CN102655883A - 具有修饰的n-末端的glp-1受体激动剂化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具经修饰的N-末端的GLP-1受体激动剂化合物。所述化合物具有化学式1：Y-Z-P，其中P代表缺乏两个N-末端氨基酸残基的GLP-1受体激动剂肽的片段；Y-Z代表新的His-Ala模拟物。GLP-1受体激动剂化合物的实例源自人GLP-1(7-37)、exendin-4(1-39)或GLP-1A(1-37)。本发明亦涉及这些化合物的衍生物，尤其是具有能够延长这些化合物的体内作用时间的一个或多个白蛋白结合侧链的化合物。本发明肽和衍生物具有令人满意的效价、延长的药代动力学概况；对胃肠酶的降解稳定；和/或具有高的口服生物利用度。这些性质在开发用于皮下、静脉内和/或尤其是口服给予的GLP-1受体激动剂化合物方面很重要。本发明亦涉及用于制备本发明GLP-1受体激动剂化合物的中间产物。

Description

具有修饰的N-末端的GLP-1受体激动剂化合物
发明领域
本发明涉及GLP-1受体激动剂肽的类似物和衍生物及其药物用途。在本发明GLP-1受体激动剂肽例如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、exendin及其类似物中，两个N-末端氨基酸业已被N-末端模拟物取代。
通过引用并入序列表
2010年12月1日创建的标题为″序列表″的序列表为1770个字节，其通过引用并入本文中。
发明背景
WO 2004/067548A2涉及调节肽的经化学修饰的代谢物及其制备和使用方法。
在WO 98/08871实施例37中公开了由Novo Nordisk A/S销售的每天给予一次的GLP-1衍生物利拉糖肽(Liraglutide)。
在WO 06/097537实施例4中公开了由Novo Nordisk A/S开发的每周给予一次的GLP-1衍生物司美鲁肽(Semaglutide)。
发明概述
本发明涉及包含修饰的N-末端的GLP-1受体激动剂化合物。
优选的化合物具有化学式1：Y-Z-P，其中P代表缺乏N-末端的GLP-1受体激动剂肽的片段；Y-Z代表模拟肽N-末端的基团。该新的N-末端优选为His-Ala、His-Gly和/或His-Ser模拟物。
更具体地，本发明涉及具有化学式1的GLP-1受体激动剂肽或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：Y-Z-P，其中P代表缺乏两个N-末端氨基酸残基的GLP-1受体激动剂肽的片段；Z代表化学式2基团：
Figure BDA00001770438400011
其中W代表化学式3基团：
Figure BDA00001770438400012
其中R1和R2独立地代表：(i)氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基，或R1和R2一起形成：(ii)环烷基、杂环基或杂芳基；和Y代表化学式4基团：
Figure BDA00001770438400021
或化学式5基团：
Figure BDA00001770438400022
其中X1为N、O或S；X2、X3、X4和X5独立地代表C或N，前提为X2、X3、X4和X5中至少一个为C；R11、R12、R13和R14独立地代表：氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基；Q代表键或化学式6基团：*-(C(R15)(R16))q-*，其中q为1-6，R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；R代表氢或烷基。
本发明亦涉及该肽的衍生物及其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
本发明亦涉及这些化合物的药物用途，优选用于治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心脏疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病(critical illness)和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
最后，本发明涉及对应于新的N-末端的中间产物以及肽片段，即在连接新的N-末端之前，这两种都与本发明肽的制备有关。
本发明肽和衍生物具有生物活性，优选高效价。此外或替代地，它们具有延长的药代动力学概况。此外或替代地，它们对胃肠酶的降解稳定。此外或替代地，它们具有高的口服生物利用度。这些性质在开发下一代用于皮下、静脉内和/或特别是口服给予的GLP-1化合物中很重要。
发明详述
本发明涉及具有化学式1的GLP-1受体激动剂肽或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：Y-Z-P，其中P代表缺乏两个N-末端氨基酸残基的GLP-1受体激动剂肽的片段；Z代表化学式2的基团：
Figure BDA00001770438400031
其中W代表化学式3的基团：
Figure BDA00001770438400032
其中R1和R2独立地代表：(i)氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基，或R1和R2一起形成：(ii)环烷基、杂环基或杂芳基；和Y代表化学式4的基团：
Figure BDA00001770438400033
或化学式5的基团：
Figure BDA00001770438400034
其中X1为N、O或S；X2、X3、X4和X5独立地代表C或N，前提为X2、X3、X4和X5中至少一个为C；R11、R12、R13和R14独立地代表：氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基；Q代表键或化学式6的基团：*-(C(R15)(R16))q-*，其中q为1-6，R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；和R代表氢或烷基。
在第一方面，R1和R2不是二者都代表氢，本发明因此涉及具有化学式1的GLP-1受体激动剂肽或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：Y-Z-P，其中P代表缺乏两个N-末端氨基酸残基的GLP-1受体激动剂肽的片段；Z代表化学式2的基团：其中W代表化学式3的基团：
Figure BDA00001770438400041
其中R1和R2独立地代表：(i)氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基，或R1和R2一起形成：(ii)环烷基、杂环基或杂芳基，前提为(iii)R1和R2不是二者都代表氢；和Y代表化学式4的基团：
Figure BDA00001770438400042
或化学式5的基团：
Figure BDA00001770438400043
其中X1为N、O或S；X2、X3、X4和X5独立地代表C或N，前提为X2、X3、X4和X5中至少一个为C；R11、R12、R13和R14独立地代表：氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基；Q代表键或化学式6的基团：*-(C(R15)(R16))q-*，其中q为1-6，R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；和R代表氢或烷基。
在第二方面，R1和R2二者可都代表氢，Q-NR-*不与化学结构4的氮原子连接。
在第三方面，R1和R2二者可都代表氢，Q-NR-*不与化学结构4的碳原子连接。
本发明亦涉及这些肽中每一种的衍生物，并涉及其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
本发明亦涉及这些化合物的药物用途，优选用于治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心脏疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
最后，本发明涉及对应于新的N-末端的中间产物以及肽片段，即在连接新的N-末端之前，这两种都与本发明肽的制备有关。
下文中，可通过其符号或相应的书面名称来表示希腊字母，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；等等。此外，希腊字母μ可由″u″来表示，例如在μl＝ul或μM＝uM中。
化学式中的星号(*)指明：i)连接点；ii)基团；和/或iii)非共享电子。
GLP-1受体激动剂
本发明GLP-1受体激动剂化合物可来源于或衍生自人GLP-1(7-37)、exendin-4(1-39)和/或GLP-1A(1-37)。可在UniProt知识库(UniProtKB)中-SwissProt部分(www.uniprot.org)分别用以下登记号、序列标识符和序列名称找到这些肽的氨基酸序列：UNIPROT：P01275_8，GLUC_人，胰高血糖素样肽1(7-37)；UNIPROT：P26349_3，EXE4_HELSU，Exendin-4或艾塞那肽(exenatide)；和UNIPROT：O42143_5，GLUC1_XENLA，胰高血糖素样肽1A。
缺乏两个N-末端氨基酸的相应片段的序列，即GLP-1(9-37)、exendin-4(3-39)和GLP-1A(3-37)包括在所附序列表中，其分别为SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
GLP-1受体激动剂片段(本发明化合物可由其得到或由其衍生)的另一实例是命名为exendin-3(3-39)的肽，其为SEQ ID NO：2的D3类似物，即除了在3位具有天冬氨酸(D，Asp)(第一个氨基酸残基)外与SEQID NO：2相同。
可在以上提及的UniprotKB数据库中用以下登记号、标识符和名称找到GLP-1受体序列：UNIPROT：P43220、GLP1R_人、胰高血糖素样肽1受体、GLP-1受体、GLP-1-R或GLP-1R。
本文所用术语″GLP-1受体激动剂″，指为人GLP-1受体激动剂的化合物，即在含有人GLP-1受体的介质中刺激cAMP形成的化合物。按以下标题为″效价″部分中所述来测定GLP-1受体激动作用(agonism)或效价，亦参见本文实施例13。
氨基酸和肽
术语“肽”，例如在本发明GLP-1受体激动剂肽情境中所用的，指包含由酰胺(或肽)键互相连接的一系列氨基酸的化合物。
在特定实施方案中，所述肽在很大程度上或主要由通过酰胺键互相连接的氨基酸组成(例如摩尔质量的至少50％、60％、70％、80％或至少90％)。在另一特定实施方案中，所述肽由通过肽键互相连接的氨基酸组成。
本发明肽包含由肽键连接的至少五个组分氨基酸。在特定实施方案中，所述肽包含至少10个、优选至少15、更优选至少20、甚至更优选至少25或最优选至少28个氨基酸。
在特定实施方案中，所述肽由至少五个组分氨基酸组成，优选由至少10、至少15、至少20、至少25个氨基酸组成，或最优选由至少28个氨基酸组成。
在另外的特定实施方案中，所述肽a)包含以下(composed of)或b)由以下组成(consist of)：i)29个氨基酸、ii)30个氨基酸、iii)31个氨基酸或iv)32个氨基酸。
在再进一步的特定实施方案中，所述肽a)包含以下或b)由以下组成：i)33个氨基酸、ii)34个氨基酸、iii)35个氨基酸或iv)36个氨基酸。
在又一特定实施方案中，所述肽由通过肽键互相连接的氨基酸组成。
氨基酸为含有胺基和羧酸基团并任选一个或多个另外基团的分子，所述其它基团通常被称为侧链。
术语″氨基酸″包括成蛋白质性(proteogenic)氨基酸(由遗传密码编码，包括天然氨基酸和标准氨基酸)以及非蛋白氨基酸(在蛋白质中未发现和/或不能用标准遗传密码编码)和合成氨基酸。因此，所述氨基酸可选自成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸和/或合成氨基酸。
不是由遗传密码编码的氨基酸的非限制性实例有γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸和磷酸丝氨酸。合成氨基酸的非限制性实例有氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、β-丙氨酸和脱氨基-组氨酸(desH，备用名称为咪唑丙酸，缩写为Imp)。
在下文中，应该将未阐明光学异构体的所有氨基酸理解为意指L-异构体(除非另外规定)。
GLP-1受体激动剂肽、片段、类似物、残基编号、同一性
″GLP-1受体激动剂肽″为如上所定义的肽，还为如上所定义的GLP-1受体激动剂。
本发明肽为GLP-1受体激动剂肽。
GLP-1受体激动剂肽的另外实例为以下已知化合物：人GLP-1(7-37)、exendin-4(1-39)、exendin-3(1-39)和GLP-1A(1-37)。
在特定实施方案中，本发明GLP-1受体激动剂化合物可来源于或衍生自这些已知GLP-1受体激动剂肽中的任何一种或多种。
术语″片段″当其指GLP-1受体激动剂肽时，意指比所提及的肽短的肽。
在对应于式I基团P的定义的特定实施方案中，与GLP-1受体激动剂的相应的全长肽比较，所述片段缺乏两个N-末端氨基酸。
在另一特定实施方案中，该特定片段由于i)基本上丧失生物活性、ii)优选几乎全部丧失生物活性或iii)更优选为所有实用目的地全部丧失生物活性(即GLP-1受体激动作用)，在本质上已经不是GLP-1受体激动剂。
P(缺乏两个N-末端氨基酸残基的GLP-1受体激动剂肽的片段)的特定实例为以下：GLP-1(9-37)、exendin-4(3-39)和GLP-1A(3-37)，其包括在所附序列表中，分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3。P的另一实例为exendin-3(3-39)，其为SEQ ID NO：2的D3变体。
在序列表中，将GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)片段的第一个氨基酸残基指定为1号，其为谷氨酸。然而，在下文中，按照本领域惯例，将该谷氨酸残基称为9号，并相应地为随后的氨基酸残基编号，以37号甘氨酸结束。
同样，在序列表中，将exendin-4(3-39)(SEQ ID NO：2)的第一个氨基酸残基指定为1号，其亦为谷氨酸。然而，在下文中，按照本领域惯例，将该谷氨酸残基称为3号，并相应地为随后的氨基酸残基编号，以39号丝氨酸结束。
同样，在序列表中，将GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)的第一个氨基酸残基指定为1号，其为天冬氨酸。然而，在下文中，按照本领域惯例，将该天冬氨酸称为3号，并相应地为随后的氨基酸残基编号，以37号丝氨酸结束。
因此，本文在SEQ ID NO：1、2或3的肽或其类似物情境中任何对氨基酸残基编号或位置编号的提及，通常是指分别以9位Glu、3位Glu或3位Asp开始并分别以37位Gly、39位Ser或37位Ser结束的序列。
P的另外特定实施例为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ IDNO：3的类似物。
本文在SEQ ID NO：1、2或3的情境中所用的″类似物″，指肽或化合物，其为SEQ ID NO：1、2或3的任何一种或多种的变体。
在特定实施方案中，SEQ ID NO：1类似物指对SEQ ID NO：1进行的修饰，其中与SEQ ID NO：1比较多个氨基酸残基被交换。这些交换或修饰可独立代表一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失。然而，优选排除在N-末端添加。类比SEQ ID NO：1类似物的定义，相似地来定义SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的类似物。
可通过参考参考序列、参考对应于被修饰的氨基酸残基的参考序列中的氨基酸残基编号(即其位置)并参考实际修饰来阐述类似物。
在特定实施方案中，参考序列为：i)GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)；ii)exendin-4(3-39)(SEQ ID NO：2)；或iii)GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)。
以下为本文所用的合适类似物命名的非限制性的说明性实例：
N9-[-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基(propionyl)}-[Lys18，Glu22，Gln34]GLP-1(9-37)肽，为来源于GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)的本发明GLP-1受体激动剂肽，即化学结构1中的P为SEQ ID NO：1类似物，即其中18位丝氨酸被赖氨酸取代、22位甘氨酸被谷氨酸取代和34位赖氨酸被谷氨酰胺取代的类似物；
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)丙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-肽，为来源于GLP-1(9-37)(SEQ IDNO：1)的本发明GLP-1受体激动剂肽，即化学结构1中的P为SEQ IDNO：1类似物，即其中30位丙氨酸被谷氨酸取代、36位精氨酸被赖氨酸取代和在C-末端即38位添加谷氨酸的类似物；和
N3-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Arg17，Arg20，Arg33，Lys38]GLP-1A(3-37)-肽，为来源于GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)的本发明GLP-1受体激动剂肽，即化学结构1中的P为SEQ ID NO：3类似物，即其中17、20和33位赖氨酸被精氨酸取代和在C-末端即38位添加赖氨酸的类似物。
顺便提及，该肽亦可来源于SEQ ID NO：1，因此其亦可被命名为GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)的类似物(17T、18Q、19Q、21D、22E、23R、26R、30D、33I、34N、36G、37P、38S、39R、40E、41I、42I、43S、44K)，其具有与N-末端N9连接的{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-。
作为另一实例，″与GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)比较包含以下取代中至少一种：18K；22E；30E；31H；34Q，R；36K；37K；和/或38E″的本发明GLP-1受体激动剂肽，指其中认为化学结构1的P为SEQ IDNO：1类似物的GLP-1受体激动剂肽，所述类似物具有：18位赖氨酸、22位谷氨酸、30位谷氨酸、31位组氨酸、34位谷氨酰胺、36位赖氨酸、37位赖氨酸和/或38位谷氨酸，且所述类似物可包含进一步的修饰(与SEQ ID NO：1相比)。
从以上实例明显看出，可通过其全称、其一个字母的编码和/或其三个字母的编码来确定氨基酸残基。这三种方式完全等同。
可通过参考SEQ ID NO：1、2或3中任何一种或多种，将表述“等同位置”或″相应位置″用于表征经修饰的GLP-1受体激动剂肽序列的修饰位点。可通过以下方法容易地推论出等同或相应位置以及修饰的编号：例如通过简单手写及目测；和/或可使用标准蛋白质或肽比对程序，例如其为Needleman-Wunsch比对的″比对″。在Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48：443-453中阐述算法，以及由Myers和W.Miller在″Optimal Alignments in LinearSpace(线性空间的最佳比对)″CABIOS(生物科学中的计算机应用)(1988)4：11-17中阐述比对程序。为了进行比对，可使用默认记分矩阵(default scoring matrix)BLOSUM50和默认单位矩阵，空隙中的第一个残基罚分可设为-12或优选-10，空隙中另外的残基罚分设为-2或优选-0.5。
该算法亦可适宜地用于测定本发明GLP-1受体激动剂肽的P-基团与SEQ ID NO：1、2和3中每一个的同一性程度，例如为了测定这三个序列中哪一个与目的P-基团具有最高同一性百分比，并由此用于测定与最密切相关的序列SEQ ID NO：1-3(同一性百分比最高的那个)比较被交换的氨基酸残基的数目。若给定的本发明GLP-1受体激动剂的P基团分别与SEQ ID NO：1、2和3的同一性百分比碰巧相同，那么具有相同的最高同一性百分比的它们中的任何一种可用于测定。
下文中插入所述比对的实例，其中1号序列为SEQ ID NO：1，2号序列为SEQ ID NO：3：
#1：GLP_1(9-37)
#2：GLP-1A(3-37)
#矩阵：EBLOSUM62
#空隙_罚分：10.0
#扩展_罚分：0.5
#长度：35
#同一性：18/35(51.4％)
#相似性：22/35(62.9％)
#空隙：6/35(17.1％)
#记分：92.0
GLP_1(9-37)     1 EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG------    29
                  ||||||||:..|:.:||||||.||:.|..
GLP-1A(3-37)    1 EGTFTSDVTQQLDEKAAKEFIDWLINGGPSKEIIS    35
以上比对仅用于阐明，因为通常SEQ ID NO：1、2或3之一的类似物将与这些参考序列中的任一种比较。
在类似物包含包括在序列中的非天然氨基酸例如Imp和/或Aib情况下，为比对目的这些可用X取代。若需要，随后可手动更正X。
衍生物
在本发明GLP-1受体激动剂肽的情境中，本文所用术语“衍生物”意即化学修饰的肽或类似物，其中一个或多个取代基与所述肽共价连接。取代基亦可被称为侧链。在特定实施方案中，本发明衍生物具有一个侧链。在另一特定实施方案中，其具有两个侧链。为该定义目的，优选不考虑式I基团Y-Z-为取代基/侧链。
在特定实施方案中，所述侧链具有至少10个碳原子或至少15、20、25、30、35、40或至少43个碳原子。在另外的特定实施方案中，侧链可进一步包括至少5个杂原子，尤其是O和N，例如至少7、9、10、12、15、17或至少20个杂原子，例如至少1、2、3或4个N-原子和/或至少3、4、6、9、12、13或15个O-原子。
GLP-1受体激动剂衍生物的非限制性实例包括本发明GLP-1受体激动剂肽与以下物质的异源融合蛋白或缀合物：例如与免疫球蛋白例如IgG的Fc部分、与人白蛋白、与抗体例如胰高血糖素结合抗体重链可变区或与这些中任何一种的片段或类似物(参见例如US2007/0161087、WO 2005/058958和WO 2007/124463A2)。另外的实例包括PEG化的肽(参见例如WO 2005/058954、WO 2004/093823和WO 2006/124529)以及酰化的肽(参见例如WO 98/08871、WO2005/027978、WO 2006/097537和WO 2009/030771)。
在优选实施方案中，所述侧链能够与白蛋白形成非共价聚集物，由此促进衍生物随血流的循环，并亦具有延长衍生物的作用时间的作用，这是由于以下事实：衍生物和白蛋白的聚集物只能缓慢崩解释放活性药物成分。因此，优选的取代基或侧链整体来看可被称为白蛋白结合部分。
在另一特定实施方案中，白蛋白结合部分包含对白蛋白结合特别重要并藉此具有延长作用的部分，所述部分可因此被称为延长部分。该延长部分可相对于其与肽的连接点位于或靠近白蛋白结合部分的相反端。
在又一特定实施方案中，白蛋白结合部分包含在延长部分和与所述肽的连接点之间的部分，所述部分可被称为接头、接头部分、间隔子(spacer)等等。任选存在接头；因此，如果不存在接头，则白蛋白结合部分可等同于延长部分。
在特定实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分为亲脂性的，和/或在生理pH(7.4)时带负电荷。
所述白蛋白结合部分、延长部分或接头可通过缀合化学(例如通过烷化、酰化、酯形成或酰胺形成)与GLP-1受体激动剂肽的赖氨酸残基共价连接；或与半胱氨酸残基共价连接，例如通过马来酰亚胺或卤代乙酰胺(例如溴代-/氟代-/碘代-)偶联。
在优选实施方案中，任选具接头的白蛋白结合部分和/或延长部分的活性酯在形成酰胺键过程(该过程被称为酰化)中与赖氨酸残基的氨基(优选其ε氨基)共价连接。
除非另外指出，否则当提及赖氨酸残基的酰化时，应理解为其ε-氨基。
在一个实施方案中，本发明涉及GLP-1受体激动剂肽衍生物，其包含(优选具有)与18K、26K、36K和/或37K中的一个或多个连接的白蛋白结合部分，其中参考物应为GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)序列。如上所解释，每一个残基编号指GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)中的相应位置。此外，亦如上所解释，正常字体可用于代替上标来指明位置编号。例如，″K18″完全等同于″18K″。
优选由手写和目测或通过用合适的比对程序来确定相应位置编号，其如上所解释。
为本目的，术语″白蛋白结合部分″、″延长部分″和″接头″包括这些分子的未反应的形式以及反应的形式。根据使用该术语的情境可明了其意指这种还是另一种形式。
在一个方面，所述白蛋白结合部分包含选自以下的延长部分或由其组成：
化学结构8：HOOC-(CH2)x-CO-*
化学结构9：HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学结构10：R18-C6H4-(CH2)z-CO-*
其中x为6-18范围内的整数，y为3-17范围内的整数，z为1-5范围内的整数，R18为具有不高于150Da的摩尔质量的基团。
在一个实施方案中，*-(CH2)x-*指直链或支链亚烷基，优选直链亚烷基，其中x为6-18范围内的整数。
在另一实施方案中，*-(CH2)y-*指直链或支链亚烷基，优选直链亚烷基，其中y为3-17范围内的整数。
在第三实施方案中，*-(CH2)z-*指直链或支链亚烷基，优选直链亚烷基，其中z为1-5范围内的整数。
化学物质(例如基团R1)的摩尔质量(M)是一摩尔所述物质的质量。以道尔顿来引用摩尔质量，符号为Da，且定义1Da＝1g/摩尔。
可根据标准原子量计算摩尔质量，其通常列入化学品目录中。通过将形成化合物的原子的标准原子量总和乘以摩尔质量常数Mu，来得到化合物的摩尔质量，Mu等于1g/摩尔。例如，叔丁基(C4H9)分子量为M(C4H9)＝([4×12.01]+[9×1.008])×1g/摩尔＝57Da。
国际纯粹化学与应用化学联合会(IUPAC)发布了标准原子量，并亦在多种多样的教科书、商业目录、挂图等中转载。
为了与GLP-1受体激动剂肽连接，脂肪酸的酸基团或脂肪二酸的酸基团之一与GLP-1受体激动剂肽的赖氨酸残基的ε氨基形成酰胺键。
术语″脂肪酸″指脂肪族单羧酸，其具有4-28个碳原子，优选不分支和/或偶数编号，其可为饱和或不饱和的。
术语″脂肪二酸″指如上所定义但在ω位置有另一个羧酸基团的脂肪酸。因此，脂肪二酸为二羧酸。
命名法如本领域所常用，例如*-COOH以及HOOC-*指羧基；*-C6H4-*指亚苯基；*-CO-*以及*-OC-*指羰基(O＝C＜**)；和C6H5-O-*指苯氧基。
在特定实施方案中，芳族化合物例如苯氧基和亚苯基可独立为邻位、间位或对位。
在优选实施方案中，若存在接头部分则其具有5-30个C-原子。在另外的优选实施方案中。若存在接头部分则其具有4-20个杂原子。H-原子不是杂原子。
在另一实施方案中，接头包含至少一个OEG分子、至少一个谷氨酸残基和/或至少一个哌啶分子，任选被取代，或更确切地说是相应基团(OEG称为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，即该二-基团：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*)。
氨基酸谷氨酸包含两个羧酸基团。优选用其γ-羧基与以下基团形成酰胺键：与赖氨酸的ε-氨基；或与OEG分子的氨基(若存在)，或与另一Glu残基的氨基(若存在)。Glu的氨基进而与以下基团形成酰胺键：与延长部分的羧基；或与OEG分子的羧基(若存在)；或与另一Glu的γ-羧基(若存在)。这种包含Glu的方式有时被简称为″γ-Glu″。
本发明衍生物可以以不同立体异构形式存在，所述立体异构形式具有相同分子式和键合原子次序，但仅在其原子的空间三维取向上不同。在实验部分用标准命名法在名称以及结构方面指出本发明例示性的衍生物的立体异构现象。除非另外指出，否则本发明涉及要求保护的衍生物的所有立体异构形式。
可用任何合适方法测定本发明GLP-1受体激动剂肽和衍生物的血浆浓度。例如，可使用LC-MS(液相色谱质谱)或免疫测定，例如RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)和LOCI(光激化学发光免疫测定(Luminescence Oxygen Channeling Immunoasssay))。用于合适RIA和ELISA测定的一般方案可参见例如WO09/030738第116-118页。优选测定为LOCI测定，其中用光激化学发光免疫测定(LOCI)来测定化合物的血浆浓度，其通常如Poulsen和Jensen在Journalof Biomolecular Screening 2007，第12卷第240-247页中对胰岛素的测定所述。用链霉抗生物素包被供体珠，而让受体珠与识别肽的中间-/C-末端表位的单克隆抗体缀合。使特异性针对N-末端的另一单克隆抗体生物素化。将这三种反应物与被分析物混合，形成两位点的(two-sited)免疫复合物。光照该复合物使单峰氧原子从供体珠释放，将其引入受体珠，引发化学发光，在Envision读板仪中测量该发光。光量与化合物浓度成比例。
药学上可接受的盐、酰胺或酯
本发明GLP-1受体激动剂肽、衍生物和中间产物可呈药学上可接受的盐、酰胺或酯的形式。
例如，由碱和酸之间的化学反应形成盐，例如：NH3+H2SO4→(NH4)2SO4。
盐可为碱性盐、酸性盐，或其可既不是碱性盐也不是酸性盐(即中性盐)。碱性盐在水中产生氢氧离子而酸性盐产生水合氢离子。
可与所添加的阳离子或阴离子形成本发明肽和衍生物的盐，所述添加的阳离子或阴离子分别与阴离子基团或阳离子基团反应。这些基团可位于肽部分和/或在本发明化合物的侧链中。
本发明化合物的阴离子基团的非限制性实例包括侧链的游离羧基(如果有的话)以及肽部分的游离羧基。肽部分通常包括C-末端的游离羧酸基团，其亦可包括内部酸性氨基酸残基例如Asp和Glu的游离羧基。
肽部分的阳离子基团的非限制性实例包括N-末端的游离氨基(如果存在的话)以及内部碱性氨基酸残基例如His、Arg和Lys的游离氨基。
可例如让游离羧酸基团与醇或酚反应来形成本发明肽和衍生物的酯，这导致由烷氧基或芳氧基取代至少一个羟基。
酯形成可涉及肽C-末端的游离羧基和/或侧链中的任何游离羧基。
可例如通过让游离羧酸基团与胺或取代的胺反应，或通过让游离的或取代的氨基与羧酸反应，来形成本发明肽和衍生物的酰胺。
酰胺形成可涉及肽C-末端的游离的羧基、侧链中任何游离的羧基、肽N-末端的游离的氨基、和/或肽和/或侧链中的任何游离的或取代的氨基。
在特定实施方案中，肽或衍生物呈药学上可接受的盐形式。在另一特定实施方案中，肽或衍生物呈药学上可接受的酰胺形式，优选含肽C-末端的酰胺基团。在又一特定实施方案中，肽或衍生物呈药学上可接受的酯形式。
中间化合物
本发明亦涉及化学式50或化学式51的中间产物：
化学结构50：
Figure BDA00001770438400161
化学结构51：
其中Q、R、R1和R2如上对于具有化学式1的本发明GLP-1受体激动剂肽所定义，PG1和PG2每一个代表保护基。
PG1基团的非限制性实例为Boc、Trt、Mtt、Mmt和Fmoc。
PG2基团的非限制性实例为-OH或官能化为活化酯的基团，例如但不限于OPfp、OPnp和OSuc。
可例如按照M.Bodanszky，″Principles of Peptide Synthesis″，第2版，Springer Verlag，1993的教导选择其它合适的活化酯。
功能性质
在第一功能方面，本发明GLP-1受体激动剂肽和/或衍生物具有令人满意的效价。此外或替代地，在第二功能方面，它们具有延长的药代动力学概况。此外或替代地，在第三功能方面，它们具有抵抗胃肠酶降解的稳定性。此外或替代地，在第四功能方面，它们具有高的口服生物利用度。
生物活性(效价)
按照第一功能方面，GLP-1受体激动剂衍生物具有生物活性或具有令人满意的效价。
意想不到地，与本文实施例11的比较性化合物(化学结构40)比较，它们具有改进的效价，所述化学结构40基于现有技术的最有效化合物之一，即WO2004/067548的化合物215。
此外或另外，本发明衍生物在低白蛋白浓度(0.005％)时与GLP-1受体具有高结合亲和力，即低IC50值，其在下文受体结合标题下进一步讨论。
关于效价，术语半数最大有效浓度(EC50)通常指通过参考剂量反应曲线诱导基线和最大值之间的一半反应的浓度。将EC50用作化合物效价的量度且EC50代表其中观察到其最大效应的50％的浓度。
可如下文所述测定本发明衍生物的体外效价，并测定目的衍生物的EC50。EC50越低，效价越高。
在特定实施方案中，本发明衍生物具有化学结构40的至少3倍效价；优选至少4倍效价；甚至更优选至少5倍效价；或最优选化学结构40的至少6倍效价。
在另一特定实施方案中，本发明衍生物具有化学结构40的至少7倍效价；优选至少8倍效价；甚至更优选至少9倍效价；或最优选化学结构40的至少10倍效价。
在另一特定实施方案中，本发明衍生物具有化学结构40的至少20倍效价；优选至少50倍效价；甚至更优选至少100倍效价；还更优选至少200倍效价；或最优选化学结构40的至少400倍效价。
效价优选如下所述测定，要注意例如三倍效价的化合物具有三分之一的EC50。
在特定实施方案中，效价和/或活性指体外效价，即在功能GLP-1受体测定中的性能，更具体地指在表达克隆的人GLP-1受体的细胞系中刺激cAMP形成的能力。
可优选用以下方法测定在含有人GLP-1受体的培养基中对cAMP形成的刺激：用稳定转染的细胞系例如BHK467-12A(tk-ts13)；和/或用测定cAMP功能受体的测定，例如基于内源性形成的cAMP和外源性添加的生物素-标记的cAMP之间的竞争，其中测定cAMP更优选用特异性抗体来捕获，和/或其中甚至更优选测定为AlphaScreen cAMP测定，最优选实施例13中所述的测定。
在另外一个特定实施方案中，培养基具有以下组成(测定中的最终浓度)：50mM TRIS-HCl；5mM HEPES；10mM MgCl2，6H2O；150mMNaCl；0.01％吐温；0.1％BSA；0.5mM IBMX；1mM ATP；1uM GTP；pH7.4。
在再一特定实施方案中，GLP-1受体激动剂具有低于2000pM、优选低于1800pM、更优选低于1700pM、甚至更优选低于1600pM或最优选低于1500pM的EC50。
在另一特定实施方案中，本发明衍生物在体内有效，其可如本领域已知在任何合适的动物模型以及在临床试验中测定。糖尿病db/db小鼠是合适动物模型的一个实例，在所述小鼠体内可测定降低血糖的作用，其例如如WO09/030738的实施例43中所述。
延长-受体结合-高和低白蛋白
按照第二功能方面，本发明衍生物具有延长的作用。
在本文实施例14中公开了用于在高和低白蛋白浓度时测定本发明肽和衍生物的受体结合的合适测定。
通常在低白蛋白浓度时，与GLP-1受体的结合应该尽可能令人满意，其对应于低的IC50值。
高白蛋白浓度时的IC50值是白蛋白对化合物与GLP-1受体结合的影响的量度。众所周知，本发明肽GLP-1受体激动剂肽衍生物亦结合白蛋白。通常这是所期需的作用，其延长了其在血浆中的寿命。因此，高白蛋白时的IC50值通常比低白蛋白时的IC50值高，对应于与GLP-1受体的结合降低，这是由白蛋白结合与GLP-1受体结合之间的竞争引起的。
因止此，可将高比率(IC50值(高白蛋白)/IC50值(低白蛋白))作为以下的指征：目的衍生物与白蛋白令人满意的结合(可具有长半衰期)，且所述衍生物本身亦与GLP-1受体令人满意的结合(IC50值(高白蛋白)高和IC50值(低白蛋白)低)。在另一方面，白蛋白结合可能并不总是所期需的，或与白蛋白的结合可能太强。因此，IC50(低白蛋白)、IC50(高白蛋白)/和比率(高/低)的所期需范围可因化合物不同而变化，这视所预期的用途及围绕所述用途的情况并视可能感兴趣的其它化合物性质而定。
在特定实施方案中，本发明肽和衍生物在低白蛋白浓度(0.005％)时与GLP-1受体具有高结合亲和力，即低IC50值。
在特定实施方案中，在0.005％HSA(低白蛋白)存在时GLP-1受体结合亲和力(IC50)低于600.00nM，优选低于500.00nM，更优选低于200.00nM，甚至更优选低于100.00nM或最优选低于45.00nM。
胃肠酶降解
按照第三功能方面，本发明GLP-1受体激动剂肽和/或衍生物对一种或多种胃肠酶的降解为稳定的或稳定化的。
胃肠酶包括但不限于外肽酶和内肽酶，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性酶和羧肽酶。可以对呈纯化酶形式或呈来自胃肠系统的提取物形式的这些胃肠酶的稳定性进行测试。
在特定实施方案中，本发明衍生物在大鼠小肠提取物中的体外半衰期(T1/2)除以相应的GLP-1(7-37)半衰期(T1/2)，高于1.0、优选高于2.0、更优选高于3.0、甚至更优选高于4.0或最优选高于5.0。换言之，可限定每一种衍生物的比率(SI)，即为大鼠小肠提取物中目的衍生物的体外半衰期(T1/2)除以相应的GLP-1(7-37)半衰期(T1/2)。
用于在大鼠小肠提取物中测定体外半衰期的合适测定在标题为″Double-acylated GLP-1 derivatives (双-酰化的GLP-1衍生物)″的PCT申请的实施例57中公开，所述申请由Novo Nordisk A/S在本申请的同一天向作为受理局的EPO提交。
延长-大鼠体内半衰期
按照第二功能方面，本发明衍生物具有延长的作用。在特定实施方案中，延长可在i.v.给予大鼠后作为体内半衰期(T1/2)来测定。在另外的实施方案中，半衰期为至少4小时，优选至少5小时，甚至更优选至少6小时或最优选至少8小时。
用于在大鼠中i.v.给予后体内测定半衰期的合适测定在标题为″Double-acylated GLP-1 derivatives (双-酰化的GLP-1衍生物)″的PCT申请的实施例58中公开，所述申请由Novo Nordisk A/S在本申请提交同一天向作为受理局的EPO提交。
延长-小型猪(minipig)体内半衰期
按照第二功能方面，本发明衍生物具有延长的作用。在特定实施方案中，延长可在i.v.给予小型猪后作为体内半衰期(T1/2)来测定。在另外的实施方案中，半衰期为至少12小时，优选至少24小时，更优选至少36小时，甚至更优选至少48小时或最优选至少60小时。
用于在i.v给予小型猪后体内测定半衰期的合适测定公开于本文实施例16中。
口服生物利用度
按照第四功能方面，本发明衍生物具有高的口服生物利用度。
市售GLP-1受体激动剂肽衍生物的口服生物利用度极低。开发中用于i.v.或s.c给予的所述衍生物的口服生物利用度亦低。
因此，本领域需要已改进口服生物利用度的衍生物。所述衍生物可为口服给药的合适候选物，只要其效价总体上令人满意，和/或只要其半衰期总体上亦令人满意即可。
本发明人鉴定了新类型的GLP-1受体激动剂肽衍生物，其具有高的口服生物利用度，同时具有令人满意的效价和/或半衰期。
此外或替代地，这些衍生物具有高的口服生物利用度，同时在低浓度白蛋白时与GLP-1受体具有高结合亲和力(即低IC50值)。
为了获得低的口服日剂量的活性药物成分，这些特征很重要，所述获得低的口服日剂量的活性药物成分是期需的，这出于多种原因，包括例如生产的经济性、潜在安全性问题的可能性以及给药舒适性问题和环境问题。
术语本发明GLP-1受体激动剂化合物的生物利用度，通常指给予的化合物剂量不变地到达体循环的部分。根据定义，当静脉内给予药物时，其生物利用度为100％。然而，当经由其它途径(例如经口)给予药物时，其生物利用度降低(由于不完全吸收和首过代谢)。当计算用于非静脉内给药途径的剂量时，了解生物利用度是必需的。
口服的绝对生物利用度比较口服给药后活性药物在体循环中的生物利用度(估测为曲线下面积或AUC)与静脉内给予同一药物后的生物利用度。其为与相应的静脉内给予同一药物比较，通过非静脉内给予所吸收的药物的部分。如果使用不同剂量，应该使剂量标准化来比较；因此，每一AUC都通过除相应的给予剂量来校正。
在口服和静脉内给予后，均用血浆药物浓度对时间作图。绝对生物利用度(F)是校正剂量的口服AUC除以静脉内AUC。
本发明GLP-1受体激动剂化合物具有高于a)利拉糖肽和/或b)司美鲁肽的口服绝对生物利用度；优选高至少10％，更优选高至少20％，甚至更优选高至少30％或最优选高至少40％。在测定口服生物利用度之前，可如促胰岛素化合物的口服制剂领域所知，合适地配制本发明GLP-1受体激动剂化合物，其例如用WO 2008/145728中所述的任何一种或多种配方。
如实施例15所述开发测试，发现该测试能很好地预测口服生物利用度。按照该测试，在将GLP-1衍生物直接注射到大鼠肠腔后，测定其在血浆中的浓度(暴露)，计算t＝30分钟的血浆浓度(皮摩尔/升)除以给药溶液中的浓度(微摩尔/升)的比率。该比率是肠生物利用度的量度，其显示与实际口服生物利用度数据很好地相关。
本发明衍生物的另外特定实施方案阐述于实验部分之前标题为″特定实施方案″的部分。
制备方法
肽例如GLP-1(7-37)及其类似物的制备在本领域众所周知。
本发明式I肽的片段P可例如通过经典的肽合成，例如用t-Boc或Fmoc化学的固相肽合成或其它充分建立的技术来制备，参见例如Greene和Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley&Sons，1999；Florencio Zaragoza
Figure BDA00001770438400221
“Organic Synthesis on solidPhase”，Wiley-VCH Verlag GmbH，2000；和“Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis”，由W.C.Chan和P.D.White编辑，Oxford University Press，2000。
此外或替代地，其可由重组方法制备，即通过培养含有编码该片段的DNA序列并能够在允许表达该肽的条件下于合适营养培养基中表达所述肽的宿主细胞来制备。适于表达这些肽的宿主细胞的非限制性实例为大肠杆菌(Escherichia coli)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以及哺乳动物BHK或CHO细胞系。
可例如如实验部分所述来产生将Y-Z引入(即加入)式I的P的本发明GLP-1受体激动剂完整肽。或参见Hodgson等：″The synthesis ofpeptides and proteins containing non-natural amino acids(含有非天然氨基酸的肽和蛋白质的合成)″，Chemical Society Reviews，第33卷第7期(2004)，第422-430页；和标题为″GLP-1类似物的半重组制备″的WO2009/083549A1。
可如本领域所知来制备本发明衍生物，并且制备多种本发明衍生物的方法的具体实例包括在本文实验部分。
药物组合物
可如本领域所知来制备药物组合物，其包含本发明肽或衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯及药学上可接受的赋形剂。
术语″赋形剂″广泛指活性治疗成分以外的任何组分。赋形剂可为惰性物质、非活性物质和/或无医药活性的物质。
赋形剂可满足不同目的，例如作为载体、溶媒、稀释剂、片剂助剂和/或改进活性物质的给予和/或吸收。
药物活性成分与各种赋形剂的配制为本领域已知，参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)和任何以后的版本)。
赋形剂的非限制性实例为：溶剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。
制剂实例包括液体制剂，即包含水的水性制剂。液体制剂可为溶液剂或混悬剂。水性制剂通常包含至少50％w/w的水或至少60％、70％、80％或甚至至少90％w/w的水。
或者，药物组合物可为固态制剂，例如冻干或喷干组合物，其可原样使用，或医生或患者在临用前向其中加入溶剂和/或稀释剂使用。
水性制剂的pH可为pH 3-pH 10之间的任何值，例如约7.0-约9.5；或约3.0-约7.0。
药物组合物可包含缓冲剂。缓冲剂可例如选自：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、曲辛(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸及其混合物。药物组合物可包含防腐剂。防腐剂可例如选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、氯丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇(bronopol)、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3p-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)及其混合物。防腐剂可以以0.1mg/ml-20mg/ml的浓度存在。药物组合物可包含等渗剂。等渗剂可例如选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇(sugar alcohol)、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(alditol)(例如丙三醇(甘油)、1，2-丙烷二醇(丙二醇)、1，3-丙烷二醇、1，3-丁烷二醇)聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。可使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、支链淀粉、糊精、环糊精、α和βHPCD、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。糖醇(sugar alcohol)可被定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂为甘露醇。药物组合物可包含螯合剂。螯合剂可例如选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐及其混合物。药物组合物可包含稳定剂。稳定剂可例如为一种或多种氧化抑制剂、聚集抑制剂、表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。这些各种各样的稳定剂的非限制性实例在以下揭示。
术语″聚集物形成″指肽分子之间导致形成寡聚物的物理相互作用，其可保持可溶性或从溶液沉淀为可见的大聚集物。在液态药物组合物储存期间由肽形成聚集物可有害影响该多肽的生物活性，导致损失药物组合物的治疗功效。此外，聚集物形成可产生其它问题，例如当将含多肽的药物组合物用输注系统给予时堵塞管、膜或泵。
药物组合物可包含足以在组合物储存期间降低多肽的聚集物形成的氨基酸碱的量。术语″氨基酸碱″指一种或多种氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)或其类似物。任何氨基酸可以以其游离碱形式或以其盐形式存在。可存在氨基酸碱的任何立体异构体(即L、D或其混合物)。
当作为治疗剂起作用的多肽为包含对下述氧化易感的至少一个甲硫氨酸残基的多肽时，可加入甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基氧化为亚砜甲硫氨酸。可使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。
药物组合物可包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。稳定剂可例如选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如一硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇和不同的盐(例如氯化钠)。药物组合物可包含：另外的稳定剂，例如但不限于甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽免于甲硫氨酸氧化；和非离子表面活性剂，其保护多肽免于与冻融或机械剪切相关的聚集。
药物组合物可包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”指由水溶性(亲水)部分和脂溶性(亲脂)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可例如选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。
药物组合物可包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如EDTA(乙二胺四乙酸)和/或苄脒HCl。
另外任选药物组合物成分包括例如：湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶)和/或两性离子(例如氨基酸例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
再另外地，可如促胰岛素化合物的口服制剂领域所知配制药物组合物，例如用WO 2008/145728中所述的任何一种或多种配方。
给予的剂量可含有0.01mg-100mg的GLP-1受体激动剂衍生物或0.01-50mg或0.01-20mg或0.01-10mg的GLP-1受体激动剂衍生物。
可呈药物组合物形式给予衍生物。可在若干位点将其给予有需要的患者，例如在局部位点，例如皮肤或粘膜位点；在旁路吸收位点，例如在动脉、静脉或心脏中；和在涉及吸收的位点，例如在皮肤中，在皮下、在肌肉中或在腹部。
给药途径可例如为：经舌给药；舌下给药；含服给药；经口给药；口服给药；经胃给药；经肠给药；经鼻给药；经肺给药，例如通过细支气管、肺泡或其组合；胃肠外给药、表皮给药；皮肤给药；透皮给药；结膜给药；输尿管给药；阴道给药；直肠给药；和/或经眼给药。组合物可为口服组合物，给药途径为口服。
组合物可以以若干剂型给予，例如作为溶液剂；混悬剂；乳剂；微乳剂；复合型乳剂；泡沫剂；药膏；糊剂；硬膏剂；软膏剂；片剂；包衣片剂；口香糖；冲洗剂(rinse)；胶囊剂，例如硬或软明胶胶囊剂；栓剂；直肠胶囊剂；滴剂；凝胶剂；喷雾剂；粉剂；气雾剂；吸入剂；滴眼液；眼膏剂；眼用冲洗剂(ophthalmic rinse)；阴道栓剂；阴道环；阴道软膏剂；注射溶液剂；原位转化溶液剂，例如原位凝胶剂、沉降剂、沉淀剂和原位结晶剂；输注溶液剂；或作为植入剂。组合物可为片剂(任选包衣片剂)、胶囊剂或口香糖。
组合物可进一步与药物载体或药物递送系统配混(compound)，例如，以便改进稳定性、生物利用度和/或溶解性。在特定实施方案中，组合物可通过共价、疏水和/或静电相互作用与所述系统连接。所述配混的目的可为例如降低有害作用、实现时间治疗和/或提高患者的依从性。
组合物亦可用于控释、持续释放、延长释放、延迟释放和/或缓慢释放药物递送系统的制剂中。
胃肠外给药可通过借助注射器(任选笔式注射器)或借助输注泵在皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射来实施。
组合物可呈溶液剂、混悬剂或粉剂形式经鼻给予；或其可呈液体或粉末喷雾剂形式经肺给予。
透皮给药是再另一选择，例如通过无针注射，自贴剂例如离子导入贴剂，或经由透粘膜途径例如经含服。
组合物可为稳定制剂。术语“稳定制剂”指具提高的物理和/或化学稳定性(优选二者都提高)的制剂。一般而言，制剂应该在使用和储存(依从推荐的使用和储存条件)期间稳定，直到到达其有效期。
术语“物理稳定性”指多肽因暴露于热-机械应力和/或与不稳定的界面及表面(例如疏水表面)相互作用而形成生物学非活性和/或不可溶的聚集物的趋势。水性多肽制剂的物理稳定性可通过在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅拌)达不同时间后，借助目视检查和/或通过浊度测量来评估。或者，可用多肽构象状态的光谱试剂或探针例如硫黄素T或“疏水块(hydrophobic patch)”探针来评估物理稳定性。
术语“化学稳定性”指导致形成化学降解产物的多肽结构中的化学(尤其是共价)变化，所述降解产物与完整多肽比较可能具有降低的生物学效价和/或增加免疫原性作用。化学稳定性可通过在暴露于不同的环境条件后于不同时间点(例如通过SEC-HPLC和/或RP-HPLC)测量化学降解产物的量来评估。
用本发明衍生物的治疗亦可与一种或多种另外的药理活性物质联合，所述药理活性物质例如选自抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、食欲调节药剂、抗高血压药剂、用于治疗和/或预防因糖尿病而产生的并发症或与糖尿病有关的并发症的药剂和用于治疗和/或预防因肥胖症而产生的并发症和病症或与肥胖症有关的并发症和病症的药物。这些药理活性物质实例为：胰岛素、磺酰脲、双胍类、氯茴苯酸类、糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、参与刺激糖异生和/或糖原分解的肝酶抑制剂、葡萄糖吸收调节剂、改变脂质代谢的化合物，例如降高血脂药剂如HMG CoA抑制剂(他汀类)、胃抑制性多肽(GIP类似物)、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于β-细胞的ATP-依赖性钾通道的药剂；消胆胺(Cholestyramine)、考来替泊(colestipol)、氯贝丁酯(clofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普罗布考(probucol)、右旋甲状腺素、那格列奈(neteglinide)、瑞格列奈(repaglinide)；β-阻断剂，例如阿普洛尔(alprenolol)、阿替洛尔(atenolol)、噻吗洛尔(timolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)和美托洛尔(metoprolol)；ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂，例如贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、alatriopril、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)；钙通道阻断剂，例如硝苯地平(nifedipine)、非洛地平(felodipine)、尼卡地平(nicardipine)、伊拉地平(isradipine)、尼莫地平(nimodipine)、地尔硫卓(diltiazem)和维拉帕米(verapamil)；和α-阻断剂，例如多沙唑嗪(doxazosin)、乌拉地尔(urapidil)、哌唑嗪(prazosin)和特拉唑嗪(terazosin)；CART(可卡因苯丙胺调节的转录物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、Y2受体激动剂、Y4受体激动剂、混合型Y2/Y4受体激动剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、阿立新(orexin)拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮质素(urocortin)激动剂、β3激动剂、泌酸调节肽和类似物、MSH(促黑素细胞激素)激动剂、MCH(黑素细胞浓集激素)拮抗剂、CCK(缩胆囊素)激动剂、血清素再吸收抑制剂、血清素和去甲肾上腺素再吸收抑制剂、混合的血清素和去甲肾上腺素能化合物、5HT(血清素)激动剂、铃蟾肽激动剂、甘丙肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3(解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦蛋白激动剂、DA激动剂(溴隐亭(bromocriptin)、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(类视黄醇X受体)调节剂、TRβ激动剂；组胺H3拮抗剂，胃抑制性多肽激动剂或拮抗剂(GIP类似物)、胃泌素和胃泌素类似物。
用本发明衍生物的治疗亦可与影响葡萄糖水平和/或脂质稳态的手术联合，所述手术例如胃囊带术或胃旁路术。
药物适应症
本发明亦涉及用作药物的本发明GLP-1受体激动剂肽及其衍生物。
在特定实施方案中，这些化合物可用于以下医药治疗，所有医药治疗都优选以一种方式或另一种方式与糖尿病有关：
(i)预防和/或治疗所有形式的糖尿病，例如高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、MODY(青春晚期糖尿病)、妊娠期糖尿病和/或用于降低HbA1C；
(ii)延迟或防止糖尿病进展，例如2型糖尿病进展；延迟糖耐量减低(IGT)发展为需要胰岛素的2型糖尿病，和/或延迟不需要胰岛素的2型糖尿病发展为需要胰岛素的2型糖尿病；
(iii)改进β-细胞功能，例如降低β-细胞的细胞凋亡、增加β-细胞功能和/或β-细胞质量和/或用于恢复β-细胞对葡萄糖的敏感性；
(iv)预防和/或治疗认知障碍；
(v)预防和/或治疗进食障碍，例如肥胖症，例如通过降低食物摄取、降低体重、抑制食欲、诱导饱满感；治疗或预防暴食症(binge eatingdisorder)、神经性贪食症和/或通过给予抗精神病药物或类固醇诱导的肥胖症；降低胃能动性；和/或延迟胃排空；
(vi)预防和/或治疗糖尿病并发症，例如包括外周神经病在内的神经病；肾病；或视网膜病；
(vii)改进脂质参数，例如预防和/或治疗血脂障碍、降低总血清脂质；降低HDL；降低小、密LDL；降低VLDL：降低甘油三酯；降低胆固醇；增加HDL；降低人载脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；在体外和/或体内抑制脂蛋白a(apo(a))的产生；
(iix)预防和/或治疗心血管疾病，例如：综合征X；动脉粥样硬化；心肌梗塞；冠心病；中风、脑缺血；早期心脏疾病或早期心血管疾病，例如左心室肥厚；冠状动脉病；原发性高血压；急性高血压急症；心肌病；心功能不全；运动耐量；慢性心力衰竭；心律失常；心律紊乱；晕厥(syncopy)；动脉粥样硬化；轻度慢性心力衰竭；心绞痛；心脏分流再封堵(cardiac bypass reocclusion)；间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)；舒张功能障碍；和/或收缩功能障碍；
(ix)预防和/或治疗胃肠疾病，例如炎性肠病综合征；小肠综合征或克罗恩病；消化不良；和/或胃溃疡；
(x)预防和/或治疗危重病，例如治疗病危患者、重症多发性肾病(critical illness poly-nephropathy，CIPNP)患者和/或潜在的CIPNP患者；预防CIPNP危重病或发展；预防、治疗和/或治愈患者的全身炎症反应综合征(SIRS)；和/或用于预防或降低患者在住院期间患菌血症、败血症和/或感染性休克的可能性；和/或
(xi)预防和/或治疗多囊性卵巢综合征(PCOS)。
在特定实施方案中，适应症选自：(i)-(iii)和(v)-(iix)，例如适应症(i)、(ii)和/或(iii)；或适应症(v)、适应症(vi)、适应症(vii)和/或适应症(iix)。
在另一特定实施方案中，适应症为(i)。在又一特定实施方案中，适应症为(v)。在再一特定实施方案中，适应症为(iix)。
特别优选以下适应症：2型糖尿病和/或肥胖症。
特定实施方案
以下为本发明特定实施方案：
1.具有化学式1的GLP-1受体激动剂肽或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：
化学结构1：Y-Z-P，其中
P代表缺乏两个N-末端氨基酸残基的GLP-1受体激动剂肽的片段；
Z代表化学式2基团：
化学结构2：
Figure BDA00001770438400311
其中
W代表化学式3基团：
化学结构3：
Figure BDA00001770438400312
其中
R1和R2独立地代表
(i)氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基或
R1和R2一起形成
(ii)环烷基、杂环基或杂芳基，
前提为
(iii)R1和R2不是二者都代表氢；和
Y代表化学式4或化学式5的基团：
化学结构4：
Figure BDA00001770438400321
化学结构5：
Figure BDA00001770438400322
其中
X1为N、O或S；X2、X3、X4和X5独立地代表C或N，前提为X2、X3、X4和X5中至少一个为C；
R11、R12、R13和R14独立地代表
氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基；Q代表键或化学式6的基团：
化学结构6：
*-(C(R15)(R16))q-*，
其中
q为1-6，
R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；和
R代表氢或烷基。
2.实施方案1的肽，其中R1和R2独立地代表氢、烷基、芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、烷基酯或芳基酯；其中优选烷基、羟基烷基、氨基烷基、羧基烷基、烷氧基，和/或烷基酯含有直链或支链的低级烷基，更优选具有1-6个C-原子。
3.实施方案1-2中任一个的肽，其中R1和R2独立地代表氢、低级烷基或低级烷氧基，其中所述低级烷基和低级烷氧基独立地具有1-5个C-原子，优选1-4个C-原子，或最优选1-3个C-原子。
4.实施方案1-3中任一个的肽，其中R1和R2独立地代表氢、具有1-2个C-原子的烷基(乙基或甲基)或具有1-2个C-原子的烷氧基(乙氧基、甲氧基)。
5.实施方案1-4中任一个的肽，其中R1和R2为甲基或甲氧基，优选甲基。
6.实施方案1的肽，其中R1和R2独立地代表烷基、芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、烷基酯或芳基酯；其中优选烷基、羟基烷基、氨基烷基、羧基烷基、烷氧基，和/或烷基酯含有直链或支链低级烷基，更优选具有1-6个C-原子。
7.实施方案1和6中任一个的肽，其中R1和R2独立地代表低级烷基或低级烷氧基，其中低级烷基和低级烷氧基独立地具有1-5个C-原子，优选1-4个C-原子，或最优选1-3个C-原子。
8.实施方案1和6-7中任一个的肽，其中R1和R2独立地代表具有1-2个C-原子的烷基(乙基或甲基)或具有1-2个C-原子的烷氧基(乙氧基、甲氧基)。
9.实施方案1和6-8中任一个的肽，其中R1和R2为甲基或甲氧基，优选甲基。
10.实施方案1-9中任一个的肽，其中Z为化学式7)的基团：
化学结构7：
11.实施方案1-10中任一个的肽，其中Y为化学结构4。
12.实施方案1-11中任一个的肽，其中X1为N。
13.实施方案1-12中任一个的肽，其中X2、X3、X4和X5之一为N。
14.实施方案1-13中任一个的肽，优选实施方案12的肽，其中：i)X3为N；ii)X4为N；iii)X5为N；或X2为N。
15.实施方案1-14中任一个的肽，其中R11和R12独立地代表氢、烷基、芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、烷基酯或芳基酯；其中优选烷基、羟基烷基、氨基烷基、羧基烷基、烷氧基，和/或烷基酯含有直链或支链低级烷基，更优选具有1-6个C-原子。
16.实施方案1-15中任一个的肽，其中R11和R12独立地代表氢、低级烷基或低级烷氧基，其中所述低级烷基和低级烷氧基独立地具有1-5个C-原子，优选1-4个C-原子，或最优选1-3个C-原子。
17.实施方案1-16中任一个的肽，其中R11和R12独立地代表氢、具有1-2个C-原子的烷基(乙基或甲基)或具有1-2个C-原子的烷氧基(乙氧基、甲氧基)。
18.实施方案1-17中任一个的肽，其中R11和R12为甲基或氢，优选氢。
19.实施方案1-18中任一个的肽，其中Y为1H-咪唑衍生物，优选1H-咪唑-4-基，任选在2、3和/或5位中的一个或两个位置被取代，其中咪唑的位置编号遵照IUPAC，和/或如维基百科2010年12月3日丹麦时间18:00时对于咪唑所示。
20.实施方案1-19中任一个的肽，其中将Q连接到：i)X2、ii)X3、X4或X5，优选连接到X2或X4，最优选连接到X4。
21.实施方案1-20中任一个的肽，其中q为1-5，优选1-4，更优选1-3，甚至更优选1、2或3。
22.实施方案1-21中任一个的肽，其中R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢。
23.实施方案1-22中任一个的肽，其中R15和R16两个都代表氢。
24.实施方案1-23中任一个的肽，其中R为氢。
25.实施方案1-24中任一个的肽，其中Y为咪唑衍生物，例如1H-咪唑，其被化学式7的基团取代：
化学结构7：
*-(R17)-N-*，
其中R17代表直链或支链亚烷基，其具有1-6个C-原子，优选1-5个C-原子，更优选1-4个C-原子，或最优选1-3个C-原子。
26.实施方案1-10中任一个的肽，其中Y为化学结构5。
27.实施方案1-10和26中任一个实施方案的肽，其中R13和R14独立地代表氢、烷基、芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、烷基酯或芳基酯；其中优选烷基、羟基烷基、氨基烷基、羧基烷基、烷氧基，和/或烷基酯含有直链或支链低级烷基，更优选具有1-6个C-原子。
28.实施方案1-10和26-27中任一个的肽，其中R13和R14独立地代表氢、低级烷基或低级烷氧基，其中所述低级烷基和低级烷氧基独立地具有1-5个C-原子，优选1-4个C-原子，或最优选1-3个C-原子。
29.实施方案1-10和26-28中任一个的肽，其中R13和R14独立地代表氢、具有1-2个C-原子的烷基(乙基或甲基)或具有1-2个C-原子的烷氧基(乙氧基、甲氧基)。
30.实施方案1-10和26-29中任一个的肽，其中R13和R14为甲基或氢，优选氢。
31.实施方案1-10和26-30中任一个的肽，其中Y为吡啶衍生物，优选吡啶-2-基，其任选在3、4、5和/或6位的一个或两个位置被取代，其中吡啶的位置编号遵照IUPAC，和/或如维基百科2010年12月3日丹麦时间18:00时对于吡啶所示。
32.实施方案1-10和26-31中任一个的肽，其中Q与吡啶环的2、3、4、5或6位连接，优选与2位连接，其中吡啶位置的编号如实施方案31所定义。
33.实施方案1-32中任一个的肽，其中q如实施方案21所定义。
34.实施方案1-33中任一个的肽，其中R15和R16如实施方案22-23中任一个所定义。
35.实施方案1-34中任一个的肽，其中R为氢。
36.实施方案1-35中任一个的肽，其中所述GLP-1受体激动剂肽为人GLP-1受体激动剂，其P为缺乏两个N-末端氨基酸残基的片段，其中激动剂活性优选测定为在含有人GLP-1受体的培养基中刺激cAMP形成。
37.实施方案36的肽，其中所述培养基为合适的培养基，例如含有人GLP-1受体并具有以下组成(测定中的最终浓度)的培养基：50mM Tris-HCl、1mM EGTA、1.5mM MgSO4、1.7mM ATP、20mMGTP、2mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01％吐温-20、pH 7.4；更优选以下组成(测定中的最终浓度)：50mM TRIS-HCl；5mMHEPES；10mM MgCl2，6H2O；150mM NaCl；0.01％吐温；0.1％BSA；0.5mM IBMX；1mM ATP；1uM GTP；pH 7.4。
38.实施方案1-37中任一个的肽，其中其P为缺乏两个N-末端氨基酸残基的片段的GLP-1受体激动剂肽具有对应于低于1000pM的EC50的效价，优选低于500pM，更优选低于250pM，甚至更优选低于125pM，或最优选低于50pM。
39.实施方案1-38中任一个的肽，其中其P为缺乏两个N-末端氨基酸残基的片段的GLP-1受体激动剂肽选自His-Ala-″P″、His-Gly-″P″和″His-Ser-P″。
40.实施方案1-39中任一个的肽，其中其P为缺乏两个N-末端氨基酸残基的片段的GLP-1受体激动剂肽选自His-Ala-″P″和His-Gly-″P″。
41.实施方案1-40中任一个的肽，其中P选自：i)GLP-1(9-37)(SEQID NO：1)；ii)exendin-4(3-39)(SEQ ID NO：2)；iii)GLP-1A(3-37)(SEQID NO：3)；和iv)i)、ii)或iii)的类似物，与各自的序列i)、ii)或iii)比较，所述类似物具有最多8个被交换的氨基酸残基，且所述类似物具有最高的相似性或优选同一性百分比。
42.实施方案1-41中任一个的肽，其中P为GLP-1(9-37)(SEQ IDNO：1)，或其类似物，所述类似物与SEQ ID NO：1比较具有最多8个被交换的氨基酸残基。
43.实施方案1-42中任一个的肽，其中P与i)GLP-1(9-37)(SEQ IDNO：1)、ii)exendin-4(3-39)(SEQ ID NO：2)和iii)GLP-1A(3-37)(SEQ IDNO：3)序列之一比较具有：a)最多7、6或5；优选b)最多4；或c)最优选最多3个被交换的氨基酸残基，且与所述序列之一比较P具有最高相似性，其中优选与GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)的比较或与GLP-1A(3-37)的比较，最优选为与GLP-1(9-37)的比较。
44.实施方案1-43中任一个的肽，其中P与i)GLP-1(9-37)(SEQ IDNO：1)、ii)exendin-4(3-39)(SEQ ID NO：2)和iii)GLP-1A(3-37)(SEQ IDNO：3)序列之一比较具有：最多2个优选最多1个或最优选没有氨基酸残基被交换，且与所述序列之一比较P具有最高相似性，其中优选与GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)的比较或与GLP-1A(3-37)的比较，最优选为与GLP-1(9-37)的比较。
45.实施方案1-44中任一个的肽，其具有C-末端酰胺。
46.实施方案1-45中任一个的肽，其具有C-末端-COOH基团。
47.实施方案1-46中任一个的肽，其与GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)比较包含至少一个以下取代：18K；22E；30E；31H；34Q，R；36K；37K；和/或38E。
48.实施方案1-47中任一个的肽，其包含18K。
49.实施方案1-48中任一个的肽，其包含22E。
50.实施方案1-49中任一个的肽，其包含30E。
51.实施方案1-50中任一个的肽，其包含31H。
52.实施方案1-51中任一个的肽，其包含34Q或34R，优选34R。
53.实施方案1-52中任一个的肽，其包含36K。
54.实施方案1-53中任一个的肽，其包含37K。
55.实施方案1-54中任一个的肽，其包含38E。
56.实施方案1-55中任一个的肽，其包含34R和37K。
57.实施方案1-56中任一个的肽，其包含30E和36K。
58.实施方案1-57中任一个的肽，其包含31H和34Q。
59.实施方案56-57中任一个的肽，其进一步包含38E。
60.实施方案1-59中任一个的肽，其包含以下取代：(i)18K、22E、34Q；(ii)31H、34Q；(iii)30E、36K；(iv)30E、36K、38E；(v)34R；(vi)34R、37K；或(vii)34R、37K、38E。
61.实施方案1-60中任一个的肽，其与GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)比较具有以下取代(所有其它氨基酸残基如SEQ ID NO：1)：(i)18K、22E、34Q；(ii)31H、34Q；(iii)30E、36K；(iv)30E、36K、38E；(v)34R；(vi)34R、37K；(vii)34R、37K、38E。
62.实施方案1-46中任一个的肽，其与GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)比较包含至少一个以下取代：17Q、R；20R；33R；和/或38K。
63.实施方案1-46和62中任一个的肽，其与GLP-1A(3-37)(SEQ IDNO：3)比较具有以下取代(所有其它氨基酸残基如SEQ ID NO：3)：17R、20R、33R和38K。
64.选自以下的GLP-1受体激动剂肽或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：
(i)N9-[-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Lys18，Glu22，Gln34]GLP-1(9-37)-肽；
(ii)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[His31，Gln34]GLP-1(9-37)-肽；
(iii)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-肽酰胺；
(iv)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)丙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-肽酰胺；
(v)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-肽酰胺；
(vi)N3-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Arg17，Arg20，Arg33，Lys38]GLP-1A(3-37)-肽；
(vii)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)-肽；
(iix)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-肽；
(ix)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)-肽；
(x)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}[Arg34]GLP-1(9-37)-肽；和
(xii)N9-[2，2-二甲基-3-氧-3-(吡啶-2-基甲基氨基)丙酰基(propanoyl)][Arg34，Lys37]-GLP-1-(9-37)-肽。
64.实施方案1-63中任一个的肽，其具有最多两个K残基。
65.实施方案1-64中任一个的肽，其具有最多一个K残基。
66.实施方案1-65中任一个的肽，其中
a)对应于i)GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)、ii)exendin-4(3-39)(SEQID NO：2)和iii)GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)所指出位置中的任何一个的位置；和/或
b)与i)GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)、ii)exendin-4(3-39)(SEQ IDNO：2)和iii)GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)比较的氨基酸修饰的数目由手写和目测来确定。
67.实施方案1-66中任一个的肽，其中
a)对应于i)GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)、ii)exendin-4(3-39)(SEQ ID NO：2)和iii)GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)所指出位置中的任何一个的位置；和/或
b)与i)GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)、ii)exendin-4(3-39)(SEQ IDNO：2)和iii)GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)比较的氨基酸修饰的数目通过用标准蛋白质或肽比对程序来确定。
68.实施方案67的肽，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。
69.实施方案67-68中任一个的肽，其中使用默认记分矩阵和默认单位矩阵。
70.实施方案67-69中任一个的肽，其中所述记分矩阵为BLOSUM62。
71.实施方案67-70中任一个的肽，其中空隙中第一个残基罚分为-10(负10)。
72.实施方案67-71中任一个的肽，其中空隙中另外的残基罚分为-0.5(负零点五)。
73.实施方案1-72中任一个的肽，其中在氨基酸残基后上标的残基编号(优选任何残基编号)或在目的氨基酸残基前或后的正常字体的残基编号，指i)GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)、ii)exendin-4(3-39)(SEQID NO：2)和iii)GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)序列之一的相应位置。
74.实施方案1-73中任一个的肽的衍生物或所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯。
75.实施方案74的衍生物，其包含，优选具有经由酰胺键与赖氨酸残基连接的白蛋白结合部分、更优选与其ε-氨基连接。
76.实施方案75的衍生物，其包含，优选具有与18K、26K、36K和/或37K中的一个或多个连接的白蛋白结合部分；优选与18K、26K或36K连接的一个白蛋白结合部分；或与26K和37K连接的两个白蛋白结合部分；其中参考物可能应该为GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)序列。
77.实施方案75的衍生物，其具有：与17K、20K、33K和/或38K中的一个或多个连接的白蛋白结合部分；优选与38K连接的一个白蛋白结合部分；或与20K和33K连接的两个白蛋白结合部分；其中参考物可能必须为GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)序列。
78.实施方案75-77中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含延长部分。
79.实施方案78的衍生物，其中
所述延长部分选自化学结构8、化学结构9和化学结构10：
化学结构8：HOOC-(CH2)x-CO-*
化学结构9：HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
化学结构10：R18-C6H4-(CH2)z-CO-*
其中x为6-18范围内的整数，y为3-17范围内的整数，z为1-5范围内的整数，R18为具有不高于150Da摩尔质量的基团。
80.实施方案79的衍生物，其中所述延长部分为化学结构8，其中x为偶数，优选在14-18的范围，更优选16-18，或最优选x为16。
81.实施方案79的衍生物，其中所述延长部分为化学结构9，其中y为奇数，优选在7-15的范围。
82.实施方案79的衍生物，其中所述延长部分为化学结构10，其中z为奇数，优选3；和R18为叔丁基。
83.实施方案79和81中任一个的衍生物，其中y为9。
84.实施方案79、81和83中任一个的衍生物，其中所述-COOH基团处于对位。
85.实施方案79和82中任一个的衍生物，其中R18处于对位。
86.实施方案75-84中任一个的衍生物，其包含接头。
87.实施方案75-86中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含接头。
88.实施方案75-87中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分进一步包含接头。
89.实施方案86-88中任一个的衍生物，其中所述接头为包含N基团和CO基团的二-基团，其中
i)所述N-基团由第一个*-NR19R20基团代表，其中R19和R20可独立地指定为氢、碳或硫，任选被取代；和
ii)所述CO基团由第一个*-CO基团代表，
其中，优选所述第一个*-NR19R20基团能够与第二个*-CO基团形成酰胺键，所述第一个*-CO基团能够与第二个*-NR19R20基团形成酰胺键，其中所述第二个*-NR19R20基团和第二个*-CO基团分别如第一个*-NR19R20基团和第一个*-CO基团所定义；并独立形成以下结构的一部分：i)类似物、ii)延长部分和/或iii)另一接头。
90.实施方案74-89中任一个的衍生物，其包含选自化学结构11、化学结构12、化学结构13和化学结构14的至少一个接头：
化学结构11：*-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
化学结构12：*-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
化学结构13：*-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
化学结构14：*-NC5H8-CO-*
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数；其中化学结构12和化学结构13为Glu的二-基团。
91.实施方案90的衍生物，其中所述接头包含化学结构11，其中优选化学结构11为第一接头单元(element)。
92.实施方案90-91中任一个的衍生物，其中k为1。
93.实施方案90-92中任一个的衍生物，其中n为1。
94.实施方案90-93中任一个的衍生物，其中化学结构11被包括m次，其中m为1-10范围内的整数。
95.实施方案94的衍生物，其中m为1-6范围内的整数；优选1-4范围内；更优选m为1或2；甚至更优选m为1；或最优选m为2。
96.实施方案94-95中任一个的衍生物，其中当m不同于1时，化学结构11单元经由酰胺键互相连接。
97.实施方案90-96中任一个的衍生物，其中所述接头由一个或多个化学结构11单元组成。
98.实施方案90-97中任一个的衍生物，其中化学结构11由化学结构11a代表：
化学结构11a：
Figure BDA00001770438400431
其中k和n如实施方案90-97中任一个所定义。
99.实施方案90-99中任一个的衍生物，其中所述接头包含Glu二-基团，例如化学结构12和化学结构13。
100.实施方案90-99中任一个的衍生物，其中化学结构12和化学结构13可分别独立地由化学结构12a和化学结构13a代表：
化学结构12a：
Figure BDA00001770438400441
化学结构13a：
Figure BDA00001770438400442
最优选由化学结构12a代表。
101.实施方案90-101中任一个的衍生物，其中所述Glu二-基团例如化学结构12和/或化学结构13独立地被包括p次，其中p为1-3范围内的整数。
102.实施方案101的衍生物，其中p为1、2或3；优选1或2，或最优选1。
103.实施方案90-102中任一个的衍生物，其中所述Glu二-基团为L-Glu或D-Glu基团，优选L-Glu基团。
104.实施方案90-103中任一个的衍生物，其中所述接头由Glu二-基团组成，优选化学结构12，更优选化学结构12a。
105.实施方案90-104中任一个的衍生物，其中所述接头包含化学结构14。
106.实施方案90-105中任一个的衍生物，其中化学结构14由化学结构14a代表：
Figure BDA00001770438400443
107.实施方案90-106中任一个的衍生物，其中所述接头由化学结构11组成，所述接头在其*-NH末端与延长部分的*-CO末端连接，并在其*-CO末端与肽的赖氨酸残基的ε氨基连接。
108.实施方案90-106中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指出的次序互相连接的化学结构12(一次)和化学结构11(两次)组成，所述接头在其*-NH末端与延长部分的*-CO末端连接，并在其*-CO末端与肽赖氨酸残基的ε氨基连接。
109.实施方案90-106中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指出的次序互相连接的化学结构14(一次)、化学结构12(一次)和化学结构11(两次)组成，所述接头在其*-NH末端与延长部分的*-CO末端连接，并在其*-CO末端与肽赖氨酸残基的ε氨基连接。
110.实施方案90-109中任一个的衍生物，其中一个或多个接头经由酰胺键互相连接。
111.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：化学结构30、化学结构31、化学结构32、化学结构33、化学结构34、化学结构35、化学结构36、化学结构37、化学结构38、化学结构39和化学结构41。
112.以其名称表征的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述化合物选自本文实施例1-10和12的每一个化合物名称的列表。
113.实施方案112的化合物，其为实施方案111的化合物。
114.实施方案111-113中任一个的化合物，其为实施方案74-110中任一个的衍生物。
115.实施方案1-114中任一个的肽或衍生物，其具有GLP-1活性。
116.实施方案115的肽或衍生物，其中GLP-1活性指激活人GLP-1受体的能力。
117.实施方案116的肽或衍生物，其中在体外测定中将人GLP-1受体的活化测量为cAMP产生的效价。
118.实施方案1-117中任一个的肽或衍生物，其具有对应于4500pM或低于4500pM的EC50的效价，优选低于4500pM，更优选低于4000pM，甚至更优选低于3500pM，或最优选低于3000pM。
119.实施方案1-118中任一个的肽或衍生物，其具有对应于低于2500pM的EC50的效价，优选低于2000pM，更优选低于1500pM，甚至更优选低于1000pM，或最优选低于800pM。
120.实施方案1-119中任一个的肽或衍生物，其具有对应于低于600pM的EC50的效价，优选低于500pM，更优选低于400pM，甚至更优选低于300pM，或最优选低于200pM。
121.实施方案1-120中任一个的肽或衍生物，其具有对应于低于180pM的EC50的效价，优选低于160pM，更优选低于140pM，甚至更优选低于120pM，或最优选低于100pM。
122.实施方案1-121中任一个的肽或衍生物，其具有对应于低于80pM的EC50的效价，优选低于60pM，更优选低于50pM，甚至更优选低于40pM，或最优选低于30pM。
123.实施方案1-122中任一个的肽或衍生物，其中将所述效价测定为剂量反应曲线的EC50，所述曲线显示在含有人GLP-1受体的培养基中cAMP的剂量依赖性形成，优选用稳定转染的细胞系例如BHK467-12A(tk-ts13)，和/或用测定cAMP功能受体的测定来测定，例如基于内源形成的cAMP和外源添加的生物素-标记的cAMP之间的竞争性，其中测定cAMP更优选用特异性抗体来捕获，和/或其中甚至更优选测定为AlphaScreen cAMP测定，最优选实施例13所述的测定。
124.实施方案1-123中任一个的肽或衍生物，其EC50为小于司美鲁肽的EC50的10倍，优选小于司美鲁肽的EC50的8倍，更优选小于司美鲁肽的EC50的6倍，甚至更优选小于司美鲁肽的EC50的4倍，或最优选小于司美鲁肽的EC50的2倍。
125.实施方案1-124中任一个的肽或衍生物，其EC50小于司美鲁肽的EC50，优选小于司美鲁肽的EC50的0.8，更优选小于司美鲁肽的效价的0.6，甚至更优选小于司美鲁肽的EC50的0.4，或最优选小于司美鲁肽的EC50的0.2。
126.实施方案1-125中任一个的肽或衍生物，其EC50为小于利拉糖肽的EC50的10倍，优选小于利拉糖肽的EC50的8倍，更优选小于利拉糖肽的EC50的6倍，甚至更优选小于利拉糖肽的EC50的4倍，或最优选小于利拉糖肽的EC50的2倍。
127.实施方案1-126中任一个的肽或衍生物，其EC50小于利拉糖肽的EC50，优选小于利拉糖肽的EC50的0.8，更优选小于利拉糖肽的EC50的0.6，甚至更优选小于利拉糖肽的EC50的0.4，或最优选小于或为利拉糖肽的EC50的0.2。
128.实施方案74-127中任一个的衍生物，其比率[在2.0％HSA(高白蛋白)存在时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)除以在0.005％HSA(低白蛋白)存在时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)]为：
a)至少0.5，优选至少1.0，更优选至少10，甚至更优选至少20，或最优选至少30；
b)至少40，优选至少50，更优选至少60，甚至更优选至少70，或最优选至少80；
c)至少90，优选至少100，更优选至少110，或最优选至少120；
d)司美鲁肽比率的至少20％，优选司美鲁肽比率的至少50％，更优选司美鲁肽比率的至少75％，甚至更优选至少等于司美鲁肽比率，或最优选至少为司美鲁肽比率的2倍；或
e)至少等于利拉糖肽的比率，优选至少为利拉糖肽比率的2倍，更优选至少为利拉糖肽比率的3倍，甚至更优选至少为利拉糖肽比率的5倍，或最优选至少为利拉糖肽比率的10倍。
129.实施方案74-128中任一个的衍生物，其在存在0.005％HSA(低白蛋白)时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)为：
a)低于600.00nM，优选低于500.00nM，更优选低于200.00nM，甚至更优选低于100.00nM，或最优选低于45.00nM；或
b)低于20.00nM，优选低于10.00nM，更优选低于5.00nM，甚至更优选低于2.00nM，或最优选低于1.00nM。
130.实施方案1-129中任一个的衍生物，其在存在2.0％HSA(高白蛋白)时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)为：
a)低于900nM，更优选低于800nM，甚至更优选低于700nM，或最优选低于600nM；或
b)低于400.00nM，优选低于300.00nM，更优选低于200.00nM，甚至更优选低于100.00nM，或最优选低于50.00nM。
131.实施方案1-130中任一个的衍生物，其中通过125I-GLP-1从受体中的取代来测量与GLP-1受体的结合亲和力，优选用SPA结合测定。
132.实施方案1-131中任一个的衍生物，其中所述GLP-1受体用稳定转染的细胞系来制备，所述细胞系优选仓鼠细胞系，更优选幼仓鼠肾细胞系，例如BHK tk-ts13。
133.实施方案1-132中任一个的类似物或衍生物，其中IC50值测定为从受体取代50％125I-GLP-1的浓度。
134.实施方案74-133中任一个的衍生物，其具有口服生物利用度，优选口服绝对生物利用度，其高于利拉糖肽的生物利用度；和/或高于司美鲁肽的生物利用度。
135.实施方案134的衍生物，其中在大鼠体内将口服生物利用度测量为直接注射到肠腔后在血浆中的暴露。
136.实施方案74-135中任一个的衍生物，其中在大鼠空肠中注射所述衍生物溶液剂后30分钟测定的衍生物的血浆浓度(pM)，除以注射的溶液剂浓度(μM)(30分钟时校正剂量的暴露)，为至少15，优选至少30，更优选至少48，还更优选至少62，甚至更优选至少80，或最优选至少100。
137.实施方案74-136中任一个的衍生物，其中在大鼠空肠中注射所述衍生物溶液剂后30分钟测定的衍生物的血浆浓度(pM)，除以注射的溶液剂浓度(μM)(30分钟时校正剂量的暴露)，为至少30，优选至少40，更优选至少50，还更优选至少60，甚至更优选至少70，或最优选至少80。
138.实施方案74-137中任一个的衍生物，其中所述衍生物以1000uM浓度与55mg/ml癸酸钠混合来测定。
139.实施方案74-138中任一个的衍生物，其中使用雄性SpragueDawley大鼠，优选体重达到大约240g以上。
140.实施方案74-139中任一个的衍生物，其中在实验前让大鼠禁食大约18小时。
141.实施方案74-140中任一个的衍生物，其中在让大鼠禁食后并在空肠中注射衍生物之前对其实施全身麻醉。
142.实施方案74-141中任一个的衍生物，其中所述衍生物在空肠近心端(离十二指肠10cm的远端)或中肠中(离盲肠50cm的近端)给予。
143.实施方案74-142中任一个的衍生物，其中用1ml注射器通过导管将100μl所述衍生物注射入空肠腔中，随后用另一注射器将200μl空气推进空肠腔中，然后让注射器与导管保持连接以防止回流到导管中。
144.实施方案74-143中任一个的衍生物，其中在所期需的时间间隔从尾静脉采集血样(200ul)到EDTA管中，例如在0、10、30、60、120和240分钟的时间，并在20分钟内以10000G于4℃离心5分钟。
145.实施方案74-144中任一个的衍生物，其中将血浆(75ul)分离，随即冷冻并保持在-20℃，直到对衍生物的血浆浓度进行分析。
146.实施方案74-145中任一个的衍生物，其中用LOCI(光激化学发光免疫测定)来分析衍生物的血浆浓度。
147.实施方案74-145中任一个的衍生物，其具有比利拉糖肽更延长的作用概况。
148.实施方案147的衍生物，其中延长意即在相关动物物种的体内半衰期，所述动物物种例如db/db小鼠、大鼠、猪和/或优选小型猪；其中衍生物如下给予：i)s.c和/或优选ii)s.c。
149.实施方案74-148中任一个的衍生物，其中在小型猪中i.v.给予后的终末半衰期(T1/2)为：
a)至少12小时，优选至少24小时，更优选至少36小时，甚至更优选至少48小时，或最优选至少60小时；或
b)至少为司美鲁肽半衰期的0.2，优选至少为司美鲁肽半衰期的0.4，更优选至少为司美鲁肽半衰期的0.6，甚至更优选至少为司美鲁肽半衰期的0.8，或最优选至少与司美鲁肽半衰期相同。
150.实施方案149的衍生物，其中所述小型猪为雄性
Figure BDA00001770438400501
小型猪。
151.实施方案149-150中任一个的衍生物，其中所述小型猪为7-14个月龄，优选重16-35kg。
152.实施方案149-151中任一个的衍生物，其中将所述小型猪单独饲养，每天一次或两次喂食，优选用SDS小型猪饮食。
153.实施方案149-152中任一个的衍生物，其中所述衍生物在适应至少2周后i.v给药。
154.实施方案149-153中任一个的衍生物，其中在给药前让动物禁食大约18小时和给药后让动物禁食至少4小时，在整个期间动物可随意饮水。
155.实施方案149-154中任一个的衍生物，其中将所述衍生物溶解于50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80、pH 7.4中到合适的浓度，优选20-60纳摩尔/ml。
156.实施方案149-155中任一个的衍生物，其中静脉内注射衍生物以对应于1-2纳摩尔/kg的体积来给予。
157.实施方案74-156中任一个的衍生物，其不是实施例2的化合物，优选不是化学结构31。
158.实施方案74-157中任一个的衍生物，其不是实施例7、8、9和12的化合物；优选不是化学结构36、化学结构37、化学结构38和化学结构41。
158.实施方案1-73和115-127中任一个的肽，其用作药物。
159.实施方案74-157中任一个的衍生物，其用作药物。
160.实施方案1-73和115-127中任一个的肽，其用于以下用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
161.实施方案74-157中任一个的衍生物，其用于以下用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
162.实施方案1-73和115-127中任一个的肽在制备用于以下的药物中的用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
163.实施方案74-157中任一个的衍生物在制备用于以下的药物中的用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
164.一种方法，所述方法用于治疗或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展，所述方法通过给予药学上有活性的量的实施方案1-73和115-127中任一个的肽来进行。
165.通过给予药学上有活性的量的实施方案74-157中任一个的衍生物用于以下的方法：治疗或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
166.化学式50或化学式51的中间产物或其药学上可接受的盐、酯或酰胺：
化学结构50：
化学结构51：
Figure BDA00001770438400522
其中Q代表键或化学式6的基团：
化学结构6：
-(C(R15)(R16))q-，
其中q为1-6，R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；
R代表氢或烷基；
R1和R2独立地代表：(i)氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基；或(ii)R1和R2一起形成环烷基、杂环基或杂芳基；和
PG1和PG2中每一个代表保护基；
任选前提为(iii)R1和R2不是二者都代表氢。
167.实施方案166的中间产物，其中PG1为可逆地使其所连接的N-原子无反应性并可被选择性去除的基团。
168.实施方案165-167中任一个的中间产物，其中PG1选自Boc、Trt、Mtt、Bzl、Tos、Clt、Mmt、Bom和Fmoc。
169.实施方案166-168中任一个的中间产物，其中PG2为可逆地使其所连接的-CO基团无反应性并可被选择性去除的基团。
170.实施方案165-169中任一个的中间产物，其中PG2为i)-OH或ii)被官能化为活化酯。
171.实施方案170的中间产物，其中所述活化酯为以下物质的酯：对硝基苯酚；2，4，5-三氯苯酚；N-羟基琥珀酰亚胺；N-羟基磺基琥珀酰亚胺；3，4-二氢-3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4-酮；5-氯-8-羟基喹啉；N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酸酰亚胺；五氟苯酚；对磺基四氟苯酚；N-羟基邻苯二甲酰亚胺；1-羟基苯并三唑；1-羟基-7-氮杂苯并三唑；N-羟基马来酰亚胺；4-羟基-3-硝基苯磺酸；或本领域已知的任何其它活化酯。
172.实施方案165-171中任一个的中间产物，其中PG2选自OPfp、OPnp和OSuc。
173.实施方案166-172中任一个的中间产物，其中PG1为Trt。
174.实施方案166-173中任一个的中间产物，其中q为1-5，优选1-4，更优选1-3。
175.实施方案166-174中任一个的中间产物，其中R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢。
176.实施方案166-175中任一个的中间产物，其中R15和R16两个都代表氢。
177.实施方案166-176中任一个的中间产物，其中Q为-(CH2)n，其中n为1、2或3。
178.实施方案166-177中任一个的中间产物，其中R为氢。
179.实施方案166-178中任一个的中间产物，其中R1和R2独立地代表氢、烷基、芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、烷基酯或芳基酯；其中优选烷基、羟基烷基、氨基烷基、羧基烷基、烷氧基，和/或烷基酯含有直链或支链低级烷基，更优选具有1-6个C-原子。
180.实施方案166-179中任一个的中间产物，其中R1和R2独立地代表氢、低级烷基或低级烷氧基，其中所述低级烷基和低级烷氧基独立地具有1-5个C-原子，优选1-4个C-原子，或最优选1-3个C-原子。
181.实施方案166-180中任一个的中间产物，其中R1和R2独立地代表具有1-2个C-原子的烷基(乙基或甲基)或具有1-2个C-原子的烷氧基(乙氧基或甲氧基)。
182.实施方案166-181中任一个的中间产物，其中R1和R2为甲基或甲氧基，优选甲基。
183.实施方案166-182中任一个的中间产物，其中R1和R2二者都为甲基。
184.实施方案166-183中任一个的中间产物，其中PG2为OH。
185.化学式50或化学式51的中间产物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：
其中Q代表键或化学式6基团：
化学结构6：
-(C(R15)(R16))q-，其中q为1-6，R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；R代表氢或烷基；R1和R2独立地代表：(i)烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基；或(ii)R1和R2一起形成环烷基、杂环基或杂芳基；和PG1和PG2中每一个代表保护基，优选其如实施方案167-173中任一个所定义。
186.选自化学结构23、化学结构24、化学结构25、化学结构26、化学结构27、化学结构28和化学结构29的中间化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
187.化学结构40的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
188.由本文实施例11化合物名称表征的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
189.实施方案188的化合物，其为实施方案187的化合物。
190.肽中间产物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述肽中间产物选自GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)的以下类似物：(i)(18K、22E、34Q)；(ii)(30E、36K、38E)；(iii)(31H、34Q)；(iv)34R；(v)(34R、37K)；和(vi)(34R、37K、38E)。
191.肽中间产物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述肽中间产物为GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)的以下类似物：(17R、20R、33R、38K)。
实施例
本实验部分以缩写列表开始，接着是包括用于合成及表征本发明肽和衍生物的通用方法的部分。然后是涉及制备特定GLP-1肽衍生物的多个实施例，最后是包括涉及这些肽和衍生物的活性和性质的多个实施例(标题为药理学方法的部分)。
实施例用于阐明本发明。
缩写
下文将使用以下缩写，按字母顺序为：
Aib：氨基异丁酸(α-氨基异丁酸)
API：活性药物成分
AUC：曲线下面积
BG：血糖
BHK：幼仓鼠肾
Boc：叔丁氧羰基
Bom：苄氧基甲基
BW：体重
Bzl：苄基
Clt：2-氯三苯甲基
collidine：2，4，6-三甲基吡啶
Cpm：每分钟计数
DCM：二氯甲烷
Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基
DIC：二异丙基碳二亚胺
DIPEA：二异丙基乙胺
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMEM：Dulbecco改良Eagle氏培养基(DMEM)
EDTA：乙二胺四乙酸
EGTA：乙二醇四乙酸
FCS：胎牛血清
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
HATU：(邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)
HBTU：(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲鎓六氟磷酸盐)
HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HFIP：1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
HPLC：高效液相色谱
HSA：人血清白蛋白
IBMX：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
Imp：咪唑丙酸(亦被称为脱氨基组氨酸、DesH)
i.v.：静脉内
ivDde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基
IVGTT：静脉葡萄糖耐量试验
LCMS：液相色谱质谱
LYD：Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS：见MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱
MeOH：甲醇
Mmt：4-甲氧基三苯甲基
Mtt：4-甲基三苯甲基
NMP：N-甲基吡咯烷酮
OBz：苄甲酰酯
OEG：8-氨基-3，6-二氧杂辛酸
OPfp：五氟苯氧基
OPnp：对硝基苯氧基
OSu：邻-琥珀酰亚氨基酯(羟基琥珀酰亚胺酯)
OSuc：2，5-二氧-吡咯烷-1-基
OtBu：叔丁酯
PBS：磷酸缓冲盐水
PD：药效
Pen/Strep：青霉素/链霉素
PK：药代动力学
RP：反相
RP-HPLC：反相高效液相色谱
RT：室温
Rt：保留时间
s.c.：皮下
SD：标准偏差
SEC-HPLC：尺寸排阻高效液相色谱
SPPS：固相肽合成
tBu：叔丁基
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
TLC：薄层色谱
Tos：甲苯磺酸盐(或对甲苯磺酰基)
Tris：三(羟基甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1，3-二醇
Trt：三苯基甲基或三苯甲基
Trx：氨甲环酸
UPLC：超高效液相色谱
制备方法
A.通用方法
本部分涉及用于固相肽合成(SPPS方法，包括用于脱去氨基酸保护的方法、用于从树脂裂解肽及用于其纯化的方法)的方法，以及用于检测和表征得到的肽(LCMS、MALDI和UPLC方法)的方法。在某些情况下，可通过利用二-肽酰胺键上受保护的二-肽与在酸性条件下可被裂解的基团来改进肽的固相合成，所述酸性条件下可被裂解的基团例如但不限于2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基。在其中肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况下，可使用假脯氨酸二-肽(可例如自Novabiochem获得，亦参见W.R.Sampson(1999)，J.Pep.Sci.5，403)。所用的受保护的氨基酸衍生物为标准Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec、IRIS或Novabiochem供应)。N-末端氨基酸在α氨基上受到Boc保护(例如用于N-末端含His的肽的Boc-His(Boc)-OH或Boc-His(Trt)-OH)。用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc来保护序列中赖氨酸的ε氨基，这视用于连接白蛋白结合部分和间隔子的途径而定。可通过使结合树脂的肽酰化或通过在未保护的肽溶液中的酰化，来让白蛋白结合部分和/或接头与肽连接。在白蛋白结合部分和/或接头与受保护的肽基树脂连接的情况下，用SPPS和合适受保护的结构单元，所述连接可为模块的(modular)，所述结构单元例如但不限于Fmoc-OEG-OH(Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-氨甲环酸)、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单-叔丁酯、十九烷二酸单-叔丁酯或4-(9-羧基壬氧基)苯甲酸叔丁酯。
1.结合树脂的肽的合成
SPPS方法A
SPPS方法A指用Fmoc化学在Applied Biosystems 433肽合成仪(亦命名为ABI433A合成仪)上合成受保护的肽基树脂，其以0.25毫摩尔或1.0毫摩尔规模用厂商FastMoc UV方案进行，所述方案在NMP中采用HBTU或HATU介导的偶联，用UV监测Fmoc保护基的脱保护。
用于合成肽酰胺的起始树脂为合适的Rink-酰胺树脂(对于肽酰胺)，或者为(对于具羧基C-末端的肽)合适的Wang树脂或合适的氯三苯甲基树脂中的任一种。合适的树脂可自例如Novabiochem市购。
SPPS方法B
SPPS方法B指用Fmoc化学在基于微波的Liberty肽合成仪(CEMCorp.，North Carolina)上合成受保护的肽基树脂。合适的树脂为预装载的低载量的Wang树脂，可自Novabiochem获得(例如低载量Fmoc-Lys(Mtt)-Wang树脂，0.35毫摩尔/g)。用5％哌啶/NMP在高达70或75℃进行Fmoc-脱保护。偶联化学为NMP中的DIC/HOAt。将氨基酸/HOAt溶液(在NMP中0.3M，以3-10倍的摩尔量过量)加到树脂中，接着加同样摩尔当量的DIC(NMP中0.75M)。例如，对于以下规模的反应每次偶联时使用以下量的0.3M氨基酸/HOAt溶液：规模/ml：0.10毫摩尔/2.5ml、0.25毫摩尔/5ml、1毫摩尔/15ml。偶联时间和温度通常为在高达70或75℃5分钟。反应规模越大，使用的偶联时间越长，例如10分钟。组氨酸氨基酸在50℃时为双偶联，或若前面的氨基酸有空间位阻(例如Aib)则为四偶联。精氨酸氨基酸在RT偶联25分钟，然后加热到70或75℃达5分钟。一些氨基酸例如但不限于Aib为“双偶联”，意即在第一次偶联(例如75℃时5分钟)后，耗尽树脂并加入更多反应试剂(氨基酸、HOAt和DIC)，并再次加热混合物(例如75℃时5分钟)。当期需化学修饰赖氨酸侧链时，让赖氨酸作为Lys(Mtt)被并入。Mtt基团通过以下除去：用DCM洗涤树脂，让树脂在纯(未稀释)的六氟异丙醇中悬浮20分钟，接着用DCM和NMP洗涤。赖氨酸的化学修饰如下实施：用合适的受保护的结构单元(参见通用方法)通过手工合成(见SPPS方法D)或通过如上所述在Liberty肽合成仪上的一个或多个自动步骤，其任选包括手动偶联。
SPPS方法D
SPPS方法D指用手动Fmoc化学合成受保护的肽基树脂。这通常用于让接头和侧链与肽主链连接。在0.25毫摩尔合成规模采用以下条件。偶联化学为在4-10倍摩尔过量的NMP中DIC/HOAt/collidine。偶联条件为室温1-6小时。Fmoc-脱保护如下实施：用20-25％哌啶/NMP(3x20ml，每次10分钟)，接着NMP洗涤(4x20mL)。Dde-或ivDde-脱保护如下实施：用2％肼/NMP(2x20ml，每次10分钟)，接着是NMP洗涤(4x20ml)。Mtt-或Mmt-脱保护如下实施：用DCM中的2％TFA和2-3％TIS(5x20ml，每次10分钟)，接着是DCM(2x20ml)、DCM中的10％MeOH和5％DIPEA(2x20ml)及NMP(4x20ml)洗涤，或通过用纯六氟异丙醇(5x20ml，每次10分钟)处理，接着如上洗涤。可通过结合树脂的肽的酰化或在未保护的肽溶液中的酰化让白蛋白结合部分和/或接头与肽连接(参见下述途径)。在白蛋白结合部分和/或接头与保护的肽基树脂连接情况下，使用SPPS和合适的受保护的结构单元，所述连接可为模块的(参见通用方法)。
与结合树脂的肽连接-途径I：将活化的(活性酯或对称酸酐)白蛋白结合部分或接头例如十八烷二酸单-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等，EP511600，相对于结合树脂的肽为4摩尔当量)溶于NMP(25mL)中，将其加到树脂中，室温振荡过夜。过滤反应混合物，用NMP、DCM、2-丙醇、甲醇和二乙醚彻底洗涤树脂。
与结合树脂的肽连接-途径II：让白蛋白结合部分溶于NMP/DCM(1∶1，10ml)中。加入活化试剂例如HOBt(相对于树脂为4摩尔当量)和DIC(相对于树脂为4摩尔当量)，将溶液搅拌达15分钟。将溶液加到树脂中，加入DIPEA(相对于树脂为4摩尔当量)。在室温将树脂振荡2-24小时。用NMP(2x20ml)、NMP/DCM(1∶1，2x20ml)和DCM(2x20ml)洗涤树脂。
与溶液中的肽连接-途径III：让活化的(活性酯或对称酸酐)白蛋白结合部分或接头例如十八烷二酸单-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等，EP511600)以相对于肽1-1.5摩尔当量溶于有机溶剂(例如乙腈、THF、DMF、DMSO)或水/有机溶剂混合物(1-2ml)中，将其连同10摩尔当量DIPEA加入到肽的水溶液(10-20ml)中。在白蛋白结合残基上的保护基为例如叔丁基情况下，过夜冻干反应混合物，此后将分离的粗肽脱保护。在叔丁基保护基情况下，脱保护通过让肽溶解在三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(90∶5∶5)混合物中来实施。30分钟后真空中蒸发混合物，如后所述通过制备型HPLC纯化粗肽。
SPPS方法E
SPPS方法E指通过Fmoc化学在来自Protein Technologies(Tucson，AZ 85714U.S.A.)的Prelude固相肽合成仪上的肽合成。合适的树脂为预装载的低载量的Wang树脂，可自Novabiochem获得(例如低载量Fmoc-Lys(Mtt)-Wang树脂，0.35毫摩尔/g)。用25％哌啶/NMP进行Fmoc-脱保护2x10分钟。偶联化学为NMP中的DIC/HOAt/collidine。将氨基酸/HOAt溶液(在NMP中0.3M，以3-10倍的摩尔量过量)加到树脂中，接着加同样摩尔当量的DIC(NMP中3M)和collidine(NMP中3M)。例如，对于以下规模的反应每次偶联时使用以下量的0.3M氨基酸/HOAt溶液：规模/ml：0.10毫摩尔/2.5ml、0.25毫摩尔/5ml。偶联时间通常为60分钟。包括但不限于精氨酸、Aib或组氨酸在内的一些氨基酸为“双偶联”，意即在第一次偶联(例如60分钟)后，耗尽树脂并加入更多反应试剂(氨基酸、HOAt、DIC和collidine)，并让混合物再次反应(例如60分钟)。在延长的时间内例如6小时，对一些氨基酸和脂肪酸衍生物进行偶联，所述氨基酸和脂肪酸衍生物包括但不限于Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Trx-OH、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单-叔丁酯、十九烷二酸单-叔丁酯或4-(9-羧基壬氧基)苯甲酸叔丁酯。当期需化学修饰赖氨酸侧链时，让赖氨酸作为Lys(Mtt)被并入。Mtt基团通过以下除去：用DCM洗涤树脂，让树脂在六氟异丙醇/DCM(75∶25)中悬浮3x10分钟，接着用DCM、20％哌啶和NMP洗涤。赖氨酸的化学修饰如下实施：用合适的受保护的结构单元通过手工合成(见SPPS方法D)或通过如上所述在Prelude肽合成仪上的一个或多个自动步骤(参见通用方法)。
2.自树脂裂解肽并纯化
合成后用DCM洗涤树脂，如下从树脂裂解肽：通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5或92.5/5/2.5)处理2-3小时，接着用二乙醚沉淀。让肽溶于合适的溶剂(例如30％乙酸)中，通过标准RP-HPLC在C18，5μM柱上用乙腈/水/TFA纯化。通过联合UPLC、MALDI和LCMS方法来分析流分，合并合适的流分并冻干。
3.用于检测和表征的方法
LCMS方法
LCMS方法1(LCMS1)
从Agilent 1200 series HPLC系统洗脱后，用Agilent TechnologiesLC/MSD TOF(G1969A)质谱仪鉴定样品质量。用Agilent的蛋白质确认软件计算蛋白质光谱的去卷积。
洗脱液：
A：0.1％三氟乙酸/水
B：0.1％三氟乙酸/乙腈
柱：Zorbax 5u，300SB-C3，4.8x50mm
梯度：经15分钟25％-95％乙腈
LCMS方法2(LCMS2)
自Perkin Elmer Series 200HPLC系统洗脱后，用Perkin Elmer SciexAPI 3000质谱仪鉴定样品的质量。
洗脱液：
A：0.05％三氟乙酸/水
B：0.05％三氟乙酸/乙腈
柱：Waters Xterra MS C-18X3mm内径5μm
梯度：经7.5分钟以1.5ml/分钟5％-90％乙腈
LCMS方法3(LCMS3)
自Waters Alliance HT HPLC系统洗脱后，用Waters Micromass ZQ质谱仪鉴定样品的质量。
洗脱液：
A：0.1％三氟乙酸/水
B：0.1％三氟乙酸/乙腈
柱：Phenomenex，Jupiter C450X4.60mm内径5μm
梯度：经7.5分钟以1.0ml/分钟10％-90％B
LCMS方法4(LCMS4)
在由来自Micromass的LCT Premier XE质谱仪和Waters AcquityUPLC系统组成的装配上实施LCMS4。将UPLC泵与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.1％甲酸/水
B：0.1％甲酸/乙腈
于RT通过将合适的样品体积(优选2-10μl)注入柱来实施分析，其用A和B梯度洗脱。
UPLC条件、检测仪设置和质谱仪设置为：
柱：Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7μm，2.1mmx50mm
梯度：4.0分钟(或者8.0分钟)期间以0.4ml/分钟的线性5％-95％乙腈
检测：214nm(从TUV(可调UV检测仪)模拟输出)
MS离子化模式：API-ES
扫描：100-2000amu(或者500-2000amu)，步长0.1amu
UPLC和HPLC方法
方法05_B5_1
UPLC(方法05_B5_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770438400641
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10％CH3CN(pH 3.5)
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经8分钟以流速0.40ml/分钟从60％A、40％B到30％A、70％B。
方法05_B7_1
UPLC(方法05_B7_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10％CH3CN(pH 3.5)
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经8分钟以流速0.40ml/分钟从80％A、20％B到40％A、60％B。
方法04_A2_1
UPLC(方法04_A2_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：90％H2O、10％CH3CN、0.25M碳酸氢铵
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟从90％A、10％B到60％A、40％B。
方法04_A3_1
UPLC(方法04_A3_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770438400651
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：90％H2O、10％CH3CN、0.25M碳酸氢铵
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟从75％A、25％B到45％A、55％B。
方法04_A4_1
UPLC(方法04_A4_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770438400652
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：90％H2O、10％CH3CN、0.25M碳酸氢铵
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟从65％A、35％B到25％A、65％B。
方法08_B2_1
UPLC(方法08_B2_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770438400653
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：99.95％H2O、0.05％TFA
B：99.95％CH3CN、0.05％TFA
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟从95％A、5％B到40％A、60％B。
方法08_B4_1
UPLC(方法08_B4_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770438400661
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：99.95％H2O、0.05％TFA
B：99.95％CH3CN、0.05％TFA
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟从95％A、5％B到95％A、5％B。
方法05_B10_1
UPLC(方法05_B10_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770438400662
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10％CH3CN(pH 3.5)
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经8分钟以流速0.40ml/分钟从40％A、60％B到20％A、80％B。
方法02_B4_4
HPLC(方法02_B4_4)：用装配Waters 2487双波段检测仪的Alliance Waters 2695系统实施RP-分析。用Symmetry300 C18，5um，3.9mmx150mm柱于42℃采集214nm和254nm处的UV检测。用5-95％乙腈、90-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)/水的线性梯度经15分钟以流速1.0ml/分钟洗脱。
方法01_B4_1
HPLC(方法01_B4_1)：用装配Waters 996二极管阵列检测仪的Waters 600S系统实施RP-分析。用Waters 3mmx150mm 3.5um C-18Symmetry柱收集UV检测。将柱加热到42℃，用5-95％乙腈、90-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)/水的线性梯度经15分钟以流速1.0ml/分钟洗脱。
MALDI-MS方法
用基质辅助激光解吸和电离飞行时间质谱测定分子量，在Microflex或Autoflex(Bruker)上记录。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸基质。
NMR方法
用以四甲基硅烷作为内标的Brucker Avance DPX 300(300MHz)记录质子NMR波谱。以ppm给出化学位移(δ)，分离模式如下命名：s，单峰；d，双峰；dd，双双峰；dt，双三重峰；t，三重峰；tt，三三峰(triplet of triplets)；q，四重峰；quint，五重峰；sext，六重峰；m，多重峰和br＝宽峰。
B.中间体合成
1.合成脂肪二酸单酯
在甲苯中让C12、C14、C16和C18二酸与Boc-酐、DMAP和叔丁醇回流过夜，主要产生单叔丁酯。检查后得到单酸、二酸和二酯混合物。通过洗涤、短柱二氧化硅过滤和结晶来纯化。
2.合成2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙胺
化学结构23：
Figure BDA00001770438400671
于室温让二盐酸组胺(20.47g；0.111摩尔)和三乙胺(48mL；0.345摩尔)在纯甲醇(400mL)中搅拌10分钟。经30分钟于0℃逐滴加入甲醇(30mL)中的三氟乙酸乙酯(14.6mL；0.122摩尔)。室温搅拌反应混合物达3.5小时，然后真空中蒸发到干燥。让残留物溶于二氯甲烷(450mL)中，加入三乙胺(31mL；0.222摩尔)。然后分段加入三苯甲基氯(34.1g；0.122摩尔)，于室温过夜搅拌混合物。将氯仿(400mL)和水(600mL)倒入反应混合物中。分离水层并用氯仿(3x400mL)萃取。经无水硫酸镁干燥合并的有机层。去掉溶剂，用己烷(1000mL)研制浅褐色固体。过滤悬浮液，得到2，2，2-三氟-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-乙酰胺，为白色固体。
产率：45.54g(91％)。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：8.44(bs，1H)；7.43(s，1H)；7.41-7.33(m，9H)；7.19-7.10(m，6H)；6.65(s，1H)；3.66(q，J＝5.9Hz，2H)；2.79(t，J＝5.9Hz，2H)。
将以上酰胺(45.54g；0.101毫摩尔)溶于四氢呋喃(1000mL)和甲醇(1200mL)中。加入氢氧化钠(20.26g；0.507摩尔)的水溶液(500mL)。于室温搅拌混合物达2小时，然后真空中浓缩。在氯仿(1200mL)和水(800mL)之间分离残留物。用氯仿(3x400mL)萃取水层。合并有机层并经无水硫酸镁干燥。蒸发溶剂得到棕色油状物，让其在真空中干燥3天，得到标题产物，为浅褐色固体。
产率：32.23g(90％)。
总产率：82％。
融点：111-113℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.39(d，J＝1.3，1H)；7.38-7.32(m，9H)；7.20-7.12(m，6H)；6.61(s，1H)；3.00(t，J＝6.6Hz，2H)；2.70(t，J＝6.5Hz，2H)；1.93(bs，2H)。
3.合成2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸
化学结构24：
Figure BDA00001770438400691
让梅钟酸(Meldrum’s acid)(5.52g，38.3毫摩尔)、碳酸钾(26.5g，191毫摩尔)和甲基碘(7.15mL，115毫摩尔)的乙腈(75mL)混合物在75℃于密闭管中加热7小时。让混合物冷却到室温，用二氯甲烷(300mL)稀释，过滤，让滤液在真空中蒸发到干燥。加入乙酸乙酯(75mL)、己烷(75mL)和水(50mL)，分离各相。用10％硫代硫酸钠水溶液(50mL)和水(50mL)洗涤有机层；经无水硫酸镁干燥，真空中去除溶剂，得到2，2，5，5-四甲基-[1，3]二噁烷-4，6-二酮，为白色固体。
产率：6.59g(79％)。
RF(SiO2，氯仿/乙酸乙酯，98∶2)：0.60。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：1.76(s，6H)；1.65(s，6H)。
在75℃经50分钟将如上所述制备的2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙胺(5.00g，14.2毫摩尔)和三乙胺(9.86mL，70.7毫摩尔)的甲苯(80mL)溶液，逐滴加入到上述二酮化合物(3.65g，21.2毫摩尔)的甲苯(40mL)溶液中。在该温度将混合物再搅拌3小时(直到在TLC上检测到起始胺)，然后蒸发到干燥。让残留物再溶于氯仿(300mL)，用10％柠檬酸水溶液(200mL)洗涤。用氯仿(2x60mL)萃取水相；合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥，真空中去掉溶剂。用热氯仿(140mL)研制残留物；加入己烷(70mL)，室温过夜搅拌该悬浮液。过滤掉固体，用氯仿/己烷混合物(1∶1，2x50mL)洗涤，真空中干燥，得到标题产物。
产率：6.73g(88％)。
融点：161-162℃。
RF(SiO2，氯仿/甲醇，85∶15)：0.40。
1H NMR波谱(300MHz，DMSO-d6，δH)：12.45(bs，1H)；7.66(t，J＝5.1Hz，1H)；7.57-7.31(m，9H)；7.26(s，1H)；7.20-7.02(m，6H)；6.66(s，1H)；3.25(m，2H)；2.57(t，J＝7.3Hz，2H)；1.21(s，6H)。
4.合成4-(4-叔丁基-苯基)-丁酸
化学结构25：
Figure BDA00001770438400701
分部分将氯化铝粉末(80.0g，600毫摩尔)加入到搅拌的叔丁基苯(40.0g，300毫摩尔)和琥珀酸酐(26.7g，267毫摩尔)和1，1，2，2-四氯乙烷(100mL)混合物中。加入所有氯化铝后，将该混合物倒入冰(500mL)和浓盐酸(100mL)混合物中。分离有机层，用水(500mL)洗涤，蒸馏掉溶剂。让固态残留物溶于15％碳酸钠热水溶液(1000mL)中，过滤，冷却，用盐酸(酸化到pH＝1)沉淀酸。过滤该粗酸，在空气中干燥，从苯(500mL)中重结晶，得到4-(4-叔丁基-苯基)-4-氧-丁酸，为无色晶体。
产率：36.00g(58％)。
融点：117-120℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.93(dm，J＝8.3Hz，2H)；7.48(dm，J＝8.3Hz，2H)；3.30(t，J＝6.6Hz，2H)；2.81(t，J＝6.6Hz，2H)；1.34(s，9H)。
让上述酸(36.0g，154毫摩尔)、氢氧化钾(25.8g，462毫摩尔)、水合肼(20mL，400毫摩尔)和乙二醇(135mL)混合物回流达3小时，然后蒸馏直到蒸气温度升到196-198℃。在再回流14小时后，让混合物稍微冷却，然后倒入冷水(200mL)中。用浓盐酸酸化(到pH＝1)混合物，并用二氯甲烷(2x400mL)萃取。合并有机萃取物，经无水硫酸镁干燥，真空中去除溶剂，通过柱色谱(硅胶60A，0.060-0.200mm；洗脱液：己烷/乙酸乙酯10∶1-6∶1)纯化残留物，得到标题产物，为淡白色固体。
产率：16.25g(48％)。
融点：59-60℃。
RF(SiO2，乙酸乙酯)：0.60。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.31(dm，J＝8.1Hz，2H)；7.12(dm，J＝8.1Hz，2H)；2.64(t，J＝7.6Hz，2H)；2.38(t，J＝7.4Hz，2H)；1.96(m，2H)；1.31(s，9H)。
5.合成2，2-二甲基-N-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基甲基)-丙酰胺酸
化学结构26：
Figure BDA00001770438400711
将盐酸羟胺(15.9g，229毫摩尔)加入到4(5)-咪唑甲醛(20.0g，209毫摩尔)和碳酸钠(12.1g，114毫摩尔)的水(400mL)溶液，让得到的溶液在室温搅拌过夜。将混合物蒸发到100mL，在冰浴中冷却。通过过滤分离固体，将滤液浓缩到40mL。冷却到0℃后，得到另一部分晶体。合并固体(23g)，从乙醇(大约160mL)重结晶，得到咪唑-4(5)-甲醛肟，为无色晶体。
产率：15.98g(69％)。
1H NMR波谱(300MHz，丙酮-d3+D2O，δH)：7.78(bs，1H)；7.74(d，J＝0.9Hz，1H)；7.43(s，1H)。
于0℃在氩气中将乙酰氯(51.0mL，718毫摩尔)逐滴加入到甲醇(670mL)中。30分钟后去掉冷却浴，加入上述肟(16.0g，144毫摩尔)，接着加入披钯碳(5wt％，6.1g)。让混合物在大气压力下氢化17小时，然后通过硅藻土过滤，蒸发溶剂，得到纯4-(氨基甲基)-咪唑二盐酸化物，为无色结晶色晶体。
产率：23.92g(98％)。
1H NMR波谱(300MHz，D2O，δH)：8.72(s，1H)；7.60(s，1H)；4.33(s，2H)。
在室温将甲醇(1000mL)中的上述二盐酸胺(18.9g；111毫摩尔)和三乙胺(93mL；667毫摩尔)搅拌10分钟。经40分钟在0℃逐滴加入甲醇(30mL)中的三氟乙酸乙酯(13.3mL；111毫摩尔)。室温搅拌反应混合物达18小时，然后真空中蒸发到干燥。让残留物溶于干二氯甲烷(2000mL)中，加入三乙胺(31mL；222毫摩尔)。然后加入三苯甲基氯(31.6g；113毫摩尔)，于室温过夜搅拌混合物。将氯仿(1000mL)和水(1000mL)倒入反应混合物中。分离水层，用氯仿(2x300mL)萃取。经无水硫酸镁干燥合并的有机层。去除溶剂，用己烷(1000mL)研制浅褐色固体。过滤悬浮液，得到2，2，2-三氟-N-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基甲基)-乙酰胺，为白色固体。
产率：46.59g(96％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇95∶5)：0.35。
1H NMR波谱(300MHz，DMSO-d6，δH)：9.77(t，J＝5.7Hz，1H)；7.47-7.34(m，9H)；7.33(d，J＝1.5Hz，1H)；7.13-7.03(m，6H)；6.80(d，J＝0.8Hz，1H)；4.25(d，J＝5.7Hz，2H)。
将以上酰胺(46.6g；107毫摩尔)溶于四氢呋喃(600mL)和乙醇(310mL)中。加入氢氧化钠(21.4g；535毫摩尔)的水(85mL)溶液。室温搅拌混合物达5小时，然后真空中浓缩。在氯仿(1600mL)和水(800mL)之间分离残留物。用氯仿(4x200mL)萃取水层。合并有机层，经无水硫酸镁干燥。蒸发溶剂，得到(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-甲胺，为淡白色固体。
产率：36.30g(100％)。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.38(d，J＝1.3，1H)；7.36-7.30(m，9H)；7.18-7.10(m，6H)；6.69(m，1H)；3.77(s，2H)；1.80(bs，2H)。
将以上胺(10.0g，29.5毫摩尔)和三乙胺(20.5mL，147毫摩尔)的甲苯(220mL)溶液，在75℃经45分钟逐滴加入到2，2，5，5-四甲基-[1，3]二噁烷-4，6-二酮(3.65g，21.2毫摩尔)的甲苯(80mL)溶液中。在该温度将混合物再搅拌3小时(直到在TLC上检测到起始胺)，然后蒸发到干燥。让残留物再溶于氯仿(500mL)，并用10％柠檬酸水溶液(300mL)洗涤。用氯仿(100mL)萃取水相；合并氯仿相，用水(150mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空中去除溶剂。通过快速柱色谱(硅胶Fluka 60，二氯甲烷/甲醇98∶2至9∶1)纯化残留物，从氯仿/己烷混合物中结晶，得到标题产物，为浅褐色晶体。
产率：9.80g(73％)。
融点：174-175℃。
RF(SiO2，氯仿/甲醇，85∶15)：0.35。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：8.45(t，J＝5.8Hz，1H)；7.53(s，1H)；7.40-7.28(m，9H)；7.14-7.01(m，6H)；6.84(s，1H)；4.39(d，J＝5.8Hz，2H)；1.44(s，6H)。
6.合成3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙胺
化学结构27：
Figure BDA00001770438400731
在1小时期间将四氢呋喃/二乙醚(1∶1，100mL)中的3-(1-三苯甲基-4-咪唑基)丙酸乙酯(93.0g，223毫摩尔)逐滴加入到氢化铝锂(17.0g，446毫摩尔)悬浮液中。让混合物回流3小时，然后在冰/水冷却下用水(100mL)、20％氢氧化钠(100mL)和水(100mL)处理，过滤，用四氢呋喃洗涤固体。经无水碳酸钾干燥有机相，过滤并蒸发，得到3-(1-三苯甲基-4-咪唑基)丙醇，为白色固体。
产率：68.0g(82％)。
融点：127-129℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.40-7.24(m，10H)；7.17-7.06(m，6H)；6.55(s，1H)；3.72(t，J＝5.3Hz，2H)；2.68(t，J＝6.6Hz，2H)；1.86(m，2H)。
在0℃经1小时期间将甲烷磺酰氯(8mL，104毫摩尔)逐滴加入到以上醇(32.0g，86.8毫摩尔)的二氯甲烷(400mL)和三乙胺(15.5mL)溶液中。无需冷却让混合物再搅拌1小时；然后用5％碳酸氢钠洗涤，经无水硫酸镁干燥。在30℃真空中蒸发二氯甲烷，在下一步骤直接使用残留的油状甲磺酸酯。
产率：31.2g(80％)。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.37-7.30(m，10H)；7.16-7.09(m，6H)；6.58(s，1H)；4.24(t，J＝6.3Hz，2H)；2.96(s，3H)；2.67(m，2H)；2.10(m，2H)。
在环境温度下过夜搅拌以上甲磺酸酯(30.0g，67毫摩尔)、邻苯二甲酰亚胺钾(18.0g，100毫摩尔)、碘化钠(4.0g，26.7毫摩尔)和二甲基甲酰胺(200mL)的混合物，然后用水(2L)和苯(2L)处理。经无水硫酸镁干燥有机相，过滤并蒸发溶剂，得到残留物，其从苯重结晶，得到1-三苯甲基-4-(3-苯二甲酰亚氨基丙基)咪唑，为白色固体。
产率：17.2g(52％)。
融点：211-214℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.83(m，2H)；7.72(m，2H)；7.39-7.27(m，10H)；7.18-7.07(m，6H)；6.60(d，J＝0.9Hz，1H)；3.72(t，J＝7.4Hz，2H)；2.60(t，J＝7.5Hz，2H)；1.99(m，2H)。
在60℃将以上咪唑衍生物(26.6g，53.5毫摩尔)溶于乙醇(300mL)和四氢呋喃(150mL)中，加入水合肼(50g，1摩尔)，让该溶液回流6小时，然后70℃加热过夜。通过过滤去除固体，用25％氨(2.51)和二氯甲烷(2.5L)水溶液处理滤液。经无水碳酸钾干燥有机层并蒸发，得到残留物，其通过柱色谱在硅胶(Fluka 60，用氨水饱和的氯仿/甲醇)上纯化，得到标题化合物，为白色固体。
产率：14.2g(72％)。
融点：112-113℃。
RF(SiO2，用氨水饱和的氯仿/甲醇9∶1)：0.30。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.37-7.28(m，10H)；7.18-7.09(m，6H)；6.53(d，J＝1.3Hz，1H)；2.74(t，J＝6.9Hz，2H)；2.59(t，J＝7.4Hz，2H)；1.95(bs，2H)；1.78(m，2H)。
7.合成2，2-二甲基-N-[3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙基]-丙酰胺酸
化学结构28：
Figure BDA00001770438400751
在DCM中让2-氯三苯甲基氯树脂(2.3g，3.0毫摩尔)溶胀20分钟，过滤。让丙二酸二甲酯(2当量；6.0毫摩尔；793mg)溶解于DCM∶DMF1∶1(10mL)中，并将其加入树脂中，接着加入DIPEA(6当量；18.0毫摩尔；3.14mL)和DCM(10mL)。于RT过夜振荡树脂。过滤树脂，用DCM∶MeOH∶DIPEA(17∶2∶1)、DCM、NMP og DCM(各2x25mL洗涤。让树脂在DMF中溶胀20分钟，过滤。加入HOAt(3当量；9.0毫摩尔；1.23g)、DIC(3当量；9.0毫摩尔；1.40mL)和DMF(25mL)，让树脂在RT振荡90分钟。过滤树脂，加入3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙胺(1.8当量；5.40毫摩尔；1.84g)、DIPEA(4当量；6.0毫摩尔；2.09mL)和DMF(10mL)。让树脂振荡2天。过滤树脂，用NMP(5x20mL)和DCM(10x20mL)洗涤。将2，2，2-三氟乙醇/二氯甲烷1∶1(20mL)加入到树脂中，振荡2小时。用2，2，2-三氟乙醇/二氯甲烷1∶1(10mL)洗涤树脂，收集合并的滤液，真空中浓缩，得到标题化合物。
产率：600mg(41％)。
LCMS4：m/z＝482(M+1)。
UPLC(方法02_B4_4)：Rt＝8.07分钟。
1H NMR波谱(300MHz，DMSO-d6，δH)：7.36-7.44(9H，m)，7.07-7.12(6H，m)，6.62(1H，s)，3.02-3.09(2H，q)，2.38-2.43(2H，t)，1.61-1.69(2H，m)，1.26(6H，s)。
8.合成2，2-二甲基-N-吡啶-2-基甲基丙酰胺酸
化学结构29：
Figure BDA00001770438400761
在DCM中让2-氯三苯甲基氯树脂(2.3g，3.0毫摩尔)溶胀20分钟，过滤。让丙二酸二甲酯(2当量；6.0毫摩尔；793mg)溶解于DCM∶NMP1∶1(10mL)中，并将其加入树脂中，接着加入DIPEA(6当量；18.0毫摩尔；3.14mL)和DCM(10mL)。于RT过夜振荡树脂。过滤树脂，用DCM∶MeOH∶DIPEA(17∶2∶1)、DCM、NMP og DCM(各2x25mL洗涤。让树脂在NMP中溶胀20分钟，过滤。加入HOAt(3当量；9.0毫摩尔；1.23g)、DIC(3当量；9.0毫摩尔；1.40mL)和NMP(25mL)，让树脂在RT振荡90分钟。过滤树脂，加入2-(氨基甲基)吡啶(2当量；6毫摩尔；659mg)、DIPEA(4当量；6.0毫摩尔；2.09mL)和NMP(10mL)。让树脂过夜振荡。过滤树脂，用NMP(5x20mL)和DCM(10x20mL)洗涤。将TFA/TIS/水(95∶2.5∶2.5；30mL)加入到树脂中，振荡1小时，过滤，真空中浓缩，得到标题化合物。
产率：600mg(41％)。
LCMS4：m/z＝223(M+1)。
UPLC (方法08B41)：Rt＝1.79分钟。
C.合成本发明化合物
实施例1
N9-[-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε 18-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-3-[1-(19-羧基-十九酰基)-哌啶-4-羧基氨基]-3-羧基丙酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Lys18，Glu22，Gln34]GLP-1(9-37)-肽
化学结构30：
制备方法：SPPS方法E。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸。
LCMS4：m/z＝1441.63(m/3)，1081.62(m/4)
实施例2
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε 26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][His31，Gln34]GLP-1(9-37)-肽
化学结构31：
Figure BDA00001770438400772
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸、Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单-叔丁酯。
LCMS4：Rt＝2.23分钟。m/z＝1341(m/3)，1006(m/4)
实施例3
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε 36-(2-{2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)(Glu30，Lys36)GLP-1(9-37)Glu38-肽酰胺
化学结构32：
Figure BDA00001770438400781
制备方法：如实施例2。
LCMS4：Rt＝6.90分钟。m/z＝1319(m/3)，990(m/4)
实施例4
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)丙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε 36-(2-{2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-肽酰胺
化学结构33：
Figure BDA00001770438400782
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙基]-丙酰胺酸、Fmoc-Oeg-OH和十八烷二酸单-叔丁酯。
LCMS4：m/z＝1324(m/3)，993(m/4)
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝12.55分钟
实施例5
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε 36-(2-{2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基}乙氧基]乙酰基)[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-肽酰胺
化学结构34：
Figure BDA00001770438400791
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基甲基)-丙酰胺酸、Fmoc-Oeg-OH和十八烷二酸单-叔丁酯。
LCMS4：m/z＝1313(m/3)，975(m/4)
UPLC (方法04_A3_1)：Rt＝12.44分钟
实施例6
N3-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)-丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)-乙酰基氨基]乙氧基}-乙氧基)乙酰基][Arg17，Arg20，Arg33，Lys38]GLP-1A(3-37)-肽
化学结构35：
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基甲基)-丙酰胺酸、Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单-叔丁酯。
LCMS4：m/z＝1663(m/3)，1247(m/4)，998(m/5)
UPLC (方法04_A3_1)：Rt＝11.26分钟
实施例7
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε 26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基-苯氧基)-癸酰基氨基]-丁酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基}，Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基-苯氧基)-癸酰基氨基]-丁酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基}[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)-肽
化学结构36：
Figure BDA00001770438400801
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸。用SPPS方法D来偶联8-(9-芴基甲氧基羰基-氨基)-3，6-二氧杂辛酸(可自IrisBiotech市购)、Fmoc-Glu-OtBu和4-(9-羧基-壬氧基)-苯甲酸叔丁酯(如WO 2006/082204中实施例25步骤2所述制备)。
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.81分钟。
LCMS4：Rt＝2.29分钟。m/z＝1625(m/3)，1219(m/4)，975(m/5)
实施例8
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}Nε 26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基-苯氧基)-癸酰基氨基]-丁酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基}，Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基-苯氧基)-癸酰基氨基]-丁酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基}[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-肽
化学结构37：
Figure BDA00001770438400811
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸。用SPPS方法D来偶联8-(9-芴基甲氧基羰基-氨基)-3，6-二氧杂辛酸(可自IrisBiotech市购)、Fmoc-Glu-OtBu和4-(9-羧基-壬氧基)-苯甲酸叔丁酯(如WO 2006/082204中实施例25步骤2所述制备)。
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝9.32分钟.
LCMS4：Rt＝2.29分钟。m/z＝1669(m/3)，1252(m/4)，1001(m/5)
实施例9
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε 26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-叔丁基-苯基)-丁酰基氨基]-4-羧基-丁酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基}，Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-叔丁基-苯基)-丁酰基氨基]-4-羧基-丁酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基}[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)-肽
化学结构38：
Figure BDA00001770438400812
制备方法：SPPS方法B。用与Fmoc-Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸。用SPPS方法D来偶联8-(9-芴基甲氧基羰基-氨基)-3，6-二氧杂辛酸(可自Iris Biotech市购)、Fmoc-Glu-OtBu和4-(4-叔-丁基苯基)丁酸。
UPLC(方法04_A4_1)：Rt＝10.56分钟。
LCMS4：Rt＝2.40分钟。m/z＝940(m/5)，1174(m/4)，1565(m/3)
实施例10
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}Nε 26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg34]GLP-1(9-37)-肽
化学结构39：
Figure BDA00001770438400821
制备方法：SPPS方法E。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸。
LCMS4：m/z＝1367.30(m/3)，1025.60(m/4)
实施例11(比较性化合物)
N9-(5-氧-5-苯基戊酰基)，Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Arg34]-GLP-1-(9-37)-肽
化学结构40：
制备方法：SPPS方法B
UPLC(方法01_B4_1：Rt＝11.48
LCMS2：Rt＝5.60m/z 1356(m/3)
实施例12
N9-[2，2-二甲基-3-氧-3-(吡啶-2-基甲基氨基)丙酰基]，Nε 26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，Nε 37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Arg34，Lys37]-GLP-1-(9-37)-肽
化学结构41：
Figure BDA00001770438400831
制备方法：SSPS方法B。用与在先前实施例中用于2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸的相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-吡啶-2-基甲基-丙酰胺酸。用SPPS方法D来偶联Fmoc-Glu-OtBu和4-(9-羧基-壬氧基)-苯甲酸叔丁酯(如WO2006/082204中实施例25步骤2所述制备)。
UPLC(方法08B41)：Rt＝8.98分钟
LCMS4：Rt＝2.23分钟。m/z＝1624(m/3)，1218(m/4)
药理学方法
实施例13：体外效价
本实施例的目的是测定GLP-1受体激动剂衍生物的体外活性或效价。
如下所述测定实施例1-12的GLP-1受体激动剂衍生物的效价，即在含有表达人GLP-1受体的膜的培养基中刺激环AMP(cAMP)的形成。
应注意实施例11化合物(化学结构40)为基于WO 2004/067548的化合物215(第24页)的比较性化合物，按照该WO出版物的图1其为该出版物中最有效的化合物之一。
原理
用目的GLP-1受体激动剂衍生物刺激表达人GLP-1受体的来自稳定转染的细胞系BHK467-12A(tk-ts13)的纯化的质膜，用来自PerkinElmer Life Sciences的AlphaScreenTM cAMP测定试剂盒来测量产生cAMP的效价。AlphaScreen测定的基本原理是内源cAMP和外源加入的生物素-cAMP之间的竞争。通过用与受体珠缀合的特异性抗体实现cAMP捕获。
细胞培养和膜的制备
选择稳定转染的细胞系和高表达克隆用于筛选。让细胞在DMEM、5％FCS、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和0.5mg/ml的选择标记G418中于5％CO2生长。
用PBS洗涤2X大约80％汇合的细胞，用Versene(乙二胺四乙酸四钠盐的水溶液)收获，以1000rpm离心5分钟，去掉上清液。另外的步骤都在冰上进行。通过Ultrathurax让细胞沉淀在10ml缓冲液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH＝7.4)中均质化20-30秒，以20.000rpm离心15分钟，将沉淀重悬于10ml缓冲液2(20mMNa-HEPES、0.1mM EDTA、pH＝7.4)中。让悬浮液均质化20-30秒，以20,000rpm离心15分钟。让缓冲液2中的悬浮液再次重复均质化和离心，将膜重悬于缓冲液2中。测定蛋白质浓度，将膜储存在-80℃直到使用。
在平底的1/2-面积的96-孔板(Costar货号：3693)中实施测定。最终体积为每孔50μl。
溶液和反应试剂
来自Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreen cAMP测定试剂盒(货号：6760625M)；含有抗-cAMP受体珠(10U/μl)、链霉抗生物素供体珠(10U/μl)和生物素化的-cAMP(133U/μl)。
AlphaScreen缓冲液，pH＝7.4：50mM TRIS-HCl(Sigma，货号：T3253)；5mM HEPES(Sigma，货号：H3375)；10mM MgCl2，6H2O(Merck，货号：5833)；150mM NaCl(Sigma，货号：S9625)；0.01％吐温(Merck，货号：822184)。使用前将以下加入到AlphaScreen缓冲液中(指最终浓度)：BSA(Sigma，货号：A7906)：0.1％；IBMX(Sigma，货号：I5879)：0.5mM；ATP(Sigma，货号：A7699)：1mM；GTP(Sigma，货号：G8877)：1uM。
cAMP标准(测定中稀释系数＝5)：cAMP溶液：5μL的5mMcAMP-储液+495μL AlphaScreen缓冲液。
在AlphaScreen缓冲液中制备cAMP标准以及待测GLP-1类似物或衍生物的合适的稀释系列，例如以下8种浓度的GLP-1化合物：10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13和10-14M和例如cAMP的系列10-6至3x10-11。
膜/受体珠
使用hGLP-1/BHK 467-12A膜；6μg/孔对应于0.6mg/ml(每孔所用膜量可变化)。
“无膜”：AlphaScreen缓冲液中的受体珠(最终15μg/ml)
“6μg/孔膜”：AlphaScreen缓冲液中的膜+受体珠(最终15μg/ml)。
加10μl“无膜”到cAMP标准(每孔一式二份)、阳性和阴性对照中。
加10μl“6μg/孔膜”到GLP-1和类似物(每孔一式二份/一式三份)
阳性对照：10μl“无膜”+10μl AlphaScreen缓冲液
阴性对照：10μl“无膜”+10μl cAMP储液(50μM)
因为珠对直接光照敏感，所以任何处理都在黑暗(尽可能黑)或在绿光中。在冰上进行所有稀释。
程序
1.制备AlphaScreen缓冲液；
2.在AlphaScreen缓冲液中溶解并稀释GLP-1/类似物/cAMP标准；
3.制备供体珠溶液并在R.T孵育30分钟；
4.将cAMP/GLP-1/类似物加到板中：每孔10μl；
5.制备膜/受体珠溶液，并将其加到板中：每孔10μl；
6.加入供体珠：每孔30μl；
7.用铝箔包裹板，于RT在振荡器中孵育3小时(极为缓慢)；
8.在AlphaScreen上计数-在AlphaScreen中计数前让每一板预孵育3分钟。
若需要，可将与GLP-1有关的倍数变化计算为EC50(GLP-1)/EC50(类似物)-3693.2。
结果
用Graph-Pad Prism软件(版本5)计算EC50[pM]值。
所有测试的本发明衍生物都具有对应于2100pM或更低的EC50的令人满意的体外效价；8种衍生物甚至更有效，具有1000pM或更低的EC50；5种衍生物具有对应于500pM或更低EC50的进一步改进的效价；4种衍生物非常有效，具有对应于300pM或更低的EC50；1种衍生物具有对应于100pM或更低的EC50的极为令人满意的效价。
实施例11的比较性化合物效价较低，即具有高于8000pM的EC50。
实施例14：GLP-1受体结合
本实验目的是研究与GLP-1激动剂衍生物的GLP-1受体的结合，及白蛋白的存在如何潜在地影响该结合。这在体外实验中如下所述进行。
通过其将125I-GLP-1从受体取代的能力来测量实施例1-12的GLP-1受体激动剂衍生物与人GLP-1受体的结合亲和力。
要注意实施例11化合物(化学结构40)为基于WO 2004/067548的化合物215(第24页)的比较性化合物，按照该WO出版物的图1其为该出版物中最有效的化合物之一。
为了测定衍生物与白蛋白的结合，用低浓度白蛋白(0.005％-对应于其在示踪剂中的残留量)以及高浓度白蛋白(加2.0％)实施测定。
结合亲和力IC50的变化表明目的肽与白蛋白结合，藉此预测在动物模型中可能延长目的肽的药代动力学概况。
条件
物种(体外)：仓鼠
生物学终点：受体结合
测定方法：SPA
受体：GLP-1受体
细胞系：BHK tk-ts13
细胞培养和膜纯化
选择稳定转染的细胞系和高表达克隆用于筛选。让细胞在DMEM、10％FCS、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和1.0mg/ml的选择标记G418中于5％CO2生长。
用PBS洗涤2次细胞(大约80％汇合)，用Versene(乙二胺四乙酸四钠盐的水溶液)收获细胞，接着以1000rpm离心5分钟来分离。在随后步骤中以尽可能的程度让细胞/细胞沉淀保持在冰上。用Ultrathurax让细胞沉淀在合适量的缓冲液1(视细胞量而定，但例如10ml)中均质化20-30秒。以20.000rpm让均质物离心15分钟。将沉淀重悬(均质化)于10ml缓冲液2中并再次离心。再次重复该步骤。将得到的沉淀重悬于缓冲液2中，测定蛋白质浓度，将膜储存在-80℃。
缓冲液1：20mM Na-HEPES+10mM EDTA，pH 7.4
缓冲液2：20mM Na-HEPES+0.1mM EDTA，pH 7.4
结合测定：
SPA：
在测定缓冲液中稀释测试化合物、膜、SPA-颗粒和[125I]-GLP-1(7-36)NH2。将25ul(微升)测试化合物加入到Optiplate中。加入(50ul)HSA(含有2％HAS的“高白蛋白”实验)或缓冲液(含有0.005％HSA的“低白蛋白”实验)。加入(50ul)对应于0.1-0.2mg蛋白/ml(优选优化每一膜制品)的5-10ug蛋白质/样品。以0.5mg/孔(50ul)的量加入SPA-颗粒(小麦胚凝集素SPA珠，Perkin Elmer，#RPNQ0001)。用[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(最终浓度为0.06nM，对应于49.880DPM，25ul)开始孵育。用板密封剂密封板，在30℃振荡孵育120分钟。让板离心(1500rpm，10min)，在Topcounter中计数。
测定缓冲液：
50mM HEPES
5mM EGTA
5mM MgCl2
0.005％吐温20
pH 7.4
HAS为SIGMA A1653
计算
从曲线读出IC50值，为从受体取代50％的125I-GLP-1的浓度，并测定[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]比率。
通常在低白蛋白浓度时的GLP-1受体结合应该近可能令人满意，其对应于低IC50值。
高白蛋白浓度时的IC50值是白蛋白对衍生物与GLP-1受体结合的影响的量度。众所周知，GLP-1受体激动剂衍生物亦与白蛋白结合。这通常是所期需的效果，其延长其在血浆中的寿命。因此，高白蛋白时的IC50值通常比低白蛋白时的IC50值高，这符合白蛋白结合与GLP-1受体结合竞争所引起的降低的GLP-1受体结合。
因此，高比率(IC50值(高白蛋白)/IC50值(低白蛋白))可作为以下的指示：目的衍生物良好地结合白蛋白(可具有长半衰期)，其本身亦良好地与GLP-1受体结合((高白蛋白)IC50值高，而(低白蛋白)IC50值低)。
结果
获得以下结果，其中″比率″指[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA])：
所有衍生物都具有高于10的比率；10种高于20；6种衍生物高于30；4种衍生物高于50；1种衍生物高于100。实施例11的比较性化合物具有高于300的比率。
此外，关于IC50(低白蛋白)，除实施例11比较性化合物外的所有衍生物都具有低于40nM的IC50(低白蛋白)；除1种外都低于20nM；除4种外都低于10.0nM；5种低于5.00nM；3种衍生物低于1.00nM。
最后，关于IC50(高白蛋白)，所有本发明衍生物都具有低于900.00nM的IC50(高白蛋白)；9种低于500.00nM；4种低于100.00nM；2种衍生物低于50.00nM。实施例11的比较性化合物的IC50(高白蛋白)高于800.00nM。
实施例15：估测口服生物利用度
本实验目的是估测GLP-1受体激动剂衍生物的口服生物利用度。
为此，如下所述在大鼠体内研究将化合物直接注射到肠腔后在血浆中的暴露。
以在55mg/ml癸酸钠溶液中1000uM的浓度测定化合物。
自Taconic(Denmark)获得体重达到大约240g以上的32只雄性Sprague Dawley大鼠，通过简单随机化指定为不同的处理，每组4只大鼠。实验前让大鼠禁食大约18小时，对其施行全身麻醉(芬太尼(Hypnorm)/多美康(Dormicum))。
将化合物给予近心端(离十二指肠10cm的远端)空肠或中肠(离盲肠50cm的近端)。将10cm长的PE50-导管插入到空肠中，至少1.5cm插入到空肠中，给药前通过3/0号缝线在肠及导管周围绑住来固定尖端末梢，以防止渗漏或导管移位。放置的导管无注射器和针头，将2ml盐水给予腹部，然后用创缘夹关闭切口。
通过导管用1ml注射器将100μl各种化合物注射入空肠腔中。随后，用另一注射器将200μl空气推入空肠腔以“冲洗”导管。将该注射器保持与导管连接，以防止回流到导管中。
以所期需间隔(通常在0、10、30、60、120和240分钟的时间)从尾静脉将血样(200ul)采集到EDTA管中，在20分钟内以10000G在4℃离心5分钟。将血浆(75ul)分离到Micronic管中，立即冷冻并保持在-20℃，直到用LOCI(光激化学发光免疫测定)分析各种GLP-1受体激动剂衍生物的血浆浓度，其通常如Poulsen和Jensen在Journal ofBiomolecular Screening 2007，第12卷第240-247页中用于测定胰岛素所述。用链霉抗生物素包被供体珠，而让受体珠与识别肽的中间-/C-末端表位的单克隆抗体缀合。使特异性针对N-末端的另一单克隆抗体生物素化。让这三种反应物与被分析物混合在一起，形成两位点免疫复合物。照射该复合物使从供体珠释放单峰氧原子，将其引入受体珠并引发化学发光，在Envision读板仪中测量该发光。光量与化合物浓度成比例。
血液取样后在麻醉下处死大鼠，打开腹部以验证导管正确放置。
测定作为时间函数的平均(n＝4)血浆浓度(皮摩尔/升)。对于每一处理，计算血浆浓度(皮摩尔/升)除以给药溶液的浓度(微摩尔/升)的比率，将t＝30分钟(在空肠中注射化合物30分钟后)的结果估测(30分钟时校正剂量的暴露)为肠生物利用度的替代测量。显示校正剂量暴露与实际生物利用度显著相关。
结果可表示为30分钟时的校正剂量暴露，其指(将化合物注射到空肠后30分钟的血浆浓度(pM))除以(给药溶液中的化合物浓度(μM))。
实施例16：小型猪中的药代动力学
本研究目的是测定将GLP-1受体激动剂衍生物i.v.给予小型猪后的体内延长，即其作用时间的延长。这在药代动力学(PK)研究中进行，其中测定目的衍生物终末半衰期。终末半衰期通常意即某一血浆浓度减半所需的时间，其在初始分布相后测量。
本研究使用自Ellegaard
Figure BDA00001770438400901
Minipigs(Dalmose，Denmark)获得的雄性
Figure BDA00001770438400902
小型猪，大约7-14个月龄，重大约16-35kg。单独饲养小型猪，用SDS小型猪饮食(Special Diets Services，Essex，UK)每天一次或两次限制性地喂养。在适应至少2周后，在每只动物的尾侧腔静脉或颅侧腔静脉中植入两根固定的中心静脉导管。手术后让动物恢复1周，然后用于重复药代动力学研究，且在给药之间具有合适的清洗期。
在给药前让动物禁食大约18小时，给药后禁食至少4小时，但在整个期间随意饮水。
让化合物溶于50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80、pH 7.4中到通常20-60纳摩尔/ml的浓度。通过导管给予静脉内注射(体积对应于通常1-2纳摩尔/kg，例如0.033ml/kg)的化合物，在预定时间点取血液样品，最多到给药后13天(优选通过另一导管)。将血样(例如0.8ml)采集到EDTA缓冲液(8mM)中，然后在4℃以1942G离心10分钟。将血浆用移液器吸取到干冰上的Micronic管中，保持在-20℃直到用ELISA或相似的基于抗体的测定或LC-MS来分析各个GLP-1化合物的血浆浓度。在WinNonlin 5.0版本(Pharsight Inc.，MountainView，CA，USA)中通过非房室模型分析单个血浆浓度-时间曲线，测定得到的终末半衰期(调和平均值)。
尽管本文阐明并阐述了某些本发明特征，但对本领域普通技术人员会出现很多修饰、取代、变化及等同物。因此，应该理解，所附权利要求意欲涵盖落在本发明真正精神内的所有所述修饰和变化。
Figure IDA00001770438700011
Figure IDA00001770438700021

Claims (15)

1.具有化学式1的GLP-1受体激动剂肽或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：
化学结构1：Y-Z-P，其中
P代表缺乏两个N-末端氨基酸残基的GLP-1受体激动剂肽的片段；
Z代表化学式2的基团：
化学结构2：
Figure FDA00001770438300011
其中
W代表化学式3的基团：
化学结构3：
Figure FDA00001770438300012
其中
R1和R2独立地代表
(i)氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基，或
R1和R2一起形成
(ii)环烷基、杂环基或杂芳基，
前提为
(iii)R1和R2不是二者都代表氢；和
Y代表化学式4或化学式5的基团：
化学结构4：
化学结构5：
Figure FDA00001770438300022
其中
X1为N、O或S；X2、X3、X4和X5独立地代表C或N，前提为X2、X3、X4和X5中至少一个为C；
R11、R12、R13和R14独立地代表
氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基；
Q代表键或化学式6的基团：
化学结构6：
＊-(C(R15)(R16))q-＊
其中
Q为1-6，和
R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；和
R代表氢或烷基。
2.选自以下的GLP-1受体激动剂肽或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：
(i)N9-[-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Lys18，Glu22，Gln34]GLP-1(9-37)-肽；
(ii)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[His31，Gln34]GLP-1(9-37)-肽；
(iii)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-肽酰胺；
(iv)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)丙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-肽酰胺；
(v)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Glu30，Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-肽酰胺；
(vi)N3-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-甲基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Arg17，Arg20，Arg33，Lys38]GLP-1A(3-37)-肽；
(vii)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)-肽；
(iix)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-肽；
(ix)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-[Arg34，Lys37]GLP-1(9-37)-肽；
(x)N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}[Arg34]GLP-1(9-37)-肽；和
(xii)N9-[2，2-二甲基-3-氧-3-(吡啶-2-基甲基氨基)丙酰基]-[Arg34，Lys37]-GLP-1-(9-37)-肽。
3.权利要求1-2中任一项的肽的衍生物或所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯。
4.权利要求3的衍生物，其具有与所述肽的赖氨酸残基连接的白蛋白结合部分。
5.权利要求4的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含选自化学结构8、化学结构9和化学结构10的延长部分：
化学结构8：HOOC-(CH2)x-CO-＊
化学结构9：HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-＊
化学结构10：R18-C6H4-(CH2)z-CO-＊
其中x为6-18范围内的整数，y为3-17范围内的整数，z为1-5范围内的整数，和R18为具有不高于150Da摩尔质量的基团。
6.权利要求5的衍生物，其中所述白蛋白结合部分进一步包含选自化学结构11、化学结构12、化学结构13和化学结构14的接头：
化学结构11：＊-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-＊
化学结构12：＊-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-＊
化学结构13：＊-N-C((CH2)2COOH)-CO-＊
化学结构14：＊-NC5H8-CO-＊
其中k为1-5范围内的整数，和n为1-5范围内的整数。
7.选自以下的GLP-1受体激动剂肽的衍生物或所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯：化学结构30、化学结构31、化学结构32、化学结构33、化学结构34、化学结构35、化学结构36、化学结构37、化学结构38、化学结构39和化学结构41。
8.化学式50或化学式51的中间化合物或其药学上可接受的盐、酯或酰胺：
化学结构50：
Figure FDA00001770438300041
化学结构51：
Figure FDA00001770438300051
其中Q代表键或化学式6的基团：
化学结构6：
-(C(R15)(R16))q-，
其中q为1-6，R15和R16彼此独立，每一个q值独立地代表氢、烷基、羧基或羟基；
R代表氢或烷基；
R1和R2独立地代表：(i)氢、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、卤素、羟基、羟基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、羧酰胺、取代的羧酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基或芳基磺酰基或(ii)R1和R2一起形成环烷基、杂环基或杂芳基；和PG1和PG2中每一个代表保护基。
9.选自化学结构23、化学结构24、化学结构25、化学结构26、化学结构27、化学结构28和化学结构29的中间化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
10.化学结构40的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
11.选自以下的肽中间产物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：
a)GLP-1(9-37)(SEQ ID NO：1)的以下类似物：(i)(18K、22E、34Q)；(ii)(30E、36K、38E)；(iii)(31H、34Q)；(iv)34R；(v)(34R、37K)；和(vi)(34R、37K、38E)；和
b)GLP-1A(3-37)(SEQ ID NO：3)的以下类似物：(17R、20R、33R、38K)。
12.权利要求1-7中任一项的肽或衍生物，其用作药物。
13.权利要求1-7中任一项的肽或衍生物，其用于治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
14.权利要求1-7中任一项的肽或衍生物在制备用于以下的药物中的用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
15.一种方法，所述方法用于治疗或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展，所述方法通过给予药学上有活性的量的权利要求1-7中任一项的肽或衍生物来进行。
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