KR20120103650A - 이중 아실화된 ｇｌｐ?１ 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, GLP-1 유사체의 유도체이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르와 관련되고, 이 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고, 유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서 알부민 결합 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분: Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-* Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-* Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-* Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*를 포함하고, 여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 단, 연장 부분이 Chem. 1일 때, 알부민 결합 부분은 추가로 Chem. 5 식의 링커: *-NH-(CH2)2-(O-((CH2)2)K-O-(CH2)n-CO-*를 포함하고, 여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이다. 본 발명은 또한, 예를 들어 당뇨병의 모든 형태 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방, 그뿐만 아니라 대응하는 새로운 펩티드 및 측쇄 중간체와 관련된다. 유도체는 구강 투여에 적합하다.

Description

이중 아실화된 ＧＬＰ?１ 유도체{DOUBLE?ACYLATED ＧＬＰ?１ DERIVATIVES}
본 발명은 글루카곤-유사 펩티드1(GLP-1) 및 그들의 약학적 사용, 즉 위치 26 및 37에서 이중 아실화된 GLP-1 유도체 및 그들의 약학적 사용과 관련된다.
Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669는 K26,34에서 이중 아실화된 GLP-1(7 내지 37) 유도체를 개시한다. - 표 1 참조.
WO 98/08871은 K26 ,34에서 이중 아실화된 일부를 포함하는 수많은 GLP-1 유도체를 개시한다. 실시예 3, 7, 17, 24, 32, 33 및 36 참조. Novo Nordisk A/S에 의해 2009년 판매되고 1일 1회 투여를 위한 단일 아실화된 GLP-1 유도체인 리라글루도 또한 WO 98/08871(실시예 37)에 개시된다.
WO 99/43706은 일부 K26 ,34 유도체를 포함하는 수많은 단일 및 이중 아실화된 GLP-1 유도체를 개시한다(p. 148-178 참조).
WO 2005/027978은 하나 및 동일한 잔기인 K37에서 이중 아실화된 몇 가지를 포함하는 수많은 GLP-1 유도체를 개시한다. 실시예 8 및 9 참조.
WO 2009/030738은 K31, Dap34에서 이중 아실화된 하나를 포함하는 수많은 GLP-1 유도체를 개시한다. 실시예 37 참조.
Journal of Controlled Release (2010), vol. 144, p. 10-16은 아실화된 엑센딘-4 유사체와 관련되고, 다른 것들 중에 개시한다. 이중 아실화된 엑센딘-4(K12 ,27-디LUA-엑센딘-4)가 개시된다(LUA는 라우르산, C12임).
WO 06/097537은 Novo Nordisk A/S에 의해 개발 중인 1주 1회 투여를 위한 단일 아실화된 GLP-1 유도체인 세마글루티드(실시예 4)를 포함하는 수많은 GLP-1 유도체를 개시한다.
Angewandte Chemie International Edition 2008, vol. 47, p. 3196-3201은 마우스 혈청 알부민(MSA) 및 인간 혈청 알부민(HSA) 모두와 안정한 비공유결합 상호작용을 의도적으로 보이는 4-(p-요오도페닐)부티르산 유도체 분류의 발견 및 특성을 보고한다.
본 발명은 GLP-1 펩티드 유도체와 관련된다.
유도체가 위치 26의 천연 리신에서 아실화되고, 그뿐만 아니라 위치 37에서 천연 글리신의 치환된 리신에서도 아실화된다. 측쇄는 알부민 결합 부분이다. 그들은, 모든 선택적으로 치환된 말단 페닐, 페녹시 또는 티오펜기를 갖는 지방이산 및 지방산으로부터 바람직하게 선택된 연장 부분을 포함한다. 지방산 또는 지방이산의 카르복시기는, 바람직하게 이것의 엡실론-아미노기에서 GLP-1 펩티드의 리신 잔기로, 선택적으로 링커에 의해 아실화된다. GLP-1 펩티드는, 예를 들어, 하나 이상의 추가, 하나 이상의 제거 및/또는 하나 이상의 치환인, GLP-1(7 내지 37)과 비교해 전부 최대 10개의 아미노산을 갖는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 유사체일 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명은, 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고; 유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서 각 알부민 결합 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 단, 연장 부분이 Chem. 1일 때, 알부민 결합 부분은 추가로 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00001
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수인 GLP-1 유사체의 유도체이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르와 관련된다.
본 발명은 또한 구체적으로 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 당뇨병의 모든 형태 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용; 및/또는 지질 파라미터 개선, β세포 기능 개선, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한 약물로 사용하기 위해 이러한 유도체와 관련된다.
게다가 본 발명은 본 발명의 특정 GLP-1 펩티드 및 유도체의 제조와 관련있는 GLP-1 펩티드 및 측쇄의 형태에서 중간 생성물과 관련된다.
본 발명의 유도체는 생물학적으로 활성이다. 또한, 또는 선택적으로, 그들은 연장된 약동학적 프로파일을 갖는다. 또한, 또는 선택적으로, 그들은 위장내 효소에 의한 변성에 대해 안정하다. 또한, 또는 선택적으로, 그들은 높은 구강 생체이용률을 갖는다. 이들 성질은 피하, 정맥 및/또는 구체적으로 구강 투여를 위한 다음 세대 GLP-1 화합물 개발에서 중요하다.
본 발명은 GLP-1 펩티드 유도체와 관련된다. 유도체가 위치 26의 천연 리신에서 아실화되고, 그뿐만 아니라 위치 37에서 천연 글리신의 치환된 리신에서도 아실화된다. 측쇄는 알부민 결합 부분이다. 그들은, 모든 선택적으로 치환된 말초 페닐, 페녹시 또는 티오펜기를 갖는 지방이산 및 지방산으로부터 바람직하게 선택된 연장 부분을 포함한다. 지방산 또는 지방이산의 카르복시기는, 바람직하게 이것의 엡실론-아미노기에서 GLP-1 펩티드의 리신 잔기로, 선택적으로 링커에 의해 아실화된다. GLP-1 펩티드는, 예를 들어, 하나 이상의 추가, 하나 이상의 제거 및/또는 하나 이상의 치환인, GLP-1(7 내지 37)과 비교해 전부 최대 10개의 아미노산을 갖는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 유사체일 수 있다.
더 구체적으로, 제 1 측면에서, 본 발명은, 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고; 유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서 각 알부민 결합 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 단, 연장 부분이 Chem. 1일 때, 알부민 결합 부분은 추가로 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00002
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수인 GLP-1 유사체의 유도체이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르와 관련된다.
따라서, 제 1 측면에서, 본 발명은, 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고; 유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서 각 알부민 결합 부분은 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르와 관련된다.
제 2 측면에서, 본 발명은, 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고; 유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서 각 알부민 결합 부분은 i) 식 Chem. 1의 연장 부분을 포함하고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고; 및 ii) 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00003
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수인 GLP-1 유사체의 유도체이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르와 관련된다.
제 3 측면에서, 본 발명은, 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고; 유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서 각 알부민 결합 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 단, 연장 부분이 Chem. 1일 때, 알부민 결합 부분은 추가로 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00004
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수인 GLP-1 유사체의 유도체이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르와 관련된다.
본 발명은, 또한 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, (i)(8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii)(des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii)(des7-8, 34R, 37K); (iv)(8Aib, 9G, 34R, 37K); (v)(8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi)(31 H, 34Q, 37K); (vii)(9Q, 34R, 37K); (iix)(30E, 34R, 37K); (ix)(34R, 37K, 38G); (x)(34R, 36G, 37K); 또는 (xi)(34R, 37K, 38E)인 변형; 또는 이것의 유사체 중 어떤것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르도 포함한다.
본 발명은, 또한 Chem. 2c, Chem. 3b 및 Chem. 4b로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2c: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-PG
Chem. 3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
Chem. 4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, w는 6 내지 18 범위의 정수이고, 및 *-CO-PG는 활성화된 에스테르; 여기서 선택적으로, 있는 경우, 연장 부분의 말단 *-COOH 기가 비활성 에스테르로서 작용되는 중간생성물; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르와도 관련된다.
그리고 최종적으로 본 발명은 또한 구체적으로 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 당뇨병의 모든 형태 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용; 및/또는 지질 파라미터 개선, β세포 기능 개선, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한 본 발명의 유사체 및 유도체의 약학적 사용과 관련된다.
다음에서, 그리스 문자가 그들의 기호 또는 대응하는 서면 이름으로, 예를 들어: α=알파; β=베타; ε=엡실론; γ=감마; ω=오메가 등으로 나타낼 수 있다. 또한, μ의 그리스 문자는 "u"로, 예를 들어, μℓ=uℓ 또는 μM=uM으로 나타낼 수 있다. 화학식에서 별표(*)는 i) 부착 지점, ii) 라디칼, 및/또는 iii) 비공유 전자를 지정한다.
GLP -1 유사체
본원에서 사용된 용어 "GLP-1 유사체" 또는 "GLP-1의 유사체"는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1(7 내지 37))의 변종으로 펩티드 또는 화합물을 의미하고, 서열은 SEQ ID NO:1 서열 목록에 포함된다. SEQ ID NO:1의 서열을 갖는 펩티드가 "천연" GLP-1로도 지정될 수 있다.
서열 목록에서, SEQ ID NO:1(히스티딘)의 제 1 아미노산 잔기는 1번으로 할당된다. 그러나, 본 분야에 설정된 실시에 따라 다음에는, 히스티딘 잔기를 7번으로 언급되고, 따라서 이어지는 아미노산 잔기는 번호를 붙여 글리신 37번으로 끝난다. 따라서 일반적으로, 본원에서 참조로, 아미노산 잔기 번호 또는 GLP-1(7 내지 37) 서열의 위치번호는 위치 7에서의 His이 시작이고 위치 37에서의 Gly이 끝이다.
본 발명 유도체의 GLP-1 유사체는 i) 변형된 아미노산 잔기에 대응하는 천연 GLP-1(7 내지 37)(즉, 천연 GLP-1에서 대응하는 위치)에서 아미노산 잔기의 수, 및 ii) 실제 변형을 참조로 기재될 수 있다. 다음은 적절한 유사체 명명법의 비제한 예이다.
본 발명 유도체의 GLP-1 유사체의 비제한 예는 GLP-1(7 내지 37)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 리신 잔기를 포함하도록 단지 변형된 유사체이다. 그렇지 않으면 이 유사체의 아미노산 서열은 천연 GLP-1에 동일하고, 이 유사체는 K37-GLP-1(7 내지 37)로 지정된다. 이 지정은, 천연 GLP-1의 아미노산 서열을 나타내고, 위치 37에서의 글리신이 리신으로 치환되었다.
게다가, 본 발명 유도체의 GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 리신 잔기를 포함한다. 그렇지 않으면 유사체의 아미노산 서열이 천연 GLP-1의 그것과 동일하기 때문에, 이러한 유사체는 여전히 K37-GLP-1(7 내지 37)로 지정되고, SEQ ID NO:1, K26은 천연 GLP-1을 참조에 의해 암시된다.
따라서, K37-GLP-1(7 내지 37)은 지정 GLP-1(7 내지 37) 유사체를 지정하고, 위치 37에서 글리신을 자연스럽게 발생하는 것은 리신으로 치환되었다.
용어는 "K37-GLP-1(7 내지 37)의 유사체"는 GLP-1(7 내지 37)의 유사체를 의미하고, GLP-1(7 내지 37)과 비교하여, 변형 K37 및 적어도 하나의 추가 변형을 포함한다.
본 발명 유사체의 GLP-1 유사체 형성 부분은 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정된다. 다른 말로, 이것은 변형된 GLP-1(7 내지 37) 펩티드이고, 수많은 아미노산 잔기가 천연 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교했을 때 변화되었다. 이들 변화, 또는 변형은 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 제거를 나타낸다.
본 발명 유도체의 유사체의 다른 비제한 예는 [Aib8, Arg34, Lys37]GLP-1(7 내지 37)이고, GLP-1(7 내지 37)을 지정하고, 위치 8에서 알라닌은 α-아미노이소부티르산(Aib)으로 치환되었고, 위치 34에서 리신은 아르지닌으로 치환되었고, 위치 37에서 글리신은 리신으로 치환되었다. 유사체는 (8Aib, R34, K37)GLP-1(7 내지 37)로 지정될 수 있다.
본 발명 유도체의 유사체의 추가 비제한 예는 "34E, 34Q 또는 34R을 포함하는" 유사체로, 천연 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 34에 대응하는 위치에서 글루탐산(E), 글루타민(Q) 또는 아르지닌(R) 중 하나가 있는 것을 의미하고, SEQ ID NO: 1과 비교해 추가 변형을 포함할 수 있다.
본 발명 유도체의 유사체의 추가 비제한 예는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 유사체이고, 간단히 "(8Aib, 31H, 34Q, 37K)"로 지정되었다. 이 지정은 이들 4개의 치환체(즉, 위치 8에서 알라닌이 α-아미노이소부티르산(Aib)으로 치환된, 위치 31에서 트립토판이 히스티딘으로 치환된, 위치 34에서 리신이 글루타민으로 치환된, 그리고 위치 37에서 글리신이 리신으로 치환된 유사체)를 제외한 SEQ ID NO: 1과 동일한 유사체를 의미한다. 이 유사체는 SEQ ID NO: 1과 비교해 추가 변형을 포함하지 않는다.
본 발명 유도체의 유사체의 추가 비제한 예는 des7(또는 Des7)을 포함하는 유사체인, N-말단 아미노산인 히스티딘이 제거된 GLP-1(7 내지 37)의 유사체를 의미한다. 이 유사체는 GLP-1(8 내지 37)로도 또한 지정될 수 있다.
유사하게, GLP-1(7 내지 37)의 참조로 암시된, GLP-1(7 내지 37)의 유사체와 관련된 (des7+des8); (des7, des8); (des7-8); 또는 (Des7, Des8)은 천연 GLP-1의 2개의 N-말단 아미노산인 히스티딘 및 알라닌에 대응하는 아미노산이 제거된 유사체를 의미한다. 이 유사체는 GLP-1(9 내지 37)로도 또한 지정될 수 있다.
본 발명 유도체의 유사체의 추가 비제한 예는 Imp7 및/또는 (Aib8 또는 S8)을 포함하는 유사체로, GLP-1(7 내지 37) 유사체를 의미하고, 천연 GLP-1과 비교할 때 위치 7에서 히스티딘의 이미다조프로피온산(Imp)으로의 치환제; 및/또는 위치 8에서 알라닌의 α-아미노이소부티르산(Aib) 또는 세린으로의 치환체를 포함한다.
유사체의 "포함하는" 특정 명시된 변형은 SEQ ID NO: 1과 비교해 추가 변형을 포함한다. 본 발명 유도체의 Imp7 및/또는 (Aib8 또는 S8)을 포함하는 유사체의 2개의 비제한 예 및 형성부는 Chem. 47 및 Chem. 58의 펩티드부이다.
(des7+des8), Arg34, Lys37 및 Glu38을 포함하는 GLP-1(7 내지 37) 유사체의 비제한 예는 [Des7, Des8, Arg34, Lys37]GLP-1(7 내지 37)-Glu38펩티드; 및 N 9 -{2-[2-(1H-이미다졸-4-일)-에틸카바모일]-2-메틸-프로피오닐}[Arg34, Lys37]GLP-1 (9 내지 37)Glu38-펩티드이다. 후자의 화합물에서 천연 GLP-1(His-Ala) N-말단의 디펩티드 모방은 아미드 결합을 통해 새로운 N-말단인 Glu9에 부착된다.
제거된 N-말단 아미노산의 치환체 종류로서 사용될 수 있는 적합한 His- 또는 His-Ala 모방은, 있는 경우, 예를 들어, 피리딘 또는 이미다졸인 헤테로 고리, 질소-함유, 방향족 고리 구조를 포함한다. His- 또는 His-Ala보다 바람직한 His- 또는 His-Ala 모방은 이미다졸 또는 피리딘의 유도체로, 한 구체예에서 펩티드의 N-말단 아미노산의 아미노기와 아미드 결합을 형성할 수 있는 자유 카르복시산기의 치환체를 갖는다. 용어 이미다졸은, 피리딘과는 반대로, 다양한 치환체가 아닌 유사한 고리 구조를 갖는 헤테로고리의 한 분류로서의 이미다졸을 의미한다.
위의 예로부터 명백한, 아미노산 잔기가 그들의 전체 이름, 그들의 1문자 코드 및/또는 3문자 코드에 의해 동일화될 수 있다. 이들 3 방법은 모두 동등하다.
표현 "동등한 위치" 또는 "대응하는 위치"가 천연 GLP-1(7 내지 37)의 참조에 의해 변형된GLP-1(7 내지 37) 서열에서 변형 위치를 특징지어지도록 사용될 수 있다. 동등한 또는 대응하는 위치는, 그뿐만 아니라 수많은 변형도 예를 들어, 간단한 필기 및 아이볼링에 의해 쉽게 유추되고; 및/또는 Needleman-Wunsch 얼라인먼트인 "얼라인"과 같은 표준 단백질 또는 펩티드 얼라인먼트 프로그램이 사용될 수 있다. 알고리즘은 Needleman, S.B. 및 Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453에, 얼라인 프로그램은 Myers 및 W. Miller의 "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS(생명과학에서의 컴퓨터 적용) (1988) 4: 11 -17에 기재된다. 얼라인먼트의 경우, 디폴트 스코어링 메트릭스 BLOSUM50 및 디폴트 동일성 메트릭스가 사용될 수 있고, 갭에서 제 1 잔기의 페널티는 -12 또는 바람직하게 -10에, 갭에서 추가 잔기의 페널티는 -2 또는 바람직하게 -0.5에 설정될 수 있다.
이러한 얼라인먼트의 예가
Figure pct00005
로, 서열 번호 1은 SEQ ID NO: 1로, 서열 번호 2는 이것의 유사체(des7-8, 34R, 37K, 38E)이다. 서열에 포함되는 Imp 및/또는 Aib와 같은 비천연 아미노산의 경우 또는 His-Ala 모방의 경우, 얼라인먼트의 목적을 위해, 이들은 X로 나타낸다. 원하는 경우, X는 후에 수동으로 교정될 수 있다.
본 발명 유도체의 GLP-1 유사체의 문맥에 사용된 예로서, 용어 "펩티드"는 아미드(또는 펩티드) 결합에 의해 상호연결된 아미노산 계열을 포함하는 화합물을 의미한다.
구체적인 구체예에서 펩티드는 큰 정도로 또는 우선적으로 아미드 결합(예를 들어, 몰질량으로 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%)에 의해 상호연결된 아미노산을 포함한다. 다른 구체적인 구체예에서 펩티드는 펩티드 결합에 의해 상호연결된 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5개의 구성 아미노산을 포함한다. 구체적인 구체예에서 펩티드는 적어도 10개, 바람직하게 적어도 15개, 더 바람직하게 적어도 20개, 훨씬 더 바람직하게 적어도 25개 또는 가장 바람직하게 적어도 28개의 아미노산을 포함한다.
구체적인 구체예에서, 펩티드는 적어도 5개의 구성 아미노산으로 구성되고, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개 또는 적어도 28개 아미노산으로 바람직하게 구성 된다.
더 구체적인 구체예에서, 펩티드는 i) 29개, ii) 30개, iii) 31개 또는 iv) 32개의 아미노산 a)으로 구성된 또는 b)을 구성한다.
추가 특정한 구체예에서 펩티드는 펩티드 결합에 의해 상호연결된 아미노산을 구성한다.
아미노산은 아민기 및 카르복시산기 및 선택적으로, 종종 측쇄로서 언급된 하나 이상의 추가 기를 포함하는 분자이다.
용어 "아미노산"은 프로테오제닉(proteogenic)(천연 아미노산 및 표준 아미노산을 포함하는 유전자 코드에 의해 코드화된) 아미노산을, 그뿐만 아니라 비프로테오제닉(non-proteogenic)(단백질에서 찾을 수 없는 및/또는 표준 유전자 코드에서 코드화되어있지 않은)및 합성 아미노산도 포함한다. 따라서, 아미노산이 프로테오제닉 아미노산, 비프로테오제닉 아미노산 및/또는 합성 아미노산기로부터 선택될 수 있다.
유전자 코드에 의해 코드화되지 않은 아미노산의 비제한 예는 γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴 및 포스포세린이다. 합성 아미노산의 비제한 예는 D-알라닌(다음에서 때때로 예를 들어 "a8"에서 "a"로 생략되고, 따라서 D-Ala8로 언급함) 및 D-류신과 같은 아미노산의 D-이성질체, Aib(α-아미노이소부티르산), β-알라닌 및 데스-아미노-히스티딘(desH, 선택적 이름 이미다조프로피온산, 생략된 Imp)이다.
다음에서, 광학 이성질체가 명시되지 않은 모든 아미노산이 L-이성질체를 의미하는 것으로 이해된다(다른 언급이 없으면).
본 발명의 GLP-1 유도체 및 유사체는 GLP-1 활성을 갖는다. 이 용어는 GLP-1 수용체에 바인딩하고 본 분야에 알려진 인슐린분비 행동 및 다른 생리적 효과를 가져오는 신호 변환 경로를 시작하는 능력을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 유사체 및 유도체가 본원의 실시예 50에서 기재된 분석법을 사용하여 GLP-1 활성을 위해 시험될 수 있다.
GLP -1 유도체
GLP-1 펩티드 또는 유사체의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "유도체"는 화학적으로 변형된 GLP-1 펩티드 또는 유사체를 의미하고, 하나 이상의 치환체가 펩티드에 공유 부착되었다. 치환체는 측쇄로서도 또한 언급된다.
구체적인 구체예에서, 측쇄는 알부민으로 비공유 집합체를 형성할 수 있고, 그래서 혈류로 유도체의 순환을 촉진하고, 또한 GLP-1-유도체 및 알부민 집합체가 활성 약학적 성분을 방출하도만 단지 서서히 분해된다는 사실 때문에, 유도체 행동의 연장 시간의 효과를 갖는다. 따라서, 전체로서 치환체, 또는 측쇄가 알부민 결합 부분으로 바람직하게 언급된다.
구체적인 구체예에서, 측쇄는 적어도 10개 탄소 원자, 또는 적어도 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 적어도 40개의 탄소 원자를 갖는다. 추가 특정한 구체예에서, 측쇄는 적어도 5개 헤테로 원자, 구체적으로 O 및 N, 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의 N-원자 및/또는 적어도 3개, 6개, 9개, 12개 또는 15개의 O-원자인 적어도 7개, 9개, 10개, 12개, 15개, 17개 또는 적어도 20개의 헤테로 원자를 또한 포함할 수 있다.
다른 구체적인 구체예에서 알부민 결합 부분은 알부민 결합 및 그로 인한 연장과 구체적으로 관련된 부분을 포함하고, 따라서 부분은 연장 부분으로서 언급될 수 있다. 연장 부분은 알부민 결합 부분의 반대 단부에 또는 근처에, 펩티드로의 부착 지점과 관련하여, 있을 수 있다.
더 구체적인 구체예에서 알부민 결합 부는 연장 부분 및 펩타이드로의 부착 지점 사이의 부분을 포함하고, 부분은 링커, 링커 부분, 스페이서 등으로서 언급될 수 있다. 링커는 선택적일 수 있고, 따라서 그런 경우 알부민 결합 부분이 연장 부분과 동일 될 수 있다.
구체적인 구체예에서, 알부민 결합 부분 및/또는 연장 부분은 친유성이고, 및/또는 생리학적 pH(7.4)에서 음성을 띈다.
알부민 결합 부분, 연장 부분 또는 링커가 아실화에 의하여 GLP-1 리신 잔기와 공유 부착될 수 있다. 추가 또는 선택적인 콘추게이션 화학은 알실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성, 또는 말레이미드 또는 할로아세트아미드(브로모-/플루오로-/요오도-와 같은) 커플링과 같은 시스테인 잔기와의 커플링을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 바람직하게 연장 부분 및 링커를 포함하는 알부민 결합 부분의 활성 에스테르가 리신 잔기의 아미노기, 바람직하게 아미드 결합의 형성(이 과정을 아실화로서 언급함)하에서 이것의 엡실론-아미노기와 공유 링크된다.
다른 언급이 없으면, 참조가 리신 잔기의 아실화로 만들어질 때, 이것의 엡실론-아미노기라고 이해된다.
선택적으로 링커를 통해 K26 및 K37에 부착된 2개의 연장 부분을 포함하는 유도체는 GLP-1(7 내지 27)의 각각 위치 26 및 37에 대응하는 위치에서 리진 잔기의 엡실론-아미노기에서 2번 아실화된 또는 2배 아실화된 또는 이중 아실화된 유도체로서 언급될 수 있다.
본 목적을 위해, 용어 "알부민 결합 부분", "연장 부분" 및 "링커"는 반응되지 않은 형태, 그뿐만 아니라 이들 분자의 반응된 형태도 포함할 수 있다. 하나 또는 다른 형태가 의미가 있는지는 용어가 사용된 문맥으로부터 명백해진다.
한 측면에서, 각 연장 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3, 및 Chem. 4로부터 독립적으로 선택된 연장 부분을 포함하거나 구성하고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이다.
한 구체예에서, *-(CH2)x-*는 곧은 또는 분지된, 바람직하게 곧은 알킬렌을 의미하고, 여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이다.
다른 구체예에서, *-(CH2)y-*는 곧은 또는 분지된, 바람직하게 곧은 알킬렌을 의미하고, 여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이다.
3번째 구체예에서, *-(CH2)z-*는 곧은 또는 분지된, 바람직하게 곧은 알킬렌을 의미하고, 여기서 z는 1 내지 5 범위의 정수이다.
추가 구체예에서, *-(CH2)w-*는 곧은 또는 분지된, 바람직하게 곧은 알킬렌을 의미하고, 여기서 w는 6 내지 18 범위의 정수이다.
다른 측면에서 알부민 결합 부분은 말단 페닐 또는 페녹시기를 갖는, 모두 선택적으로 치환된 지방이산 및 지방산으로부터 선택된 연장 부분을 포함하거나 또는 구성한다. 페닐 및/또는 페녹시기로의 선택적 치환체는150 Da보다 높지 않은, 바람직하게 125 Da보다 높지 않은, 더 바람직하게 100 Da보다 높지 않은, 훨씬 더 바람직하게 75 Da보다 높지 않은, 가장 바람직하게 50 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는다. 제한 없는 치환체의 예는 카르복시, 히드록시, 메틸과 같은 낮은 선형 또는 분지된 C1 내지 C5 알킬 및 tert-부틸 및 요오드와 같은 할로겐을 포함한다.
GLP-1 펩티드로 부착의 경우, 지방산의 산기 또는 지방이산의 산기 중 하나는 바람직하게 링커를 통해 GLP-1 펩티드에서 리신 잔기의 엡실론-아미노기를 갖는 아미드 결합을 형성한다.
용어 "지방산"은 4개 내지 28개의 탄소 원자를 갖는 지방족 단일카르복시산을 의미하고, 이것은 바람직하게 분지되지 않고 및/또는 번호를 메기지 않고, 그리고 이것은 포화 또는 불포화될 수 있다.
용어 "지방이산"은 위에서 정의된 그렇지만 오메가 위치에서 추가 카르복시산기를 갖는 지방산을 의미한다. 따라서, 지방이산은 디카르복시산이다.
바람직한 구체예에서 연장 부분은 HOOC-(CH2)n-CO-*, HOOC-C6H4-0-(CH2)m-CO-* 및 R1-C6H4-(CH2)p-CO-*로부터 선택되고, 여기서 n은 8 내지 16 범위의 정수이고, m은 7 내지 17 범위의 정수이고, p는 1 내지 5 범위의 정수이고, 그리고 R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는다. 명명법은 본 분야에서 보통이고, 예를 들어, 위 식 *-COOH, 그뿐만 아니라 HOOC-*도 카르복시; *-C6H4-*는 페닐린; *-CO-* 그뿐만 아니라 *-OC-*도 카르보닐(O=C< * *); C6H5-O-*는 페녹시; C4H4S 또는 C4SH4는 티오펜; 및 *-C4SH2-*는 이것(어떤 티오페닐린)의 디-라디칼을 의미한다. 특정 구체예에서, 페녹시와 같은 방향족 및 페닐린 라디칼은 독립적으로 오쏘(ortho), 메타(meta) 또는 파라(para)일 수 있다. 다른 구체예에서, 티오페닐린 디-라디칼은2,3-, 2,4- 또는 2,5- 일 수 있다.
화학 물질(R1기와 같은)의 몰질량(M)은 물질의 1몰의 질량이다. 몰질량은 달톤, 기호 Da, 1 Da= 1 g/mol로 제시된다.
몰질량이 표준 원자 무게로부터 계산될 수 있고, 화학 카탈로그에 종종 목록화된다. 화합물의 몰질량은 1 g/mol과 동등한 몰질량상수 Mu에 의해 곱해진 화합물로 형성된 원자의 표준 원자 무게의 합에 의해 주어진다. 예를 들어, tert-부틸(C4H9)의 몰질량은 M(C4H9)=([4×12.01]+[9×1.008])×1 g/mol=57 Da이다.
표준 원자 무게는 국제순수응용화학연합(IUPAC)에 의해 공개되고, 또한 다양한 교과서, 상용 카달로그, 월차트 등에 재인쇄된다.
위에 설명된 바와 같이, 본 발명의 GLP-1 유도체가 이중 아실화된, 즉 2개의 알부민 결합 부분이 GLP-1 펩티드에 공유 부착된다. 부착 지점은 GLP-1(7 내지 37) 위치 26에 대응하는 위치에서의 천연 리진 잔기 및 GLP-1(7 내지 37) 위치 37에 대응하는 위치에서 천연 글리신 잔기의 치환된 리신 잔기이다.
특정 구체예에서, 2개의 알부민 결합 부분(즉, 전체 측쇄)은 유사한, 바람직하게 실질적으로 동일한, 또는 가장 바람직하게 동일하다.
다른 구체예에서, 2개의 연장 부분은 유사한, 바람직하게 실질적으로 동일한, 또는 가장 바람직하게 동일하다.
추가 구체예에서, 2개의 링커는 유사한, 바람직하게 실질적으로 동일한, 또는 가장 바람직하게 동일하다.
용어 "실질적으로 동일한"은 하나 이상의 염, 에스테르 및/또는 아미드의 형성; 바람직하게 하나 이상의 염, 메틸 에스테르 및 간단한 아미드의 형성; 더 바람직하게 2개 이하의 염, 메틸 에스테르 및/또는 간단한 아미드의 형성; 훨씬 더 바람직하게 하나 이하의 염, 에스테르 및/또는 간단한 아미드의 형성; 가장 바람직하게 하나 이하의 염의 형성 때문에 동일성과는 다른점을 포함한다.
알부민 결합 부분과 같은 화학 화합물의 문맥에서, 연장 부분 및 링커, 유사성 및/또는 동일성이 어떤 적합한 컴퓨터 프로그램 및/또는 본 분야에 알려진 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다.
예를 들어, 2개의 연장 부분, 2개의 링커 및/또는 2개의 전체 측쇄의 유사성이 분자 지문을 사용하여 적합하게 측정될 수 있다. 지문은 화학 구조를 나타내는 수학적 방법(예를 들어, Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger 및 Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003 참조)이다.
적합한 지문의 예는 제한 없이 UNITY 지문, MDL 지문 및/또는 ECFP_6 지문(ECFP는 확장된 연결 지문을 나타냄)과 같은 ECFP 지문을 포함한다.
특정 구체예에서, 2개의 연장 부분, 2개의 링커 및/또는 2개의 전체 측쇄는 a) ECFP_6 지문; b) UNITY 지문; 및/또는 MDL 지문을 나타낸다.
Tanimoto 계수가 a), b) 또는 c)가 사용된 2개의 지문의 유사성을 계산하기 위해 바람직하게 사용된다.
특정 구체예에서, a), b) 또는 c)가 사용된, 2개의 연장 부분, 2개의 링커 및/또는 각각 2개의 전체 측쇄는 적어도 0.5(50%); 바람직하게 적어도 0.6(60%); 더 바람직하게 적어도 0.7(70%) 또는 적어도 0.8(80%); 훨씬 더 바람직하게 적어도 0.9(90%); 또는 가장 바람직하게 1.0(100%)의 유사성과 같은 적어도 0.99(99%)를 갖는다.
UNITY 지문이 프로그램 SYBYL(Tripos, 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144-2319 미국에서 이용가능한)을 사용하여 계산될 수 있다. ECFP_6 및 MDL 지문이 프로그램 Pipeline Pilot(Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego, CA 92121 , 미국에서 이용가능한)를 사용하여 계산될 수 있다.
더많은 정보를 위해, 예를 들어 J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 170-178; J. Med. Chem. 2004, 47, 2743-2749; J. Chem. Inf. Model. 2010, 50, 742-754; 그뿐만 아니라 SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection: Basic Chemistry User Guide, March 2008, SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection, 2008도 - 모두 Accelrys Software Inc., San Diego, 미국으로부터, 및 가이드 http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_1 1 1408.pdf 및 http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf 참조.
유사성 계산의 예가 본원 아래에 삽입되고, Chem 23의 전체 측쇄가 이것의 메틸 에스터, 즉 글루타민 링커 부분의 단일 메일 에스테르(Chem 23a):
Figure pct00006
와 비교되었다.
a) ECFP_6 지문을 사용한 유사성은 0.798이고, b) UNITY 지문을 사용한 유사성은 0.957이고; 및 MDL 지문을 사용한 유사성은 0.905이다.
2개의 동일한 측쇄(알부민 결합 부분)의 경우, 유도체가 대칭으로 지정될 수 있다.
구체적인 구체예에서, 유사성 계수는 적어도 0.80, 바람직하게 적어도 0.85, 더 바람직하게 적어도 0.90, 훨씬 더 바람직하게 적어도 0.95, 또는 가장 바람직하게 적어도 0.99이다.
본 발명유도체의 각각의 두 링커는 다음의 제 1 링커 원소를 포함할 수 있고:
Chem. 5:
Figure pct00007
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이다.
구체적인 구체예에서, k=1 및 n=1일 때, 링커 원소는 OEG 또는 8-아미노-3, 6-디옥사옥탄산의 디-라디칼로 지정될 수 있고, 및/또는 그것은 다음식에 의해 나타낼 수 있다:
Chem. 5a:
*-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-0-CH2-CO-*.
또다른 구체예에서, 본 발명 유도체의 각 링커는 독립적으로, Chem. 6 및/또는 Chem. 7과 같은 제 2 링커 원소:
Chem. 6:
Figure pct00008
Chem. 7:
Figure pct00009
바람직하게 Glu 디-라디칼을 더 포함하고, 여기서 Glu 디-라디칼이 p번 포함될 수 있고, p는 1 내지 3 범위의 정수이다.
Chem. 6이 또한 γ-Glu 또는 간단히 gGlu로 언급될 수 있고, 이것이 다른 링커 원소 또는 리신의 엡실론-아미노산기로의 연결을 위해 여기에 사용된 아미노산 글루탐산의 γ 카르복시기라는 사실 때문이다. 위에서 설명한 바와 같이, 예를 들어, 다른 링커 원소가 다른 Glu 잔기 또는 OEG 분자일 수 있다. 차례로 Glu의 아미노기는 연장 부분의 카르복시기와 또는 예를 들어, 있는 경우, OEG 분자의 카르복시기와, 다른 Glu의 γ-카르복시기와 아미드 결합을 형성한다.
Chem. 7이 또한 α-Glu, 또는 간단히 aGlu, 또는 단순히 GLU로 언급될 수 있고, 이것이 다른 링커 원소 또는 리신의 엡실론-아미노산기로의 연결을 위해 여기에 사용된 아미노산 글루탐산의 알파 카르복시기라는 사실 때문이다.
위의 구조 Chem. 6 및 Chem. 7는 Glu의 L-형, 그뿐만 아니라 D-형도 망라한다. 구체적인 구체예에서, Chem. 6 및/또는 Chem. 7은 독립적으로 a) L-형 또는 b)D-형이다.
다른 구체적인 구체예에서, 본 발명 유도체의 각 링커는 독립적으로 다음 제 3 링커 원소를 추가로 포함할 수 있고:
Chem. 8:
*-NH-(CH2)q-CHR2-CO-*
여기서 q는 2 내지 12 범위의 정수이고, R2은 수소(H) 또는 아미노(NH2)이다.
Chem. 8에서, *-(CH2)q-*기는 곧은 또는 분지된, 바람직하게 곧은 알킬렌을 의미하고, 여기서 q는 2 내지 12 범위의 정수이다.
더 구체적인 구체예에서 링커는 a) 5 내지 41개의 C 원자; 및/또는 b) 4 내지 28개의 헤테로 원자를 갖는다. 헤테로 원자의 구체적인 비제한 예는 N- 및 O-원자이다. H-원자는 이종 원자가 없다.
선택적으로, 있는 경우, 링커 부분은 5 내지 30개의 C-원자, 바람직하게 5 내지 25개의 C-원자, 더 바람직하게 5 내지 20개의 C-원자, 또는 가장 바람직하게 5 내지 17개의 C-원자를 갖는다. 게다가 바람직한 구체예에서, 있는 경우, 링커 부분은 4 내지 20개의 헤테로 원자, 바람직하게 4 내지 18개의 헤테로 원자, 더 바람직하게 4 내지 14개의 헤테로 원자, 또는 가장 바람직하게 4 내지 12개의 헤테로 원자를 갖는다.
선택적으로, 링커는 적어도 한 OEG 분자 및/또는 적어도 한 글루탐산 잔기, 또는 오히려 대응하는 라디칼을 포함한다.
다른 구체적인 구체예, 각 링커는 아미드 결합을 통해 상호연결된 서열에 표시된 Chem. 6을 1번 및 Chem. 5를 2번을 구성하고, 링커가 연장 부분의 자유 카보닐기로 그것의 자유 아미노 단부에서, 및 GLP-1 유사체 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 그것의 자유 카보닐 단부에서 연결된다.
또 다른 구체적인 구체예, 각 링커는 아미드 결합을 통해 상호연결된 서열에 표시된 Chem. 5를 2번 및 Chem. 6을 1번을 구성하고, 링커가 연장 부분의 자유 카보닐기로 그것의 자유 아미노 단부에서, 및 GLP-1 유사체 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 그것의 자유 카보닐 단부에서 연결된다.
본 발명의 유도체는 결합된 원자의 동일한 분자식과 서열을 갖지만, 공간에서 그들 원자의 3차원 방향으로만 서로 다른, 다른 입체이성질체 형에서 존재할 수 있다. 본 발명의 예시된 유도체의 입체이성질체현상이 표준 명명법을 사용하여 이름에서, 그뿐만 아니라 구조에서도 실험 섹션에 표시된다. 다른 언급이 없으면 본 발명은 청구된 유도체의 모든 입체이성질체 형과 관련된다.
본 발명 GLP-1 유도체의 혈장에서 농도가 어떤 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, LC-MS(액체 크로마토그래피 질량분석기), 또는 RIA(방사면역분석법), ELISA(효소면역측정법) 및 LOCI(루미네센스 산소 채널링 면역분석법)와 같은 면역분석법이 사용될 수 있다. 적합한 RIA 및 ELISA 분석법에 대한 일반적인 프로토콜은 예를 들어, WO 09/030738 p.116-118에서 발견된다. 바람직한 분석법이 본원의 실시예 52, 55 및 58에 기재된 LOCI 분석법이다.
약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르
본 발명의 유도체, 유사체 및 중간 생성물이 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르의 형태로 있을 수 있다.
예를 들어, 염은 염기 및 산 사이의 화학 반응에 의해 형성되고, 예를 들어: NH3 + H2S04 -> (NH4)2S04이다.
염은 염기성염, 산성염이 될 수 있고, 또는 그것은 어떤것도 아닐 수 있다(즉, 중성염). 염기성염은 물에 수산화 이온 및 산성염의 히드로늄 이온을 만든다.
본 발명 유도체의 염이 각각 음이온기 또는 양이온기와 반응하는 추가된 양이온 또는 음이온으로 형성된다. 이들 기가 본 발명 유도체의 펩티드 부분 및/또는 측쇄에서 위치될 수 있다.
본 발명 유도체의 음이온기의 비제한 예는, 어떤 경우, 측쇄에서, 그뿐만 아니라 펩티드 부분에서도 자유 카르복시기를 포함한다. 펩티드 부분은 종종 C-말단에서 자유 카르복시기를 포함하고, 또한 Asp 및 Glu와 같은 내부 산성 아미노산 잔기에서 자유 카르복시기를 포함할 수 있다.
펩티드 부분에서 양이기의 비제한 예는, 있는 경우, N-말단에서 자유 아미노기를, 그뿐만 아니라 His, Arg 및 Lys와 같은 내부 염기성 아미노산 잔기의 어떤 자유 아미노기도 포함한다.
본 발명 유도체의 에스테르가 예를 들어, 알코올 또는 페놀을 갖는 자유 카르복시기의 반응에 의해 형성될 수 있고, 알콕시 또는 아릴콕시기에 의해 적어도 1개의 히드록실기의 교체를 가져온다.
에스테르 형성은 펩티드의 C-말단에서 자유 카르복시기 및/또는 측쇄에서 어떤 자유 카르복시기를 포함한다.
본 발명 유도체의 아미드가 예를 들어, 자유 카르복시기의 아민 또는 치환된 아민과의 반응에 의해, 또는 자유 또는 치환된 아미노기의 카르복시산과의 반응에 의해 형성될 수 있다.
아미드 형성은 펩티드의 C-말단에서 자유 카르복시기를, 측쇄에서 자유 카르복시기를, 펩티드의 N-말단에서 자유 아미노기를, 및/또는 펩티드 및/또는 측쇄에서 펩티드의 어떤 자유 또는 치환된 아미노기를 포함할 수 있다.
구체적인 구체예에서, 펩티드 또는 유도체는 약학적으로 허용되는 염의 형태에 있다. 다른 구체적인 구체예에서, 유도체는 바람직하게 펩티드의 C-말단에서 아미드기를 갖는 약학적으로 허용되는 아미드의 형태에 있다.
중간 생성물
본 발명의 중간 생성물의 한 유형은, GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, (i)(8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii)(des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii)(des7-8, 34R, 37K); (iv)(8Aib, 9G, 34R, 37K); (v)(8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi)(31 H, 34Q, 37K); (vii)(9Q, 34R, 37K); (iix)(30E, 34R, 37K); (ix)(34R, 37K, 38G); (x)(34R, 36G, 37K); 또는 (xi)(34R, 37K, 38E)의 변형; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르도 포함하는 GLP-1 유사체의 형태를 갖는다.
본 발명의 중간 생성물의 다른 유형은 알부민 결합 부분 또는 측쇄 중간체를 갖고, 여기서 측쇄 중간체는 Chem. 2c, Chem. 3b 및 Chem. 4b로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2c: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-PG
Chem. 3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
Chem. 4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, w는 6 내지 18 범위의 정수이고, PG는 보호기로, 바람직하게 *-CO-PG는 활성된 에스테르이고; 여기서 선택적으로, 있는 경우, 연장 부분의 다른(말단) *-COOH기가 바람직하게 본 분야에 알려진 바와 같이 보호되고, 예를 들어, 비반응 에스테르로서 기능화되고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
구체적인 구체예에서, 측쇄 중간체는 a) Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 및 b) Chem. 5b, Chem. 6a 및 Chem. 7a로부터 선택된 하나 이상의 링커를 포함하고:
Chem. 5b:
Figure pct00010
,
Chem. 6a:
Figure pct00011
, 및/또는
Chem. 7a:
Figure pct00012
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이고; 및 PG는 보호기로; 여기서 선택적으로, 연장 부분의 *-COOH기가 바람직하게 또한 본 분야에 알려진 바와 같이 보호되고, 바람직하게 비반응 에스테르로서 기능화되고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
구체적인 구체예에서, PG는, 비반응 연장 부분과 같은 화합물을 뒤집어 만드는, 그리고 선택적으로 제거될 수 있는 기다.
PG기의 비제한 예는 -OH, 또는 예를 들어, 제한없이, OPfp, OPnp 및 OSuc인 활성 에스테르로서 관능화된 기다.
다른 적합한 활성 에스테르가 예를 들어, M. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", 2판, Springer Verlag, 1993에 따른 가르침에 의해 선택될 수 있다.
기능적 성질
제 1 기능적 측면에서, 본 발명의 유도체는 양호한 효능이 있다. 또한, 또는 선택적으로, 제 2 기능적 측면에서, 그들은 연장된 약동학적 프로파일이 있다. 또한, 또는 선택적으로, 제 3 기능적 측면에서, 그들은 위장 내 효소에 의한 변성에 대해 안정하다. 또한, 또는 선택적으로, 제 4 기능적 측면에서, 그들은 높은 구강 생체 이용률을 갖는다.
생물학적 활성(효능)
제 1 기능적 측면에 따라서, 본 발명의 유도체는, 그뿐만 아니라 구성 GLP-1 펩티드(K37-GLP-1(7 내지 37)또는 이것의 유사체 같은)도 생물학적 활성 또는 효능이 있다.
구체적인 구체예에서, 효능 및/또는 활성은 시험관 내 효능을, 즉 기능적 GLP-1 수용체 분석에서의 성능을, 더 구체적으로 복제된 인간 GLP-1 수용체를 발현하는 세포주에서 자극하는 cAMP의 형성 능력을 의미한다.
인간 GLP-1 수용체를 함유하는 배지에서 cAMP의 형성 자극이 BHK467-12A(TK-ts13)와 같은 안정한 형질주입된 세포주를 사용하여, 및/또는 cAMP 의 측정을 위해 바람직하게 기능적 수용체 분석을 사용하여 측정되고, 여기서 더 바람직하게 분석 cAMP가 특정한 항체를 사용하여 캡쳐되고, 및/또는 훨씬 더 바람직한 분석은 AlphaScreen cAMP Assay이고, 가장 바람직하게 하나를 실시예 50에 기재했다.
용어, 최대유효농도의 절반(EC50)은 용량반응곡선에 대한 참조로, 기준선 및 최대값 사이에 반응 중간을 유도하는 농도를 의미한다. EC50이 화합물 효능의 척도로 사용되고, 최대 효과의 50%가 관찰되는 농도를 나타낸다.
본 발명 유도체의 시험관 내 효능은 위에 기재한 바와 같이, 그리고 측정된 문제에서 유도체의 EC50으로 측정될 수 있다. 낮은 EC50은 더 좋은 효능이다.
구체적인 구체예에서, 배지는 50 mM 트리스-HCl; 5 mM HEPES; 10 mM MgCl2,6H2O; 150 mM NaCl; 0.01% 트윈; 0.1% BSA; 0.5 mM IBMX; 1 mM ATP; 1 uM GTP; pH 7.4의 조성(최종 분석용 농도)을 갖는다.
선택적 배지는 50 mM 트리스-HCl; 1 mM EGTA; 1.5 mM MgS04 ; 1.7 mM ATP; 20 mM GTP; 2 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX); 0.01% 트윈-20; pH 7.4이다.
더 구체적인 구체예에서, 본 발명의 유도체는 3000pM 이하, 더 바람직하게 2000pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 1000pM 미만, 또는 가장 바람직하게 500pM 미만의 EC50을 갖는다.
다른 구체적인 구체예에서 본 발명의 유도체는 생체 내에서 효능이 있고, 어떤 적합한 동물 모델에서, 그뿐만 아니라 임상실험에서 본 분야에 알려진 바와 같이 측정될 수 있다.
당뇨병 마우스 모델(db/db 마우스)은 적합한 동물 모델의 한 예이고, 그리고 혈액 글루코오스를 낮추는 효과가 생체 내 이러한 마우스에서 측정될 수 있으며 예를 들어, 실시예 53에 기재되고 또는 WO 09/030738의 실시예 43에 기재된다.
또한, 또는 선택적으로, 생체 내에서 글루코오스 매개 인슐린 분비에서의 효과가 미니돼지(IVGTT)의 약력학 연구에서 측정될 수 있고, 예를 들어, 실시예 55에 기재된다.
또한, 또는 선택적으로, 생체 내에서 섭취의 효과가 돼지의 약력학 연구에서 측정될 수 있고, 예를 들어, 실시예 56에 기재된다.
연장-수용체 결합 / 낮은 및 높은 알부민
제 2 기능적 측면에 따라서, 본 발명의 유도체는 연장된다.
본 발명 유도체의 GLP-1 수용체로의 능력이 알부민의 각각 낮은 또는 높은 농도 존재에서 측정될 수 있고, 실시예 51에 기재된다.
일반적으로, 낮은 알부민 농도에서 GLP-1 수용체로의 결합이, 낮은 IC50 값에 대응하는, 가능한 양호해야된다.
높은 알부민 농도에서의 IC50 값은 GLP-1 수용체로의 유도체 결합에서 알부민 영향의 측정이다. 알려진 바와 같이, GLP-1 유도체도 또한 알부민과 결합한다. 이것은 일반적으로 바람직한 효과로, 혈장에서 그들의 수명을 연장한다. 그러므로, 높은 알부민에서의 IC50 값은 일반적으로 낮은 알부민에서의 IC50 값보다 높을것이고, GLP-1 수용체로의 감소된 결합에 대응하고, GLP-1 수용체로의 결합과 경쟁하는 알부민 결합에 의해 발생된다.
그러므로 높은 비율(IC50 값(높은 알부민)/IC50 값(낮은 알부민))이 문제의 유도체가 알부민(긴 반감기를 가질 수 있음)과 잘 결합한다는 표시로서 갖게 될 수 있고, 또한 그 자체로 GLP-1 수용체와 잘 결합한다(IC50 값(높은 알부민)이 높고, 그리고 IC50 값(낮은 알부민)이 낮음). 한편, 알부민 결합이 항상 바람직하지 않을 수도 있거나, 또는 알부민에 대한 결합이 너무 강해질 수 있다. 그러므로, IC50(높은 알부민)/IC50(낮은 알부민), 및 높은/낮은 비율을 위한 바람직한 범위는 화합물 내지 화합물로 다양하고, 의도된 사용 및 이러한 사용을 둘러싼 상황 및 가능성있는 관심의 다른 화합물의 성질에 따라 다르다.
구체적인 구체예에서, 0.005% HSA의 존재(낮은 알부민)에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)는 1000.00 nM 미만이고, 바람직하게 600.00 nM 미만이고, 더 바람직하게 100.00 nM 미만이고, 또는 가장 바람직하게 50.00 nM 미만이다.
높은 및 낮은 알부민 농도에서 결합하는 수용체를 측정하기 위한 적합한 분석법은 본원에서 예제 51에 개시된다.
래트의 생체 내에서 연장-반갑기
제 2 기능적 측면에 따라서, 본 발명의 유도체는 연장된다. 구체적인 구체예에서, 연장이 정맥 내 투여 후 래트의 생체 내에서의 반감기(T1 /2)로서 측정될 수 있다. 게다가 추가 구체예에서, 반감기는 적어도 4시간, 바람직하게 적어도 6시간, 더 바람직하게 적어도 8시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 10시간이다.
정맥 내 투여 후 래트의 생체 내에서의 반감기를 측정하는 적합한 분석법은 본원에서 예제 58에 개시된다.
미니돼지의 생체 내에서 연장-반감기
제 2 기능적 측면에 따라서, 본 발명의 유도체는 연장된다. 구체적인 구체예에서, 연장이 정맥 내 투여 후 래트의 생체 내에서의 반감기(T1 /2)로서 측정될 수 있다. 게다가 추가 구체예에서, 반감기는 적어도 12시간, 바람직하게 적어도 24시간, 더 바람직하게 적어도 36시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 48시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 60시간이다.
정맥 내 투여 후 래트의 생체 내에서의 반감기를 측정하는 적합한 분석법은 본원에서 예제 54에 개시된다.
위장 내 효소에 의한 변성
제 3 기능적 측면에 따라서, 본 발명의 유도체가 하나 이상의 위장 내 효소에 의한 변성에 대해, 안정적이고, 혹은 안정화된다.
위장 내 효소는 제한 없이, 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제 및 카르복시펩티다제와 같은 외부 및 내부 펩티다제를 포함한다. 안정성이, 정제된 효소의 형태에서, 또는 위장 시스템으로부터의 추출 형태에서 이들 위장 내 효소에 대해 시험될 수 있다.
구체적인 구체예에서, 본 발명의 유도체는 시험관 내 반감기(T1 /2)를 갖고, 래트의 작은 창가 추출물에서, 적어도 1, 바람직하게 1.0 이상, 더 바람직하게 적어도 1.2, 여전히 더 바람직하게 적어도 2.0, 훨씬 더 바람직하게 적어도 3.0, 또는 가장 바람직하게 적어도 4.0의 GLP-1(7 내지 37)에 대응하는 반감기에 의해 나눠진다. 다른 말로, 비율(SI)이 각 유도체로 정의될 수 있고, 즉 문제에서 유도체의 시험관 내 반감기(T1 /2)로서, 래트의 작은 창가 추출물에서, GLP-1(7 내지 37)에 대응하는 반감기에 의해 나눠진다.
래트의 작은 창가 추출물에서 시험관 내 반감기를 측정하기 위한 적합한 분석법은 본원에서 실시예 57에 개시된다.
구강 생체이용률
제 4 기능적 측면에 따라서, 본 발명의 유도체는 높은 구강 생체이용률을 갖는다.
상용 GLP-1 유도체의 구강 생체이용률은 매우 낮다. 개발중인 정맥 내 또는 피하 투여를 위한 GLP-1 유도체 구강 생체이용률도 낮다.
따라서, 본 분야에서 개선된 구강 생체이용률의 GLP-1 유도체의 필요가 있다. 이들 유도체가, 그들의 효능이 일반적으로 만족하는 한, 및/또는 그들의 반감기도 일반적으로 만족하는 한, 구강 투여를 위한 적합한 후보자가 될 수 있다.
본 발명자는 GLP-1 유도체의 새로운 분류를 확인했고, 이것은 의외로 높은 구강 생체이용률을 갖고, 동시에 만족하는 효능 및/또는 반감기를 갖는다.
또한, 또는 선택적으로, 이들 유도체는 의외로 높은 구강 생체이용률을 갖고, 동시에 알부민의 낮은 농도에서 GLP-1 수용체로의 높은 결합 친화도(즉 낮은 IC50 값)를 갖는다.
이들 특징은, 활성 약학적 성분의 낮은 1일 구강 투여량을 얻을 목적으로 중요하고, 예를 들어, 제조의 경제성, 잠재적인 안전 문제 가능성, 그뿐만 아니라 투여 편안 문제 및 환경 문제를 포함하는 다양한 이유에 바람직하다.
일반적으로 용어 생체이용률은 활성 약학적 성분(API)의 투여된 용량의 분율을 의미하고, 변하지 않는 몸 전체의 순환에 도달하는 본 발명 유도체와 같다. 정의에 의해, API가 정맥 내로 투여될 때, 이것의 생체이용률은 100%이다. 그러나, 그것이 다른 경로(구강과 같은)를 통해 투여될 때, 그것의 생체이용률은 감소된다(불완전한 흡수 및 첫 통과 대사로 인해). 투여의 비정맥 경로를 위한 투여량을 계산할 때, 생체이용률에 대한 지식은 필요하다.
절대 구강 생체이용률은 구강 투여에 따른 몸 전체의 순환에서 API의 생체이용률(곡선 아래 영역 또는 AUC로 추정)을 정맥 내 투여에 따른 동일한 API의 생체이용률과 비교한다. 그것은 동일한 API의 대응하는 정맥 투여와 비교되는 비정맥투여를 통해 흡수된 API의 분율이다. 다른 투여량이 사용된 경우, 비교는 투여량 정상화되어야 하고; 따라서, 각 AUC는 대응하는 투여량을 나누어 정정된다.
혈장 API 농도 대 시간 플롯이 모든 구강 및 정맥 투여 후에 만들어진다. 절대 생체이용률(F)은 AUC-정맥 내로 나눈 용량-보정 AUC-구강이다.
본 발명의 유도체는 절대 구강 생체이용률을 갖고, 이것은 a) 리라글루티드 및/또는 b) 세마글루티드 보다 높고; 바람직하게 적어도 10% 높은, 더 바람직하게 적어도 20% 높은, 훨씬 더 바람직하게 적어도 30% 높은, 또는 가장 바람직하게 적어도 40% 높다. 구강 생체이용률을 시험하기 전에 본 발명의 유도체가, 예를 들어, WO 2008/145728에 기재된 하나 이상의 제제를 사용하여, 인슐린분비 화합물의 구강 제제의 본 분야에 알려진 바와 같이 적합하게 공식화될 수 있다.
시험이 개발되었고, 실시예 52에 기재되고, 구강 생체이용률의 아주 양호한 예측이라고 알려졌다. 이 시험에 따라서, 래트의 장의 루멘으로 GLP-1의 직접 주사 후, 혈장에서 이것의 농도(노출)는 측정되고, 그리고 투여 용액의 농도(umol/ℓ)에 의해 나눠진 혈장 농도(pmol/ℓ)의 비율은 t=30분 동안 계산된다. 이 비율은 장의 생체이용률의 척도이고, 이것은 실제 구강 생체이용률 데이터와 함께 정확히 정정하도록 나타났다.
본 발명 유도체의 추가 구체적인 구체예가, 실험 섹션 전에 "구체적인 구체예" 및 "추가 구체적인 구체예"로 표시된 섹션에 기재된다.
제조 과정
GLP-1(7 내지 37) 및 GLP-1 유사체 같은 펩티드 제조는 본 분야에 알려졌다.
예를 들어, K37-GLP-1(7 내지 37) 또는 유사체 또는 조각과 같은 본 발명 유도체의 GLP-1 부분(또는 이것의 조각)이, 예를 들어, t-Boc 또는 Fmoc 화학 또는 다른 잘 수립된 기술을 사용하여 고체상 펩티드 합성인 고전적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Greene 및 Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, "Organic Synthesis on solid Phase", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, 및 "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", W.C. Chan 및 P.D. White에 의한 편집, Oxford University Press, 2000 참조.
또한, 또는 선택적으로, 그것들은 재조합 방법, 즉 유사체를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고, 펩티드 발현이 허락되는 조건하의 적합한 영양 배지에서 펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포 배양에 의해 제조될 수 있다. 이들 펩티드 발현에 적합한 숙주 세포의 비제한 예는 Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, 그뿐만 아니라 포유류의 BHK 또는 CHO 세포주이다.
비천연 아미노산 및/또는 공유 부착된 N-말단 단일 또는 디펩티드 모방을 포함하는 본 발명의 그들 유도체가 실험 부분에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 또는 예를 들어, Hodgson 등: "The synthesis of Peptide and proteins containg non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, no. 7 (2004), p. 422-430; 및 WO 2009/083549 A1 "GLP-1 유사체의 반재조합체 제조" 참조.
본 발명의 수많은 유도체의 제조 방법의 특정한 예는 실험 부분에 포함된다.
약학적 조성물
본 발명의 유도체 또는 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 이것의 에스테르를 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제가 본 분야에 알려진 바와 같이 제조될 수 있다.
용어는 "부형제"는 활성 처리 재료(들) 이외의 다른 어떤 성분을 의미한다. 부형제가 불활성 물질 및/또는 의약으로 활성 물질이 아닌 것일 수 있다.
부형제는 다양한 목적, 예를 들어, 담체, 운반체, 희석제, 정제 보조제로서, 및/또는 투여 및/또는 활성 물질의 흡수를 개선하도록, 지원될 수 있다.
다양한 부형제가 있는 약학적으로 활성 재료의 제제가 본 분야에 알려졌다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (예를 들어, 19판(1995) 및 이후의 편집) 참조.
부형제의 비제한 예는 용제, 희석제, 버퍼, 방부제, 긴장성 조절제, 킬레이트화제 및 안정제이다.
제제의 예는 액체 제제, 즉 물을 포함하는 수성 제제를 포함한다. 액체 제제는 용액 또는 현탁액일 수 있다. 수성 제제는 적어도 50 w/w%의 물, 또는 적어도 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90 w/w%의 물도 전형적으로 포함한다.
선택적으로, 약학적 조성물이 고체 제제, 예를 들어, 그대로 사용할 수 있는 냉동건조된 또는 분무건조된 조성물 또는 여기로 의사 또는 환자가 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 추가한다.
수성 제제의 pH는 pH 3 내지 pH 10 사이의 어떤 것, 예를 들어, 약 7.0 내지 약 9.5; 또는 약 3.0 내지 약 7.0일 수 있다.
약학적 조성물은 버퍼를 포함할 수 있다. 버퍼는 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 나트륨 카보네이트, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 소듐디히드로겐 포스페이트, 디소듐히드로겐 포스페이트, 나트륨 포스페이트 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 및 이것의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 보존제가 예를 들어, 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 벤질알코올, 클로로부탄올 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미듀레아, 클로로헥시딘, 나트륨 디히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 염화벤제토늄, 클로르페네신(3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올) 및 이것의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 보존제가 0.1 ㎎/㎖ 내지 20 ㎎/㎖의 농도에서 존재될 수 있다. 약학적 조성물은 등장제를 포함할 수 있다. 등장제는 예를 들어, 염(예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산(예를 들어, 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소로이신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어, 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG400) 또는 이것의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 단당, 이당 또는 다당류와 같은 어떤 당, 또는 예를 들어, 프럭토스, 글루코오스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 알파 및 베타 HPCD, 가용성 녹말, 히드록시에틸 녹말 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na를 포함하는 수용성 글루칸이 사용될 수 있다. 당 알코올은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C4 내지 C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 크실리톨 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 약학적 조성물은 킬레이트화제를 포함할 수 있다. 킬레이트화제는 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 및 아스파르트산의 염들 및 이것의 혼합물로부터 선택된다. 약학적 조성물은 안정제를 포함할 수 있다. 안정제는 예를 들어, 하나 이상의 산화 억제제, 집합 억제제, 계면활성제 및/또는 하나 이상의 프로테아제 억제제이다. 안정제의 이들 다양한 종류의 비제한 예는 다음에 개시된다.
"응집체 형성"은 폴리펩티드 분자들 간의 물리적인 상호작용을 의미하고, 가용성을 유지할 수 있는 올리고머가 형성되거나, 또는 용액으로부터 침전하는 커다란 눈에 보이는 응집체가 형성될 수 있다.
액체 약학적 조성물의 저장 기간 동안 폴리펩티드에 의한 응집체 형성은 폴리펩티드의 생물학적 활성에 악영향을 미칠 수 있고, 약학적 조성물의 치료 효능의 손실을 가져온다. 게다가, 응집체 형성은, 폴리펩티드-함유 약학적 조성물이 주입 시스템을 사용하여 투여될 때, 튜브, 막, 또는 펌프의 막힘과 같은 다른 문제를 일으킬 수 있다.
약학적 조성물은 조성물의 보관 중 폴리펩티드의 응집체 형성을 감소시키는데 충분한 상당한 양의 아미노산 염기를 포함할 수 있다. 용어 "아미노산 염기"는 하나 이상의 아미노산(메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 리신, 이소로이신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌과 같은) 또는 이것의 유사체를 의미한다. 어떤 아미노산이 자유 염기형 또는 염형 중 하나의 형태로 존재할 수 있다. 아미노산 염기의 어떤 입체이성질체(즉, L, D 또는 이것의 혼합물)가 존재할 수 있다.
메티오닌(또는 다른 황-함유 아미노산 또는 아미노산 유사체)이, 치료제로서 작용하는 폴리펩티드가 이러한 산화에 민감한 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드일 때, 메티오닌 잔기의 메티오닌 술폭시드로의 산화를 억제하도록 첨가될 수 있다. 메티오닌의 어떤 입체이성질체(L 또는 D) 또는 이것의 조합이 사용될 수 있다.
약학적 조성물은 제제는 고분자량 중합체 또는 저분자량 화합물의 군으로부터 선택된 안정제를 포함할 수 있다. 안정제가 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로오스 또는 그 유도체(예를 들어, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올과 같은 황-함유 물질, 및 다른 염들(예를 들어, 염화나트륨)로부터 선택된다. 약학적 조성물은 메티오닌 산화에 대해 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 그리고 냉동-해동 또는 기계적 전단과 관련된 응집에 대해 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물은 하나 이상의 계면활성제를, 바람직하게 하나의 계면활성제, 적어도 하나의 계면활성제, 또는 2개의 다른 계면활성제를 포함할 수 있다. 용어 "계면활성제"는 수용성(친수성) 부분 및 지용성(친유성) 부분으로 이루어진 어떤 분자 또는 이온을 의미한다. 계면활성제가 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및/또는 양이온성 계면활성제를 구성하는 군으로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 예를 들어, EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 및/또는 벤즈아미딘 HCl과 같은 하나 이상의 프로테아제 억제제를 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 부가적, 선택적 재료는 예를 들어, 습윤제, 유화제, 항산화제, 벌크화제, 금속이온, 유성 부형제, 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민, 젤라틴) 및/또는 양쪽성 이온(예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기난, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함한다.
여전히 추가적인, 약학적 조성물이, 예를 들어, WO 2008/145728에 기재된 하나 이상의 제제를 사용하여 인슐린분비 화합물의 구강 제제에 대해 본 분야에서 알려진 바와 같이 조제될 수 있다.
투여량은 유도체의 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎, 또는 유도체의 0.01 내지 50 ㎎, 또는 0.01 내지 20 ㎎, 또는 0.01 내지 10 ㎎을 포함할 수 있다.
유도체가 약학적 조성물의 형태에서 투여될 수 있다. 그것이 이것을 필요로 하는 환자에게 몇몇 부위에서, 예를 들어 피부 및 점막 부위와 같은 국소적 부위에서; 동맥내, 정맥내, 심장내와 같은 흡수를 우회하는 부위에서; 및 피부내, 피부하, 근육내 또는 복부내와 같은 흡수를 포함하는 부위에서 투여될 수 있다.
투여 경로가 예를 들어, 기관지 및 허파꽈리 또는 이것의 조합을 통해; 비경구, 상피; 진피; 경피; 결막; 요로; 질; 직장; 및/또는 안구와 같은 혀; 혀밑; 볼내; 구강내; 경구; 위내; 장내; 비강내; 폐일 수 있다.
조성물이 예를 들어, 용액; 현탁액; 에멀젼; 마이크로에멀젼; 멀티플 에멀젼; 포말; 고약; 페이스트; 플라스터; 연고; 정제; 코팅 정제; 츄잉 껌; 린스; 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐; 좌약; 직장 캡슐; 드롭; 겔,;스프레이; 분말; 에어로졸; 흡입제; 점안제; 안과용 연고; 안과용 린스; 질 페서리; 질 고리; 질 연고; 주사액; 인시튜 겔화, 경화, 침전화, 결정화와 같은 인시튜 변환액; 주입 용액; 또는 임플란트인 몇 가지 투여형태로 투여될 수 있다. 조성물은 정제, 선택적으로 코팅된, 캡슐, 또는 츄잉 껌일 수 있다.
조성물이 예를 들어, 안정성, 생체이용률, 용해도를 증가시키도록 약물 담체 또는 약물 전달 시스템에서 추가로 혼합될 수 있다. 구체적인 구체예에서 조성물이 공유, 소수성 및/또는 정전기 상호작용을 통해 이러한 시스템에 부착될 수 있다. 이러한 혼합의 목적이 예를 들어, 역효과를 감소시키고, 크로노테라피를 달성하고, 및/또는 환자 순응성을 증가시킬 수 있다.
조성물이 제어, 지속, 연장, 지체, 및/또는 서행 방출 약물 전달 시스템의 제제에서도 또한 사용될 수 있다.
비경구 투여가 주사기, 선택적으로는 펜-형 주사기, 또는 주입 펌프에 의해 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다.
조성물이 용액, 현탁액, 또는 분말의 형태로 비강으로 투여될 수 있고; 또는 액체 또는 분말 스프레이의 형태로 폐로 투여될 수 있다.
경피 투여는 예를 들어, 무바늘 주사에 의해, 또는 이온침투형 패치와 같은 패치로부터, 또는 예를 들어, 볼내인 경점막 경로를 통해 추가적인 선택이다.
조성물이 안정화된 제제일 수 있다. 용어 "안정화된 제제"는 물리적으로 및/또는 화학적으로, 바람직하게 모두 증가된 안정성이 있는 제제를 의미한다. 일반적으로, 제제가, 유효기간이 도달할 때까지, 사용 및 저장(요구되는 사용 및 저장 조건에 따라) 중에 안정해야 한다.
용어 "물리적 안정성"은 열-기계적 스트레스에의 노출 및/또는 계면 및 표면(소수성 표면과 같은)을 불안정화하는 상호작용의 결과로서 생물학적 불활성 및/또는 불용성 응집체를 형성하려는 폴리펩티드의 경향을 의미한다. 수성 폴리펩티드 제제의 물리적 안정성이, 다양한 시간 기간 동안 다른 온도에서 기계적/물리적 스트레스(예를 들어, 교반)에 노출 후, 육안 검사 및/또는 탁도 측정에 의해 평가된다. 선택적으로, 물리적 안전성이, 예를 들어, 티오플라빈T 또는 "소수성 패치" 프로브와 같은 폴리펩티드의 입체형태 상태의 프로브 또는 분광 제제를 이용하여 평가될 수 있다.
용어 "화학적 안정성"은, 본래 단백질 구조와 비교했을 때 감소된 생물학적 효능 및/또는 증가된 면역원성 특성을 잠재적으로 갖는 화학적 변성 생성물을 형성하는 폴리펩티드 구조에서 화학적(특히 공유) 변화를 의미한다. 화학적 안정성이 예를 들어, SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC에 의해 다른 환경 조건에 노출 후 다양한 시간 지점에서 화학 변성 생성물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 발명에 따른 유도체를 사용한 치료는 하나 이상의 부가적인 약리학적으로 활성인 물질과도 조합될 수 있고, 이러한 물질은, 예를 들어 항당뇨병제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로부터 또는 관련된 합병증의 치료 및/또는 예방용 물질, 및 비만으로부터 또는 관련된 합병증 및 장애의 치료 및/또는 예방용 물질로부터 선택된다. 이들 약리학적 활성 물질의 예는 인슐린, 술포닐유레아, 비구아나이드, 메글리티나이드, 글루코시다제 억제제, 글루카곤 길항제, DPP-IV(디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, 글루코오스신합성 및/또는 글리코겐증의 자극에 연관된 간 효소의 억제제, 글루코오스 흡수 조정제, HMG CoA 억제제(스타틴류)인 항고지혈증제와 같은 지질대사를 변경하는 화합물, 억제성 위 폴리펩티드(GIP 유사체류), 음식섭취를 줄이는 화합물, RXR 작용제 및 β-세포 ATP-의존성 칼륨 채널에 대해 작용하는 제제; 콜레스티라민, 콜레스티폴, 클로피브레이트, 겜피브로질, 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴, 프로부콜, 덱스트로티록신, 네테글리나이드, 레파글리나이드; β-차단제류, 예를 들어 알프레놀올, 아테놀올, 티몰올, 핀돌올, 프로프라놀올 및 메토프롤올, ACE(안지오텐신 전환효소) 억제제류, 예를 들어 베나제프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제류, 예를 들어 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 그리고 α-차단제류, 예를 들어 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신; CART(코카인 암페타민 조절 전사) 작용제, NPY(뉴로펩티드 Y) 길항제, PYY 작용제, PYY2 작용제, PYY4 작용제, PPY2/PYY4 혼성작용제, MC4(멜라노코르틴 4) 작용제, 오렉신 길항제, TNF(종양괴사인자) 작용제, CRF(코르티코트로핀 방출 인자) 작용제, CRF BP(코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 유로코르틴 작용제, β3 작용제, MSH(멜라닌세포-자극 호르몬) 작용제, MCH(멜라닌세포-농축 호르몬) 길항제, CCK(콜레시스토키닌) 작용제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 혼성 화합물, 5HT(세로토닌) 작용제, 봄베신 작용제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH(티레오트로핀 방출 호르몬) 작용제, UCP 2 또는 3(커플링 해제 단백질 2 또는 3) 조정제, 렙틴 작용제, DA 작용제(브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR(레티노이드 X 수용제) 조정제, TR β 작용제; 히스타민 H3 길항제, 억제성 위 폴리펩티드 작용제 또는 길항제(GIP 유사체류), 가스트린 및 가스트린 유사체이다.
또한, 본 발명에 따른 유도체를 사용한 치료는 수술과 조합될 수 있고, 수술은 위 밴드 삽입술 또는 위 우회술과 같은 글루코오스 수준 및/또는 지질 항상성에 영향을 미친다.
약학적 징후
본 발명은 또한 약제로서의 사용을 위한 본 발명의 유도체와 관련된다.
구체적인 구체예에서, 본 발명의 유도체가 다음의 의학적 치료를 위해 사용 될 수 있고, 당뇨병과 한 방법 또는 서로 바람직하게 관련된 모든 것은,
(i) 고혈당증, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비인슐린-의존성 당뇨병, MODY(소아성인형당뇨병), 임신성 당뇨병, 및/또는 HbA1C의 감소와 같은 당뇨병의 모든 형태의 예방 및/또는 치료;
(ii) 2형 당뇨병이 진행, 내당능장애(IGT)의 인슐린을 요구하는 2형 당뇨병으로의 진행 지연 및/또는 인슐린이 필요없는 2형 당뇨병의 인슐린을 요구하는 2형 당뇨병으로의 진행 지연과 같은 당뇨병의 진행을 지연 또는 예방;
(iii) β-세포 세포자살 감소, β-세포 기능 및/또는 β-세포 질량 증가, 및/또는 β-세포의 글루코오스 민감성의 회복과 같은 β-세포 기능 개선;
(iv) 인지장애 예방 및/또는 치료;
(v) 예를 들어, 섭취 음식의 감소, 체중 감소, 식욕 억제, 포만감 유도에 의해 비만과 같은 식이 장애의 예방 및/또는 치료; 폭식 식이 장애, 폭식증, 및/또는 항정신병약 또는 스테로이드 투여에 의해 유도된 비만의 치료 또는 예방; 및/또는 위 배출 지연;
(vi) 말초신경장해를 포함하는 신경장해; 신장병; 또는 망막병증과 같은 당뇨 합병증을 예방 및/또는 치료;
(vii) 이상지질혈증, 총 혈청 지질 낮추기와 같은 지질 파라미터 개선; HDL 낮추기; 작고 조밀한 LDL 낮추기; VLDL 낮추기; 트리글리세리드 낮추기; 콜레스테롤 낮추기; HDL 높이기; 인간의 지질단백질a(Lp(a))의 혈장 레벨 낮추기; 시험관 내 및/또는 생체 내에서 아포리포단백질a(아포(a)) 발생 억제;
(iix) X증후군과 같은 심혈관계 질환; 죽상동맥경화증; 심근경색증; 관동맥성심장병; 뇌졸중, 뇌허혈; 왼쪽 심실 비대와 같은 초기 심장 또는 초기 심혈관계 질환; 관상 동맥 질환; 필수 고혈압; 급성 고혈압성 응급 상황; 심근증; 심장 부족; 운동 내성; 만성 심부전; 부정맥; 심장 리듬장애; 졸도; 죽상경화증; 약한 만성 심부전; 협심증, 심장 바이패스 재폐색; 간헐성파행증(죽상경화증 폐색); 심장 이완 장애 및/또는 수축 장애 예방 및/또는 치료;
(ix) 염증성 장 증후군과 같은 위장 질환; 소장 증후군, 또는 크론병; 소화불량; 및/또는 위궤양의 예방 및/또는 치료;
(x) 중대하게 아픈 환자, 중대한 질병 폴리-신장병(CIPNP) 환자 및/또는 잠재 CIPNP 환자의 치료와 같은 중대한 질병의 예방 및/또는 치료; 환자의 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 예방, 치료 및/또는 치유법; 및/또는 입원 중 균혈증, 패혈증, 및/또는 패혈성 쇼크로부터 고통받는 환자의 가능성을 예방 또는 감소; 및/또는
(xi) 다낭성 난소 증후군(PCOS)의 예방 및/또는 치료이다.
구체적인 구체예에서, 징후가, 징후 (i), (ii), 및/또는 (iii); 또는 징후(v), 징후(vi), 징후(vii), 및/또는 징후(iix)과 같은 (i) 내지 (iii) 및 (v) 내지 (iix)을 구성하는 군으로부터 선택된다.
다른 구체적인 구체예에서, 징후는 (i)이다. 추가 구체적인 구체예에서, 징후는 (v)이다. 추가 구체적인 구체예에서 징후는 (iix)이다.
다음의 징후들은 구체적으로 바람직한 제 2 형 당뇨병 및/또는 비만이다.
구체적인 구체예
다음은 본 발명의 구체적인 구체예이다:
1. GLP-1 유사체의 유도체로,
유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고,
유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서
알부민 결합 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고;
단, 연장 부분이 Chem. 1일 때, 알부민 결합 부분은 추가로 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00013
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
2. 실시예 1의 유도체로,
여기서 GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고,
유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서
알부민 결합 부분은 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
3. 구체예 2의 유도체로, 여기서 알부민 결합 부분은 추가로 링커를 포함한다.
4. 구체예 3의 유도체로, 여기서 링커는 i) Glu 디-라디칼; 및/또는 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00014
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이다.
5. 실시예 4의 유도체로, 여기서 Glu 디-라디칼은 Chem. 6 및/또는 Chem. 7로부터:
Chem. 6:
Figure pct00015
Chem. 7:
Figure pct00016
바람직하게 Chem. 6으로부터 선택된다.
6. 구체예 1의 유도체로,
여기서 GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고,
유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서
알부민 결합 부분은
i) Chem. 1의 연장 부분을 포함하고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고;
ii) 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00017
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
7. 구체예 1의 유도체로,
여기서 GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고;
유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 연장 부분을 링커를 통해 포함하고, 여기서
연장 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택되고:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 및
링커는 Chem. 5를 포함하고:
Chem. 5:
Figure pct00018
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이고;
또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
8. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 Chem. 5는 제 1 링커 원소이다.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 k는 1이다.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 n는 1이다.
11. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 Chem. 5는 m번을 포함하고, 여기서 m은 1 내지 10 범위의 정수이다.
12. 구체예 11의 유도체로, 여기서 m은 1 내지 6 범위의 정수; 바람직하게 1 내지 4 범위; 더 바람직하게 m은 1 또는 2; 가장 바람직하게 m은 2이다.
13. 구체예 11 내지 12 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 m이 1이 아닐 때, Chem. 5 원소는 아미드 결합(들)을 통해 상호연결된다.
14. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커는 하나 이상의 Chem. 5 원소를 구성한다.
15. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 추가로 제 2 링커 원소; 바람직하게 Glu 디-라디칼; 더 바람직하게 Chem. 6 및/또는 Chem. 7:
Chem. 6:
Figure pct00019
Chem. 7:
Figure pct00020
,
더 바람직하게 Chem. 6으로부터 선택된다.
16. 구체예 15의 유도체로, 여기서 Glu 디-라디칼은 p번 포함되고, 여기서 p는 1 내지 3 범위의 정수이다.
17. 구체예 16의 유도체로, 여기서 p는 1, 2 또는 3; 바람직하게 1 또는 2; 가장 바람직하게 1이다.
18. 구체예 1 내지 17 중 하나의 유도체로, 여기서 Glu 디-라디칼은 L-Glu 또는 D-Glu, 바람직하게 L-Glu 라디칼이다.
19. 구체예 16 내지 18 중 하나의 유도체로, 여기서 하나 이상의 Glu 디-라디칼 및 하나 이상의 Chem. 5 원소가 아미드 결합(들)에 의해 상호연결된다.
20. 구체예 1 내지 19 중 하나의 유도체로, 여기서 링커는 제 3 링커 원소와 같은 추가 링커 원소를 포함한다.
21. 구체예 20의 유도체로, 여기서 제 3 링커 원소가 Chem. 8이고:
Chem. 8: *-NH-(CH2)q-CHR2-CO-*
여기서 q는 2 내지 12 범위의 정수이고, R2는 수소(H), 아미노(NH2) 또는 C1 내지 C5의 낮은 알코올이다.
22. 구체예 21의 유도체로, 여기서 q는 4, 6, 또는 10이다.
23. 구체예 21 내지 22 중 하나의 유도체로, 여기서 Chem. 8은 아미노 헥산산, 아미노 옥탄산, 아미노 도데칸산 또는 리신의 라이칼이다.
24. 구체예 23의 유도체로, 여기서 라디칼된 아미노기는 엡실론 위치에 있다.
25. 구체예 1 내지 24 중 하나의 유도체로, 여기서 링커는 m번의 Chem. 5 및 p번의 Glu 디-라디칼을 구성한다.
26. 구체예 25의 유도체로, 여기서 (m.p)는 (2,2), (2,1), (2,3), (4,1), (6,1), (1,0), (1,1), (1,2), (0,1), 또는 (0,2); 바람직하게 (2,1), (2,0), (1,0), (1,1), (0,1), 또는 (0,2); 더 바람직하게 (2,1), (2,2), 또는 (1,2); 훨씬 더 바람직하게 (1,1) 또는 (2,1); 또는 가장 바람직하게 (2,1)이다.
27. 구체예 25 내지 26 중 하나의 유도체로, 여기서 m의 Chem. 5 원소 및 p의 Glu 디-라디칼이 아미드 결합에 의해 상호연결된다.
28. 구체예 21 내지 24 중 하나의 유도체로, 여기서 링커는 m번의 Chem. 5 및 p번의 Glu 디-라디칼을 구성한다.
29. 구체예 28의 유도체로, 여기서 (m,p)는 (2,1) 또는 (1,1); 바람직하게 (2,1)이다.
30. 구체예 28 내지 29 중 하나의 유도체로, 여기서 m의 Chem. 5 원소 및 p의 Glu 디-라디칼이 아미드 결합에 의해 상호연결된다.
31. 구체예 1 내지 30 중 하나의 유도체로, 여기서 링커 및 연장 부분이 아미드 결합에 의해 상호연결된다.
32. 구체예 1 내지 31 중 하나의 유도체로, 여기서 링커 및 GLP-1 유사체는 아미드 결합에 의해 상호연결된다.
33. 구체예 32의 유도체로, 여기서 링커가 K26 및 K37에 엡실론-아미노기로 부착된다.
34. 구체예 1 내지 33 중 하나의 유도체로, 여기서 링커는
(i) 5 내지 41개의 C-원자; 바람직하게 5 내지 17개의 C-원자; 5, 6, 11, 12 또는 17개 C-원자와 같은; 예를 들어, 5, 6 또는 12개의 C-원자, 또는 11 또는 17개의 C-원자; 또는 가장 바람직하게 17개의 C-원자; 또는
(ii) 5 내지 30개의 C-원자, 바람직하게 5 내지 25개의 C-원자, 더 바람직하게 5 내지 20개의 C-원자, 또는 가장 바람직하게 5 내지 17개의 C-원자를 갖는다.
35. 구체예 1 내지 34 중 하나의 유도체로, 여기서 링커는
(i) 4 내지 28개의 헤테로 원자; 바람직하게 4 내지 12개의 헤테로 원자; 4, 8 또는 12개의 헤테로 원자와 같은; 더 바람직하게 8 또는 12개의 헤테로 원자; 또는 가장 바람직하게 12개의 헤테로 원자; 또는
(ii) 4 내지 20개의 헤테로 원자, 바람직하게 4 내지 18개의 헤테로 원자, 더 바람직하게 4 내지 14개의 헤테로 원자, 또는 가장 바람직하게 4 내지 12개의 헤테로 원자를 갖는다.
36. 구체예 35의 유도체로, 여기서 헤테로 원자는 N- 및/또는 O-원자이다.
37. 구체예 34 내지 36 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커는 1 내지 7개의 N-원자; 바람직하게 1 내지 3개의 N-원자; 1, 2 또는 3개 N-원자와 같은; 예를 들어, 1 또는 2개의 N- 원자; 또는 가장 바람직하게 3개의 N-원자를 갖는다.
38. 구체예 34 내지 37 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커는 3 내지 21개의 O-원자; 바람직하게 3 내지 9개의 O-원자; 3, 6 또는 9개 O-원자와 같은; 예를 들어 3 또는 6개의 O-원자; 또는 바람직하게 9개의 O-원자를 갖는다.
39. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 2번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
40. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 4번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
41. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 2번의 Chem. 6 및 2번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
42. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 2번의 Chem. 5 및 1번의 Chem. 6를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
43. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 3번의 Chem. 6 및 2번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
44. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6 및 2번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
45. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6 및 1번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
46. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6 및 4번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
47. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6 및 6번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
48. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6 및 1번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
49. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 5, 1번의 Chem. 6 및 1번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
50. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 7 및 2번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
51. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
52. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6을, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
53. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 2번의 Chem. 6을, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
54. 구체예 1 내지 53 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6, 1번의 Chem. 8, 여기서 바람직하게 q는 10이고, R2은 H이고, 1번의 Chem. 6 및 2번의 Chem 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
55. 구체예 1 내지 54 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6, 1번의 Chem. 8, 여기서 바람직하게 q는 4이고, R2은 H이고, 1번의 Chem. 6 및 2번의 Chem 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
56. 구체예 1 내지 53 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6, 1번의 Chem. 8, 여기서 바람직하게 q는 6이고, R2은 H이고, 1번의 Chem. 6 및 2번의 Chem 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
57. 구체예 1 내지 53 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커가 아미드 결합에 의해 상호연결된 그리고 나타낸 서열에서, 1번의 Chem. 6, 1번의 Chem. 8, 여기서 바람직하게 q는 4이고, R2은 NH2이고, 1번의 Chem. 6 및 2번의 Chem 5를, 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로, 및 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K26 또는 K37의 엡실론 아미노기로 상호연결되어, 구성한다.
58. 구체예 1 내지 57 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 연장 부분은 Chem. 1이다.
59. 구체예 1 내지 58 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 x는 짝수이다.
60. 구체예 1 내지 59 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 x는 8 내지 16 범위의 정수이고, 8, 10, 12, 14 또는 16과 같은; 또는 바람직하게 10 내지 14 범위이다.
61 . 구체예 1 내지 60 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 x는 10, 12 또는 14;
바람직하게 14; 더 바람직하게 10; 또는 가장 바람직하게 12이다.
62. 구체예 1 내지 61 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 Chem. 1이 Chem. 1a에 의해 나타내고:
Chem. 1a:
Figure pct00021
x는 구체예 1 내지 61 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
63. 구체예 1 내지 57 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 연장 부분은 Chem. 2이다.
64. 구체예 1 내지 63 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y는 홀수이다.
65. 구체예 1 내지 64 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y 7 내지 17 범위의 정수이고, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17과 같은; 바람직하게 7 내지 15, 예를 들어, 9, 11 또는 15와 같다.
66. 구체예 1 내지 65 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y는 7, 8, 9, 11 또는 15이다.
67. 구체예 1 내지 66 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y는 7, 9, 11 또는 15이다.
68. 구체예 1 내지 67 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y는 7이다.
69. 구체예 1 내지 68 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y는 9이다.
70. 구체예 1 내지 69 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y는 11이다.
71. 구체예 1 내지 70 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 y는 15이다.
72. 구체예 1 내지 71 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 Chem. 2이 Chem. 2a 또는 Chem. 2b:
Chem. 2a:
Figure pct00022
Chem. 2b:
Figure pct00023
,
더 바람직하게 Chem. 2a를 나타내고, 여기서 y는 구체예 1 내지 71 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
73. 구체예 1 내지 57 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 연장 부분 Chem. 3이다.
74. 구체예 1 내지 73 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 z는 홀수; 바람직하게 3이다.
75. 구체예 1 내지 74 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1은 127 Da를 넘지 않는 몰질량을 갖는 기이다.
76. 구체예 1 내지 74 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1은 1 내지 127 Da 범위; 바람직하게 1 내지 125 Da, 더 바람직하게 1 내지 100 Da; 훨씬 더 바람직하게 1 내지 75 Da, 또는 가장 바람직하게 1 내지 50 Da의 몰질량을 갖는 기이다.
77. 구체예 1 내지 74 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1은
(i) 130 Da 미만, 바람직하게 100 Da 미만, 더 바람직하게 75 Da 미만, 훨씬 더 바람직하게 60 Da 미만, 또는 가장 바람직하게 50 Da 미만의 몰질량; 또는
(ii) 40 Da 미만, 바람직하게 30 Da 미만, 더 바람직하게 20 Da 미만, 또는 가장 바람직하게 15 Da 미만의 몰질량을 갖는 기이다.
78. 구체예 1 내지 77 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1은 -H이다.
79. 구체예 1 내지 78 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1은 할로겐 라디칼이다.
80. 구체예 1 내지 79 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1은 -I이다.
81 . 구체예 1 내지 80 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1은 선형 또는 분지형 C1 내지 C5 알킬; 바람직하게 C1 내지 C4 알킬; 더 바람직하게 메틸; 또는 가장 바람직하게 tert-부틸이다.
82. 구체예 1 내지 81 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 Chem. 3이 Chem. 3a로 나타내고:
Chem. 3a:
Figure pct00024
여기서 R1 및 z는 구체예 1 내지 81 중 하나에서 정의된 바와 같다.
83. 구체예 1 내지 57 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 연장 부분 Chem. 4이다.
84. 구체예 1 내지 83 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 w는 짝수이다.
85. 구체예 1 내지 84 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 w는 8 내지 16 범위; 또는 바람직하게 10 내지 14 범위의 정수이다.
86. 구체예 1 내지 85 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 w는 10, 12 또는 14;
바람직하게 14; 더 바람직하게 10; 또는 가장 바람직하게 12이다.
87. 구체예 1 내지 86 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 Chem. 4가 Chem. 4a로 나타내고:
Chem. 4a:
Figure pct00025
여기서 w는 구체예 1 내지 86 중 하나에서 정의된 바와 같다.
88. 구체예 1 내지 87 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 2개의 연장 부분은 실질적으로 동일한; 예를 들어 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다.
89. 구체예 1 내지 88 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 2개의 연장 부분은 적어도 0.5; 바람직하게 적어도 0.6; 더 바람직하게 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8; 훨씬 더 바람직하게 적어도 0.9; 또는 가장 바람직하게 적어도 0.99, 예를 들어 1.0의 유사성을 갖는다.
90. 구체예 1 내지 89 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 2개의 링커는 실질적으로 동일한; 예를 들어 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다.
91. 구체예 1 내지 90 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 링커는 적어도 0.5; 바람직하게 적어도 0.6; 더 바람직하게 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8; 훨씬 더 바람직하게 적어도 0.9; 또는 가장 바람직하게 적어도 0.99, 예를 들어 1.0의 유사성을 갖는다.
92. 구체예 1 내지 91 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 2개의 알부민 바인더, 예를 들어 연장 부분 및 링커를 구성하는 2개의 측쇄가 실질적으로 동일한; 예를 들어 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다.
93. 구체예 1 내지 92 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 2개의 알부민 바인더, 예를 들어 연장 부분 및 링커를 구성하는 2개의 측쇄가 적어도 0.5; 바람직하게 적어도 0.6; 더 바람직하게 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8; 훨씬 더 바람직하게 적어도 0.9; 또는 가장 바람직하게 적어도 0.99, 예를 들어 1.0의 유사성을 갖는다.
94. 구체예 88 내지 93 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 비교되는 2개의 화학 구조가 지문으로서 예를 들어 a) ECFP_6 지문; b) UNITY 지문; 및/또는 c) MDL 지문을 나타내고; 그리고, 여기서 각각의 a), b) 및 c)를 위한 Tanimoto 계수가 2개 지문의 유사성 또는 동일성을 계산하기 위해 바람직하게 사용된다.
95. 구체예 1 내지 94 중 어느 하나의 유도체로, 여기서
a) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37 및 26에 대응하는 위치, 및/또는
b) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해 아미노산 변형의 수
가 필기 및 아이볼링에 의해 동일화된다.
96. 구체예 1 내지 95 중 어느 하나의 유도체로, 여기서
a) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37 및 26에 대응하는 위치, 및/또는
b) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해 아미노산 변형의 수
가 표준 단백질 또는 펩티드 얼라인먼트 프로그램의 사용에 의해 동일화된다.
97. 구체예 96의 유도체로, 여기서 얼라인먼트 프로그램은 Needleman- Wunsch 얼라인먼트이다.
98. 구체예 96 내지 97 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 디폴트 스코어링 메트릭스 및 디폴트 동일성 메트릭스가 사용된다.
99. 구체예 96 내지 98 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 스코어링 메트릭스는 BLOSUM62이다.
100. 구체예 96 내지 99 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 갭에서 제 1 잔기의 페널티는 -10(마이너스 10)이다.
101. 구체예 96 내지 100 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 갭에서 추가 잔기의 페널티는 -0.5(마이너스 0.5)이다.
102. 구체예 1 내지 101 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 제 1 및 제 2 K 잔기와 다르게 비 K 잔기를 포함한다.
103. 구체예 1 내지 102 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 아미노산 변형(들)은 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)에서 위치 7, 8, 9, 23, 30, 31, 34, 36, 37 및 38에 대응하는 하나 이상의 위치에서 있다.
104. 구체예 1 내지 103 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는, 바람직하게 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최소 2개의 아미노산 변형; GLP-1(7 내지 37)의 위치 34 및 37에 대응하는 각 위치에서 바람직하게 최소 2개의 아미노산 변형을 갖고, 더 바람직하게 위치 37에 대응하는 위치에서의 아미노산은 K, 그리고 위치 34에 대응하는 위치에서의 아미노산은 K가 아니 도록 한다.
105. 구체예 1 내지 104 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체는 C-말단 아미드를 갖는다.
106. 구체예 105의 유도체로, 여기서 위치 34에 대응하는 위치에서의 아미노산은 R 또는 Q이다.
107. 구체예 1 내지 106 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 아미노산 변형이 (R34 또는 Q34), K37, (Des7 또는 Imp7), (D-Ala8, Des8, Aib8, G8 또는 S8), (Q9 또는 G9), R23, E30, H31, G36, 및/또는 (E38 또는 G38)로부터 선택된다.
108. 구체예 1 내지 107 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 아미노산 변형이 (R34 또는 Q34), K37, (Des7 또는 Imp7), (Des8또는 Aib8), (Q9 또는 G9), R23, E30, H31, G36, 및/또는 (E38 또는 G38)로부터 선택된다.
109. 구체예 1 내지 108 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 (R34 또는 Q34), K37을 포함한다.
110. 구체예 1 내지 109 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 Imp7 및/또는 (Aib8 또는 S8); 바람직하게 Imp7 및/또는 Aib8; 더 바람직하게 Imp7; 또는 가장 바람직하게 Aib8을 포함한다.
111. 구체예 1 내지 110 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 G38 또는 E38, 바람직하게 E38을 포함한다.
112. 구체예 1 내지 111 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 Q9 또는 G9을 포함한다.
113. 구체예 1 내지 112 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 G36을 포함한다.
114. 구체예 1 내지 113 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 H31을 포함한다.
115. 구체예 1 내지 114 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 R23을 포함한다.
116. 구체예 1 내지 115 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 des7 및/또는 des8, 바람직하게 모두를 포함한다.
117. 구체예 1 내지 116 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 하나의 아미노산이 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 7에 대응하는 위치에서 제거되었다.
118. 구체예 1 내지 117 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 하나의 아미노산이 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 8에 대응하는 위치에서 제거되었다.
119. 구체예 1 내지 118 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 2개의 아미노산이 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 7 및 8에 대응하는 위치에서 제거되었다.
120. 구체예 1 내지 119 중 어느 하나의 유도체로, 이것은 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 10, 9, 8 또는 6개의 아미노산 변형을 갖는 GLP-1(8 내지 37)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 2 내지 31)의 유사체이다.
121. 구체예 1 내지 120 중 어느 하나의 유도체로, 이것은 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 10, 9, 8 또는 6개의 아미노산 변형을 갖는 GLP-1(9 내지 37)(SEQ ID NO: 1 각각의 아미노산 3 내지 31)의 유사체이다.
122. 구체예 1 내지 121 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체는 (a) K37-GLP-1(7 내지 37), (b) K37-GLP-1(8 내지 37), (c) K37-GLP-1(9 내지 37), 또는 (d) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 10, 9, 8 또는 6개의 아미노산 변형을 갖는 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 유사체에 대응한다.
123. 구체예 1 내지 122 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 His와 다른 His-모방은 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 2에 대응하는 위치에 있다.
124. 구체예 1 내지 123 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 His-Ala와 다른 His-Ala-모방은 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 7 및 8에 대응하는 위치에 있다.
125. 구체예 123 내지 124 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 His-모방, 또는 His-Ala 모방은 a) 이미다졸; 또는 b) 피리딘을 포함한다.
126. 구체예 125의 유도체로, 여기서 이미다졸은, 아미드 결합의 형성에 의해, 유사체 N-말단 아미노산의 *-NH로의 공유 커플링을 위한 *-CO 단부를 포함하는 이미다졸의 유도체이다.
127. 구체예 125의 유도체로, 여기서 피리딘은, 아미드 결합의 형성에 의해, 유사체 N-말단 아미노산의 *-NH로의 공유 커플링을 위한 *-CO 단부를 포함하는 피리딘의 유도체이다.
128. 구체예 125 내지 127 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 이미다졸 유도체가 단일치환된다.
129. 구체예 125 내지 127 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 피리딘 유도체가 단일치환된다.
130. 구체예 125 내지 129 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 이미다졸 유도체가 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 낮은 알킬의 카르복시산 라디칼을 포함하는 기로 치환된다.
131. 구체예 125 내지 129 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 피리딘 유도체가 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 낮은 알킬의 카르복시산 라디칼을 포함하는 기로 치환된다.
132. 구체예 130 내지 131 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 카르복시산 라디칼이 아세틸; 및 곧은 또는 분지된 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일; 바람직하게 아세틸로부터 선택된다.
133. 구체예 1 내지 132 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 8에 대응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 그것의 N-원자가 부착된 3H-이미다졸-4-일-아세틸을 갖는다.
134. 구체예 1 내지 133 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 SEQ ID NO: 1의 위치 8에 대응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 알라닌이다.
135. 구체예 125 내지 134 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 이미다졸이 (메틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, (에틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, (프로필카바모일)-2-메틸-프로피오닐, 또는 (부틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐; 바람직하게 (에틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐로 치환된다.
136. 구체예 1 내지 135 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 9에 대응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 그것의 N-원자가 부착된 {2-[2-(1H-이미다졸-4-일)-에틸카바모일]-2-메틸-프로피오닐}을 갖는다.
137. 구체예 125 내지 136 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 피리딘이 (메틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, (에틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, (프로필카바모일)-2-메틸-프로피오닐, 또는 (부틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐; 바람직하게 (메틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐로 치환된다.
138. 구체예 1 내지 137 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 9에 대응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 그것의 N-원자가 부착된 [2,2-디메틸-3-옥소-3-(피리딘-2-일메틸아미노)프로판노일]을 갖는다.
139. 구체예 1 내지 138 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체의 위치 9에 대응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 글루탐산이다.
140. 구체예 1 내지 139 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 (H31 및 Q34)을 포함하지 않는다.
141. 구체예 1 내지 139 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는, 구체예 116 내지 140 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이, (des7 및 des8)을 포함하지 않고; 및/또는 His-모방 또는 His-Ala 모방을 포함하지 않는다.
142. 구체예 1 내지 141 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 GLP-1(7 내지 37), 또는 GLP-1 (9 내지 37)의 유사체이다.
143. 구체예 1 내지 142 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는, GLP-1 (7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, i)(34R, 37K); ii)(8Aib, 34R, 37K); iii)(31H, 34Q, 37K); iv)(des7, des8, 34R, 37K), 및 선택적으로 38E; 또는 v)(34R, 36G, 37K)의 아미노산 변화 또는 변형을 포함하고, 바람직하게 갖는다.
144. 구체예 1 내지 143 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 9개의 아미노산 변형을 갖는다.
145. 구체예 1 내지 144 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 8개의 아미노산 변형을 갖는다.
146. 구체예 1 내지 145 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 7개의 아미노산 변형을 갖는다.
147. 구체예 1 내지 146 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 6개의 아미노산 변형을 갖는다.
148. 구체예 1 내지 147 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 5개의 아미노산 변형을 갖는다.
149. 구체예 1 내지 148 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 4개의 아미노산 변형을 갖는다.
150. 구체예 1 내지 149 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 3개의 아미노산 변형을 갖는다.
151. 구체예 1 내지 150 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최대 2개의 아미노산 변형을 갖는다.
152. 구체예 1 내지 151 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 2개의 아미노산 변형을 갖는다.
153. 구체예 1 내지 152 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 3개의 아미노산 변형을 갖는다.
154. 구체예 1 내지 153 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 4개의 아미노산 변형을 갖는다.
155. 구체예 1 내지 154 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 5개의 아미노산 변형을 갖는다.
156. 구체예 1 내지 155 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 6개의 아미노산 변형을 갖는다.
157. 구체예 1 내지 156 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 7개의 아미노산 변형을 갖는다.
158. 구체예 1 내지 157 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 8개의 아미노산 변형을 갖는다.
159. 구체예 1 내지 158 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 9개의 아미노산 변형을 갖는다.
160. 구체예 1 내지 159 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 최소 10개의 아미노산 변형을 갖는다.
161. 구체예 1 내지 160 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 하나의 아미노산 변형을 갖는다.
162. 구체예 1 내지 161 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 2개의 아미노산 변형을 갖는다.
163. 구체예 1 내지 162 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 3개의 아미노산 변형을 갖는다.
164. 구체예 1 내지 163 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 4의 아미노산 변형을 갖는다.
165. 구체예 1 내지 164 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 5개의 아미노산 변형을 갖는다.
166. 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 6개의 아미노산 변형을 갖는다.
167. 구체예 1 내지 166 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 7개의 아미노산 변형을 갖는다.
168. 구체예 1 내지 167 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 8개의 아미노산 변형을 갖는다.
169. 구체예 1 내지 168 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 9개의 아미노산 변형을 갖는다.
170. 구체예 1 내지 169 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 유사체는 10개의 아미노산 변형을 갖는다.
171. 구체예 1 내지 170 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 변형은 독립적으로, 치환, 첨가, 및/또는 제거이다.
172. 구체예 1 내지 171 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 변형은 치환이다.
173. 구체예 1 내지 172 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 변형은 제거이다.
174. 구체예 1 내지 173 중 어느 하나의 유도체로, 여기서 변형은 첨가이다.
175. 구체예 1 내지 174 중 어느 하나의 유도체로, 여기서
a) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 어떤 표시된 위치에 대응하는 위치, 및/또는
b) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 아미노산 변형의 수가
필기 및 아이볼링에 의해 정의된다.
176. 구체예 1 내지 175 중 어느 하나의 유도체로, 여기서
a) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 어떤 표시된 위치에 대응하는 위치, 및/또는
b) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 아미노산 변형의 수가
구체예 96 내지 101 중 어느 하나에서 기재된 바와 같이 동일화된다.
177. Chem. 20, Chem. 21, Chem. 22, Chem. 23, Chem. 24, Chem. 25, Chem. 26, Chem. 27, Chem. 28, Chem. 29, Chem. 30, Chem. 31, Chem. 32, Chem. 33, Chem. 34, Chem. 35, Chem. 36, Chem. 37, Chem. 38, Chem. 39, Chem. 40, Chem. 41, Chem. 42, Chem. 43, Chem. 44, Chem. 45, Chem. 46, Chem. 47, Chem. 48, Chem. 49, Chem. 50, Chem. 51, Chem. 52, Chem. 53, Chem. 54, Chem. 55, Chem. 56, Chem. 57, Chem. 58, Chem. 59, Chem. 60, Chem. 61, Chem. 62, Chem. 63, Chem. 64, Chem. 65, Chem. 66, Chem. 67, 및 Chem. 68로부터 선택된 화합물; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르.
178. 이름에 의해 특징지어지고 본원에서의 실시예 1 내지 49의 화합물의 각 이름 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르.
179. 구체예 178의 화합물로, 이것이 구체예 177의 화합물이다.
180. 구체예 178 및 179 중 어느 하나의 화합물로, 구체예 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 유도체.
181. 구체예 1 내지 180 중 어느 하나의 유도체로, 이것은:
(i) N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4- 카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Gly36,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 62:
Figure pct00026
,
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 58:
Figure pct00027
,
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 40:
Figure pct00028
,
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Gln9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드,
Chem.56:
Figure pct00029
,
N ε26 {2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem.21:
Figure pct00030
,
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[9-(4-카르복시페녹시)논나노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[9-(4-카르복시페녹시)논나노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 63:
Figure pct00031
,
N ε26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]-N ε37 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 36:
Figure pct00032
,
N ε26 -[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부탄오일], N ε37 -[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부탄오일]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 55:
Figure pct00033
,
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 51:
Figure pct00034
,
N ε26 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴], N ε37 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 44:
Figure pct00035
,
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티딜-Glu, 및
Chem. 64:
Figure pct00036
;
(ii)
N 9 -[2-(1H-이미다졸-4-일)-에틸카바모일]-2-메틸프로피오닐}-N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸페닐)부티릴아미노]-4-카르복시부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸페닐)부티릴아미노]-4-카르복시부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[ Arg34, Lys37]GLP-1(9 내지 37)-펩티드,
Chem. 46:
Figure pct00037
,
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg23,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 50:
Figure pct00038
,
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 24:
Figure pct00039
,
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부틸아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드, 및
Chem. 31:
Figure pct00040
;
(iii)
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 35:
Figure pct00041
,
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 23:
Figure pct00042
,
N ε26 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴], N ε37 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 44:
Figure pct00043
,
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 21:
Figure pct00044
,
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드, 및
Chem. 48:
Figure pct00045
;
(iv)
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 35:
Figure pct00046
,
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드,
Chem. 21:
Figure pct00047
,
N ε26 -[2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]], N ε37 -[2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드아미드,
Chem. 29:
Figure pct00048
,
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부틸아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드, 및
Chem. 31:
Figure pct00049
;
또는 이들 화합물의 어떤 것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르로부터 선택된다.
182. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 62, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
183. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 40, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
184. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 21, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
185. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 55, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
186. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 51, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
187. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 44, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
188. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 46, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
189. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 31, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
190. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 35, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
191. 구체예 181의 유도체로, 이것은 Chem. 23, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
192. 구체예 1 내지 191의 어느 하나의 유도체로, 이것이 GLP-1 활성을 갖는다.
193. 구체예 192의 유도체로, 여기서 GLP-1 활성은 인간 GLP-1 수용체에 활성하는 능력을 의미한다.
194. 구체예 193의 유도체로, 여기서 인간 GLP-1 수용체의 활성이 cAMP 생성물의 효능으로서, 시험관 내 분석법에서 측정된다.
195. 구체예 1 내지 194의 어느 하나의 유도체로, 이것이
a) 10000 pM 미만, 더 바람직하게 5000 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 4000 pM 미만, 또는 가장 바람직하게 3000 pM 미만;
b) 3000pM 이하, 바람직하게 3000pM 미만, 더 바람직하게 2500pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 2000pM 미만, 또는 가장 바람직하게 1500pM 미만;
c) 2000 pM 미만, 바람직하게 1000 pM 미만, 더 바람직하게 800 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 600 pM 미만, 또는 가장 바람직하게 500 pM 미만;
c) 400 pM 미만, 바람직하게 300 pM 미만, 더 바람직하게 200 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 150 pM 미만, 또는 가장 바람직하게 100 pM 미만;
d) 80 pM 미만, 바람직하게 60 pM 미만, 더 바람직하게 50 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 40 pM 미만, 또는 가장 바람직하게 30 pM 미만; 또는
e) 세마글루티드의 EC50보다 10배 미만, 바람직하게 세마글루티드의 EC50보다 8배 미만, 더 바람직하게 세마글루티드의 EC50보다 6배 미만, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드의 EC50보다 4배 미만, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드의 EC50보다 2배 미만;
f) 리라글루티드의 EC50보다 10배 미만, 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 8배 미만, 더 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 6배 미만, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 4배 미만, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 2배 미만; 또는
g) 리라글루티드의 EC50보다 미만, 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 0.8배 미만, 더 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 0.6배 미만, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 0.5배 미만, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드의 EC50보다 0.4배 미만의 EC50에 대응하는 효능을 갖는다.
196. 구체예 1 내지 195의 어느 하나의 유도체로, 여기서 효능이 인간 GLP-1 수용체를 함유하는 배지에서 cAMP의 용량-의존 형성을 나타내는 용량반응곡선을 위한 EC50으로서 측정되고, 바람직하게 BHK467-12A(tk-ts13)와 같은 안정한 형질주입된 세포주를 사용하여, 및/또는 cAMP의 측정을 위한 기능적 수용체 분석법을 사용하여, 예를 들어 내인성으로 형성된 cAMP 및 외인성으로 첨가된 비오틴-라벨된 cAMP 사이의 경쟁에 기초한, cAMP 분석법이 더 바람직하게 특정 항체를 사용하여 포획되고, 및/또는 여기서 훨씬 더 바람직한 분석법은 AlphaScreen cAMP Assay이고, 가장 바람직하게 하나가 실시예 50에 기재된다.
197. 구체예 1 내지 196의 어느 하나의 유도체로, 비율[0.005% HSA(낮은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)에 의해 나눠진, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]이
a) 적어도 0.5, 바람직하게 적어도 1.0, 더 바람직하게 적어도 10, 훨씬 더 바람직하게 적어도 20, 또는 가장 바람직하게 적어도 30;
b) 적어도 40, 바람직하게 적어도 50, 더 바람직하게 적어도 60, 훨씬 더 바람직하게 적어도 70, 또는 가장 바람직하게 적어도 80;
c) 적어도 90, 바람직하게 적어도 100, 더 바람직하게 적어도 200, 더 바람직하게 적어도 300, 훨씬 더 바람직하게 적어도 400, 또는 가장 바람직하게 적어도 500;
d) 적어도 120, 바람직하게 적어도 140, 훨씬 더 바람직하게 적어도 160, 또는 가장 바람직하게 적어도 180;
e) 세마글루티드 비율의 적어도 20%, 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 50%, 더 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 75%, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 동등한; 또는
f) 리라글루티드 비율의 적어도 동등한, 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 2배, 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 3배, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 4배, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 5배이다.
198. 구체예 1 내지 197의 어느 하나의 유도체로, 0.005% HSA(낮은 알부민)에서 GLP-1 수용체 결합 결합 친화도(IC50)가
a) 1000.00 nM 미만, 바람직하게 600.00 nM 미만, 더 바람직하게 100.00 nM 미만, 또는 가장 바람직하게 50.00 nM 미만; 또는
b) 20.00 nM 미만, 바람직하게 10.00 nM 미만, 더 바람직하게 5.00 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게 2.00 nM 미만, 또는 가장 바람직하게 1.00 nM 미만이다.
199. 구체예 1 내지 198의 어느 하나의 유도체로, 2.0% HSA(높은 알부민)에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)가
a) 1100.00 nM 미만, 바람직하게 1000.00 nM 이하, 더 바람직하게 800.00 nM 미만, 또는 가장 바람직하게 600 nM 미만; 또는
b) 400.00 nM 미만, 바람직하게 300.00 nM 미만, 더 바람직하게 200.00 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게 100.00 nM 미만, 또는 가장 바람직하게 50.00 nM 미만이다.
200. 구체예 1 내지 199의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 수용체에 대한 결합 친화도가 수용체로부터 125I-GLP-1의 치환에 의해, 바람직하게 SPA 결합 분석법을 사용하여 측정된다.
201. 구체예 1 내지 200의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 수용체가 안정한 형질주입된 세포주, 바람직하게 햄스터 세포주, 더 바람직하게 BHK tk-ts13과 같은 새끼 햄스터 신장 세포주를 사용하여 제조된다.
202. 구체예 1 내지 201의 어느 하나의 유도체로, 여기서 IC50 값이 수용체로부터 125I-GLP-1이 50% 치환된 농도로서 측정된다.
203. 구체예 1 내지 201의 어느 하나의 유도체로, 이것이 구강 생체이용률, 바람직하게 세마글루티드의 그것보다 높은 절대 구강 생체이용률을 갖는다.
204. 구체예 203의 유도체로, 여기서 구강 생체이용률이 래트의 생체 내에서 장의 루멘으로의 직접 주입 후 혈장에서의 노출로서 측정된다.
205. 구체예 1 내지 204의 어느 하나의 유도체로, 유도체의 혈장 농도(pM)가, 래트의 빈장에서 유도체 용액을 주사한 후 30분에 측정되고, 주사된 용액(30분에서 용량-보정 노출)의 농도(μM)에 의해 나눠져, 적어도 40, 바람직하게 적어도 50, 더 바람직하게 적어도 60, 더 바람직하게 적어도 70, 훨씬 더 바람직하게 적어도 80, 또는 가장 바람직하게 적어도 100이다.
206. 구체예 1 내지 205의 어느 하나의 유도체로, 유도체의 혈장 농도(pM)가, 래트의 빈장에서 유도체 용액을 주사한 후 30분에 측정되고, 주사된 용액(30분에서 용량-보정 노출)의 농도(μM)에 의해 나눠져, 적어도 110, 바람직하게 적어도 120, 더 바람직하게 적어도 130, 더 바람직하게 적어도 140, 훨씬 더 바람직하게 적어도 150, 또는 가장 바람직하게 적어도 160이다.
207. 구체예 1 내지 206의 어느 하나의 유도체로, 유도체의 혈장 농도(pM)가, 래트의 빈장에서 유도체 용액을 주사한 후 30분에 측정되고, 주사된 용액(30분에서 용량-보정 노출)의 농도(μM)에 의해 나눠져, 적어도 180, 바람직하게 적어도 190, 더 바람직하게 적어도 200, 또는 가장 바람직하게 적어도 210이다.
208. 구체예 1 내지 207의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유도체가 55 ㎎/㎖ 소듐 카프레이트가 있는 혼합에서 1000 uM 농도에서 시험되었다.
209. 구체예 1 내지 208의 어느 하나의 유도체로, 여기서 바람직하게 약 240 g의 도착시 체중의 수컷 Sprague Dawley 래트가 사용되었다.
210. 구체예 1 내지 209의 어느 하나의 유도체로, 여기서 래트가 실험 전 약 18시간 동안 금식된다.
211. 구체예 1 내지 210의 어느 하나의 유도체로, 여기서 래트가 금식된 후 및 빈장으로의 유도체의 주사 전에 전신마취된다.
212. 구체예 1 내지 211의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체가 빈 장의 근위 부분(십이지장에서 말단 10 ㎝) 또는 중간-대장(맹장에서 근위 50 ㎝)에서 투여된다.
213. 구체예 1 내지 212의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체의 100 ㎕가 1 ㎖ 주사기가 있는 카테터를 통해 빈 루멘으로 주입되고, 이후 공기의 200 ㎕가 다른 주사기로 빈 루멘으로 밀려지고, 다른 주사기는 그 다음 카테터로의 역류를 방지하는 카테터로 연결된 채로 남긴다.
214. 구체예 1 내지 213의 어느 하나의 유도체로, 여기서 혈액 샘플(200 ㎕)이 꼬리 정맥으로부터, 0, 10, 30, 60, 120 및 240분과 같은 원하는 시간에, EDTA 튜브에 수집되고, 1000 G로 5분, 4℃에서 20분 내에 원심분리된다.
215. 구체예 1 내지 214의 어느 하나의 유도체로, 여기서 혈장(75 ㎕)이 분리되고, 즉시 냉동되고, 그리고 -20℃에서 유도체의 혈장농도를 분석할 때까지 보관된다.
216. 구체예 1 내지 215의 어느 하나의 유도체로, 여기서 LOCI(루미네센트 산소 채널링 면역분석법)가 유도체의 혈장 농도 분석을 위해 사용된다.
217. 구체예 1 내지 216의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체는 db/db 마우스의 생체 내에서 혈액 글루코오스를 낮추는데 효과적이다.
218. 구체예 1 내지 217의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체는 db/db 마우스의 생체 내에서 체중을 낮추는데 효과적이다.
219. 구체예 1 내지 218의 어느 하나의 유도체로, 여기서 db/db 마우스가 GLP-1 유도체 투여량의 적합한 범위에서 피하로 치료되고, 그리고 혈액 글루코오스 및/또는 체중은 알맞은 간격에서 측정된다.
220. 구체예 1 내지 219의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유도체의 투여량은 0.3 nmol/kg, 1.0 nmol/kg, 3.0 nmol/kg, 10 nmol/kg, 30 nmol/kg, 및 100 nmol/kg이고, 여기서 kg은 마우스 체중을 의미한다.
221. 구체예 1 내지 220의 어느 하나의 유도체로, 여기서 대조군이 부형제로 피하로 치료되고, 부형제가 바람직하게 GLP-1 유도체가 용해된 배지인, 예를 들어 조성이 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% 트윈80, pH 7.4이다.
222. 구체예 1 내지 221의 어느 하나의 유도체로, 여기서 혈액 글루코오스가 측정되고, 및/또는 마우스의 체중을, ½시간(투여 전 ½시간(t=0)), 및 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 및 96시간에서 잰다.
223. 구체예 1 내지 222의 어느 하나의 유도체로, 여기서 글루코오스 농도가 글루코오스 옥시다제법을 사용하여 측정된다.
224. 구체예 1 내지 223의 어느 하나의 유도체로, 여기서
(i) ED50(체중(BW))이 유도체의 피하 투여 24시간 후 ΔBW(예를 들어, 감소)에 최대효과의 절반을 나타내는 투여량으로서 계산되고; 및/또는
(ii) ED50(혈액 글루코오스(BG))이 유도체의 피하 투여 8시간 후 AUC(곡선 아래 영역)ΔBG(예를 들어, 감소)에 최대효과의 절반을 나타내는 투여량으로서 계산된다.
225. 구체예 1 내지 224의 어느 하나의 유도체로, 여기서 S자형 용량-반응 관계가 바람직하게 최대 반응의 명확한 정의를 갖도록 존재한다.
226. 구체예 1 내지 225의 어느 하나의 유도체로, 이것은 리라글루티드보다 더 연장된 작용의 프로파일을 갖는다.
227. 구체예 226의 유도체로, 여기서 연장은 관련 동물종의 생체 내에서 반감기를 의미하고, 동물은 db/db 마우스, 래트, 돼지 및/또는, 바람직하게, 미니돼지이고; 여기서 유도체가 i) 피하 및/또는 바람직하게, ii) 피하로 투여된다.
228. 구체예 1 내지 227의 어느 하나의 유도체로, 미니돼지에서 정맥내 투여 후 말단 반감기(T1 /2)는
a) 적어도 12시간, 바람직하게 적어도 24시간, 더 바람직하게 적어도 36시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 48시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 60시간;
b) 적어도 7시간, 바람직하게 적어도 16시간, 더 바람직하게 적어도 24시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 30시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 40시간;
c) 적어도 44시간, 바람직하게 적어도 55시간, 더 바람직하게 적어도 66시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 77시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 88시간; 또는
d) 세마글루티드 반감기의 적어도 0.2배, 바람직하게 세마글루티드 반감기의 적어도 0.4배, 더 바람직하게 세마글루티드 반감기의 적어도 0.6배, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드 반감기의 적어도 0.8배, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드 반감기와 적어도 같다.
229. 구체예 228의 유도체로, 여기서 미니돼지는 수컷 Gottingen 미니돼지이다.
230. 구체예 227 내지 229의 어느 하나의 유도체로, 여기서 미니돼지는 7 내지 14달의 연령, 및 바람직하게 체중은 16 내지 35 kg이다.
231. 구체예 227 내지 230의 어느 하나의 유도체로, 여기서 미니돼지가 개별적으로 수용되고, 바람직하게 SDS 미니돼지 사료로 1일 1 내지 2회 먹이를 먹는다.
232. 구체예 227 내지 231의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체가 적어도 2주의 적응 후, 정맥내로 투여된다.
233. 구체예 227 내지 232의 어느 하나의 유도체로, 여기서 동물을 투여 전 약 18시간 동안, 투여 후 적어도 4시간 동안 금식시키고, 그리고 전체 기간 동안 물의 접근은 자율적이다.
234. 구체예 227 내지 233의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유도체가 바람직하게 20 내지 60 nmol/㎖의 적합한 농도로, 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% 트윈80, pH 7.4에 용해된다.
235. 구체예 227 내지 234의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체의 정맥 주사가 1 내지 2 nmol/kg에 대응하는 부피로 제공된다.
236. 구체예 227 내지 235의 어느 하나의 유도체로, 이것은 미니돼지에서 인슐린 분비가 자극되는 글루코오스를 증가시킨다.
237. 구체예 236의 유도체로, 여기서 미니돼지는 수컷 Gottingen 미니돼지이다.
238. 구체예 236 내지 237의 어느 하나의 유도체로, 여기서 미니돼지는 7 내지 14달의 연령이다.
239. 구체예 236 내지 238의 어느 하나의 유도체로, 여기서 미니 돼지가 단일 우리에 수용되고, 바람직하게 SDS 미니돼지 사료로 1일 1 내지 2회 먹이를 먹는다.
240. 구체예 236 내지 239의 어느 하나의 유도체로, 여기서 단일 용량, 선택적으로 일정 기간 후 단계적으로 확대된 투여량이 정맥 내, 또는 귀 뒤 얇은 피부에서 피하로 주어진다.
241. 구체예 236 내지 240의 어느 하나의 유도체로, 여기서 동물을 투여 전 약 18시간 동안 금식시킨다.
242. 구체예 236 내지 241의 어느 하나의 유도체로, 여기서 2 내지 6개의 다른 혈장 농도 레벨에 대응하는 베이스라인 군 및 수많은 유도체 투여량이 시험되고, 여기서 베이스라인 군은 a) 부형제 처리된, 또는 b) 처리되지 않는 군이다.
243. 구체예 236 내지 242의 어느 하나의 유도체로, 여기서 혈장 농도 레벨은 3000 내지 80000 pM이다.
244. 구체예 236 내지 243의 어느 하나의 유도체로, 여기서 1 또는 2시간 글루코오스 정주부하시험(IVGTT)이 수행된다.
245. 구체예 236 내지 244의 어느 하나의 유도체로, 여기서 0.3 g/kg 글루코오스가 30초가 넘는 시간 동안 정맥 내에 주어지고, 혈액 샘플은 적합한 시간 지점에서, 예를 들어 다음의 시간 지점(t=0은 글루코오스 보러스에 대응됨): -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 분에서 취한다.
246. 구체예 236 내지 245의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체, 글루코오스, 및 인슐린의 혈장 농도가 측정된다.
247. 구체예 236 내지 246의 어느 하나의 유도체로, 여기서 유도체 농도가 t=0 분, 및 선택적으로, 시험 종료 시점(t=60 분, 또는 t=120 분)에서 측정된다.
248. 구체예 236 내지 247의 어느 하나의 유도체로, 여기서 글루코오스가 글루코오스 옥시다제법을 사용하여 분석된다.
249. 구체예 236 내지 248의 어느 하나의 유도체로, 여기서 인슐린 곡선 아래 영역(AUC인슐린)이 계산되고, 인슐린 분비의 측정으로서 사용된다.
250. 구체예 236 내지 249의 어느 하나의 유도체로, 여기서 이것의 적어도 하나의 농도를 위해, AUC인슐린은 베이스라인 AUC인슐린보다 높고, 바람직하게 이것의 적어도 110%, 더 바람직하게 이것의 적어도 120%, 훨씬 더 바람직하게 이것의 적어도 130% 또는 가장 바람직하게 이것의 적어도 140% 높다.
251. 구체예 1 내지 250의 어느 하나의 유도체로, 이것은 대조군(바람직하게 부형제-처리된, 또는 처리되지않은)에 관하여 돼지에서 감소된 섭취의 원인이고; 선택적으로 섭취(0 내지 24시간)가 부형제-처리된 대조군에 관하여 90% 이하, 바람직하게 80% 이하, 더 바람직하게 70% 이하, 훨씬 더 바람직하게 60% 이하, 또는 가장 바람직하게 50% 이하일 수 있고;
여기서 섭취(0 내지 24시간)는 유도체 또는 부형제 투여 후 처음 24시간을 의미한다.
252. 구체예 251의 유도체로, 여기서 돼지는 암컷 Landrace Yorkshire Duroc(LYD) 돼지이다.
253. 구체예 251 내지 252의 어느 하나의 유도체로, 여기서 돼지는 3 달의 연령이고, 바람직하게 30 내지 35 kg의 체중을 갖는다.
254. 구체예 251 내지 253의 어느 하나의 유도체로, 동물은 적응을 위해 1 내지 2주 동안 군에서 사육된다.
255. 구체예 251 내지 254의 어느 하나의 유도체로, 여기서 실험 기간 동안 동물이, 개별 사료섭취량을 측정하기 위해 월요일 아침 내지 금요일 오후에 개별 우리에 놓여진다.
256. 구체예 251 내지 255의 어느 하나의 유도체로, 여기서 동물이 돼지 사료(예를 들어 Svinefoder, Antonio)를 자율적으로 먹는다.
257. 구체예 251 내지 256의 어느 하나의 유도체로, 여기서 사료섭취량이, 바람직하게 Mpigwin 시스템을 사용하여 15분 마다 사료의 무게를 기록함으로써 모니터된다.
258. 구체예 251 내지 257의 어느 하나의 유도체로, 이것이 0.3, 1.0, 3.0, 10, 또는 30 nmol/kg으로 투여되고, 바람직하게 포스페이트 버퍼(50 mM 포스페이트, 0.05% 트윈80, pH 8)에 용해되고, 더 바람직하게 12, 40, 120, 400, 또는 1200 nmol/㎖ 농도이다.
259. 구체예 251 내지 258의 어느 하나의 유도체로, 여기서 포스페이트 버퍼는 부형제로서 역할을 한다.
260. 구체예 251 내지 259의 어느 하나의 유도체로, 여기서 동물이 1일 아침에, 유도체 또는 부형제(바람직하게 0.025 ㎖/kg의 투여량이 있는)의 단일 피하 투여량으로 투여되고, 사료섭취량이 투여 후 4일 동안 측정된다.
261. 구체예 1 내지 260의 어느 하나의 유도체로, [GLP-1(7 내지 37)에 대응하는 반감기 (T1 /2)로 나눈, 래트 소장 추출물의 시험관 내에서 반감기(T1 /2)]가 적어도 0.4, 바람직하게 0.5 이상, 더 바람직하게 1.0 이상, 훨씬 더 바람직하게 2.0 이상, 더 바람직하게 3.0 이상, 또는 가장 바람직하게 4.0 이상을 갖는다.
262. 구체예 1 내지 261의 어느 하나의 유도체로, 이것은 시험관 내에서 반감기(T1 /2)를 갖고, 래트 소장 추출물에서, GLP-1(7 내지 37)에 대응하는 반감기 (T1/2), 5.0 이상, 바람직하게 6.0 이상, 더 바람직하게 7.0 이상, 훨씬 더 바람직하게 8.0 이상, 더 바람직하게 9.0 이상, 또는 가장 바람직하게 10.0 이상으로 나눠진다.
263. 구체예 261 내지 262의 어느 하나의 유도체로, 여기서 래트 소장 추출물이 실시예 57에 기재된 바와 같이 제조되고, 유도체가 37℃에서 1시간 동안 배양되고, 추출물의 농도는 GLP-1(7 내지 37)의 반감기가 예를 들어 1.4 ㎍/㎖인 10 내지 20분 범위에 있도록 적정되고, 결과되는 샘플이 UPLC 및/또는 MALDI-TOF에 의해 분석되고, 및/또는 배양 및 분석은 실시예 57에 기재된 바와 같이 수행된다.
264. 구체예 1 내지 263의 어느 하나의 유도체로, 비율[GLP-1(7 내지 37)의 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1 /2)에 의해 나눠진, 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1 /2)]은 세마글루티드에 대응하는 비율의 적어도 0.5배, 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 2배, 더 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 3배, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 5배, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 7배이다.
265. 구체예 1 내지 264의 어느 하나의 유도체로, 비율[GLP-1(7 내지 37)의 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1/2)에 의해 나눠진, 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1 /2)]은 리라글루티드에 대응하는 비율의 적어도 0.1배, 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 0.4배, 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 0.8배, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 1.2배, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 1.5배이다.
266. 구체예 1 내지 265의 어느 하나의 유도체로, 이것은 적어도 4시간, 바람직하게 적어도 6시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 8시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 10시간의 정맥내 투여 후 래트의 생체 내에서 반감기(T1 /2)를 갖는다.
267. 구체예 1 내지 266의 어느 하나의 유도체로, 이것은 적어도 12시간, 바람직하게 적어도 15시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 18시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 20시간의 정맥내 투여 후 래트의 생체 내에서 반감기(T1 /2)를 갖는다.
268. 구체예 1 내지 266의 어느 하나의 유도체로, 이것은 적어도 24시간, 바람직하게 적어도 26시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 30시간의 정맥내 투여 후 래트의 생체 내에서 반감기(T1 /2)를 갖는다.
269. 구체예 266 내지 268의 어느 하나의 유도체로, 래트는 수컷 Sprague Dawley 래트로 300 내지 600 g의 체중을 갖는다.
270. 구체예 1 내지 269의 어느 하나의 유도체로, 이것은 래트의 생체 내에서 정맥 내 투여 후 반감기(T1 /2)를, 세마글루티드의 반감기와 적어도 같은, 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 2배, 더 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 3배, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 4배, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 5배를 갖는다.
271. 구체예 1 내지 270의 어느 하나의 유도체로, 이것은 실시예 17, 21, 33, 34, 35, 및 36의 화합물이 아니고; 바람직하게 Chem. 36, Chem. 40, Chem. 52, Chem. 53, Chem. 54, 및 Chem. 55가 아니다.
272. 구체예 1 내지 271의 어느 하나의 유도체로, 이것은 실시예 22, 23, 27, 및 41의 화합물이 아니고; 바람직하게 Chem. 41, Chem. 42, Chem. 46, 및 Chem. 60이 아니다.
273. 실시예 19의 유도체; 바람직하게 Chem. 38이다.
274. 실시예 10의 유도체; 바람직하게 Chem. 29이다.
275. GLP-1 유사체의 형태에서 중간 생성물이, GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해,
(A) (i)(8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii)(des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii)(des7-8, 34R, 37K); (iv)(8Aib, 9G, 34R, 37K); (v)(8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi)(31H, 34Q, 37K); (vii)(9Q, 34R, 37K); (iix)(30E, 34R, 37K); (ix)(34R, 37K, 38G); (x)(34R, 36G, 37K); 또는 (xi) (34R, 37K, 38E)의 변형을 포함하고; 여기서 유사체는 GLP-1(7 내지 37) (SEQ ID NO: 1)의
(B) (i-a)(8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii-a)(des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii-a)(des7-8, 34R, 37K); (iv-a)(8Aib, 9G, 34R, 37K); (v-a)(8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi-a)(31H, 34Q, 37K); (vii-a)(9Q, 34R, 37K); (iix-a)(30E, 34R, 37K); (ix-a)(34R, 37K, 38G); (x-a)(34R, 36G, 37K); (xi-a)(34R, 37K, 38E); (xii-a)(7lmp, 34R, 37K); (xiii-a)(8Aib, 34R, 37K); 및 (xiv-a)(34R, 37K)의 유사체로부터 선택되고;
또는 유사체의 어떤 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르를 포함한다.
276. 구체예 275의 유사체인, 여기서 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과의 비교가 필기 및 아이볼링에 의해 만들어진다.
277. 구체예 275의 유사체인, 여기서 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과의 비교가 표준 단백질 또는 펩티드 얼라인먼트 프로그램을 사용하여 만들어진다.
278. 구체예 277의 유사체인, 여기서 얼라인먼트 프로그램은 Needleman-Wunsch 얼라인먼트이다.
279. 구체예 277 내지 278의 어느 하나의 유사체인, 여기서 디폴트 스코어링 메트릭스 및 디폴트 동일성 메트릭스가 사용된다.
280. 구체예 277 내지 279의 어느 하나의 유사체인, 여기서 스코어링 메트릭스는 BLOSUM62이다.
281. 구체예 277 내지 280의 어느 하나의 유사체인, 여기서 갭에서 제 1 잔기의 페널티는 -10(마이너스 10)이다.
282. 구체예 277 내지 281의 어느 하나의 유사체인, 여기서 여기서 갭에서 추가 잔기의 페널티는 -0.5(마이너스 0.5)이다.
283. 구체예 277 내지 282의 어느 하나의 유사체인, 이것은 GLP-1 활성을 갖는다.
284. 구체예 283의 유사체인, 여기서 GLP-1 활성이 구체예 192 내지 196에 기재된 바와 같이 정의된다.
285. 중간 생성물은 Chem. 2c, Chem. 3b 및 Chem. 4b로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2c: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-PG
Chem. 3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
Chem. 4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, w는 6 내지 18 범위의 정수이고, 및 *-PG는 보호기로; 여기서 선택적으로, 있는 경우, 연장 부분의 말단 *-COOH 기도 또한 보호되고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
286. 구체예 285의 중간 생성물인, 여기서 *-CO-PG는 i) *-COOH, 또는 ii) 활성화된 에스테르이다.
287. 구체예 286의 중간 생성물로, 여기서 활성화된 에스테르는 p-니트로페놀의 에스테르; 2,4,5-트리클로로페놀; N-히드록시숙신이미드; N-히드록시설포숙신이미드; 3,4-디히드로-3-히드록시-1,2,3-벤조트리아진-4-온; 5-클로로-8-히드록시퀴놀린; N-히드록시-5-노보넨-2,3-디카르복시산이미드; 펜타플루오로페놀; p-설포테트라플루오로페놀; N- 히드록시프탈이미드; 1-히드록시벤조트리아졸; 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸; N-히드록시말레이미드; 4-히드록시-3-니트로벤젠 술폰산; 또는 본 분야에 알려진 다른 활성화된 에스테르이다.
288. 구체예 285 내지 287의 어느 하나의 중간 생성물인, 이것은 a) Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 및 b) Chem. 5b, Chem. 6a 및 Chem. 7a로부터 선택된 링커를 포함하고:
Chem. 5b:
Figure pct00050
,
Chem. 6a:
Figure pct00051
, 및/또는
Chem. 7a:
Figure pct00052
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이고; 및 PG는 보호기로; 여기서 선택적으로, 있는 경우, 연장 부분의 *-COOH기가 바람직하게 또한 본 분야에 알려진 바와 같이 보호되고, 바람직하게 비반응 에스테르로서 기능화되고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
289. 구체예 285 내지 288의 어느 하나의 중간 생성물인, 여기서 링커는 구체예 1 내지 57의 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
290. 구체예 285 내지 289의 어느 하나의 중간 생성물인, 여기서 연장 부분은 구체예 1 내지 87의 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
291. 중간 생성물은, a) Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고, 바람직하게 구성하고:
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 및 b) Chem. 5b를 포함하는 링커를 포함하고, 바람직하게 구성하고:
Chem. 5b:
Figure pct00053
,
여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수이고; 및 PG는 보호기로; 여기서 선택적으로, 어떤 경우, 연장 부분의 *-COOH기가 바람직하게 또한 본 분야에 알려진 바와 같이 보호되고, 바람직하게 비반응 에스테르로서 기능화되고; 더 바람직하게 i) 페놀의 에스테르와 같은, 선택적으로 치환된 벌크한 측쇄를 갖는 알코올의 에스테르; 또는 ii) 분지된 알킬의 에스테르, 바람직하게 낮은 알킬; 가장 바람직하게 OtBu, OBz 등으로서 보호되고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함하고, 바람직하게 구성한다.
292. 중간 생성물인, 바람직하게 구체예 285 내지 291의 어느 하나를 따르는, 다름으로부터 선택되고;
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
_
Figure pct00057
여기서, 선택적으로, 하나 이상의 *-COOH 기(들), 바람직하게 연장 부분의 말단 *-COOH 기도 또한 보호된다.
293. 구체예 1 내지 274의 어느 하나에 따르는 유도체로, 의약으로서 사용한다.
294. 구체예 1 내지 274의 어느 하나에 따르는 유도체로, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용; 및/또는 지질 파라미터 개선, β-세포 기능 개선, 및/또는 당뇨병 진행을 지연 또는 예방한다.
295. 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련된 질환의 치료 및/또는 예방를 위한 의약의 제조에서 구체예 1 내지 274의 어느 하나에 따르는 유도체의 사용; 및/또는 지질 파라미터 개선, β-세포 기능 개선, 및/또는 당뇨병 진행을 지연 또는 예방한다.
296. 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련된 질환의 치료 또는 예방법; 및/또는 구체예 1 내지 274의 어느 하나에 따른 유도체의 약학적으로 활성하는 양을 투여함으로써, 지질 파라미터 개선, β-세포 기능 개선, 및/또는 당뇨병 진행을 지연 또는 예방한다.
297. GLP-1 유사체의 유도체로, 이것은 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고;
또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
298. 구체예 297의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체는 구체예 1 내지 296의 어느 하나에 정의된 바와 같다.
299. 구체예 297 내지 298의 어느 하나의 유도체로, 여기서 연장 부분은 구체예 1 내지 296의 어느 하나에 정의된 바와 같다.
300. 구체예 297 내지 299의 어느 하나의 유도체로, 이것은 추가로 바람직하게 구체예 1 내지 296의 어느 하나에 정의된 바와 같은, 링커를 포함한다.
추가 구체적인 구체예
다음은 본 발명의 추가 구체적인 구체예이다:
1. GLP-1 유사체의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체는, GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 최대 6개의 아미노산 잔기를 갖는 K37-GLP-1(7 내지 37) 또는 이것의 유사체이고, GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)은 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 갖고, 여기서 알부민 결합 부분은 HOOC-(CH2)n-CO-, HOOC-C6H4-0-(CH2)m-CO- 및 R1-C6H4-(CH2)p-CO-로부터 선택된 연장 부분을 포함하고, 여기서 n은 8 내지 16 범위의 정수이고, m은 7 내지 17 범위의 정수이고, p는 1 내지 5 범위의 정수이고, 그리고 R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖고; 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르를 포함한다.
2. 구체예 1의 유도체로, n은 짝수이다.
3. 구체예 2의 유도체로, n은 8, 10, 12, 14, 또는 16; 바람직하게 10, 12, 또는 14이다.
4. 구체예 1의 유도체로, m은 홀수이다.
5. 구체예 4의 유도체로, m은 7, 9, 11, 13, 15, 또는 17; 바람직하게 9, 11, 또는 15; 가장 바람직하게 9이다.
6. 구체예 1의 유도체로, p는 홀수이다.
7. 구체예 6의 유도체로, p는 1, 3, 또는 5, 바람직하게 3이다.
8. 구체예 1 및 4 내지 5의 어느 하나의 유도체로, COOH 기가 메타- 또는 파라-위치, 바람직하게 파라-위치에 있다.
9. 구체예 1 내지 8의 어느 하나의 유도체로, R1은 130 Da보다 높지 않은 몰질량, 바람직하게 100 Da보다 높지 않은, 더 바람직하게 75 Da보다 높지 않은, 훨씬 더 바람직하게 60 Da보다 높지 않은, 또는 가장 바람직하게 50 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는다.
10. 구체예 1 내지 9의 어느 하나의 유도체로, R1은 40 Da보다 높지 않은 몰질량, 바람직하게 30 Da보다 높지 않은, 더 바람직하게 20 Da보다 높지 않은, 또는 가장 바람직하게 15 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는다.
11. 구체예 1 내지 10의 어느 하나의 유도체로, 여기서 R1이 할로겐, 및 1 내지 5개의 C-원자를 갖는 직쇄 또는 분지된 알킬로부터 선택된다.
12. 구체예 1 및 6 내지 7의 어느 하나의 유도체로, R1은 메틸 또는 tert-부틸이다.
13. 구체예 12의 유도체로, R1은 파라-위치에 있다.
14. 구체예 1 및 6 내지 7의 어느 하나의 유도체로, R1은 -I이다.
15. 구체예 14의 유도체로, R1은 파라-위치에 있다.
16. 구체예 1 내지 15의 어느 하나의 유도체로, GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 최대 5개, 바람직하게 최대 4개, 더 바람직하게 최대 3개, 또는 가장 바람직하게 최대 2개의 아미노산 변화를 갖는다.
17. 구체예 1 내지 16의 어느 하나의 유도체로, GLP-1 유사체는 C-말단 아미드를 갖는다.
18. 구체예 1 내지 16의 어느 하나의 유도체로, GLP-1 유사체는 C-말단 -COOH 기, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염을 갖는다.
19. 구체예 1 내지 18의 어느 하나의 유도체로, GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 적어도 하나의 제거를 포함한다.
20. 구체예 1 내지 19의 어느 하나의 유도체로, 하나 또는 2개의 아미노산은, 유사체는 des7, des8, 또는 (des7+des8); 더 바람직하게 des7, 또는 (des7+des8)를 포함하도록, N-말단에서 제거되었다.
21. 구체예 1 내지 20의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 최대 6개의 변화된 아미노산 잔기를 갖는 GLP-1(8 내지 37) 또는 GLP-1(9 내지 37)의 유사체이다.
22. 구체예 1 내지 21의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체는 (i) K37-GLP-1(7 내지 37), (ii) K37-GLP-1(8 내지 37), (iii) K37-GLP-1(9 내지 37), 또는 (iv) GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, 최대 6개의 아미노산 잔기 변화가 있는 (i) 내지 (iii)의 어느 하나의 유사체로부터 선택된다.
23. 구체예 20 내지 21 또는 22(ii) 내지 (iv)의 어느 하나의 유도체로, 여기서 His-모방 또는 His-Ala-모방이 새로운 N-말단 아미노산에 추가되었다.
24. 구체예 20 내지 23의 어느 하나의 유도체로, 여기서 자유 카르복시산기를 갖는 이미다졸의 유도체가 N-말단으로, 바람직하게 자유 카르복시산기 및 N-말단 아미노기 사이에서의 아미드 결합의 형성에 의해 공유 커플링되었다.
25. 구체예 24의 유도체로, 여기서 이미다졸 유도체는 단일 치환된 이미다졸이다.
26. 구체예 25의 유도체로, 여기서 이미다졸이 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 낮은 알킬의 카르복시산 라디칼로 치환된다.
27. 구체예 26의 유도체로, 여기서 카르복시산 라디칼이 아세틸; 및 곧은 또는 분지된 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일; 바람직하게 아세틸로부터 선택된다.
28. 구체예 1 내지 27의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체의 위치 8의 아미노산 잔기는 그것의 N-원자가 부착된 3H-이미다졸-4-일-아세틸을 갖는다.
29. 구체예 1 내지 28의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체의 위치 8의 아미노산 잔기는 알라닌이다.
30. 구체예 25의 유도체로, 여기서 이미다졸이 (메틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, (에틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, (프로필카바모일)-2-메틸-프로피오닐, 또는 (부틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐로 치환된다.
31. 구체예 30의 유도체로, 여기서 이미다졸이 (메틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, (에틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐, 또는 (프로필카바모일)-2-메틸-프로피오닐, 바람직하게 (에틸카바모일)-2-메틸-프로피오닐로 치환된다.
32. 구체예 1 내지 31의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체의 위치 9의 아미노산 잔기는 그것의 N-원자가 {2-[2-(1H-이미다졸-4-일)-에틸카바모일]-2-메틸-프로피오닐}을 갖는다.
33. 구체예 1 내지 32의 어느 하나의 유도체로, 여기서 GLP-1 유사체의 위치 9의 아미노산 잔기는 글루탐산이다.
34. 구체예 1 내지 33의 어느 하나의 유도체는, 37K에 더하여, 8Aib; 31H; 34E,Q,R; 및/또는 38E의 치환을 적어도 하나 포함한다.
35. 구체예 34의 유도체는, 8Aib를 포함한다.
36. 구체예 34의 유도체는, 34E, 34Q, 또는 34R; 바람직하게 34R을 포함한다.
37. 구체예 35의 유도체는, 34R을 추가로 포함한다.
38. 구체예 34의 유도체는, 31H를 포함한다.
39. 구체예 35의 유도체는, 31H 및/또는 34Q, 바람직하게 모두를 추가로 포함한다.
40. 구체예 34의 유도체는, 34R을 포함한다.
41. 구체예 34의 유도체는, 38E를 포함한다.
42. 구체예 37의 유도체는, 38E를 추가로 포함한다.
43. 구체예 1 내지 42의 어느 하나의 유도체로, 2개의 알부민 결합 부분은 유사한; 바람직하게 실질적으로 동일한; 또는, 가장 바람직하게, 동일하다.
44. 구체예 1 내지 43의 어느 하나의 유도체로, 2개의 연장 부분은 유사한; 바람직하게 실질적으로 동일한; 또는, 가장 바람직하게, 동일하다.
45. 구체예 1 내지 44의 어느 하나의 유도체로, 2개의 알부민 결합 부분, 및/또는 2개의 연장 부분은 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 또는 훨씬 더 바람직하게 적어도 95%, 또는 가장 바람직하게 적어도 99%의 동일성 백분율을 갖는다.
46. 구체예 45의 유도체로, 여기서 동일성 백분율이 Tanimoto 유사성 계수 및 ECFP_6 확장된 연결 지문이 있는 데이터모델링을 사용하여 측정된다.
47. 구체예 1 내지 46의 어느 하나의 유도체로, 알부민 결합 부분이, 아미드 결합에 의해, 선택적으로 링커 부분에 의해, 각각 위치 26 및 37에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 부착된다.
48. 구체예 1 내지 47의 어느 하나의 유도체로, 알부민 결합 부분은, 연장 부분 CO- 기로의 아미드 결합에 의해 부착된 한 단부, 및 각각 위치 26 및 37에서 리신 잔기 엡실론 아미노기로의 아미드 결합에 의해 부착된 다른 단부의 링커 부분을 포함한다.
49. 구체예 47 내지 48의 어느 하나의 유도체로, 링커 부분은 5 내지 30개의 C-원자, 바람직하게 5 내지 25개의 C-원자, 더 바람직하게 5 내지 20개의 C-원자, 또는 가장 바람직하게 5 내지 17개의 C-원자를 갖는다.
50. 구체예 47 내지 49의 어느 하나의 유도체로, 링커 부분은 4 내지 20개의 헤테로 원자, 바람직하게 4 내지 18개의 헤테로 원자, 더 바람직하게 4 내지 14개의 헤테로 원자, 또는 가장 바람직하게 4 내지 12개의 헤테로 원자를 갖는다.
51. 구체예 50의 유도체로, 헤테로 원자는 N- 및/또는 O-원자이다.
52. 구체예 47 내지 51의 어느 하나의 유도체로, 링커 부분이 다음으로부터 선택됨:
Figure pct00058
53. 구체예 47 내지 52의 어느 하나의 유도체로, 링커 부분은 적어도 하나의 OEG 라디칼, 및/또는 적어도 하나의 Glu (글루탐산) 라디칼을 포함한다.
54. 구체예 53의 유도체로, 링커는, 리신 잔기의 엡실론 아미노기와 아미드 결합을 바람직하게 형성하는 γ-카르복시산기, 하나의 OEG 라디칼, 또는 하나의 Glu 라디칼을 구성한다.
55. 구체예 53의 유도체로, 링커는 아미드 결합에 의해 상호연결된 라디칼인 2개의 OEG 라디칼, 또는 2개의 Glu 라디칼을 구성하고, 및 바람직하게, 2개의 Glu 라디칼의 경우, 하나의 Glu의 γ-카르복시산기는 리신 잔기의 엡실론 아미노기와 아미드 결합을 형성하고, 또는 더 바람직하게 "및", 다른 Glu의 γ-카르복시산기는 제 1 Glu의 아미노기와 아미드 결합을 형성하도록 한다.
56. 구체예 53의 유도체로, 링커는, 적어도 하나의 OEG 라디칼 및 적어도 하나의 Glu 라디칼, 바람직하게 각각 하나씩, 더 바람직하게 리신 잔기의 엡실론 아미노기와 아미드 결합을 형성하는 OEG 라디칼의 카르복시 단부, 및 라디칼의 γ-카르복시기와 아미드 결합을 형성하는 OEG 라디칼의 아미노 단부를 포함한다.
57. 구체예 56의 유도체로, 링커는 하나의 Glu 라디칼 및 2개의 OEG 라디칼을 구성하고, 바람직하게 -Glu-OEG-OEG-, -OEG-Glu-OEG-, 및 -OEG-OEG-Glu-로부터 선택되며, 여기서 극좌 라디칼의 아미노기가 각도기 부분과 아미드 결합을 형성하고, 및 극우 라디칼의 카르복시기가 리신 잔기의 엡실론 아미노기와 아미드 결합을 형성하고, 바람직하게, Glu 라디칼의 경우, 극우 단부에서, 그것의 γ-카르복시기가 아미드 결합을 위해 사용된다.
58. 구체예 1 내지 57의 어느 하나의 유도체로, 이것이 3000 pM 이하, 바람직하게 3000 pM 미만, 더 바람직하게 2500 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 2000 pM 미만, 또는 가장 바람직하게 1500 pM 미만의 효능(EC50)을 갖는다.
59. 구체예 1 내지 58의 어느 하나의 유도체로, 이것이 1000 pM 미만, 바람직하게 800 pM 미만, 더 바람직하게 600 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 400 pM 미만, 또는 가장 바람직하게 200 pM 미만의 효능(EC50)을 갖는다.
60. 구체예 1 내지 59의 어느 하나의 유도체로, 이것이 180 pM 미만, 바람직하게 160 pM 미만, 더 바람직하게 140 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 120 pM 미만, 또는 가장 바람직하게 100 pM 미만의 효능(EC50)을 갖는다.
61. 구체예 1 내지 59의 어느 하나의 유도체로, 이것이 80 pM 미만, 바람직하게 60 pM 미만, 더 바람직하게 50 pM 미만, 훨씬 더 바람직하게 40 pM 이하, 또는 가장 바람직하게 30 pM 미만의 효능(EC50)을 갖는다.
62. 구체예 58 내지 61의 어느 하나의 유도체로, 여기서 효능이 인간 GLP-1 수용체를 함유하는 배지에서 cAMP의 형성 자극으로서 측정되고, 바람직하게 BHK467-12A(tk-ts13)와 같은 안정한 형질주입된 세포주를 사용하여, 및/또는 cAMP 의 측정을 위해 바람직하게 기능적 수용체 분석을 사용하여, 예를 들어 내인성으로 형성된 cAMP 및 외인성으로 추가된 비오틴-라벨된 cAMP 사이의 경쟁에 기초하고, 여기서 더 바람직하게 분석 cAMP가 특정한 항체를 사용하여 캡쳐되고, 및/또는 훨씬 더 바람직한 분석은 AlphaScreen cAMP Assay이고, 가장 바람직하게 하나를 실시예 50에 기재했다.
63. 구체예 1 내지 62의 어느 하나의 유도체로, 효능(EC50)이 세마글루티드 효능의 10배 미만, 바람직하게 세마글루티드 효능의 8배 미만, 더 바람직하게 세마글루티드 효능의 6배 미만, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드 효능의 4배 미만, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드 효능의 2배 미만이다.
64. 구체예 1 내지 63의 어느 하나의 유도체로, 효능(EC50)이 리라글루티드 효능의 10배 미만, 바람직하게 리라글루티드 효능의 8배 미만, 더 바람직하게 리라글루티드 효능의 6배 미만, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드 효능의 4배 미만, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드 효능의 2배 미만이다.
65. 구체예 1 내지 64의 어느 하나의 유도체로, 효능(EC50)이 리라글루티드의 효능보다 미만인, 바람직하게 리라글루티드 효능의 0.8배 미만, 더 바람직하게 리라글루티드 효능의 0.6배 미만, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드 효능의 0.5배 미만, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드 효능의 0.4배 이하이다.
66. 구체예 1 내지 65의 어느 하나의 유도체로, 비율[0.005% HSA(낮은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)에 의해 나눠진, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]이 적어도 1, 바람직하게 적어도 10, 더 바람직하게 적어도 20, 훨씬 더 바람직하게 적어도 30, 또는 가장 바람직하게 적어도 40이다.
67. 구체예 1 내지 66의 어느 하나의 유도체로, 비율[0.005% HSA(낮은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)에 의해 나눠진, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]이 적어도 50, 바람직하게 적어도 60, 더 바람직하게 적어도 70, 훨씬 더 바람직하게 적어도 80, 또는 가장 바람직하게 적어도 90이다.
68. 구체예 1 내지 67의 어느 하나의 유도체로, 비율[0.005% HSA(낮은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)에 의해 나눠진, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]이 적어도 100, 바람직하게 적어도 120, 더 바람직하게 적어도 140, 더 바람직하게 적어도 160, 훨씬 더 바람직하게 적어도 180, 또는 가장 바람직하게 적어도 200이다.
69. 구체예 1 내지 68의 어느 하나의 유도체로, GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)가 수용체로부터 125I-GLP-1을 치환하는 그것의 능력에 의해 측정되고, 바람직하게 수용체가 인간 GLP-1 수용체로 형질주입된 BHK tk-ts13과 같은 안정한 세포주로부터의 막 형성에서 제공되고; 및/또는 SPA 결합 분석법을 사용하여, 바람직하게 소맥배아응집소 SPA 비드와 같은 SPA-입자를 사용하여, 결합 분석법은 가장 바람직하게 실시예 51에 기재된 바와 같이 수행된다.
70. 구체예 1 내지 69의 어느 하나의 유도체로, 비율[0.005% HSA(낮은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)에 의해 나눠진, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]이 세마글루티드 비율의 적어도 20%, 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 50%, 더 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 75%, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드 비율에 적어도 동일하다.
71. 구체예 1 내지 70의 어느 하나의 유도체로, 비율[0.005% HSA(낮은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)에 의해 나눠진, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]이 리라글루티드 비율에 적어도 동일한, 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 2배, 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 3배, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 4배, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 5배이다.
72. 구체예 1 내지 71의 어느 하나의 유도체로, 이것은 시험관 내 반감기(T1 /2)를 갖고, 래트의 작은 창가 추출물에서, 적어도 1, 바람직하게 1.0 이상, 더 바람직하게 적어도 1.2, 여전히 더 바람직하게 적어도 2.0, 훨씬 더 바람직하게 적어도 3.0, 또는 가장 바람직하게 적어도 4.0의 GLP-1(7 내지 37)에 대응하는 반감기에 의해 나눠진다.
73. 구체예 1 내지 72의 어느 하나의 유도체로, 이것은 시험관 내에서 반감기(T1 /2)를 갖고, 래트 소장 추출물에서, GLP-1(7 내지 37)에 대응하는 반감기 (T1/2), 5.0 이상, 바람직하게 6.0 이상, 더 바람직하게 7.0 이상, 훨씬 더 바람직하게 8.0 이상, 더 바람직하게 9.0 이상, 또는 가장 바람직하게 10.0 이상으로 나눠진다.
74. 구체예 72 내지 73의 어느 하나의 유도체로, 여기서 래트 소장 추출물이 실시예 57에 기재된 바와 같이 제조되고, 유도체가 37℃에서 1시간 동안 배양되고, 추출물의 농도는 GLP-1(7 내지 37)의 반감기가 예를 들어 1.4 ㎍/㎖인 10 내지 20분 범위에 있도록 적정되고, 결과되는 샘플이 UPLC 및/또는 MALDI-TOF에 의해 분석되고, 및/또는 배양 및 분석은 실시예 57에 기재된 바와 같이 수행된다.
75. 구체예 1 내지 74의 어느 하나의 유도체로, 비율[GLP-1(7 내지 37)의 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1 /2)에 의해 나눠진, 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1 /2)]은 세마글루티드에 대응하는 비율의 적어도 0.5배, 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 2배, 더 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 3배, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 5배, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드 비율의 적어도 7배이다.
76. 구체예 1 내지 75의 어느 하나의 유도체로, 비율[GLP-1(7 내지 37)의 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1 /2)에 의해 나눠진, 래트 소장 추출물에서 시험관 내의 반감기(T1 /2)]은 리라글루티드에 대응하는 비율의 적어도 0.1배, 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 0.4배, 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 0.8배, 훨씬 더 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 1.2배, 또는 가장 바람직하게 리라글루티드 비율의 적어도 1.5배이다.
77. 구체예 1 내지 76의 어느 하나의 유도체로, 적어도 4시간, 바람직하게 적어도 6시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 8시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 10시간의 정맥내 투여 후 래트의 생체 내에서 반감기(T1 /2)를 갖는다.
78. 구체예 1 내지 77의 어느 하나의 유도체로, 이것은 적어도 12시간, 바람직하게 적어도 15시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 18시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 20시간의 정맥내 투여 후 래트의 생체 내에서 반감기(T1 /2)를 갖는다.
79. 구체예 77 내지 78의 어느 하나의 유도체로, 래트는 수컷 Sprague Dawley 래트로 300 내지 600 g의 체중을 갖는다.
80. 구체예 1 내지 79의 어느 하나의 유도체로, 이것은 래트의 생체 내에서 정맥 내 투여 후 반감기(T1 /2)를, 세마글루티드의 반감기와 적어도 같은, 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 2배, 더 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 3배, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 4배, 또는 가장 바람직하게 세마글루티드의 반감기의 적어도 5배를 갖는다.
81. 구체예 1 내지 80의 어느 하나의 유도체로, 이것은 미니 돼지의 생체 내에에서 정맥내 투여 후, 적어도 12시간, 바람직하게 적어도 24시간, 더 바람직하게 적어도 36시간, 훨씬 더 바람직하게 적어도 48시간, 또는 가장 바람직하게 적어도 60시간에 반감기(T1 /2)를 갖는다.
82. 구체예 81의 유도체로, 미니 돼지는 수컷 Gottingen 미니 돼지이다.
83. 구체예 1 내지 82의 어느 하나의 유도체로, 이것은 미니 돼지의 생체 내에에서 정맥내 투여 후, 세마글루티드 반감기의 적어도 0.2배, 바람직하게 세마글루티드 반감기의 적어도 0.4배, 더 바람직하게 세마글루티드 반감기의 적어도 0.6배, 훨씬 더 바람직하게 세마글루티드 반감기의 적어도 0.8배, 또는 가장 바람직하게 적어도 세마글루티드 반감기와 동등한 반감기(T1 /2)를 갖는다.
84. GLP-1 유도체는:
(i) N ε26 -[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시} 에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00059
(ii) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00060
(iii) N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00061
(iv) N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00062
(v) N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00063
(vi) N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드:
(vii) N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드:
Figure pct00065
(iix) N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드:
Figure pct00066
(ix) N ε26 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드:
Figure pct00067
(x) N ε26 -[2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]], N ε37 -[2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드:
Figure pct00068
(xi) N ε26 -(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-카르복시- tri데카노일아미노)에톡시]에톡시}아세틸아미노)에톡시]에톡시}아세틸), N ε37 -(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-카르복시-트리데카노일아미노)에톡시]에톡시}아세틸아미노)에톡시]에톡시}아세틸)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드:
Figure pct00069
(xii) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸} [Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00070
(xiii) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(4-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(4-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00071
(xiv) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(3-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(3-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00072
(xv) N ε26 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)-에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]-부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00073
(xvi) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00074
(xvii) N ε26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]-N ε37 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00075
(iixx) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-메틸페닐)부티릴아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-메틸페닐)부티릴아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]-아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00076
(ixx) N ε26 -((S)-4-카르복시-4-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)- 데카노일아미노]부티릴아미노}부티릴), N ε37 -((S)-4-카르복시-4-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)-데카노일아미노]부티릴아미노}부티릴)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00077
(xx) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-카르복시-4-[10-(3-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-카르복시-4-[10-(3-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00078
;
(xxi) N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00079
(xxii) N 9 -{2-[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸카바모일]-2-메틸프로피오닐},N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노] 부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Arg34,Lys37]GLP-1(9 내지 37)Glu38-펩티드:
Figure pct00080
(xxiii) N 9 -{2-[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸카바모일]-2-메틸프로피오닐}-N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9 내지 37)-펩티드:
Figure pct00081
(xxiv) N ε26 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00082
(xxv) N ε26 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴],N ε37 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00083
(xxvi) N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸-페닐)-부티릴아미노]-4-카르복시-부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸-페닐)-부티릴아미노]-4-카르복시-부틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸} [Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드:
Figure pct00084
및
(xxvii) N 9 -{2-[2-(1H-이미다졸-4-일)-에틸카바모일]-2-메틸프로피오닐}-N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸페닐)부티릴아미노]-4-카르복시부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-iert-부틸페닐)부티릴아미노]-4-카르복시부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Arg34,Lys37]GLP-1(9 내지 37)-펩티드:
Figure pct00085
또는 (i) 내지 (xxvii)의 어떤 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르로부터 선택된다.
85. 구체예 1 내지 84의 어느 하나에 따른 유도체로, 의약으로서 사용한다.
86. 구체예 1 내지 84의 어느 하나에 따른 유도체로, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용; 및/또는 지질 파라미터 개선, β-세포 기능 개선, 및/또는 당뇨병 진행을 지연 또는 예방한다.
87. 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련된 질환의 치료 및/또는 예방를 위한 의약의 제조에서 구체예 1 내지 84의 어느 하나에 따르는 유도체의 사용; 및/또는 지질 파라미터 개선, β-세포 기능 개선, 및/또는 당뇨병 진행을 지연 또는 예방한다.
88. 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련된 질환의 치료 또는 예방법; 및/또는 구체예 1 내지 84의 어느 하나에 따른 유도체의 약학적으로 활성하는 양을 투여함으로써, 지질 파라미터 개선, β-세포 기능 개선, 및/또는 당뇨병 진행을 지연 또는 예방한다.
실시예
이 실험 부분은 약어의 목록으로 시작하고, 본 발명의 유사체 및 유도체의 합성화 및 특징화를 위한 일반적인 방법을 포함하는 섹션이 이어진다. 그 다음 특정 GLP-1 유도체의 제조와 관련한 수많은 실시예가 이어지고, 마지막에 수많은 실시예가 이들 유사체 및 유도체의 활성 및 성질(약리학적 방법 섹션)과 관련하여 포함했다.
실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공한다.
약자
다음 약자는 알파벳 순서로, 다음에서 사용됨:
Aib: 아미노이소부티르산(a-아미노이소부티르산)
API: 활성 약학적 재료
AUC: 곡선 아래 영역
BG: 혈액 글루코오스
BHK: 새끼 햄스터 신장
BW: 체중
Bom: 벤질옥시메틸
Boc: t-부틸옥시카보닐
BSA: 소혈청 알부민
Bzl: 벤질
Clt: 2-클로로트리틸
collidine: 2,4,6-트리메틸피리딘
DCM: 디클로로메탄
Dde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸
DIC: 디이소프로필카르보디이미드
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DMEM: Dulbecco의 변형된 Eagle의 배지(DMEM)
EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산
EGTA: 에틸렌 글리콜 테트라아세트산
FCS: 신생우아혈청
Fmoc: 9-플루오랜일메틸옥시카보닐
HATU: (0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트)
HBTU: (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트)
HEPES: 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산
HFIP 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 또는 헥사플루오로이소프로판올
HOAt: 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
HSA: 인간 혈청 알부민
IBMX: 3-이소부틸-1-메틸크산틴
Imp: 이미다조프로피온산(des-아미노 히스티딘, DesH으로도 언급됨)
i.v.: 정맥 내로
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸
IVGTT: 글루코오스 정주부하시험
LCMS: 액체 크로마토그래피 질량분석기
LYD: Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS: MALDI-TOF MS 참조
MALDI-TOF MS: 매트릭스보조레이져탈착/이온화비행시간 질량분석기
MeOH: 메탄올
Mmt: 4-메톡시트리틸
Mtt: 4-메틸트리틸
NMP: N-메틸 피롤리돈
OBz: 벤조일 에스테르
OEG: 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산
OPfp: 펜타플루오로페녹시
OPnp: 파라-니트로페녹시
OSu: O-숙신이미딜 에스테르(히드록시숙신이미드 에스테르)
OSuc: 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일
OtBu: tert 부틸 에스테르
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐
PBS: 인산완충식염수
PD: 약력학
Pen/Strep: 페니실린/스트렙토마이신
PK: 약동학적
RP: 역상
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
RT: 실온
Rt: 체류시간
s.c: 피하로
SD: 표준편차
SEC-HPLC: 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피
SEM: 평균의 표준 오차
SPA: 섬광근접측정법
SPPS: 고체상 펩티드 합성
tBu: tert. 부틸
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS: 트리이소프로필실란
TLC: 박층크로마토그래피
Tos: 토실레이트(또는 파라-톨루엔술포닐)
Tris: 트리스히드록시메틸)아미노메탄 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올
Trt: 트리페닐메틸 또는 트리틸
Trx: 트라넥삼산
UPLC: 초고성능 액체 크로마토그래피
제조법
A. 일반적인 방법
이 섹션은 고체상 펩티드 합성법(SPPS 방법, 아미노산의 탈-보호 방법, 수지로부터 펩티드의 절단 방법, 및 그것의 정제법을 포함), 그뿐만 아니라 결과되는 펩티드의 검출 및 특징화를 위한 방법(LCMS, MALDI, 및 UPLC 방법)과 관련된다. 일부 경우 펩티드의 고체상 합성이 2- Fmoc-옥시-4-메톡시벤질, 또는 2,4,6-트리메톡시벤질과 같은, 그러나 제한되지 않는, 산성 조건에서 절단될 수 있는 기로 디-펩티드 아미드 결합에서 보호되는 디-펩티드의 사용에 의해 개선될 수 있다. 세린 또는 트레오닌이 펩티드에 존재할 경우, 슈도프롤린 디-펩티드가 사용될 수 있다(예를 들어, Novabiochem, 또는 W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403으로부터 이용가능함). 사용된 보호된 아미노산 유도체는 표준 Fmoc-아미노산(예를 들어 Anaspec, IRIS, 또는 Novabiochem으로부터 공급됨)이다. N-말단 아미노산은 알파 아미노기에서 Boc 보호했다(예를 들어, N-말단에 His를 갖는 펩티드에 대해 Boc-His(Boc)OH 또는 Boc-His(Trt)OH). 서열에서 리신의 엡실론 아미노기가 Mtt, Mmt, Dde, ivDde, 또는 Boc 중 하나에 의해 보호되었고, 알부민 결합 부분 및 스페이서의 경로에 따른다. 알부민 결합 부분 및/또는 링커가 수지 결합 펩티드의 아실화 또는 비보호된 펩티드의 용액에서의 아실화에 의해 펩티드에 부착될 수 있다. 보호된 펩티딜 수지로의 알부민 결합 부분 및/또는 링커의 부착인 경우, 부착은, Fmoc-Oeg-OH(Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산), Fmoc-Trx-OH(Fmoc-트라넥삼산), Fmoc-Glu-OtBu, 옥타데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르, 노나데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르, 또는 4-(9-카르복시논일옥시) 벤조산 tert-부틸 에스테르와 같은, 그러나 제한되지 않는, SPPS 및 적합하게 보호된 빌딩 블록을 사용하여 조정될 수 있다.
1. 수지 결합 펩티드의 합성
SPPS 방법 A
SPPS 방법 A은, NMP에 HBTU 또는 HATU 매개 커플링, 및 Fmoc 보호기 탈-보호의 UV 모니터링을 사용하는 제조사의 FastMoc UV 프로토콜을 사용하여 0.25 mmol 또는 1.0 mmol 규모에서 Applied Biosystems 433 펩티드 합성기(또한 지정된 ABI433A 합성기) 상에 Fmoc 화학을 사용한 보호된 펩티딜 수지의 합성을 의미한다.
펩티드 아미드의 합성을 위해 사용된 시작 수지는 적합한 Rink-Amid 수지(펩티드 아미드인 경우), 또는 (카르복시 C-말단을 갖는 펩티드인 경우) 적합한 Wang 수지 또는 적합한 클로로트리틸 수지 중 하나였다. 적합한 수지는 예를 들어, Novabiochem로부터 상업적으로 이용가능하다.
SPPS 방법 B
SPPS 방법 B는 마이크로파-기반 Liberty 펩티드 합성기(CEM Corp., North Carolina) 상에 Fmoc 화학을 사용한 보호된 펩티딜 수지의 합성을 의미한다. 적합한 수지는 Novabiochem로부터 이용가능한 미리 로딩된, 낮은로딩 Wang 수지(예를 들어 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지, 0.35 mmol/g)이다. Fmoc-탈보호는 5% 피페리딘을 갖는 NMP에서 최대 70 또는 75℃에서 있었다. 커플링 화학은 NMP에서의 DIC/HOAt이었다. 아미노산/HOAt 용액(3 내지 10배의 몰 과잉에서의 NMP에서 0.3 M)을 수지에 첨가하고, DIC의 동일한 몰 당량(NMP에서 0.75M)을 첨가했다. 예를 들어, 0.3M 아미노산/HOAt 용액의 다음 양을 규모/㎖, 0.10 mmol/2.5 ㎖, 0.25 mmol/5 ㎖, 1 mmol/15 ㎖의 규모 반응을 위해 커플링마다 사용했다. 커플링 시간 및 온도는 일반적으로 최대 70 또는 75℃에서 5분이었다. 더 긴 커플링 시간 예를 들어 10 분을 더 큰 규모 반응에 사용했다. 히스티딘 아미노산을 50℃에서 이중 커플링하였고, 또는 이전 아미노산이 입체적 장애를 받은 경우 4중 커플링하였다(예를 들어 Aib). 아르지닌 아미노산을 실온에서 25분 동안 커플링하였고, 그 다음 70 또는 75℃에서 5분 동안 가열했다. Aib와 같은, 그러나 제한되지 않는, 일부 아미노산을 "이중 커플링하였다", 의미는 제 1커플링(예를 들어 75℃에서 5분) 후, 수지를 건져내고, 시약(아미노산, HOAt 및 DIC)을 더 추가하고, 그리고 혼합물을 다시 가열한다(예를 들어 75℃에서 5분)는 것이다. 리신 측쇄의 화학 변형을 원하는 경우, 리신을 Lys(Mtt)로서 포함했다. Mtt기를 DCM를 갖는 수지로 세척하고, 수지를 순한(희석되지 않은) 헥사플루오로이소프로판올에 20분 동안 부유시킴으로써 제거하고, DCM 및 NMP로 세척했다. 리신의 화학 변형이 수동 합성(SPPS 방법 D 참조) 또는 위에 기재된 바와 같이 Liberty 펩티드 합성기 상의 하나 이상의 자동화 단계에 의해 수행되었고, 적합하게 보호된 빌딩 블록(일반적인 방법 참조)을 사용했고, 선택적으로 수동 커플링을 포함했다.
SPPS 방법 D
SPPS 방법 D는 수동 Fmoc 화학을 이용하는 보호된 펩티딜 수지의 합성을 의미한다. 이것은 펩티드 백본으로 링커 및 측쇄를 부착하는데 전형적으로 사용되었다. 다음 조건을 0.25 mmol 합성 규모에 사용했다. 커플링 화학은 4-10 배 몰 과잉에서 NMP에서의 DIC/HOAt/콜리딘이었다. 커플링 조건은 실온에서 1 내지 6시간이었다. Fmoc-탈보호를 NMP(3 × 20 ㎖, 각 10분)에서 20 내지 25% 피페리딘으로 수행하고, NMP 세척(4 × 20 ㎖)했다. Dde- 또는 ivDde-탈보호를 NMP(2 × 20 ㎖, 각 10분)에서 2% 히드라진으로 수행하고, NMP 세척(4 × 20 ㎖)했다. Mtt- 또는 Mmt-탈보호를 DCM(5 × 20 ㎖, 각 10분)에서 2% TFA 및 2 내지 3% TIS로, DCM(2 × 20 ㎖)에서 DCM(2 × 20 ㎖), 10% MeOH 및 5% DIPEA, 및 NMP(4 × 20 ㎖) 세척, 또는 순한 헥사플루로이소프로판올(5 × 20 ㎖, 각 10분)로 처리하고, 상기 세척함으로써 수행했다. 알부민 결합 부분 및/또는 링커를 펩티드로 수지 결합 펩티드의 아실화 또는 비보호된 펩티드 용액에서의 아실화에 의해 부착할 수 있다(아래 기재된 경로 참조). 보호된 펩티딜 수지로의 알부민 결합 부분 및/또는 링커의 부착인 경우 부착을 SPPS 및 적합하게 보호된 빌딩 블록을 사용하여 조정할 수 있다(일반적인 방법 참조).
수지 결합 펩티드로의 부착 - 경로 I : 옥타데칸디오산 모노-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르(EP511600, Ebashi 등, 수지 결합 펩티드에 대해 4몰 당량)와 같은 활성화된(활성 에스테르 또는 대칭형 무수물) 알부민 결합 부분 또는 링커를 NMP (25 ㎖)에 용해하고, 수지에 첨가하고, 그리고 실온에서 밤새도록 교반했다. 반응 혼합물을 여과하고, 수지를 NMP, DCM, 2-프로판올, 메탄올 및 디에틸에테르로 광범위하게 세척했다.
수지 결합 펩티드로의 부착 - 경로 II : 알부민 결합 부분을 NMP/DCM(1:1, 10 ㎖)에 용해했다. HOBt(수지에 대해 4몰 당량) 및 DIC(수지에 대해 4몰 당량)와 같은 활성화 시약을 첨가하고, 용액을 15분 동안 교반했다. 용액을 수지에 첨가하고, DIPEA(수지에 대해 4몰 당량)를 첨가했다. 수지를 실온에서 2 내지 24시간동안 교반했다. 수지를 NMP(2 × 20 ㎖), NMP/DCM(1:1, 2 × 20 ㎖) 및 DCM(2 × 20 ㎖)으로 세척했다.
수지 결합 펩티드로의 부착 - 경로 III : 옥타데칸디오산 모노-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르(EP511600, Ebashi 등) 펩티드에 대해 1 내지 1.5몰 당량과 같은 활성화된(활성 에스테르 또는 대칭형 무수물) 알부민 결합 부분 또는 링커 아세토니트릴, THF, DMF, DMSO와 같은 유기 용매 물/유기 용매 혼합물(1 내지 2 ㎖)에 용해하고, 10몰 EQ DIPEA와 함께 있는 물(10 내지 20 ㎖)에서의 펩티드 용액에 첨가했다. tert-부틸과 같은 알부민 결합 잔기의 보호기인 경우, 반응 혼합물을 밤새도록 동결건조하고, 그 후 분리된 조 펩티드를 탈보호했다. tert-부틸 보호기인 경우, 탈보호를, 펩티드를 트리플루오로아세트산, 물 및 트리이소프로필실란(90:5:5)의 혼합물에 용해하여 수행했다. 30분 후 혼합물을 진공에서 증발시키고, 조 펩티드를 후에 기재된 바와 같이 예비 HPLC로 정제했다.
SPPS 방법 E
SPPS 방법 E는 Protein Technologies(Tucson, AZ 85714 U.S.A.)로부터 Prelude Solid Phase Peptide Synthesiser 상의 Fmoc 화학에 의한 펩티드 합성을 의미한다. 적합한 수지는 Novabiochem(예를 들어 낮은 로딩 fmoc- Lys(Mtt)-Wang 수지, 0.35 mmol/g)으로부터 이용가능한 미리 로딩된, 낮은 로딩 Wang 수지이다. Fmoc-탈보호는 NMP에서 2 × 10분 동안 25% 피페리딘으로 했다. 커플링 화학은 NMP에서 DIC/HOAt/콜리딘이었다. 아미노산/HOAt 용액(3 내지 10배의 몰 과잉에서의 NMP에서 0.3 M)을 수지에 첨가하고, DIC(NMP에서 3 M) 및 콜리딘(NMP에서 3 M)의 동일한 몰 당량을 첨가했다. 예를 들어, 0.3M 아미노산/HOAt 용액의 다음의 양을 규모/㎖, 0.10 mmol/2.5 ㎖, 0.25 mmol/5 ㎖, 1 mmol/15 ㎖의 규모 반응을 위해 커플링마다 사용했다. 커플링 시간은 일반적으로 60분이었다. 아르지닌, Aib 또는 히스티딘을 포함하나 제한되지 않는 일부 아미노산을 "이중 커플링하였다", 의미는 제 1커플링(예를 들어 60분) 후, 수지를 건져내고, 시약(아미노산, HOAt, DIC, 및 콜리딘)을 더 추가하고, 그리고 혼합물을 다시 반응하도록 허락했다(예를 들어 60분)는 것이다. Fmoc-Oeg-OH, Fmoc-Trx-OH, Fmoc-Glu-OtBu, 옥타데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르, 노나데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르, 또는 4-(9-카르복시논일옥시) 벤조산 tert-부틸 에스테르를 포함하나 제한되지 않는 일부 아미노산 및 지방산 유도체를 긴 시간, 예를 들어 6시간 동안 커플링하였다. 리신 측쇄의 화학 변형을 원하는 경우, 리신을 Lys(Mtt)로서 포함했다. Mtt기를 DCM을 갖는 수지로 세척하고, 수지를 헥사플루오로이소프로판올/DCM(75:25)에 3 × 10분 동안 부유시킴으로써 제거하고, DCM, 20% 피페리딘 및 NMP로 세척했다. 리신의 화학 변형이 수동 합성(SPPS 방법 D 참조) 또는 위에 기재된 바와 같이 Liberty 펩티드 합성기 상의 하나 이상의 자동화 단계에 의해 수행되었고, 적합하게 보호된 빌딩 블록(일반적인 방법 참조)을 사용했다.
2. 수리로부터 펩티드의 절단 및 정제
합성 후 수지를 DCM으로 세척하고, 펩티드를 TFA/TIS/물(95/2.5/2.5 또는 92.5/5/2.5)로 2 내지 3시간 처리함으로써 수지로부터 절단하고 디에틸에테르로 침전시켰다. 펩티드를 적합한 용매(예를 들어, 30% 아세트산과 같은)에 용해하고, C18 상의 표준 RP-HPLC에 의해 정제하고, 아세토니트릴/물/TFA를 사용했다. 분획들을 UPLC, MALDI 및 LCMS 방법의 조합에 의해 분석하고, 알맞은 분획들을 모아서 동결건조했다.
3. 검출 및 특징화를 위한 방법
LCMS 방법
LCMS 방법 1( LCMS1 )
Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A) 질량분석기를 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템으로부터 용출 후 샘플의 질량을 확인하도록 사용했다. 단백질 스펙트럼의 디-컨볼루션을 Agilent's 단백질 확인 소프트웨어로 계산했다.
용리액:
A: 물에서 0.1% 트리플루오로 아세트산
B: 아세토니트릴에서 0.1% 트리플루오로 아세트산
컬럼: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4.8×50 mm
구배: 15분 이상 25% 내지 95% 아세토니트릴
LCMS 방법 2( LCMS2 )
Perkin Elmer Sciex API 3000 질량분석기를 Perkin Elmer Series 200 HPLC 시스템으로부터 용출 후 샘플의 질량을 확인하도록 사용했다.
용리액:
A: 물에서 0.05% 트리플루오로 아세트산
B: 아세토니트릴에서 0.05% 트리플루오로 아세트산
컬럼: Waters Xterra MS C-18 × 3 mm 내경 5 ㎛
구배: 1.5 ㎖/분에서 7.5분 이상 5% 내지 90% 아세토니트릴
LCMS 방법 3( LCMS3 )
Waters Micromass ZQ 질량분석기를 Waters Alliance HT HPLC 시스템으로부터 용출 후 샘플의 질량을 확인하도록 사용했다
용리액:
A: 물에서 0.1% 트리플루오로 아세트산
B: 아세토니트릴에서 0.1% 트리플루오로 아세트산
컬럼: Phenomenex, Jupiter C4 50 ×4.60 mm 내경
구배: 1.0 ㎖/분에서 7.5분 이상 10% 내지 90% B
LCMS 방법 4( LCMS4 )
LCMS4를 Micromass로부터 Waters Acquity UPLC 시스템 및 LCT Premier XE 질량분석기를 구성한 장치에서 수행했다. UPLC 펌프를 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 물에서 0.1% 포름산
B: 아세토니트릴에서 0.1% 포름산
분석은 실온에서 샘플의 알맞은 부피(바람직하게 2 내지 10 ㎕)를 A 및 B의 구배로 용리되는 컬럼으로 주입함으로써 수행되었다.
UPLC 조건, 검출기 설정 및 질량분석기 설정은:
컬럼: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1.7 um, 2.1 mm × 50 mm
구배: 0.4 ㎖/분에서 4.0분(선택적으로 8.0분) 동안 5% 내지 95% 아세토니트릴 선형
검출: 214 nm (TUV (Tunable UV 검출기)로부터 유사체 아웃풋)
MS 이온화 모드: API-ES
스캔: 100-2000 amu (선택적으로 500-2000 amu), 단계 0.1 amu
UPLC 및 HPLC 방법
방법 05 B5 1
UPLC(방법 05_B5_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 0.2 M Na2S04, 0.04 M H3P04, 10% CH3CN(pH 3.5)
B: 70% CH3CN, 30% H20
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 8분 이상 60% A, 40% B 내지 30% A, 70% B
방법 05 B7 1
UPLC(방법 05_B7_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 0.2 M Na2S04, 0.04 M H3P04, 10% CH3CN(pH 3.5)
B: 70% CH3CN, 30% H20
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 8분 이상 80% A, 20% B 내지 40% A, 60% B
방법 04 A2 1
UPLC(방법 04_A2_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 90% H20, 10% CH3CN, 0.25 M 탄화수소 암모늄
B: 70% CH3CN, 30% H20
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 90% A, 10% B 내지 60% A, 40% B
방법 04 A3 1
UPLC(방법 04_A3_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 90% H20, 10% CH3CN, 0.25 M 탄화수소 암모늄
B: 70% CH3CN, 30% H20
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 75% A, 25% B 내지 45% A, 55% B
방법 04 A4 1
UPLC(방법 04_A4_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 90% H20, 10% CH3CN, 0.25 M 탄화수소 암모늄
B: 70% CH3CN, 30% H20
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 65% A, 35% B 내지 25% A, 65% B
방법 08 B2 1
UPLC(방법 08_B2_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 99.95% H20, 0.05% TFA
B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 95% A, 5% B 내지 40% A, 60% B
방법 08 B4 1
UPLC(방법 08_B4_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 99.95% H20, 0.05% TFA
B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 95% A, 5% B 내지 95% A, 5% B
방법 05 B10 1
UPLC(방법 05_B10_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 0.2 M Na2S04, 0.04 M H3P04, 10% CH3CN(pH 3.5)
B: 70% CH3CN, 30% H20
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 8분 이상 40% A, 60% B 내지 20% A, 80% B
방법 01 A4 2
UPLC(방법 01_A4_2): RP-분석을 Waters 996 다이오드어레이 검출기를 갖춘 Waters 600S 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 Symmetry300 C18, 5 um, 3.9 mm × 150 mm 컬럼, 42℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 100% H20, B: 100% CH3CN, C: H20에서 1% 트리플루오로아세트산.
다음 선형 구배를 사용함: 1.0 ㎖/분의 흐름속도에서 15분 이상 90% A, 5% B, 5% C 내지 0% A, 95% B, 5% C
방법 09 B2 1
UPLC(방법 09_B2_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 99.95% H20, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA.
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 95% A, 5% B 내지 40% A, 60% B
방법 09 B4 1
UPLC(방법 09_B4_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 99.95% H20, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA.
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 95% A, 5% B 내지 5% A, 95% B
방법 05 B8 1
UPLC(방법 05_B8_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 0.2 M Na2S04, 0.04 M H3P04, 10% CH3CN(pH 3.5); B: 70% CH3CN, 30% H20.
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 8분 이상 50% A, 50% B 내지 20% A, 80% B
방법 10 B14 1
UPLC(방법 10_B14_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18,1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 50℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 99.95% H20, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA.
다음 선형 구배를 사용함: 0.40 ㎖/분의 흐름속도에서 12분 이상 70% A,30% B 내지 40% A, 60% B
방법 04 A6 1
UPLC(방법 04_A6_1): RP-분석을 이중 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행했다. 214 nm 및 254 nm에서 UV 검출을 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼, 40℃를 사용하여 수집했다.
UPLC 시스템을 다음을 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결했음:
A: 10 mM TRIS, 15 mM 황산 암모늄 80%, H20 20%, pH 7.3; B: 80% CH3CN, 20% H20.
다음 선형 구배를 사용함: 0.35 ㎖/분의 흐름속도에서 16분 이상 95% A, 5% B 내지 10% A, 90% B
방법 01 B4 1
HPLC(방법 01_B4_1): RP-분석을 Waters 996 다이오드어레이 검출기를 갖춘 Waters 600S 시스템을 사용하여 수행했다. UV 검출을 Waters 3 mm × 150 mm 3.5um C-18 Symmetry 컬럼을 사용하여 수집했다. 컬럼을 42℃로 가열하고, 1 ㎖/분의 흐름속도에서 15분 이상, 5% 내지 95% 아세토니트릴, 90% 내지 0% 물, 및 물에서 5% 트리플루오로아세트산(1.0%)의 선형 구배로 용리시켰다.
MALDI - MS 방법
분자 무게를 매트릭스보조레이져탈착/이온화비행시간 질량분석기를 사용하여 측정했고, Microflex 또는 Autoflex(Bruker) 상에 기록했다. 알파-시아노-4-히드록시 신남산의 메트릭스를 사용했다.
NMR 방법
양자 NMR 스펙트럼을 내부 표준으로 테트라메틸실란이 있는 Brucker Avance DPX 300(300 MHz)을 사용하여 기록했다. 화학이동(δ)을 ppm으로 나타내고, 분열 패턴을 s, 단일항; d, 이중항; dd, 이중 이중항; dt, 이중 삼중항; t, 삼중항; tt, 삼중항의 삼중항; q, 사중항; quint, 오중항; sext, 육중항; m, 다중항; 및 br, 넒은;과 같이 지정한다.
B. 중간체의 합성
1. 지방이산의 모노 에스테르의 합성
톨루엔에서 Boc-무수물, DMAP, 및 t-부탄올을 갖는 C12, C14, C16 및 C18 이산의 밤샘 환류는 지배적으로 t-부틸 모노 에스테르를 준다. 반응 후, 일산, 이산 및 디에스테르의 혼합물이 얻어진다. 정제는 세척, 짧은 플러그 실리카 여과 및 결정화에 의해 수행된다.
2. 2-(1- 트리틸 -1H- 이미다졸 -4-일)- 에틸아민의 합성
Chem. 13:
Figure pct00086
무수 메탄올(400 ㎖)에, 히스타민 디히드로클로라이드(20.47 g; 0.111 mol) 및 트리에틸아민(48 ㎖; 0.345 mol)을 실온에서 10분간 교반했다. 메탄올(30 ㎖)에, 트리플루오로아세트산 에틸에스테르(14.6 ㎖; 0.122 mol)를 0℃에서 30분 이상 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하고, 그 다음 그것을 진공에서 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(450 ㎖)에 용해하고, 트리에틸아민(31 ㎖; 0.222 mol)을 첨가했다. 그 다음 염화트리틸(34.1 g; 0.122 mol)을 낱낱으로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반했다. 클로로포름(400 ㎖) 및 물(600 ㎖)을 반응 혼합물에 부었다. 수층을 분리하고 클로로포름(3 × 400 ㎖)으로 추출했다. 조합된 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 완전 건조시켰다. 용매를 제거하고, 베이지색 고체를 헥산(1000 ㎖)으로 가루로 만들었다. 현탁액을 여과하여 흰색고체의 2,2,2-트리플루오로-N-[2-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-에틸]-아세트아미드를 얻었다.
수득(률): 45.54 g(91%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 8.44(bs, 1H); 7.43(s,1H); 7.41-7.33(m, 9H); 7.19-7.10(m, 6H); 6.65(s,1H); 3.66(q, J=5.9 Hz, 2H); 2.79(t, J=5.9 Hz, 2H).
상기 아미드(45.54 g; 0.101 mmol)를 테트라히드로푸란(1000 ㎖) 및 메탄올 (1200 ㎖)에 용해했다. 물(500 ㎖) 중의 수산화나트륨(20.26 g; 0.507 mol) 용액을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 그 다음 그것을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 클로로포름(1200 ㎖) 및 물(800 ㎖) 사이로 분리했다. 수층을 클로로포름 (3 × 400 ㎖)으로 추출했다. 유기층을 조합하고 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조했다. 용매의 증발건조는 갈색 오일을 얻었고, 베이지색 고체인 제목 생성물을 얻도록 진공에서 3일 동안 건조했다.
수득(률): 32.23 g(90%).
전체 수득(률): 82%.
녹는점: 111-113℃.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.39(d, J=1.3, 1H); 7.38-7.32(m, 9H); 7.20-7.12(m, 6H); 6.61(s,1H); 3.00(t, J=6.6 Hz, 2H); 2.70(t, J=6.5 Hz, 2H); 1.93(bs, 2H).
3. 2,2-디메틸- N -[2-(1- 트리틸 -1 H - 이미다졸 -4-일)-에틸]- 말로남산의 합성
Chem. 14:
Figure pct00087
아세토니트릴(75 ㎖) 중의 Meldrum산(5.52 g, 38.3 mmol), 탄산칼륨(26.5 g, 191 mmol) 및 요오드화메틸(7.15 ㎖, 115 mmol) 혼합물을 실링 튜브에서 75℃로 7시간 동안 가열했다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 디클로로메탄(300 ㎖)으로 희석시키고, 여과하고, 그리고 여과물을 진공에서 증발건조시켰다. 에틸아세테이트(75 ㎖), 헥산(75 ㎖) 및 물(50 ㎖)을 첨가하고, 상을 분리했다. 유기층을 10% 티오황산나트륨 수용액(50 ㎖) 및 물(50 ㎖)로 세척하고; 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조시키고, 그리고 용매를 진공에서 제거하여, 흰색 고체의 2,2,5,5-테트라메틸-[1,3]디옥산-4,6-디온을 얻었다.
수득(률): 6.59 g (79%).
RF(Si02, 클로로포름/에틸아세테이트, 98:2): 0.60.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 1.76(s, 6H); 1.65(s, 6H).
2-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-에틸아민(5.00 g, 14.2 mmol) 용액을 상기 기재된 바와 같이, 톨루엔(80 ㎖) 중의 트리에틸아민(9.86 ㎖, 70.7 mmol)을 톨루엔(40 ㎖) 중의 상기 디온 화합물(3.65 g, 21.2 mmol) 용액에 75℃에서 50분 이상 적가하여 제조했다. 혼합물을 이 온도에서 추가 3시간 동안 교반하고(시작 아민이 TLC 상에 검출될 때까지), 그 다음 그것을 진공에서 증발건조시켰다. 잔류물을 클로로포름(300 ㎖)에 재용해했고, 10% 시트르산 수용액(200 ㎖)으로 세척했다. 수상을 클로로포름(2 × 60 ㎖)으로 추출하고; 클로로포름상을 조합하고, 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조하고, 그리고 용매를 진공에서 제거했다. 잔류물을 뜨거운 클로로포름(140 ㎖)으로 가루로 만들고; 헥산(70 ㎖)을 첨가하고, 그리고 현탁액을 실온에서 밤새도록 교반했다. 고체를 여과하고, 클로로포름/헥산 혼합물(1:1, 2 × 50 ㎖)로 세척하고, 그리고 제목 생성물을 얻도록 진공에서 건조했다.
수득(률): 6.73 g (88%).
녹는점: 161-162℃.
RF(Si02, 클로로포름/메탄올, 85:15): 0.40.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 12.45(bs, 1H); 7.66(t, J=5.1 Hz, 1H); 7.57-7.31(m, 9H); 7.26(s, 1H); 7.20-7.02(m, 6H); 6.66(s,1H); 3.25(m, 2H); 2.57(t, J=7.3 Hz, 2H); 1.21(s, 6H).
4. 4-(4-tert-부틸-페닐)-부티르산의 합성
Chem. 15:
Figure pct00088
염화암모늄 분말(80.0 g, 600 mmol)을 tert-부틸벤젠(40.0 g, 300 mmol) 및 숙신산무수물(26.7 g, 267 mmol) 및 1,1,2,2-테트라클로로에탄(100 ㎖)의 교반 혼합물 부분에 첨가했다. 염화암모늄을 모두 첨가한 후, 혼합물을 얼음(500 ㎖) 및 농축된 염산(100 ㎖)의 혼합물에 부었다. 유기층을 분리하고, 물(500 ㎖)로 세척하고, 그리고 용매를 증류시켰다. 고체 잔류물을 뜨거운 15% 탄산나트륨 수용액(1000 ㎖)에 용해하고, 여과하고, 냉각시키고, 그리고 산을 염산(pH=1로 산성화됨)으로 침전시켰다. 조 산을 여과하고, 공기 중에 건조시키고, 그리고 벤젠(500 ㎖)으로부터 재결정하여 무색 결정의 4-(4-tert-부틸-페닐)-4-옥소-부티르산을 얻었다.
수득(률): 36.00 g(58%).
녹는점: 117-120℃.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.93(dm, J=8.3 Hz, 2H); 7.48(dm, J=8.3 Hz, 2H); 3.30(t, J=6.6 Hz, 2H); 2.81(t, J=6.6 Hz, 2H); 1.34 (s, 9H).
상기 산(36.0 g, 154 mmol), 수산화칼륨(25.8 g, 462 mmol), 히드라진 하이드레이트(20 ㎖, 400 mmol) 및 에틸렌 글리콜(135 ㎖)의 혼합물을 3시간 동안 환류시키고, 그 다음 증기의 온도가 196 내지 198℃가 될 때까지 증류시켰다. 추가로 14시간 환류 후, 혼합물을 가볍게 냉각시키고, 그 다음 찬물(200 ㎖)에 부었다. 혼합물을 농축된 염산(pH=1까지)으로 산성화시키고, 디클로로메탄(2 × 400 ㎖)으로 추출했다. 유기 추출물을 조합하고, 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조하고, 용매를 진공에서 제거하고, 그리고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60A, 0.060-0.200 mm; 용리액: 헥산/에틸아세테이트 10:1 내지 6:1)로 정제하여, 흰색 고체의 제목 생성물을 얻었다.
수득(률): 16.25 g(48%).
녹는점: 59-60℃.
RF(Si02, 에틸아세테이트): 0.60.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.31(dm, J=8.1 Hz, 2H); 7.12(dm, J=8.1 Hz, 2H); 2.64(t, J=7.6 Hz, 2H); 2.38(t, J=7.4 Hz, 2H); 1.96(m, 2H); 1.31(s, 9H).
5. 2,2-디메틸-N-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일메틸)-말로남산의 합성
Chem. 16:
Figure pct00089
히드록실아민 염화나트륨(15.9 g, 229 mmol)을 물(400 ㎖) 중의 4(5)-이미다졸카르복스알데히드(20.0 g, 209 mmol) 및 탄산나트륨(12.1 g, 114 mmol)의 용액에 첨가하고, 결과되는 용액을 실온에서 밤새도록 교반했다. 혼합물을 100 ㎖까지 진공에서 증발시키고, 얼음 욕에 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 분리하고, 여과물을 40 ㎖까지 농축시켰다. 0℃로 냉각 후, 결정의 다른 부분을 얻었다. 고체(23 g)를 조합하고, 에탄올(약 160 ㎖)로부터 재결정하여 무색 결정의 이미다졸-4(5)-카르발데히드옥심을 얻었다.
수득(률): 15.98 g(69%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, 아세톤-d3+D20, δH): 7.78(bs,1H); 7.74(d, J=0.9 Hz,1H); 7.43(s,1H).
염화아세틸(51.0 ㎖, 718 mmol)을 아르곤에서 0℃ 메탄올(670 ㎖)에 적가했다. 30분 후, 냉각 욕을 제거하고, 상기 옥심(16.0 g, 144 mmol)을 첨가하고, 탄소(5 wt%, 6.1 g) 상의 팔라듐을 첨가했다. 혼합물을 대기압에서 17시간 동안 수소화하고, 그 다음 그것을 Celite를 통해 여과하고, 그리고 용매를 진공에서 증발시켜, 깨끗한 무색 결정의 4-(아미노메틸)-이미다졸 디히드로클로라이드를 얻었다.
수득(률): 23.92 g(98%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, D20 δH): 8.72(s, 1H); 7.60(s, 1H); 4.33(s, 2H).
메탄올(1000 ㎖)에서 상기 아민 디히드로클로라이드(18.9 g; 111 mmol) 및 트리에틸아민(93 ㎖; 667 mmol)을 실온에서 10분 동안 교반했다. 메탄올(30 ㎖) 중의 트리플루오로아세트산 에틸에스테르(13.3 ㎖; 111 mmol)를 0℃에서 40분 이상 적가했다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 그 다음 그것을 진공에서 증발건조시켰다. 잔류물을 건조한 디클로로메탄(2000 ㎖)에 용해하고, 트리에틸아민(31 ㎖; 222 mmol)을 첨가했다. 그 다음 염화트리틸(31.6 g; 113 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반했다. 클로로포름(1000 ㎖) 및 물(1000 ㎖)을 반응 혼합물에 부었다. 수층을 분리하고 클로로포름(2 × 300 ㎖)으로 추출했다. 조합된 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조시켰다. 용매를 제거하고, 베이지색 고체를 헥산(1000 ㎖)으로 가루로 만들었다. 현탁액을 여과하여, 흰색 고체인 2,2,2-트리플루오로-N-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일메틸)-아세트아미드를 얻었다.
수득(률): 46.59 g(96%).
RF(Si02, 디클로로메탄/메탄올 95:5): 0.35.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, DMSO-d 6, δH): 9.77(t, J=5.7 Hz, 1H); 7.47-7.34(m, 9H); 7.33(d, J=1.5 Hz, 1H); 7.13-7.03(m, 6H); 6.80(d, J=0.8 Hz, 1H); 4.25(d, J=5.7 Hz, 2H).
상기 아미드(46.6 g; 107 mmol)를 테트라히드로푸란(600 ㎖)및 에탄올(310 ㎖)에 용해했다. 물(85 ㎖) 중의 수산화나트륨(21.4 g; 535 mmol) 용액을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하고, 그 다음 그것을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 클로로포름(1600 ㎖) 및 물 (800 ㎖) 사이에 분리시켰다. 수층을 클로로포름(4 × 200 ㎖)으로 추출했다. 유기층을 조합하고, 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조시켰다. 용매의 진공증발은 흰색 고체의 (1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-메틸아민을 얻었다.
수득(률): 36.30 g(100%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.38(d, J=1.3, 1H); 7.36-7.30(m, 9H); 7.18-7.10(m, 6H); 6.69(m,1H); 3.77(s, 2H); 1.80(bs, 2H).
톨루엔(220 ㎖) 중의 상기 아민(10.0 g, 29.5 mmol) 및 트리에틸아민(20.5 ㎖, 147 mmol) 용액을 75℃의 톨루엔(80 ㎖) 중의 2,2,5,5-테트라메틸-[1,3]디옥산-4,6-디온(3.65 g, 21.2 mmol) 용액에 45분 이상 적가했다. 혼합물을 이 온도에서 추가 3시간 동안 교반하고(시작 아민이 TLC 상에 검출될 때까지), 그 다음 그것을 진공에서 증발건조시켰다. 잔류물을 클로로포름(500 ㎖)에 재용해하고, 10% 시트르산 수용액(300 ㎖)으로 세척했다. 수상을 클로로포름(100 ㎖)으로 추출하고; 클로로포름상을 조합하고, 물(150 ㎖)로 세척하고, 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조하고, 그리고 용매를 진공에서 제거했다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 Fluka 60, 디클로로메탄/메탄올 98:2 내지 9:1)로 정제하고, 클로로포름/헥산 혼합물로부터 결정화하여 베이지색 결정의 제목 생성물을 얻었다.
수득(률): 9.80 g(73%).
녹는점: 174-175℃.
RF(Si02, 클로로포름/메탄올, 85:15): 0.35.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 8.45(t, J=5.8 Hz, 1H); 7.53(s, 1H); 7.40-7.28(m, 9H); 7.14-7.01(m, 6H); 6.84(s, 1H); 4.39(d, J=5.8 Hz, 2H); 1.44(s, 6H).
6. 3-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-프로필 아민의 합성
Chem. 17:
Figure pct00090
테트라히드로푸란/디에틸에테르(1:1,100 ㎖) 중의 에틸3-(1-트리틸-4-이미다졸일)프로피오네이트(93.0 g,223 mmol)을 수소화알루미늄리튬(17.0 g, 446 mmol) 중의 현탁액에 1시간 동안 적가했다. 혼합물을 3시간 동안 환류시키고, 그 다음 얼음/물로 냉각하에 물(100 ㎖), 20% 수산화나트륨(100 ㎖) 및 물(100 ㎖)로 처리하고, 여과하고, 그리고 고체를 테트라히드로푸란으로 세척했다. 유기층을 무수 탄산칼륨으로 완전히 건조하고, 여과하고, 그리고 진공에서 증발시켜, 흰색 고체의 3-(1-트리틸-4-이미다졸일)프로판올을 얻었다.
수득(률): 68.0 g(82%).
녹는점: 127-129℃.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.40-7.24(m, 10H); 7.17-7.06(m, 6H); 6.55(s,1H); 3.72(t, J=5.3 Hz, 2H); 2.68(t, J=6.6 Hz, 2H); 1.86(m, 2H).
염화메탄술포닐(8 ㎖, 104 mmol)을 0℃의 디클로로메탄(400 ㎖) 및 트리에틸아민(15.5 ㎖) 중의 상기 알코올(32.0 g, 86.8 mmol)에 1시간 동안 적가했다. 혼합물을 냉각없이 추가 1시간 동안 교반하고; 그 다음 그것을 5% 탄산수소나트륨으로 세척하고, 그리고 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조시켰다. 디클로로메탄을 30℃ 진공에서 증발시키고, 잔류 기름기있는 메실레이트를 바로 다음단계에 사용하였다.
수득(률): 31.2 g (80%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.37-7.30(m, 10H); 7.16-7.09(m, 6H); 6.58(s, 1H); 4.24(t, J=6.3 Hz, 2H); 2.96(s, 3H); 2.67(m, 2H); 2.10(m, 2H).
상기 메실레이트(30.0 g, 67 mmol), 프탈이민화칼륨(18.0 g, 100 mmol), 요오드화나트륨(4.0 g, 26.7 mmol) 및 디메틸포름아미드(200 ㎖)의 혼합물을 주위 온도에서 밤새도록 교반했고, 그 다음 물(2 ℓ) 및 벤젠 (2 ℓ)으로 처리했다. 유기상을 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조시키고, 여과하고, 그리고 용매를 진공에서 증발시켜, 잔류물을 벤젠으로부터 재결정하여 흰색 고체의 1-트리틸-4-(3-프탈리미도프로필)이미다졸을 얻었다.
수득(률): 17.2 g(52%).
녹는점: 211-214℃.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.83(m, 2H); 7.72(m, 2H); 7.39-7.27(m, 10H); 7.18-7.07(m, 6H); 6.60(d, J=0.9 Hz, 1H); 3.72(t, J=7.4 Hz, 2H); 2.60(t, J=7.5 Hz, 2H); 1.99 (m, 2H).
상기 이미다졸 유도체(26.6 g, 53.5 mmol)를 60℃의 에탄올(300 ㎖) 및 테트라히드로푸란(150 ㎖)에 용해하고, 히드라진 하이드레이트(50 g, 1 mol)을 첨가하고, 그리고 용액을 6시간 동안 환류하고, 그 다음 70℃에서 밤새도록 가열했다. 고체를 여과로 제거하고, 여과물을 25% 암모니아 수용액(2.5 ℓ) 및 디클로로메탄 (2.5 ℓ)으로 처리했다. 유기층을 무수 탄산칼륨으로 완전히 건조시키고, 진공에서 증발시켜, 잔류물을 실리카겔(Fluka 60, 암모니아/메탄올로 포화된 클로로포름) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 흰색 고체의 제목 화합물을 얻었다.
수득(률): 14.2 g (72%).
녹는점: 112-113℃.
RF(Si02, 암모니아/메탄올 9:1로 포화된 클로로포름): 0.30.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH): 7.37-7.28(m,10H); 7.18-7.09(m, 6H); 6.53(d, J=1.3 Hz, 1H); 2.74(t, J=6.9 Hz, 2H); 2.59(t, J=7.4 Hz, 2H); 1.95(bs, 2H); 1.78(m, 2H).
7. 2,2-디메틸-N-[3-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-프로필]-말로남산의 합성
Chem. 18:
Figure pct00091
2-클로로염화트리틸 수지(2.3 g,3.0 mmol)를 DCM에 20분 동안 팽창시키고, 여과했다. 디메틸말론산(2 당량; 6.0 mmol; 793 mg)을 DCM:DMF 1:1(10 ㎖)에 용해하고, 수지에 첨가하고, DIPEA(6 당량; 18.0 mmol; 3.14 ㎖) 및 DCM(10 ㎖)을 첨가했다. 수지를 실온에서 밤새도록 교반했다. 수지를 여과하고, DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1), DCM, NMP 또는 DCM(각 2 × 25 ㎖)으로 세척했다. 수지를 DMF에 20분 동안 팽창시키고, 여과했다. HOAt(3 당량; 9.0 mmol; 1.23 g), DIC(3 당량; 9.0 mmol; 1.40 ㎖) 및 DMF(25 ㎖)를 첨가하고, 수지를 실온에서 90분동안 교반했다. 수지를 여과하고, 3-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-프로필 아민(1.8 당량; 5.40 mmol; 1.84 g), DIPEA(4 당량; 6.0 mmol; 2.09 ㎖), 및 DMF(10 ㎖)를 첨가했다. 수지를 2일 동안 교반했다. 수지를 여과하고, NMP(5 × 20 ㎖) 및 DCM(10 × 20 ㎖)로 세척했다. 2,2,2-트리플루오로에탄올/디클로로메탄 1:1(20 ㎖)을 수지에 첨가하고, 그것을 2시간 동안 교반했다. 수지를 2,2,2-트리플루오로에탄올/디클로로메탄 1:1(10 ㎖)로 세척하고, 조합된 여과물을 모으고, 그리고 진공에서 농축시켜, 제목 화합물을 얻었다.
수득(률): 600 mg(41%).
LCMS4: m/z=482(M+1)
UPLC(방법 02_B4_4): Rt = 8.07분
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, DMSO-d 6, δH): 7.36-7.44(9H, m), 7.07-7.12(6H, m), 6.62(1H, s), 3.02-3.09(2H, q), 2.38-2.43(2H, t), 1.61-1.69(2H, m), 1.26(6H, s).
8. 2, 2-디메틸-N-[3-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-프로필]-말로남산의 합성 2,2-디메틸-N-피리딘-2-일메틸말로남산의 합성
Chem. 19:
Figure pct00092
클로로염화트리틸 수지(2.3 g,3.0 mmol)를 DCM에 20분 동안 팽창시키고, 여과했다. 디메틸말론산(2 당량; 6.0 mmol; 793 mg)을 DCM:NMP 1:1(10 ㎖)에 용해하고, 수지에 첨가하고, DIPEA(6 당량; 18.0 mmol; 3.14 ㎖) 및 DCM(10 ㎖)을 첨가했다. 수지를 실온에서 밤새도록 교반했다. 수지를 여과하고, DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1), DCM, NMP 또는 DCM(각 2 × 25 ㎖)에 세척했다. 수지를 NMP에 20분간 팽창시키고, 여과했다. HOAt(3 당량; 9.0 mmol; 1.23 g), DIC(3 당량; 9.0 mmol; 1.40 ㎖) 및 NMP (25 ㎖)를 첨가하고, 수지를 실온에서 90분 동안 교반했다. 수지를 여과하고, 2-(아미노메틸)피리딘(2 당량; 6 mmol; 659 mg), DIPEA(4 당량; 6.0 mmol; 2.09 ㎖), 및 NMP(10 ㎖)를 첨가했다. 수지를 밤새도록 교반했다. 수지를 여과하고, NMP(5 × 20 ㎖) 및 DCM(10 × 20 ㎖)으로 세척했다. TFA/TIS/물(95:2.5:2.5; 30 ㎖)를 수지에 첨가하고, 그것을 1시간 동안 교반하고, 여과하고, 그리고 진공에서 농축시켜, 제목 화합물을 얻었다.
수득(률): 600 mg(41%).
LCMS4: m/z=223(M+1)
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=1.79분
B. 본 발명 화합물의 합성
실시예 1
N ε26 -[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 20:
Figure pct00093
제조 방법: SPPS 방법 B, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작. Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(trt)-OH를 위치 7에 사용했다. Mtt를 HFIP로 제거하고, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함) 및 4-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에 기재된 바와 같이 제조함)를 Liberty 펩티드 합성기 상에 이중 커플링 방법을 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 04_A3_1): 10.51분
LCMS4: m/z=1085.2(M+4H)+, 1447.3(M+3H)3+
실시예 2
N ε26 {2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 21:
Figure pct00094
제조 방법: SPPS 방법 B, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작.
Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(Trt)-OH를 위치 7에 사용했다. Mtt를 HFIP로 제거하고, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu, 및 4-(9-카르복시-논일옥시)- 벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에 기재된 바와 같이 제조함)를 Liberty 펩티드 합성기 상에 이중 커플링 방법을 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 04_A3_1): 7.19분
LCMS4: m/z=978.5(M+5H)5+, 1222.8(M+4H)+, 1630.1(M+3H)3+
실시예 3
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 22:
Figure pct00095
제조 방법: 펩티드를 0.35 mmol/g 로딩이 있는 Lys(Mtt)-Wang 수지 상에 합성했다. 합성을 Liberty 합성기 상에 마이크로파 조건에서 DIC/HOAt가 있는 5분 단일 커플링을 사용하여 최대 70℃에서 수행하고, 히스티딘의 경우 최대 50℃에서 20분 동안 커플링하였다. 모든 아미노산을 표준 보호기로 보호하고, 아실화된 리신의 경우(Lys26의 경우) Mtt로 보호했다. 탈보호를 50℃ NMP에서 3분 동안 5% 피페리딘으로 했다. 합성이 끝난 후, N-말단을 10 당량 Boc-카보네이트 및 10 당량 DIPEA로 30분 동안 블로킹했다. Mtt기를 순한(희석되지 않은) 헥사플루오로이소프로판올로 20분 동안 처리하여 제거하고, 측쇄를, Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, Fmoc-Glu-OBut, 및 헥사데칸2산모노-t-부틸 에스테르를 사용한 상기와 같이 동일한 프로토콜을 사용하여 Liberty 상에 단계적으로 만들었다. 펩티드를 TFA/물/TIS(95:2.5:2.5)로 2시간 동안 절단시키고, 디에틸에테르로 침전시켜 분리했다. 조 펩티드를 5 u 또는 7 u 중 하나의 C18 실리카로 충진된 20 mm × 250 mm 컬럼의 예비 HPLC에 의해 정제했다. 펩티드를 5 ㎖ 50% 아세트산으로 용해하고, H20로 20 ㎖까지 희석하고, 그 다음 40℃에서 50분 동안 10 ㎖/분으로 0.1% TFA에서 40% 내지 60% CH3CN의 구배로 용리되는 컬럼에 주입했다. 펩티드를 함유하는 분획들을 모으고, 순도를 MALDI 및 UPLC에 의해 측정했다. 정제된 펩티드를 물로 용출액을 희석한 후, 동결건조했다.
이론 분자량 4844.6을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 9.50분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 11.23분
실시예 4
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 23:
Figure pct00096
제조 방법: 실시예 3과 같음, 측쇄에서 테트라데칸2산 모노-t-부틸 에스테르를 사용한 것 제외.
이론 분자량 4788.5을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 8.74분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 9.39분
실시예 5
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 24:
Figure pct00097
제조 방법: 실시예 3과 같음, 도데칸2산 모노-t-부틸 에스테르를 측쇄에 사용한 것 제외.
이론 분자량 4732.4을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 8.19분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 8.17분
실시예 6
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드
Chem. 25:
Figure pct00098
제조 방법: 실시예 3과 같음, 사용된 수지는 0.24 mmol/g을 로딩한 Tentagel S RAM이었고, Fmoc-Lys(Mtt)를 위치 26 및 37 모두에 사용한 것 제외.
이론 분자량 4843.6을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 9.43분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 11.88분
실시예 7
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드
Chem. 26:
Figure pct00099
제조 방법: 실시예 6과 같음, 테트라데칸2산 모노-t-부틸 에스테르를 측쇄에 사용한 것 제외.
이론 분자량 4787.5을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 8.72분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 9.98분
실시예 8
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드
Chem. 27:
Figure pct00100
제조 방법: 실시예 6과 같음, 도데칸2산모노-t-부틸 에스테르를 측쇄에 사용한 것 제외.
이론 분자량 4731.4을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 8.16분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 8.83분
실시예 9
N ε26 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드
Chem. 28:
Figure pct00101
제조 방법: 실시예 7와 같음.
이론 분자량 4497.2를 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 8.85분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 10.27분
실시예 10
N ε26 -[2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]], N ε37 -[2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드
Chem. 29:
Figure pct00102
제조 방법: 실시예 7과 같음.
이론 분자량 4206.8을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 9.04분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 10.68분
실시예 11
N ε26 -(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-카르복시-트리데카노일아미노)에톡시]에톡시}아세틸아미노)에톡시]에톡시}아세틸), N ε37 -(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-카르복시-트리데카노일아미노)에톡시]에톡시}아세틸아미노)에톡시]에톡시}아세틸)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드 아미드
Chem. 30:
Figure pct00103
제조 방법: 실시예 7과 같음.
이론 분자량 4529.2을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt 9.07분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt 13.31분
실시예 12
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-요오도-페닐)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 31:
Figure pct00104
제조 방법: SPPS 방법 B, SPPS 방법 D를 사용하여 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산 (Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), 4-(4-요오도페닐)부티르산 (상업적으로 이용가능한 from Aldrich) 및 Fmoc-Glu-OtBu를 커플링하였다.
UPLC(방법 04_A4_1): Rt=8.54분
UPLC(방법 01_A4_2): Rt=10.23분
LCMS4: Rt=2.4분, m/z=971(m/5) 1213(m/44) 1617(m/3)
실시예 13
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(4-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(4-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 32:
Figure pct00105
제조 방법: SPPS 방법 B. 최종 생성물을 분석적인 UPLC 및 LC-MS에 의해 특징지어지고, 단 아세트산무수물 캡핑 단계를 Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 및 Aib8의 아미노산을 커플링한 후 수행했다는 것은 제외했다(NMP에서 1 N 아세트산 무수물로 2.5분, 65℃). 4-(15-카르복시-펜타데실옥시)벤조산 tert-부틸 에스테르를 WO 07128817의 실시예 17에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=11.272분
UPLC(방법 05_B10_1): Rt=7.319분
LCMS4: Rt=2.37분, m/z=5054.48
계산된 MW=5056.82
실시예 14
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(3-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[16-(3-카르복시페녹시)헥사데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 33:
Figure pct00106
3-히드록시-벤조산 tert -부틸 에스테르의 제조
3-히드록시벤조산(55.0 g, 400 mmol), 디-tert-부틸 디카보네이트(178 g, 820 mmol), 과염소산마그네슘(0.89 g, 4.0 mmol) 및 건조 니트로메탄(750 ㎖)의 혼합물을 40℃에서 96시간 동안 교반했다. 에틸아세테이트(800 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 5% 탄산수소나트륨 수용액(1500 ㎖)으로 세척했다. 유기 용액을 무수 황산 마그네슘으로 완전히 건조하고, 그 다음 진공에서 증발건조했다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 Fluka 60, 헥산/에틸아세테이트 8:1)에 위치시켜, 흰색 고체의 제목 화합물을 얻었다.
수득(률): 9.07 g(12%)
녹는점: 94-96℃
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, δH(dH)): 7.61-7.53(m, 2H); 7.29(t, J=8.1 Hz, 1H); 7.05(m, 1H); 6.06(bs, 1H); 1.59(s, 9H).
16- 브로모 - 헥사데칸산메틸 에스테르의 제조
16-브로모-헥사데칸산(6.0 g)을 MeOH(35 ㎖), 톨루엔(100 ㎖) 및 트리메틸오쏘포름산(20 ㎖)에 용해하고, 그 다음 Fluka로부터 앰버리스트15(1.4 g)를 첨가했다. 혼합물을 55℃에서 16시간 동안 교반했다. 혼합물을 진공에서 16시간 동안 증발건조하여, 7.7g을 얻었다. 잔류물을 MeOH(약 50 ㎖)에 부유시키고, 약 ½시간 동안 교반했다. 앰버리스트15를 DCM(30 ㎖)으로 ½시간 동안 교반 후 여과했다. 여과물을 농축하여 DCM을 제거하고, 깨끗한 용액을 냉각시키고 추가의 MeOH(약 20 ㎖, 전체 약 40 ㎖)를 첨가했다. 플라스크를 냉각시키고, 추가 결정을 침전시키고, 30분 동안 교반한 후, 결정을 여과하고 찬 MeOH로 세척했다. 흰색 결정을 감압 건조하여, 5.61 g 얻었다.
3-(15- 메톡시카보닐 - 펜타데실옥시 )-벤조산 tert -부틸 에스테르의 제조
3-히드록시-벤조산 tert-부틸 에스테르(1.79 g)를 MeCN 75 ㎖에 용해하고, 그 다음 브로모-헥사데칸산메틸 에스테르(3.22 g)를 첨가하고, K2C03(2.5 g)을 첨가했다. 반응을 80℃에서 3일 동안 교반했다. 반응 혼합물을 여과했다. 여과물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 EtOAc 100 ㎖에 용해하고, 그리고 EtOAc층을 100 ㎖ 염수로 두번 세척했다. 유기층을 MgS04로 완전히 건조하고, 여과하고, 그리고 용매를 진공에서 증발시켜 제거하여 4.165 g(98%)을 얻었다.
3-(15- 카르복시 - 펜타데실옥시 )-벤조산 tert -부틸 에스테르의 제조
3-(15-메톡시카보닐-펜타데실옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(4.165 g)를 50 ㎖ THF 및 50 ㎖ MeOH에 용해했다. 물(10 ㎖)을 첨가하고, LiOH(0.565g, 13.5 mmol)를 첨가했다. 반응을 실온에서 16시간 동안 있다. 반응 혼합물을 진공에서 증발하고, 잔류물을 EtOAC 150 ㎖ 및 물 80 ㎖에 용해하고, 20 ㎖ 1 N HCI을 첨가했다. 층을 분리하고, 유기층을 MgS04로 완전히 건조하고, 여과하고, 그리고 용매를 진공에서 증발시켜 제거하여 흰색 고체 화합물(3.91 g, 97%)을 얻었다.
제조 방법: SPPS 방법 B 및 실시예 1과 유사한 방식에서 3-(15-카르복시-펜타데실옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르를 사용함. 최종 생성물을 분석적인 UPLC 및 LC-MS로 특징지어지고, 단 아세트산무수물 캡핑 단계를 Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 및 Aib8의 아미노산을 커플링한 후 수행했다는 것은 제외했다(NMP에서 1 N 아세트산 무수물로 2.5분, 65℃).
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=11.201분
UPLC 방법 05_B10_1): Rt=8.622분
LCMS4: Rt=2.37분, m/z=1011.88(m/5); 1664.32(m/4); 5053.28
계산된 MW=5056.82
실시예 15
N ε26 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)-에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]-부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 34:
Figure pct00107
제조 방법: SPPS 방법 B, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작. Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(Trt)-OH를 위치 7에 사용했다. Mtt를 HFIP로 제거하고, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu 및 4-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에 기재된 바와 같이 제조함)를 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=8.8분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=9.6분
LCMS4: 4598.0
계산된 MW = 4598.2
실시예 16
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[12-(3-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 35:
Figure pct00108
제조 방법: SPPS 방법 B. 3-(11-카르복시-운데실옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르를 12-브로모-도데칸산을 사용한 3-(15-카르복시-펜타데실옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르를 위해 기재된 유사한 방식으로 제조했다. 최종 생성물을 분석적인 UPLC 및 LC-MS로 특징지어지고, 단 아세트산 무수물 캡핑 단계를 Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 및 Aib8의 아미노산을 커플링한 후 수행했다는 것은 제외했다(NMP에서 1 N 아세트산 무수물로 2.5분, 65℃).
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=9.449분
LCMS4: Rt=2.37분, m/z=m/z: 1011.88(m/4); 1264.32(m/3); 4942.24
계산된 MW=4944.608
실시예 17
N ε26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]-N ε37 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 36:
Figure pct00109
제조: SPPS 방법 A, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작. Fmoc- Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(trt)-OH를 위치 7에 사용했음. Mtt를 HFIP로 제거하고, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함)를 2번 커플링하고, Fmoc-Glu-OtBu 및 4-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에서 기재된 바와 같이 제조함)를 SPPS 방법 A를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 05_B5_1): Rt=4.95분(92%)
LCMS4: m/z=4011, 계산된=4011
실시예 18
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-메틸페닐)부티릴아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[4-(4-메틸페닐)부티릴아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]-아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 37:
Figure pct00110
제조: SPPS 방법 B, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), 4-(4-메틸페닐)부티르산(상업적으로 이용가능한 from ABCR) 및 Fmoc-Glu-OtBu를 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 01_B4_1): Rt=9.93분
LCMS4: Rt=2.44분, m/z=926(m/5) 1157(m/4) 1543(m/3)
실시예 19
N ε26 -((S)-4-카르복시-4-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)-데카노일아미노]부티릴아미노}부티릴), N ε37 -((S)-4-카르복시-4-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)-데카노일아미노]부티릴아미노}부티릴)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 38:
Figure pct00111
제조: SPPS 방법 B, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작. Fmoc- Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(Trt)-OH를 위치 7에 사용했다. Mtt를 HFIP로 제고하고, Fmoc-Glu-OtBu 및 4-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에서 기재된 바와 같이 제조함)를 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=8.6분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=7.9분
LCMS4: 4565.0
계산된 MW=4566.1
실시예 20
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-카르복시-4-[10-(3-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-카르복시-4-[10-(3-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 39:
Figure pct00112
3-(9- 카르복시 - 논일옥시 )벤조산 tert -부틸 에스테르의 제조
3-히드록시-벤조산 tert-부틸 에스테르(3 g)를 아세토니트릴(50 ㎖)에 용해했다. Aldrich로부터 10-브로모 데칸산 메틸 에스테르(4.1 g)를 아세토니트릴(20 ㎖)에 첨가하고 및 용기를 아세토니트릴(30 ㎖)로 세척했다. 탄산칼륨을 첨가하고, 혼합물을 질소에서 약 18시간 동안 환류시켰다. 반응을 냉각시키고, 진공에서 증발건조시켰다. 잔류물을 AcOEt(80 ㎖) 및 물(30 ㎖)에 용해하고, 추출했다. 수상을 AcOEt(30 ㎖)로 세척하고, 조합된 유기상을 물(50 ㎖), 포화 NaCl (30 ㎖)로 세척하고, MgS04로 완전히 건조하고, 여과물을 진공에서 농축시켜, 흰색 고체(5.8 g)를 얻었다. 잔류물을 DCM(15 ㎖)에 용해하고, 헵탄(약 60 ㎖)을 첨가하고, 그리고 용액을 약 30 ㎖로 농축시켰다. 30분 동안 교반 후 결정이 형성되기 시작하고, 용액을 얼음-냉각시켰다. 결정을 여과하고, 냉각된 헵탄으로 세척하고, 진공에서 건조하여, 4.13 g(71%)의 3-(9-메톡시카보닐-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르를 얻었다.
결정을 THF(30 ㎖)에 용해하고, 1 N NaOH(11 ㎖)를 첨가했다. 탁한 용액을 16시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 가장 많은 THF를 제거하도록 농축시키고, 남은 수용액을 AcOEt(50 ㎖)로 추출했다. 수용액의 pH를 약 12 ㎖ 1 N HCl로 1 내지 2로 조정하고, 수상을 AcOEt(25 ㎖)로 추출했다. 조합된 유기상을 물로 세척하고, MgS04로 완전히 건조하고, 여과하고, 농축하여, 흰색 반-결정 고체(3.97 g)를 얻었다.
LCMS2: 401(M+23), H-NMR(400 MHz, CDCl3): 7.56(d,1H), 7.50(m,1H), 7.26-7.32(m,1H), 7.05(dd,1H), 3.99(t, 2H), 2.35(t, 2H),1.75-1.82(m, 2H),1.62-1.65(m, 2H), 1.59(s, 9H), 1.42-1.47(m, 2H), 1.33(br, 8H).
제조 방법: SPPS 방법 B, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작. Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(trt)-OH를 위치 7에 사용했다. Mtt를 HFIP로 제거하고, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu, 및 3-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르를 Liberty 펩티드 합성기 상에 이중 커플링 방법을 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 04_A4_1): 10.01분
UPLC(방법 08_B4_1): 8.81분
LCMS4: m/z=978.5(M+5H)5+, 1222.8(M+4H)+, 1630.1(M+3H)3+
실시예 21
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], N ε37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 40:
Figure pct00113
제조 방법: 실시예 5와 같음.
이론 분자량 4655.2을 MALDI로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=7.72분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=5.70분
실시예 22
N9-{2-[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸카바모일]-2-메틸프로피오닐},N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노] 부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Arg34,Lys37]GLP-1(9 내지 37)Glu38-펩티드
Chem. 41:
Figure pct00114
제조: SPPS 방법 B. 2,2-디메틸-N-[2-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-에틸]-말로남산을 Aib 아미노산과 동일한 커플링 조건을 사용하여 커플링하였다. 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu , 및 4-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에서 기재된 바와 같이 제조함)를 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=9.32분
LCMS4: Rt=2.29분, m/z=1669(m/3), 1252(m/4), 1001(m/5)
실시예 23
N 9 -{2-[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸카바모일]-2-메틸프로피오닐}-N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Arg34,Lys37]GLP-1(9 내지 37)-펩티드
Chem. 42:
Figure pct00115
제조: SPPS 방법 B, 2,2-디메틸-A/-[2-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-에틸]-말로남산Aib 아미노산과 동일한 커플링 조건을 사용하여 커플링하였다. 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu 및 4-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에서 기재된 바와 같이 제조함)를 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 08_B4_1(TFA)): Rt=8.81분
LCMS4: Rt=2.29분, m/z=1625(m/3), 1219(m/4), 975(m/5)
실시예 24
N ε26 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 43:
Figure pct00116
제조: SPPS 방법 B, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작. Fmoc- Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(trt)-OH를 위치 7에 사용했다. Mtt를 HFIP로 수동으로 제거하고, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu 및 테트라데칸디옥을 Liberty 펩티드 합성기 상에 이중 커플링 방법을 사용하여 커플링하였다. 이론 분자량을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=8.6분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=9.7분
MALDI-MS: 4788
실시예 25
N ε26 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴], N ε37 -[(S)-4-카르복시-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-카르복시트리데카노일아미노)]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노}부티릴][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 44:
Figure pct00117
제조: SPPS 방법 B, 낮은 로딩 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지로 시작. Fmoc- Lys(Mtt)-OH를 위치 26에, Boc-His(trt)-OH를 위치 7에 사용했다. Mtt를 HFIP로 수동으로 제거하고, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu 및 테트라데칸디옥을 Liberty 펩티드 합성기 상에 이중 커플링 방법을 사용하여 커플링하였다. 이론 분자량을 MALDI-MS로 확인했다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=8.8분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=10분
MALDI-MS: 4787
실시예 26
N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸-페닐)-부티릴아미노]-4-카르복시-부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸-페닐)-부티릴아미노]-4-카르복시-부티릴아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7 내지 37)-펩티드
Chem. 45:
Figure pct00118
제조: SPPS 방법 B, 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함),4-(4-t-부틸페닐)부티르산 및 Fmoc-Glu- OtBu를 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=9.07분
LCMS4: Rt= 2.29분, m/z=943(m/5) 1179(m/4) 1571(m/3)
실시예 27
N 9 -{2-[2-(1H-이미다졸-4-일)-에틸카바모일]-2-메틸프로피오닐}-N ε26 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-부틸페닐)부티릴아미노]-4-카르복시부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, N ε37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-iert-부틸페닐)부티릴아미노]-4-카르복시부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}[Arg34,Lys37]GLP-1(9 내지 37)-펩티드
Chem. 46:
Figure pct00119
제조: SPPS 방법 B, 2,2-디메틸-A/-[2-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-에틸]-말로남산을 Fmoc-Aib 아미노산과 동일한 커플링 조건을 사용하여 커플링하였다. 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu 및 4-(4-t-부틸페닐)부티르산을 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 04_A4_1): Rt=10.56분
LCMS4: Rt=2.40분 m/z=940(m/5), 1174(m/4), 1565(m/3)
실시예 28
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)
데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시) 데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[lmp7,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 47:
Figure pct00120
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt: 2.22분, m/z: 4859.5; 1214.9(M+4H)4+; 1619.8(M+3H)3+
UPLC(방법: 08_B4_1): Rt=8.88분
UPLC(방법: 04_A3_1): Rt=9.28분
실시예 29
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 48:
Figure pct00121
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC(방법 05_B5_1): Rt=5.75분
UPLC(방법 08_B2_1): Rt=13.09분
LCMS4 (M/5)+1=976; (M/4)+1 = 1219; 정확한 질량=4874
실시예 30
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Gly9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 49:
Figure pct00122
제조 방법: SPPS 방법 A
UPLC(방법 09_B2_1): Rt=13.20분
UPLC(방법 05_B5_1): Rt=6.05분
LCMS4: (M/5)+1=964; (M/4)+1=1204; 정확한 질량=4816
실시예 31
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg23,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 50:
Figure pct00123
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt=2.12분, m/z: 4916.0
UPLC(방법: 08_B2_1): Rt=12.59분
UPLC(방법: 04_A3_1): Rt=10.57분
실시예 32
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 51:
Figure pct00124
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt=2.12분, m/z: 4774.4
UPLC(방법: 09_B2_1): Rt=12.87분
UPLC(방법: 04_A3_1): Rt=8.86분
실시예 33
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 52:
Figure pct00125
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt=1.92분, m/z: 4797.3; M/4: 1199.8; M/3: 1599.4
UPLC(방법: 09_B4_1): Rt=8.12분
UPLC(방법: 05_B8_1): Rt=2.03분
실시예 34
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 53:
Figure pct00126
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt=1.99분, m/z: 4697.0
UPLC(방법: 09_B2_1) Rt=12.20분
UPLC(방법: 05_B5_1): Rt=5.31분
실시예 35
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 54:
Figure pct00127
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt=1.89분, m/z: 4641.2
UPLC(방법: 09_B2_1): Rt=11.2분
UPLC(방법: 05_B5_1): Rt=4.00분
실시예 36
N ε26 -[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부탄오일], N ε37 -[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부탄오일]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 55:
Figure pct00128
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt: 1.97분, m/z: 4797.3; M/4: 1199.8; M/3: 1599.4
UPLC(방법: 09_B4_1): Rt=8.24분
UPLC(방법: 05_B8_1): Rt=2.88분
실시예 37
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Gln9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 56:
Figure pct00129
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt=1.06분, m/z: 4873.3
UPLC(방법: 09_B2_1): Rt=13.18분
UPLC(방법: 05_B5_1): Rt=6.40분
실시예 38
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu30,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 57:
Figure pct00130
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt=2.13분, m/z: 4932.7
UPLC(방법: 09_B2_1): Rt=13.39분
UPLC(방법: 04_A3_1): Rt=8.20분
실시예 39
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 58:
Figure pct00131
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt: 1.93분, m/z: 4832.4; M/4: 1208.5; M/3: 1611.0
UPLC(방법 09_B4_1): Rt=8.10분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=8.15분
UPLC(방법 05_B5_1): Rt= 5.30분
실시예 40
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 59:
Figure pct00132
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS4: Rt: 1.92분, m/z: 4818.4; M/4: 1205.0; M/3: 1606.7
UPLC(방법 09_B4_1): Rt=8.06분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=8.02분
실시예 41
N 9 -[2,2-디메틸-3-옥소-3-(피리딘-2-일메틸아미노)프로판노일], N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(9 내지 37)-펩티드
Chem. 60:
Figure pct00133
제조 방법: SSPS 방법 B. 2,2-디메틸-N-피리딘-2-일메틸-말로남산을, 이전 실시예에서 2,2-디메틸-N-[2-(1-트리틸-1H-이미다졸-4-일)-에틸]-말로남산을 위해 사용한 바와 동일한 커플링 조건을 사용하여 커플링하였다. Fmoc-Glu-OtBu 및 4-(9-카르복시-논일옥시)-벤조산 tert-부틸 에스테르(WO 2006/082204 단계 2의 실시예 25에서 기재된 바와 같이 제조함)를 SPPS 방법 D를 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=8.98분
LCMS4: Rt=2.23분 m/z=1624(m/3), 1218(m/4)
실시예 42
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티딜-Gly
Chem. 61:
Figure pct00134
제조 방법: SSPS 방법 B
LCMS4: Rt: 2.05분, m/z: 4931.5; M/4: 1233.3; M/3: 1644.4
UPLC(방법 09_B4_1): Rt=8.52분
UPLC(방법 05_B5_1): Rt=5.18분
UPLC(방법 04_A3_1): Rt=9.24분
실시예 43
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Gly36,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 62:
Figure pct00135
제조 방법: SSPS 방법 B
LCMS4: Rt: 2.18분, m/z: 4775.3; M/4: 1194.5; M/3: 1592.4
UPLC(방법: 09_B4_1): Rt=9.01분
UPLC(방법: 04_A3_1): Rt=9.60분
UPLC(방법: 05_B5_1): Rt=5.88분
실시예 44
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[9-(4-카르복시페녹시)논나노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[9-(4-카르복시페녹시)논나노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 63:
Figure pct00136
제조 방법: SSPS 방법 B
LCMS4: Rt: 2.03분, m/z: 4846.4; M/4: 1212.3; M/3: 1616.1
UPLC(방법: 09_B4_1): Rt=8.27분
UPLC(방법: 05_B5_1): Rt=5.09분
실시예 45
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[13-(5-카르복시티오펜-2-일)트리데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[13-(5-카르복시티오펜-2-일)트리데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 64:
Figure pct00137
제조 방법: SSPS 방법 B. 8-(9-플루오랜일메틸옥시카보닐-아미노)-3,6-디옥사옥탄산(Iris Biotech로부터 상업적으로 이용가능함), Fmoc-Glu-OtBu, 및 5-(12-카르복시-도데실)-티오펜-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르(WO 07128815의 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조함)를 Liberty 합성기 상에 SSPS 방법 D 방법을 사용하여 커플링하였다.
UPLC(방법 08_B4_1): Rt=9.87분
LCMS4: m/z=1651(m/3), 1239(m/4), 991(m/5)
실시예 46
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티딜-Glu
Chem. 65:
Figure pct00138
제조 방법: SPPS 방법 A
UPLC(방법 10_B14_1): Rt= 6.54분
LCMS4: (M/5)+1=1001 ; (M/4)+1=1251 ; 정확한 질량=5003.5
실시예 47
N ε26 -[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부탄오일], N ε37 -[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부탄오일]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 66:
Figure pct00139
제조 방법: SSPS 방법 B
UPLC(방법: 09_B4_1): Rt=8.76분
UPLC(방법: 04_A6_1): Rt=6.02분
LCMS4: Rt=2.12분 m/z: 4775; M/4=1194; M/5=955
실시예 48
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-카르복시-2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-카르복시-2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 67:
Figure pct00140
제조 방법: SSPS 방법 B
UPLC(방법:08_B2_1): Rt=13.193분
UPLC(방법:05_B5_1): Rt=6.685분
LCMS4: m/z: 4887; m/3: 1630; m/4: 1222; m/5:978
실시예 49
N ε26 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], N ε37 -[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[8-(4-카르복시페녹시)옥타노일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg34,Gly36,Lys37]-GLP-1-(7 내지 37)-펩티드
Chem. 68:
Figure pct00141
제조 방법: SSPS 방법 B
LCMS4: Rt: 2.07분, m/z: 4719.2; M/4: 1180.5; M/3: 1573.7
UPLC(방법: 08_B4_1): Rt=8.45분
UPLC(방법: 05_B5_1): Rt=5.19분
약리학적 방법
실시예 50: 시험관 내에서 효능
본 실시예의 목적은 시험관 내에서 GLP-1 유도체의 활성 또는 효능을 시험하는 것이다.
실시예 1 내지 49의 GLP-1 유도체 효능은 아래에 기재된 바와 같이 측정되었고, 즉 인간 GLP-1 수용체를 발현하는 막을 함유하는 배지에서 고리형 AMP(cAMP)의 형성 자극이다.
원리
인간 GLP-1 수용체를 발현하는 안정한 형질주입된 세포주, BHK467-12A(tk- ts13)로부터 정제된 혈장 막이 문제에서 GLP-1 유사체 또는 유도체로 자극되었고, cAMP 생산의 효능이 Perkin Elmer Life Sciences로부터 AlphaScreenTM cAMP Assay Kit를 사용하여 측정되었다. AlphaScreen Assay의 기본 원리는 내인성 cAMP 및 외인성으로 첨가된 biotin-cAMP 사이의 경쟁이다. cAMP의 캡쳐가 수용체 비드와 콘주게이트된 특정 항체를 사용하여 달성된다.
세포 배양 및 막의 제조
안정한 형질주입된 세포주 및 높이 발현하는 복제가 검사를 위해 선택되었다. 세포가 5% C02하의 5% FCS, 1% Pen/Strep(페니실린/스트렙토마이신) 및 0.5 mg/㎖ 선택 마커 G418의 DMEM에서 자랐다.
약 80% 융합된 세포를 PBS로 2번 세척하고, Versene(에틸렌디아민테트라아세트산의 4나트륨염 수용액)으로 수확하고, 1000 rpm에서 5분 원심분리하고, 그리고 상층액을 제거했다. 추가 단계는 모두 얼음 상에서 만들었다. 세포 펠렛을 10 ㎖ 버퍼 1(20 mM Na-HEPES,10 mM EDTA, pH=7.4)에서 Ultrathurax에 의해 20 내지 30초 동안 균일화하고, 20,000 rpm에서 15분 원심분리하고, 그리고 펠렛을 10 ㎖ 버퍼 2(20 mM Na-HEPES, 0.1 mM EDTA, pH=7.4)에서 재부유시켰다. 현탁액을 20 내지 30초 동안 균힐화하고, 20,000 rpm에서 15분 원심분리했다. 버퍼 2에서 부유화, 균일화 및 원심분리가 1번 반복되었고, 막을 버퍼 2에서 재부유시켰다. 단백질 농도는 측정되었고, 막은 사용할 때까지 -80℃에서 보관되었다.
분석은 평평한 바닥의 ½-영역 96-웰 플레이트(Costar Cat. No: 3693)에서 수행되었다. 웰 당 최종 부피는 50 ㎕였다.
용액 및 시약
Perkin Elmer Life Sciences로부터 AlphaScreen cAMP Assay Kit(Cat. No: 6760625M); Anti-cAMP 수용체 비드(10 U/㎕), 스트렙타아비딘 주게 비드(10 U/㎕) 및 비오틴화된-cAMP(133 U/㎕)를 함유.
AlphaScreen 버퍼, pH=7.4: 50 mM TRIS-HCl(Sigma, Cat. No: T3253); 5 mM HEPES(Sigma, Cat. No: H3375); 10 mM MgCl2,6H2O(Merck, Cat. No: 5833); 150 mM NaCl(Sigma, Cat. No: S9625); 0.01% 트윈(Merck, Cat. No: 822184). 다음을 사용 전에 AlphaScreen 버퍼에 첨가함(지시된 최종 농도): BSA(Sigma, Cat. No: A7906): 0.1%; IBMX(Sigma, Cat. No: I5879): 0.5 mM; ATP(Sigma, Cat. No: A7699): 1 mM; GTP(Sigma, Cat. No: G8877): 1 uM.
cAMP 표준(분석에서의 희석 요인=5): cAMP 용액: 5 mM cAMP-스톡의 5 ㎕ + AlphaScreen 버퍼의 495 ㎕.
AlphaScreen 버퍼의 적합한 희석 시리즈는 시험하도록, cAMP 표준, 그뿐만 아니라 GLP-1 유사체 또는 유도체를, 예를 들어 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 및 10-14 M의 8개 GLP-1 화합물 농도로 및 cAMP의 10-6 내지 3 × 10-11의 시리즈로 제조했다.
막/수용체 비드
hGLP-1/BHK 467-12A 막 사용; 0.6 mg/㎖에 대응하는 6 ㎕/웰(웰 당 사용되는 막의 양은 다양할 수 있음)
"비 막": AlphaScreen 버퍼에서의 수용체 비드(최종 15 ㎍/㎖)
"6 ㎍/웰 막": AlphaScreen 버퍼에서의 막 + 수용체 비드(최종 15 ㎍/㎖)
10 ㎕ "비 막"을 cAMP 표준(2번 복제물에서, 웰당) 및 양성 및 음성 대조군에 첨가
10 ㎕ "6 ㎍/웰 막"을 GLP-1 및 유사체(2번/3번 복제물에서, 웰당)에 첨가
양성 대조군: 10 ㎕ "비 막" + 10 ㎕ AlphaScreen 버퍼
음성 대조군: 10 ㎕ "비 막" + 10 ㎕ cAMP 스톡 용액(50 μM)
비드가 직사광선에 민감하기 때문에, 모든 조작은 어둠속에서(가능한 어둡게), 또는 녹색광에서 있다. 모든 희석은 얼음상에서 만들었다.
절차
1. AlphaScreen 버퍼 만들기.
2. AlphaScreen 버퍼에서 GLP-1/유사체/cAMP 표준 용해 및 희석.
3. 주게 비드 용액 만들고, 실온에서 30분 배양.
4. 플레이트에 cAMP/GLP-1/유사체 첨가: 웰 당 10 ㎕.
5. 막/수용체 비드 용액 제조하고 이것을 플레이트에 첨가: 웰 당 10 ㎕.
6. 주게 비드 첨가: 웰 당 30 ㎕.
7. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고, 실ㄹ온에서 3시간 동안 교반하며(매우 천천히) 배양.
8. AlphaScreen에서 카운팅 - 카운팅 전 각 플레이트를 AlphaScreen에서 3분 동안 미리 배양하기.
결과
EC50[pM] 값이 Graph-Pad Prism 소프트웨어(버전 5)를 사용하여 계산되었다.
시험관 내에서 모든 유도체의 효능을 확인했다. 43개의 유도체는 2000 pM 이하의 EC50에 대응하는 시험관 내 양호한 효능을 가졌고; 42개의 유도체는 1000 pM 이하의 EC50을 갖는 훨씬 더 강력했고; 35개의 유도체는 500 pM 이하의 EC50에 대응하는 추가로 개선된 효능을 가졌고; 19개의 유도체는 200 pM 이하의 EC50에 대응하는 매우 강력했고; 및 10개의 유도체는 100 pM 이하의 EC50에 대응하는 매우 양호한 효능을 가졌다.
비교를 위해, Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669(K26,34에서 비스-C12-이산으로 아실화된 GLP-1(7 내지 37))의 표1에서 화합물 13번은 1200 pM의 EC50에 대응하는 시험관 내 효능을 가졌다.
원하는 경우, GLP-1 관련한 배 변화가 EC50(GLP-1)/EC50(유사체)-3693.2로서 계산될 수 있다.
실시예 51: GLP -1 수용체 결합
본 실험의 목적은 GLP-1 유도체의 GLP-1 수용체로의 결합 및 어떻게 결합이 알부민 존재에 의해 잠재적으로 영향을 받는지를 조사하는 것이다. 이것은 아래 기재된 바와 같이 시험관 내 실험에서 수행했다.
실시예 1 내지 49의 GLP-1 유도체의 인간 GLP-1 수용체로의 결합 친화도는 그것들의 수용체로부터 125I-GLP-1의 치환 능력으로 측정되었다. 리라글루티드 및 세마글루티드를 비교 화합물로 포함시켰다. 유도체의 알부민으로의 결합을 시험하도록, 분석법이 알부민의 낮은 농도(0.005%-트레이서에서 이것의 잔류량에 대응하는)에서, 그뿐만 아니라 알부민의 높은 농도(2.0% 추가된)에서도 수행되었다. 결합 친화도(IC50)에서의 이동은, 문제에서 펩티드가 알부민과 결합하는 것을 나타내고, 따라서 가능성의 예상이 동물 모델의 문제에서 펩티드의 약동학적 프로파일로 연장되었다.
조건
종(시험관 내에서): 햄스터
생물학적 종결 지점: 수용체 결합
분석법: SPA
수용체: GLP-1 수용체
세포주: BHK tk-ts13
세포 배양 및 막 정제
안정한 형질주입된 세포주 및 높이 발현하는 복제가 검사를 위해 선택되었다. 세포가 5% C02하의 5% FCS, 1% Pen/Strep(페니실린/스트렙토마이신) 및 0.5 mg/㎖ 선택 마커 G418의 DMEM에서 자랐다.
약 80% 융합된 세포를 PBS로 2번 세척하고, Versene(에틸렌디아민테트라아세트산의 4나트륨염 수용액)으로 수확하고, 1000 rpm에서 5분 원심분리하여 분리했다. 세포/세포 펠렛이 이후 단계에서 가능한 정도로 얼음 상에서 유지되어야 한다. 세포 펠렛을 적합한 양의 버퍼 1(세포 양에 따름, 그러나 예를 들어 10 ㎖)에서 Ultrathurax에 의해 20 내지 30초 동안 균일화했다. 균일물을 20,000 rpm에서 15분 원심분리했다. 펠렛을 10 ㎖ 버퍼 2에서 재부유시키고 다시 원심분리했다. 이 단계를 1번 더 반복했다. 결과되는 펠렛을 버퍼 2에서 재부유시키고, 단백질 농도를 측정했다. 막은 -80℃에서 보관되었다.
버퍼 1: 20 mM Na-HEPES + 10mM EDTA, pH 7.4
버퍼 2: 20 mM Na-HEPES + 0.1 mM EDTA, pH 7.4
결합 분석법:
SPA:
시험 화합물, 막, SPA-입자 및 125I-GLP-1(7 내지 36)NH2를 분석 버퍼에 희석시켰다. 시험 화합물의 25 ㎕(마이크로 리터)를 Optiplate에 첨가했다. HSA(2% HSA를 함유하는 "높은 알부민" 실험), 또는 버퍼(0.005% HSA를 함유하는 "낮은 알부민" 실험)를 첨가(50 ㎕)했다. 5 내지 10 ㎍ 단백질/샘플을 0.1 내지 0.2 mg 단백질/㎖(각각의 막 제조를 위해 바람직하게 최적화된)에 대응하여 첨가(50 ㎕)했다. SPA-입자(Wheatgerm 응집소 SPA 비드, Perkin Elmer, #RPNQ0001)를 0.5 mg/웰(50 ㎕)의 양으로 첨가했다. 배양은 125I-GLP-1(7 내지 36)NH2(49.880 DPM, 25 ㎕에 대응하는 최종 농도 0.06 nM)로 시작했다. 플레이트를 PlateSealer로 밀봉하고, 30℃에서 120분 동안 교반하며 배양했다. 플레이트를 원심분리(1500 rpm, 10분)하고, Topcounter에서 카운팅했다.
분석 버퍼:
50 mM HEPES
5 mM EGTA
5 mM MgCl2 0.005% 트윈20
pH 7.4
HSA는 SIGMA A1653임.
계산
IC50 값을 125I-GLP-1의 수용체로부터의 50% 치환된 농도로서 곡선으로부터 읽고, [(IC50/nM) 높은 HSA]/[(IC50/nM) 극도로 낮은 HSA]의 비율을 측정했다.
일반적으로, 낮은 알부민 농도에서의 GLP-1 수용체 결합은 낮은 IC50 값에 대응하여 가능한 양호해야 한다.
높은 알부민 농도에서의 IC50 값은, 유도체의 GLP-1 수용체로의 결합에서 알부민의 영향의 판정이다. 알려진 바와 같이, GLP-1 유도체는 또한 알부민과 결합한다. 이것은 일반적으로 혈장에서 그들의 생명을 연장하는 원하는 효과이다. 따라서, 높은 알부민에서 IC50 값은 일반적으로 낮은 알부민에서 IC50 값보다 높을 것이고, GLP-1 수용체로의 감소된 결합과 대응하고, GLP-1 수용체로의 결합과 경쟁하는 알부민 결합에 원인이 된다.
따라서 높은 비율(IC50 값(높은 알부민)/IC50 값(낮은 알부민))은 문제에서 유도체는 알부민과 잘 결합하고(긴 반감기를 가질 수 있음), 그 자체가 GLP-1 수용체와 잘 결합함(IC50 값(높은 알부민)이 높고, IC50 값(low 알부민)이 낮음)을 나타낼 수 있다.
결과
다음 결과가 얻어지고, "비율"은 [(IC50/nM) 높은 HSA]/[(IC50/nM) 낮은 HSA])을 의미함:
2개를 제외한 모든 유도체는 1.0 이상의 비율을 가졌고; 40개의 유도체는 10 이상; 34개 유도체는 25 이상; 22개 유도체는 50 이상; 12개 유도체는 100 이상; 및 3개 유도체는 250 이상의 비율을 가졌다.
게다가 IC50(낮은 알부민)과 관련하여, 모든 유도체는 600 nM 미만의 IC50(낮은 알부민)을 가졌고; 1개를 제외한 모두는 500 nM 미만; 46개 유도체는 100 nM 미만; 44개 유도체는 50.00 nM 미만; 34개 유도체는 10.00 nM 미만; 23개 유도체는 5.00 nM 미만; 및 7개 유도체는 1.00 nM 미만이었다.
최종적으로 IC50(높은 알부민)과 관련하여, 모든 유도체는 1000.00 nM 이하의 IC50(높은 알부민)을 가졌고; 46개 유도체는 1000.00 nM 미만; 39개 유도체는 500.00 nM 미만; 7개 유도체는 100.00 nM 미만; 및 4개 유도체는 50.00 nM 미만이었다.
실시예 52: 구강 생체이용률의 추정
이 실험의 목적은 GLP-1 유도체의 구강 생체이용률을 추정하는 것이다.
이것을 위해, 실시예 2,15 내지 17, 21, 25, 32, 36 내지 39, 및 42 내지 48의 GLP-1 유도체에서 장의 루멘으로의 직접 주사 후 혈장에서의 노출을 다음에서 기재된 바와 같이 래트의 생체 내에서 연구했다.
GLP-1 유도체를 55 mg/㎖ 소듐카프레이트 용액에서 1000 uM의 농도로 시험했다. 약 240 g의 도착시 체중의 32마리의 수컷 Sprague Dawley 래트를 Taconic(덴마크)로부터 얻었고, 군마다 4마리의 레트를 간단하게 임의 추출하여 배정했다. 래트를 시험 전 약 18시간 동안 금식시키고, 일반적인 마취제(Hypnorm/Dormicum)로 마취되었다.
GLP-1 유도체를 빈 장의 근위 부분(십이지장에서 말단 10 ㎝) 또는 중간-대장(맹장에서 근위 50 ㎝)에서 투여했다. PE50-카테터, 10 cm 길이가 빈장으로 삽입되고, 빈장으로 적어도 1.5 cm 더 들어가고, 누출 또는 카테터 이동을 방지하도록 내장 및 카테터 주위를 말단에서 끝까지 3/0 봉합실로 매듭져 투여 전에 고정시켰다. 카테터를 주사기 및 바늘 없이 위치시키고, 상처 클립으로 절개를 닫기 전에 2 ㎖ 식염수를 복부에 투여했다.
각각의 GLP-1 유도체 100 ㎕를 1 ㎖ 주사기로 카테터를 통해 빈장의 루멘으로 주입했다. 이 후, 공기 200 ㎕가 카테터를 "플러시(flush)"하는 다른 주사기로 빈장의 루멘으로 밀어 넣었다. 이 주사기를 카테터로의 역류를 방지하는 카테터로 연결된 채로 남겼다.
혈액 샘플(200 ㎕)을 꼬리 정맥으로부터 원하는 시간에(보통 0, 10, 30, 60, 120 및 240 분에) EDTA 튜브에 수집되고, 4℃에서 20분 이내로 5분, 10000 G로 원심분리했다. 혈장(75 ㎕)을 Micronic 튜브로 분리하고, 즉시 냉동시켜, Poulsen 및 Jensen의 Journal of Biomolecular 검사 2007, vol. 12, p. 240-247의 일반적으로 일슐린 측정을 위해 기재된 바와 같이, LOCI(루미네센트 산소 채널링 면역분석법)로 각각의 GLP-1 유도체의 혈장 농도를 분석할 때까지, -20℃에서 보관했다. 주게 비드를 스트렙타아비딘로 코팅하고, 반면 수용체 비드를 펩티드의 중간-/C-말단 에피토프를 인식하는 단일복제 항체로 콘주게이트했다. N-말단에 특정한 다른 단일복제 항체를 비오틴화했다. 3개의 반응물을 분석물로 조합했고, 2개로 위치된 면역복합체(immuno-complex)를 형성했다. 복합체의 조도는 주게 비드로부터 단일 산소원자를 방출하고, 주게 비드를 수용체 비드로 체널화하고 Envision 플레이트 리더로 측정되는 화학 루미네센스를 작동시켰다. 빛의 양이 화합물의 농도에 비례했다.
혈액을 샘플링한 후, 래트를 마취제로 희생시키고, 정확한 카테터 위치를 증명하도록 복부를 열었다.
평균(n=4) 혈장 농도(pmol/ℓ)를 시간의 기능으로서 측정했다. 투여 용액의 농도(μmol/ℓ)로 나눈 혈장 농도(pmol/ℓ)의 비를 각 처리를 위해 계산했고, t=30분(빈장에서 화합물 주사 후 30분) 결과를 장의 생체이용률 대리 측정으로서 측정했다(30분에서 용량-보정 노출). 용량-보정 노출이 실제 생체이용률과 상당히 상관관계가 있게 나타났다.
다음 결과를 얻었고, 30분에서 용량-보정 노출은 (투여 용액에서 화합물의 농도(μM))로 나눈 (빈장에서 화합물 주사 후 30분의 혈장 농도(pM))를 의미함:
모든 유도체는 30분에서 40 이상의 용량-보정 노출을 가졌고; 17개는 50 이상; 14개는 70 이상; 11개는 100 이상; 6개는 125 이상; 및 2개 유도체는 150 이상이었다.
비교를 위해, Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669(K26,34에서 비스-C12-이산으로 아실화된 GLP-1(7 내지 37))의 표1에서 화합물 번호 13은 30분에서 40 미만의 용량-보정 노출을 가졌고, 세마글루티드를 위한 30분에서의 용량-보정 노출은 40 미만의 동일한 범위에 있었다.
실시예 53: 혈액 글루코오스 및 체중에서의 효과
이 연구의 목적은 당뇨병 설정에서 혈액 글루코오스(BG) 및 체중(BW) 상의 GLP-1 유도체의 효과를 증명하는 것이다.
실시예 2, 4 내지 5, 17 및 29의 GLP-1 유도체를 다음에 기재된 바와 같이 비만, 당뇨병 마우스 모델(db/db 마우스)에서 시험했다.
출생서부터 사료 NIH31(NIH 31M Rodent Diet, Taconic Farms, Inc., 미국, www.taconic.com으로부터 상업적으로 이용가능한)를 먹인 50마리의 db/db 마우스(Taconic, 덴마크)가 7 내지 9주의 연령에서의 연구를 위해 기록되었다. 마우스는 표준 음식(예를 들어 Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, 덴마크) 및 수도물의 접근이 자유로웠고, 24℃를 유지했다. 1 내지 2 주의 적응 후, 기저 혈액 글루코오스를 연이은 2일(즉 9시에)에서 2번 측정했다. 가장 낮은 혈액 글루코오스 값을 갖는 8마리의 마우스를 실험으로부터 배제했다. 평균 혈액 글루코오스 값에 근거하여, 남은 42마리의 마우스를 추가 실험을 위해 선택했고, 혈액 글루코오스 레벨을 맞춘 7개 군(n=6)으로 할당했다. 마우스를 최대 4배를 위한 5일 기간의 실험에서 사용했다. 마지막 실험 후 마우스를 안락사시켰다.
7군을 다음과 같이 처리했음:
1: 부형제, 피하
2: GLP-1 유도체, 0.3 nmol/kg, 피하
3: GLP-1 유도체,1.0 nmol/kg, 피하
4: GLP-1 유도체,3.0 nmol/kg, 피하
5: GLP-1 유도체,10 nmol/kg, 피하
6: GLP-1 유도체,30 nmol/kg, 피하
7: GLP-1 유도체,100 nmol/kg, 피하
부형제: 50mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% 트윈80, pH 7.4.
GLP-1 유도체를 부형제에서, 0.05, 0.17, 0.5, 1.7, 5.0 및 17.0 nmol/㎖의 농도로 용해했다. 동물에게 6 ㎖/kg(즉 50 g 마우스 당 300 ㎕)의 투여-부피로 피하 투여했다.
투여 날에, 혈액 글루코오스를 ½ 시간(오전 8:30)에서 측정하고, 마우스의 체중을 재었다. GLP-1 유도체를 약 오전 9시(time 0)에 투여했다. 투여 날에, 혈액 글루코오스를 1, 2, 4 및 8시간(오전 10시, 11시, 오후 1시 및 5시)에 측정했다.
다음 날에, 혈액 글루코오스를 투여 후 24, 48, 72, 및 96시간(즉 2, 3, 4, 5일에서의 오전 9시)에 측정했다. 각 날에, 혈액 글루코오스 샘플링 후 마우스의 체중을 재었다.
마우스는 개별적으로 디지털 체중기로 체중을 재었다.
혈액 글루코오스의 측정 샘플을 의식이 있는 마우스의 꼬리 끝 모세혈관으로부터 얻었다. 혈액, 10 ㎕를 헤파린화 모세관에 모으고, 500 ㎕ 글루코오스 버퍼(EKF 시스템 용액, Eppendorf, 독일)로 옮겼다. 글루코오스 농도를 글루코오스 옥시다제법(글루코오스 분석기 Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, 독일)을 사용하여 측정했다. 샘플을 분석할 때까지 최대 1시간 동안 실온에서 보관했다. 분석이 연기된 경우, 샘플을 4℃에서 최대 24시간 동안 보관했다.
ED50은 nmol/kg으로 최대 효과의 절반을 일으키는 투여량이다. 이값을 더 낮은 체중으로의 유도체 능력, 그뿐만 아니라 아래에 설명한 바와 같이 더 낮은 혈액 글루코오스 능력을 기반으로 계산한다.
체중의 ED50이 유도체의 피하 투여 24시간 후 Δ BW 상의 최대 효과의 절반을 일으키는 투여량으로서 계산된다. 예를 들어, 24시간 후 체중의 최대 감소가 4.0 g인 경우, 그 다음 ED50 체중은, 2.0 g의 24시간 후 체중 감소를 일으키는 nmol/kg의 투여인 것이다. 이 투여(ED50 체중)를 용량반응곡선으로부터 읽을 수 있다.
혈액 글루코오스의 ED50이 유사체의 피하투여 8시간 후 AUC Δ BG 상의 최대 효과의 절반을 일으키는 투여량으로서 계산된다.
ED50 값이 알맞은 S자형 용량-반응 관계가 최대 반응의 명백한 정의로 존재하는 경우에서만 계산될 수 있다. 따라서, 이것이 나타나지 않는 경우, 문제에서 유도체가, S자형 용량-반응 관계가 얻어질 때까지, 투여량의 다른 범위에서 재시험된다.
다음 결과가 얻어짐:
시험된 유도체는 체중 뿐만 아니라 혈액 글루코오스에서 기대한 효과가 있었다(모든 경우에서 낮음). 게다가, S자형 용량반응곡선을, 상기 설명한 바와 같이 각각의 혈액 글루코오스 및 체중을 위한 ED50 값을 계산할 수 있도록 얻었다.
실시예 54: 미니 돼지에서의 반감기
이 연구의 목적은 미니 돼지에서 정맥 내 투여 후 GLP-1 유도체의 생체 내 연장, 즉 그들의 활동 시간의 연장을 측정하는 것이다. 이것은, 문제에서 유도체의 말단 반감기를 측정하는, 약동학적(PK) 연구에서 수행된다. 말단 반감기는 일반적으로 어떤 혈장 농도를 반으로 줄이는데 걸리는 시간을 의미하고, 초기 분포상 후에 측정된다. 수컷 Gottingen 미니 돼지를 Ellegaard Gottingen 미니 돼지(Dalmose, 덴마크)로부터 얻고, 약 7 내지 14달 연령 및 약 16 내지 35 kg 체중인 것을 연구에 사용했다. 미니 돼지를 개별적으로 사육했고, SDS 미니 돼지 사료(Special Diets Services, Essex, 영국)를 제한적으로 1번 또는 2번 주었다. 적어도 2주의 적응 후, 2개의 영구적인 중앙 정맥 카테터를 각 동물의 대정맥 머리쪽 또는 꼬리쪽에 이식했다. 동물을 수술 후 1주 회복시키고, 그 다음 투여 사이의 적합한 세척기간이 있는 반복 약동학적 연구에 사용했다.
실시예 2, 4 내지 5, 16 내지 17, 25, 29 및 39의 GLP-1 유도체를 보통 20 내지 60 nmol/㎖ 농도의 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% 트윈80, pH 7.4에 용해했다. 화합물의 정맥 주사(보통 1 내지 2 nmol/kg에 대응하는 부피, 예를 들어 0.033㎖/kg)를 하나의 카테터를 통해 주입하고, 혈액을 투여 후 최대 13일까지 미리 지정한 시간 지점에서 샘플링했다(바람직하게 다른 카테터를 통해). 혈액 샘플(예를 들어 0.8 ㎖)을 EDTA 버퍼(8 mM)에 수집하고, 그 다음 4℃ 1942 G에서 10분 동안 원심분리했다. 혈장을 드라이아이스 상에서 Micronic 튜브로 피펫팅하고, ELISA 또는 유사한 항체 기반 분석법 또는 LC-MS를 사용하여 각각의 GLP-1 화합물의 혈장 농도를 분석할 때까지 -20℃에서 보관했다. 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 WinNonlin v. 5.0(Pharsight Inc., Mountain View, CA, 미국)에서 ofiles 비구분된 모델로 분석하고, 결과되는 말단 반감기(조화 평균)를 측정했다.
결과
시험된 유도체의 1개를 제외한 모두는 적어도 12시간의 반감기를 가졌고, 6개는 적어도 24시간의 반감기를 가졌고, 5개는 적어도 36시간의 반감기를 가졌고, 3개는 적어도 48시간의 반감기를 가졌고, 그리고 2개는 적어도 60시간의 반감기를 가졌다.
실시예 55: 글루코오스 매개 인슐린 분비의 효과
이 실시예의 목적은 글루코오스 매개 인슐린 분비 상의 GLP-1 유도체 효과를 시험하는 것이다.
이것을 글루코오스 정주부하시험(IVGTT)을 사용하여 Gottingen 미니 돼지에게 수행했다. 수컷 Gottingen 미니 돼지(Ellegaard Gottingen 미니 돼지 A/S, Dalmose, 덴마크)를 7 내지 14달의 연령으로 본 연구에 사용했다. 동물이 적응하는 동안 및 실험하는 동안 단일 펜스에서 사육된다. 적어도 2주의 적응 후, 2개의 영구적인 중앙 정맥 카테터를 각 동물의 대정맥 머리쪽 또는 꼬리쪽에 이식했다. 동물을 수술 후 1주 회복시키고, 그 다음 투여 사이의 적합한 세척기간이 있는 반복 약동학적 연구에 사용했다.
미니 돼지를 개별적으로 사육했고, SDS 미니 돼지 사료(Special Diets Services, Essex, 영국)를 제한적으로 1 내지 2번 주었고, 물의 접근은 자율적이었다.
GLP-1 유도체의 효과를 격한 높은 투여로부터의 역효과를 피하도록 단계적으로 확대된 투여로 단일 투여 후 또는 일정 기간 후에 시험했다. GLP-1 유도체를 정맥내 또는 귀 뒤 얇은 피후의 피하에 주입했다.
각각의 시험된 GLP-1 유도체를 위해 부형제 처리된(또는 처리되지 않은) 베이스라인 군 및 2 내지 6개의 다른 혈장 농도 레벨에 대응하는 2 내지 6개의 GLP-1 투여량 군이 있고, 여기서 혈장 농도 레벨은 보통 약 3000 내지 80000 pM(n=5 내지 8)이다.
각각의 GLP-1 유도체를 위해, 1 또는 2시간 글루코오스 정주부하시험(IVGTT)이 수행되었다. 돼지를 시험 전 약 18시간 동안 금식시켰다. 중앙 정맥 카테터의 효능이 확인되고, 2개의 베이스라인 혈액 샘플을 취했다. 0분에서 샘플 후 0.3 g/kg 글루코오스(글루코오스 500 g/L, SAD)를 30초가 넘는 시간 동안 정맥 내에 주입하고, 카테터를 식염수 0.9% NaCl의 20 ㎖로 플러쉬한다. 혈액 샘플을 글루코오스 보러스에 관하여 다음의 시간 지점: -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 분에서 취한 후, 각 혈액 샘플 카테터를 10 U/㎖ 헤파린을 갖는 식염수 0.9% NaCl 4 ㎖로 플러쉬한다. 유도체의 인슐린, 글루코오스 및 혈장 농도를 위한 혈액 샘플을 EDTA로 코팅된 튜브로 옮긴다. 튜브를 젖은 얼음에 보관하고, 1시간 원심분리(4℃, 3000 rpm, 10분)하고, 혈장을 드라이아이스 상에서 Micronic 튜브로 피펫팅하고, 분석할 때까지 -20℃에서 보관한다. GLP-1 유도체의 반감기에 따라 혈장 농도를 t=0분에서 또는 t=0분 및 시험 종료(t=60 분, 또는 t=120 분)에서 측정한다. 글루코오스를, 500 ㎕ 버퍼(EBIO 플러스 자동분석기 및 용액, Eppendorf, 독일)에서 10 ㎕ 혈장이 있는 제조자의 지시에 따라 글루코오스 옥시다제법을 사용하여 분석한다. 인슐린을 적합한 면역계수측정법(LOCI와 같은, 예를 들어 Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247 참조)을 사용하여 분석한다. GLP-1 유도체의 혈장 농도를 ELISA 또는 유사한 항체 기반 분석법 또는 LC-MS를 사용하여 분석한다. 각 연구를 위해 인슐린 곡선 아래 영역(AUC인슐린)을 인슐린 분비의 측정으로서 계산하고 사용한다. 다른 투투여 군을, 일원배치분산분석(one-way ANOVA) 또는 다른 알맞은 통계 분석을 사용하여 각각의 부형제/베이스라인 군과 비교한다. AUC인슐린의 EC50도 계산할 수 있다.
실시예 56: 섭취의 효과
이 실험의 목적은 돼지에서 GLP-1 유도체의 섭취 효과를 조사하는 것이다. 이것을 아래에 기재된 바와 같이 약력학(PD) 연구에서 수행되고, 섭취를 부형제-처리 대조군과 비교해, GLP-1 유도체의 단일 투여 후 1, 2, 3 및 4일에 측정한다.
약 3달의 연령, 약 30 내지 35 kg의 체중의 암컷 Landrace Yorkshire Duroc(LYD) 돼지를 사용했다(군마다 n=3 내지 4). 동물을, 동물 시설에 적응하도록 1 내지 2주 동안 군으로 사육한다. 실험 기간 동안, 동물을 개별 우리에 넣고, 월요일 아침 내지 금요일 오후에 개별 사료섭취량을 측정했다. 동물에게 적응 및 실험 기간 동안 모두 항상 돼지 사료(Svinefoder, Antonio)로 자율적으로 먹이를 주었다. 사료섭취량을 15분 마다 사료의 무게를 기록함으로써 온라인으로 모니터한다. 사용된 시스템은 Mpigwin(Ellegaard Systems, Faaborg, 덴마크)이다.
GLP-1 유도체를 인산 버퍼(50 mM 인산, 0.05% 트윈80, pH 8)에 0.3, 1, 3, 10 또는 30 nmol/kg에 대응하는 12, 40, 120, 400 또는 1200 nmol/㎖의 농도로 용해한다. 대응하는 to doses of . 인산 버퍼는 부형제 역할을 한다. 동물에게 1일 아침에 GLP-1 유도체 또는 부형제(투여량 0.025 ㎖/kg)를 단일 피하 투여로 투여하고, 투여 4일 동안 사료 섭취량을 측정한다. 각 연구 마지막 날에, 투여 후 4일에, GLP-1 유도체의 혈장 노출을 측정하기 위해, 혈액 샘플을 마취된 동물의 심장으로부터 취한다. 그 후 동물을 펜토바비톤의 심장내 과투여로 안락사시켰다. GLP-1 유도체의 혈장 내용물을 ELISA 또는 유사한 항체 분석붑을 사용하여 분석한다.
섭취를 4일에 평균 ± SEM 24시간 사료섭취량으로서 계산한다.
4일의 부형제 대 GLP-1 유도체 군의 24시간 섭취의 통계적 비교를 일원배치분산분석 또는 이원배치분산분석과 Bonferroni 후 검정을 사용하여 수행한다.
실시예 57: 장의 효소에 의한 변성에 대한 안정성
이 실시예의 목적은 장의 효소에 의한 변성에 대한 안정성을 시험하는 것이다. GLP-1(7 내지 37)을 표준의 종류로서 분석법에 사용했다.
실시예 4, 6, 8, 34 내지 35 및 49의 화합물을 제외한 모든 실시예 화합물을 시험했다.
장에서 가장 강한 단백질 가수분해 활성은 췌장 기원이고, 세린 엔도펩티다제 트립신, 키모트립신, 및 엘라스타제, 그뿐만 아니라 카르복시펩티다제의 여러 종류를 포함한다.
래트로부터 소장 추출물로의 분석을 다음에 기재된 바와 같이 개발하고 사용했다.
래트 소장으로부터의 추출물
소장을 래트로부터 준비하고, 8 ㎖ 150 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 7.4로 플러쉬했다. 용액을 75006445 회전자가 있는 Heraeus Multifuge 3 S-R 원심분리기에서 4,600 rpm에서 15분 동안 원심분리했다. 상층액을 제거하고 0.22 ㎛ Millipore Millex GV PVDF 막을 통해 여과했다. 여러 동물의 여과액을 개별 차이를 평균 내도록 모았다.
추출물에서 얻은 단백질 내용물을 Bradford Assay(예를 들어 Analytical Biochemistry (1976), vol. 72, p. 248-254, 및 Analytical Biochemistry (1996), vol. 236 p. 302-308 참조)로 측정했다.
변성 분석
시험할 유도체 2.5 nmol을 장 추출물 부피 250 ㎕와 37℃에서 1시간 이상의 기간 동안 배양했다. 장 샘플을 pH 7.4 20 mM Hepes 존재에서 분석했다. 장 추출물의 농도를 파일럿 테스트에서 적정하여, GLP-1(7 내지 37)의 반감기(t1 /2)가 10 내지 20분 범위에 있었다. 소장 추출물을 1.4 ㎍/㎖의 농도에서 사용했다. 장의 추출물을 제외한 모든 성분을 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 미리 데웠다. 장 추출물의 첨가 후 바로 50 ㎕ 샘플을 취하고 1% 트리플루오로아세트산(TFA)의 동일한 부피와 혼합했다. 추가 샘플을 15, 30 및 60분 후 취했다.
샘플 분석
UPLC 분석
샘플의 10 ㎕를 BEH C18 1.7 ㎛ 2.1 × 50 mm 컬럼 및 0.6 ㎖/분의 유속에서 5분 이상 아세토니트릴에서 0.1% TFA 및 0.07% TFA의 30% 내지 65% 구배가 있는 Waters Acquity 시스템을 사용하여 UPLC에 의해 분석했다. 베이스라인 공제 후 HPLC 크로마토그램에서 214 nm의 파장에 기록된 온전한 화합물의 피크 적분 값을 측정했다.
MALDI - TOF 분석
각 샘플의 1 ㎕를 Bruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDI 타겟에 옮겼다. 분석을, 500 내지 5000 Da의 확장된 검출 범위가 있는 미리 정의된 방법 "PAC_측정" 및 미리 정의된 교정 방법 "PAC_교정"을 사용하여 Bruker Autoflex 매트릭스보조레이져탈착/이온화비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기로 수행했다.
데이터 분석
HPLC 크로마토그램의 피크 적분을 시간에 대해 플롯팅했다. 각 화합물의 반감기를 SigmaPlot 9.0 소프트웨어 및 2-파라미터 지수함수형 붕괴의 공식을 사용하여 데이터를 일치시킴으로써 계산했다.
시험된 각 화합물의 경우, 상대 반감기(상대 T1 /2)를, 동일한 방법으로 측정된 GLP-1(7 내지 37)의 반감기(상대 T1 /2)로 나누어, 문제에서 화합물의 반감기(상대 T1 /2)로서 계산했다.
결과
알려진 화합물인 리라글루티드 및 세마글루티드의 상대 반감기는 각각 4.8 및 1.2였다.
1개의 화합물을 제외하고, 본 발명의 모든 GLP-1 유도체는 적어도 1개 이상의 상대 반갑기를 가졌고; 31개는 적어도 2개의 상대 반감기를 가졌고; 그리고 10개는 적어도 5개의 반감기를 가졌다.
실시예 58: 래트에서의 약동학
이 실시예의 목적은 래트의 생체 내에서의 반감기를 조사하는 것이다. 래트의 생체 내에서 약동학적 연구를 다음에 기재된 바와 같이, 본 발명의 10개의 유도체(본 실시예 2, 4 내지 5, 16 내지 17, 25, 29, 36, 39 및 43의 화합물)로 수행했다. 세마글루티드를 비교를 위해 포함했다. 400 내지 600 g의 체중을 갖는 동일한 연령의 수컷 Sprague Dawley 래트를 Taconic(덴마크)로부터 얻었고, 군마다 약 3 내지 6마리의 래트를 체중에서 간단하게 임의 추출하여 처리에 배정했다.
GLP-1 유도체(약 6 nmole/㎖)를 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% 트윈80, pH 7.4에 용해했다. 화합물의 정맥 주사(1.0 ㎖/kg)를 경정맥에 이식된 카테터를 통해 주입했다. 혈액을 투여 후 5일 동안 혀밑 정맥으로부터 샘플링했다. 혈액 샘플(200 ㎕)를 EDTA 버퍼(8mM)로 수집하고, 그 다음 4℃ 10000 G에서 5분 동안 원심분리했다. 혈장 샘플을 각 GLP-1 화합물의 혈장 농도를 분석할 때까지 -20℃를 유지했다.
GLP-1 화합물의 혈장 농도를, 일반적으로 Poulsen 및 Jensen, Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247의 인슐린 측정을 위해 기재된 바와 같이, 루미네센스 산소 채널 면역분석법(LOCI)을 사용하여 측정했다. 주게 비드를 스트렙타아비딘으로 코팅하고, 반면 수용체 비드를 펩티드의 중간-/C-말단 에피토프를 인식하는 단일복제 항체로 콘주게이트했다. N-말단에 특정한 다른 단일복제 항체를 비오틴화했다. 3개의 반응물을 분석물로 조합했고, 2개로 위치된 면역복합체를 형성했다. 복합체의 조도는 주게 비드로부터 단일 산소원자를 방출하고, 주게 비드를 수용체 비드로 체널화하고 Envision 플레이트 리더로 측정되는 화학 루미네센스를 작동시켰다. 빛의 양이 화합물의 농도에 비례했다.
혈장 농도-시간 프로파일을 WinNonlin(ver. 5.0, Pharsight Inc., Mountain View, CA, 미국), 및 각 동물로부터 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 사용하여 계산된 반감기(T1 /2)를 사용하여 분석했다.
결과
세마글루티드의 반감기는 4시간이었다.
시험된 본 발명의 10개의 유도체는 적어도 4시간의 반감기를 가졌고, 하나를 제외한 모두는 적어도 8시간의 반감기를 가졌고, 7개는 적어도 12시간의 반감기를 가졌고, 6개는 적어도 16시간의 반감기를 가졌고, 그리고 3개는 적어도 24시간의 반감기를 가졌다.
본 발명의 어떤 특징이 본원에 묘사되고 기재된 반면, 많은 변형, 치환, ㅂ변화, 및 등가물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 그러므로 이것은 첨부된 청구범위가 본 발명의 진실한 정신 내에 떨어진 바와 같이 모든 이들 변형 및 변화를 망라하도록 의미된다고 이해된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Double-acylated GLP-1 derivatives <130> 8067.204-WO <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> GLP-1(7-37) <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30

Claims (15)

  1. GLP-1 유사체의 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르로서,
    상기 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고,
    상기 유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서
    알부민 결합 부분은 하기 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
    Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
    Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
    Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
    Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
    여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고;
    단, 연장 부분이 Chem. 1일 때, 알부민 결합 부분은 추가로 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
    Chem. 5:
    Figure pct00142

    여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수인
    GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르.
  2. 제 1항에 있어서,
    GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고,
    유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서
    알부민 결합 부분은 하기 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
    Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
    Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
    Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
    여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르.
  3. 제 1항에 있어서,
    GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고,
    유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서
    알부민 결합 부분은 i) 식 Chem. 1의 연장 부분과:
    Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
    여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고;
    ii) 식 Chem. 5의 링커를 포함하고:
    Chem. 5:
    Figure pct00143

    여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르.
  4. 제 1항에 있어서,
    GLP-1 유사체는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 위치 37에 대응하는 위치에서 제 1 K 잔기, GLP-1(7 내지 37)의 위치 26에 대응하는 위치에서 제 2 K 잔기, 및 GLP-1(7 내지 37)과 비교해 최대 10개 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제 1 K 잔기는 K37로 지정되고, 제 2 K 잔기는 K26로 지정되고,
    유도체는 각각 K26 및 K37에 부착된 2개의 연장 부분을, 각각 링커를 통해 포함하고, 여기서 연장 부분은 Chem. 1 , Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4로부터 선택되고:
    Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
    Chem. 2: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-*
    Chem. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*
    Chem. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*
    여기서 x는 6 내지 18 범위의 정수이고, y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, 그리고 w는 6 내지 18 범위의 정수이고; 및
    링커는 식 Chem. 5를 포함하고:
    Chem. 5:
    Figure pct00144

    여기서 k는 1 내지 5 범위의 정수이고, n은 1 내지 5 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르.
  5. Chem. 20, Chem. 21, Chem. 22, Chem. 23, Chem. 24, Chem. 25, Chem. 26, Chem. 27, Chem. 28, Chem. 29, Chem. 30, Chem. 31, Chem. 32, Chem. 33, Chem. 34, Chem. 35, Chem. 36, Chem. 37, Chem. 38, Chem. 39, Chem. 40, Chem. 41, Chem. 42, Chem. 43, Chem. 44, Chem. 45, Chem. 46, Chem. 47, Chem. 48, Chem. 49, Chem. 50, Chem. 51, Chem. 52, Chem. 53, Chem. 54, Chem. 55, Chem. 56, Chem. 57, Chem. 58, Chem. 59, Chem. 60, Chem. 61, Chem. 62, Chem. 63, Chem. 64, Chem. 65, Chem. 66, Chem. 67, 및 Chem. 68로부터 선택된 GLP-1 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르.
  6. 그 이름에 의해 특징지어지고, 본원에서의 실시예 1 내지 49의 화합물의 각 이름의 목록으로부터 선택되는 GLP-1 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르.
  7. 제 6항에 있어서, 제 5항의 유도체인 것을 특징으로 하는 유도체.
  8. GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해, (i)(8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii)(des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii)(des7-8, 34R, 37K); (iv)(8Aib, 9G, 34R, 37K); (v)(8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi)(31 H, 34Q, 37K); (vii)(9Q, 34R, 37K); (iix)(30E, 34R, 37K); (ix)(34R, 37K, 38G); (x)(34R, 36G, 37K); 또는 (xi)(34R, 37K, 38E)의 변형을 포함하는 GLP-1 유사체 형태의 중간 생성물, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르.
  9. 제 8항에 있어서, 유사체는 (i-a)(8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii-a)(des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii-a)(des7-8, 34R, 37K); (iv-a)(8Aib, 9G, 34R, 37K); (v-a)(8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi-a)(31H, 34Q, 37K); (vii-a)(9Q, 34R, 37K); (iix-a)(30E, 34R, 37K); (ix-a)(34R, 37K, 38G); (x-a)(34R, 36G, 37K); (xi-a)(34R, 37K, 38E); (xii-a)(7lmp, 34R, 37K); (xiii-a)(8Aib, 34R, 37K); 및 (xiv-a)(34R, 37K)의 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 유사체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 중간 생성물, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 또는 에스테르.
  10. Chem. 2c, Chem. 3b 및 Chem. 4b로부터 선택된 연장 부분을 포함하고:
    Chem. 2c: HOOC-C6H4-0-(CH2)y-CO-PG
    Chem. 3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG
    Chem. 4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG
    여기서 y는 3 내지 17 범위의 정수이고, z는 1 내지 5 범위의 정수이고, R1은 150 Da보다 높지 않은 몰질량을 갖는 기이고, w는 6 내지 18 범위의 정수이고, 및 *-CO-PG는 활성화된 에스테르이며;
    여기서 선택적으로, 연장 부분의 말단 *-COOH 기가 존재하는 경우 비활성 에스테르로서 작용하는
    중간생성물, 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르.
  11. 제 10항에 있어서, Chem. 69, Chem. 70, Chem. 71, Chem. 72, Chem. 73, Chem. 74, Chem. 75, Chem. 76, Chem. 77, Chem. 78, Chem. 79, Chem. 80, Chem. 81, Chem. 82 및 Chem. 83로부터 선택되며, 여기서 선택적으로, Chem. 69 내지 Chem. 83의 어느 하나의 연장 부분의 말단 *-COOH 기가 존재하는 경우 또한 보호되는 것을 특징으로 하는 중간 생성물.
  12. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  13. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 당뇨병의 모든 형태 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용; 및/또는 지질 파라미터 개선, β세포 기능 개선, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한 것을 특징으로 하는 유도체.
  14. 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 당뇨병의 모든 형태 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방; 및/또는 지질 파라미터 개선, β세포 기능 개선, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 유도체의 사용.
  15. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의, 유도체의 약학적으로 활성인 양의 투여함으로써, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 당뇨병의 모든 형태 및 관련 질환의 치료 또는 예방; 및/또는 지질 파라미터 개선, β세포 기능 개선, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연 또는 예방하는 방법.
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