるならば同様にペプチド部分中の遊離カルボキシル基が挙げられる。ペプチド部分はしばしばC末端において遊離のカルボン酸基を包含し、また内部のAsp及びGluなどの酸性アミノ酸残基において遊離のカルボキシル基をも包含し得る。
ペプチド部分中のカチオン基の限定されない例としては、N末端における遊離のアミノ基、存在する場合は同様に内部のHis、Arg及びLysなどの塩基性アミノ酸残基の任意の遊離アミノ基が挙げられる。
本発明の誘導体のエステルは例として遊離カルボン酸基とアルコール又はフェノールとの反応により形成され得るもので、少なくとも1つのヒドロキシル基のアルコキシ基又はアリールオキシ基による置換につながる。
エステル形成はペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、及び/又は側鎖中の任意の遊離カルボキシル基と関係し得る。
本発明の誘導体のアミドは、例として遊離カルボン酸基とアミン若しくは置換アミンとの反応により、又は遊離若しくは置換アミノ基とカルボン酸との反応により形成され得る。
アミド形成はペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、側鎖中の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのN末端における遊離アミノ基、並びに/又はペプチド中及び/若しくは側鎖中のペプチドの任意の遊離若しくは置換アミノ基と関係し得る。
特定の実施形態において、ペプチド又は誘導体は薬学的に許容される塩の形である。別の特定の実施形態において、誘導体は薬学的に許容されるアミドの形であり、好ましくはペプチドのC末端においてアミド基を有する。なおさらなる特定の実施形態において、ペプチド又は誘導体は薬学的に許容されるエステルの形である。
中間生成物
本発明の中間生成物の1つのタイプは、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して以下の改変(i)(8Aib、31H、34Q、37K); (ii)(des7-8、34R、37K、38E); (iii)(des7-8、34R、37K); (iv)(8Aib、9G、34R、37K); (v)(8Aib、23R、34R、37K); (vi)(31H、34Q、37K); (vii)(9Q、34R、37K); (iix)(30E、34R、37K); (ix)(34R、37K、38G); (x)(34R、36G、37K); 又は(xi)(34R、37K、38E)を含むGLP-1アナログ、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルの形を取る。
本発明の中間生成物の別のタイプは、化学式2c、化学式3b及び化学式4b
化学式2c: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-PG
化学式3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
化学式4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数、PGが保護基の場合、好ましくは*-CO-PGは活性化エステル)から選択される持続時間延長性部分を含み、持続時間延長性部分の他の(遠位の)*-COOH基が存在する場合、任意選択で好ましくは当該技術分野で知られているようにまた保護されている、例えば非反応性エステルとして官能化されている、アルブミン結合部分又は側鎖の中間体、若しくは薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルの形を取る。
特定の実施形態において、側鎖中間体は
a)化学式2、化学式3及び化学式4
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分、並びに
b)化学式5b、化学式6及び化学式7
化学式5b:
化学式6a:
及び/又は化学式7a:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数、PGは保護基)から選択される1つ若しくは複数のリンカーを含み、ここで持続時間延長性部分の*-COOH基は任意選択で好ましくは当該技術分野で知られているようにまた保護されている、好ましくは非反応性エステルとして官能化されている、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである。
特定の実施形態において、PGは持続時間延長性部分などの化合物を可逆的に反応性でないものとする基、及び選択的に除去可能な基である。
PG基の限定されない例は-OH、又は活性化エステルとして官能化されている基、例えばOPfp、OPnp及びOSucであるが、これらに限定されるものではない。
他の適切な活性化エステルは例としてM.Bodanszky、「Principles of Peptide Synthesis」、第2版、Springer Verlag、1993の教示に従って選択され得る。
機能的性質
第一の機能的態様において、本発明の誘導体は良好な効力を持つ。さらに又は或いは第二の機能的態様において、本発明の誘導体は持続時間が延長された薬物動態学的プロファイルを持つ。さらに又は或いは第三の機能的態様において、本発明の誘導体は胃腸の酵素による分解に対して安定である。さらに又は或いは第四の機能的態様において、本発明の誘導体は経口での高い生物学的利用能を持つ。
生物学的活性(効力)
第一の機能的態様によると、本発明の誘導体、同様に構成GLP-1ペプチドそれ自体(K37-GLP-1(7-37)又はそのアナログなど)は生物学的に活性がある、又は効力がある。
特定の実施形態において、効力及び/又は活性はインビトロでの効力、すなわち機能的GLP-1受容体アッセイにおける性能をいい、より詳細にはクローニングされたヒトGLP-1受容体を発現する細胞株においてcAMP形成を刺激する能力をいう。
ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMP形成の刺激は、好ましくはBHK467-12A(tk-ts13)などの安定的に形質導入された細胞株を用いて、及び/又はcAMPの決定のために機能受容体アッセイを用いて決定され得るが、このアッセイは例として内因的に形成されたcAMPと外因的に追加されたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づくもので、このアッセイにおいてcAMPはより好ましくは特異的な抗体を用いて捕捉され、及び/又は一層より好ましくはアッセイはAlphaScreen cAMP Assayであり、最も好ましくは実施例50に記載されるアッセイである。
最大半量効果濃度(EC50)という用語は一般にベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する濃度をいい、用量応答曲線への参照によるものである。EC50は化合物の効力測定値として用いられ、最大の効果が認められる50%の濃度を表す。
本発明の誘導体のインビトロでの効力は上記のように決定可能で、当該誘導体のEC50が決定される。EC50が低いほど、効力は良い。
特定の実施形態において、培地は50mM TRIS-HCl、5mM HEPES、10mM MgCl2,6H2O、150mM NaCl、0.01% Tween、0.1% BSA、0.5mM IBMX、1mM ATP、1uM GTP、pH7.4の組成(アッセイ中の終濃度)を持つ。
代替的な培地は50mM Tris-HCl、1mM EGTA、1.5mM MgSO4、1.7mM ATP、20mM GTP、2mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、0.01% Tween-20、pH7.4である。
さらなる特定の実施形態において、本発明の誘導体は3000pM以下の、より好ましくは2000pMより低い、一層より好ましくは1000pMより低い、又は最も好ましくは500pMより低いEC50を持つ。
別の特定の実施形態において、本発明の誘導体はインビボで効力があり、これは当該技術分野で知られているように適切な動物モデルにおいて、同様に臨床試験において決定され得る。
糖尿病のdb/dbマウスは適切な動物モデルの1つの例であり、血糖低下効果はかかるマウスにおいてインビボで、例として実施例53に記載されるように、又はWO09/030738の実施例43に記載されるように決定され得る。
さらに又は或いは、インビボでのグルコース仲介性インスリン分泌に対する効果は、ミニブタにおける薬力学的研究(IVGTT)において、例として実施例55に記載されるように決定され得る。
さらに又は或いは、インビボでの飼料摂取に対する効果は、ブタにおける薬力学的研究において、例として実施例56に記載されるように決定され得る。
持続時間延長-受容体結合/低及び高アルブミン
第二の機能的態様によると、本発明の誘導体は持続時間が延長されている。
本発明の誘導体の低濃度及び高濃度それぞれのアルブミン存在下でのGLP-1受容体に結合する能力は、実施例51に記載されるように決定され得る。
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC50値に対応して、可能な限り良好であるはずである。
高アルブミン濃度でのIC50値は、誘導体のGLP-1受容体への結合に対するアルブミンの影響の測定値である。知られているように、GLP-1誘導体もまたアルブミンに結合する。これは一般に望ましい効果であり、血漿における存続時間を延ばす。それ故、高アルブミンでのIC50値は低アルブミンでのIC50値よりも一般に高く、これはGLP-1受容体への結合低減に対応して、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミンの結合により引き起こされるものである。
高比率(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))はそれ故、当該誘導体がアルブミンに良好に結合し(長い半減期を持つであろう)、それ自体もまたGLP-1受容体に良好に結合する(IC50値(高アルブミン)が高く、IC50値(低アルブミン)が低い)ことの指標として受け取られ得る。他方、アルブミンの結合は常に望ましいものでないだろうし、又はアルブミンへの結合が強すぎになることもあるであろう。それ故、IC50(低アルブミン)、IC50(高アルブミン)/、及び高/低の比率についての望ましい範囲は、意図される使用及びかかる使用を取り囲む環境、並びに潜在的に興味深い他の化合物性質に依存して、化合物ごとに変わり得る。
特定の実施形態において、0.005% HSA(低アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)は1000.00nMより低く、好ましくは600.00nMより低く、より好ましくは100.00nMより低く、又は最も好ましくは50.00nMより低い。
高及び低アルブミン濃度での受容体結合を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例51に開示される。
持続時間延長-ラットにおけるインビボの半減期
第二の機能的態様によると、本発明の誘導体は持続時間が延長されている。特定の実施形態において、持続時間延長は静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)として決定され得る。付加的な実施形態において、半減期は少なくとも4時間、好ましくは少なくとも6時間、一層より好ましくは少なくとも8時間、又は最も好ましくは少なくとも10時間である。
静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例58に開示される。
持続時間延長-ミニブタにおけるインビボの半減期
第二の機能的態様によると、本発明の誘導体は持続時間が延長されている。特定の実施形態において、持続時間延長は静脈内投与後のミニブタにおけるインビボの半減期(T1/2)として決定され得る。付加的な実施形態において、半減期は少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも36時間、一層より好ましくは少なくとも48時間、又は最も好ましくは少なくとも60時間である。
静脈内投与後のミニブタにおけるインビボの半減期を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例54に開示される。
胃腸の酵素による分解
第三の機能的態様によると、本発明の誘導体は1つ又は複数の胃腸の酵素による分解に対して安定である、又は安定化されている。
胃腸の酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びカルボキシペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。安定性は、精製された酵素の形の、又は胃腸系からの抽出物の形のこれら胃腸の酵素に対して試験され得る。
特定の実施形態において、本発明の誘導体は、相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)が少なくとも1、好ましくは1.0より高い、より好ましくは少なくとも1.2、なおより好ましくは少なくとも2.0、一層より好ましくは少なくとも3.0、又は最も好ましくは少なくとも4.0である。言い換えれば、比率(SI)は、すなわち相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物の中での当該誘導体のインビトロの半減期(T1/2)として、各誘導体について規定され得る。
ラット小腸の抽出物の中でのインビトロの半減期を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例57に開示される。
経口での生物学的利用能
第四の機能的態様によると、本発明の誘導体は経口での高い生物学的利用能を持つ。
市販のGLP-1誘導体の経口での生物学的利用能は非常に低い。静脈内投与又は皮下投与用に開発中であるGLP-1誘導体の経口での生物学的利用能もまた低い。
従って、GLP-1誘導体の技術分野において、経口での生物学的利用能改善についての需要がある。かかる誘導体は効力が一般に満足なものである限り、及び/又はその半減期がまた一般に満足なものである限り、経口投与のための適切な候補であることができる。
本発明者は新規の種類のGLP-1誘導体を同定したが、これらは驚くべきことに経口での高い生物学的利用能と、同時に満足な効力及び/又は半減期を持つ。
さらに又は或いは、これらの誘導体は驚くべきことに経口での高い生物学的利用能と、同時に低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への高い結合アフィニティー(すなわち低いIC50値)を持つ。
これらの特徴は経口での低い医薬品有効成分1日量を獲得する目的で重要であり、例として生産の経済性、潜在的な安全性問題の可能性、同様に投与の快適性の問題及び環境への懸念を包含する様々な理由のために望ましい。
一般に、生物学的利用能という用語は、変化せずに体循環に達する本発明の誘導体などの医薬品有効成分(API)の投与量の画分をいう。定義によると、APIが静脈内に投与される場合、その生物学的利用能は100%である。一方、他の経路(経口など)を通じて投与される場合、その生物学的利用能は減少する(不完全な吸収及び初回通過代謝に起因する)。生物学的利用能に関する知識は非静脈内投与経路のための用量を計算する場合に必須である。
経口での絶対的生物学的利用能は、経口投与後の体循環中のAPIの生物学的利用能(曲線下面積すなわちAUCとして推定される)を、静脈内投与後の同じAPIの生物学的利用能と比較する。これは相当する同じAPIの静脈内投与と比較される、非静脈内投与を通じて吸収されるAPIの画分である。比較は異なる用量が用いられるならば正規化された用量でなければならず、その結果として、各AUCは相当する投与量で除算されることで補正される。
時間に対する血漿API濃度のプロットは経口投与及び静脈内投与の両方の後に作られる。絶対的生物学的利用能(F)は用量補正されたAUC-静脈内で除算されたAUC-経口である。
本発明の誘導体は、a)リラグルチド及び/又はb)セマグルチドより、好ましくは少なくとも10%高い、より好ましくは少なくとも20%高い、一層より好ましくは少なくとも30%高い、又は最も好ましくは少なくとも40%高い、経口での絶対的生物学的利用能を持つ。経口での生物学的利用能を試験する前に、本発明の誘導体は、インスリン分泌性化合物の経口製剤の技術分野で知られているように、例としてWO2008/145728に記載される製剤の任意の1つ又は複数を用いて適切に処方され得る。
実施例52に記載される試験が開発され、これは経口での生物学的利用能の非常に良好な予測であることが見出された。この試験によると、GLP-1誘導体のラット腸管腔内への直接注射の後、血漿中のGLP-1誘導体の濃度(曝露)が決定され、投薬溶液の濃度(umol/l)で除算された血漿濃度(pmol/l)の比率がt=30分について計算される。この比率は腸の生物学的利用能の測定値であり、実際の経口での生物学的利用能のデータと正確に相関することが示された。
本発明の誘導体の付加的な特定の実施形態は、実施例の節の前の「特定の実施形態」及び「付加的な特定の実施形態」という見出しのある節に記載される。
生産プロセス
GLP-1(7-37)及びGLP-1アナログのようなペプチドの生産は当該技術分野で周知である。
K37-GLP-1(7-37)若しくはアナログ又はそれらの断片などの本発明の誘導体(又はその断片)のGLP-1部分は、例えば古典的なペプチド合成、例としてt-Boc若しくはFmoc化学又は他の良好に確立された技術を用いた固相ペプチド合成により生産され得るものであり、例としてGreene及びWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999やFlorencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000、及び「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W.C.Chan及びP.D.White編、Oxford University Press、2000を参照されたい。
さらに又は或いは、本発明の誘導体(又はその断片)のGLP-1部分は組換え法により、すなわちアナログをコードするDNA配列を含有し、適切な栄養培地中でペプチドの発現を可能にする条件下でペプチドを発現する能力を持つ宿主細胞を培養することにより、生産され得る。これらペプチドの発現に適した宿主細胞の限定されない例は、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、同様に哺乳類のBHK又はCHO細胞株である。
非天然アミノ酸及び/又は共有結合で付着されたN末端モノペプチド若しくはジペプチドの模倣物を包含する本発明の誘導体は、例として実施例部に記載されるように生産され得る。又は例としてHodgsonら、「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、vol.33、no.7(2004)、422〜430ページ及び「Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues」と題するWO2009/083549A1を参照されたい。
本発明の誘導体のいくつかを調製する方法の特定の例は実施例部に包含される。
医薬組成物
本発明の誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル及び薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で知られているように調製され得る。
用語「添加剤」は、広くは治療有効成分以外の任意の成分をいう。添加剤は不活性な物質、不活発な物質であり、及び/又は医薬活性物質でないものであり得る。
添加剤は、例として担体、ビヒクル、賦形剤、錠剤助剤として、並びに/又は投与及び/若しくは活性物質の吸収を改善するためといった様々な目的に役立つことが可能である。
様々な添加剤を伴う医薬品有効成分の製剤は当該技術分野で知られており、例として「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(例として第19版(1995)、及びその後の任意の版)を参照されたい。
添加剤の限定されない例は、溶媒、賦形剤、緩衝剤、保存剤、張性調節剤、キレート剤及び安定化剤である。
製剤の例としては液体製剤、すなわち水を含む水性製剤が挙げられる。液体製剤は溶液剤又は懸濁剤であり得る。水性製剤は典型的に少なくとも50% w/wの水、又は少なくとも60%、70%、80%、又は少なくとも90% w/wの水を含む。
或いは、医薬組成物は固体製剤、例として凍結乾燥又はスプレードライされた組成物であってもよく、そのまま用いられてもよいし、又は内科医若しくは患者が使用の前にこの組成物に溶媒及び/又は賦形剤を添加する。
水性製剤のpHは、pH3からpH10の間のいずれであってもよく、例えばおよそ7.0からおよそ9.5まで、又はおよそ3.0からおよそ7.0までである。
医薬組成物は緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤は例として、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸並びにこれらの混合物からなる群より選択され得る。医薬組成物は保存剤を含んでもよい。保存剤は例として、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール)並びにこれらの混合物からなる群より選択され得る。保存剤は0.1mg/mlから20mg/mlまでの濃度で存在し得る。医薬組成物は等張化剤を含んでもよい。等張化剤は例として、塩(例として塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例としてグリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例としてグリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例としてPEG400)及びこれらの混合物からなる群より選択され得る。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、乳糖、ショ糖、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータHPCD、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びカルボキシメチルセルロース-Naを包含する単糖、二糖若しくは多糖又は水可溶性グルカンなどの任意の糖が用いられ得る。糖アルコールは少なくとも1つの-OH基を持つC4〜C8炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール
、ダルシトール、キシリトール及びアラビトールを包含する。1つの実施形態において、糖アルコール添加物はマンニトールである。医薬組成物はキレート剤を含んでもよい。キレート剤は例として、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸及びアスパラギン酸の塩並びにこれらの混合物から選択され得る。医薬組成物は安定化剤を含んでもよい。安定化剤は例として、1つ若しくは複数の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤及び/又は1つ若しくは複数のプロテアーゼ阻害剤であり得る。これら様々な種類の安定化剤の限定されない例は以下に開示される。
用語「凝集物形成」は、オリゴマーの形成をもたらすポリペプチド分子の間の物理的な相互作用をいい、可溶性のままであっても、又は溶液から沈殿する目に見える大きな凝集物であってもよい。液体医薬組成物保存中のポリペプチドによる凝集物形成はそのポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼすことがあり、医薬組成物の治療的有効性の喪失をもたらす。そのうえ、凝集物形成は、ポリペプチドを含有する医薬組成物が注入系を用いて投与される場合に管、膜又はポンプの閉塞などの他の問題を引き起こし得る。
医薬組成物は、組成物保存中のポリペプチドの凝集物形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含んでもよい。用語「アミノ酸塩基」は、1つ又は複数のアミノ酸(メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンなど)又はそのアナログをいう。任意のアミノ酸が遊離の塩基の形、又は塩の形のいずれかで存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体(すなわちL、D又はそれらの混合物)が存在してもよい。
メチオニン(若しくは他の含硫アミノ酸又はアミノ酸アナログ)は、治療薬として働くポリペプチドがメチオニンスルホキシドへの酸化を受けやすいメチオニン残基を少なくとも1つ含むポリペプチドである場合、メチオニン残基のかかる酸化を阻害するために添加されてもよい。任意のメチオニン立体異性体(L若しくはD)又はそれらの組み合わせを使用できる。
医薬組成物は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定化剤を含んでもよい。安定化剤は例として、ポリエチレングリコール(例としてPEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの派生物(例としてHPC、HPC-SL、HPC-L及びHPMC)、シクロデキストリン、モノチオグリセロールやチオグリコール酸及び2-メチルチオエタノールのような含硫物質並びに異なる塩(例として塩化ナトリウム)から選択され得る。医薬組成物は、メチオニン酸化に対してポリペプチドを保護するメチオニン及びEDTA、並びに凍結融解又は機械的剪断に関連した凝集に対してポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤などの付加的な安定化剤を含み得るが、これらに限定されるものではない。
医薬組成物は、1つ又は複数の界面活性剤、好ましくは界面活性剤、少なくとも1つの界面活性剤又は2つの異なる界面活性剤を含んでもよい。用語「界面活性剤」は、水溶性(親水性)部及び脂溶性(親油性)部から構成される任意の分子又はイオンをいう。界面活性剤は例として、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び/又は両イオン性界面活性剤からなる群より選択され得る。
医薬組成物は、例としてEDTA(エチレンジアミン四酢酸)及び/又はベンズアミジンHClなどのプロテアーゼ阻害剤を1つ又は複数含んでもよい。
医薬組成物の付加的な、任意選択の成分としては、例として湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例としてヒト血清アルブミン、ゼラチン)並びに/又は両性イオン(例としてベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンなどのアミノ酸)が挙げられる。
なおさらに、医薬組成物はインスリン分泌性化合物の経口製剤の技術分野で知られているように、例としてWO2008/145728に記載される製剤の任意の1つ又は複数を用いて、処方され得る。
投与量は0.01mg〜100mgの誘導体、又は0.01〜50mg、又は0.01〜20mg、又は0.01〜10mgの誘導体を含有し得る。
誘導体は医薬組成物の形で投与され得る。誘導体はその必要がある患者に数ヶ所の部位において、例えば皮膚又は粘膜部位などの局所部位において;動脈内、静脈内又は心臓内などの吸収を迂回する部位において;及び皮内、皮下、筋肉内又は腹腔内などの吸収に関与する部位において投与され得る。
投与の経路は、例えば舌;舌下;頬側;口内;経口;胃内;腸内;鼻;細気管支を通じて、肺胞を通じて若しくはそれらの組み合わせなどの肺;非経口、表皮;真皮;経皮;結膜;尿管;膣;直腸;及び/又は眼球であり得る。組成物は経口組成物であってもよく、投与の経路は経口である。
組成物は数種の剤形で、例えば溶液剤;懸濁剤;乳剤;微細乳剤;多層乳剤;フォーム剤;塗剤;ペースト剤;貼付剤;軟膏剤;錠剤;コーティング錠;チューインガム;すすぎ剤;ハード若しくはソフトのゼラチンカプセル剤などのカプセル剤;坐剤;直腸カプセル剤;ドロップ剤;ゲル剤;スプレー剤;粉末剤;エアゾール剤;吸入剤;点眼剤;眼軟膏剤;眼すすぎ剤;膣ペッサリー;膣リング;膣軟膏剤;注射液剤;原位置ゲル化、硬化、沈殿及び原位置結晶化などの原位置変換液剤;輸液剤;又はインプラント剤として投与され得る。組成物は錠剤、任意選択でコーティング錠、カプセル剤又はチューインガムであってもよい。
組成物はさらに、例として安定性、生物学的利用能及び/又は溶解性を改善するため、薬物担体又はドラッグデリバリーシステム中に調合され得る。特定の実施形態において、組成物は共有結合性、疎水性、及び/又は静電気的な相互作用を通じてかかるシステムに付着され得る。かかる調合の目的は例として副作用を減少させること、時間治療を達成すること、及び/又は患者コンプライアンスを増加させることであり得る。
組成物はまた、制御された、持続性の、持続時間延長の、遅延の、及び/又は徐放のドラッグデリバリーシステムの製剤においても用いられ得る。
非経口投与は皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射により、シリンジ、任意選択でペン様シリンジを使って、又は輸液ポンプを使って行われ得る。
組成物は溶液剤、懸濁剤又は粉末剤の形で経鼻的に投与されてもよく、液体又は粉末のスプレー剤の形で経肺的に投与されてもよい。
経皮的投与、例として無針注射による、イオントフォレーシスパッチなどのパッチからの、又は経粘膜の経路、例として頬側を通じた投与は、なおさらなる選択肢である。
組成物は安定化製剤であってもよい。用語「安定化製剤」は、上昇した物理的な及び/又は化学的な安定性、好ましくは両者を有する製剤をいう。一般的に、製剤は(推奨される使用及び保存条件に従った)使用及び保存の間、使用期限に達するまで安定でなければならない。
用語「物理的安定性」は、熱機械的ストレスへの曝露並びに/又は不安定な界面及び表面(疎水性表面など)との相互作用の結果として生物学的に不活性な及び/又は不溶性の凝集物を形成するポリペプチドの傾向をいう。水性ポリペプチド製剤の物理的安定性は目視検査を使って、及び/又は異なる温度における様々な時間間隔での機械的/物理的ストレス(例として撹拌)への曝露後の濁度測定により評価され得る。或いは、物理的安定性は、例としてチオフラビンT又は「疎水性パッチ」プローブなどのポリペプチドの立体構造状態の分光剤又は分光プローブを用いて評価され得る。
用語「化学的安定性」は、インタクトなポリペプチドと比較して低減された生物学的効力及び/又は上昇した免疫原性作用を潜在的に持つ化学的分解産物の形成につながる、ポリペプチド構造中の化学的(とりわけ共有結合性の)変化をいう。化学的安定性は、異なる環境条件への曝露後の様々な時点における化学的分解産物の量を、例としてSEC-HPLC及び/又はRP-HPLCにより測定することにより評価できる。
本発明による誘導体を使用した治療はまた1つ又は複数の付加的な薬理活性物質と組み合わされてもよく、薬理活性物質は例として抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲調節剤、降圧剤、糖尿病から生じる又は糖尿病に関連した合併症の治療及び/又は予防のための剤、並びに肥満から生じる又は肥満に関連した合併症及び障害の治療及び/又は予防のための剤から選択される。これら薬理活性物質の例は:インスリン、スルホニルウレア、ビグアナイド、メグリチニド、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害剤、糖新生及び/又はグリコーゲン分解の刺激に関与する肝酵素の阻害剤、グルコース取り込みモジュレーター、HMG CoA阻害剤(スタチン)のような抗高脂血症剤などの脂質代謝を改変する化合物、胃抑制ポリペプチド(GIPアナログ)、食事摂取量を低下させる化合物、RXRアゴニスト及びβ細胞のATP依存性カリウムチャネルに対して働く剤;コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン、ナテグリニド、レパグリニド;アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロール及びメトプロロールなどのβ遮断薬、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル、キナプリル及びラミプリルなどのACE(アンジオテンシン変換酵素)阻害剤、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼム及びベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬、並びにドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシン及びテラゾシンなどのα遮断薬;CART(コカインアンフェタミン調節転写産物)アゴニスト、NPY(神経ペプチドY)アンタゴニスト、PYYアゴニスト、Y2受容体アゴニスト、Y4受容体アゴニスト、混合性Y2/Y4受容体アゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(副腎皮質刺激ホルモン放出因子)アゴニスト、CRF BP(副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3アゴニスト、オキシントモジュリン及びアナログ、MSH(メラニン細胞刺激
ホルモン)アゴニスト、MCH(メラニン細胞凝集ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニン及びノルアドレナリン再吸収阻害剤、混合セロトニン及びノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2又は3(脱共役タンパク質2又は3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニスト(GIPアナログ)、ガストリン及びガストリンアナログである。
本発明による誘導体を使用した治療はまた、胃緊縛術又は胃バイパス術などのグルコースレベル及び/又は脂質恒常性に影響する外科手術と組み合わされてもよい。
医薬適応症
本発明はまた、薬剤として使用するための本発明の誘導体に関する。
特定の実施形態において、本発明の誘導体は以下の薬物治療に用いられ得るが、これらの全ては好ましくはいずれにせよ糖尿病に関する。
(i)高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠性糖尿病などの全ての型の糖尿病の予防及び/若しくは治療、並びに/若しくはHbA1Cの低減;
(ii)2型糖尿病の進行などの糖尿病性疾患進行を遅延させること若しくは予防すること、耐糖能障害(IGT)のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延させること、及び/若しくは非インスリン要求性2型糖尿病のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延させること;
(iii)β細胞のアポトーシスの減少、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加などのβ細胞の機能を改善すること、並びに/若しくはβ細胞のグルコース感受性を回復させること;
(iv)認知障害の予防及び/若しくは治療;
(v)例として食事摂取量の減少、体重低減、食欲抑制、飽満誘導による肥満などの摂食障害の予防及び/若しくは治療;過度の摂食障害、神経性過食症、及び/若しくは統合失調症治療薬若しくはステロイドの投与により誘導される肥満を治療すること若しくは予防すること;胃運動の低減;並びに/若しくは胃排出を遅延させること;
(vi)末梢神経障害を包含する神経障害、腎症若しくは網膜症などの糖尿病合併症の予防及び/若しくは治療;
(vii)脂質異常症の予防及び/若しくは治療、総血清脂質の低下、HDLの低下、小型高密度LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、HDLの上昇、ヒトにおける血漿リポタンパク質a(Lp(a))レベルの低下、インビトロ及び/若しくはインビボでのアポリポタンパク質a(apo(a))の生成阻害などの脂質パラメーターを改善すること;
(iix)症候群X、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患、脳卒中、大脳虚血、左心室性肥大などの早期心疾患若しくは早期心血管疾患、冠動脈疾患、本態性高血圧、急性高血圧緊急症、心筋症、心機能不全、運動耐性、慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、アテローム性動脈硬化症、軽度慢性心不全、狭心症、心臓バイパス再狭窄、間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症)、拡張機能障害及び/若しくは収縮不全などの心血管疾患の予防及び/若しくは治療;
(ix)炎症性腸症候群、小腸症候群若しくはクローン病、消化不良、及び/若しくは胃潰瘍などの胃腸疾患の予防及び/若しくは治療;
(x)重篤疾患患者、重篤疾患多発性腎症(CIPNP)患者及び/若しくは潜在的なCIPNP患者の治療などの重篤疾患の予防及び/若しくは治療;重篤疾患若しくはCIPNP発展の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、治療及び/若しくは治癒;並びに/若しくは入院中に患者が菌血症、敗血症、及び/若しくは敗血症性ショックを患うことの予防若しくは可能性の低減;並びに/又は
(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防及び/若しくは治療。
特定の実施形態において、適応症は(i)〜(iii)及び(v)〜(iix)からなる群より選択され、適応症(i)、(ii)及び/若しくは(iii);又は適応症(v)、適応症(vi)、適応症(vii)及び/若しくは適応症(iix)などである。
別の特定の実施形態において、適応症は(i)である。さらなる特定の実施形態において、適応症は(v)である。なおさらなる特定の実施形態において、適応症は(iix)である。
以下の適応症、2型糖尿病及び/又は肥満は、とりわけ好ましい。
特定の実施形態
以下は本発明の特定の実施形態である。
1. GLP-1アナログの誘導体であって、前記アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、
前記誘導体はそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、
前記アルブミン結合部分は化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含み、
前記持続時間延長性部分が化学式1である場合は前記アルブミン結合部分が化学式5
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)のリンカーをさらに含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
2. 前記GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基がK37で示され、前記第二のK残基がK26で示され、
前記誘導体がそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、
前記アルブミン結合部分が化学式2、化学式3及び化学式4
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含む、実施形態1の誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
3. アルブミン結合部分がリンカーをさらに含む、実施形態2の誘導体。
4. リンカーが、i)Gluジラジカル及び/又はii)化学式5のリンカー
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)を含む、実施形態3の誘導体。
5. Gluジラジカルが化学式6及び/又は化学式7
化学式6:
化学式7:
から選択され、好ましくは化学式6である、実施形態4の誘導体。
6. 前記GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基がK37で示され、前記第二のK残基がK26で示され、
前記誘導体がそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、
前記アルブミン結合部分が
i)化学式1
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数)の持続時間延長性部分、及び
ii)化学式5
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)のリンカーを含む、実施形態1の誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
7. 前記GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基がK37で示され、前記第二のK残基がK26で示され、
前記誘導体がそれぞれK26及びK37にリンカーを通じて付着された2つの持続時間延長性部分を含み、
前記持続時間延長性部分が化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択され、
前記リンカーが化学式5
化学式5:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)を含む、実施形態1の誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
8. 化学式5が第一のリンカー構成成分である、実施形態1〜7のいずれか1つの誘導体。
9. kが1である、実施形態1〜8のいずれか1つの誘導体。
10. nが1である、実施形態1〜9のいずれか1つの誘導体。
11. 化学式5がm回包含され、mが1〜10の範囲の整数である、実施形態1〜10のいずれか1つの誘導体。
12. mが1〜6の範囲の整数、好ましくは1〜4の範囲の整数、より好ましくはmが1若しくは2、又は最も好ましくはmが2である、実施形態11の誘導体。
13. mが1ではなく、化学式5構成成分がアミド結合を通じて相互連結されている、実施形態11〜12のいずれか1つの誘導体。
14. リンカーが1つ又は複数の化学式5構成成分からなる、実施形態1〜13のいずれか1つの誘導体。
15. リンカーが、好ましくはGluジラジカルである、より好ましくは化学式6及び/又は化学式7
化学式6:
化学式7:
から選択される、最も好ましくは化学式6である第二のリンカー構成成分をさらに含む、実施形態1〜13のいずれか1つの誘導体。
16. Gluジラジカルがp回包含され、pが1〜3の範囲の整数である、実施形態15の誘導体。
17. pが1、2若しくは3、好ましくは1若しくは2、又は最も好ましくは1である、実施形態16の誘導体。
18. GluジラジカルがL-Glu又はD-Gluのラジカル、好ましくはL-Gluのラジカルである、実施形態1〜17のいずれか1つの誘導体。
19. 1つ又は複数のGluジラジカル、及び1つ又は複数の化学式5構成成分がアミド結合を通じて相互連結されている、実施形態16〜18のいずれか1つの誘導体。
20. リンカーが第三のリンカー構成成分などのさらなるリンカー構成成分を含む、実施形態1〜19のいずれか1つの誘導体。
21. 第三のリンカー構成成分が
化学式8: *-NH-(CH2)q-CHR2-CO-*
(式中qは2〜12の範囲の整数、R2は水素(H)、アミノ(NH2)又はC1〜C5の低級アルコール)である、実施形態20の誘導体。
22. qが4、6又は10である、実施形態21の誘導体。
23. 化学式8がアミノヘキサン酸、アミノオクタン酸、アミノドデカン酸又はリジンのラジカルである、実施形態21〜22のいずれか1つの誘導体。
24. ラジカル化されたアミノ基がイプシロン位にある、実施形態23の誘導体。
25. リンカーがm回の化学式5及びp回のGluジラジカルからなる、実施形態1〜24のいずれか1つの誘導体。
26. (m,p)が(2,2)、(2,1)、(2,3)、(4,1)、(6,1)、(1,0)、(1,1)、(1,2)、(0,1)若しくは(0,2);好ましくは(2,1)、(2,0)、(1,0)、(1,1)、(0,1)若しくは(0,2);より好ましくは(2,1)、(2,2)若しくは(1,2);一層より好ましくは(1,1)若しくは(2,1);又は最も好ましくは(2,1)である、実施形態25の誘導体。
27. m回の化学式5構成成分及びp回のGluジラジカルがアミド結合を通じて相互連結されている、実施形態25〜26のいずれか1つの誘導体。
28. リンカーがm回の化学式5、p回のGluジラジカル、及び化学式8からなる、実施形態21〜24のいずれか1つの誘導体。
29. (m,p)が(2,1)又は(1,1);好ましくは(2,1)である、実施形態28の誘導体。
30. m回の化学式5構成成分、p回のGluジラジカル、及び化学式8構成成分がアミド結合を通じて相互連結されている、実施形態28〜29のいずれか1つの誘導体。
31. リンカー及び持続時間延長性部分がアミド結合を通じて相互連結されている、実施形態1〜30のいずれか1つの誘導体。
32. リンカー及びGLP-1アナログがアミド結合を通じて相互連結されている、実施形態1〜31のいずれか1つの誘導体。
33. リンカーがK26又はK37のイプシロン-アミノ基に付着している、実施形態32の誘導体。
34. リンカーが
(i)5個から41個までのC原子;好ましくは5〜17個のC原子;5、6、11、12若しくは17個などのC原子;例えば5、6若しくは12個のC原子、若しくは11若しくは17個のC原子;若しくは最も好ましくは17個のC原子;又は
(ii)5〜30個までのC原子、好ましくは5〜25個までのC原子、より好ましくは5〜20個までのC原子、若しくは最も好ましくは5〜17個までのC原子
を持つ、実施形態1〜33のいずれか1つの誘導体。
35. リンカーが
(i)4個から28個までのヘテロ原子;好ましくは4個から12個までのヘテロ原子;4個、8個若しくは12個などのヘテロ原子;より好ましくは8個若しくは12個のヘテロ原子;若しくは最も好ましくは12個のヘテロ原子;又は
(ii)4〜20個のヘテロ原子、好ましくは4〜18個のヘテロ原子、より好ましくは4〜14個のヘテロ原子、若しくは最も好ましくは4〜12個のヘテロ原子
を持つ、実施形態1〜34のいずれか1つの誘導体。
36. ヘテロ原子がN原子及び/又はO原子である、実施形態35の誘導体。
37. リンカーが1個から7個までのN原子;好ましくは1個から3個までのN原子;1、2若しくは3個などのN原子;例えば1若しくは2個のN原子;又は最も好ましくは3個のN原子を持つ、実施形態34〜36のいずれか1つの誘導体。
38. リンカーが3個から21個までのO原子;好ましくは3個から9個までのO原子;3、6若しくは9個などのO原子;例えば3若しくは6個のO原子;又は最も好ましくは9個のO原子を持つ、実施形態34〜37のいずれか1つの誘導体。
39. リンカーがアミド結合を通じて相互連結された2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
40. リンカーがアミド結合を通じて相互連結された4回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
41. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された2回の化学式6及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
42. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された2回の化学式5及び1回の化学式6からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、その遊離*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
43. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された3回の化学式6及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、その遊離*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
44. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された1回の化学式6及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
45. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された1回の化学式6、1回の化学式5、及び1回の化学式6からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
46. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された1回の化学式6及び4回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
47. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された1回の化学式6及び6回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
48. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された1回の化学式6及び1回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
49. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された1回の化学式5、1回の化学式6及び1回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
50. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された1回の化学式7及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
51. リンカーが1回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
52. リンカーが1回の化学式6からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
53. リンカーがアミド結合を通じて相互連結された2回の化学式6からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つの誘導体。
54. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された、1回の化学式6、1回の化学式8(式中、好ましくはqは10でR2はHである)、1回の化学式6、及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜53のいずれか1つの誘導体。
55. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された、1回の化学式6、1回の化学式8(式中、好ましくはqは4でR2はHである)、1回の化学式6、及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜54のいずれか1つの誘導体。
56. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された、1回の化学式6、1回の化学式8(式中、好ましくはqは6でR2はHである)、1回の化学式6、及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態1〜55のいずれか1つの誘導体。
57. リンカーが指示された配列中でアミド結合を通じて相互連結された、1回の化学式6、1回の化学式8(式中、好ましくはqは4でR2はNH2である)、1回の化学式6、及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、*-CO末端においてGLP-1アナログのK26又はK37のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態15〜18のいずれか1つの誘導体。
58. 持続時間延長性部分が化学式1である、実施形態1〜57のいずれか1つの誘導体。
59. xが偶数である、実施形態1〜58のいずれか1つの誘導体。
60. xが8、10、12、14若しくは16などの8〜16の範囲の整数;又は好ましくは10〜14の範囲の整数である、実施形態1〜59のいずれか1つの誘導体。
61. xが10、12若しくは14;好ましくは14;より好ましくは10;又は最も好ましくは12である、実施形態1〜60のいずれか1つの誘導体。
62. 化学式1が化学式1a
化学式1a:
により表され、xが実施形態1〜61のいずれか1つに規定される、実施形態1〜61のいずれか1つの誘導体。
63. 持続時間延長性部分が化学式2である、実施形態1〜57のいずれか1つの誘導体。
64. yが奇数である、実施形態1〜63のいずれか1つの誘導体。
65. yが7、9、11、13、15若しくは17などの7〜17の範囲の整数;好ましくは7〜15の範囲の整数、例えば9、11若しくは15などである、実施形態1〜64のいずれか1つの誘導体。
66. yが7、8、9、11又は15である、実施形態1〜65のいずれか1つの誘導体。
67. yが7、9、11又は15である、実施形態1〜66のいずれか1つの誘導体。
68. yが7である、実施形態1〜67のいずれか1つの誘導体。
69. yが9である、実施形態1〜68のいずれか1つの誘導体。
70. yが11である、実施形態1〜69のいずれか1つの誘導体。
71. yが15である、実施形態1〜70のいずれか1つの誘導体。
72. 化学式2が化学式2a又は化学式2b
化学式2a:
化学式2b:
により、好ましくは化学式2aにより表され、yが実施形態1〜71のいずれか1つに規定される、実施形態1〜71のいずれか1つの誘導体。
73. 持続時間延長性部分が化学式3である、実施形態1〜57のいずれか1つの誘導体。
74. zが奇数;好ましくは3である、実施形態1〜73のいずれか1つの誘導体。
75. R1が127Da以下のモル質量を持つ基である、実施形態1〜74のいずれか1つの誘導体。
76. R1が1〜127Da、好ましくは1〜125Da、より好ましくは1〜100Da、一層より好ましくは1〜75Da、又は最も好ましくは1〜50Daの範囲のモル質量を持つ基である、実施形態1〜75のいずれか1つの誘導体。
77. R1が
(ii)130Daより小さい、好ましくは100Daより小さい、より好ましくは75Daより小さい、一層より好ましくは60Daより小さい、若しくは最も好ましくは50Daより小さいモル質量;又は
(iii)40Daより小さい、好ましくは30Daより小さい、より好ましくは20Daより小さい、若しくは最も好ましくは15Daより小さいモル質量
を持つ基である、実施形態1〜76のいずれか1つの誘導体。
78. R1が-Hである、実施形態1〜77のいずれか1つの誘導体。
79. R1がハロゲンラジカルである、実施形態1〜78のいずれか1つの誘導体。
80. R1が-Iである、実施形態1〜79のいずれか1つの誘導体。
81. R1が直鎖又は分枝のC1〜C5アルキル、好ましくはC1〜C4アルキル、より好ましくはメチル、又は最も好ましくはtert-ブチルである、実施形態1〜80のいずれか1つの誘導体。
82. 化学式3が化学式3a
化学式3a:
により表され、R1及びzが実施形態1〜81のいずれか1つに規定される、実施形態1〜81のいずれか1つの誘導体。
83. 持続時間延長性部分が化学式4である、実施形態1〜57のいずれか1つの誘導体。
84. wが偶数である、実施形態1〜83のいずれか1つの誘導体。
85. wが8〜16の範囲の整数;又は好ましくは10〜14の範囲の整数である、実施形態1〜84のいずれか1つの誘導体。
86. wが10、12若しくは14;好ましくは14;より好ましくは10;又は最も好ましくは12である、実施形態1〜85のいずれか1つの誘導体。
87. 化学式4が化学式4a
化学式4a:
により表され、wが実施形態1〜86のいずれか1つに規定される、実施形態1〜86のいずれか1つの誘導体。
88. 2つの持続時間延長性部分が少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一であるなどの実質的に同一である、実施形態1〜87のいずれか1つの誘導体。
89. 2つの持続時間延長性部分が少なくとも0.5、好ましくは少なくとも0.6、より好ましくは少なくとも0.7若しくは少なくとも0.8、一層より好ましくは少なくとも0.9、又は最も好ましくは1.0の類似性などの少なくとも0.99の類似性を持つ、実施形態1〜88のいずれか1つの誘導体。
90. 2つのリンカーが少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一であるなどの実質的に同一である、実施形態1〜89のいずれか1つの誘導体。
91. 2つのリンカーが少なくとも0.5、好ましくは少なくとも0.6、より好ましくは少なくとも0.7、若しくは少なくとも0.8、一層より好ましくは少なくとも0.9、又は最も好ましくは1.0の類似性などの少なくとも0.99の類似性を持つ、実施形態1〜90のいずれか1つの誘導体。
92. 持続時間延長性部分及びリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一であるなどの実質的に同一である、実施形態1〜91のいずれか1つの誘導体。
93. 持続時間延長性部分及びリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが少なくとも0.5、好ましくは少なくとも0.6、より好ましくは少なくとも0.7若しくは少なくとも0.8、一層より好ましくは少なくとも0.9、又は最も好ましくは1.0の類似性などの少なくとも0.99の類似性を持つ、実施形態1〜92のいずれか1つの誘導体。
94. 比較される2つの化学構造がa)ECFP_6フィンガープリント、b)UNITYフィンガープリント、及び/又はc)MDLフィンガープリントなどのフィンガープリントとして表され、a)、b)及びc)の各々においてTanimoto係数が2つのフィンガープリントの類似性又は同一性を計算するのに好ましくは用いられる、実施形態88〜93のいずれか1つの誘導体。
95.
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の37位及び26位に相当する位置、並びに/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が筆記及び視認により同定される、実施形態1〜94のいずれか1つの誘導体。
96.
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の37位及び26位に相当する位置、並びに/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が標準的なタンパク質又はペプチドアラインメントプログラムの使用により同定される、実施形態1〜95のいずれか1つの誘導体。
97. アラインメントプログラムがNeedleman-Wunschアラインメントである、実施形態96の誘導体。
98. デフォルトのスコア行列及びデフォルトの同一性行列が用いられる、実施形態96〜97のいずれか1つの誘導体。
99. スコア行列がBLOSUM62である、実施形態96〜98のいずれか1つの誘導体。
100. ギャップ中の第一の残基についてのペナルティが-10(マイナス10)である、実施形態96〜99のいずれか1つの誘導体。
101. ギャップ中の付加的な残基についてのペナルティが-0.5(マイナス0.5)である、実施形態96〜100のいずれか1つの誘導体。
102. アナログが第一及び第二のK残基以外のK残基を含まない、実施形態1〜101のいずれか1つの誘導体。
103. アミノ酸改変がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位、8位、9位、23位、30位、31位、34位、36位、37位及び38位に相当する位置の1つ又は複数にある、実施形態1〜102のいずれか1つの誘導体。
104. アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して最低2つのアミノ酸改変を含み、好ましくは持ち、前記最低2つのアミノ酸改変が好ましくはGLP-1(7-37)(配列番号1)の34位及び37位に相当する各位置におけるものである、より好ましくは37位に相当する位置におけるアミノ酸がKで、34位に相当する位置におけるアミノ酸がKでないようにする、実施形態1〜103のいずれか1つの誘導体。
105. GLP-1アナログがC末端のアミドを持つ、実施形態1〜104のいずれか1つの誘導体。
106. 34位に相当する位置におけるアミノ酸がR又はQである、実施形態105の誘導体。
107. アミノ酸改変が(R34若しくはQ34)、K37、(Des7若しくはImp7)、(D-Ala8、Des8、Aib8、G8若しくはS8)、(Q9若しくはG9)、R23、E30、H31、G36及び/又は(E38若しくはG38)から選択される、実施形態1〜106のいずれか1つの誘導体。
108. アミノ酸改変が(R34若しくはQ34)、K37、(Des7若しくはImp7)、(Des8若しくはAib8)、(Q9若しくはG9)、R23、E30、H31、G36及び/又は(E38若しくはG38)から選択される、実施形態1〜107のいずれか1つの誘導体。
109. アナログが(R34若しくはQ34)及びK37を含む、実施形態1〜108のいずれか1つの誘導体。
110. アナログがImp7及び/若しくは(Aib8若しくはS8)、好ましくはImp7及び/若しくはAib8、より好ましくはImp7、又は最も好ましくはAib8を含む、実施形態1〜109のいずれか1つの誘導体。
111. アナログがG38又はE38、好ましくはE38を含む、実施形態1〜110のいずれか1つの誘導体。
112. アナログがQ9又はG9を含む、実施形態1〜111のいずれか1つの誘導体。
113. アナログがG36を含む、実施形態1〜112のいずれか1つの誘導体。
114. アナログがH31を含む、実施形態1〜113のいずれか1つの誘導体。
115. アナログがR23を含む、実施形態1〜114のいずれか1つの誘導体。
116. アナログがdes7及び/又はdes8、好ましくは両方を含む、実施形態1〜115のいずれか1つの誘導体。
117. 1つのアミノ酸がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位に相当する位置において欠失している、実施形態1〜116のいずれか1つの誘導体。
118. 1つのアミノ酸がGLP-1(7-37)(配列番号1)の8位に相当する位置において欠失している、実施形態1〜117のいずれか1つの誘導体。
119. 2つのアミノ酸がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位及び8位に相当する位置において欠失している、実施形態1〜118のいずれか1つの誘導体。
120. GLP-1(8-37)(配列番号1のアミノ酸の2〜31)のアナログであって、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して10個まで、9個まで、8個まで又は6個までのアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜119のいずれか1つの誘導体。
121. GLP-1(9-37)(配列番号1のアミノ酸のそれぞれ3〜31)のアナログであって、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して10個まで、9個まで、8個まで又は6個までのアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜120のいずれか1つの誘導体。
122. GLP-1アナログが(a)K37-GLP-1(7-37)、(b)K37-GLP-1(8-37)、(c)K37-GLP-1(9-37)、又は(d)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して10個まで、9個まで、8個まで又は6個までのアミノ酸改変を持つ(a)〜(c)のいずれか1つのアナログに相当する、実施形態1〜121のいずれか1つの誘導体。
123. His以外のHis模倣物がGLP-1(7-37)(配列番号1)の2位に相当する位置にある、実施形態1〜122のいずれか1つの誘導体。
124. His-Ala以外のHis-Ala模倣物がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位及び8位に相当する位置にある、実施形態1〜123のいずれか1つの誘導体。
125. His模倣物又はHis-Ala模倣物がa)イミダゾール、又はb)ピリジンを含む、実施形態123〜124のいずれか1つの誘導体。
126. イミダゾールがアナログのN末端アミノ酸の*-NHへのアミド結合の形成を通じた共有結合性カップリングのための*-CO末端を含むイミダゾールの誘導体である、実施形態125の誘導体。
127. ピリジンがアナログのN末端アミノ酸の*-NHへのアミド結合の形成を通じた共有結合性カップリングのための*-CO末端を含むピリジンの誘導体である、実施形態125の誘導体。
128. イミダゾール誘導体が一置換体である、実施形態125〜127のいずれか1つの誘導体。
129. ピリジン誘導体が一置換体である、実施形態125〜127のいずれか1つの誘導体。
130. イミダゾール誘導体が1個から6個までの炭素原子を持つ低級アルキルのカルボン酸ラジカルを含む基で置換されている、実施形態125〜129のいずれか1つの誘導体。
131. ピリジン誘導体が1個から6個までの炭素原子を持つ低級アルキルのカルボン酸ラジカルを含む基で置換されている、実施形態125〜129のいずれか1つの誘導体。
132. カルボン酸ラジカルがアセチル及び直鎖又は分枝のプロピニル、ブチリル、ペンタノイルから選択される、好ましくはアセチルである、実施形態130〜131のいずれか1つの誘導体。
133. GLP-1(7-37)(配列番号1)の8位に相当する位置におけるアミノ酸残基のN原子に3H-イミダゾール-4-イル-アセチルが付着されている、実施形態1〜132のいずれか1つの誘導体。
134. 配列番号1の8位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアラニンである、実施形態1〜133のいずれか1つの誘導体。
135. イミダゾールが(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(プロピルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル又は(ブチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、好ましくは(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、実施形態125〜134のいずれか1つの誘導体。
136. GLP-1(7-37)(配列番号1)の9位に相当する位置におけるアミノ酸残基のN原子に{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}が付着されている、実施形態1〜135のいずれか1つの誘導体。
137. ピリジンが(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(プロピルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル又は(ブチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、好ましくは(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、実施形態125〜136のいずれか1つの誘導体。
138. GLP-1(7-37)(配列番号1)の9位に相当する位置におけるアミノ酸残基のN原子に [2,2-ジメチル-3-オキソ-3-(ピリジン-2-イルメチルアミノ)プロパノイル]が付着されている、実施形態1〜137のいずれか1つの誘導体。
139. GLP-1アナログの9位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸である、実施形態1〜138のいずれか1つの誘導体。
140. アナログが(H31及びQ34)を含まない、実施形態1〜139のいずれか1つの誘導体。
141. アナログが(des7及びdes8)を含まない、並びに/又は実施形態116〜140のいずれか1つに規定されるHis模倣物若しくはHis-Ala模倣物を含まない、実施形態1〜140のいずれか1つの誘導体。
142. アナログがGLP-1(7-37)又はGLP-1(9-37)のアナログである、実施形態1〜141のいずれか1つの誘導体。
143. アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、i)(34R,37K)、ii)(8Aib,34R,37K)、iii)(31H,34Q,37K)、iv)(des7,des8,34R,37K)及び任意選択で38E、又はv)(34R,36G,37K)のアミノ酸変化又は改変を含む、好ましくは持つ、実施形態1〜142のいずれか1つの誘導体。
144. アナログが最大9個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜143のいずれか1つの誘導体。
145. アナログが最大8個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜144のいずれか1つの誘導体。
146. アナログが最大7個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜145のいずれか1つの誘導体。
147. アナログが最大6個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜146のいずれか1つの誘導体。
148. アナログが最大5個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜147のいずれか1つの誘導体。
149. アナログが最大4個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜148のいずれか1つの誘導体。
150. アナログが最大3個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜149のいずれか1つの誘導体。
151. アナログが最大2個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜150のいずれか1つの誘導体。
152. アナログが最小2個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜151のいずれか1つの誘導体。
153. アナログが最小3個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜152のいずれか1つの誘導体。
154. アナログが最小4個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜153のいずれか1つの誘導体。
155. アナログが最小5個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜154のいずれか1つの誘導体。
156. アナログが最小6個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜155のいずれか1つの誘導体。
157. アナログが最小7個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜156のいずれか1つの誘導体。
158. アナログが最小8個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜157のいずれか1つの誘導体。
159. アナログが最小9個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜158のいずれか1つの誘導体。
160. アナログが最小10個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜159のいずれか1つの誘導体。
161. アナログが1個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜160のいずれか1つの誘導体。
162. アナログが2個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜161のいずれか1つの誘導体。
163. アナログが3個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜162のいずれか1つの誘導体。
164. アナログが4個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜163のいずれか1つの誘導体。
165. アナログが5個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜164のいずれか1つの誘導体。
166. アナログが6個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜165のいずれか1つの誘導体。
167. アナログが7個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜166のいずれか1つの誘導体。
168. アナログが8個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜167のいずれか1つの誘導体。
169. アナログが9個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜169のいずれか1つの誘導体。
170. アナログが10個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜170のいずれか1つの誘導体。
171. 改変が独立して置換、付加及び/又は欠失である、実施形態1〜171のいずれか1つの誘導体。
172. 改変が置換である、実施形態1〜172のいずれか1つの誘導体。
173. 改変が欠失である、実施形態1〜173のいずれか1つの誘導体。
174. 改変が付加である、実施形態1〜174のいずれか1つの誘導体。
175.
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の指示された位置のいずれかに相当する位置、及び/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が筆記及び視認により同定される、実施形態1〜174のいずれか1つの誘導体。
176.
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の指示された位置のいずれかに相当する位置、及び/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が実施形態96〜101のいずれか1つに記載されるように同定される、実施形態1〜175のいずれか1つの誘導体。
177. 化学式20、化学式21、化学式22、化学式23、化学式24、化学式25、化学式26、化学式27、化学式28、化学式29、化学式30、化学式31、化学式32、化学式33、化学式34、化学式35、化学式36、化学式37、化学式38、化学式39、化学式40、化学式41、化学式42、化学式43、化学式44、化学式45、化学式46、化学式47、化学式48、化学式49、化学式50、化学式51、化学式52、化学式53、化学式54、化学式55、化学式56、化学式57、化学式58、化学式59、化学式60、化学式61、化学式62、化学式63、化学式64、化学式65、化学式66、化学式67、及び化学式68から選択される化合物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
178. 名称により特徴づけられ、本明細書の実施例1〜49の各々の化合物名称の表から選択される化合物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
179. 実施形態177の化合物である、実施形態178の化合物。
180. 実施形態1〜176のいずれか1つに記載の誘導体である、実施形態178及び179のいずれか1つの化合物。
181. (i)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Gly36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
化学式62:
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
化学式58:
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式40:
Nε26[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Gln9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
化学式56:
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式21:
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[9-(4-カルボキシフェノキシ)ノナノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[9-(4-カルボキシフェノキシ)ノナノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
化学式63:
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式36:
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]、Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
化学式55:
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
化学式51:
Nε26[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル]、Nε37-[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式44:
Nε26[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu、及び
化学式64:
(ii)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチルフェニル)ブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチルフェニル)ブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド、
化学式46:
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg23,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
化学式50:
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式24:
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、及び
化学式31:
(iii)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式35:
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式23:
Nε26-[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル]、Nε37-[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式44:
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式21:
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、及び
化学式48:
(iv)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式35:
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、
化学式21:
Nε26-[2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]]、Nε37-[2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチドアミド、
化学式29:
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド、及び
化学式31:
又は薬学的に許容されるこれら化合物のいずれかの塩、アミド若しくはエステルから選択される、実施形態1〜180のいずれか1つの誘導体。
182. 化学式62又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
183. 化学式40又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
184. 化学式21又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
185. 化学式55又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
186. 化学式51又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
187. 化学式44又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
188. 化学式46又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
189. 化学式31又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
190. 化学式35又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
191. 化学式23又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態181の誘導体。
192. GLP-1活性を持つ、実施形態1〜191のいずれか1つの誘導体。
193. GLP-1活性がヒトGLP-1受容体を活性化する能力をいう、実施形態192の誘導体。
194. ヒトGLP-1受容体の活性化がインビトロアッセイにおいてcAMP生産能として測定される、実施形態193の誘導体。
195.
a)10000pMより低い、より好ましくは5000pMより低い、一層より好ましくは4000pMより低い、若しくは最も好ましくは3000pMより低い;
b)3000pM以下、好ましくは3000pMより低い、より好ましくは2500pMより低い、一層より好ましくは2000pMより低い、若しくは最も好ましくは1500pMより低い;
c)2000pMより低い、好ましくは1000pMより低い、より好ましくは800pMより低い、一層より好ましくは600pMより低い、若しくは最も好ましくは500pMより低い;
c)400pMより低い、好ましくは300pMより低い、より好ましくは200pMより低い、一層より好ましくは150pMより低い、若しくは最も好ましくは100pMより低い;
d)80pMより低い、好ましくは60pMより低い、より好ましくは50pMより低い、一層より好ましくは40pMより低い、若しくは最も好ましくは30pMより低いEC50に相当する効力を持つ;或いは
e)セマグルチドのEC50の10倍より小さい、好ましくはセマグルチドのEC50の8倍より小さい、より好ましくはセマグルチドのEC50の6倍より小さい、一層より好ましくはセマグルチドのEC50の4倍より小さい、若しくは最も好ましくはセマグルチドのEC50の2倍より小さい;
f)リラグルチドのEC50の10倍より小さい、好ましくはリラグルチドのEC50の8倍より小さい、より好ましくはリラグルチドのEC50の6倍より小さい、一層より好ましくはリラグルチドのEC50の4倍より小さい、若しくは最も好ましくはリラグルチドのEC50の2倍より小さい;又は
g)リラグルチドのEC50より小さい、好ましくはリラグルチドのEC50の0.8倍より小さい、より好ましくはリラグルチドのEC50の0.6倍より小さい、一層より好ましくはリラグルチドのEC50の0.5倍より小さい、若しくは最も好ましくはリラグルチドのEC50の0.4倍より小さい
EC50に相当する効力を持つ、実施形態1〜194のいずれか1つの誘導体。
196. 効力がヒトGLP-1受容体を含有する培地における用量依存的なcAMP形成を示す用量応答曲線についてのEC50として、好ましくはBHK467-12A(tk-ts13)などの安定的に形質導入された細胞株を用いて、及び/又はcAMPの決定のために機能受容体アッセイを用いて決定される、実施形態1〜195のいずれか1つの誘導体であって、前記アッセイが例として内因的に形成されたcAMPと外因的に追加されたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づくものであり、前記アッセイにおいてcAMPはより好ましくは特異的な抗体を用いて捕捉され、及び/又は一層より好ましくは前記アッセイがAlphaScreen cAMP Assayであり、最も好ましくは実施例50に記載されるアッセイである、誘導体。
197. 比率[0.005% HSA(低アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)で除算された2.0% HSA(高アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)]が
a)少なくとも0.5、好ましくは少なくとも1.0、より好ましくは少なくとも10、一層より好ましくは少なくとも20、若しくは最も好ましくは少なくとも30;
b)少なくとも40、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも60、一層より好ましくは少なくとも70、若しくは最も好ましくは少なくとも80;
c)少なくとも90、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも200、なおより好ましくは少なくとも300、一層より好ましくは少なくとも400、若しくは最も好ましくは少なくとも500;
d)少なくとも120、好ましくは少なくとも140、一層より好ましくは少なくとも160、若しくは最も好ましくは少なくとも180;
e)セマグルチドの比率の少なくとも20%、好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも50%、より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも75%、若しくは最も好ましくはセマグルチドの比率と少なくとも等しい;又は
f)リラグルチドの比率と少なくとも等しい、好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも2倍、より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも3倍、一層より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも4倍、若しくは最も好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも5倍
である、実施形態1〜196のいずれか1つの誘導体。
198. 0.005% HSA(低アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)が
a)1000.00nMより低い、好ましくは600.00nMより低い、より好ましくは100.00nMより低い、若しくは最も好ましくは50.00nMより低い;又は
b)20.00nMより低い、好ましくは10.00nMより低い、より好ましくは5.00nMより低い、一層より好ましくは2.00nMより低い、若しくは最も好ましくは1.00nMより低い、実施形態1〜197のいずれか1つの誘導体。
199. 2.0% HSA(高アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)が
a)1100.00nMより低い、好ましくは1000.00nMより低い、より好ましくは800.00nMより低い、若しくは最も好ましくは600nMより低い;又は
b)400.00nMより低い、好ましくは300.00nMより低い、より好ましくは200.00nMより低い、一層より好ましくは100.00nMより低い、若しくは最も好ましくは50.00nMより低い、実施形態1〜198のいずれか1つの誘導体。
200. GLP-1受容体への結合アフィニティーが受容体からの125I-GLP-1の転置として、好ましくはSPA結合アッセイを用いて測定される、実施形態1〜199のいずれか1つの誘導体。
201. GLP-1受容体が安定的に形質導入された細胞株を用いて、好ましくはハムスター細胞株を用いて、より好ましくはBHK tk-ts13などのベビーハムスター腎臓細胞株を用いて調製される、実施形態1〜200のいずれか1つの誘導体。
202. IC50値が受容体から125I-GLP-1の50%を転置させる濃度として決定される、実施形態1〜201のいずれか1つの誘導体。
203. セマグルチドより高い経口での生物学的利用能、好ましくは経口での絶対的生物学的利用能を持つ、実施形態1〜202のいずれか1つの誘導体。
204. 経口での生物学的利用能がラットにおいて、腸管腔への直接注射後の血漿中曝露としてインビボで測定される、実施形態203の誘導体。
205. 注射された溶液の濃度(μM)で除算された、ラット空腸内への誘導体溶液注射の30分後に決定された誘導体の血漿濃度(pM)(用量補正された30分時の曝露)が、少なくとも40、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも60、なおより好ましくは少なくとも70、一層より好ましくは少なくとも80、又は最も好ましくは少なくとも100である、実施形態1〜204のいずれか1つの誘導体。
206. 注射された溶液の濃度(μM)で除算された、ラット空腸内への誘導体溶液注射の30分後に決定された誘導体の血漿濃度(pM)(用量補正された30分時の曝露)が、少なくとも110、好ましくは少なくとも120、より好ましくは少なくとも130、なおより好ましくは少なくとも140、一層より好ましくは少なくとも150、又は最も好ましくは少なくとも160である、実施形態1〜205のいずれか1つの誘導体。
207. 注射された溶液の濃度(μM)で除算された、ラット空腸内への誘導体溶液注射の30分後に決定された誘導体の血漿濃度(pM)(用量補正された30分時の曝露)が、少なくとも180、好ましくは少なくとも190、より好ましくは少なくとも200、又は最も好ましくは少なくとも210である、実施形態1〜206のいずれか1つの誘導体。
208. GLP-1誘導体が1000uMの濃度で55mg/mlカプリン酸ナトリウムとの混合物中で試験される、実施形態1〜207のいずれか1つの誘導体。
209. 雄性Sprague Dawleyラットが用いられ、好ましくは到着時のその体重がおよそ240gである、実施形態1〜208のいずれか1つの誘導体。
210. ラットを実験前におよそ18時間絶食させる、実施形態1〜209のいずれか1つの誘導体。
211. ラットが絶食後、空腸内への誘導体の注射前に全身麻酔をかけられる、実施形態1〜210のいずれか1つの誘導体。
212. 誘導体が空腸の近位部(十二指腸の10cm遠位)内、又は中腸(盲腸の50cm近位)内に投与される、実施形態1〜211のいずれか1つの誘導体。
213. 100μlの誘導体が1mlシリンジを使用してカテーテルを通じて空腸管腔内に注射され、続いて200μlの空気が別のシリンジを使用して空腸管腔内に押し入れられ、その後カテーテル内への逆流を防ぐためにカテーテルに連結されたままにされる、実施形態1〜212のいずれか1つの誘導体。
214. 血液サンプル(200ul)が0、10、30、60、120及び240分時などの所望の間隔で尾静脈からEDTAチューブ内に回収され、20分以内に4℃で5分間、10000Gで遠心分離される、実施形態1〜213のいずれか1つの誘導体。
215. 血漿(75ul)が分離され、速やかに凍結され、血漿中の誘導体濃度について分析されるまで-20℃で保存される、実施形態1〜214のいずれか1つの誘導体。
216. LOCI(蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ)が血漿中の誘導体濃度を分析するために用いられる、実施形態1〜215のいずれか1つの誘導体。
217. 誘導体がdb/dbマウスにおいてインビボで血糖を低下させるのに有効である、実施形態1〜216のいずれか1つの誘導体。
218. 誘導体がdb/dbマウスにおいてインビボで体重を低下させるのに有効である、実施形態1〜217のいずれか1つの誘導体。
219. db/dbマウスが適切な用量範囲のGLP-1誘導体を皮下に処置され、血糖及び/又は体重が適当な間隔で決定される、実施形態1〜218のいずれか1つの誘導体。
220. GLP-1誘導体の用量が0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg,10nmol/kg、30nmol/kg及び100nmol/kgであって、kgはマウスの体重を参照する、実施形態1〜219のいずれか1つの誘導体。
221. 対照群がビヒクル、好ましくはGLP-1誘導体が溶解される溶媒、例として50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4の組成の溶媒を皮下に処置される、実施形態1〜220のいずれか1つの誘導体。
222. -1/2時間時(投薬(t=0)の30分前)、及び1、2、4、8、24、48、72及び96時間時に血糖が決定され、及び/又はマウスが秤量される、実施形態1〜221のいずれか1つの誘導体。
223. グルコース濃度がグルコースオキシダーゼ法を用いて測定される、実施形態1〜222のいずれか1つの誘導体。
224.
(i)ED50(体重(BW))が誘導体の皮下投与後24時間のBWのデルタ(例として減少)に対する最大半量効果を生じる用量として計算される、及び/又は
(ii)ED50(血糖(BG))が誘導体の皮下投与後8時間のBGのAUC(曲線下面積)デルタ(例として減少)に対する最大半量効果を生じる用量として計算される、
実施形態1〜223のいずれか1つの誘導体。
225. S字状の用量反応関係、好ましくは最大応答が明確に規定されるS字状の用量反応関係が存在する、実施形態1〜224のいずれか1つの誘導体。
226. リラグルチドより持続時間延長された作用プロファイルを持つ、実施形態1〜225のいずれか1つの誘導体。
227. 持続時間延長がdb/dbマウス、ラット、ブタ、及び/又は好ましくはミニブタなどの関連する動物種におけるインビボの半減期を意味し、誘導体がi)皮下、及び/又は好ましくはii)皮下に投与される、実施形態226の誘導体。
228. ミニブタにおける静脈内投与後の終末相半減期(T1/2)が
a)少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも36時間、一層より好ましくは少なくとも48時間、若しくは最も好ましくは少なくとも60時間;
b)少なくとも7時間、好ましくは少なくとも16時間、より好ましくは少なくとも24時間、一層より好ましくは少なくとも30時間、若しくは最も好ましくは少なくとも40時間;
c)少なくとも44時間、好ましくは少なくとも55時間、より好ましくは少なくとも66時間、一層より好ましくは少なくとも77時間、若しくは最も好ましくは少なくとも88時間;又は
d)セマグルチドの半減期の少なくとも0.2倍、好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.4倍、より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.6倍、一層より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.8倍、若しくは最も好ましくはセマグルチドの半減期と少なくとも同じ
である、実施形態1〜227のいずれか1つの誘導体。
229. ミニブタが雄性Gottingenミニブタである、実施形態228の誘導体。
230. ミニブタが7〜14カ月齢で、好ましくは16〜35kgの体重である、実施形態227〜229のいずれか1つの誘導体。
231. ミニブタが個別に飼育され、1日1回又は2回、好ましくはSDSミニブタ食を給餌される、実施形態227〜230のいずれか1つの誘導体。
232. 少なくとも2週間の順化の後、誘導体が静脈内に投薬される、実施形態227〜231のいずれか1つの誘導体。
233. 動物を投薬前およそ18時間及び投薬後少なくとも4時間絶食させ、及び全期間を通じて水を自由摂取させる、実施形態227〜232のいずれか1つの誘導体。
234. GLP-1誘導体が50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4の中に、適切な濃度、好ましく20〜60nmol/mlで溶解される、実施形態227〜233のいずれか1つの誘導体。
235. 誘導体の静脈内注射が1〜2nmol/kgに相当する容量でなされる、実施形態227〜234のいずれか1つの誘導体。
236. ミニブタにおけるグルコース刺激性インスリン分泌を増加させる、実施形態1〜235のいずれか1つの誘導体。
237. ミニブタが雄性Gottingenミニブタである、実施形態236の誘導体。
238. ミニブタが7〜14カ月齢である、実施形態236〜237のいずれか1つの誘導体。
239. ミニブタが一匹用の檻の中で飼育され、1日1回又は2回、好ましくはSDSミニブタ飼料を給餌される、実施形態236〜238のいずれか1つの誘導体。
240. 単回投与が、任意選択で用量増加を伴う期間の後に、耳の後ろの薄い皮膚において静脈内又は皮下になされる、実施形態236〜239のいずれか1つの誘導体。
241. 動物を投薬前におよそ18時間絶食させる、実施形態236〜240のいずれか1つの誘導体。
242. ベースライン群及び2〜6の異なる血漿濃度レベルに相当するいくつかの誘導体用量群が試験され、ベースライン群がa)ビヒクル処置される、又はb)処置されない、実施形態236〜241のいずれか1つの誘導体。
243. 血漿濃度レベルが3000〜80000pMである、実施形態236〜242のいずれか1つの誘導体。
244. 1又は2時間の静脈内耐糖能試験(IVGTT)が行われる、実施形態236〜243のいずれか1つの誘導体。
245. 0.3g/kgグルコースが30秒間かけて静脈内に与えられ、血液サンプルが-10、-5、0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分時などの適切な時点(t=0はグルコース急速投与に相当する)で採取される、実施形態236〜244のいずれか1つの誘導体。
246. 誘導体、グルコース及びインスリンの血漿中濃度が決定される、実施形態236〜245のいずれか1つの誘導体。
247. 誘導体濃度がt=0分、及び任意選択で試験終了時(t=60分又はt=120分)に測定される、実施形態236〜246のいずれか1つの誘導体。
248. グルコースがグルコースオキシダーゼ法を用いて分析される、実施形態236〜247のいずれか1つの誘導体。
249. インスリンの曲線下領域(AUCインスリン)が計算され、インスリン分泌の測定値として用いられる、実施形態236〜248のいずれか1つの誘導体。
250. 少なくとも1つの誘導体濃度について、AUCインスリンがベースラインのAUCインスリンより、好ましくは少なくとも110%、より好ましくは少なくとも120%、一層より好ましくは少なくとも130%、又は最も好ましくは少なくとも140%高い、実施形態236〜249のいずれか1つの誘導体。
251. ブタにおいて対照(好ましくはビヒクル処置又は未処置)と比べて低減された飼料摂取を引き起こす、実施形態1〜250のいずれか1つの誘導体であって、任意選択で飼料摂取(0〜24時間)がビヒクル処置対照と比べて90%以下、好ましくは80%以下、より好ましくは70%以下、一層より好ましくは60%以下、又は最も好ましくは50%以下であってもよく、飼料摂取(0〜24時間)が誘導体又はビヒクルの投与後の最初の24時間をいう、誘導体。
252. ブタが雌性ランドレースヨークシャーデュロック(LYD)ブタである、実施形態251の誘導体。
253. ブタが3カ月齢で、好ましくは30〜35kgの体重である、実施形態251〜252のいずれか1つの誘導体。
254. 動物が順化のために群の中で1〜2週間飼育される、実施形態251〜253のいずれか1つの誘導体。
255. 実験期間中、個々の食事摂取の測定のために動物が月曜日の朝から金曜日の午後まで個別の檻の中に置かれる、実施形態251〜254のいずれか1つの誘導体。
256. 動物がブタ飼料(Svinefoder、Antonioなど)を自由摂餌する、実施形態251〜255のいずれか1つの誘導体。
257. 食事摂取が飼料の重量を15分ごとに、好ましくはMpigwinシステムを用いてログを取ることによりオンラインでモニターされる、実施形態251〜256のいずれか1つの誘導体。
258. 0.3、1.0、3.0、10、又は30nmol/kgの用量で、好ましくはリン酸緩衝液(50mMリン酸、0.05% tween 80、pH8)中に溶解され、より好ましくは12、40、120、400、又は1200nmol/mlの濃度で投薬される、実施形態251〜257のいずれか1つの誘導体。
259. リン酸緩衝液がビヒクルとして役立つ、実施形態251〜258のいずれか1つの誘導体。
260. 動物が誘導体又はビヒクルの皮下への単回用量を(好ましくは0.025ml/kgの投薬量で)1日目の朝に投薬され、食事摂取が投薬後4日間測定される、実施形態251〜259のいずれか1つの誘導体。
261. 相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)が少なくとも0.4、好ましくは0.5より大きい、より好ましくは1.0より大きい、一層より好ましくは2.0より大きい、なおより好ましくは3.0より大きい、又は最も好ましくは4.0より大きい、実施形態1〜260のいずれか1つの誘導体。
262. 相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)が5.0より大きい、好ましくは6.0より大きい、より好ましくは7.0より大きい、一層より好ましくは8.0より大きい、なおより好ましくは9.0より大きい、又は最も好ましくは10.0より大きい、実施形態1〜261のいずれか1つの誘導体。
263. ラット小腸抽出物が実施例57に記載されるように調製され、誘導体が37℃で1時間インキュベートされ、抽出物の濃度がGLP-1(7-37)の半減期が10〜20分の範囲になるように、例として1.4ug/mlに設定され、結果として生じるサンプルがUPLC及び/若しくはMALDI-TOFにより分析される、並びに/又はインキュベーション及び分析が実施例57に記載されるように行われる、実施形態261〜262のいずれか1つの誘導体。
264. 比率[GLP-1(7-37)のラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)]が、相当するセマグルチドの比率の少なくとも0.5倍、好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも2倍、より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも3倍、一層より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも5倍、又は最も好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも7倍である、実施形態1〜263のいずれか1つの誘導体。
265. 比率[GLP-1(7-37)のラット小腸抽出物中での半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中での半減期(T1/2)]が、相当するリラグルチドの比率の少なくとも0.1倍、好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも0.4倍、より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも0.8倍、一層より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも1.2倍、又は最も好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも1.5倍である、実施形態1〜264のいずれか1つの誘導体。
266. 静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)が少なくとも4時間、好ましくは少なくとも6時間、一層より好ましくは少なくとも8時間、又は最も好ましくは少なくとも10時間である、実施形態1〜265のいずれか1つの誘導体。
267. 静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)が少なくとも12時間、好ましくは少なくとも15時間、一層より好ましくは少なくとも18時間、又は最も好ましくは少なくとも20時間である、実施形態1〜266のいずれか1つの誘導体。
268. 静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)が少なくとも24時間、好ましくは少なくとも26時間、又は最も好ましくは少なくとも30時間である、実施形態1〜266のいずれか1つの誘導体。
269. ラットが体重300gから600gまでの雄性Sprague Dawleyラットである、実施形態266〜268のいずれか1つの誘導体。
270. 静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)がセマグルチドの半減期と少なくとも同じ、好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも2倍、より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも3倍、一層より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも4倍、又は最も好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも5倍である、実施形態1〜269のいずれか1つの誘導体。
271. 実施例17、21、33、34、35及び36の化合物でない、好ましくは化学式36、化学式40、化学式52、化学式53、化学式54及び化学式55でない、実施形態1〜270のいずれか1つの誘導体。
272. 実施例22、23、27及び41の化合物でない、好ましくは化学式41、化学式42、化学式46及び化学式60でない、実施形態1〜271のいずれか1つの誘導体。
273. 実施例19の誘導体、好ましくは化学式38。
274. 実施例10の誘導体、好ましくは化学式29。
275. GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して
(A) (i)(8Aib、31H、34Q、37K); (ii)(des7-8、34R、37K、38E); (iii)(des7-8、34R、37K); (iv)(8Aib、9G、34R、37K); (v)(8Aib、23R、34R、37K); (vi)(31H、34Q、37K); (vii)(9Q、34R、37K); (iix)(30E、34R、37K); (ix)(34R、37K、38G); (x)(34R、36G、37K); 又は(xi)(34R、37K、38E)
の改変を含むGLP-1アナログであって、好ましくは
(B) (i-a)(8Aib、31H、34Q、37K); (ii-a)(des7-8、34R、37K、38E); (iii-a)(des7-8、34R、37K); (iv-a)(8Aib、9G、34R、37K); (v-a)(8Aib、23R、34R、37K); (vi-a)(31 H、34Q、37K); (vii-a)(9Q、34R、37K); (iix-a)(30E、34R、37K); (ix-a)(34R、37K、38G); (x-a)(34R、36G、37K); (xi-a)(34R、37K、38E); (xii-a)(7lmp、34R、37K); (xiii-a)(8Aib、34R、37K); 及び(xiv-a)(34R、37K)
のGLP-1(7-37)(配列番号1)のアナログから選択されるGLP-1アナログ、又は薬学的に許容される(A)若しくは(B)のアナログのいずれかの塩、アミド若しくはエステルの形の中間生成物。
276. GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が筆記及び視認によりなされる、実施形態275のアナログ。
277. GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が標準的なタンパク質又はペプチドアラインメントプログラムの使用によりなされる、実施形態275のアナログ。
278. アラインメントプログラムがNeedleman-Wunschアラインメントである、実施形態277のアナログ。
279. デフォルトのスコア行列及びデフォルトの同一性行列が用いられる、実施形態277〜278のいずれか1つのアナログ。
280. スコア行列がBLOSUM62である、実施形態277〜279のいずれか1つのアナログ。
281. ギャップ中の第一の残基についてのペナルティが-10(マイナス10)である、実施形態277〜280のいずれか1つのアナログ。
282. ギャップ中の付加的な残基についてのペナルティが-0.5(マイナス0.5)である、実施形態277〜281のいずれか1つのアナログ。
283. GLP-1活性を持つ、実施形態277〜282のいずれか1つのアナログ。
284. GLP-1活性が実施形態192〜196に記載されるように規定される、実施形態283のアナログ。
285. 化学式2c、化学式3b及び化学式4b
化学式2c: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-PG
化学式3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
化学式4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数、*-PGは保護基)から選択される持続時間延長性部分を含み、持続時間延長性部分の遠位の*-COOH基が、存在する場合は任意選択でまた保護されている中間生成物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
286. *-CO-PGが、i)*-COOH、又はii)活性化エステルである、実施形態285の中間生成物。
287. 活性化エステルがp-ニトロフェノール;2,4,5-トリクロロフェノール;N-ヒドロキシサクシニミド;N-ヒドロキシスルホサクシニミド;3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4-オン;5-クロロ-8-ヒドロキシキノリン;N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸イミド;ペンタフルオロフェノール;p-スルホテトラフルオロフェノール;N-ヒドロキシフタルイミド;1-ヒドロキシベンゾトリアゾール;1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール;N-ヒドロキシマレイミド;4-ヒドロキシ-3-ニトロベンゼンスルホン酸のエステル、又は当該技術分野で知られている任意の他の活性化エステルである、実施形態286の中間生成物。
288.
a)化学式2、化学式3及び化学式4
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分、並びに
b)化学式5b、化学式6及び化学式7
化学式5b:
化学式6a:
及び/又は化学式7a:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数、PGは保護基)から選択されるリンカーを含み、持続時間延長性部分の*-COOH基が存在する場合、任意選択で好ましくは当該技術分野で知られているようにまた保護されている、好ましくは非反応性エステルとして官能化されている、実施形態285〜287のいずれか1つの中間生成物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
289. リンカーが実施形態1〜57のいずれか1つにおいて規定される、実施形態285〜288のいずれか1つの中間生成物。
290. 持続時間延長性部分が実施形態1〜87のいずれか1つにおいて規定される、実施形態285〜289のいずれか1つの中間生成物。
291.
a)化学式2、化学式3及び化学式4
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分、並びに
b)化学式5b
化学式5b:
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数、PGは保護基)を含むリンカーを含み、好ましくはこれらからなり、持続時間延長性部分の遠位の*-COOH基がもしあるならば任意選択で当該技術分野で知られているようにまた保護されている、好ましくは非反応性エステルの形成下で、より好ましくはi)フェノールのエステルなどアルコールとかさ高い側鎖とのエステルであって、任意選択で置換されているエステル;又はii)分枝のアルキル、好ましくは低級アルキルのエステルの形成下で保護されている、最も好ましくはOtBu、OBz等として保護されている中間生成物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
292.
化学式69:
化学式70:
化学式71:
化学式72:
化学式73:
化学式74:
化学式75:
化学式76:
化学式77:
化学式78:
化学式79:
化学式80:
化学式81:
化学式82:
及び化学式83:
から選択され、持続時間延長性部分の1つ又は複数の*-COOH基、好ましくは遠位の*-COOH基が任意選択でまた保護されている、好ましくは実施形態285〜291のいずれか1つの中間生成物。
293. 薬剤としての使用のための、実施形態1〜274のいずれか1つの誘導体。
294. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防における使用のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、実施形態1〜274のいずれか1つの誘導体。
295. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための薬剤の製造における、実施形態1〜274のいずれか1つの誘導体の使用。
296. 実施形態1〜274のいずれか1つの誘導体の薬学的な活性量を投与することによる、全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患を治療若しくは予防する方法、並びに/又は脂質パラメーターを改善、β細胞機能を改善する方法、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防する方法。
297. 化学式2、化学式3及び化学式4
化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含むGLP-1アナログの誘導体、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
298. GLP-1アナログが実施形態1〜296のいずれか1つに規定される、実施形態297の誘導体。
299. 持続時間延長性部分が実施形態1〜296のいずれか1つに規定される、実施形態297〜298のいずれか1つの誘導体。
300. リンカー、好ましくは実施形態1〜296のいずれか1つに規定されるリンカーをさらに含む、実施形態297〜299のいずれか1つの誘導体。
付加的な特定の実施形態
以下は本発明の付加的な特定の実施形態である。
1. GLP-1アナログの誘導体であって、GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して変化したアミノ酸残基を6個まで持つK37-GLP-1(7-37)又はそのアナログであり、誘導体がそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、アルブミン結合部分がHOOC-(CH2)n-CO-、HOOC-C6H4-O-(CH2)m-CO-、及びR1-C6H4-(CH2)p-CO-(式中nは8〜16の範囲の整数、mは7〜17の範囲の整数、pは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基)から選択される持続時間延長性部分を含む、GLP-1アナログの誘導体、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
2. nが偶数である、実施形態1の誘導体。
3. nが8、10、12、14又は16、好ましくは10、12又は14である、実施形態2の誘導体。
4. mが奇数である、実施形態1の誘導体。
5. mが7、9、11、13、15又は17、好ましくは9、11又は15、最も好ましくは9である、実施形態4の誘導体。
6. pが奇数である、実施形態1の誘導体。
7. pが1、3又は5、好ましくは3である、実施形態6の誘導体。
8. COOH基がメタ位又はパラ位に、好ましくはパラ位にある、実施形態1及び4〜5のいずれか1つの誘導体。
9. R1が130Da以下の、好ましくは100Da以下の、より好ましくは75Da以下の、一層より好ましくは60Da以下の、又は最も好ましくは50Da以下のモル質量を持つ、実施形態1〜8のいずれか1つの誘導体。
10. R1が40Da以下の、好ましくは30Da以下の、より好ましくは20Da以下の、又は最も好ましくは15Da以下のモル質量を持つ、実施形態1〜9のいずれか1つの誘導体。
11. R1がハロゲン及び1〜5個のC原子を持つ直鎖又は分枝のアルキルから選択される、実施形態1〜10のいずれか1つの誘導体。
12. R1がメチル又はtert-ブチルである、実施形態1及び6〜7のいずれか1つの誘導体。
13. R1がパラ位にある、実施形態12の誘導体。
14. R1が-Iである、実施形態1及び6〜7のいずれか1つの誘導体。
15. R1がパラ位にある、実施形態14の誘導体。
16. GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して最大で5個、好ましくは最大で4個、より好ましくは最大で3個、又は最も好ましくは最大で2個のアミノ酸変化を持つ、実施形態1〜15のいずれか1つの誘導体。
17. GLP-1アナログがC末端のアミドを持つ、実施形態1〜16のいずれか1つの誘導体。
18. GLP-1アナログがC末端の-COOH基、又は薬学的に許容されるその塩を持つ、実施形態1〜16のいずれか1つの誘導体。
19. GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して少なくとも1つの欠失を含む、実施形態1〜18のいずれか1つの誘導体。
20. アナログが好ましくはdes7、des8又は(des7+des8)、より好ましくはdes7又は(des7+des8)を含むように、GLP-1アナログのN末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失されている、実施形態1〜19のいずれか1つの誘導体。
21. GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して変化したアミノ酸残基を6個まで持つGLP-1(8-37)又はGLP-1(9-37)のアナログである、実施形態1〜20のいずれか1つの誘導体。
22. GLP-1アナログが、(i)K37-GLP-1(7-37)、(ii)K37-GLP-1(8-37)、(iii)K37-GLP-1(9-37)、又は(iv)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して変化したアミノ酸残基を6個まで持つ(i)〜(iii)のいずれか1つのアナログから選択される、実施形態1〜21のいずれか1つの誘導体。
23. His模倣物又はHis-Ala模倣物が新たなN末端アミノ酸に加えられている、実施形態20〜21又は22(ii)〜(iv)のいずれか1つの誘導体。
24. 遊離カルボン酸基を有するイミダゾールの誘導体が、好ましくは遊離カルボン酸基とN末端アミノ基との間のアミド結合の形成を通じて、N末端に共有結合でカップリングされている、実施形態20〜23のいずれか1つの誘導体。
25. イミダゾール誘導体が一置換イミダゾールである、実施形態24の誘導体。
26. イミダゾールが1個から6個までの炭素原子を持つ低級アルキルのカルボン酸ラジカルで置換される、実施形態25の誘導体。
27. カルボン酸ラジカルがアセチル及び直鎖又は分枝のプロピオニル、ブチリル、ペンタノイルから選択され、好ましくはアセチルである、実施形態26の誘導体。
28. GLP-1アナログの8位におけるアミノ酸残基のN原子に3H-イミダゾール-4-イル-アセチルが付着されている、実施形態1〜27のいずれか1つの誘導体。
29. GLP-1アナログの8位におけるアミノ酸残基がアラニンである、実施形態1〜28のいずれか1つの誘導体。
30. イミダゾールが(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(プロピルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル又は(ブチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換される、実施形態25の誘導体。
31. イミダゾールが(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル又は(プロピルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで、好ましくは(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換される、実施形態30の誘導体。
32. GLP-1アナログの9位におけるアミノ酸残基のN原子に{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}が付着されている、実施形態1〜31のいずれか1つの誘導体。
33.GLP-1アナログの9位におけるアミノ酸残基がグルタミン酸である、実施形態1〜32のいずれか1つの誘導体。
34. 37Kに加えて、8Aib;31H;34E、Q、R及び/又は38Eのうち少なくとも1つの置換を含む、実施形態1〜33のいずれか1つの誘導体。
35. 8Aibを含む、実施形態34の誘導体。
36. 34E、34Q又は34R、好ましくは34Rを含む、実施形態34の誘導体。
37. 34Rをさらに含む、実施形態35の誘導体。
38. 31Hを含む、実施形態34の誘導体。
39. 31H及び/又は34Q、好ましくは両者をさらに含む、実施形態35の誘導体。
40. 34Rを含む、実施形態34の誘導体。
41. 38Eを含む、実施形態34の誘導体。
42. 38Eをさらに含む、実施形態37の誘導体。
43. 2つのアルブミン結合部分が類似している、好ましくは実質的に同一、又は最も好ましくは同一である、実施形態1〜42のいずれか1つの誘導体。
44. 2つの持続時間延長性部分が類似している、好ましくは実質的に同一、又は最も好ましくは同一である、実施形態1〜43のいずれか1つの誘導体。
45. 2つのアルブミン結合部分及び/又は2つの持続時間延長性部分が少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、又は一層好ましくは少なくとも95%、又は最も好ましくは少なくとも99%の同一性パーセンテージを持つ、実施形態1〜44のいずれか1つの誘導体。
46. 同一性パーセンテージがTanimoto類似性係数及びECFP_6拡張連結性フィンガープリントを使用したデータモデリングを用いて決定される、実施形態45の誘導体。
47. アルブミン結合部分がそれぞれ26位及び37位のリジン残基のイプシロンアミノ基にアミド結合を通じて、任意選択でリンカー部分を通じて付着されている、実施形態1〜46のいずれか1つの誘導体。
48. アルブミン結合部分がリンカー部分を含み、リンカー部分が一方の末端においてアミド結合を通じて持続時間延長性部分のCO-基に付着され、他方の末端においてアミド結合を通じて26位及び37位のリジン残基のイプシロンアミノ基に付着されている、実施形態1〜47のいずれか1つの誘導体。
49. リンカー部分が5個から30個までのC原子、好ましくは5個から25個までのC原子、より好ましくは5個から20個までのC原子、又は最も好ましくは5個から17個までのC原子を持つ、実施形態47〜48のいずれか1つの誘導体。
50. リンカー部分が4個から20個までのヘテロ原子、好ましくは4個から18個までのヘテロ原子、より好ましくは4個から14個までのヘテロ原子、又は最も好ましくは4個から12個までのヘテロ原子を持つ、実施形態47〜49のいずれか1つの誘導体。
51. ヘテロ原子がN原子及び/又はO原子である、実施形態50の誘導体。
52. リンカー部分が
から選択される、実施形態47〜51のいずれか1つの誘導体。
53. リンカー部分が少なくとも1つのOEGラジカル、及び/又は少なくとも1つのGlu(グルタミン酸)ラジカルを含む、実施形態47〜52のいずれか1つの誘導体。
54. リンカーが1つのOEGラジカル又は1つのGluラジカルからなり、リンカーのガンマ-カルボン酸基が好ましくはリジン残基のイプシロンアミノ基とアミド結合を形成する、実施形態53の誘導体。
55. リンカーが2つのOEGラジカル又は2つのGluラジカルからなる実施形態53の誘導体であって、ラジカルがアミド結合を通じて相互連結されており、そのため好ましくは2つのGluラジカルの場合、一方のGluのガンマ-カルボン酸基がリジン残基のイプシロンアミノ基とアミド結合を形成し、又は-より好ましくは「及び」-、他方のGluのガンマ-カルボン酸基が第一のGluのアミノ基とアミド結合を形成する、誘導体。
56. リンカーが少なくとも1つのOEGラジカル及び少なくとも1つのGluラジカルを含む実施形態53の誘導体であって、好ましくはいずれか1つ、より好ましくはOEGラジカルのカルボキシ末端でリジン残基のイプシロンアミノ基とアミド結合を形成し、OEGラジカルのアミノ末端でGluラジカルのガンマカルボキシ基とアミド結合を形成する、誘導体。
57. リンカーが1つのGluラジカル及び2つのOEGラジカルからなり、好ましくは-Glu-OEG-OEG-、-OEG-Glu-OEG-、及び-OEG-OEG-Glu-から選択される実施形態56の誘導体であって、左端のラジカルのアミノ基が持続時間延長性部分とアミド結合を形成し、右端のラジカルのカルボキシ基がリジン残基のイプシロンアミノ基とアミド結合を形成し、好ましくは右末端にあるGluラジカルの場合、そのガンマ-カルボキシ基がアミド結合に用いられる、誘導体。
58. 3000pM以下、好ましくは3000pMより低い、より好ましくは2500pMより低い、一層より好ましくは2000pMより低い、又は最も好ましくは1500pMより低い効力(EC50)を持つ、実施形態1〜57のいずれか1つの誘導体。
59. 1000pMより低い、好ましくは800pMより低い、より好ましくは600pMより低い、一層より好ましくは400pMより低い、又は最も好ましくは200pMより低い効力(EC50)を持つ、実施形態1〜58のいずれか1つの誘導体。
60. 180pMより低い、好ましくは160pMより低い、より好ましくは140pMより低い、一層より好ましくは120pMより低い、又は最も好ましくは100pMより低い効力(EC50)を持つ、実施形態1〜59のいずれか1つの誘導体。
61. 80pMより低い、好ましくは60pMより低い、より好ましくは50pMより低い、一層より好ましくは40pM以下、又は最も好ましくは30pMより低い効力(EC50)を持つ、実施形態1〜60のいずれか1つの誘導体。
62. 効力がヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMP形成の刺激として、好ましくはBHK467-12A(tk-ts13)などの安定的に形質導入された細胞株を用いて、及び/又はcAMPの決定のために機能受容体アッセイを用いて決定される、実施形態58〜61のいずれか1つの誘導体であって、前記アッセイが例として内因的に形成されたcAMPと外因的に追加されたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づくものであり、前記アッセイにおいてcAMPはより好ましくは特異的な抗体を用いて捕捉され、及び/又は一層より好ましくは前記アッセイがAlphaScreen cAMP Assayであり、最も好ましくは実施例50に記載されるアッセイである、誘導体。
63. 効力(EC50)がセマグルチドの効力の10倍より小さい、好ましくはセマグルチドの効力の8倍より小さい、より好ましくはセマグルチドの効力の6倍より小さい、一層より好ましくはセマグルチドの効力の4倍より小さい、又は最も好ましくはセマグルチドの効力の2倍より小さい、実施形態1〜62のいずれか1つの誘導体。
64. 効力(EC50)がリラグルチドの効力の10倍より小さい、好ましくはリラグルチドの効力の8倍より小さい、より好ましくはリラグルチドの効力の6倍より小さい、一層より好ましくはリラグルチドの効力の4倍より小さい、又は最も好ましくはリラグルチドの効力の2倍より小さい、実施形態1〜63のいずれか1つの誘導体。
65. 効力(EC50)がリラグルチドの効力より小さい、好ましくはリラグルチドの効力の0.8倍より小さい、より好ましくはリラグルチドの効力の0.6倍より小さい、一層より好ましくはリラグルチドの効力の0.5倍より小さい、又は最も好ましくはリラグルチドの効力の0.4倍より小さい、実施形態1〜64のいずれか1つの誘導体。
66. 比率[0.005%ヒト血清アルブミン(HSA)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)で除算された2.0% HSA存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)]が少なくとも1、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも20、一層より好ましくは少なくとも30、又は最も好ましくは少なくとも40である、実施形態1〜65のいずれか1つの誘導体。
67. 比率[0.005%ヒト血清アルブミン(HSA)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)で除算された2.0% HSA存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)]が少なくとも50、好ましくは少なくとも60、より好ましくは少なくとも70、一層より好ましくは少なくとも80、又は最も好ましくは少なくとも90である、実施形態1〜66のいずれか1つの誘導体。
68. 比率[0.005%ヒト血清アルブミン(HSA)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)で除算された2.0% HSA存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)]が少なくとも100、好ましくは少なくとも120、より好ましくは少なくとも140、なおより好ましくは少なくとも160、一層より好ましくは少なくとも180、又は最も好ましくは少なくとも200である、実施形態1〜67のいずれか1つの誘導体。
69. GLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)が受容体から125I-GLP-1を転置させる能力として測定される、実施形態1〜68のいずれか1つの誘導体であって、受容体が好ましくはヒトGLP-1受容体を形質導入されたBHK tk-ts13などの安定的な細胞株由来の膜の形で提供され、及び/又はSPA結合アッセイを用いて、好ましくはコムギ胚芽凝集素のSPAビーズなどのSPA粒子を利用して、結合アッセイが最も好ましくは実施例51に記載されるように行われる、誘導体。
70. 比率[0.005%ヒト血清アルブミン(HSA)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)で除算された2.0% HSA存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)]がセマグルチドの比率の少なくとも20%、好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも50%、より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも75%、又は最も好ましくはセマグルチドの比率と少なくとも等しい、実施形態1〜69のいずれか1つの誘導体。
71. 比率[0.005%ヒト血清アルブミン(HSA)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)で除算された2.0% HSA存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)]がリラグルチドの比率と少なくとも等しい、好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも2倍、より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも3倍、一層より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも4倍、又は最も好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも5倍である、実施形態1〜70のいずれか1つの誘導体。
72. 相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)が0.5より大きい、好ましくは1.0より大きい、より好ましくは2.0より大きい、一層より好ましくは3.0より大きい、又は最も好ましくは4.0より大きい、実施形態1〜71のいずれか1つの誘導体。
73. 相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)が5.0より大きい、好ましくは6.0より大きい、より好ましくは7.0より大きい、又は最も好ましくは8.0より大きい、実施形態1〜72のいずれか1つの誘導体。
74. ラット小腸抽出物が実施例57に記載されるように調製され、誘導体が37℃で1時間インキュベートされ、抽出物の濃度がGLP-1(7-37)の半減期が10〜20分の範囲になるように、例として1.4ug/mlに設定され、結果として生じるサンプルがUPLC及び/若しくはMALDI-TOFにより分析される、並びに/又はインキュベーション及び分析が実施例57に記載されるように行われる、実施形態72〜73のいずれか1つの誘導体。
75. 比率[GLP-1(7-37)のラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのインビトロの半減期(T1/2)]が、相当するセマグルチドの比率の少なくとも0.5倍、好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも2倍、より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも3倍、一層より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも5倍、又は最も好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも7倍である、実施形態1〜74のいずれか1つの誘導体。
76. 比率[GLP-1(7-37)のラット小腸抽出物中での半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中での半減期(T1/2)]が、相当するリラグルチドの比率の少なくとも0.1倍、好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも0.4倍、より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも0.8倍、一層より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも1.2倍、又は最も好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも1.5倍である、実施形態1〜75のいずれか1つの誘導体。
76. 静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)が少なくとも4時間、好ましくは少なくとも6時間、一層より好ましくは少なくとも8時間、又は最も好ましくは少なくとも10時間である、実施形態1〜75のいずれか1つの誘導体。
77. 静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)が少なくとも12時間、好ましくは少なくとも15時間、一層より好ましくは少なくとも18時間、又は最も好ましくは少なくとも20時間である、実施形態1〜76のいずれか1つの誘導体。
78. ラットが体重300gから600gまでの雄性Sprague Dawleyラットである、実施形態76〜77のいずれか1つの誘導体。
79. 静脈内投与後のラットにおけるインビボの半減期(T1/2)がセマグルチドの半減期と少なくとも同じ、好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも2倍、より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも3倍、一層より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも4倍、又は最も好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも5倍である、実施形態1〜78のいずれか1つの誘導体。
80. 静脈内投与後のミニブタにおけるインビボの半減期(T1/2)が少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも36時間、一層より好ましくは少なくとも48時間、又は最も好ましくは少なくとも60時間である、実施形態1〜79のいずれか1つの誘導体。
81. ミニブタが雄性Gottingenミニブタである、実施形態80の誘導体。
82. 静脈内投与後のミニブタにおけるインビボの半減期(T1/2)がセマグルチドの半減期の少なくとも0.2倍、好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.4倍、より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.6倍、一層より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.8倍、又は最も好ましくはセマグルチドの半減期と少なくとも同じである、実施形態1〜81のいずれか1つの誘導体。
83. (i)Nε26-[2-(2-{2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(ii)Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(iii)Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(iv)Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(v)Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(vi)Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチドアミド:
(vii)Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチドアミド:
(iix)Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチドアミド:
(ix)Nε26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチドアミド:
(x)Nε26-[2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]]、Nε37-[2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチドアミド:
(xi)Nε26-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)、Nε37-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチドアミド:
(xii)Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xiii)Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(4-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(4-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xiv)Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(3-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(3-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xv)Nε26-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)-エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xvi)Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xvii)Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(iixx)Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-メチルフェニル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-メチルフェニル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]-アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(ixx)Nε26-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリル)、Nε37-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリル)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xx)Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xxi)Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xxii)N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}、Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチド:
(xxiii)N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド:
(xxiv)Nε26-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xxv)Nε26-[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル]、Nε37-[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
(xxvi)Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチル-フェニル)-ブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチル-フェニル)-ブチリルアミノ]-4-カルボキシ-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド:
及び
(xxvii)N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチルフェニル)ブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチルフェニル)ブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド:
から選択されるGLP-1誘導体、又は薬学的に許容される誘導体(i)〜(xxvii)の任意の塩、アミド若しくはエステル。
84. 薬剤としての使用のための、実施形態1〜83のいずれか1つの誘導体。
85. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防における使用のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、実施形態1〜83のいずれか1つの誘導体。
86. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための薬剤の製造における、実施形態1〜83のいずれか1つの誘導体の使用。
87. 実施形態1〜83のいずれか1つの誘導体の薬学的な活性量を投与することによる、全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患を治療若しくは予防する方法、並びに/又は脂質パラメーターを改善、β細胞機能を改善する方法、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防する方法。
(実施例)
本実施例部は略語の表で始まり、本発明のアナログ及び誘導体を合成して性質決定する一般的な方法を包含する節が続く。次いで特定のGLP-1誘導体の調製に関するいくつかの実施例が続き、最後にこれらのアナログ及び誘導体の活性及び性質に関するいくつかの実施例が包含される(薬理学的方法という見出しの節)。
実施例は本発明を例証するのに役立つ。
略語
次の略語(アルファベット順)が以下で用いられる。
Aib: アミノイソ酪酸(α-アミノイソ酪酸)
API: 医薬品有効成分
AUC: 曲線下面積
BG: 血糖
BHK ベビーハムスター腎臓
BW: 体重
Bom: ベンジルオキシメチル
Boc: t-ブチルオキシカルボニル
BSA: ウシ血清アルブミン
Bzl: ベンジル
Clt: 2-クロロトリチル
コリジン: 2,4,6-トリメチルピリジン
DCM: ジクロロメタン
Dde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMAP: 4-ジメチルアミノピリジン
DMEM: ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
EDTA: エチレンジアミン四酢酸
EGTA: エチレングリコール四酢酸
FCS: ウシ胎児血清
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU: (O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU: (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES: 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール又はヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
HSA: ヒト血清アルブミン
IBMX: 3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp: イミダゾプロピオン酸(des-アミノヒスチジン、DesHとも呼ばれる)
i.v. 静脈内
ivDde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT: 静脈内耐糖能試験
LCMS: 液体クロマトグラフィー質量分析
LYD: ランドレースヨークシャーデュロック
MALDI-MS: MALDI-TOF MSを参照
MALDI-TOF MS: マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析
MeOH: メタノール
Mmt: 4-メトキシトリチル
Mtt: 4-メチルトリチル
NMP: N-メチルピロリドン
OBz: ベンゾイルエステル
OEG: 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OPfp: ペンタフルオロフェノキシ
OPnp: パラ-ニトロフェノキシ
OSu: O-サクシニミジルエステル(ヒドロキシサクシニミドエステル)
OSuc: 2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル
OtBu: tertブチルエステル
Pbf: 2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS: リン酸緩衝生理食塩水
PD: 薬力学
Pen/Strep: ペニシリン/ストレプトマイシン
PK: 薬物動態
RP: 逆相
RP-HPLC: 逆相高速液体クロマトグラフィー
RT: 室温
Rt: 保持時間
s.c.: 皮下
SD: 標準偏差
SEC-HPLC: サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM: 平均値の標準誤差
SPA: シンチレーション近接アッセイ
SPPS: 固相ペプチド合成
tBu: tert-ブチル
TFA: トリフルオロ酢酸
TIS: トリイソプロピルシラン
TLC: 薄層クロマトグラフィー
Tos: トシレート(又はパラ-トルエンスルホニル)
Tris: トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン又は2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt: トリフェニルメチル又はトリチル
Trx: トラネキサム酸
UPLC: 超高速液体クロマトグラフィー
調製の方法
A.一般的方法
この節は、固相ペプチド合成の方法(SPPS法。アミノ酸の脱保護の方法、樹脂からペプチドを切断する方法、及びその精製方法を包含する)、同様に結果として生じるペプチドを検出して性質決定する方法(LCMS法、MALDI法、及びUPLC法)に関する。ペプチドの固相合成は、酸性条件下で切断できる基とのジペプチドアミド結合上で保護されるジペプチドの使用により、場合によっては改善可能であって、この酸性条件下で切断できる基は2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル又は2,4,6-トリメトキシベンジルなどであるが、これらに限定されない。セリン又はスレオニンがペプチド中に存在する場合、擬プロリンジペプチドが用いられ得る(例としてNovabiochemから入手可能、W.R.Sampson(1999)、J.Pep.Sci.5、403ページも参照)。用いられた保護アミノ酸誘導体は標準的なFmoc-アミノ酸(例としてAnaspec、IRIS又はNovabiochemから供給されたもの)であった。N末端アミノ酸はアルファアミノ基においてBoc保護された(例としてN末端にHisを有するペプチドについてBoc-His(Boc)-OH、又はBoc-His(Trt)-OH)。配列中のリジンのイプシロンアミノ基は、アルブミン結合部分及びスペーサーの付着経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDde又はBocのいずれかで保護された。アルブミン結合部分及び/又はリンカーは、樹脂に結合したペプチドのアシル化、又は保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかによりペプチドに付着できる。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分及び/又はリンカーの付着の場合、付着はSPPS及び適切に保護された構成ブロックを用いたモジュール式であることができ、この構成ブロックはFmoc-Oeg-OH(Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-トラネキサム酸)、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル又は4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されない。
1.樹脂結合ペプチドの合成
SPPS法A
SPPS法Aは、Fmoc化学を用いて、Applied Biosystems 433ペプチド合成装置(ABI433A合成装置とも示される)上で、0.25mmol又は1.0mmol規模で、NMP中でのHBTU又はHATU仲介性カップリング及びFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを利用する製造業者のFastMoc UVプロトコールを用いる、保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。
ペプチドアミドの合成に用いられる開始樹脂は、適切なRink-Amide樹脂(ペプチドアミド用)又は(カルボキシC末端を持つペプチド用には)適切なWang樹脂若しくは適切なクロロトリチル樹脂のいずれかであった。適切な樹脂は、例としてNovabiochemから市販されている。
SPPS法B
SPPS法Bは、Fmoc化学を用いた、マイクロ波に基づくLibertyペプチド合成装置(CEM Corp.、North Carolina)上での保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め充填された低充填Wang樹脂(例として低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc-脱保護は5%ピペリジンのNMP溶液を使用して、70℃又は75℃以下であった。カップリング化学はDIC/HOAtのNMP溶液であった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3MのNMP溶液、3〜10倍モル過剰)が樹脂に添加され、その後、同じモル当量のDIC(0.75MのNMP溶液)が添加された。例えば、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液が、以下の規模の反応についてのカップリングごとに用いられた:規模/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml、1mmol/15ml。カップリング時間及び温度は一般に5分間、70℃又は75℃以下であった。より規模の大きい反応については、より長いカップリング時間、例えば10分間が用いられた。ヒスチジンアミノ酸は50℃で二重にカップリングされ、又は前のアミノ酸が立体障害を持つ場合(例としてAib)は四重にカップリングされた。アルギニンアミノ酸は室温で25分間カップリングされ、次いで70℃又は75℃で5分間加熱された。Aibなどであるがこれに限定されないいくらかのアミノ酸は「二重にカップリングされた」が、これは最初のカップリング(例として75℃で5分間)の後、樹脂が排出され、さらなる試薬(アミノ酸、HOAt及びDIC)が添加されて、混合物が再度加熱される(例として75℃で5分間)ことを意味する。リジン側鎖の化学的修飾が望まれる場合、リジンはLys(Mtt)として組み込まれた。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、樹脂を原液の(希釈されていない)ヘキサフルオロイソプロパノール中に20分間懸濁し、その後DCM及びNMPで洗浄することにより除去された。リジンの化学的修飾は、手作業の合成(SPPS法Dを参照)、又は上記のLibertyペプチド合成装置上での1つ若しくは複数の自動化ステップのいずれかにより、適切に保護された構成ブロックを用いて(一般的方法を参照)、任意選択で手作業のカップリングを包含して、行われた。
SPPS法D
SPPS法Dは、手作業のFmoc化学を用いた、保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。これはペプチド骨格へのリンカー及び側鎖の付着に典型的に用いられた。以下の条件は0.25mmolの合成規模で利用された。カップリング化学は4〜10倍モル過剰の、DIC/HOAt/コリジンのNMP溶液であった。カップリング条件は室温で1〜6時間であった。Fmoc-脱保護は20〜25%ピペリジンのNMP溶液を使用して行われ(3×20ml、各10分間)、その後、NMP洗浄(4×20mL)が行われた。Dde-脱保護又はivDde-脱保護は2%ヒドラジンのNMP溶液を使用して行われ(2×20ml、各10分間)、その後、NMP洗浄(4×20mL)が行われた。Mtt-脱保護又はMmt-脱保護は2% TFA及び2〜3% TISのDCM溶液を使用して行われ(5×20ml、各10分間)、その後、DCM洗浄(2×20ml)、10%メタノール及び5% DIPEAのDCM溶液での洗浄(2×20ml)及びNMP洗浄(4×20ml)が行われるか、又は原液のヘキサフルオロイソプロパノールでの処理(5×20ml、各々10分間)が行われ、その後、上の洗浄が行われた。アルブミン結合部分及び/又はリンカーは、樹脂に結合したペプチドのアシル化、又は保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかにより、ペプチドに付着できる(下に記載される経路を参照)。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分及び/又はリンカーの付着の場合、付着はSPPS及び適切に保護された構成ブロックを用いたモジュール式であることができる(一般的方法を参照)。
樹脂に結合したペプチドへの付着-経路I:オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600、樹脂に結合したペプチドに対して4モル当量)などの活性化された(活性エステル若しくは対称的無水物)アルブミン結合部分又はリンカーは、NMP(25mL)中に溶解され、樹脂に添加され、室温で一晩振とうされた。反応混合物はろ過され、樹脂はNMP、DCM、2-プロパノール、メタノール及びジエチルエーテルで十分に洗浄された。
樹脂に結合したペプチドへの付着-経路II:アルブミン結合部分はNMP/DCM中に溶解された(1:1、10ml)。HOBt(樹脂に対して4モル当量)及びDIC(樹脂に対して4モル当量)などの活性化試薬が添加され、溶液は15分間撹拌された。溶液は樹脂に添加され、DIPEA(樹脂に対して4モル当量)が添加された。樹脂は室温で2〜24時間振とうされた。樹脂はNMP(2×20ml)、NMP/DCM(1:1、2×20ml)及びDCM(2×20ml)で洗浄された。
溶液中のペプチドへの付着-経路III:オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600)などの活性化された(活性エステル若しくは対称的無水物)アルブミン結合部分又はリンカーは、ペプチドに対して1〜1.5モル当量がアセトニトリル、THF、DMF、DMSOなどの有機溶媒中に、又は水/有機溶媒の混合物(1〜2ml)中に溶解され、ペプチド水溶液(10〜20ml)に10モル当量のDIPEAと共に添加された。tert-ブチルなどのアルブミン結合残基上の保護基の場合、反応混合物は一晩凍結乾燥され、単離された粗ペプチドは後で脱保護された。tert-ブチル保護基の場合、脱保護はトリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシランの混合物(90:5:5)中にペプチドを溶解することにより行われた。30分後、混合物は減圧下で蒸発されて、粗ペプチドは後記の調製用HPLCにより精製された。
SPPS法E
SPPS法Eは、Fmoc化学による、Protein Technologies社(Tucson、AZ85714 U.S.A.)のPrelude Solid Peptide Synthesiser上でのペプチド合成をいう。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め充填された低充填Wang樹脂(例として低充填fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc-脱保護は25%ピペリジンのNMP溶液を使用して、2×10分間であった。カップリング化学はDIC/HOAt/コリジンのNMP溶液であった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3MのNMP溶液、3〜10倍モル過剰)が樹脂に添加され、その後、同じモル当量のDIC(3MのNMP溶液)及びコリジン(3MのNMP溶液)が添加された。例えば、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液が、以下の規模の反応についてのカップリングごとに用いられた:規模/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml。カップリング時間は一般に60分間であった。アルギニン、Aib又はヒスチジンを包含するがこれらに限定されないいくらかのアミノ酸は「二重にカップリングされた」が、これは最初のカップリング(例として60分間)の後、樹脂が排出され、さらなる試薬(アミノ酸、HOAt、DIC及びコリジン)が添加されて、混合物が再度反応される(例として60分間)ことを意味する。Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Trx-OH、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル又は4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルを包含するがこれらに限定されない、いくらかのアミノ酸及び脂肪酸誘導体は、より長い時間、例えば6時間カップリングされた。リジン側鎖の化学的修飾が望まれる場合、リジンはLys(Mtt)として組み込まれた。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、樹脂をヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)中に3×10分間懸濁し、その後DCM、20%ピペリジン及びNMPで洗浄することにより除去された。リジンの化学的修飾は、手作業の合成(SPPS法Dを参照)、又は上記のPreludeペプチド合成装置上での1つ若しくは複数の自動化ステップのいずれかにより、適切に保護された構成ブロックを用いて(一般的方法を参照)、行われた。
2.樹脂からのペプチドの切断及び精製
合成後に樹脂はDCMで洗浄され、ペプチドは2〜3時間のTFA/TIS/水(95/2.5/2.5又は92.5/5/2.5)での処理により樹脂から切断され、その後、ジエチルエーテルを使用して沈殿された。ペプチドは適切な溶媒(例として30%酢酸など)中に溶解され、C18、5μMカラムに対してアセトニトリル/水/TFAを用いた標準的なRP-HPLCにより精製された。画分はUPLC法、MALDI法及びLCMS法の組み合わせにより分析され、適当な画分がプールされて凍結乾燥された。
3.検出及び性質決定の方法
LCMS法
LCMS法1(LCMS1)
Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)質量分析装置はAgilent 1200シリーズHPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。タンパク質スペクトルの逆重畳はAgilent社のタンパク質確認ソフトウェアを使用して計算された。
溶出液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.1%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Zorbax 5u、300SB-C3、4.8×50mm
グラジエント:25%〜95%アセトニトリルの15分間
LCMS法2(LCMS2)
Perkin Elmer Sciex API 3000質量分析装置はPerkin Elmer Series 200 HPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。
溶出液:
A:0.05%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.05%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm id 5μm
グラジエント:5%〜90%アセトニトリルの7.5分間、1.5ml/分
LCMS法3(LCMS3)
Waters Micromass ZQ質量分析装置はWaters Alliance HT HPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。
溶出液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.1%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Phenomenex、Jupiter C4 50×4.60mm id 5μm
グラジエント:10%〜90% Bの7.5分間、1.0ml/分
LCMS法4(LCMS4)
LCMS4はWaters Acquity UPLCシステム及びMicromass社のLCT Premier XE質量分析装置からなる構成上で行われた。UPLCポンプは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.1%ギ酸水溶液
B:0.1%ギ酸のアセトニトリル溶液
分析は室温で適当な量のサンプル(好ましくは2〜10μl)をカラム上に注入することにより行われ、A及びBのグラジエントを使用して溶出された。UPLC条件、検出器の設定及び質量分析装置の設定は以下であった。
カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mm
グラジエント:5%〜95%アセトニトリルの4.0分間(或いは8.0分間)のリニアグラジエント、0.4ml/分
検出:214nm(TUV(可変同調UV検出器)からのアナログ出力)
MSイオン化モード:API-ES
スキャン:100〜2000amu(或いは500〜2000amu)、ステップ0.1amu
UPLC法及びHPLC法
方法 05 B5 1
UPLC(方法05_B5_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
60% A、40% Bから30% A、70% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 05 B7 1
UPLC(方法05_B7_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
80% A、20% Bから40% A、60% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 04 A2 1
UPLC(方法04_A2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
90% A、10% Bから60% A、40% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 04 A3 1
UPLC(方法04_A3_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
75% A、25% Bから45% A、55% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 04 A4 1
UPLC(方法04_A4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
65% A、35% Bから25% A、65% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 08 B2 1
UPLC(方法08_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから40% A、60% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 08 B4 1
UPLC(方法08_B4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから95% A、5% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 05 B10 1
UPLC(方法05 B10 1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
40% A、60% Bから20% A、80% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 01 A4 2
UPLC(方法01_A4_2):RP分析はwaters 996ダイオードアレイ検出器を取り付けたWaters 600Sシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はSymmetry300 C18、5um、3.9mm×150mmカラムを用いて、42℃で収集された。HPLCシステムは以下を含有する3つの溶出液リザーバーに連結された。
A:100% H2O、B:100% CH3CN、C:1%トリフルオロ酢酸水溶液
90% A、5% B、5% Cから0% A、95% B、5% Cの15分間、流速1.0ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 09 B2 1
UPLC(方法09_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから40% A、60% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 09 B4 1
UPLC(方法09_B4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから5% A、95% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 05 B8 1
UPLC(方法05_B8_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
50% A、50% Bから20% A、80% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 10 B14 1
UPLC(方法10_B14_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH Shield RP18、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、50℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
70% A、30% Bから40% A、60% Bの12分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法 04 A6 1
UPLC(方法04_A6_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:10mM TRIS、15mM硫酸アンモニウム、80% H2O、20%、pH7.3
B:80% CH3CN、20% H2O
95% A、5% Bから10% A、90% Bの16分間、流速0.35ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法01 B4 1
HPLC(方法01_B4_1):RP分析はWaters 996ダイオードアレイ検出器を取り付けたWaters 600Sシステムを用いて行われた。UV検出値はWaters 3mm×150mm 3.5um C-18 Symmetryカラムを用いて収集された。カラムは42℃に加熱され、5〜95%アセトニトリル、90〜0%水、及び5%トリフルオロ酢酸(1.0%)水溶液の15分間のリニアグラジエントを使用して、流速1ml/分で溶出された。
MALDI-MS法
分子量はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析を用いて決定され、Microflex又はAutoflex(Bruker)上に記録された。アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスが用いられた。
NMR法
プロトンNMRスペクトルはBrucker Avance DPX 300(300 MHz)を用いて、テトラメチルシランを内部標準として使用して、記録された。化学シフト(σ)はppmで与えられ、分裂パターンは、sが一重線、dが二重線、ddが二重の二重線、dtが二重の三重線、tが三重線、ttが三重の三重線、qが四重線、quintが五重線、sextが六重線、mが多重線、及びbr=ブロードで示される。
B.中間体の合成
1. 脂肪二酸のモノエステルの合成
C12、C14、C16及びC18の二酸をBoc無水物、DMAP及びt-ブタノールと共にトルエン中で一晩還流すると、t-ブチルモノエステルを優位に与える。集成後に取得されるのは一酸、二酸及びジエステルの混合物である。精製は洗浄、ショートプラグのシリカろ過及び結晶化により実施される。
2. 2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチルアミンの合成
化学式13:
無水メタノール(400mL)中のヒスタミン二塩酸塩(20.47g、0.111mol)及びトリエチルアミン(48mL、0.345mol)は室温で10分間撹拌された。メタノール(30mL)中のトリフルオロ酢酸エチルエステル(14.6mL、0.122mol)は0℃で30分間かけて液滴で添加された。反応混合物は室温で3.5時間撹拌され、次いで乾燥するまで減圧下で蒸発された。残渣はジクロロメタン(450mL)中に溶解され、トリエチルアミン(31mL、0.222mol)が添加された。次いで、トリチルクロライド(34.1g、0.122mol)が少しずつ添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。クロロホルム(400mL)及び水(600mL)が反応混合物中に注ぎ込まれた。水層は分離され、クロロホルム(3×400mL)で抽出された。合わせられた有機層は無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒は除去され、ベージュ色の固体はヘキサン(1000mL)を使用してすりつぶされた。懸濁液はろ過され、2,2,2-トリフルオロ-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-アセトアミドが白色の固体として得られた。
収率:45.54g(91%)
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 8.44 (bs, 1H); 7.43 (s, 1H); 7.41〜7.33 (m, 9H); 7.19〜7.10 (m, 6H); 6.65 (s, 1H); 3.66 (q, J=5.9Hz, 2H); 2.79 (t, J=5.9Hz, 2H)。
上のアミド(45.54g、0.101mmol)はテトラヒドロフラン(1000mL)及びメタノール(1200mL)中に溶解された。水酸化ナトリウム(20.26g、0.507mol)の水溶液(500mL)が添加された。混合物は室温で2時間撹拌され、次いで減圧濃縮された。残渣はクロロホルム(1200mL)と水(800mL)との間で分離された。水層はクロロホルム(3×400mL)で抽出された。有機層は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒の蒸発は茶色の油をもたらしたが、これは3日間減圧乾燥されて、標題の産物をベージュ色の固体として与えた。
収率:32.23g(90%)
全体収率:82%
M.p.:111〜113℃
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.39 (d, J=1.3, 1H); 7.38〜7.32 (m, 9H); 7.20〜7.12 (m, 6H); 6.61 (s, 1H); 3.00 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.70 (t, J=6.5Hz, 2H); 1.93 (bs, 2H)。
3. 2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸の合成
化学式14:
アセトニトリル(75mL)中のメルドラム酸(5.52g、38.3mmol)、炭酸カリウム(26.5g、191mmol)及びヨウ化メチル(7.15mL、115mmol)の混合物は封をされたチューブ内で75℃で7時間加熱された。混合物は室温まで冷却され、ジクロロメタン(300mL)で希釈され、ろ過されて、ろ液は乾燥するまで減圧下で蒸発された。酢酸エチル(75mL)、ヘキサン(75mL)及び水(50mL)が添加され、相が分離された。有機層は10%チオ硫酸ナトリウム水溶液(50mL)及び水(50mL)で洗浄され、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、溶媒が減圧下で除去されて、2,2,5,5-テトラメチル-[1,3]ジオキサン-4,6-ジオンを白色の固体として与えた。
収率:6.59g(79%)
RF(SiO2、クロロホルム/酢酸エチル、98:2):0.60
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 1.76 (s, 6H); 1.65 (s, 6H)。
上記のように調製された2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチルアミン(5.00g、14.2mmol)及びトリエチルアミン(9.86mL、70.7mmol)のトルエン溶液(80mL)は、上のジオン化合物(3.65g、21.2mmol)のトルエン溶液(40mL)に75℃で50分間かけて液滴で添加された。混合物はこの温度でさらに3時間(先発のアミンがTLC上で検出されるまで)撹拌され、次いで乾燥するまで蒸発された。残渣はクロロホルム(300mL)中に再溶解され、10%クエン酸水溶液(200mL)で洗浄された。水相はクロロホルム(2×60mL)で抽出され、クロロホルム相は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、溶媒は減圧下で除去された。残渣は熱クロロホルム(140mL)ですりつぶされ、ヘキサン(70mL)が添加されて、懸濁液は室温で一晩撹拌された。固体はろ過で取り除かれ、クロロホルム/ヘキサン混合物(1:1、2×50mL)で洗浄され、減圧乾燥されて標題の産物を与えた。
収率:6.73g(88%)
M.p.:161〜162℃
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.40
1H NMR スペクトル (300MHz, DMSO-d6, δH): 12.45 (bs, 1H); 7.66 (t, J=5.1Hz, 1H); 7.57〜7.31 (m, 9H); 7.26 (s, 1H); 7.20〜7.02 (m, 6H); 6.66 (s, 1H); 3.25 (m, 2H); 2.57 (t, J=7.3Hz, 2H); 1.21 (s, 6H)。
4. 4-(4-tert-ブチル-フェニル)-酪酸の合成
化学式15:
塩化アルミニウムの粉末(80.0g、600mmol)はtert-ブチルベンゼン(40.0g、300mmol)及び無水コハク酸(26.7g、267mmol)及び1,1,2,2-テトラクロロエタン(100mL)の撹拌された混合物に分けながら添加された。全ての塩化アルミニウムが添加された後、混合物は氷(500mL)と濃塩酸(100mL)との混合物の中に注ぎ込まれた。有機層は分離され、水(500mL)で洗浄され、溶媒が蒸留で取り除かれた。固体残渣は熱15%炭酸ナトリウム水溶液(1000mL)中に溶解され、ろ過され、冷却され、酸は塩酸で沈殿された(pH=1に酸性化)。粗精製の酸はろ過され、風乾され、ベンゼン(500mL)から再結晶化されて、4-(4-tert-ブチル-フェニル)-4-オキソ-酪酸を無色の結晶として与えた。
収率:36.00g(58%)
M.p.:117〜120℃
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.93 (dm, J=8.3Hz, 2H); 7.48 (dm, J=8.3Hz, 2H); 3.30 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.81 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.34 (s, 9H)。
上の酸(36.0g、154mmol)、水酸化カリウム(25.8g、462mmol)、ヒドラジン水和物(20mL、400mmol)及びエチレングリコール(135mL)の混合物は3時間還流され、次いで蒸気の温度が196〜198℃に上がるまで蒸留された。さらに14時間の還流後、混合物は少し冷却されて、次いで冷水(200mL)中に注ぎ込まれた。混合物は濃塩酸で(pH=1に)酸性化され、ジクロロメタン(2×400mL)で抽出された。有機抽出物は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、溶媒が減圧下で除去されて、残渣がカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60A、0.060〜0.200mm、溶出液:ヘキサン/酢酸エチル10:1〜6:1)により精製されて、標題の産物をオフホワイト色の固体として与えた。
収率:16.25g(48%)
M.p.:59〜60℃
RF(SiO2、酢酸エチル):0.60
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.31 (dm, J=8.1Hz, 2H); 7.12 (dm, J=8.1Hz, 2H); 2.64 (t, J=7.6Hz, 2H); 2.38 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.96 (m, 2H); 1.31 (s, 9H)。
5. 2,2-ジメチル-N-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-マロンアミド酸の合成
化学式16:
ヒドロキシルアミン塩酸塩(15.9g、229mmol)は4(5)-イミダゾールカルボキシアルデヒド(20.0g、209mmol)及び炭酸ナトリウム(12.1g、114mmol)の水溶液(400mL)に添加され、結果として生じた溶液は室温で一晩撹拌された。混合物は100mLまで蒸発され、氷浴中で冷却された。固体はろ過により分離され、ろ液は40mLに濃縮された。0℃に冷却後、別の結晶部分が取得された。固体(23g)は合わされ、エタノール(およそ160mL)から再結晶化されて、イミダゾール-4(5)-カルボアルデヒドオキシムを無色の結晶として産出した。
収率:15.98g(69%)
1H NMR スペクトル (300MHz, アセトン-d3+D2O, δH): 7.78 (bs, 1H); 7.74 (d, J=0.9Hz, 1H); 7.43 (s, 1H)。
アセチルクロライド(51.0mL、718mmol)は0℃、アルゴン下でメタノール(670mL)に液滴で添加された。30分後、冷浴が除去され、上のオキシム(16.0g、144mmol)が添加され、その後、炭素上のパラジウム(5wt%、6.1g)が添加された。混合物は大気圧で17時間水素付加され、次いでセライトを通じてろ過され、溶媒が蒸発されて、純粋な4-(アミノメチル)-イミダゾール二塩酸塩を無色の結晶として与えた。
収率:23.92g(98%)
1H NMR スペクトル (300MHz, D2O, δH): 8.72 (s, 1H); 7.60 (s, 1H); 4.33 (s, 2H)。
メタノール(1000mL)中の上のアミン二塩酸塩(18.9g、111mmol)及びトリエチルアミン(93mL、667mmol)は、室温で10分間撹拌された。メタノール(30mL)中のトリフルオロ酢酸エチルエステル(13.3mL、111mmol)が0℃で40分間かけて液滴で添加された。反応混合物は室温で18時間撹拌され、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発された。残渣は乾燥ジクロロメタン(2000mL)中に溶解され、トリエチルアミン(31mL、222mmol)が添加された。次いでトリチルクロライド(31.6g、113mmol)が添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。クロロホルム(1000mL)及び水(1000mL)が反応混合物中に注ぎ込まれた。水層は分離され、クロロホルム(2×300mL)で抽出された。合わされた有機層は無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒が除去され、ベージュ色の固体はヘキサン(1000mL)ですりつぶされた。懸濁液はろ過され、2,2,2-トリフルオロ-N-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-アセトアミドが白色の固体として得られた。
収率:46.59g(96%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 95:5):0.35
1H NMR スペクトル (300MHz, DMSO-d6, δH): 9.77 (t, J=5.7Hz, 1H); 7.47〜7.34 (m, 9H); 7.33 (d, J=1.5Hz, 1H); 7.13〜7.03 (m, 6H); 6.80 (d, J=0.8Hz, 1H); 4.25 (d, J=5.7Hz, 2H)。
上のアミド(46.6g、107mmol)はテトラヒドロフラン(600mL)及びエタノール(310mL)中に溶解された。水酸化ナトリウム(21.4g、535mmol)の水溶液(85mL)が添加された。混合物は室温で5時間撹拌され、次いで減圧濃縮された。残渣はクロロホルム(1600mL)と水(800mL)との間で分離された。水層はクロロホルム(4×200mL)で抽出された。有機層は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒の蒸発は(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-メチルアミンをオフホワイト色の固体としてもたらした。
収率:36.30g(100%)
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.38 (d, J=1.3, 1H); 7.36〜7.30 (m, 9H); 7.18〜7.10 (m, 6H); 6.69 (m, 1H); 3.77 (s, 2H); 1.80 (bs, 2H)。
上のアミン(10.0g、29.5mmol)及びトリエチルアミン(20.5mL、147mmol)のトルエン溶液(220mL)は、75℃で45分間かけて2,2,5,5-テトラメチル-[1,3]ジオキサン-4,6-ジオン(3.65g、21.2mmol)のトルエン溶液(80mL)中に液滴で添加された。混合物はこの温度でさらに3時間(先発のアミンがTLC上で検出されるまで)撹拌され、次いで乾燥するまで蒸発された。残渣はクロロホルム(500mL)中に再溶解され、10%クエン酸水溶液(300mL)で洗浄された。水相はクロロホルム(100mL)で抽出され、クロロホルム相は合わされ、水(150mL)で洗浄され、無水硫酸マグネシウムで乾燥されて、溶媒は減圧下で除去された。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲルFluka 60、ジクロロメタン/メタノール 98:2〜9:1)により精製され、クロロホルム/ヘキサン混合物から結晶化されて、標題の産物をベージュ色の結晶として与えた。
収率:9.80g(73%)
M.p.:174〜175℃
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.35
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 8.45 (t, J=5.8Hz, 1H); 7.53 (s, 1H); 7.40〜7.28 (m, 9H); 7.14〜7.01 (m, 6H); 6.84 (s, 1H); 4.39 (d, J=5.8Hz, 2H); 1.44 (s, 6H)。
6. 3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピルアミンの合成
化学式17:
テトラヒドロフラン/ジエチルエーテル(1:1、100mL)中のエチル3-(1-トリチル-4-イミダゾリル)プロピオネート(93.0g、223mmol)は水素化アルミニウムリチウムの懸濁液(17.0g、446mmol)に1時間の間に液滴で添加された。混合物は3時間還流され、次いで氷/水で冷却しながら水(100mL)、20%水酸化ナトリウム(100mL)及び水(100mL)で処理され、ろ過されて、固体はテトラヒドロフランで洗浄された。有機相は無水炭酸カリウムで乾燥され、ろ過され、蒸発されて、3-(1-トリチル-4-イミダゾリル)プロパノールを白色の固体として与えた。
収率:68.0g(82%)
M.p.:127〜129℃
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.40〜7.24 (m, 10H); 7.17〜7.06 (m, 6H); 6.55 (s, 1H); 3.72 (t, J=5.3Hz, 2H); 2.68 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.86 (m, 2H)。
メタンスルホニルクロライド(8mL、104mmol)は、上のアルコール(32.0g、86.8mmol)のジクロロメタン(400mL)及びトリエチルアミン(15.5mL)の溶液に液滴で、0℃で1時間の間に添加された。混合物はさらに1時間、冷却せずに撹拌され、次いで5%重炭酸ナトリウムで洗浄され、無水硫酸マグネシウムで乾燥された。ジクロロメタンは30℃で減圧下で蒸発され、残渣の油状のメシレートが次のステップにおいて直接用いられた。
収率:31.2g(80%)
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.30 (m, 10H); 7.16〜7.09 (m, 6H); 6.58 (s, 1H); 4.24 (t, J=6.3Hz, 2H); 2.96 (s, 3H); 2.67 (m, 2H); 2.10 (m, 2H)。
上のメシレート(30.0g、67mmol)、フタルイミドカリウム(18.0g、100mmol)、ヨウ化ナトリウム(4.0g、26.7mmol)及びジメチルホルムアミド(200mL)の混合物は外界温度で一晩撹拌され、次いで水(2L)及びベンゼン(2L)で処理された。有機相は無水硫酸マグネシウムで乾燥され、ろ過され、溶媒が蒸発されて残渣を与えたが、この残渣はベンゼンから再結晶化されて、1-トリチル-4-(3-フタルイミドプロピル)イミダゾールを白色の固体としてもたらした。
収率:17.2g(52%)
M.p.:211〜214℃
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.83 (m, 2H); 7.72 (m, 2H); 7.39〜7.27 (m, 10H); 7.18〜7.07 (m, 6H); 6.60 (d, J=0.9Hz, 1H); 3.72 (t, J=7.4Hz, 2H); 2.60 (t, J=7.5Hz, 2H); 1.99 (m, 2H)。
上のイミダゾール誘導体(26.6g、53.5mmol)はエタノール(300mL)及びテトラヒドロフラン(150mL)中に60℃で溶解され、ヒドラジン水和物(50g、1mol)が添加され、溶液は6時間還流されて、次いで70℃で一晩加熱された。固体はろ過により除去され、ろ液は25%アンモニア水溶液(2.5l)及びジクロロメタン(2.5L)で処理された。有機層は無水炭酸カリウムで乾燥され、蒸発されて残渣を与えたが、この残渣はシリカゲル(Fluka 60、アンモニア/メタノールで飽和されたクロロホルム)上のカラムクロマトグラフィーにより精製されて、標題の化合物を白色の固体として与えた。
収率:14.2g(72%)
M.p.:112〜113℃
RF(SiO2、アンモニア/メタノール 9:1で飽和されたクロロホルム):0.30
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.28 (m, 10H); 7.18〜7.09 (m, 6H); 6.53 (d, J=1.3Hz, 1H); 2.74 (t, J=6.9Hz, 2H); 2.59 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.95 (bs, 2H); 1.78 (m, 2H)。
7. 2,2-ジメチル-N-[3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピル]-マロンアミド酸の合成
化学式18:
2-クロロトリチルクロライド樹脂(2.3g、3.0mmol)はDCM中で20分間膨潤され、ろ過された。ジメチルマロン酸(2当量、6.0mmol、793mg)はDCM:DMF 1:1(10mL)中に溶解され、樹脂に添加され、その後、DIPEA(6当量、18.0mmol、3.14mL)及びDCM(10mL)が添加された。樹脂は室温で一晩振とうされた。樹脂はろ過され、DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1)、DCM、NMP及びDCM(各々2×5mL)で洗浄された。樹脂はDMF中で20分間膨潤され、ろ過された。HOAt(3当量、9.0mmol、1.23g)、DIC(3当量、9.0mmol、1.40mL)及びDMF(25mL)が添加され、樹脂は室温で90分間振とうされた。樹脂はろ過され、3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピルアミン(1.8当量、5.40mmol、1.84g)、DIPEA(4当量、6.0mmol、2.09mL)及びDMF(10mL)が添加された。樹脂は2日間振とうされた。樹脂はろ過され、NMP(5×20mL)及びDCM(10×20mL)で洗浄された。2,2,2-トリフルオロエタノール/ジクロロメタン1:1(20mL)が樹脂に添加され、2時間振とうされた。樹脂は2,2,2-トリフルオロエタノール/ジクロロメタン1:1(10mL)で洗浄され、合わされたろ液は回収され、減圧下で濃縮されて、標題の化合物が得られた。
収率:600mg(41%)
LCMS4:m/z=482(M+1)
UPLC(方法02_B4_4):Rt=8.07分
1H NMR スペクトル (300MHz, DMSO-d6, δH): 7.36〜7.44 (9H, m), 7.07〜7.12 (6H, m), 6.62 (1H, s), 3.02〜3.09 (2H, q), 2.38〜2.43 (2H, t), 1.61〜1.69 (2H, m), 1.26 (6H, s)。
8. 2,2-ジメチル-N-[3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピル]-マロンアミド酸の合成
2,2-ジメチル-N-ピリジン-2-イルメチルマロンアミド酸の合成
化学式19:
クロロトリチルクロライド樹脂(2.3g、3.0mmol)はDCM中で20分間膨潤され、ろ過された。ジメチルマロン酸(2当量、6.0mmol、793mg)はDCM:NMP 1:1(10mL)中に溶解され、樹脂に添加され、その後、DIPEA(6当量、18.0mmol、3.14mL)及びDCM(10mL)が添加された。樹脂は室温で一晩振とうされた。樹脂はろ過され、DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1)、DCM、NMP及びDCM(各々2×5mL)で洗浄された。樹脂はNMP中で20分間膨潤され、ろ過された。HOAt(3当量、9.0mmol、1.23g)、DIC(3当量、9.0mmol、1.40mL)及びNMP(25mL)が添加され、樹脂は室温で90分間振とうされた。樹脂はろ過され、2-(アミノメチル)ピリジン(2当量、6mmol、659g)、DIPEA(4当量、6.0mmol、2.09mL)及びNMP(10mL)が添加された。樹脂は一晩振とうされた。樹脂はろ過され、NMP(5×20mL)及びDCM(10×20mL)で洗浄された。TFA/TIS/水(95:2.5:2.5、30mL)が樹脂に添加され、1時間振とうされ、ろ過され、減圧下で濃縮されて、標題の化合物が得られた。
収率:600mg(41%)
LCMS4:m/z=223(M+1)
UPLC(方法08_B4_1):Rt=1.79分
B.本発明の化合物の合成
(実施例1)
Nε26-[2-(2-{2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式20:
調製方法:SPPS法B、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)は二重カップリング法を用いて、Libertyペプチド合成装置上でカップリングされた。
UPLC(方法04_A3_1):10.51分
LCMS4:m/z=1085.2(M+4H)4+、1447.3(M+3H)3+
(実施例2)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式21:
調製方法:SPPS法B、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(Trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu、及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)は二重カップリング法を用いて、Libertyペプチド合成装置上でカップリングされた。
UPLC(方法04_A3_1):7.19分
LCMS4:m/z=978.5(M+5H)5+、1222.8(M+4H)4+、1630.1(M+3H)3+
(実施例3)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式22:
調製方法:ペプチドは充填量0.35mmol/gのLys(Mtt)-Wang樹脂上で合成された。合成はLiberty合成装置上で、マイクロ波条件を用いて、DIC/HOAtを使用した70℃以下での5分間の単一カップリングを用いて行われたが、ヒスチジンは50℃以下で20分間カップリングされた。全てのアミノ酸は標準的な保護基で保護されたが、アシル化されるリジン(この場合はLys26)はMttで保護された。脱保護はNMP中の5%ピペリジンを使用して、50℃で3分間であった。合成完了後、N末端は10当量のBoc-炭酸塩及び10当量のDIPEAで30分間ブロックされた。Mtt基は原液の(希釈されていない)ヘキサフルオロイソプロパノールでの20分間の処理により除去され、側鎖はLiberty上で、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-Glu-OBut及びヘキサデカン二酸モノ-t-ブチルエステルを用いた上と同じプロトコールを用いて、段階的に構築された。ペプチドはTFA/水/TIS(95:2.5:2.5)を使用して2時間切断され、ジエチルエーテルでの沈殿により単離された。粗ペプチドは5u又は7uいずれかのC18シリカが充填された20mm×250mmカラム上での調製用HPLCにより精製された。ペプチドは5mlの50%酢酸中に溶解され、H2Oで20mlに希釈され、カラム上に注入されて、次いで0.1% TFA中の40〜60% CH3CNの10ml/分、50分間の間のグラジエントで、40℃で溶出された。ペプチド含有画分は回収され、純度がMALDI及びUPLCにより査定された。精製されたペプチドは溶出液を水で希釈した後、凍結乾燥された。
理論的な分子質量の4844.6はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 9.50分
UPLC(方法04 A3_1):Rt 11.23分
(実施例4)
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式23:
調製方法:側鎖におけるテトラデカン二酸モノ-t-ブチルエステルの使用を除いて、実施例3と同様。
理論的な分子質量の4788.5はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 8.74分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 9.39分
(実施例5)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式24:
調製方法:側鎖におけるドデカン二酸モノ-t-ブチルエステルの使用を除いて、実施例3と同様。
理論的な分子質量の4732.4はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 8.19分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 8.17分
(実施例6)
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチドアミド
化学式25:
調製方法:用いられた樹脂が充填量0.24mmol/gのTentagel S RAMで、Fmoc-Lys(Mtt)が26位及び37位の両方に対して用いられたことを除いて、実施例3と同様。
理論的な分子質量の4843.6はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 9.43分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 11.88分
(実施例7)
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチドアミド
化学式26:
調製方法:側鎖におけるテトラデカン二酸モノ-t-ブチルエステルの使用を除いて、実施例6と同様。
理論的な分子質量の4787.5はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 8.72分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 9.98分
(実施例8)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチドアミド
化学式27:
調製方法:側鎖におけるドデカン二酸モノ-t-ブチルエステルの使用を除いて、実施例6と同様。
理論的な分子質量の4731.4はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 8.16分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 8.83分
(実施例9)
Nε26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチドアミド
化学式28:
調製方法:実施例7と同様。
理論的な分子質量の4497.2はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 8.85分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 10.27分
(実施例10)
Nε26-[2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]],Nε37-[2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチドアミド
化学式29:
調製方法:実施例7と同様。
理論的な分子質量の4206.8はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 9.04分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 10.68分
(実施例11)
Nε26-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル),Nε37-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-トリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチドアミド
化学式30:
調製方法:実施例7と同様。
理論的な分子質量の4529.2はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt 9.07分
UPLC(方法04_A3_1):Rt 13.31分
(実施例12)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-ヨード-フェニル)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式31:
調製方法:SPPS法B、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、4-(4-ヨードフェニル)酪酸(Aldrichから市販されている)及びFmoc-Glu-OtBuがSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法04_A4_1):Rt=8.54分
UPLC(方法01_A4_2):Rt=10.23分
LCMS4:Rt=2.4分、m/z=971(m/5)1213(m/44)1617(m/3)
(実施例13)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(4-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(4-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式32:
調製方法:SPPS法B。最終産物は、アミノ酸Trp31、Ala25、Tyr19、Phe12及びAib8のカップリング(NMP中の1N無水酢酸を使用して65℃、2分半)後に無水酢酸のキャッピングステップが行われたことを除いて、分析用UPLC及びLC-MSにより性質決定された。4-(15-カルボキシ-ペンタデシルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルはWO07128817の実施例17に記載されるように調製できる。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=1.272分
UPLC(方法05_B10_1):Rt=7.319分
LCMS4:Rt=2.37分、m/z=5054.48 計算されたMW=5056.82
(実施例14)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(3-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[16-(3-カルボキシフェノキシ)ヘキサデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式33:
3-ヒドロキシ-安息香酸tert-ブチルエステルの調製
3-ヒドロキシ安息香酸(55.0g、400mmol)、ジ-tert-ブチル二炭酸塩(178g、820mmol)、過塩素酸マグネシウム(0.89g、4.0mmol)及び乾燥ニトロメタン(750mL)の混合物は40℃で96時間撹拌された。酢酸エチル(800mL)が添加され、有機層は5%の重炭酸ナトリウム水溶液(1500mL)で洗浄された。有機溶液は無水硫酸マグネシウムで乾燥され、次いで減圧下で蒸発された。残渣はカラムクロマトグラフィー(シリカゲルFluka 60、ヘキサン/酢酸エチル8:1)に供され、標題の化合物を白色の固体として産出した。
収率:9.07g(12%)
M.p.:94〜96℃
1H NMR スペクトル (300MHz, CDCl3, δH(dH)):7.61〜7.53 (m, 2H);7.29 (t, J=8.1Hz, 1H);7.05 (m, 1H);6.06 (bs, 1H);1.59 (s, 9H)
16-ブロモ-ヘキサデカン酸メチルエステルの調製
16-ブロモ-ヘキサデカン酸(6.0g)はMeOH(35mL)、トルエン(100mL)及びオルトギ酸トリメチル(20mL)中に溶解され、次いでFluka社のAmberlyst 15(1.4g)が添加された。混合物は55℃で16時間撹拌された。混合物は乾燥するまで蒸発され、減圧下で16時間乾燥されて7.7gが得られた。残渣はMeOH(約50mL)中に懸濁され、約半時間撹拌された。amberlyst 15はDCM(30mL)を使用して半時間撹拌した後にろ過で取り除かれた。ろ液は濃縮されてDCMが除去され、明澄な溶液は冷却され、さらなるMeOH(約20mL、全体で約40mL)が添加された。フラスコは冷却され、さらなる結晶が沈殿され、30分間撹拌した後に結晶はろ過で取り除かれ、冷MeOHで洗浄された。白色の結晶は減圧下で乾燥されて、5.61gが得られた。
3-(15-メトキシカルボニル-ペンタデシルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステルの調製
3-ヒドロキシ-安息香酸tert-ブチルエステル(1.79g)はMeCN 75ml中に溶解され、次いでブロモ-ヘキサデカン酸メチルエステル(3.22g)が添加され、その後にK2CO3(2.5g)が添加された。反応は80℃で3日間撹拌された。反応混合物はろ過された。ろ液は蒸発され、残渣はEtOAc 100ml中に溶解され、EtOAc層は100mlの塩水で2回洗浄された。有機層はMgSO4で乾燥、ろ過され、溶媒が蒸発により除去されて、4.165g(98%)を与えた。
3-(15-カルボキシ-ペンタデシルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステルの調製
3-(15-メトキシカルボニル-ペンタデシルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(4.165g)は50ml THF及び50ml MeOH中に溶解された。水(10mL)が添加され、その後にLiOH(0.565g、13.5mmol)が添加された。反応は室温で16時間であった。反応混合物は蒸発され、残渣はEtOAC 150ml中に溶解され、水80ml及び20mlの1N HClが添加された。層は分離され、有機層はMgSO4で乾燥され、ろ過され、溶媒が蒸発により除去されて、白色固体化合物(3.91g、97%)を与えた。
調製方法:SPPS法B、実施例1と類似の様式で3-(15-カルボキシ-ペンタデシルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステルを使用。最終産物は、アミノ酸Trp31、Ala25、Tyr19、Phe12及びAib8のカップリング(NMP中の1N無水酢酸を使用して65℃、2分半)後に無水酢酸のキャッピングステップが行われたことを除いて、分析用UPLC及びLC-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=11.201分
UPLC(方法05_B10_1):Rt=8.622分
LCMS4:Rt=2.37分、m/z=1011.88(m/5);1664.32(m/4);5053.28
計算されたMW=5056.82
(実施例15)
Nε26{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)-エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式34:
調製方法:SPPS法B、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(Trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)はSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.8分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.6分
LCMS4:4598.0
計算されたMW=4598.2
(実施例16)
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[12-(3-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式35:
調製方法:SPPS法B。3-(11-カルボキシ-ウンデシルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステルは、3-(15-カルボキシ-ペンタデシルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステルについて記載されたものと類似の様式で、12-ブロモ-ドデカン酸を利用して、調製された。最終産物は、アミノ酸Trp31、Ala25、Tyr19、Phe12及びAib8のカップリング(NMP中の1N無水酢酸を使用して65℃、2分半)後に無水酢酸のキャッピングステップが行われたことを除いて、分析用UPLC及びLC-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=9.449分
LCMS4:Rt=2.37分、m/z=m/z:1011.88(m/4);1264.32(m/3);4942.24
計算されたMW=4944.608
(実施例17)
Nε26[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式36:
調製:SPPS法A、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)が2回カップリングされ、その後、Fmoc-Glu-OtBu及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)がSPPS法Aを用いてカップリングされた。
UPLC(方法05_B5_1):Rt=4.95分(92%)
LCMS4:m/z=4011、計算値=4011
(実施例18)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-メチルフェニル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[4-(4-メチルフェニル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]-アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式37:
調製:SPPS法B、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、4-(4-メチルフェニル)酪酸(ABCRから市販されている)及びFmoc-Glu-OtBuがSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法01_B4_1):Rt=9.93分
LCMS4:Rt=2.44分、m/z=926(m/5) 1157(m/4) 1543(m/3)
(実施例19)
Nε26-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリル),Nε37-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリルアミノ}ブチリル)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式38:
調製:SPPS法B、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(Trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して除去され、Fmoc-Glu-OtBu及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)はSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.6分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=7.9分
LCMS4:4565.0
計算されたMW=4566.1
(実施例20)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式39:
3-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルの調製
3-ヒドロキシ-安息香酸tert-ブチルエステル(3g)はアセトニトリル(50mL)中に溶解された。アセトニトリル(20mL)中のAldrich社の10-ブロモデカン酸メチルエステル(4.1g)が添加され、容器はアセトニトリル(30mL)で洗浄された。炭酸カリウムが添加され、混合物は窒素下で約18時間還流された。反応は冷却され、乾燥するまで蒸発された。残渣はAcOEt(80mL)及び水(30mL)中に溶解され、抽出された。水相はAcOEt(30mL)で洗浄され、合わされた有機相は水(50mL)、飽和NaCl(30mL)で洗浄され、MgSO4で乾燥され、ろ液は減圧下で濃縮されて白色の固体(5.8g)が得られた。残渣はDCM(15mL)中に溶解され、ヘプタン(約60mL)が添加され、溶液は約30mLに濃縮された。30分間の撹拌後、結晶が形成され始め、溶液は氷冷された。結晶はろ過で取り除かれ、冷ヘプタンで洗浄され、減圧乾燥されて、4.13g(71%)の3-(9-メトキシカルボニル-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステルが得られた。
結晶はTHF(30mL)中に溶解され、1N NaOH(11mL)が添加された。濁った溶液は16時間撹拌された。反応混合物は濃縮されて大部分のTHFが除去され、残った水溶液はAcOEt(50mL)で抽出された。水溶液のpHが約12mLの1N HClを使用して1〜2に調整され、水相はAcOEt(25mL)で抽出された。合わされた有機相は水で洗浄され、MgSO4で乾燥され、ろ過され、濃縮されて、白色の半結晶固体(3.97g)が得られた。
LCMS2:401(M+23) H-NMR (400MHz, CDCl3): 7.56 (d, 1H), 7.50 (m, 1H), 7.26〜7.32 (m, 1H), 7.05 (dd, 1H),3.99 (t, 2H), 2.35 (t, 2H), 1.75〜1.82 (m, 2H), 1.62〜1.65 (m, 2H), 1.59 (s, 9H), 1.42〜1.47 (m, 2H), 1.33 (br, 8H)。
調製方法:SPPS法B、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及び3-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステルが二重カップリング法を用いてLiberty Peptide合成装置上でカップリングされた。
UPLC(方法04_A4_1):10.01分
UPLC(方法08_B4_1):8.81分
LCMS4:m/z=978.5(M+5H)5+、1222.8(M+4H)4+、1630.1(M+3H)3+
(実施例21)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル],Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8, His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式40:
調製方法:実施例5と同様。
理論的な分子質量の4655.5はMALDIにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.72分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=5.70分
(実施例22)
N9-{2-[2-(1 H-イミダゾール-4-イル)エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル},Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチド
化学式41:
調製:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸は、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングされた。8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)はSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.32分
LCMS4:Rt=2.29分、m/z=1669(m/3)、1252(m/4)、1001(m/5)
(実施例23)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)ペプチド
化学式42:
調製:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸は、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングされた。8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)はSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法08_B4_1(TFA)):Rt=8.81分
LCMS4:Rt=2.29分、m/z=1669(m/3)、1219(m/4)、975(m/5)
(実施例24)
Nε26-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式43:
調製:SPPS法B、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して手作業で除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及びテトラデカン二酸は二重カップリング法を用いて、Liberty Peptide合成装置上でカップリングされた。理論的な分子質量はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.6分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.7分
MALDI-MS:4788
(実施例25)
Nε26-[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル],Nε37-[(S)-4-カルボキシ-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}ブチリル][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式44:
調製:SPPS法B、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して手作業で除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及びテトラデカン二酸は二重カップリング法を用いて、Liberty Peptide合成装置上でカップリングされた。理論的な分子質量はMALDI-MSにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.8分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10分
MALDI-MS:4787
(実施例26)
Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチル-フェニル)-ブチリルアミノ]-4-カルボキシ-ブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチル-フェニル)-ブチリルアミノ]-4-カルボキシ-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式45:
調製:SPPS法B、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、4-(4-t-ブチルフェニル)酪酸及びFmoc-Glu-OtBuはSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=9.07分
LCMS4:Rt=2.29分、m/z=943(m/5)1179(m/4)1571(m/3)
(実施例27)
N9-{2-[2-(1 H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチルフェニル)ブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル},Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチルフェニル)ブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)ペプチド
化学式46:
調製:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸は、Fmoc-Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングされた。8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及び4-(4-t-ブチルフェニル)酪酸はSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法04_A4_1):Rt=10.56分
LCMS4:Rt=2.40分、m/z=940(m/5)、1174(m/4)、1565(m/3)
(実施例28)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Imp7,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式47:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt:2.22分、m/z=4859.5;1214.9(M+4H)4+;1619.8(M+3H)3+
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.88分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.28分
(実施例29)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式48:
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.75分
UPLC(方法08_B2_1):Rt=13.09分
LCMS4: (M/5)+1=976;(M/4)+1=1219;精密質量=4874
(実施例30)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Gly9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式49:
調製方法:SPPS法A
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.20分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.05分
LCMS4: (M/5)+1=964;(M/4)+1=1204; 精密質量=4816
(実施例31)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg23,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式50:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=2.12分、m/z=4916.0
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.59分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.57分
(実施例32)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式51:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=2.12分、m/z=4774.4
UPLC(方法09_B2_1):Rt=12.87分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.86分
(実施例33)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式52:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=1.92分、m/z=4797.3;M/4:1199.8;M/3:1599.4
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.12分
UPLC(方法05_B8_1):Rt=2.03分
(実施例34)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式53:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=1.99分、m/z=4697.0
UPLC(方法09_B2_1):Rt=12.20分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.31分
(実施例35)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式54:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=1.89分、m/z=4641.2
UPLC(方法09_B2_1):Rt=11.2分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=4.00分
(実施例36)
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式55:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=1.97分、m/z=4797.3;M/4:1199.8;M/3:1599.4
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.24分
UPLC(方法05_B8_1):Rt=2.88分
(実施例37)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Gln9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式56:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=1.06分、m/z=4873.3
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.18分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.40分
(実施例38)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu30,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式57:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt=2.13分、m/z=4932.7
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.39分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.20分
(実施例39)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式58:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt:1.93分、m/z=4832.4;M/4:1208.5;M/3:1611.0
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.10分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.15分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.30分
(実施例40)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式59:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt:1.92分、m/z=4818.4;M/4:1205.0;M/3:1606.7
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.06分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.02分
(実施例41)
N{9}-[2,2-ジメチル-3-オキソ-3-(ピリジン-2-イルメチルアミノ)プロパノイル],Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)ペプチド
化学式60:
調製方法:SSPS法B。2,2-ジメチル-N-ピリジン-2-イルメチル-マロンアミド酸は、先の実施例において2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸に用いられるのと同じカップリング条件を用いてカップリングされた。Fmoc-Glu-OtBu及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)はSPPS法Dを用いてカップリングされた。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.98分
LCMS4: Rt=2.23分。m/z=1624(m/3),1218(m/4)
(実施例42)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチジル-Gly
化学式61:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt:2.05分、m/z=4931.5;M/4:1233.3;M/3:1644.4
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.52分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.18分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.24分
(実施例43)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34, Gly36,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式62:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt:2.18分、m/z=4775.3;M/4:1194.5;M/3:1592.4
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.01分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.60分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.88分
(実施例44)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[9-(4-カルボキシフェノキシ)ノナノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[9-(4-カルボキシフェノキシ)ノナノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式63:
調製方法:SPPS法B
LCMS4: Rt:2.03分、m/z=4846.4;M/4:1212.3;M/3:1616.1
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.27分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.09分
(実施例45)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(5-カルボキシチオフェン-2-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(5-カルボキシチオフェン-2-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式64:
調製方法:SSPS法B。8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBu及び5-(12-カルボキシ-ドデシル)-チオフェン-2-カルボン酸tert-ブチルエステル(WO07128815の実施例6に記載されるように調製されたもの)はSSPS法Dを用いて、Liberty合成装置上でカップリングされた。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=9.87分
LCMS4: m/z=1651(m/3),1239(m/4),991(m/5)
(実施例46)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチジル-Glu
化学式65:
調製方法:SPPS法A
UPLC(方法10_B14_1):Rt=6.54分
LCMS4:(M/5)+1=1001;(M/4)+1=1251; 精密質量=5003.5
(実施例47)
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式66:
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.76分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.02分
LCMS4: Rt=2.12分。m/z:4775;M/4=1194;M/5=955
(実施例48)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-カルボキシ-2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-カルボキシ-2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式67:
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B2_1):Rt=13.193分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.685分
LCMS4:m/z:4887;m/3:1630;m/4:1222;m/5:978
(実施例49)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[8-(4-カルボキシフェノキシ)オクタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Gly36,Lys37]-GLP-1-(7-37)ペプチド
化学式68:
調製方法:SPPS法B
LCMS4:Rt:2.07分、m/z:4719.2;M/4:1180.5;M/3:1573.7
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.45分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.19分
薬理学的方法
(実施例50)
インビトロの効力
本実施例の目的はGLP-1誘導体のインビトロでの活性又は効力を試験することである。
実施例1〜49のGLP-1誘導体の効力は下記のように、すなわちヒトGLP-1受容体を発現する膜を含有する培地中のサイクリックAMP(cAMP)の形成刺激として、決定された。
原理
ヒトGLP-1受容体を発現する安定的に形質導入された細胞株であるBHK467-12A(tk-ts13)から精製された細胞膜は当該GLP-1アナログ又は誘導体で刺激され、cAMP生産能はPerkin Elmer Life Sciences社のAlphaScreen(商標) cAMP Assay Kitを用いて測定された。AlphaScreen Assayの基本原理は、内因的なcAMPと外因的に追加されたビオチンcAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズにコンジュゲートされた特異的な抗体を用いることにより達成される。
細胞培養及び膜の調製
安定的に形質導入された細胞株及び高発現クローンはスクリーニング用に選択された。細胞は5% CO2において、5% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び0.5mg/mlの選択マーカーG418を含むDMEM中で増殖された。
およそ80%コンフルエンスの細胞はPBSで2回洗浄され、Versene液(エチレンジアミン四酢酸の四ナトリウム塩水溶液)で収集され、5分間、1000rpmで遠心分離されて上清が除去された。付加的なステップは全て氷上でなされた。細胞ペレットはUltrathuraxにより20〜30秒間、10mlのBuffer 1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH=7.4)中でホモジェナイズされ、15分間、20,000rpmで遠心分離され、ペレットは10mlのBuffer 2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA、pH=7.4)中に再懸濁された。懸濁液は20〜30秒間ホモジェナイズされ、15分間、20,000rpmで遠心分離された。Buffer 2における懸濁、ホモジェナイズ及び遠心分離は1回繰り返され、膜はBuffer 2中に再懸濁された。タンパク質濃度が決定され、膜は使用するまで-80℃で保存された。
アッセイは平底96ウェルプレート(Costarカタログ番号:3693)の半分の領域内で行われた。1ウェルあたりの終容量は50μlであった。
溶液及び試薬
Perkin Elmer Life Sciences社のAlphaScreen cAMP Assay Kit(カタログ番号:6760625M);抗cAMP Acceptor Beads(10U/μl)、ストレプトアビジンDonor Beads(10U/μl)及びビオチン化cAMP(133U/μl)を含有。
AlphaScreen Buffer、pH=7.4:50mM TRIS-HCl(Sigma、カタログ番号:T3253)、5mM HEPES(Sigma、カタログ番号:H3375)、10mM MgCl2,H2O(Merck、カタログ番号:5833)、150mM NaCl(Sigma、カタログ番号:S9625)、0.01% Tween(Merck、カタログ番号:822184)。使用前にAlphaScreen Bufferに以下が添加された(終濃度が指し示される):BSA(Sigma、カタログ番号A7906)が0.1%、IBMX(Sigma、カタログ番号I5879)が0.5mM、ATP(Sigma、カタログ番号A7699)が1mM、GTP(Sigma、カタログ番号G8877)が1uM。
cAMP標準物質(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP Solution:5μLの5mM cAMPストック+495μLのAlphaScreen Buffer
cAMP標準物質、同様に試験されるGLP-1アナログ又は誘導体のAlphaScreen Buffer中の適切な希釈系列は、例としてGLP-1化合物について以下の8濃度:10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13及び10-14Mで、cAMPについて例として10-6から3×10-11までの系列で、調製された。
膜/Acceptorビーズ
hGLP-1/BHK467-12A膜の使用;0.6mg/mlに相当する6μg/ウェル(ウェルあたりの用いられる膜の量は変わり得る)
「膜無し」:AlphaScreen Buffer中のAcceptor Beads(最終15μg/ml)
「6μg/ウェルの膜」:膜+AlphaScreen Buffer中のAcceptorビーズ(最終15μg/ml)
10μlの「膜無し」をcAMP標準物質(1ウェルあたり、2連)並びに陽性対照及び陰性対照に添加
10μlの「6μg/ウェルの膜」をGLP-1及びアナログに添加(1ウェルあたり、2連/3連)
陽性対照:10μl「膜無し」+10μl AlphaScreen Buffer
陰性対照:10μl「膜無し」+10μl cAMP Stock Solution(50μM)
ビーズは直接光に敏感なため、あらゆる操作は(できる限り暗い)暗所で、又は緑色光の中であった。全ての希釈は氷上でなされた。
手順
1. AlphaScreen Bufferを作成
2. GLP-1/アナログ/cAMP標準物質をAlphaScreen Buffer中に溶解して希釈
3. Donor Beads溶液を作成、30分間室温でインキュベート
4. cAMP/GLP-1/アナログをプレートに添加:1ウェルあたり10μl
5. 膜/Acceptor Beads Solutionを調製、これをプレートに添加:1ウェルあたり10μl
6. Donor Beadsを添加:1ウェルあたり30μl
7. プレートをアルミホイル中に包み、振とう機上で3時間(非常に低速で)室温でインキュベート
8. AlphaScreen上でカウント-各プレートはAlphaScreen中でカウント前に3分間プレインキュベート
結果
EC50[pM]値はGraph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を用いて計算された。
全ての誘導体のインビトロの効力が確認された。43個の誘導体はEC50が2000pM以下に相当する良好なインビトロの効力を持っていた。42個の誘導体はより一層効力があり、EC50は1000pM以下であった。35個の誘導体はEC50が500pM以下に相当する、なおさらに改善された効力を持っていた。19個の誘導体は非常に効力があり、EC50は200pM以下に相当した。そして10個の誘導体は非常に良好な効力を持ち、EC50は100pM以下に相当した。
比較用のJournal of Medicinal Chemistry(2000)、vol.43、no.9、1664〜669ページの表1中の化合物番号13(K26,34においてビス-C12-二酸でアシル化されたGLP-1(7-37))は、EC50が1200pMに相当するインビトロでの効力を持っていた。
所望の場合、GLP-1に関する変動倍率は、EC50(GLP-1)/EC50(アナログ)-3693.2として計算され得る。
(実施例51)
GLP-1受容体結合
本実験の目的はGLP-1受容体へのGLP-1誘導体の結合、及びその結合がアルブミンの存在によりどのように潜在的に影響されるかを調査することである。これは下記のインビトロ実験においてなされた。
実施例1〜49のGLP-1誘導体のヒトGLP-1受容体への結合アフィニティーは受容体から125I-GLP-1を転置させる能力として測定された。リラグルチド及びセマグルチドは比較化合物として包含された。誘導体のアルブミンへの結合を試験するため、アッセイは低濃度のアルブミン(0.005%-トレーサー中のその残量に相当)を、同様に高濃度のアルブミン(2.0%添加)を使用して行われた。結合アフィニティーIC50におけるシフトは当該ペプチドがアルブミンに結合することの指標であり、それにより、当該ペプチドが動物モデルにおいて潜在的な持続時間延長された薬物動態学的プロファイルを持つことの予測である。
条件
種類(インビトロ):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ方法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞株:BHK tk-ts13
細胞培養及び膜の精製
安定的に形質導入された細胞株及び高発現クローンはスクリーニング用に選択された。細胞は5% CO2において、10% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び1.0mg/mlの選択マーカーG418を含むDMEM中で増殖された。
細胞(およそ80%コンフルエンス)はPBSで2回洗浄され、Versene液(エチレンジアミン四酢酸の四ナトリウム塩水溶液)で収集され、続いて1000rpmで5分間の遠心分離により分離された。細胞/細胞ペレットは以後のステップにおいて可能な限り氷上で保たれなければならない。細胞ペレットはUltrathurraxを使用して20〜30秒間、適切な量のBuffer 1(細胞の量によるが、例として10ml)中でホモジェナイズされた。ホモジネートは20000rpmで15分間遠心分離された。ペレットは10mlのBuffer 2中に再懸濁(ホモジェナイズ)され、再遠心分離された。このステップはもう1回繰り返された。結果として生じたペレットはBuffer 2中に再懸濁され、タンパク質濃度が決定された。膜はマイナス80℃で保存された。
Buffer 1:20mM Na-HEPES+10mM EDTA、pH7.4
Buffer 2:20mM Na-HEPES+0.1mM EDTA、pH7.4
結合アッセイ:
SPA:
試験化合物、膜、SPA粒子及び[125I]]-GLP-1(7-36)NH2はアッセイ緩衝液中で希釈された。25ul(マイクロリッター)の試験化合物はOptiplateに添加された。HSA(2% HSAを含有する「高アルブミン」実験)、又は緩衝液(0.005% HSAを含有する「低アルブミン」実験)が添加された(50ul)。5〜10ugのタンパク質/サンプルが0.1〜0.2mgタンパク質/mlに相当して(50ul)添加された(各膜調製物について好ましくは最適化される)。SPA粒子(コムギ胚芽凝集素SPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)が0.5mg/ウェル(50ul)の量で添加された。インキュベーションは[125I]-GLP-1](7-36)NH2(終濃度0.06nM、49.880DPMに相当、25ul)と共に開始された。プレートはPlateSealerでシールされ、120分間、30℃で、振とうしながらインキュベートされた。プレートは遠心分離され(1500rpm、10分間)、Topcounterにおいてカウントされた。
アッセイ緩衝液:
50mM HEPES
5mM EGTA
5mM MgCl2
0.005% Tween 20
pH7.4
HSAはSIGMA A1653であった。
計算
IC50値は受容体から50%の125I-GLP-1を転置させる濃度として曲線から読み取られ、比率[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)超低HSA]が決定された。
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC50値に対応して、可能な限り良好であるはずである。
高アルブミン濃度でのIC50値は、誘導体のGLP-1受容体への結合に対するアルブミンの影響の測定値である。知られているように、GLP-1誘導体もまたアルブミンに結合する。これは一般に望ましい効果であり、血漿における存続時間を延ばす。それ故、高アルブミンでのIC50値は低アルブミンでのIC50値よりも一般に高く、これはGLP-1受容体への結合低減に対応して、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミンの結合により引き起こされるものである。
高比率(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))はそれ故、当該誘導体がアルブミンに良好に結合し(長い半減期を持つであろう)、それ自体もまたGLP-1受容体に良好に結合する(IC50値(高アルブミン)が高く、IC50値(低アルブミン)が低い)ことの指標として受け取られ得る。
結果
以下の結果が得られたが、ここで「比率」とは[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA])をいう。
誘導体は2個を除いて全てが1.0より高い比率を持っていた。40個の誘導体は10より高かった。34個の誘導体は25より高かった。22個の誘導体は50より高かった。12個の誘導体は100より高かった。そして3個の誘導体は250より高い比率を持っていた。
そのうえIC50(低アルブミン)に関しては、全ての誘導体が600nMより低いIC50(低アルブミン)を持っていた。1個を除いて全てが500nMより低かった。46個の誘導体は100nMより低かった。44個の誘導体は50.00nMより低かった。34個の誘導体は10.00nMより低かった。23個の誘導体は5.00nMより低かった。そして7個の誘導体は1.00nMより低かった。
最後にIC50(高アルブミン)に関しては、全ての誘導体が1000.00nM以下のIC50(高アルブミン)を持っていた。46個の誘導体は1000.00nMより低かった。39個の誘導体は500.00nMより低かった。7個の誘導体は100.00nMより低かった。そして4個の誘導体は50.00nMより低かった。
(実施例52)
経口での生物学的利用能の推定
本実験の目的はGLP-1誘導体の経口での生物学的利用能を推定することである。
この目的を達成するため、実施例2、15〜17、21、25、32、36〜39及び42〜48のGLP-1誘導体を腸管腔内に直接注射した後の血漿中の曝露が、ラットにおいてインビボで、以下に記載されるように研究された。
GLP-1誘導体は1000uMの濃度で55mg/mlカプリン酸ナトリウム溶液中で試験された。
到着時の体重がおよそ240gの、32匹の雄性Sprague DawleyラットはTaconic(Denmark)から入手され、単純ランダム化により1群あたり4匹のラットが異なる処置群に割り当てられた。ラットは実験前におよそ18時間絶食させられ、全身麻酔(Hypnorm/Dormicum)をかけられた。
GLP-1誘導体は空腸の近位部(十二指腸の10cm遠位)内、又は中腸(盲腸の50cm近位)内のいずれかに投与された。10cm長のPE50-カテーテルが空腸内に挿入され、少なくとも1.5cm空腸内を進められ、漏れ又はカテーテル転置を防ぐため、投薬前に腸及びカテーテル周囲を3/0縫合を用いて先端から遠位で結紮することにより固定された。カテーテルはシリンジや針を伴わずに置かれ、創傷クリップで切開を閉じる前に2mlの生理食塩水が腹部内に投与された。
100μlの各GLP-1誘導体は空腸管腔内にカテーテルを通じて1mlシリンジを使用して注射された。続いて、カテーテルを「洗い流す」ため、200μlの空気が空腸管腔内に別のシリンジを使用して押し入れられた。このシリンジはカテーテル内への逆流を防ぐためにカテーテルに連結されたままにされた。
血液サンプル(200ul)は所望の間隔(通常0、10、30、60、120及び240分時)で尾静脈からEDTAチューブ内に回収され、20分以内に5分間、10000G、4℃で遠心分離された。血漿(75ul)はMicronicチューブに分離され、速やかに凍結され、血漿中の各GLP-1誘導体濃度についてLOCI(蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ)を使用して、一般にインスリンの決定についてPoulsen及びJensenによりJournal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページに記載されるように分析されるまで-20℃で保存された。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングされ、一方アクセプタービーズはペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体でコンジュゲートされた。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体はビオチン化された。3つの反応物は分析物と併合され、2部位化免疫複合体を形成した。複合体を照らすと一重項酸素原子がドナービーズから放出され、これはアクセプタービーズに向けられて化学発光が誘引され、化学発光はEnvisionプレートリーダー内で測定された。光の量は化合物の濃度に比例した。
血液採取後、ラットは麻酔下で屠殺され、腹部が開かれてカテーテル配置が正しいか検証された。
平均(n=4)血漿濃度(pmol/l)は時間の関数として決定された。投薬溶液の濃度(μmol/l)で除算された血漿濃度(pmol/l)の比率が各処置群について計算され、t=30分(空腸内への化合物注射後30分)についての結果は腸の生物学的利用能のサロゲート測定値として査定された(30分時の用量補正曝露)。用量補正された曝露は実際の生物学的利用能と顕著に相関することが示されている。
以下の結果が得られたが、ここで30分時の用量補正曝露とは(投薬溶液(μM)中の化合物濃度)で除算された(空腸内への化合物注射の30分後の血漿濃度(pM))をいう。
全ての誘導体が40より高い30分時の用量補正曝露を持っていた。17個は50より高く、14個は70より高かった。11個は100より高かった。6個は125より高かった。そして2個の誘導体は150より高かった。
比較用のJournal of Medicinal Chemistry(2000)、vol.43、no.9、1664〜669ページの表1中の化合物番号13(K26,34においてビス-C12-二酸でアシル化されたGLP-1(7-37))は30分時の用量補正曝露が40より低く、セマグルチドについての30分時の用量補正曝露は40より低い同範囲内であった。
(実施例53)
血糖及び体重に対する効果
本研究の目的は糖尿病設定における血糖(BG)及び体重(BW)に対するGLP-1誘導体の効果を検証することである。
実施例2、4〜5、17及び29のGLP-1誘導体は、肥満の糖尿病マウスモデル(db/dbマウス)における用量応答研究において、以下に記載されるように試験された。
50匹のdb/dbマウス(Taconic、Denmark)は出生時からNIH31食(NIH 31M Rodent Diet、Taconic Farms、Inc.、USから市販されている、www.taconic.comを参照)を給餌され、7〜9週齢時に研究に加えられた。マウスは標準的な固形飼料(例としてAltromin 1324、Brogaarden、Gentofte、Denmark)及び水道水の自由摂取を与えられ、24℃で保たれた。1〜2週間の順化の後、基礎的な血糖が連続した2日間で2回(すなわち午前9時に)査定された。血糖値が最も低かった8匹のマウスは実験から除外された。平均血糖値に基づいて、残りの42匹のマウスはさらなる実験用に選択され、血糖レベルが合わせられた7つの群(n=6)に割り付けされた。マウスは5日間の期間の実験に4回まで用いられた。最後の実験後、マウスは安楽死させられた。
7つの群は以下の処置を受けた。
1:ビヒクル、皮下投与
2:GLP-1誘導体、0.3nmol/kg、皮下投与
3:GLP-1誘導体、1.0nmol/kg、皮下投与
4:GLP-1誘導体、3.0nmol/kg、皮下投与
5:GLP-1誘導体、10nmol/kg、皮下投与
6:GLP-1誘導体、30nmol/kg、皮下投与
7:GLP-1誘導体、100nmol/kg、皮下投与
ビヒクル:50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4
GLP-1誘導体は濃度が0.05、0.17、0.5、1.7、5.0及び17.0nmol/mlになるようにビヒクル中に溶解された。動物は6ml/kg(すなわち50gのマウスあたり300μl)の投薬量で、皮下に投薬された。
投薬の日、血糖は-1/2時間時(午前8時30分)に査定され、その後マウスは秤量された。GLP-1誘導体はおよそ午前9時(0時間時)に投薬された。投薬の日、血糖は1、2、4及び8時間時(午前10時、午前11時、午後1時及び午後5時)に査定された。
翌日、血糖は投薬後24、48、72及び96時間時(すなわち2、3、4、5日目の午前9時)に査定された。各日においてマウスは血糖採取後に秤量された。
マウスは個々にデジタル体重計で秤量された。
血糖測定用のサンプルは意識のあるマウスの尾端毛細血管から得られた。10μlの血液がヘパリン処理されたキャピラリー内に回収され、500μlのグルコース緩衝液(EKFシステム溶液、Eppendorf、Germany)に移された。グルコース濃度はグルコースオキシダーゼ法を用いて測定された(グルコース分析装置Biosen 5040、EKF Diagnostics、GmbH、Barleben、Germany)。サンプルは室温で分析までの1時間以内、保存された。分析が延期される場合、サンプルは4℃で最大24時間保存された。
ED50は最大半減効果を生じるnmol/kgでの用量である。この値は体重を低下させる誘導体の能力に基づいて、同様に血糖を低下させる能力に基づいて、下に説明されるように計算される。
体重についてのED50は、誘導体の皮下投与後24時間のデルタBWに対して最大半量効果を生じる用量として計算される。例えば、24時間後の体重の最大減少が4.0gの場合、ED50体重は24時間後に2.0gの体重減少を生じるnmol/kgでの用量であろう。この用量(ED50体重)は用量応答曲線から読み取られ得る。
血糖についてのED50は、アナログの皮下投与後8時間のAUCデルタBGに対して最大半量効果を生じる用量として計算される。
ED50値は最大応答の明確な規定を有する妥当なS字状の用量反応関係が存在する場合にのみ計算され得る。それ故に、そうでない場合、当該誘導体は異なる用量範囲でS字状の用量反応関係が得られるまで再試験される。
以下の結果が得られた。
試験された誘導体は血糖に対して、同様に体重に対して(両方の場合において低下させる)期待された効果を持っていた。そのうえ、S字状の用量応答曲線が得られ、血糖及び体重のそれぞれについてのED50値の計算が上に説明されたように可能となった。
(実施例54)
ミニブタにおける半減期
本研究の目的は、ミニブタへの静脈内投与後のGLP-1誘導体のインビボでの持続時間延長、すなわちその作用時間の延長を決定することである。これは薬物動態学的(PK)研究においてなされ、当該誘導体の終末相半減期が決定される。終末相半減期は、一般に、ある特定の血漿濃度を半減させるのに必要な時間が意味され、初期の分布相の後に測定される。Ellegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から入手された、およそ7〜14カ月齢でおよそ16〜35kgの体重の雄性Gottingenミニブタが研究に用いられた。ミニブタは個別に飼育され、制限された状態で1日1回又は2回、SDSミニブタ食(Special Diets Services、Essex、UK)を給餌された。少なくとも2週間の順化後、2つの常置中心静脈カテーテルが各動物において尾方又は頭方の大静脈内に植え込まれた。動物は外科手術後1週間の回復を許され、次いで投薬の間に適切なウォッシュアウト期間を有する繰り返しの薬物動態学的研究に用いられた。
動物は投薬前およそ18時間及び投薬後少なくとも4時間絶食させられたが、全期間を通じて水を自由に摂取できた。
実施例2、4〜5、16〜17、25、29及び39のGLP-1誘導体は50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4の中に、通常20〜60nmol/mlの濃度になるように溶解された。化合物の静脈内注射(通常1〜2nmol/kgに相当する容量、例えば0.033ml/kg)は1つのカテーテルを通じて与えられ、血液サンプルが予め規定された時点で投薬後13日まで(好ましくは他のカテーテルを通じて)採取された。血液サンプル(例えば0.8ml)はEDTA緩衝液(8mM)中に回収され、次いで4℃、1942Gで10分間遠心分離された。血漿はドライアイス上のMicronicチューブ内にピペットで移され、各GLP-1化合物の血漿濃度についてELISA若しくは類似の抗体に基づくアッセイ又はLC-MSを用いて分析されるまで-20℃で保存された。個々の血漿濃度-時間プロファイルはノンコンパートメントモデルによりWinNonlin v.5.0(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)において分析され、結果として生じた終末相半減期(調和平均)が決定された。
結果
試験された誘導体は1個を除いて全てが少なくとも12時間の半減期を持ち、6個は少なくとも24時間の半減期を持ち、5個は少なくとも36時間の半減期を持ち、3個は少なくとも48時間の半減期を持ち、そして2個は少なくとも60時間の半減期を持っていた。
(実施例55)
グルコース仲介性インスリン分泌に対する効果
本実施例の目的はグルコース仲介性インスリン分泌に対するGLP-1誘導体の効果を試験することである。
これはGottingenミニブタにおいて静脈内耐糖能試験(IVGTT)を用いることでなされる。
7〜14カ月齢の雄性Gottingenミニブタ(Ellegaard Gottingen minipigs A/S、Dalmose、Denmark)が研究に用いられる。動物は順化及び実験の間、一匹用の檻の中で飼育される。少なくとも2週間の順化後、2つの常置中心静脈カテーテルが各動物において尾方又は頭方の大静脈内に植え込まれる。動物は外科手術後1週間の回復を許され、次いで投薬の間に適切なウォッシュアウト期間を有する繰り返しの研究に用いられる。
ブタは制限された状態で1日1回又は2回、SDSミニブタ飼料(Special Diets Services、Essex、UK)を給餌され、水の自由摂取を許される。
GLP-1誘導体の効果は単回投与の後に、又は急性高用量による副作用を回避するための用量増加を伴う期間の後に試験される。GLP-1誘導体は耳の後ろの薄い皮膚において静脈内又は皮下のいずれかに与えられる。
試験される各GLP-1誘導体について、ビヒクル処置される(又は処置されていない)ベースライン群、及び2〜6の異なる血漿濃度レベルに相当する2〜6のGLP用量群があり、この血漿濃度レベルは通常、約3000〜80000pM(n=5〜8)である。
各GLP-1誘導体について、1又は2時間の静脈内耐糖能試験が行われる。ブタは実験前におよそ18時間絶食させられる。中央静脈カテーテルの開存がチェックされ、2つのベースライン血液サンプルが採取される。0分時サンプルの後、0.3g/kgグルコース(グルコース500g/L、SAD)が30秒間かけて静脈内に与えられ、カテーテルは20mlの滅菌0.9% NaClで洗い流される。血液サンプルは通常、グルコース急速投与に関する以下の時点:-10、-5、0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分時で採取され、各血液サンプルの後、カテーテルは10U/mlのヘパリンを添加した4mlの滅菌0.9% NaClで洗い流される。インスリン、グルコース及び誘導体の血漿濃度についての血液サンプルはEDTAでコーティングされたチューブに移される。チューブは1時間以内に遠心分離(4℃、3000rpm、10分間)されるまで濡れた氷上で保存され、血漿はドライアイス上のMicronicチューブ内にピペットで移されて、分析まで-20℃で保存される。GLP-1誘導体の半減期に応じて、血漿濃度はt=0分、又はt=0分及び試験終了時(t=60分若しくはt=120分)に測定される。グルコースはグルコースオキシダーゼ法を用いて、製造業者の説明書に従って、500μLの緩衝液中の10μLの血漿を使用して分析される(EBIO plus自動分析装置及び溶液、Eppendorf、Germany)。インスリンは適切な免疫測定アッセイ(LOCIなど、例としてJournal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページを参照)を用いて分析される。GLP-1誘導体の血漿濃度はELISA若しくは類似の抗体に基づくアッセイ又はLC-MSを用いて分析される。
各研究についてインスリンの曲線下領域(AUCインスリン)が計算され、インスリン分泌の測定値として用いられる。異なる用量の群は一元配置ANOVA又は他の適当な統計解析を用いて各ビヒクル/ベースライン群と比較される。AUCインスリンについてのEC50もまた計算され得る。
(実施例56)
飼料摂取に対する効果
本実験の目的はブタにおける飼料摂取に対するGLP-1誘導体の効果を調査することである。これは薬力学的(PD)研究において下記のようになされ、飼料摂取がGLP-1誘導体の単回用量投与の1、2、3及び4日後に測定され、ビヒクル処置対照群と比較される。
およそ3カ月齢でおよそ30〜35kgの体重の雌性ランドレースヨークシャーデュロック(LYD)ブタが用いられる(1群あたりn=3〜4)。動物は飼養施設への順化の間、群の中で1〜2週間飼育される。実験期間の間、動物は個々の食事摂取の測定のために月曜日の朝から金曜日の午後まで個別の檻の中に置かれる。動物は順化及び実験期間の間のいずれにおいても、全ての時間、ブタ飼料(Svinefoder、Antonio)を自由摂餌させられる。食事摂取は飼料の重量を15分ごとにログを取ることによりオンラインでモニターされる。用いられるシステムはMpigwin(Ellegaard Systems、Faaborg、Denmark)である。
GLP-1誘導体はリン酸緩衝液(50mMリン酸、0.05% tween 80、pH8)中に濃度が12、40、120、400又は1200nmol/mlになるように溶解されるが、これは0.3、1、3、10又は30nmol/kgの用量に相当する。リン酸緩衝液はビヒクルとして役立つ。動物はGLP-1誘導体又はビヒクルの皮下への単回用量(投薬量0.025ml/kg)を1日目の朝に投薬され、飼料摂取が投薬後4日間測定される。各研究の最終日である投薬後4日目に、GLP-1誘導体の血漿曝露測定用の血液サンプルが麻酔された動物において心臓から採取される。動物はその後ペントバルビトンの心臓内過剰投与で安楽死させられる。GLP-1誘導体の血漿含量はELISA又は類似の抗体に基づくアッセイを用いて分析される。
飼料摂取は4日目の24時間食事摂取の平均値±SEMとして計算される。
4日目のビヒクル群対GLP-1誘導体群における24時間飼料摂取の統計比較は、一元配置又は二元配置ANOVA繰り返し測定を、その後にボンフェローニ事後検定を用いてなされる。
(実施例57)
腸の酵素による分解に対する安定性
本実施例の目的は腸の酵素による分解に対する安定性を試験することである。GLP-1(7-37)はアッセイにおいて標準物質の一種として用いられた。
実施例4、6、8、34〜35及び49の化合物を除いた全ての実施例化合物が試験された。
腸において最もタンパク質分解活性が強いのは膵臓由来のものであり、セリンエンドペプチダーゼのトリプシン、キモトリプシン、及びエラスターゼ、同様に数タイプのカルボキシペプチダーゼが挙げられる。
ラットからの小腸抽出物を使用したアッセイが開発され、以下に記載されるように用いられた。
ラット小腸からの抽出物
小腸はラットから調製され、8mlの150mM NaCl、20mM Hepes pH 7.4で洗い流された。溶液は15分間、4,600rpmで、Heraeus Multifuge 3 S-R遠心機において75006445ローターを使用して遠心分離された。上清が除去され、0.22μm Millipore Millex GV PVDF膜を通じてろ過された。個体差を平均化するため、数匹の動物のろ液がプールされた。
得られた抽出物のタンパク質含量はBradfordアッセイにより決定された(例としてAnalytical Biochemistry(1976)、vol.72、248〜254ページ、及びAnalytical Biochemistry(1996)、vol.236、302〜308ページを参照)。
分解アッセイ
2.5nmolの試験される誘導体は腸抽出物と共に250μlの容量で37℃で1時間にわたってインキュベートされた。腸サンプルは20mM Hepesの存在下pH7.4でアッセイされた。腸抽出物の濃度はパイロット実験においてGLP-1(7-37)の半減期(t1/2)が10〜20分の範囲になるように設定された。小腸抽出物は濃度1.4μg/mlで用いられた。腸抽出物以外の全ての成分は混合され、10分間、37℃で予め温められた。腸抽出物を添加後すぐにサンプル50μlが採取され、同じ容量の1%トリフルオロ酢酸(TFA)と混合された。さらにサンプルは続く15、30及び60分後に採取された。
サンプル分析
UPLC分析
10μlのサンプルはWaters Acquityシステムを用いたUPLCにより、BEH C18 1.7μm 2.1×50mmカラムを使用して、0.1% TFA及び0.07% TFAのアセトニトリル溶液の30〜65%グラジエントを5分間かけて、流速0.6ml/分で分析された。ベースライン減算後、波長214nmで記録されたHPLCクロマトグラム中のインタクトな化合物のピーク積分が決定された。
MALDI-TOF分析
1μlの各サンプルはBruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDIターゲットに移された。分析はBruker Autoflexマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析装置を使用して、予め規定された方法「PAC_measure」を用いて、500〜5000Daの拡張検出範囲及び予め規定された較正方法「PAC_calibrate」を使用して行われた。
データ解析
HPLCクロマトグラムのピーク積分は時間に対してプロットされた。各化合物の半減期はSigmaPlot 9.0ソフトウェア及び2パラメーター指数関数形崩壊についての式を用いてデータを適合させることにより計算された。
試験された各化合物について、相対的半減期(相対的T1/2)が、同じように決定されたGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算された当該化合物の半減期(T1/2)として計算された。
結果
既知化合物であるリラグルチド及びセマグルチドの相対的半減期はそれぞれ4.8及び1.2であった。
1個の化合物を除いて、試験された全ての本発明のGLP-1誘導体は少なくとも1の相対的半減期を持っていた。31個は少なくとも2の相対的半減期を持っていた。そして10個は少なくとも5の相対的半減期を持っていた。
(実施例58)
ラットにおける薬物動態
本実施例の目的はラットにおけるインビボの半減期を調査することである。
ラットにおけるインビボの薬物動態学的研究は、10個の本発明のGLP-1誘導体(本実施例2、4〜5、16〜17、25、29、36、39及び43の化合物)を使用して、以下に記載されるように行われた。セマグルチドが比較用に包含された。齢が同じで体重400gから600gまでの雄性Sprague DawleyラットはTaconic(Denmark)から入手され、体重に対する単純ランダム化により、1群あたりおよそ3〜6匹のラットが各群における全ての動物が同様の体重であるよう処置群に割り当てられた。
GLP-1誘導体(およそ6nmole/ml)は50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4中に溶解された。化合物の静脈内注射(1.0ml/kg)は右頸静脈内に植え込まれたカテーテルを通じて与えられた。血液は投薬後5日間、舌下静脈から採取された。血液サンプル(200μl)はEDTA緩衝液(8mM)中に回収され、次いで4℃、10000Gで5分間遠心分離された。血漿サンプルは各GLP-1化合物の血漿濃度について分析されるまで-20℃で保存された。
GLP-1化合物の血漿濃度は蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ(LOCI)を用いて、一般にインスリンの決定についてPoulsen及びJensenによりJournal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページに記載されるように、決定された。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングされ、一方アクセプタービーズはペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体でコンジュゲートされた。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体はビオチン化された。3つの反応物は分析物と併合され、2部位化免疫複合体を形成した。複合体を照らすと一重項酸素原子がドナービーズから放出され、これはアクセプタービーズに向けられて化学発光が誘引され、化学発光はEnvisionプレートリーダー内で測定された。光の量は化合物の濃度に比例した。
血漿濃度-時間プロファイルはWinNonlin(ver.5.0、Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を用いて分析され、半減期(T1/2)は各動物からの個別の血漿濃度-時間プロファイルを用いて計算された。
結果
セマグルチドの半減期は4時間であった。
試験された本発明の誘導体の10個全てが少なくとも4時間の半減期を持ち、1個を除いて全てが少なくとも8時間の半減期を持ち、7個は少なくとも12時間の半減期を持ち、6個は少なくとも16時間の半減期を持ち、そして3個は少なくとも24時間の半減期を持っていた。
本発明のある特定の特徴が本明細書に例証され記載されているが、多くの改変、置換、変更及び等価物は今や当業者が思い付くものであろう。それ故、添付の特許請求の範囲は本発明の真の趣旨の範囲内に入る全てのかかる改変及び変更に及ぶことが意図されると理解されるものである。
［配列表］

Claims (15)

  1. GLP-1アナログの誘導体であって、前記アナログはGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基はK37で示され、前記第二のK残基はK26で示され、
    前記誘導体はそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、
    前記アルブミン結合部分は化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
    化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
    化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
    化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
    化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
    (式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含み、
    前記持続時間延長性部分が化学式1である場合は前記アルブミン結合部分が化学式5
    化学式5:
    (式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)のリンカーをさらに含む、GLP-1アナログの誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  2. 前記GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基がK37で示され、前記第二のK残基がK26で示され、
    前記誘導体がそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、
    前記アルブミン結合部分が化学式2、化学式3及び化学式4
    化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
    化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
    化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
    (式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含む、請求項1に記載の誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  3. 前記GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基がK37で示され、前記第二のK残基がK26で示され、
    前記誘導体がそれぞれK26及びK37に付着された2つのアルブミン結合部分を含み、
    前記アルブミン結合部分が
    i)化学式1
    化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
    (式中xは6〜18の範囲の整数)の持続時間延長性部分、及び
    ii)化学式5
    化学式5:
    (式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)のリンカーを含む、請求項1に記載の誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  4. 前記GLP-1アナログがGLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に相当する位置における第一のK残基、GLP-1(7-37)の26位に相当する位置における第二のK残基及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記第一のK残基がK37で示され、前記第二のK残基がK26で示され、
    前記誘導体がそれぞれK26及びK37にリンカーを通じて付着された2つの持続時間延長性部分を含み、
    前記持続時間延長性部分が化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
    化学式1: HOOC-(CH2)x-CO-*
    化学式2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
    化学式3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
    化学式4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
    (式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数)から選択され、
    前記リンカーが化学式5
    化学式5:
    (式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数)を含む、請求項1に記載の誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  5. 化学式20、化学式21、化学式22、化学式23、化学式24、化学式25、化学式26、化学式27、化学式28、化学式29、化学式30、化学式31、化学式32、化学式33、化学式34、化学式35、化学式36、化学式37、化学式38、化学式39、化学式40、化学式41、化学式42、化学式43、化学式44、化学式45、化学式46、化学式47、化学式48、化学式49、化学式50、化学式51、化学式52、化学式53、化学式54、化学式55、化学式56、化学式57、化学式58、化学式59、化学式60、化学式61、化学式62、化学式63、化学式64、化学式65、化学式66、化学式67、及び化学式68から選択されるGLP-1誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  6. 名称により特徴づけられ、本明細書の実施例1〜49の各々の化合物名称の表から選択される、GLP-1誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  7. 請求項5に記載の誘導体である、請求項6に記載の誘導体。
  8. GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して以下の改変(i)(8Aib、31H、34Q、37K); (ii)(des7-8、34R、37K、38E); (iii)(des7-8、34R、37K); (iv)(8Aib、9G、34R、37K); (v)(8Aib、23R、34R、37K); (vi)(31H、34Q、37K); (vii)(9Q、34R、37K); (iix)(30E、34R、37K); (ix)(34R、37K、38G); (x)(34R、36G、37K); 又は(xi)(34R、37K、38E)を含むGLP-1アナログの形の中間生成物又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  9. 前記アナログが以下のGLP-1(7-37)(配列番号1)のアナログ(i-a)(8Aib、31H、34Q、37K); (ii-a)(des7-8、34R、37K、38E); (iii-a)(des7-8、34R、37K); (iv-a)(8Aib、9G、34R、37K); (v-a)(8Aib、23R、34R、37K); (vi-a)(31H、34Q、37K); (vii-a)(9Q、34R、37K); (iix-a)(30E、34R、37K); (ix-a)(34R、37K、38G); (x-a)(34R、36G、37K); (xi-a)(34R、37K、38E); (xii-a)(7lmp、34R、37K); (xiii-a)(8Aib、34R、37K); 及び(xiv-a)(34R、37K)から選択される、請求項8に記載の中間生成物又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  10. 化学式2c、化学式3b及び化学式4b
    化学式2c: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-PG
    化学式3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
    化学式4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
    (式中yは3〜17の範囲の整数、zは1〜5の範囲の整数、R1は150Da以下のモル質量を持つ基、wは6〜18の範囲の整数、*-CO-PGは活性化エステル)から選択される持続時間延長性部分を含み、持続時間延長性部分の遠位の*-COOH基が、存在する場合は任意選択で非反応性エステルとして官能化されている、中間生成物又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
  11. 化学式69、化学式70、化学式71、化学式72、化学式73、化学式74、化学式75、化学式76、化学式77、化学式78、化学式79、化学式80、化学式81、化学式82、及び化学式83から選択され、化学式69〜化学式83のいずれか1つについての持続時間延長性部分の遠位の*-COOH基が、存在する場合は任意選択でまた保護されている、請求項10に記載の中間生成物。
  12. 薬剤としての使用のための、請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体。
  13. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防における使用のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体。
  14. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための薬剤の製造における、請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体の使用。
  15. 請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体の薬学的な活性量を投与することによる、全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患を治療若しくは予防する方法、並びに/又は脂質パラメーターを改善、β細胞機能を改善する方法、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防する方法。
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