CN102791731A - Glp-1类似物和衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及GLP-1类似物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述类似物包含对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的31位位置的组氨酸(H)残基、对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的34位位置的谷氨酰胺(Q)残基，和与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较，所述类似物包含最多10个氨基酸修饰；其中所述H残基被命名为H31，所述Q残基被命名为Q34。本发明亦涉及其衍生物以及这些类似物和衍生物的药物用途，例如在治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病中的药物用途。本发明进一步涉及相应的新的侧链中间体。所述衍生物适于口服给药。

Description

GLP-1类似物和衍生物
发明领域
本发明涉及包含31位组氨酸和34位谷氨酰胺的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的类似物和衍生物及其药物用途。
通过引用并入序列表
2010年11月28日创建的标题为″序列表″的序列表为582个字节，其通过引用并入本文中。
发明背景
WO 00/16797涉及GLP-1或类似物在治疗中风中的用途，并包括用于设计改进胰岛素刺激性质或增加胰岛素在血浆中的降解抗性的GLP-1类似物和衍生物的若干建议。
WO 2006/096515涉及GLP-1肽的转铁蛋白融合蛋白，例如GLP-1(7-37)，其通过使K34突变为Q、A或N来修饰(其中的权利要求16)。
WO 2009/030771涉及用A-B-C-D-衍生的肽例如GLP-1，包括其中K34突变为Q的一些肽(实施例68、69、71)。
美国专利号5,545,618涉及用于糖尿病治疗的GLP-1类似物，并包括用于设计改进胰岛素刺激性质或增加在血浆中的降解抗性的GLP-1类似物和衍生物的若干建议。
在WO 98/08871实施例37中公开了由Novo Nordisk A/S销售的每天给予一次的GLP-1衍生物利拉糖肽(Liraglutide)。
在WO 06/097537实施例4中公开了由Novo Nordisk A/S开发的每周给予一次的GLP-1衍生物司美鲁肽(Semaglutide)。
发明简述
本发明涉及GLP-1类似物及其衍生物。
在本发明GLP-1类似物中，31位以及34位的天然氨基酸残基即W和K分别被取代为H和Q。
与天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较，类似物可总计最多有10个氨基酸被修饰，包括31位和34位的取代。
更具体地，本发明涉及包含对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的31位位置上的组氨酸残基和对应于GLP-1(7-37)的34位位置上的谷氨酰胺残基的GLP-1类似物。
因此，可认为所述类似物包含或具有H31和Q34。与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较，所述类似物进一步优选具有最多10个氨基酸修饰。
本发明亦涉及该类似物的衍生物以及所述类似物的药学上可接受的盐、酰胺或酯和所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯。
本发明进一步涉及这些化合物的药物用途，优选用于治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病(critical illness)和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
此外，本发明涉及呈侧链形式的中间产物，其对于制备本发明某些GLP-1衍生物是重要的。
本发明肽和衍生物具有生物活性。此外或替代地，它们具有延长的药代动力学概况。此外或替代地，它们对胃肠酶的降解稳定。此外或替代地，它们具有高的口服生物利用度。这些性质在开发下一代用于皮下、静脉内和/或特别是口服给予的GLP-1化合物中很重要。
发明详述
本发明涉及GLP-1类似物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述类似物包含对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的31位位置上的组氨酸残基和对应于GLP-1(7-37)的34位位置上的谷氨酰胺残基，和与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较，所述类似物包含最多10个氨基酸修饰；其中H残基被命名为H31，Q残基被命名为Q34。
本发明亦涉及该类似物的衍生物及其药学上可接受的盐、酰胺或酯；以及涉及所述衍生物和所述类似物的药物用途。
此外，本发明涉及两种中间产物(化学结构67和化学结构68)，其中PG表示保护基。
下文中，可通过其符号或相应的书面名称来表示希腊字母，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；等等。同样，希腊字母μ可由″u″来表示，例如在μl＝ul或μM＝uM中。
化学式中的星号(*)指明：i)连接点；ii)基团；和/或iii)非共享电子。
GIP-1类似物
本文所用术语“GLP-1类似物”或″GLP-1的类似物″，指为人胰高血糖素样肽-1(GLP-1(7-37))变体的肽或化合物，其序列作为SEQ ID NO：1包括在序列表中。具有序列SEQ ID NO：1的肽亦可被命名为″天然″GLP-1。
在序列表中，将SEQ ID NO：1(组氨酸)的第一个氨基酸残基指定为1号。然而，在下文中，按照本领域惯例，将该组氨酸残基称为7号，并相应地为随后的氨基酸残基编号，以37号甘氨酸结束。因此，本文任何提及GLP-1(7-37)序列的氨基酸残基编号或位置编号，通常为以7位His开始并以37位Gly结束的序列。
在特定实施方案中，本发明GLP-1类似物指经修饰的GLP-1(7-37)肽，其中与天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较，许多氨基酸残基被改变。这些改变或修饰可独立为一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失。
本发明GLP-1类似物可参考以下来阐述：i)对应于经修饰的氨基酸残基的天然GLP-1(7-37)中氨基酸残基的数目(即天然GLP-1的相应位置)；和ii)实际修饰。以下为本文所用的合适的类似物命名的非限制性的阐明性实例。
本发明化合物为GLP-1类似物GLP-1(7-37)，其包含对应于GLP-1(7-37)的31位位置上的组氨酸残基和对应于GLP-1(7-37)的34位位置上的谷氨酰胺残基，所述类似物与GLP-1(7-37)比较，包含最多10个氨基酸修饰，其中GLP-1(7-37)指具有SEQ ID NO：1的天然GLP-1(7-37)。
例如，若本发明类似物总计仅有两个氨基酸修饰，即明确提及两个修饰，这意味着所述类似物的氨基酸序列以另外的方式等同于天然GLP-1，那么这种类似物可例如被命名为(H31，Q34)-GLP-1(7-37)。这表示天然GLP-1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中31位W被H取代，34位的K被Q取代。该类似物亦可被命名为[His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽、[His31，Gln34]GLP-1(7-37)或简单地(31H、34Q)，其中暗指提及GLP-1(7-37)。
本发明类似物的另一实例为[Aib8，His31，Gln34]GLP-1-(7-37)，其具有总计3个氨基酸修饰，其中除31和34位的两处所述取代外，8位丙氨酸被α-氨基异丁酸(Aib)取代。该类似物可被简单命名为(8Aib，31H、34Q)，其中暗指提及GLP-1(7-37)。
作为再一实例，[Aib8，Glu30，His31，Gln34，Lys36]GLP-1(7-37)基-Glu指明另一本发明GLP-1(7-37)类似物，其总计具6个氨基酸修饰，其中8位丙氨酸被氨基异丁酸(Aib)取代，30位丙氨酸被谷氨酸取代，31位色氨酸被组氨酸取代，34位赖氨酸被谷氨酰胺取代，36位精氨酸被赖氨酸取代，谷氨酸被加到C-末端，在38位。可将该类似物简单命名为(8Aib，30E，31H，34Q，36K，38E)，其中暗指提及GLP-1(7-37)。
作为再一实例，与GLP-1(7-37)类似物相关的des7(或Des7)，指其中对应于GLP-1(7-37)N-末端氨基酸的氨基酸即组氨酸缺失的类似物。亦可将该类似物命名为GLP-1(8-37)。
同样，与GLP-1(7-37)类似物有关的(des7+des8)、(des7，des8)、(des7-8)或(Des7，Des8)，指其中两个N-末端氨基酸即组氨酸和丙氨酸缺失的类似物。亦可将该类似物命名为GLP-1(9-37)。
作为再一实例，″包含Des7或Imp7″的类似物，指当与天然GLP-1比较时，其分别包含7位组氨酸缺失或7位组氨酸被咪唑丙酸(Imp)取代的GLP-1(7-37)类似物。
当与SEQ ID NO：1比较时，″包含″某些特定修饰的类似物可包含另外的修饰。例如，包含Des7或Imp7的本发明类似物的非限制性实例为化学结构31、化学结构37、化学结构40和化学结构41的肽部分，除化学结构40外所有的都为本发明衍生物(化学结构40为本发明类似物)。
包含Des7、His31和Gln34的类似物的非限制性实例为以下：[Des7，His31，Gln34]GLP-1(7-37)肽和N8 3H-咪唑-4-基-乙酰基][His31，Gln34]GLP-1(8-37)-肽。在后一化合物中，His单肽模拟物经由酰胺键与新的N-末端Ala 8连接。
可用作缺失的N-末端氨基酸(如果真有的话)的取代物种类的合适的His-或His-Ala模拟物，包含杂环含氮芳环结构，例如吡啶或咪唑。优选His-或His-Ala模拟物为咪唑或吡啶的衍生物，而不是His和His-Ala的衍生物，在一个实施方案中，其具有含游离羧酸基团的取代基，可与肽的N-末端氨基酸的氨基形成酰胺键。术语咪唑指具相似环结构但取代基不同的杂环类的咪唑，对吡啶亦是这样。
从以上实例明显看出，可通过其全称、其一个字母的编码和/或其三个字母的编码来识别氨基酸残基。这三种方式完全等同。
可通过参考天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)，将表述“等同位置”或″相应位置″用于表征经修饰的GLP-1(7-37)序列的修饰位点。可通过以下方法容易地推论出等同或相应位置以及修饰的编号：例如通过简单手写及目测；和/或可使用标准蛋白质或肽比对程序，例如Needleman-Wunsch比对的″比对″。在Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48：443-453中阐述算法，由Myers和W.Miller在″Optimal Alignments in Linear Space(线性空间的最佳比对)″CABIOS(生物科学中的计算机应用)(1988)4：11-17中阐述比对程序。为了进行比对，可使用默认记分矩阵(default scoring matrix)BLOSUM50和默认单位矩阵，空隙中的第一个残基罚分可设为-12或优选-10，空隙中另外的残基罚分设为-2或优选-0.5。
下文中插入所述比对的实例，其中1号序列为SEQ ID NO：1，2号序列为其类似物(8Aib，30E，31H，34Q，36K，38E)：
#1：GLP-1(7-37)：
#2：GLP-1(7-37)_类似物：
#矩阵：EBLOSUM62
#空隙_罚分：10.0
#延伸_罚分：0.5
#长度：32
#同一性：26/32(81.2％)
#同一性：28/32(87.5％)
#空隙：1/32(3.1％)
#记分：132.0
1：1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG-    31
     |.|||||||||||||||||||||..||:|:|
2：1 HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEHLVQGKGE    32
在非天然氨基酸例如在序列中包括Imp、N-甲基-Ala和/或Aib的情况下，或在His-Ala模拟物情况下，为比对目的这些可用X取代。若需要后来可手工更正X。
例如在本发明类似物情境中所用术语“肽”，指包含由酰胺(或肽)键互相连接的一系列氨基酸的化合物。
在特定实施方案中，所述肽在很大程度上或主要由通过酰胺键互相连接的氨基酸组成(例如摩尔质量的至少50％、60％、70％、80％或至少90％)。在另一特定实施方案中，所述肽由通过肽键互相连接的氨基酸组成。
本发明肽包含由肽键连接的至少五个组分氨基酸。在特定实施方案中，所述肽包含至少10个、优选至少15、更优选至少20、甚至更优选至少25或最优选至少28个氨基酸。
在特定实施方案中，所述肽由至少五个组分氨基酸组成，优选由至少10、至少15、至少20、至少25个氨基酸组成，或最优选由至少28个氨基酸组成。
在另外的特定实施方案中，所述肽a)包含以下(composed of)或b)由以下组成(consist of)：i)29个氨基酸、ii)30个氨基酸、iii)31个氨基酸或iv)32个氨基酸。
在又一特定实施方案中，所述肽由通过肽键互相连接的氨基酸组成。
氨基酸为含有胺基和羧酸基团并任选一个或多个另外基团的分子，所述其它基团通常被称为侧链。
术语″氨基酸″包括成蛋白质性(proteogenic)氨基酸(由遗传密码编码，包括天然氨基酸和标准氨基酸)以及非成蛋白质性氨基酸(在蛋白质中未发现和/或不能用标准遗传密码编码)和合成氨基酸。因此，所述氨基酸可选自成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸和/或合成氨基酸。
不是由遗传密码编码的氨基酸的非限制性实例有γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸和磷酸丝氨酸。合成氨基酸的非限制性实例为氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸(在下文中，有时缩写为″a″，例如在″a8″中，其相应地指D-Ala8)和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、β-丙氨酸、N-甲基-丙氨酸和脱氨基-组氨酸(desH，备用名称为咪唑丙酸，缩写为Imp)。
在下文中，应该将未阐明光学异构体的所有氨基酸理解为意指L-异构体(除非另外规定)。
本发明GLP-1类似物和衍生物具有GLP-1活性。该术语指与GLP-1受体结合并启动信号转导途径从而导致促胰岛素作用或本领域已知的其它生理效应的能力。例如，可用本文实施例48所述测定来测定本发明类似物和衍生物的GLP-1活性。
GLP-1衍生物
本文在GLP-1肽或类似物情境中所用术语″衍生物”，意即化学修饰的GLP-1肽或类似物，其中一个或多个取代基与所述肽共价连接。取代基亦可被称为侧链。
在特定实施方案中，所述侧链具有至少10个碳原子或至少15、20、25、30、35或至少40个碳原子。在另一特定实施方案中，所述侧链可进一步包括至少5个杂原子，尤其是O和N，例如至少7、9、10、12、15、17或至少20个杂原子，例如至少1、2或3个N-原子和/或至少3、6、9、12或15个O-原子。
GLP-1衍生物的非限制性实例包括异源融合蛋白，或GLP-1类似物与以下物质的缀合物：例如与免疫球蛋白例如IgG的Fc部分、与人白蛋白、与抗体例如胰高血糖素结合抗体重链可变区或与任何这些物质的片段或类似物(参见例如US 2007/0161087、WO 2005/058958和WO 2007/124463 A2)。另外的实例包括PEG化的GLP-1肽(参见例如WO 2005/058954、WO 2004/093823和WO 2006/124529)以及酰化的GLP-1肽(参见例如WO 98/08871、WO2005/027978、WO 2006/097537和WO 2009/030771)。
在优选实施方案中，所述侧链能够与白蛋白形成非共价聚集物，由此促进衍生物随血流的循环，并亦具有延长衍生物的作用时间的作用，这是由于以下事实：GLP-1-衍生物和白蛋白的聚集物只能缓慢崩解释放活性药物成分。因此，优选的取代基或侧链整体来看可被称为白蛋白结合部分。
在另一特定实施方案中，白蛋白结合部分包含对白蛋白结合特别重要并藉此延长作用的部分，所述部分可因此被称为延长部分。该延长部分可相对于其与肽的连接点位于或靠近白蛋白结合部分的相反端。
在又一特定实施方案中，白蛋白结合部分包含在延长部分和与所述肽的连接点之间的部分，所述部分可被称为接头、接头部分、间隔子(spacer)等等。任选存在接头；因此，如果不存在接头，则白蛋白结合部分可等同于延长部分。
在特定实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分为亲脂性的，和/或在生理pH(7.4)时带负电荷。
所述白蛋白结合部分、延长部分或接头可通过缀合化学(例如通过烷化、酰化、酯形成或酰胺形成)与GLP-1肽的赖氨酸残基共价连接；或与半胱氨酸残基共价连接，例如通过马来酰亚胺或卤代乙酰胺(例如溴代-/氟代-/碘代-)偶联。
在优选实施方案中，任选具接头的白蛋白结合部分和/或延长部分的活性酯在形成酰胺键过程(该过程被称为酰化)中与赖氨酸残基的氨基(优选其ε氨基)共价连接。
除非另外指出，否则当提及赖氨酸残基的酰化时，应理解为其ε-氨基。
在一个实施方案中，本发明涉及包含(优选具有)与以下连接的白蛋白结合部分的衍生物：i)K12、ii)K16、iii)K18、iv)K22、v)K24、vi)K26、vii)K27、iix)K36和/或ix)K37。如上所解释，每一个残基的上标编号指GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)中的相应位置。此外，亦如上所解释，正常字体可用于代替上标来标明位置编号。例如，″K12″完全等同于″12K″。
优选由手写和目测或通过用合适的比对程序来确定相应位置编号，其如上所解释。
为本目的，术语″白蛋白结合部分″、″延长部分″和″接头″包括这些分子的未反应的形式以及反应的形式。从使用所述术语的情境中可明了其意指这种还是另一种形式。
在一个方面，白蛋白结合部分包含选自化学结构1、化学结构2、化学结构3和化学结构4的延长部分或由其组成：
化学结构1：CH3-(CH2)x-CO-*
化学结构2：HOOC-(CH2)x-CO-*
化学结构3：HN4C-(CH2)x-CO-*
化学结构4：HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*，
其中x为6-18范围内的整数，y为3-17范围内的整数。
在一个实施方案中，*-(CH2)x-*指直链或支链亚烷基，优选直链亚烷基，其中x为6-18范围内的整数。
在另一实施方案中，*-(CH2)y-*指直链或支链亚烷基，优选直链亚烷基，其中y为3-17范围内的整数。
在另一方面，白蛋白结合部分包含延长部分或由其组成，所述延长部分选自具任选被取代的末梢(末端)苯基或苯氧基的脂肪二酸和脂肪酸。任选苯基和苯氧基的取代基具有不高于150Da的摩尔质量，优选不高于125Da，更优选不高于100Da，甚至更优选不高于75Da或最优选不高于50Da。取代基实例包括但不限于低级线性或支链C1-C5烷基。
化学物质的摩尔质量(M)是一摩尔该物质的质量。以道尔顿来引用摩尔质量，符号为Da，且定义1Da＝1g/摩尔。
可根据标准原子量计算摩尔质量，其通常列入化学品目录中。通过将形成化合物的原子的标准原子量总和乘以摩尔质量常数Mu，来得到化合物的摩尔质量，Mu等于1g/摩尔。例如，叔丁基(C4H9)分子量为M(C4H9)＝([4×12.01]+[9×1.008])×1g/摩尔＝57Da。
国际纯粹化学与应用化学联合会(IUPAC)发布了标准原子量，并亦在多种多样的教科书、商业目录、挂图等中转载。
为了与GLP-1肽连接，脂肪酸的酸基或脂肪二酸的酸基之一与GLP-1肽的赖氨酸残基的ε氨基任选经由一个或多个接头形成酰胺键。
术语″脂肪酸″指脂肪族单羧酸，其具有4-28个碳原子，优选不分支和/或偶数数字，其可为饱和或不饱和的。
术语″脂肪二酸″指如上所定义但在ω位置有另一个羧酸基团的脂肪酸。因此，脂肪二酸为二羧酸。
命名法如本领域所常用，例如*-COOH以及HOOC-*指羧基；*-C6H4-*指亚苯基；*-CO-*以及*-OC-*指羰基(O＝C＜**)；和C6H5-O-*指苯氧基；和HN4C-*指任何四唑基基团。在特定实施方案中，芳族化合物例如苯氧基和亚苯基可独立为邻位、间位或对位。在另一特定实施方案中，四唑基为1H-四唑-5基。
在优选实施方案中，若存在接头部分则其具有5-30个C-原子，优选5-25个C-原子，更优选5-20个C-原子，或最优选5-17个C-原子。在另外的优选实施方案中。若存在接头部分则其具有4-20个杂原子，优选4-18个杂原子，更优选4-14个杂原子，或最优选4-12个杂原子。尤其优选杂原子实例为N-和O-原子。H-原子不是杂原子。
在另一实施方案中，接头包含至少一个OEG分子和/或至少一个谷氨酸残基，或更确切地说是相应基团(OEG指代8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的二-基团，即此基团：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*)。
氨基酸谷氨酸包含两个羧酸基团。优选用其γ-羧基与以下基团形成酰胺键：与赖氨酸的ε-氨基；或与OEG分子的氨基(若存在)，或与另一Glu残基的氨基(若存在)。Glu的氨基进而与以下基团形成酰胺键：与延长部分的羧基；或与OEG分子的羧基(若存在)；或与另一Glu的γ-羧基(若存在)。这种包含Glu的方式有时被简称为″γ-Glu″。
本发明衍生物可以以不同立体异构形式存在，所述立体异构形式具有相同分子式和键合原子次序，但仅在其原子的空间三维取向上不同。在实验部分用标准命名法在名称以及结构方面指出本发明例示性的衍生物的立体异构现象。除非另外指出，否则本发明涉及要求保护的衍生物的所有立体异构形式。
可用任何合适方法测定本发明GLP-1类似物和衍生物的血浆浓度。例如，可使用LC-MS(液相色谱质谱)或免疫测定，例如RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)和LOCI(光激化学发光免疫测定(Luminescence Oxygen Channeling Immunoasssay))。用于合适RIA和ELISA测定的一般方案可参见例如WO09/030738第116-118页。优选测定为LOCI测定。该测定在本文实施例51、实施例53和实施例55中阐述。
药学上可接受的盐、酰胺或酯
本发明类似物、衍生物和中间产物可呈药学上可接受的盐、酰胺或酯的形式。
例如，由碱和酸之间的化学反应形成盐，例如：NH3+H2SO4→(NH4)2SO4。
盐可为碱性盐、酸性盐，或其可既不是碱性盐也不是酸性盐(即中性盐)。碱性盐在水中产生氢氧离子而酸性盐产生水合氢离子。
可与所添加的阳离子或阴离子形成本发明类似物和衍生物的盐，所述添加的阳离子或阴离子分别与阴离子基团或阳离子基团反应。这些基团可位于肽部分和/或在本发明化合物的侧链中。
本发明化合物的阴离子基团的非限制性实例包括侧链的游离羧基(如果真有的话)以及肽部分的游离羧基。肽部分通常包括C-末端的游离羧酸基团，其亦可包括内部酸性氨基酸残基例如Asp和Glu的游离羧基。
肽部分的阳离子基团的非限制性实例包括N-末端的游离氨基(如果存在的话)以及内部碱性氨基酸残基例如His、Arg和Lys的游离氨基。
可例如让游离羧酸基团与醇或苯酚反应来形成本发明肽和衍生物的酯，这导致由烷氧基或芳氧基取代至少一个羟基。
酯形成可涉及肽C-末端的游离羧基和/或侧链中的任何游离羧基。
可例如通过让游离羧酸基团与胺或取代的胺反应，或通过让游离的或取代的氨基与羧酸反应，来形成本发明肽和衍生物的酰胺。
酰胺形成可涉及肽C-末端的游离的羧基、侧链中任何游离的羧基、肽N-末端的游离的氨基、和/或肽和/或侧链中的任何游离的或取代的氨基。
在特定实施方案中，所述肽或衍生物呈药学上可接受的盐形式。在另一特定实施方案中，所述肽或衍生物呈药学上可接受的酰胺形式，优选含肽C-末端的酰胺基团。在又一特定实施方案中，所述肽或衍生物呈药学上可接受的酯形式。
中间产物
本发明另外涉及两种中间产物(化学结构67和化学结构68)，其中PG表示保护基。PG基团的非限制性实例为-OH或功能化为活化酯的基团，例如但不限于OPfp、OPnp和OSuc。
其它合适的活化酯可例如按照M.Bodanszky，″Principles ofPeptide Synthesis″，第2版，Springer Verlag，1993的教导选择。
功能性质
在第一方面，本发明类似物和/或衍生物具有令人满意的效价。此外或替代地，在第二方面，它们具有延长的药代动力学概况。此外或替代地，在第三方面，它们具有抵抗胃肠酶降解的稳定性。此外或替代地，在第四方面，它们具有相对低的白蛋白结合亲和力。此外或替代地，在第五方面，它们具有高的口服生物利用度。
生物活性(效价)
按照第一方面，所述类似物和衍生物具有生物活性或有效。
在特定实施方案中，效价和/或活性指体外效价，即在功能GLP-1受体测定中的性能，更具体地指在表达克隆的人GLP-1受体的细胞系中刺激cAMP形成的能力。
可优选用以下方法测定在含有人GLP-1受体的培养基中对cAMP形成的刺激：用稳定转染的细胞系例如BHK467-12A(tk-ts13)；和/或用测定cAMP功能受体的测定，例如基于内源形成的cAMP和外源添加的生物素-标记的cAMP之间的竞争，其中测定cAMP更优选用特异性抗体来捕获，和/或其中甚至更优选测定为AlphaScreen cAMP测定，最优选实施例48中所述的测定。
术语半数最大有效浓度(EC50)通常指通过参考剂量反应曲线诱导基线和最大值之间的一半反应的浓度。将EC50用作化合物效价的量度，且EC50代表其中观察到其最大效应的50％的浓度。
可如上文所述测定本发明衍生物的体外效价，并测定目的衍生物的EC50。EC50越低，效价越高。
在特定实施方案中，培养基具有以下组成(测定中的最终浓度)：50mM TRIS-HCl；5mM HEPES；10mM MgCl2，6H2O；150mM NaCl；0.01％吐温；0.1％BSA；0.5mM IBMX；1mM ATP；1uM GTP；pH7.4。
备选培养基为：50mM Tris-HCl、1mM EGTA、1.5mM MgSO4、1.7mM ATP、20mM GTP、2mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01％吐温-20、pH 7.4。
在又一特定实施方案中，本发明类似物和/或衍生物具有以下EC50：4500pM或低于4500pM、优选低于4500pM、更优选低于4000pM、甚至更优选低于3500pM或最优选低于3000pM。
在另一特定实施方案中，本发明类似物和/或衍生物在体内有效，其可如本领域已知在任何合适的动物模型以及在临床试验中测定。
糖尿病db/db小鼠是合适动物模型的一个实例，在所述小鼠体内可测定降低血糖的作用，其例如如本文实施例54或如WO09/030738的实施例43所述。
此外或替代地，可在小型猪(minipig)药效学研究中体内测定对葡萄糖介导的胰岛素分泌的作用(IVGTT)，其例如如实施例55所述。
此外或替代地，可在猪药效研究中体内测定对采食量(feed intake)的作用，其例如如实施例56所述。
延长-受体结合-低和高白蛋白
按照第二方面，本发明类似物和/或衍生物具有延长的作用。
可如本文实施例49所述分别测定在低和高浓度白蛋白存在时本发明类似物和/或衍生物与GLP-1受体结合的能力。
通常在低白蛋白浓度时与GLP-1受体结合应该尽可能令人满意，其对应于低IC50值。
高白蛋白浓度时的IC50值是白蛋白对衍生物与GLP-1受体结合的影响的量度。众所周知，GLP-1衍生物亦结合白蛋白。通常这是所期需的作用，这延长了其在血浆中的寿命。因此，高白蛋白时的IC50值通常比低白蛋白时的IC50值高，对应于与GLP-1受体的结合降低，这是由白蛋白结合与GLP-1受体结合之间的竞争引起的。
因此，可将高比率(IC50值(高白蛋白)/IC50值(低白蛋白))作为以下的指征：目的衍生物与白蛋白令人满意的结合(可具有长半衰期)，且所述衍生物本身亦与GLP-1受体令人满意的结合(IC50值(高白蛋白)高和IC50值(低白蛋白)低)。在另一方面，白蛋白结合可能并不总是所期需的，或与白蛋白的结合可能太强。因此，IC50(低白蛋白)、IC50(高白蛋白)/和比率(高/低)的所期需范围可因化合物不同而变化，这视所预期的用途及围绕所述用途的情况并视可能感兴趣的其它化合物性质而定。
在特定实施方案中，在0.005％HSA(低白蛋白)存在时GLP-1受体结合亲和力(IC50)低于1000.00nM，优选低于600.00nM，更优选低于100.00nM，或最优选低于50.00nM。
在本文实施例49中公开了用于在高和低白蛋白浓度时测定受体结合的合适测定。
延长-大鼠体内半衰期
按照第二方面，本发明衍生物延长的作用。在特定实施方案中，延长可在i.v.给予后作为大鼠体内半衰期(T1/2)来测定。在另外的实施方案中，所述半衰期为至少4小时，优选至少5小时，甚至更优选至少6小时，或最优选至少7小时。
在本文实施例51中公开了用于i.v.给予后在大鼠体内测定半衰期的合适的测定。
延长-小型猪体内半衰期
按照第二方面，本发明衍生物具有延长的作用。在特定实施方案中，延长可在i.v.给予小型猪后作为体内半衰期(T1/2)来测定。在另外的实施方案中，所述半衰期为至少8小时，优选至少12小时，更优选至少16小时，甚至更优选至少24小时，甚至更优选至少36小时，或最优选至少48小时。
用于在i.v.给予小型猪后体内测定半衰期的合适测定公开于本文实施例52中。
胃肠酶降解
按照第三方面，本发明类似物和/或衍生物对一种或多种胃肠酶的降解为稳定的或稳定化的。
胃肠酶包括但不限于外肽酶和内肽酶，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性酶和羧肽酶。可以对呈纯化酶形式或呈来自胃肠系统的提取物形式的这些胃肠酶的稳定性进行测试。
在特定实施方案中，本发明类似物或衍生物在大鼠小肠提取物中的体外半衰期(T1/2)除以相应的GLP-1(7-37)半衰期(T1/2)至少为1，优选高于1.0，更优选为至少1.2，还更优选为至少2.0，甚至更优选为至少3.0，或最优选为至少4.0。换言之，可限定每一种衍生物的比率(SI)，即目的衍生物在大鼠小肠提取物中的体外半衰期(T1/2)除以相应的GLP-1(7-37)半衰期(T1/2)。
用于在大鼠小肠提取物测定体外半衰期的合适测定公开于本文实施例50中。
在另外的特定实施方案中，与以下化合物比较，改进了用合适方法例如实施例50中的一种测定的本发明衍生物的酶稳定性：a)WO2009/030771的实施例68的化合物；b)WO 2009/030771的实施例69的化合物；和/或c)WO 2009/030771的实施例71的化合物。
白蛋白结合亲和力
按照第四方面，本发明衍生物与人血清白蛋白HSA具有相对低的结合亲和力。
尽管从延长的观点来看通常期需一定水平的白蛋白结合，但与白蛋白结合不应该太紧密，因为这可能潜在地负面影响衍生物与GLP-1受体的结合，而所述结合对生物活性很重要。
可用任何合适的方法测定与HSA的结合亲和力，例如本文实施例57中的一种方法。
与HSA的结合亲和力可表示为Kd或Kd表观常数，其中Kd为解离常数，其指引起与HSA结合的衍生物的化学平衡方程式。
解离常数(Kd)越小，GLP-1衍生物和HSA之间的结合亲和力越高。
因此，按照第四方面，本发明衍生物的Kd或表观Kd可相对高，其对应于相对低的与HSA结合。
然而，在特定实施方案中，这些与HSA具相对低结合的衍生物意想不到地仍然具有增加的酶稳定性，尤其是抵抗胃肠酶的降解，其中可如本文实施例50所述测定酶稳定性。亦具体参考以上标题为″胃肠酶降解″的部分。
增加的酶稳定性与低白蛋白结合亲和力联合，提供增加血浆中类似物或衍生物的游离部分的可能性，藉此提高体内效价。与已知通常具有高白蛋白结合亲和力的GLP-1衍生物比较，关于血浆半衰期其亦提供更宽的设计范围，因为到目前为止焦点主要是延长半衰期。
口服生物利用度
按照第五方面，本发明衍生物具有高的口服生物利用度。
市售GLP-1衍生物的口服生物利用度极低。开发中用于i.v.或s.c.给予的GLP-1衍生物的口服生物利用度亦低。
因此，本领域需要已改进口服生物利用度的GLP-1衍生物。所述衍生物可为口服给药的合适候选物，只要其效价总体上令人满意，和/或只要其半衰期总体上亦令人满意即可。
本发明人鉴定了新类型的GLP-1衍生物，其意想不到地具有高的口服生物利用度，同时具有令人满意的效价和/或半衰期。
在特定实施方案中，意想不到地，这些具有高的口服生物利用度的衍生物，亦在低浓度白蛋白时与GLP-1受体具有高结合亲和力(即低IC50值)。为了获得低的口服日剂量的活性药物成分，这些特征很重要，所述获得低的口服日剂量的活性药物成分是期需的，这出于多种原因，包括例如生产的经济性、潜在安全性问题的可能性以及给药舒适性问题和环境问题。
在另一特定实施方案中，意想不到地，这些具有高的口服生物利用度的衍生物亦表现出相对低的与人血清白蛋白(HSA)的结合，其中与HSA结合可例如如本文实施例57所述测定。亦具体参考以上标题为″白蛋白结合亲和力″的部分。
高的口服生物利用度与低白蛋白结合亲和力联合，提供降低活性药物成分剂量的可能性，其因各种原因为所期需，所述原因包括例如：生产的经济性、潜在的安全性问题的可能性以及给药舒适性问题和环境问题。与已知通常具有高白蛋白结合亲和力的GLP-1衍生物比较，关于血浆半衰期其亦提供更宽的设计范围。
本发明术语类似物或衍生物的生物利用度，通常指给予的活性药物成分(API)例如本发明类似物或衍生物的剂量不变地到达体循环的部分。根据定义，当静脉内给予API时，其生物利用度为100％。然而，当经由其它途径(例如经口)给予API时，其生物利用度降低(由于不完全吸收和首过代谢)。当计算用于非静脉内给药途径的剂量时，了解生物利用度是必需的。
口服的绝对生物利用度比较口服给药后API在体循环中的生物利用度(估测为曲线下面积或AUC)与静脉内给予同一API后的生物利用度。其为与相应的静脉内给予同一API比较，通过非静脉内给予所吸收的API的部分。如果使用不同剂量，应该使剂量标准化来比较；因此，每一AUC都通过除相应的给予剂量来校正。
在口服和静脉内给予后用血浆API浓度对时间作图。绝对生物利用度(F)是校正剂量的口服AUC除以静脉内AUC。
本发明衍生物具有高于a)利拉糖肽和/或b)司美鲁肽的口服绝对生物利用度；优选高至少10％，更优选高至少20％，甚至更优选高至少30％或最优选高至少40％。在测定口服生物利用度之前，可如促胰岛素化合物的口服制剂领域所知，合适地配制本发明类似物和/或衍生物，其例如用WO 2008/145728中所述的任何一种或多种配方。
如实施例53所述开发测定，发现所述测定能很好地预测口服生物利用度。按照该测定，在将GLP-1衍生物直接注射到大鼠肠腔后，测定其在血浆中的浓度(暴露)，计算t＝30分钟的血浆浓度(皮摩尔/升)除以给药溶液中的浓度(微摩尔/升)的比率。该比率是肠生物利用度的量度，其显示与实际口服生物利用度数据很好地相关。
本发明衍生物的另外特定实施方案阐述于实验部分之前标题为″特定实施方案″的部分。
制备方法
肽例如GLP-1(7-37)及其类似物的制备在本领域众所周知。
本发明类似物或其片段可例如通过经典的肽合成，例如用t-Boc或Fmoc化学的固相肽合成或其它充分建立的技术来制备，参见例如Greene和Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley &Sons，1999；Florencio Zaragoza
Figure BDA00001770475400191
“Organic Synthesis on solidPhase”，Wiley-VCH Verlag GmbH，2000；和“Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis”，由W.C.Chan和P.D.White编辑，Oxford University Press，2000。
此外或替代地，其可由重组方法制备，即通过培养含有编码该片段的DNA序列并能够在允许表达该肽的条件下于合适营养培养基中表达所述肽的宿主细胞来实现。适于表达这些肽的宿主细胞的非限制性实例为大肠杆菌(Escherichia coli)、啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)以及哺乳动物BHK或CHO细胞系。
可例如如实验部分所述来产生包括非天然氨基酸和/或共价连接的N-末端单-或二肽模拟物的本发明那些类似物。或参见Hodgson等：″The synthesis of peptides and proteins containing non-natural aminoacids(含有非天然氨基酸的肽和蛋白质的合成)″，Chemical SocietyReviews，第33卷第7期(2004)，第422-430页；和标题为″GLP-1类似物的半重组制备的WO 2009/083549 A1″。
制备多种本发明类似物和衍生物的方法的具体实例包括在实验部分。
药物组合物
可如本领域所知制备药物组合物，其包含本发明类似物或衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺、烷化物(alkyl)或酯及药学上可接受的赋形剂。
术语″赋形剂″广泛指活性治疗成分以外的任何组分。赋形剂可为惰性物质。在另一实施方案中，其为非活性物质和/或无医药活性的物质。
赋形剂可满足不同目的，例如作为载体、溶媒、稀释剂、片剂助剂和/或改进活性物质的给予和/或吸收。
药物活性成分与各种赋形剂的配制为本领域已知，参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)和任何以后的版本)。
赋形剂的非限制性实例为：溶剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。
制剂实例包括液体制剂，即水性(即包含水)制剂。液体制剂可为溶液剂或混悬剂。水性制剂通常包含至少50％w/w的水或至少60％、70％、80％或甚至至少90％w/w的水。
或者，药物组合物可为固态制剂，例如冻干或喷干组合物，其可原样使用，或医生或患者在临用前向其中加入溶剂和/或稀释剂使用。
水性制剂的pH可为pH 3-pH 10之间的任何值，例如约7.0-约9.5；或约3.0-约7.0。
药物组合物可包含缓冲剂。缓冲剂可例如选自：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、曲辛(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸及其混合物。
药物组合物可包含防腐剂。防腐剂可例如选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、氯丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇(bronopol)、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3p-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)及其混合物。防腐剂可以以0.1mg/ml-20mg/ml的浓度存在。
药物组合物可包含等渗剂。等渗剂可例如选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇(sugar alcohol)、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(alditol)(例如丙三醇(甘油)、1，2-丙烷二醇(丙二醇)、1，3-丙烷二醇、1，3-丁烷二醇)聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。可使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、支链淀粉、糊精、环糊精、α和βHPCD、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。糖醇(sugaralcohol)可被定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂为甘露醇。
药物组合物可包含螯合剂。螯合剂可例如选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐及其混合物。
药物组合物可包含稳定剂。稳定剂可例如为一种或多种氧化抑制剂、聚集抑制剂、表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。这些各种各样的稳定剂的非限制性实例在以下揭示。
术语″聚集物形成″指多肽分子之间导致形成寡聚物的物理相互作用，其可保持可溶性或从溶液沉淀为可见的大聚集物。在液态药物组合物储存期间由多肽形成聚集物可有害影响该多肽的生物活性，导致损失药物组合物的治疗功效。此外，聚集物形成可产生其它问题，例如当将含多肽的药物组合物用输注系统给予时堵塞管、膜或泵。
药物组合物可包含足以在组合物储存期间降低多肽的聚集物形成的氨基酸碱的量。术语″氨基酸碱″指一种或多种氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)或其类似物。任何氨基酸可以以其游离碱形式或以其盐形式存在。可存在氨基酸碱的任何立体异构体(即L、D或其混合物)。
当作为治疗剂起作用的多肽为包含对下述氧化易感的至少一个甲硫氨酸残基的多肽时，可加入甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基氧化为亚砜甲硫氨酸。可使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。
药物组合物可包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。稳定剂可例如选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如一硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇和不同的盐(例如氯化钠)。
药物组合物可包含：另外的稳定剂，例如但不限于甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽免于甲硫氨酸氧化；和非离子表面活性剂，其保护多肽免于与冻融或机械剪切相关的聚集。
药物组合物可包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”指由水溶性(亲水)部分和脂溶性(亲脂)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可例如选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。
药物组合物可包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如EDTA(乙二胺四乙酸)和/或苄脒HCl。
另外任选药物组合物成分包括例如：湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶)和/或两性离子(例如氨基酸例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
可进一步如促胰岛素化合物的口服制剂领域所知配制药物组合物，例如用WO 2008/145728中所述的任何一种或多种配方。
给予的剂量可含有0.01mg-100mg的类似物或衍生物，或0.01-50mg或0.01-20mg或0.01-10mg。
可呈药物组合物形式给予本发明衍生物。可在若干位点将其给予有需要的患者，例如在局部位点，例如皮肤或粘膜位点；在旁路吸收位点，例如在动脉、静脉或心脏中；和在涉及吸收的位点，例如在皮肤中，在皮下、在肌肉中或在腹部。
给药途径可例如为：经舌给药；舌下给药；含服给药；经口给药；口服给药；经胃给药；经肠给药；经鼻给药；经肺给药，例如通过细支气管、肺泡或其组合；胃肠外给药、表皮给药；皮肤给药；透皮给药；结膜给药；输尿管给药；阴道给药；直肠给药；和/或经眼给药。在特定实施方案中，组合物可为口服组合物，给药途径为口服。
组合物可以以若干剂型给予，例如作为溶液剂；混悬剂；乳剂；微乳剂；复合型乳剂；泡沫剂；药膏；糊剂；硬膏剂；软膏剂；片剂；包衣片剂；口香糖；冲洗剂(rinse)；胶囊剂，例如硬或软明胶胶囊剂；栓剂；直肠胶囊剂；滴剂；凝胶剂；喷雾剂；粉剂；气雾剂；吸入剂；滴眼液；眼膏剂；眼用冲洗剂(ophthalmic rinse)；阴道栓剂；阴道环；阴道软膏剂；注射溶液剂；原位转化溶液剂，例如原位凝胶剂、沉降剂、沉淀剂和原位结晶剂；输注溶液剂；或作为植入剂。组合物可为片剂(任选包衣片剂)、胶囊剂或口香糖。
组合物可进一步与药物载体或药物递送系统配混(compound)，例如，以便改进稳定性、生物利用度和/或溶解性。在特定实施方案中，组合物可通过共价、疏水和/或静电相互作用与所述系统连接。所述配混的目的可为例如降低有害作用、实现时间治疗和/或提高患者的依从性。
组合物亦可用于控释、持续释放、延长释放、延迟释放和/或缓慢释放药物递送系统的制剂中。
胃肠外给药可通过借助注射器(任选笔式注射器)或借助输注泵在皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射来实施。
组合物可呈溶液剂、混悬剂或粉剂形式经鼻给予；或其可呈液体或粉末喷雾剂形式经肺给予。
透皮给药是再另一选择，例如通过无针注射，自贴剂例如离子导入贴剂，或经由透粘膜途径例如经含服。
组合物可为稳定制剂。术语“稳定制剂”指具提高的物理和/或化学稳定性(优选二者都提高)的制剂。一般而言，制剂应该在使用和储存(依从推荐的使用和储存条件)期间稳定，直到到达其有效期。
术语“物理稳定性”指多肽因暴露于热-机械应力和/或与去稳定界面及表面(例如疏水表面)相互作用而形成生物学非活性和/或不可溶的聚集物的趋势。水性多肽制剂的物理稳定性可通过在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅拌)达不同时间后，借助目视检查和/或通过浊度测量来评估。或者，可用多肽构象状态的光谱试剂或探针例如硫黄素T或“疏水块(hydrophobic patch)”探针来评估物理稳定性。
术语“化学稳定性”指导致形成化学降解产物的多肽结构中的化学(尤其是共价)变化，所述降解产物与完整多肽比较可能具有降低的生物学效价和/或增加免疫原性作用。化学稳定性可通过在暴露于不同的环境条件后于不同时间点(例如通过SEC-HPLC和/或RP-HPLC)测量化学降解产物的量来评估。
用本发明衍生物的治疗亦可与一种或多种另外的药理活性物质联合，所述药理活性物质例如选自抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、食欲调节药剂、抗高血压药剂、用于治疗和/或预防因糖尿病而产生的并发症或与糖尿病有关的并发症的药剂和用于治疗和/或预防因肥胖症而产生的并发症和病症或与肥胖症有关的并发症和病症的药物。这些药理活性物质实例为：胰岛素、磺酰脲、双胍类、氯茴苯酸类、糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、参与刺激糖异生和/或糖原分解的肝酶抑制剂、葡萄糖吸收调节剂、改变脂质代谢的化合物，例如降高血脂药剂如HMG CoA抑制剂(他汀类)、胃抑制性多肽(GIP类似物)、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于β-细胞的ATP-依赖性钾通道的药剂；消胆胺(Cholestyramine)、考来替泊(colestipol)、氯贝丁酯(clofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普罗布考(probucol)、右旋甲状腺素、那格列奈(neteglinide)、瑞格列奈(repaglinide)；β-阻断剂，例如阿普洛尔(alprenolol)、阿替洛尔(atenolol)、噻吗洛尔(timolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)和美托洛尔(metoprolol)；ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂，例如贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、alatriopril、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)；钙通道阻断剂，例如硝苯地平(nifedipine)、非洛地平(felodipine)、尼卡地平(nicardipine)、伊拉地平(isradipine)、尼莫地平(nimodipine)、地尔硫卓(diltiazem)和维拉帕米(verapamil)；和α-阻断剂，例如多沙唑嗪(doxazosin)、乌拉地尔(urapidil)、哌唑嗪(prazosin)和特拉唑嗪(terazosin)；CART(可卡因苯丙胺调节的转录物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、Y2受体激动剂、Y4受体激动剂、混合型Y2/Y4受体激动剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、阿立新(orexin)拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮质素(urocortin)激动剂、β3激动剂、泌酸调节肽和类似物、MSH(促黑素细胞激素)激动剂、MCH(黑素细胞浓集激素)拮抗剂、CCK(缩胆囊素)激动剂、血清素再吸收抑制剂、血清素和去甲肾上腺素再吸收抑制剂、混合的血清素和去甲肾上腺素能化合物、5HT(血清素)激动剂、铃蟾肽激动剂、甘丙肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3(解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦蛋白激动剂、DA激动剂(溴隐亭(bromocriptin)、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(类视黄醇X受体)调节剂、TR β激动剂；组胺H3拮抗剂，胃抑制性多肽激动剂或拮抗剂(GIP类似物)、胃泌素和胃泌素类似物。
用本发明衍生物的治疗亦可与影响葡萄糖水平和/或脂质稳态平衡的手术联合，所述手术例如胃囊带术或胃旁路术。
药物适应症
本发明亦涉及用作药物的本发明类似物和本发明衍生物。
在特定实施方案中，本发明类似物和衍生物可用于以下医药治疗，所有医药治疗都优选以一种方式或另一种方式与糖尿病有关：
(i)预防和/或治疗所有形式的糖尿病，例如高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、MODY(青春晚期糖尿病)、妊娠期糖尿病和/或用于降低HbA1C；
(ii)延迟或防止糖尿病进展，例如2型糖尿病进展；延迟糖耐量减低(IGT)发展为需要胰岛素的2型糖尿病，和/或延迟不需要胰岛素的2型糖尿病发展为需要胰岛素的2型糖尿病；
(iii)改进β-细胞功能，例如降低β-细胞的细胞凋亡、增加β-细胞功能和/或β-细胞质量和/或用于恢复β-细胞对葡萄糖的敏感性；
(iv)预防和/或治疗认知障碍；
(v)预防和/或治疗进食障碍，例如肥胖症，例如通过降低食物摄取、降低体重、抑制食欲、诱导饱满感；治疗或预防暴食症(binge eatingdisorder)、神经性贪食症和/或通过给予抗精神病药物或类固醇诱导的肥胖症；降低胃能动性；和/或延迟胃排空；
(vi)预防和/或治疗糖尿病并发症，例如包括外周神经病在内的神经病；肾病；或视网膜病；
(vii)改进脂质参数，例如预防和/或治疗血脂障碍、降低总血清脂质；降低HDL；降低小、密LDL；降低VLDL：降低甘油三酯；降低胆固醇；增加HDL；降低人载脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；在体外和/或体内抑制脂蛋白a(apo(a))的产生；
(iix)预防和/或治疗心血管疾病，例如：综合征X；动脉粥样硬化；心肌梗塞；冠心病；中风、脑缺血；早期心脏疾病或早期心血管疾病，例如左心室肥厚；冠状动脉病；原发性高血压；急性高血压急症；心肌病；心功能不全；运动耐量；慢性心力衰竭；心律失常；心律紊乱；晕厥(syncopy)；动脉粥样硬化；轻度慢性心力衰竭；心绞痛；心脏分流再封堵(cardiac bypass reocclusion)；间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)；舒张功能障碍；和/或收缩功能障碍；
(ix)预防和/或治疗胃肠疾病，例如炎性肠病综合征；小肠综合征或克罗恩病；消化不良；和/或胃溃疡；
(x)预防和/或治疗危重病，例如治疗病危患者、重症多发性肾病(critical illness poly-nephropathy，CIPNP)患者和/或潜在的CIPNP患者；预防CIPNP危重病或发展；预防、治疗和/或治愈患者的全身炎症反应综合征(SIRS)；和/或用于预防或降低患者在住院期间患菌血症、败血症和/或感染性休克的可能性；和/或
(xi)预防和/或治疗多囊性卵巢综合征(PCOS)。
在特定实施方案中，适应症选自：(i)-(iii)和(v)-(iix)，例如适应症(i)、(ii)和/或(iii)；或适应症(v)、适应症(vi)、适应症(vii)和/或适应症(iix)。
在另一特定实施方案中，适应症为(i)。在又一特定实施方案中，适应症为(v)。在再一特定实施方案中，适应症为(iix)。
特别优选以下适应症：2型糖尿病和/或肥胖症。
特定实施方案
以下为本发明特定实施方案：
1.GLP-1类似物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述类似物包含对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的31位位置的组氨酸(H)残基和对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的34位位置的谷氨酰胺(Q)残基，和与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较，所述类似物包含最多10个氨基酸修饰；其中H残基被命名为H31，Q残基被命名为Q34。
2.实施方案1的类似物，其具有最多9个氨基酸修饰。
3.实施方案1的类似物，其具有最多8个氨基酸修饰。
4.实施方案1的类似物，其具有最多7个氨基酸修饰。
5.实施方案1的类似物，其具有最多6个氨基酸修饰。
6.实施方案1的类似物，其具有最多5个氨基酸修饰。
7.实施方案1的类似物，其具有最多4个氨基酸修饰。
8.实施方案1的类似物，其具有最多3个氨基酸修饰。
9.实施方案1的类似物，其具有最多2个氨基酸修饰。
10.实施方案1-9中任一个的类似物，其具有最少2个氨基酸修饰。
11.实施方案1-8中任一个的类似物，其具有最少3个氨基酸修饰。
12.实施方案1-7中任一个的类似物，其具有最少4个氨基酸修饰。
13.实施方案1-6中任一个的类似物，其具有最少5个氨基酸修饰。
14.实施方案1-5中任一个的类似物，其具有最少6个氨基酸修饰。
15.实施方案1-4中任一个的类似物，其具有最少7个氨基酸修饰。
16.实施方案1-3中任一个的类似物，其具有最少8个氨基酸修饰。
17.实施方案1-2中任一个的类似物，其具有最少9个氨基酸修饰。
18.实施方案1的类似物，其具有最少10个氨基酸修饰。
19.实施方案1的类似物，其具有2个氨基酸修饰。
20.实施方案1的类似物，其具有3个氨基酸修饰。
21.实施方案1的类似物，其具有4个氨基酸修饰。
22.实施方案1的类似物，其具有5个氨基酸修饰。
23.实施方案1的类似物，其具有6个氨基酸修饰。
24.实施方案1的类似物，其具有7个氨基酸修饰。
25.实施方案1的类似物，其具有8个氨基酸修饰。
26.实施方案1的类似物，其具有9个氨基酸修饰。
27.实施方案1的类似物，其具有10个氨基酸修饰。
28.实施方案1-27中任一个的类似物，其中所述氨基酸修饰独立为取代、添加和/或缺失。
29.实施方案1-28中任一个的类似物，其中所述氨基酸修饰为取代。
30.实施方案1-28中任一个的类似物，其中所述氨基酸修饰为缺失。
31.实施方案1-28中任一个的类似物，其中所述氨基酸修饰为添加。
32.实施方案1-31中任一个的类似物，其具有C-末端酰胺。
33.实施方案1-31中任一个的类似物，其具有C-末端*-COOH基团。
34.实施方案1-33中任一个的类似物，其中所述氨基酸修饰在对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)中的以下位置的一个或多个位置：7、8、12、16、18、22、24、25、26、27、30、31、34、36、37和/或38。
35.实施方案1-34中任一个的类似物，其中非H31和Q34的氨基酸修饰选自以下：(Des7或Imp7)、(Des8，Aib8，N-甲基-Ala8，D-Ala8，G8或S8)、K12、K16、K18、(E22或K22)、K24、I25、(R26或H26)、K27、E30、H31、Q34、K36、(K37或p37)和/或(E38或K38)。
36.实施方案1-35中任一个的类似物，其包含i)Des7或ii)Imp7；优选ii)Imp7。
37.实施方案1-36中任一个的类似物，其包含i)Des8、ii)Aib8、iii)D-Ala8、iv)N-甲基-Ala8、v)G8或vi)S8；优选iii)D-Ala8、iv)N-甲基-Ala8、v)G8或vi)S8；更优选v)G8或vi)S8；甚至更优选iii)D-Ala8或iv)N-甲基-Ala8；或最优选ii)Aib8。
38.实施方案1-37中任一个的类似物，其包含K12。
39.实施方案1-38中任一个的类似物，其包含K16。
40.实施方案1-39中任一个的类似物，其包含K18。
41.实施方案1-40中任一个的类似物，其包含i)E22或ii)K22，优选i)E22。
42.实施方案1-41中任一个的类似物，其包含K24。
43.实施方案1-42中任一个的类似物，其包含I25。
44.实施方案1-43中任一个的类似物，其包含i)R26或ii)H26；优选i)R26。
45.实施方案1-44中任一个的类似物，其包含K27。
46.实施方案1-45中任一个的类似物，其包含E30。
47.实施方案1-46中任一个的类似物，其包含K36。
48.实施方案1-47中任一个的类似物，其包含i)K37或ii)P37；优选i)K37。
49.实施方案1-48中任一个的类似物，其包含i)E38或ii)K38；优选i)E38。
50.实施方案1-49中任一个的类似物，其包含(优选具有)以下氨基酸修饰：(i)(31H，34Q)；(ii)(31H，34Q，37K)；(iii)(8G，31H，34Q)；(iv)(8Aib，31H，34Q)；(v)(8a，31H，34Q)；(vi)(des7，31H，34Q)；(vii)(8S，31H，34Q)；(iix)(8-N-甲基-A，31H，34Q)；(ix)(des7-8，31H，34Q)；(x)(8Aib，31H，34Q，38K)；(xi)(8Aib，12K，31H，34Q)；(xii)(8Aib，31H，34Q，37K)；(xiii)(22K，26R，31H，34Q)；(xiv)(22E，24K，26R，31H，34Q)；(xv)(12K，22E，26R，31H，34Q)；(xvi)(8Aib，26R，27K，31H，34Q)；(xvii)(7Imp，22E，26R，31H，34Q，37K)；(iixx)(8Aib，30E，31H，34Q，36K，38E)；(ixx)(8Aib，12K，22E，26R，31H、34Q)；(xx)(8Aib，18K，22E，26R，31H，34Q)；(xxi)(8Aib，18K，22E，26H，31H，34Q)；(xxii)(8Aib，22E，26R，27K，31H，34Q)；(xxiii)(8Aib，22E，24K，26R，31H，34Q)；(xiv)(8Aib，25I，26R，27K，31H，34Q)；(xv)(8Aib，16K，22E，26R，31H，34Q)；或(xvi)(8Aib，22E，26R，27K，30E，31H，34Q，37P)；优选化学结构20、化学结构22、化学结构41、化学结构44或化学结构45。
51.实施方案1-50中任一个的类似物，其中与GLP-1(7-37)(SEQ IDNO：1)比较，至少一个氨基酸残基缺失。
52.实施方案1-51中任一个的类似物，其包含des7和/或des8，优选包含二者。
53.实施方案1-52中任一个的类似物，其中对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的7位位置的一个氨基酸缺失。
54.实施方案1-53中任一个的类似物，其中对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的8位位置的一个氨基酸缺失。
55.实施方案1-54中任一个的类似物，其中对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的7和8位位置的两个氨基酸缺失。
56.实施方案1-55中任一个的类似物，其为与GLP-1(7-37)(SEQID NO：1)比较具有多达10、9、8或6个氨基酸修饰的GLP-1(8-37)(SEQID NO：1的氨基酸2-31)类似物。
57.实施方案1-56中任一个的类似物，其为与GLP-1(7-37)(SEQID NO：1)比较具有多达10、9、8或6个氨基酸修饰的GLP-1(9-37)(分别是SEQ ID NO：1的氨基酸3-31)类似物。
58.实施方案1-57中任一个的类似物，其中His-模拟物而非His在对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的2位位置。
59.实施方案1-58中任一个的类似物，其中His-Ala-模拟物而非His-Ala在对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的7和8位位置。
60.实施方案58-59中任一个的类似物，其中所述His-模拟物或His-Ala模拟物包含：a)咪唑；或b)吡啶。
61.实施方案60的类似物，其中所述咪唑为咪唑衍生物，其包含用于经由形成酰胺键与所述类似物的N-末端氨基酸的*-NH共价偶联的*-CO末端。
62.实施方案60的类似物，其中所述吡啶为吡啶衍生物，其包含用于经由形成酰胺键与所述类似物的N-末端氨基酸的*-NH共价偶联的*-CO末端。
63.实施方案61的类似物，其中所述咪唑衍生物被单取代。
64.实施方案62的类似物，其中所述吡啶衍生物被单取代。
65.实施方案61和63中任一个的类似物，其中所述咪唑衍生物被包含具有1-6个碳原子的低级烷基的羧酸基团的基团取代。
66.实施方案62和64中任一个的类似物，其中所述吡啶衍生物被包含具有1-6个碳原子的低级烷基的羧酸基团的基团取代。
67.实施方案65-66中任一个的类似物，其中所述羧酸基团选自乙酰基；和直链或支链丙酰基、丁酰基、戊酰基；优选乙酰基。
68.实施方案1-67中任一个的类似物，其中对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的8位位置的氨基酸残基具有与其N-原子连接的3H-咪唑-4-基-乙酰基。
69.实施方案1-68中任一个的类似物，其中对应于SEQ ID NO：1的8位位置氨基酸残基为丙氨酸。
70.实施方案60-69中任一个的类似物，其中所述咪唑被以下基团取代：(甲基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基、(乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基、(丙基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基或(丁基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基；优选(乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基。
71.实施方案1-70中任一个的类似物，其中对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的9位位置的氨基酸残基具有与其N-原子连接的{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}。
72.实施方案60-71中任一个的类似物，其中所述吡啶被以下基团取代：(甲基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基、(乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基、(丙基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基或(丁基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基；优选(甲基氨基甲酰基)-2-甲基-丙酰基。
73.实施方案1-72中任一个的衍生物，其中对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的9位位置的氨基酸残基具有与其N-原子连接的[2，2-二甲基-3-氧-3-(吡啶-2-基甲基氨基)丙酰基]。
74.实施方案1-73中任一个的类似物，其中对应于GLP-1类似物的9位位置的氨基酸残基为谷氨酸。
75.实施方案1-74中任一个的类似物，其具有最多两个K残基。
76.实施方案1-75中任一个的类似物，其具有最多一个K残基。
77.实施方案1-76中任一个的类似物，其中由手写和目测来确定：
a)对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)任何指定位置的位置；和/或
b)与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较氨基酸修饰的数目。
78.实施方案1-77中任一个的类似物，其中通过使用标准蛋白或肽比对程序来确定：
a)对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)任何指定位置的位置；和/或
b)与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较氨基酸修饰的数目。
79.实施方案78的类似物，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。
80.实施方案78-79中任一个的类似物，其中使用默认记分矩阵和默认单位矩阵。
81.实施方案78-80中任一个的类似物，其中所述记分矩阵为BLOSUM62。
82.实施方案78-81中任一个的类似物，其中空隙中第一个残基的罚分为-10(负十)。
83.实施方案78-82中任一个的类似物，其中空隙中另外残基的罚分为-0.5(负零点五)。
84.实施方案1-83中任一个的类似物，其中与实施方案1中的H31和Q34定义类似，在氨基酸残基后上标的残基编号(优选任何残基编号)或在目的氨基酸残基之前或后的正常字体的残基编号(优选任何残基编号)，指GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)中的相应位置。
85.实施方案1-84中任一个的类似物的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
86.实施方案85的衍生物，其具有经由酰胺键与所述类似物的赖氨酸残基，更优选与其ε-氨基连接的白蛋白结合部分。
87.实施方案86的衍生物，其具有与以下连接的白蛋白结合部分：i)K12、ii)K16、iii)K18、iv)K22、v)K24、vi)K26、vii)K27、iix)K36和/或ix)K37，其中上标中的每一个残基编号指GLP-1(7-37)(SEQ IDNO：1)中的相应位置。
88.实施方案87的衍生物，其具有与以下连接的白蛋白结合部分：i)K12、iii)K18、vi)K26和/或vii)K27；优选vi)K26。
89.实施方案87的衍生物，其具有与以下连接的白蛋白结合部分：i)K12、iii)K18、v)K24、vi)K26和/或vii)K27。
90.实施方案87-88中任一个的衍生物，其具有与以下连接的白蛋白结合部分：i)K12、vi)K26和/或vii)K27。
91.实施方案87的衍生物，其具有优选与K26和K37连接的两个白蛋白结合部分。
92.实施方案85-91中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含延长部分。
93.实施方案92的衍生物，其中所述延长部分选自化学结构1、化学结构2、化学结构3和化学结构4：
化学结构1：CH3-(CH2)x-CO-*
化学结构2：HOOC-(CH2)x-CO-*
化学结构3：HN4C-(CH2)x-CO-*
化学结构4：HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*，
其中x为6-18范围内的整数，优选6-16，y为3-17范围内的整数。
94.实施方案93的衍生物，其中所述延长部分为化学结构1或化学结构2，x优选为偶数。
95.实施方案93-94中任一个的衍生物，其中x为i)10、ii)12、iii)14、iv)16或v)18；优选iii)14或iv)16；更优选i)10、ii)12；或v)18；或最优选iv)16。
96.实施方案93-95中任一个的衍生物，其中所述延长部分为化学结构1。
97.实施方案93-96中任一个的衍生物，其中化学结构1由化学结构1a表示：
化学结构1a：
Figure BDA00001770475400351
其中x如实施方案93-95中任一个所定义。
98.实施方案93-95中任一个的衍生物，其中所述延长部分为化学结构2。
99.实施方案93-95和98中任一个的衍生物，其中化学结构2由化学结构2a表示：
化学结构2a：
Figure BDA00001770475400352
其中x如实施方案84-86中任一个所定义。
100.实施方案93的衍生物，其中所述延长部分为化学结构3，x优选为奇数。
101.实施方案93和100中任一个的衍生物，其中x为i)11、ii)13、iii)15、iv)17或v)19；优选iii)15。
102.实施方案93和100-101中任一个的衍生物，其中化学结构3由化学结构3a表示：
化学结构3a：
其中x如实施方案93和100-101中任一个所定义。
103.实施方案93的衍生物，其中所述延长部分为化学结构4，y优选为奇数。
104.实施方案93和103中任一个的衍生物，其中y为i)5、ii)7、iii)9、iv)11或v)13；优选iii)9。
105.实施方案93和103-104中任一个的衍生物，其中化学结构4由化学结构4a或化学结构4b表示：
化学结构4a：
Figure BDA00001770475400362
化学结构4b：
Figure BDA00001770475400363
优选由化学结构4a表示；
其中y如实施方案93和103-104中任一个所定义。
106.实施方案86-105中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含一个延长部分。
107.实施方案86-105中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含两个延长部分。
108.实施方案107的衍生物，其中所述延长部分与一个相同的赖氨酸残基连接，优选经由接头连接。
109.实施方案107的衍生物，其中所述延长部分与两个不同的赖氨酸残基连接，优选经由接头连接。
110.实施方案87-109中任一个的衍生物，其包含接头。
111.实施方案87-110中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含接头。
112.实施方案92-111中任一个的衍生物，其中所述白蛋白结合部分进一步包含接头。
113.实施方案110-112中任一个的衍生物，其中所述接头为包含N基团和CO基团的二-基团，其中
i)N-基团由第一个*-NR1R2基团表示，其中R1和R2可独立指定氢、碳或硫，任选被取代；和
ii)CO基团由第一个*-CO基团表示，
其中，优选所述第一个*-NR1R2基团能够与第二个*-CO基团形成酰胺键，所述第一个*-CO基团能够与第二个*-NR1R2基团形成酰胺键，其中所述第二个*-NR1R2基团和所述第二个*-CO基团分别如对所述第一个*-NR1R2基团和对所述第一个*-CO基团所定义，并独立形成以下结构的一部分：i)类似物，ii)延长部分和/或iii)另一接头。
114.实施方案86-113中任一个的衍生物，其包含选自化学结构5、化学结构6、化学结构7、化学结构8、化学结构9和化学结构10的至少一个接头：
化学结构5：*-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
化学结构6：*-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
化学结构7：*-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
化学结构8：*-NH-C6H8-CO-*
化学结构9：*-NC5H8-CO-*
化学结构10：*-NH-SO2-(CH2)3-CO-*
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数；和其中化学结构6和化学结构7为Glu的二-基团。
115.实施方案110-114中任一个的衍生物，其中所述接头包含化学结构5，其中优选化学结构5为第一接头单元(element)。
116.实施方案114-115中任一个的衍生物，其中k为1。
117.实施方案114-116中任一个的衍生物，其中n为1。
118.实施方案114-117中任一个的衍生物，其中化学结构5被包括m次，其中m为1-10范围内的整数。
119.实施方案118的衍生物，其中m为1-6范围内的整数；优选在1-4范围内；更优选m为1或2；甚至更优选m为1；或最优选m为2。
120.实施方案118-119中任一个的衍生物，其中当m不同于1时，化学结构5单元经由酰胺键互相连接。
121.实施方案114-120中任一个的衍生物，其中所述接头由一个或多个化学结构5单元组成。
122.实施方案114-121中任一个的衍生物，其中化学结构5由化学结构5a表示：
化学结构5a：
Figure BDA00001770475400381
其中k和n如实施方案114-117中任一个所定义。
123.实施方案114-122中任一个的衍生物，其中所述接头包含Glu二-基团，例如化学结构6和化学结构7。
124.实施方案114-123中任一个的衍生物，其中化学结构6和化学结构7可分别独立由化学结构6a和化学结构7a表示：
化学结构6a：
Figure BDA00001770475400382
化学结构7a：
Figure BDA00001770475400391
最优选由化学结构6a表示。
125.实施方案114-124中任一个的衍生物，其中所述Glu二-基团例如化学结构6和/或化学结构7独立被包括p次，其中p为1-3范围内的整数。
126.实施方案125的衍生物，其中p为1、2或3；优选1或2，或最优选1。
127.实施方案114-126中任一个的衍生物，其中所述Glu二-基团为L-Glu或D-Glu基团，优选L-Glu基团。
128.实施方案114-127中任一个的衍生物，其中所述接头由Glu二-基团组成，优选化学结构6，更优选化学结构6a。
129.实施方案114-128中任一个的衍生物，其中所述接头包含化学结构8。
130.实施方案129的衍生物，其中化学结构8由化学结构8a表示：
化学结构8a：
Figure BDA00001770475400392
优选由化学结构8b表示：
化学结构8b：
Figure BDA00001770475400401
131.实施方案114-130中任一个的衍生物，其包含化学结构9。
132.实施方案131的衍生物，其中化学结构9由化学结构9a表示：
化学结构9a：
Figure BDA00001770475400402
133.实施方案114-132中任一个的衍生物，其包含化学结构10。
134.实施方案133的衍生物，其中化学结构10由化学结构10a表示：
化学结构10a：
Figure BDA00001770475400403
135.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由化学结构5(两次)经由酰胺键互相连接组成，在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
136.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由化学结构5组成，在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
137.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由化学结构6组成，在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
138.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指定次序互相连接的化学结构5(两次)和化学结构6(一次)组成，所述接头在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
139.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指定次序互相连接的化学结构6(一次)和化学结构5(两次)组成，所述接头在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
140.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指定次序互相连接的化学结构5(一次)、化学结构6(一次)和化学结构5(一次)组成，所述接头在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
141.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指定次序互相连接的化学结构6(一次)和化学结构5(一次)组成，所述接头在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
142.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指定次序互相连接的化学结构8(一次)、化学结构6(优选以D-形式)(一次)和化学结构5(两次)组成，所述接头在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
143.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由经由酰胺键并以指定次序互相连接的化学结构9(一次)、化学结构6(一次)和化学结构5(两次)组成，所述接头在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物的赖氨酸残基的ε氨基连接。
144.实施方案114-134中任一个的衍生物，其中所述接头由化学结构10(一次)组成，在其*-NH端与延长部分的*-CO端连接，在其*-CO端与GLP-1类似物赖氨酸残基的ε氨基连接。
145.实施方案110-144中任一个的衍生物，其中一个或多个接头经由酰胺键互相连接。
146.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：化学结构20、化学结构21、化学结构22、化学结构23、化学结构24、化学结构25、化学结构26、化学结构27、化学结构28、化学结构29、化学结构30、化学结构31、化学结构32、化学结构33、化学结构34、化学结构35、化学结构36、化学结构37、化学结构38、化学结构39、化学结构40、化学结构41、化学结构42、化学结构43、化学结构44、化学结构45、化学结构46、化学结构47、化学结构48、化学结构49、化学结构50、化学结构51、化学结构52、化学结构53、化学结构54、化学结构55、化学结构56、化学结构57、化学结构58、化学结构59、化学结构60、化学结构61、化学结构62、化学结构63、化学结构64、化学结构65和化学结构66。
147.由其名称表征的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述化合物选自本文实施例1-47的化合物名称的每一个的列表。
148.实施方案147的化合物，其为实施方案146的化合物。
149.实施方案146-148中任一个的化合物，其为实施方案1-84中任一个的类似物。
150.实施方案146-148中任一个的化合物，其为实施方案85-145中任一个的衍生物。
151.实施方案85-150中任一个的衍生物，其选自以下：
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构21：
Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；
化学结构46：
Figure BDA00001770475400431
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34，Lys37]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构47：
Figure BDA00001770475400432
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Ser8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构32：
Figure BDA00001770475400433
Nε26[2-(2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构35：
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(17-羧基-十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构38：
Figure BDA00001770475400442
Nε26-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]，Nε37-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]-[His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽；
化学结构56：
Figure BDA00001770475400443
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Glu22，Lys24，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；
化学结构60：
Figure BDA00001770475400451
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Lys16，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；
化学结构62：
Figure BDA00001770475400452
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；和
化学结构65：
152.实施方案85-150中任一个的衍生物，其选自以下：
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构21：
Figure BDA00001770475400454
Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；
化学结构46：
Figure BDA00001770475400461
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(17-羧基-十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构38：
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Glu22，Lys24，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；
化学结构60：
Figure BDA00001770475400463
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Lys16，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；
化学结构62：
Figure BDA00001770475400464
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；和
化学结构65：
Figure BDA00001770475400471
153.实施方案85-150中任一个的衍生物，其选自以下：
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构21：
Figure BDA00001770475400472
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34，Lys37]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构47：
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Ser8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构32：
Figure BDA00001770475400481
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(17-羧基-十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；和
化学结构38：
Figure BDA00001770475400482
优选选自：
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Ser8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构32：
Figure BDA00001770475400483
和
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽；
化学结构21：
154.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构21。
155.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构32。
156.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构35。
157.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构38。
158.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构46。
159.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物化学结构47。
160.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构56。
161.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构60。
162.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构62。
163.实施方案151-153中任一个的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物为化学结构65。
164.实施方案1-163中任一个的类似物或衍生物，其具有GLP-1活性。
165.实施方案164的类似物或衍生物，其中GLP-1活性指激活人GLP-1受体的能力。
166.实施方案165的类似物或衍生物，其中激活人GLP-1受体在体外测定中作为cAMP产生的效价来测量。
167.实施方案1-166中任一个的类似物或衍生物，其具有对应于4500pM或更低的EC50的效价，优选低于4500pM，更优选低于4000pM，甚至更优选低于3500pM，或最优选低于3000pM。
168.实施方案1-167中任一个的类似物或衍生物，其具有对应于低于2500pM的EC50的效价，优选低于2000pM，更优选低于1500pM，甚至更优选低于1000pM，或最优选低于800pM。
169.实施方案1-168中任一个的类似物或衍生物，其具有对应于低于600pM的EC50的效价，优选低于500pM，更优选低于400pM，甚至更优选低于300pM，或最优选低于200pM。
170.实施方案1-169中任一个的类似物或衍生物，其具有对应于低于180pM的EC50的效价，优选低于160pM，更优选低于140pM，甚至更优选低于120pM，或最优选低于100pM。
171.实施方案1-170中任一个的类似物或衍生物，其具有对应于低于80pM的EC50的效价，优选低于60pM，更优选低于50pM，甚至更优选低于40pM，或最优选低于30pM。
172.实施方案1-171中任一个的类似物或衍生物，其中将所述效价测定为剂量反应曲线的EC50，所述曲线显示在含有人GLP-1受体的培养基中cAMP的剂量依赖性形成，优选用稳定转染的细胞系例如BHK467-12A(tk-ts13)，和/或用测定cAMP功能受体的测定来测定，例如基于内源形成的cAMP和外源添加的生物素-标记的cAMP之间的竞争性，其中测定cAMP更优选用特异性抗体来捕获，和/或其中甚至更优选测定为AlphaScreen cAMP测定，最优选实施例48所述的测定。
173.实施方案1-172中任一个的类似物或衍生物，其EC50为小于司美鲁肽的EC50的10倍，优选小于司美鲁肽的EC50的8倍，更优选小于司美鲁肽的EC50的6倍，甚至更优选小于司美鲁肽的EC50的4倍，或最优选小于司美鲁肽的EC50的2倍。
174.实施方案1-173中任一个的类似物或衍生物，其EC50小于司美鲁肽的EC50，优选小于司美鲁肽的EC50的0.8，更优选小于司美鲁肽的EC50的0.6，甚至更优选小于司美鲁肽的EC50的0.4，或最优选小于司美鲁肽的EC50的0.2。
175.实施方案1-174中任一个的类似物或衍生物，其EC50为小于利拉糖肽的EC50的10倍，优选小于利拉糖肽的EC50的8倍，更优选小于利拉糖肽的EC50的6倍，甚至更优选小于利拉糖肽的EC50的4倍，或最优选小于利拉糖肽的EC50的2倍。
176.实施方案1-175中任一个的类似物或衍生物，其EC50小于利拉糖肽的EC50，优选小于利拉糖肽的EC50的0.8，更优选小于利拉糖肽的效价的0.6，甚至更优选小于利拉糖肽的EC50的0.5，或最优选小于或为利拉糖肽的EC50的0.4。
177.实施方案85-176中任一个的衍生物，其比率[在2.0％HSA(高白蛋白)存在时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)除以在0.005％HSA(低白蛋白)存在时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)]为：
a)至少0.5，优选至少1.0，更优选至少10，甚至更优选至少20，或最优选至少30；
b)至少40，优选至少50，更优选至少60，甚至更优选至少70，或最优选至少80；
c)至少90，优选至少100，更优选至少200，还更优选至少300，甚至更优选至少400，或最优选至少500；
d)至少600，优选至少700，更优选至少800，甚至更优选至少1000或最优选至少1300；
e)司美鲁肽比率的至少20％，优选司美鲁肽比率的至少50％，更优选司美鲁肽比率的至少75％，甚至更优选至少等于司美鲁肽比率，或最优选至少为司美鲁肽比率的2倍；或
f)至少等于利拉糖肽的比率，优选至少为利拉糖肽比率的2倍，更优选至少为利拉糖肽比率的3倍，甚至更优选至少为利拉糖肽比率的5倍，或最优选至少为利拉糖肽比率的10倍。
178.实施方案1-177中任一个的类似物或衍生物，其在存在0.005％HSA(低白蛋白)时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)为：
a)低于600.00nM，优选低于500.00nM，更优选低于200.00nM，甚至更优选低于100.00nM，或最优选低于50.00nM；或
b)低于20.00nM，优选低于10.00nM，更优选低于5.00nM，甚至更优选低于2.00nM，或最优选低于1.00nM。
179.实施方案85-178中任一个的衍生物，其在存在2.0％HSA(高白蛋白)时的GLP-1受体结合亲和力(IC50)为：
a)为或低于1000.00nM，优选低于900nM，更优选低于800nM，甚至更优选低于700nM，或最优选低于600nM；或
b)低于400.00nM，优选低于300.00nM，更优选低于200.00nM，甚至更优选低于100.00nM，或最优选低于50.00nM。
180.实施方案1-179中任一个的类似物或衍生物，其中通过125I-GLP-1从受体中的取代来测量与GLP-1受体的结合亲和力，优选用SPA结合测定。
181.实施方案1-180中任一个的类似物或衍生物，其中所述GLP-1受体用稳定转染的细胞系来制备，所述细胞系优选仓鼠细胞系，更优选幼仓鼠肾细胞系，例如BHK tk-ts13。
182.实施方案1-181中任一个的类似物或衍生物，其中IC50值测定为从受体取代50％125I-GLP-1的浓度。
183.实施方案85-182中任一个的衍生物，其具有口服生物利用度，优选口服绝对生物利用度，其高于利拉糖肽的生物利用度；和/或高于司美鲁肽的生物利用度。
184.实施方案183的衍生物，其中在大鼠体内将口服生物利用度测量为直接注射到肠腔后在血浆中的暴露。
185.实施方案85-184中任一个的衍生物，其中在大鼠空肠中注射所述衍生物溶液剂后30分钟测定的衍生物的血浆浓度(pM)，除以注射的溶液剂浓度(μM)(30分钟时校正剂量的暴露)，为至少15，优选至少30，更优选至少48，还更优选至少62，甚至更优选至少80，或最优选至少100。
186.实施方案85-185中任一个的衍生物，在大鼠空肠中注射所述衍生物溶液剂后30分钟测定的衍生物的血浆浓度(pM)，除以注射的溶液剂浓度(μM)(30分钟时校正剂量的暴露)，为至少110，优选至少120，更优选至少130，还更优选至少140，甚至更优选至少150，或最优选至少160。
187.实施方案85-186中任一个的衍生物，其中在大鼠空肠中注射所述衍生物溶液剂后30分钟测定的衍生物的血浆浓度(pM)，除以注射的溶液剂浓度(μM)(30分钟时校正剂量的暴露)，为至少180，优选至少210，更优选至少240，或最优选至少280。
188.实施方案85-187中任一个的衍生物，其中GLP-1衍生物以1000uM浓度与55mg/ml癸酸钠混合来测定。
189.实施方案85-188中任一个的衍生物，其中使用雄性SpragueDawley大鼠，优选体重达到大约240g以上。
190.实施方案85-189中任一个的衍生物，其中在实验前让大鼠禁食大约18小时。
191.实施方案85-190中任一个的衍生物，其中在让大鼠禁食后并在空肠中注射衍生物之前对其实施全身麻醉。
192.实施方案85-191中任一个的衍生物，其中所述衍生物在空肠近心端(离十二指肠10cm的远端)或中肠中(离盲肠50cm的近端)给予。
193.实施方案85-192中任一个的衍生物，其中用1ml注射器通过导管将100μl所述衍生物注射入空肠腔中，随后用另一注射器将200μl空气推进空肠腔中，然后让注射器与导管保持连接以防止回流到导管中。
194.实施方案85-193中任一个的衍生物，其中在所期需的时间间隔从尾静脉采集血样(200ul)到EDTA管中，例如在0、10、30、60、120和240分钟的时间，并在20分钟内以10000G于4℃离心5分钟。
195.实施方案85-194中任一个的衍生物，其中将血浆(75ul)分离，随即冷冻并保持在-20℃，直到对衍生物的血浆浓度进行分析。
196.实施方案85-195中任一个的衍生物，其中用LOCI(光激化学发光免疫测定)来分析衍生物的血浆浓度。
197.实施方案1-196中任一个的类似物或衍生物，其在体内有效降低db/db小鼠血糖。
198.实施方案1-197中任一个的类似物或衍生物，其在体内有效降低db/db小鼠体重。
199.实施方案1-198中任一个的类似物或衍生物，其中用合适范围的GLP-1类似物或衍生物剂量s.c.处理db/db小鼠，以合适间隔来测定血糖和/或体重。
200.实施方案199的类似物或衍生物，其中GLP-1类似物或衍生物剂量为0.3纳摩尔/kg、1.0纳摩尔/kg、3.0纳摩尔/kg、10纳摩尔/kg、30纳摩尔/kg和100纳摩尔/kg，其中kg指小鼠体重。
201.实施方案197-200中任一个的类似物或衍生物，其中用溶媒s.c.处理对照组，优选GLP-1类似物或衍生物溶解于其中的培养基例如具以下组成：50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80、pH 7.4。
202.实施方案197-201中任一个的类似物或衍生物，其中在-1/2h(给药(t＝0)前半小时)和1、2、4、8、24、48、72和96小时时测定血糖和/或给小鼠称重。
203.实施方案197-202中任一个的类似物或衍生物，其中葡萄糖浓度用葡萄糖氧化酶方法来测量。
204.实施方案197-203中任一个的类似物或衍生物，其中
(i)ED50(体重(BW))计算为皮下给予所述类似物或衍生物后24小时引起对Δ(例如降低)BW的半最大效应的剂量；和/或
(ii)ED50(血糖(BG))计算为皮下给予所述类似物或衍生物后24小时引起对AUC(曲线下面积)Δ(例如降低)BG的半最大效应的剂量。
205.实施方案197-204中任一个的类似物或衍生物，其中存在S形剂量-反应关系，优选具明确定义的最大反应。
206.实施方案85-205中任一个的衍生物，其具有比利拉糖肽更延长的作用概况。
207.实施方案206的衍生物，其中延长意即在相关动物物种的体内半衰期，所述动物物种例如db/db小鼠、大鼠、猪和/或优选小型猪；其中所述衍生物如下给予：i)s.c.和/或优选ii)s.c。
208.实施方案206-207中任一个的衍生物，其中在小型猪中i.v.给予后的终末半衰期(T1/2)为：
a)至少12小时，优选至少24小时，更优选至少36小时，甚至更优选至少48小时，或最优选至少60小时；或
b)至少为司美鲁肽半衰期的0.2，优选至少为司美鲁肽半衰期的0.4，更优选至少为司美鲁肽半衰期的0.6，甚至更优选至少为司美鲁肽半衰期的0.8，或最优选至少与司美鲁肽半衰期相同。
209.实施方案207-208中任一个的衍生物，其中所述小型猪为雄性
Figure BDA00001770475400551
小型猪。
210.实施方案207-209中任一个的衍生物，其中所述小型猪为7-14个月龄，优选重16-35kg。
211.实施方案207-210中任一个的衍生物，其中将小型猪单独饲养，每天一次或两次喂食，优选用SDS小型猪饮食。
212.实施方案207-211中任一个的衍生物，其中所述衍生物在适应至少2周后i.v.给药。
213.实施方案207-212中任一个的衍生物，其中在给药前让动物禁食大约18小时和给药后让动物禁食至少4小时，在整个期间动物可随意饮水。
214.实施方案207-213中任一个的衍生物，其中将所述GLP-1衍生物溶解于50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80、pH 7.4中到合适的浓度，优选20-60纳摩尔/ml。
215.实施方案207-214中任一个的衍生物，其中静脉内注射衍生物以对应于1-2纳摩尔/kg的体积来给予。
216.实施方案1-215中任一个的类似物或衍生物，其在小型猪内提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
217.实施方案216的类似物或衍生物，其中所述小型猪为雄性
Figure BDA00001770475400561
小型猪。
218.实施方案216-217中任一个的类似物或衍生物，其中所述小型猪为7-14个月龄。
219.实施方案216-218中任一个的类似物或衍生物，其中将小型猪在单独猪圈中饲养，每天喂养一次或两次，优选用SDS小型猪饲料。
220.实施方案216-219中任一个的类似物或衍生物，其中任选在渐增剂量期间后，在耳后薄皮肤中i.v.或s.c.给予单剂量。
221.实施方案216-220中任一个的类似物或衍生物，其中在给药前让动物禁食大约18小时。
222.实施方案216-221中任一个的类似物或衍生物，其中测定了基线组和对应于2-6个不同的血浆浓度水平的若干衍生物给药组，其中所述基线组为a)溶媒处理或b)不处理。
223.实施方案216-222中任一个的类似物或衍生物，其中血浆浓度水平为3000-80000pM。
224.实施方案216-223中任一个的类似物或衍生物，其中实施1或2小时的静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)。
225.实施方案216-224中任一个的类似物或衍生物，其中经30秒时间i.v.给予0.3g/kg葡萄糖，在合适时间点采取血样，例如以下时间点(t＝0对应于葡萄糖推注)：-10、-5、0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟。
226.实施方案225的类似物或衍生物，其中测定类似物或衍生物、葡萄糖和胰岛素的血浆浓度。
227.实施方案226的类似物或衍生物，其中类似物或衍生物浓度在t＝0分钟并任选在测定结束时(t＝60分钟或t＝120分钟)测量。
228.实施方案216-227中任一个的类似物或衍生物，其中葡萄糖用葡萄糖氧化酶方法分析。
229.实施方案216-228中任一个的类似物或衍生物，其中计算胰岛素曲线下面积(AUC胰岛素)，并将其用作胰岛素分泌的量度。
230.实施方案216-229中任一个的类似物或衍生物，其中对于其至少一个浓度，AUC胰岛素比基线AUC胰岛素高，优选至少为其110％，更优选至少为其120％，甚至更优选为其至少130％，或最优选至少为其140％。
231.实施方案1-230中任一个的类似物或衍生物，其在猪中相对于对照(优选溶媒处理或不作处理)引起采食量减少；
任选采食量(0-24小时)可相对于溶媒-处理对照为90％或更低，优选80％或更低，更优选70％或更低，甚至更优选60％或更低，或最优选50％或更低；
其中采食量(0-24小时)指给予衍生物或溶媒后的第一个24小时。
232.实施方案231的类似物或衍生物，其中所述猪为雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)猪。
233.实施方案232的类似物或衍生物，其中所述LYD猪为3个月龄，优选具有30-35kg的重量。
234.实施方案231-233中任一个的类似物或衍生物，其中让动物在小组中适应饲养1-2周。
235.实施方案231-234中任一个的类似物或衍生物，其中在实验期间，从星期一上午到星期五下午将动物安置在单独的圈中用于测量单个食物摄取。
236.实施方案231-235中任一个的类似物或衍生物，其中用猪饲料(例如Svinefoder，Antonio)随意喂养动物。
237.实施方案231-236中任一个的类似物或衍生物，其中通过每15分钟记录饲料重量来监测食物摄取，优选用Mpigwin系统。
238.实施方案231-237中任一个的类似物或衍生物，其以0.3、1.0、3.0、10或30纳摩尔/kg来给药，优选将其溶于磷酸盐缓冲液(50mM磷酸盐、0.05％吐温80、pH 8)中，更优选以12、40、120、400或1200纳摩尔/ml的浓度。
239.实施方案231-238中任一个的类似物或衍生物，其中将磷酸盐缓冲液用作溶媒。
240.实施方案231-239中任一个的类似物或衍生物，其中在第1天上午给予动物单个皮下剂量的衍生物或溶媒(优选用0.025ml/kg的剂量体积)，给药后测量食物摄取达4天。
241.实施方案1-240中任一个的类似物或衍生物，其在大鼠小肠提取物中的体外半衰期(T1/2)除以相应的GLP-1(7-37)半衰期(T1/2)为至少1.0，优选至少2.0，还更优选至少4.0，或最优选至少5.0。
242.实施方案1-241中任一个的类似物或衍生物，其在大鼠小肠提取物中的体外半衰期(T1/2)除以相应的GLP-1(7-37)半衰期(T1/2)为至少9.0，优选至少10.0，更优选至少12.0，甚至更优选至少14.0，还更优选至少16.0，或最优选至少18.0；或甚至至少20.0。
243.实施方案241-242中任一个的类似物或衍生物，其中如实施例50所述制备大鼠小肠提取物，将所述类似物或衍生物在37℃孵育1小时，滴定提取物浓度(例如1.4ug/ml)以使GLP-1(7-37)半衰期在10-20分钟范围内，由UPLC和/或MALDI-TOF分析得到的样品，和/或如实施例50所述实施孵育和分析。
244.实施方案241-243中任一个的类似物或衍生物，其中[大鼠小肠提取物的体外半衰期(T1/2)除以GLP-1(7-37)的大鼠小肠提取物的体外半衰期(T1/2)]比率为司美鲁肽相应比率的至少0.5，优选司美鲁肽比率的至少2倍，更优选司美鲁肽比率的至少3倍，甚至更优选司美鲁肽比率的至少5倍，或最优选司美鲁肽比率的至少7倍。
245.实施方案241-244中任一个的类似物或衍生物，其中[大鼠小肠提取物的半衰期(T1/2)除以GLP-1(7-37)的大鼠小肠提取物的半衰期(T1/2)]比率为利拉糖肽相应比率的至少0.1，优选利拉糖肽比率的至少0.4，更优选利拉糖肽比率的至少0.8，甚至更优选利拉糖肽比率的至少1.2倍，或最优选利拉糖肽比率的至少1.5倍。
246.实施方案85-245中任一个的衍生物，其在i.v.给予大鼠后具有至少4小时、优选至少6小时、甚至更优选至少8小时或最优选至少10小时的体内半衰期(T1/2)。
247.实施方案85-246中任一个的衍生物，其在i.v.给予大鼠后具有至少11小时、优选至少12小时、甚至更优选至少13小时或最优选至少14小时的体内半衰期(T1/2)。
248.实施方案85-247中任一个的衍生物，其中所述大鼠为具300-600g体重的雄性Sprague Dawley大鼠。
249.实施方案85-248中任一个的衍生物，其在i.v.给予大鼠后，体内半衰期(T1/2)至少与司美鲁肽的半衰期相同，优选至少为司美鲁肽半衰期的2倍，更优选为司美鲁肽半衰期的3倍，甚至更优选至少为司美鲁肽半衰期的4倍，或最优选至少为司美鲁肽半衰期的5倍。
250.实施方案85-249中任一个的衍生物，其与HSA具有相对低的结合亲和力，优选比以下化合物具有更低的结合亲和力和/或更高的Kd(或表观Kd)：a)WO 2009/030771实施例68的化合物；b)WO2009/030771实施例69的化合物；和/或c)WO 2009/030771实施例71的化合物；其中与HSA的结合亲和力可表示为解离常数(Kd，用μM表示)；优选表示为表观解离常数；和其中更优选解离常数或表观解离常数为：
i)1或高于1；优选5或高于；甚至更优选或高于10；或最优选20或高于20；
ii)25或低于25；优选低于20；更优选低于10；甚至更优选低于5.0；或最优选低于1.0；和/或
iii)在由i)和ii)限度确定的范围内，例如1-5；1-10；1-20；1-25；5-10；5-20；5-25；10-20；或20-25。
251.实施方案250的衍生物，其中用竞争闪烁邻近测定(scintillation proximity assay)(SPA)来测量解离常数，例如如实施例57所述的方法。
252.实施方案250-251中任一个的衍生物，其中链霉抗生物素-SPA珠(例如GE Healthcare RPNQ0009)与生物素化的HSA孵育5小时。
253.实施方案252的衍生物，其中优选用缓冲液洗涤珠以除去未结合的HSA；并随后与125I-标记的酰化的GLP-1类似物(例如N-ε37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，125I-Tyr19，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1(7-37)-NH2)在含有100mM Hepes、100mM NaCl、10mMMgSO4、0.025％吐温-20、pH 7.4的缓冲液中混合。
254.实施方案253的衍生物，其中将反应混合物用移液器吸到例如Perkin Elmer Optiplate-966005290的孔中，优选每孔100μl；然后将待测量的100μl的GLP-1衍生物的稀释系列加到相同缓冲液中。
255.实施方案254的衍生物，其中在室温轻柔振摇20小时后将板离心，并例如在TopCounter上计数；此后结合的cpm作为GLP-1衍生物浓度的函数作图；Kd和/或表观Kd可计算为目的GLP-1衍生物的摩尔浓度乘以HSA的摩尔浓度并除以GLP-1-HSA复合物的摩尔浓度。
256.实施方案1-255中任一个的类似物或衍生物，其分子量低于80kDa；优选低于60kDa，例如低于40kDa；甚至更优选低于20kDa；还更优选低于10kDa；或最优选低于6kDa。
257.实施方案85-256中任一个的衍生物，其不是实施例18的化合物，优选不是化学结构37。
258.实施方案85-257中任一个的衍生物，其不是实施例28、29、34、35、36和37的化合物，优选不是化学结构47、化学结构48、化学结构53、化学结构54、化学结构55和化学结构56。
259.中间产物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述中间产物包含(优选由其组成)选自以下的化合物：
化学结构67：
Figure BDA00001770475400611
化学结构68：
Figure BDA00001770475400612
其中PG表示保护基；和
其中任选化学结构67的延长部分的远端*-COOH基团亦如本领域所知受到保护；优选在形成非反应性酯情况下；更优选：i)具有大侧链(bulky side chain)的醇的酯，例如苯酚酯，其任选被取代；或ii)支链烷基的酯，优选低级烷基的酯；最优选作为OtBu、OBz等等被保护。
260.实施方案259的中间产物，其中PG为可逆地使中间产物无反应性并可被选择性去除的基团。
261.实施方案259-260中任一个的中间产物，其中PG为i)-OH或ii)官能化为活化酯。
262.实施方案261的中间产物，其中所述活化酯为以下物质的酯：对硝基苯酚；2，4，5-三氯苯酚；N-羟基琥珀酰亚胺；N-羟基磺基琥珀酰亚胺；3，4-二氢-3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4-酮；5-氯-8-羟基喹啉；N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酸酰亚胺；五氟苯酚；对磺基四氟苯酚；N-羟基邻苯二甲酰亚胺；1-羟基苯并三唑；1-羟基-7-氮杂苯并三唑；N-羟基马来酰亚胺；4-羟基-3-硝基苯磺酸；或本领域已知的任何其它活化酯。
263.实施方案1-258中任一个的类似物或衍生物，其用作药物。
264.实施方案1-258中任一个的类似物或衍生物，其用于以下用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
265.实施方案1-258中任一个的类似物或衍生物用于制备用于以下的药物的用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
266.一种方法，所述方法用于治疗或防止各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展，所述方法通过给予药学上有活性的量的实施方案1-258中任一个的类似物或衍生物来进行。
实施例
本实验部分以缩写列表开始，接着是包括用于合成及表征本发明肽和衍生物的通用方法的部分。然后是涉及制备特定GLP-1肽衍生物的多个实施例，最后是包括涉及这些肽和衍生物的活性和性质的多个实施例(标题为药理学方法的部分)。
实施例用于阐明本发明。
缩写
下文将使用以下缩写，按字母顺序为：
Aib：氨基异丁酸(α-氨基异丁酸)
API：活性药物成分
AUC：曲线下面积
BG：血糖
BHK：幼仓鼠肾
Boc：叔丁氧基羰基
Bom：苄氧基甲基
BW：体重
Bzl：苄基
Clt：2-氯三苯甲基
collidine：2，4，6-三甲基吡啶
Cpm：每分钟计数
DCM：二氯甲烷
Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基
DIC：二异丙基碳二亚胺
DIPEA：二异丙基乙胺
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMEM：Dulbecco改良Eagle氏培养基(DMEM)
EDTA：乙二胺四乙酸
EGTA：乙二醇四乙酸
FCS：胎牛血清
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
HATU：(邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)
HBTU：(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲鎓六氟磷酸盐)
HEPES：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HFIP：1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
HPLC：高效液相色谱
HSA：人血清白蛋白
IBMX：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
Imp：咪唑丙酸(亦被称为脱氨基组氨酸、DesH)
i.v.：静脉内
ivDde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基
IVGTT：静脉葡萄糖耐量试验
LCMS：液相色谱质谱
LYD：Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS：见MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱
MeOH：甲醇
Mmt：4-甲氧基三苯甲基
Mtt：4-甲基三苯甲基
NMP：N-甲基吡咯烷酮
OBz：苯甲酰酯
OEG：8-氨基-3，6-二氧杂辛酸
OPfp：五氟苯氧基
OPnp：对硝基苯氧基
OSu：邻-琥珀酰亚氨基酯(羟基琥珀酰亚胺酯)
OSuc：2，5-二氧-吡咯烷-1-基
OtBu：叔丁酯
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS：磷酸缓冲盐水
PD：药效
Pen/Strep：青霉素/链霉素
PK：药代动力学
RP：反相
RP-HPLC：反相高效液相色谱
RT：室温
Rt：保留时间
s.c.：皮下
SD：标准偏差
SEC-HPLC：尺寸排阻高效液相色谱
SEM：均值的标准差
SPA：闪烁邻近测定
SPPS：固相肽合成
tBu：叔丁基
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
TLC：薄层色谱
Tos：甲苯磺酸盐(或对甲苯磺酰基)
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1，3-二醇
Trt：三苯基甲基或三苯甲基
Trx：氨甲环酸
UPLC：超高效液相色谱
制备方法
A.通用方法
本部分涉及用于合成结合树脂的肽(SPPS方法，包括用于脱去氨基酸保护的方法、用于从树脂裂解肽及用于其纯化的方法)的方法，以及用于检测和表征得到的肽(LCMS、MALDI和UPLC方法)的方法。在某些情况下，可通过利用二-肽酰胺键上受保护的二-肽与在酸性条件下可被裂解的基团来改进肽的合成，所述酸性条件下可被裂解的基团例如但不限于2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基。在其中肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况下，可使用假脯氨酸二-肽(可例如自Novabiochem获得，亦参见W.R.Sampson(1999)，J.Pep.Sci.5，403)。所用的受保护的氨基酸衍生物为标准Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec、IRIS或Novabiochem供应)。N-末端氨基酸在α氨基上受到Boc保护(例如用于N-末端含His的肽的Boc-His(Boc)-OH或Boc-His(Trt)-OH)。用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc来保护序列中赖氨酸的ε氨基，这视用于连接白蛋白结合部分和间隔子的途径而定。可通过使结合树脂的肽酰化或通过在未保护的肽溶液中的酰化，来让白蛋白结合部分和/或接头与肽连接。在白蛋白结合部分和/或接头与受保护的肽基树脂连接的情况下，用SPPS和合适受保护的结构单元，所述连接可为模块的(modular)，所述结构单元例如但不限于Fmoc-OEG-OH(Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-氨甲环酸)、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单-叔丁酯、十九烷二酸单-叔丁酯或4-(9-羧基壬氧基)苯甲酸叔丁酯。
1.结合树脂的肽的合成
SPPS方法A
SPPS方法A指用Fmoc化学在Applied Biosystems 433肽合成仪(亦命名为ABI433A合成仪)上合成受保护的肽基树脂，其以0.25毫摩尔或1.0毫摩尔规模用厂商FastMoc UV方案进行，所述方案在NMP中采用HBTU或HATU介导的偶联，用UV监测Fmoc保护基的脱保护。
用于合成肽酰胺的起始树脂为合适的Rink-酰胺树脂(对于肽酰胺)或为(对于具羧基C-末端的肽)合适的Wang树脂或合适的氯三苯甲基树脂中的任一种。合适的树脂可自例如Novabiochem市购。
SPPS方法B
SPPS方法B指用Fmoc化学在基于微波的Liberty肽合成仪(CEMCorp.，North Carolina)上合成受保护的肽基树脂。合适的树脂为预装载的低载量的Wang树脂，可自Novabiochem获得(例如低载量Fmoc-Lys(Mtt)-Wang树脂，0.35毫摩尔/g)。用5％哌啶/NMP在高达70或75℃进行Fmoc-脱保护。偶联化学为NMP中的DIC/HOAt。将氨基酸/HOAt溶液(在NMP中0.3M，以3-10倍的摩尔量过量)加到树脂中，接着加同样摩尔当量的DIC(NMP中0.75M)。例如，对于以下规模的反应每次偶联时使用以下量的0.3M氨基酸/HOAt溶液：规模/ml：0.10毫摩尔/2.5ml、0.25毫摩尔/5ml、1毫摩尔/15ml。偶联时间和温度通常为在高达70或75℃5分钟。反应规模越大，使用的偶联时间越长，例如10分钟。组氨酸氨基酸在50℃时为双偶联，或若前面的氨基酸有空间位阻(例如Aib)为四偶联。精氨酸氨基酸在RT偶联25分钟，然后加热到70或75℃达5分钟。一些氨基酸为“双偶联”，意即在第一次偶联(例如75℃时5分钟)后，耗尽树脂并加入更多反应试剂(氨基酸、HOAt和DIC)，并再次加热混合物(例如75℃时5分钟)。当期需化学修饰赖氨酸侧链时，让赖氨酸作为Lys(Mtt)被并入。Mtt基团通过以下除去：用DCM洗涤树脂，让树脂在纯(未稀释)的六氟异丙醇中悬浮20分钟，接着用DCM和NMP洗涤。赖氨酸的化学修饰如下实施：用合适的受保护的结构单元(参见通用方法)通过手工合成(见SPPS方法D)或通过如上所述在Liberty肽合成仪上的一步或多步自动步骤，其任选包括手动偶联。
SPPS方法D
SPPS方法D指用手动Fmoc化学合成受保护的肽基树脂。这通常用于让接头和侧链与肽主链连接。偶联化学为在4-10倍摩尔过量NMP中的DIC/HOAt/collidine。偶联条件为室温1-6小时。Fmoc-脱保护如下实施：用20-25％哌啶/NMP(3x20ml，每次10分钟)，接着NMP洗涤(4x20mL)。Dde-或ivDde-脱保护如下实施：用2％肼/NMP(2x20ml，每次10分钟)，接着是NMP洗涤(4x20ml)。Mtt-或Mmt-脱保护如下实施：用DCM中的2％TFA和2-3％TIS(5x20ml，每次10分钟)，接着是DCM(2x20ml)、DCM中的10％MeOH和5％DIPEA(2x20ml)和NMP(4x20ml)洗涤，或通过用纯六氟异丙醇(5x20ml，每次10分钟)处理，接着如上洗涤。可通过结合树脂的肽的酰化或在未保护的肽溶液中的酰化让白蛋白结合部分和/或接头与肽连接(参见下述途径)。在白蛋白结合部分和/或接头与保护的肽基树脂连接情况下，用SPPS和合适的受保护的结构单元，所述连接可为模块的(参见通用方法)。
与结合树脂的肽连接-途径I：将活化的(活性酯或对称酸酐)白蛋白结合部分或接头例如十八烷二酸单-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等，EP511600，相对于结合树脂的肽为4摩尔当量)溶于NMP(25mL)中，加到树脂中，室温振荡过夜。过滤反应混合物，用NMP、DCM、2-丙醇、甲醇和二乙醚彻底洗涤树脂。
与结合树脂的肽连接-途径II：让白蛋白结合部分溶于NMP/DCM(1∶1，10ml)中。加入活化试剂例如HOBt(相对于树脂为4摩尔当量)和DIC(相对于树脂为4摩尔当量)，将溶液搅拌达15分钟。将溶液加到树脂中，加入DIPEA(相对于树脂为4摩尔当量)。在室温将树脂振荡2-24小时。用NMP(2x20ml)、NMP/DCM(1∶1，2x20ml)和DCM(2x20ml)洗涤树脂。
与溶液中的肽连接-途径III：让活化的(活性酯或对称酸酐)白蛋白结合部分或接头例如十八烷二酸单-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等，EP511600)以相对于肽为1-1.5摩尔当量溶于有机溶剂(例如乙腈、THF、DMF、DMSO)或水/有机溶剂混合物(1-2ml)中，将其连同10摩尔当量DIPEA加入到肽的水溶液(10-20ml)中。在白蛋白结合残基上的保护基为例如叔丁基情况下，过夜冻干反应混合物，此后将分离的粗肽的脱保护。在叔丁基保护基情况下，通过让肽溶解在三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(90∶5∶5)混合物中实施脱保护。30分钟后真空中蒸发混合物，如后所述通过制备型HPLC纯化粗肽。
SPPS方法F
SPPS方法E指通过Fmoc化学在来自Protein Technologies(Tucson，AZ 85714 U.S.A.)的Prelude固相肽合成仪上的肽合成。合适的树脂为预装载的低载量的Wang树脂，可自Novabiochem获得(例如低载量fmoc-Lys(Mtt)-Wang树脂，0.35毫摩尔/g)。用25％哌啶/NMP进行Fmoc-脱保护2x10分钟。偶联化学为NMP中的DIC/HOAt/collidine。将氨基酸/HOAt溶液(在NMP中0.3M，以3-10倍的摩尔量过量)加到树脂中，接着加同样摩尔当量的DIC(NMP中3M)和collidine(NMP中3M)。例如，对于以下规模的反应每次偶联时使用以下量的0.3M氨基酸/HOAt溶液：规模/ml：0.10毫摩尔/2.5ml、0.25毫摩尔/5ml。偶联时间通常为60分钟。包括但不限于精氨酸和组氨酸在内的一些氨基酸为“双偶联”，意即在第一次偶联(例如60分钟)后，耗尽树脂加入更多反应试剂(氨基酸、HOAt、DIC和collidine)，并让混合物再次反应(例如60分钟)。当期需化学修饰赖氨酸侧链时，让赖氨酸作为Lys(Mtt)被并入。Mtt基团通过以下除去：用DCM洗涤树脂，让树脂在六氟异丙醇/DCM(75∶25)中悬浮3x10分钟，接着用DCM、20％哌啶和NMP洗涤。赖氨酸的化学修饰如下实施：用合适的受保护的结构单元通过手工合成(见SPPS方法D)或通过如上所述在Prelude肽合成仪上的一步或多步自动步骤(参见通用方法)。
2.自树脂裂解肽并纯化
合成后用DCM洗涤树脂，如下从树脂裂解肽：通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5或92.5/5/2.5)处理2-3小时，接着用二乙醚沉淀。让肽溶于合适的溶剂(例如30％乙酸)中，通过标准RP-HPLC在C18，5μM柱上用乙腈/水/TFA纯化。通过联合UPLC、MALDI和LCMS方法来分析流分，合并合适的流分并冻干。
3.用于检测和表征的方法
LCMS方法
LCMS方法1(LCMS1)
从Agilent 1200 series HPLC系统洗脱后，用Agilent TechnologiesLC/MSD TOF(G1969A)质谱仪鉴定样品质量。用Agilent的蛋白质确认软件计算蛋白质光谱的去卷积。
洗脱液：
A：0.1％三氟乙酸/水
B：0.1％三氟乙酸/乙腈
柱：Zorbax 5u，300SB-C3，4.8x50mm
梯度：经15分钟25％-95％乙腈
LCMS方法2(LCMS2)
自Perkin Elmer Series 200HPLC系统洗脱后用Perkin Elmer SciexAPI 3000质谱仪鉴定样品的质量。
洗脱液：
A：0.05％三氟乙酸/水
B：0.05％三氟乙酸/乙腈
柱：Waters Xterra MS C-18 X 3mm内径5μm
梯度：经7.5分钟以1.5ml/分钟5％-90％乙腈
LCMS方法3(LCMS3)
自Waters Alliance HT HPLC系统洗脱后用Waters Micromass ZQ质谱仪鉴定样品的质量。
洗脱液：
A：0.1％三氟乙酸/水
B：0.1％三氟乙酸/乙腈
柱：Phenomenex，Jupiter C4 50 X 4.60mm内径5μm
梯度：经7.5分钟以1.0ml/分钟10％-90％B
LCMS方法4(LCMS4)
在由Waters Acquity UPLC系统和来自Micromass的LCT PremierXE质谱仪组成的装配上实施LCMS4。将UPLC泵与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.1％蚁酸/水
B：0.1％蚁酸/乙腈
于RT通过合适的样品体积(优选2-10μl)注入柱来实施分析，其用A和B梯度洗脱。
UPLC条件、检测仪设置和质谱仪设置为：
柱：Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7μm，2.1mmx50mm
梯度：4.0分钟(或者8.0分钟)期间以0.4ml/分钟线性5％-95％乙腈
检测：214nm(从TUV(可调UV检测仪)模拟输出)
MS离子化方式：API-ES
扫描：100-2000amu(或者500-2000amu)，步长0.1amu
UPLC和HPLC方法
方法05_B5_1
UPLC(方法05_B5_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400711
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10％CH3CN(pH 3.5)
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经8分钟以流速0.40ml/分钟实现60％A、40％B到30％A、70％B。
方法05_B7_1
UPLC(方法05_B7_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400712
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10％CH3CN(pH 3.5)
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经8分钟以流速0.40ml/分钟实现80％A、20％B到40％A、60％B。
方法04_A2_1
UPLC(方法04_A2_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400713
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：90％H2O、10％CH3CN、0.25M碳酸氢铵
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟实现90％A、10％B到60％A、40％B。
方法04_A3_1
UPLC(方法04_A3_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400721
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：90％H2O、10％CH3CN、0.25M碳酸氢铵
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟实现75％A、25％B到45％A、55％B。
方法04_A4_1
UPLC(方法04_A4_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400722
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：90％H2O、10％CH3CN、0.25M碳酸氢铵
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟实现65％A、35％B到25％A、65％B。
方法08_B2_1
UPLC(方法08_B2_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400723
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：99.95％H2O、0.05％TFA
B：99.95％CH3CN、0.05％TFA
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟实现95％A、5％B到40％A、60％B。
方法08_B4_1
UPLC(方法08_B4_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400731
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：99.95％H2O、0.05％TFA
B：99.95％CH3CN、0.05％TFA
使用以下线性梯度：经16分钟以流速0.40ml/分钟实现95％A、5％B到95％A、5％B。
方法05_B10_1
UPLC(方法05_B10_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400732
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：
A：0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10％CH3CN(pH 3.5)
B：70％CH3CN、30％H2O
使用以下线性梯度：经8分钟以流速0.40ml/分钟实现40％A、60％B到20％A、80％B。
方法09_B4_1
UPLC(方法09_B4_1)：用装配双波段检测仪的Waters UPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400733
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：A：99.95％H2O、0.05％TFA；B：99.95％CH3CN、0.05％TFA。使用以下线性梯度：经16分钟以0.40ml/分钟流速实现95％A、5％B到5％A、95％B。
方法09_B2_1
UPLC(方法09_B2_1)：用装配双波段检测仪的WatersUPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：A：99.95％H2O、0.05％TFA；B：99.95％CH3CN、0.05％TFA。使用以下线性梯度：经16分钟以0.40ml/分钟流速实现95％A、5％B到40％A、60％B。
方法10_B14_1
UPLC(方法10_B14_1)：用装配双波段检测仪的WatersUPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEHShieldRP18，1.7um，2.1mmx150mm柱于50℃采集214nm和254nm处的UV检测。
将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：A：99.95％H2O、0.05％TFA；B：99.95％CH3CN、0.05％TFA。使用以下线性梯度：经12分钟以0.40ml/分钟流速实现70％A、30％B到40％A、60％B。
方法05_B8_1
UPLC(方法05_B8_1)：用装配双波段检测仪的WatersUPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400742
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：A：0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10％CH3CN(pH 3.5)；B：70％CH3CN、30％H2O。使用以下线性梯度：经8分钟以0.40ml/分钟流速实现50％A、50％B到20％A、80％B。
方法07_B4_1
UPLC(方法07_B4_1)：用装配双波段检测仪的WatersUPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400751
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：A：99.95％H2O、0.05％TFA；B：99.95％CH3CN、0.05％TFA。使用以下线性梯度：经16分钟以0.40ml/分钟流速实现95％A、5％B到5％A、95％B。
方法04_A6_1
UPLC(方法04_A6_1)：用装配双波段检测仪的WatersUPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400752
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：A：10mM TRIS、15mM硫酸铵、80％H2O、20％CH3CN、pH 7.3；B：80％CH3CN、20％H2O。使用以下线性梯度：经16分钟以0.35ml/分钟流速实现95％A、5％B到10％A、90％B。
方法05_B2_1
UPLC(方法05_B2_1)：用装配双波段检测仪的WatersUPLC系统实施RP-分析。用ACQUITY UPLC BEH130，C18，
Figure BDA00001770475400753
1.7um，2.1mmx150mm柱于40℃采集214nm和254nm处的UV检测。将UPLC系统与含有以下物质的两个洗脱液池连接：A：99.95％H2O、0.05％TFA；B：99.95％CH3CN、0.05％TFA。使用以下线性梯度：经16分钟以0.40ml/分钟流速实现95％A、5％B到40％A、60％B。
方法02_B4_4
HPLC(方法02_B4_4)：用装配Waters 2487双波段检测仪的Alliance Waters 2695系统实施RP-分析。用Symmetry300 C18，5um，3.9mmx150mm柱于42℃采集214nm和254nm处的UV检测。用5-95％乙腈、90-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)/水的线性梯度经15分钟以流速1.0ml/分钟洗脱。
方法02_B5_1
HPLC(方法02_B5_1)：用装配Waters 2487双波段检测仪的Alliance Waters 2695系统实施RP-分析。用Symmetry C18，3.5um，3.0mmx100mm柱采集UV检测。用10-95％乙腈、95-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)/水的线性梯度经8分钟以流速1.0ml/分钟洗脱。
MALDI-MS方法
用基质辅助激光解吸和电离-飞行时间质谱测定分子量，在Microflex或Autoflex(Bruker)上记录。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸基质。
NMR方法
用以四甲基硅烷作为内标的Brucker Avance DPX 300(300MHz)记录质子NMR波谱。以ppm给出化学位移(δ)，分离模式如下命名：s，单峰；d，双峰；dd，双双峰；dt，双三重峰；t，三重峰；tt，三三峰(triplet of triplets)；q，四重峰；quint，五重峰；sext，六重峰；m，多重峰和br＝宽峰。
B.中间体合成
1.合成脂肪二酸单酯
在甲苯中让C12、C14、C16和C18二酸与Boc-酐、DMAP和叔丁醇过夜回流，主要产生单叔丁酯。在检查单酸、二酸和二酯混合物后收获。通过洗涤、短柱硅胶过滤和结晶来纯化。
2.合成2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙胺
化学结构13：
Figure BDA00001770475400771
于室温让二盐酸组胺(20.47g；0.111摩尔)和三乙胺(48mL；0.345摩尔)在纯甲醇(400mL)中搅拌10分钟。经30分钟于0℃逐滴加入甲醇(30mL)中的三氟乙酸乙酯(14.6mL；0.122摩尔)。室温搅拌反应混合物达3.5小时，然后真空中蒸发到干燥。让残留物溶于二氯甲烷(450mL)中，加入三乙胺(31mL；0.222摩尔)。然后分段加入三苯甲基氯(34.1g；0.122摩尔)，于室温过夜搅拌混合物。将氯仿(400mL)和水(600mL)倒入反应混合物中。分离水层并用氯仿(3x400mL)萃取。经无水硫酸镁干燥合并的有机层。去掉溶剂，用己烷(1000mL)研制浅褐色固体。过滤悬浮液，得到2，2，2-三氟-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-乙酰胺，为白色固体。
产率：45.54g(91％)。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：8.44(bs，1H)；7.43(s，1H)；7.41-7.33(m，9H)；7.19-7.10(m，6H)；6.65(s，1H)；3.66(q，J＝5.9Hz，2H)；2.79(t，J＝5.9Hz，2H)。
将以上酰胺(45.54g；0.101毫摩尔)溶于四氢呋喃(1000mL)和甲醇(1200mL)中。加入氢氧化钠(20.26g；0.507摩尔)的水溶液(500mL)。于室温搅拌混合物达2小时，然后真空中浓缩。在氯仿(1200mL)和水(800mL)之间分离残留物。用氯仿(3x400mL)萃取水层。合并有机层并经无水硫酸镁干燥。蒸发溶剂得到棕色油状物，让其在真空中干燥3天，得到标题产物，为浅褐色固体。
产率：32.23g(90％)。
总产率：82％。
融点：111-113℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.39(d，J＝1.3，1H)；7.38-7.32(m，9H)；7.20-7.12(m，6H)；6.61(s，1H)；3.00(t，J＝6.6Hz，2H)；2.70(t，J＝6.5Hz，2H)；1.93(bs，2H)。
3.合成2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸
化学结构14：
Figure BDA00001770475400781
让梅钟酸(Meldrum’s acid)(5.52g，38.3毫摩尔)、碳酸钾(26.5g，191毫摩尔)和甲基碘(7.15mL，115毫摩尔)的乙腈(75mL)混合物在75℃于密闭管中加热7小时。让混合物冷却到室温，用二氯甲烷(300mL)稀释，过滤，让滤液在真空中蒸发到干燥。加入乙酸乙酯(75mL)、己烷(75mL)和水(50mL)，分离各相。用10％硫代硫酸钠水溶液(50mL)和水(50mL)洗涤有机层；经无水硫酸镁干燥，真空中去掉溶剂，得到2，2，5，5-四甲基-[1，3]二噁烷-4，6-二酮，为白色固体。
产率：6.59g(79％)。
RF(SiO2，氯仿/乙酸乙酯，98∶2)：0.60。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：1.76(s，6H)；1.65(s，6H)。
在75℃经50分钟将如上所述制备的2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙胺(5.00g，14.2毫摩尔)和三乙胺(9.86mL，70.7毫摩尔)的甲苯(80mL)溶液，逐滴加入到上述二酮化合物(3.65g，21.2毫摩尔)的甲苯(40mL)溶液中。在该温度将混合物再搅拌3小时(直到在TLC上检测到起始胺)，然后蒸发到干燥。让残留物再溶于氯仿(300mL)，用10％柠檬酸水溶液(200mL)洗涤。用氯仿(2x 60mL)萃取水相；合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥，真空中去掉溶剂。用热氯仿(140mL)研制残留物；加入己烷(70mL)，室温过夜搅拌该悬浮液。过滤掉固体，用氯仿/己烷混合物(1∶1，2x50mL)洗涤，真空中干燥，得到标题产物。
产率：6.73g(88％)。
融点：161-162℃。
RF(SiO2，氯仿/甲醇，85∶15)：0.40。
1H NMR波谱(300MHz，DMSO-d6，δH)：12.45(bs，1H)；7.66(t，J＝5.1Hz，1H)；7.57-7.31(m，9H)；7.26(s，1H)；7.20-7.02(m，6H)；6.66(s，1H)；3.25(m，2H)；2.57(t，J＝7.3Hz，2H)；1.21(s，6H)。
4.合成4-(4-叔丁基-苯基)-丁酸
化学结构15：
Figure BDA00001770475400791
分部分将氯化铝粉末(80.0g，600毫摩尔)加入到搅拌的叔丁基苯(40.0g，300毫摩尔)和琥珀酸酐(26.7g，267毫摩尔)和1，1，2，2-四氯乙烷(100mL)混合物中。加入所有氯化铝后，将该混合物倒入冰(500mL)和浓盐酸(100mL)混合物中。分离有机层，用水(500mL)洗涤，蒸馏掉溶剂。让固态残留物溶于15％碳酸钠热水溶液(1000mL)中，过滤，冷却，用盐酸(酸化到pH＝1)沉淀酸。过滤该粗酸，在空气中干燥，从苯(500mL)中重结晶，得到4-(4-叔丁基-苯基)-4-氧-丁酸，为无色晶体。
产率：36.00g(58％)。
融点：117-120℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.93(dm，J＝8.3Hz，2H)；7.48(dm，J＝8.3Hz，2H)；3.30(t，J＝6.6Hz，2H)；2.81(t，J＝6.6Hz，2H)；1.34(s，9H)。
让以上酸(36.0g，154毫摩尔)、氢氧化钾(25.8g，462毫摩尔)、水合肼(20mL，400毫摩尔)和乙二醇(135mL)混合物回流达3小时，然后蒸馏直到蒸气温度升到196-198℃。在再回流14小时后，让混合物稍微冷却，然后倒入冷水(200mL)中。用浓盐酸酸化(到pH＝1)混合物，并用二氯甲烷(2x400mL)萃取。合并有机萃取物，经无水硫酸镁干燥，真空中去掉溶剂，通过柱色谱(硅胶60A，0.060-0.200mm；洗脱液：己烷/乙酸乙酯10∶1-6∶1)纯化残留物，得到标题产物，为淡白色固体。
产率：16.25g(48％)。
融点：59-60℃。
RF(SiO2，乙酸乙酯)：0.60。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.31(dm，J＝8.1Hz，2H)；7.12(dm，J＝8.1Hz，2H)；2.64(t，J＝7.6Hz，2H)；2.38(t，J＝7.4Hz，2H)；1.96(m，2H)；1.31(s，9H)。
5.合成2，2-二甲基-N-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基甲基)-丙酰胺酸
化学结构16：
将盐酸羟胺(15.9g，229毫摩尔)加入到4(5)-咪唑甲醛(20.0g，209毫摩尔)和碳酸钠(12.1g，114毫摩尔)的水(400mL)溶液，让得到的溶液在室温过夜搅拌。将混合物蒸发到100mL，在冰浴中冷却。通过过滤分离固体，将滤液浓缩到40mL。冷却到0℃后，得到另一部分晶体。合并固体(23g)，从乙醇(大约160mL)重结晶，得到咪唑-4(5)-甲醛肟，为无色晶体。
产率：15.98g(69％)。
1H NMR波谱(300MHz，丙酮-d3+D2O，δH)：7.78(bs，1H)；7.74(d，J＝0.9Hz，1H)；7.43(s，1H)。
于0℃在氩气中将乙酰氯(51.0mL，718毫摩尔)逐滴加入到甲醇(670mL)中。30分钟后去掉冷却浴，加入上述肟(16.0g，144毫摩尔)，接着加入披钯碳(5wt％，6.1g)。让混合物在大气压力下氢化17小时，然后通过硅藻土过滤，蒸发溶剂，得到纯4-(氨基甲基)-咪唑二盐酸化物，为无色晶体。
产率：23.92g(98％)。
1H NMR波谱(300MHz，D2O，δH)：8.72(s，1H)；7.60(s，1H)；4.33(s，2H)。
在室温将甲醇(1000mL)中的二盐酸胺(18.9g；111毫摩尔)和三乙胺(93mL；667毫摩尔)搅拌10分钟。经40分钟在0℃逐滴加入甲醇(30mL)中的三氟乙酸乙酯(13.3mL；111毫摩尔)。室温搅拌反应混合物达18小时，然后真空中蒸发到干燥。让残留物溶于干二氯甲烷(2000mL)中，加入三乙胺(31mL；222毫摩尔)。然后加入三苯甲基氯(31.6g；113毫摩尔)，于室温过夜搅拌混合物。将氯仿(1000mL)和水(1000mL)倒入反应混合物中。分离水层，用氯仿(2x300mL)萃取。经无水硫酸镁干燥合并的有机层。去掉溶剂，用己烷(1000mL)研制浅褐色固体。过滤悬浮液，得到2，2，2-三氟-N-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基甲基)-乙酰胺，为白色固体。
产率：46.59g(96％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇95∶5)：0.35。
1H NMR波谱(300MHz，DMSO-d6，δH)：9.77(t，J＝5.7Hz，1H)；7.47-7.34(m，9H)；7.33(d，J＝1.5Hz，1H)；7.13-7.03(m，6H)；6.80(d，J＝0.8Hz，1H)；4.25(d，J＝5.7Hz，2H)。
将以上酰胺(46.6g；107毫摩尔)溶于四氢呋喃(600mL)和乙醇(310mL)中。加入氢氧化钠(21.4g；535毫摩尔)的水(85mL)溶液。室温搅拌混合物达5小时，然后真空中浓缩。在氯仿(1600mL)和水(800mL)之间分离残留物。用氯仿(4x200mL)萃取水层。合并有机层，经无水硫酸镁干燥。蒸发溶剂，得到(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-甲胺，为淡白色固体。
产率：36.30g(100％)。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.38(d，J＝1.3，1H)；7.36-7.30(m，9H)；7.18-7.10(m，6H)；6.69(m，1H)；3.77(s，2H)；1.80(bs，2H)。
将以上胺(10.0g，29.5毫摩尔)和三乙胺(20.5mL，147毫摩尔)的甲苯(220mL)溶液，在75℃经45分钟逐滴加入到2，2，5，5-四甲基-[1，3]二噁烷-4，6-二酮(3.65g，21.2毫摩尔)的甲苯(80mL)溶液中。在该温度将混合物再搅拌3小时(直到在TLC上检测到起始胺)，然后蒸发到干燥。让残留物再溶于氯仿(500mL)，并用10％柠檬酸水溶液(300mL)洗涤。用氯仿(100mL)萃取水相；合并氯仿相，用水(150mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空中去掉溶剂。通过快速柱色谱(硅胶Fluka 60，二氯甲烷/甲醇98∶2至9∶1)纯化残留物，从氯仿/己烷混合物中结晶，得到标题产物，为浅褐色晶体。
产率：9.80g(73％)。
融点：174-175℃。
RF(SiO2，氯仿/甲醇，85∶15)：0.35。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：8.45(t，J＝5.8Hz，1H)；7.53(s，1H)；7.40-7.28(m，9H)；7.14-7.01(m，6H)；6.84(s，1H)；4.39(d，J＝5.8Hz，2H)；1.44(s，6H)。
6.合成3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙胺
化学结构17：
Figure BDA00001770475400821
在1小时期间将四氢呋喃/二乙醚(1∶1，100mL)中的3-(1-三苯甲基-4-咪唑基)丙酸乙酯(93.0g，223毫摩尔)逐滴加入到氢化铝锂(17.0g，446毫摩尔)悬浮液中。让混合物回流3小时，然后在冰/水冷却下将其用水(100mL)、20％氢氧化钠(100mL)和水(100mL)处理，过滤，用四氢呋喃洗涤固体。经无水碳酸钾干燥有机相，过滤并蒸发，得到3-(1-三苯甲基-4-咪唑基)丙醇，为白色固体。
产率：68.0g(82％)。
融点：127-129℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.40-7.24(m，10H)；7.17-7.06(m，6H)；6.55(s，1H)；3.72(t，J＝5.3Hz，2H)；2.68(t，J＝6.6Hz，2H)；1.86(m，2H)。
在0℃经1小时期间将甲烷磺酰氯(8mL，104毫摩尔)逐滴加入到以上醇(32.0g，86.8毫摩尔)的二氯甲烷(400mL)和三乙胺(15.5mL)溶液中。无需冷却让混合物再搅拌1小时；然后用5％碳酸氢钠洗涤，经无水硫酸镁干燥。在30℃真空中蒸发二氯甲烷，在下一步骤直接使用残留的油状甲磺酸酯。
产率：31.2g(80％)。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.37-7.30(m，10H)；7.16-7.09(m，6H)；6.58(s，1H)；4.24(t，J＝6.3Hz，2H)；2.96(s，3H)；2.67(m，2H)；2.10(m，2H)。
在环境温度过夜搅拌以上甲磺酸酯(30.0g，67毫摩尔)、邻苯二甲酰亚胺钾(18.0g，100毫摩尔)、碘化钠(4.0g，26.7毫摩尔)和二甲基甲酰胺(200mL)的混合物，然后用水(2L)和苯(2L)处理。经无水硫酸镁干燥有机相，过滤和蒸发溶剂，得到残留物，其从苯重结晶，得到1-三苯甲基-4-(3-苯二甲酰亚氨基丙基)咪唑，为白色固体。
产率：17.2g(52％)。
融点：211-214℃。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.83(m，2H)；7.72(m，2H)；7.39-7.27(m，10H)；7.18-7.07(m，6H)；6.60(d，J＝0.9Hz，1H)；3.72(t，J＝7.4Hz，2H)；2.60(t，J＝7.5Hz，2H)；1.99(m，2H)。
在60℃将以上咪唑衍生物(26.6g，53.5毫摩尔)溶于乙醇(300mL)和四氢呋喃(150mL)中，加入水合肼(50g，1摩尔)，让该溶液回流6小时，然后70℃加热过夜。通过过滤去除固体，用25％氨(2.5L)和二氯甲烷(2.5L)水溶液处理滤液。经无水碳酸钾干燥有机层并蒸发，得到残留物，其通过柱色谱在硅胶(Fluka 60，用氨水饱和的氯仿/甲醇)上纯化，得到标题化合物，为白色固体。
产率：14.2g(72％)。
融点：112-113℃。
RF(SiO2，用氨水饱和的氯仿/甲醇9∶1)：0.30。
1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，δH)：7.37-7.28(m，10H)；7.18-7.09(m，6H)；6.53(d，J＝1.3Hz，1H)；2.74(t，J＝6.9Hz，2H)；2.59(t，J＝7.4Hz，2H)；1.95(bs，2H)；1.78(m，2H)。
7.合成2，2-二甲基-N-[3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙基]-丙酰胺酸
化学结构18：
Figure BDA00001770475400841
在DCM中让2-氯三苯甲基氯树脂(2.3g，3.0毫摩尔)溶胀20分钟，过滤。让丙二酸二甲酯(2当量；6.0毫摩尔；793mg)溶解于DCM∶DMF1∶1(10mL)中，并将其加入树脂中，接着加入DIPEA(6当量；18.0毫摩尔；3.14mL)和DCM(10mL)。于RT过夜振荡树脂。过滤树脂，用DCM∶MeOH∶DIPEA(17∶2∶1)、DCM、NMP og DCM(每样2x25mL洗涤。让树脂在DMF中溶胀20分钟，过滤。加入HOAt(3当量；9.0毫摩尔；1.23g)、DIC(3当量；9.0毫摩尔；1.40mL)和DMF(25mL)，让树脂在RT振荡90分钟。过滤树脂，加入3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙胺(1.8当量；5.40毫摩尔；1.84g)、DIPEA(4当量；6.0毫摩尔；2.09mL)和DMF(10mL)。让树脂振荡2天。过滤树脂，用NMP(5x20mL)和DCM(10x20mL)洗涤。将2，2，2-三氟乙醇/二氯甲烷1∶1(20mL)加入到树脂中，振荡2小时。用2，2，2-三氟乙醇/二氯甲烷1∶1(10mL)洗涤树脂，收集合并的滤液，真空中浓缩，得到标题化合物。
产率：600mg(41％)。
LCMS4：m/z＝482(M+1)。
UPLC(方法02_B4_4)：Rt＝8.07分钟。
1H NMR波谱(300MHz，DMSO-d6，δH)：7.36-7.44(9H，m)，7.07-7.12(6H，m)，6.62(1H，s)，3.02-3.09(2H，q)，2.38-2.43(2H，t)，1.61-1.69(2H，m)，1.26(6H，s)。
8.合成2，2-二甲基-N-[3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-丙基]-丙酰胺酸合成2，2-二甲基-N-吡啶-2-基甲基丙酰胺酸
化学结构19：
在DCM中让2-氯三苯甲基氯树脂(2.3g，3.0毫摩尔)溶胀20分钟，过滤。让丙二酸二甲酯(2当量；6.0毫摩尔；793mg)溶解于DCM∶NMP1∶1(10mL)中，并将其加入树脂中，接着加入DIPEA(6当量；18.0毫摩尔；3.14mL)和DCM(10mL)。于RT过夜振荡树脂。过滤树脂，用DCM∶MeOH∶DIPEA(17∶2∶1)、DCM、NMP og DCM(每样2x25mL洗涤。让树脂在NMP中溶胀20分钟，过滤。加入HOAt(3当量；9.0毫摩尔；1.23g)、DIC(3当量；9.0毫摩尔；1.40mL)和NMP(25mL)，让树脂在RT振荡90分钟。过滤树脂，加入2-(氨基甲基)吡啶(2当量；6毫摩尔；659mg)、DIPEA(4当量；6.0毫摩尔；2.09mL)和NMP(10mL)。让树脂过夜振荡。过滤树脂，用NMP(5x20mL)和DCM(10x20mL)洗涤。将TFA/TIS/水(95∶2.5∶2.5；30mL)加入到树脂中，振荡1小时，过滤，真空中浓缩，得到标题化合物。
产率：600mg(41％)。
LCMS4：m/z＝223(M+1)
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝1.79分钟
C.合成本发明化合物
实施例1
[Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构20：
Figure BDA00001770475400861
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法05_B2_1)：Rt＝9.78分钟(97％)
UPLC(方法04_A2_1)：Rt＝13.48分钟(93％)
LCMS4：(M/4)+1＝830；(M/3)+1＝1106；准确质量＝3320；计算值＝3320
实施例2
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构21：
制备方法：SPPS方法A，接着是手动除去Mtt基团，手动偶联Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单-叔丁酯。
HPLC(方法02_B4_4)：Rt＝9.02分钟(99％)
HPLC(方法02_B5_1)：Rt＝13.15分钟(98％)
LCMS4：(M/4)+1＝1010；(M/3)+1＝1346；准确质量＝4036；计算值＝4036
实施例3
[Aib8，Glu30，His31，Gln34，Lys36]GLP-1(7-37)基-Glu38-肽酰胺
化学结构22：
Figure BDA00001770475400871
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法05_B2_1)：Rt＝9.46分钟(100％)
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝5.12分钟(93％)
LCMS4：(M/4)+1＝870；(M/3)+1＝1160；准确质量＝3479；计算值＝3479
实施例4
Nε12(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-羧基-十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)[Aib8，Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构23：
Figure BDA00001770475400872
制备方法：通过SPPS方法B用Wang-树脂(LL)制备所述肽。12位用Fmoc-Lys(Mtt)-OH，7位用Boc-His(trt)-OH。用HFIP手动除去Mtt。由UPLC和MALDI-MS表征最终产物。
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.2分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝9.85分钟
MALDI-MS：3986
实施例5
Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Lys12，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构24：
Figure BDA00001770475400881
制备方法：通过SPPS方法B用Wang-树脂(LL)制备所述肽。12位用Fmoc-Lys(Mtt)-OH，7位用Boc-His(trt)-OH。用HFIP手动除去Mtt。由UPLC和MALDI-MS表征最终产物。
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝7.9分钟
UPLC(方法04_A4_1)：Rt＝3.9分钟
MALDI-MS：4016.8
实施例6
Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构25：
制备方法：通过SPPS方法B用Wang-树脂(LL)制备所述肽。12位用Fmoc-Lys(Mtt)-OH，7位用Boc-His(trt)-OH。用HFIP手动除去Mtt。由UPLC和MALDI-MS表征最终产物。
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝7.9分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝7.1分钟
MALDI-MS：4114
实施例7
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][His31，Gln34]GLP-1-(7-37)-肽
化学结构26：
Figure BDA00001770475400891
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝12.90分钟(96％)
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝6.34分钟(91％)
LCMS4：(M/4)+1＝1006；(M/3)+1＝1341；准确质量＝4022；计算值＝4023
实施例8
Nε18[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Lys18，Glu22，Arg26，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构27：
Figure BDA00001770475400892
制备方法：通过SPPS方法B制备所述肽。通过分析型UPLC和LC-MS表征最终产物，但由方法D除去Mtt并偶联接头。
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝12.4分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝8.5分钟
LCMS4：4178.0
计算的MW＝4177.7
实施例9
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}[Gly8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构28：
制备方法：通过SPPS方法B制备所述肽，通过分析型UPLC和LC-MS表征最终产物，但由方法D除去Mtt并偶联接头。
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝13.0分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝10.0分钟
LCMS4：4008.0
计算的MW＝4008.49
实施例10
Nε26[(S)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-羧基-十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]-乙氧基}乙酰基氨基)丁酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构29：
Figure BDA00001770475400902
使用SPPS方法B，并由UPLC和LC-MS表征最终产物。
UPLC(方法04_A4_1)：Rt＝6.08分钟
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.61分钟
LCMS4：(1010x4)-4＝4036
计算的MW＝4036.5
实施例11
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][D-Ala8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构30：
制备方法：使用SPPS方法B，并由UPLC和LCMS表征最终产物。
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝10.33分钟
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.80分钟
LCMS4：(1005.97x4)-4＝4019.9
计算的MW＝4022.5
实施例12
N8 3H-咪唑-4-基-乙酰基，Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][His31，Gln34]GLP-1(8-37)-肽
化学结构31：
Figure BDA00001770475400912
制备方法：通过SPPS方法B制备所述肽。由UPLC和LC-MS表征最终产物，但将2当量的DIEA加入到咪唑-4-乙酸盐酸盐和HOAt的溶液中，在使用前过滤该溶液。
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝9.82分钟
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.95分钟
LCMS1：(999.26x4)-4＝3393.0
计算的MW＝3393.5
实施例13
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Ser8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构32：
Figure BDA00001770475400921
制备方法：通过SPPS方法B制备所述肽，通过分析型UPLC和LC-MS表征最终产物，但由方法D除去Mtt并偶联接头。
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝12.8分钟
UPLC(方法04_A4_1)：Rt＝4.5分钟
LCMS4：4038.0
计算的MW＝4008.51
实施例14
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构33：
Figure BDA00001770475400922
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法09_B2_1)：Rt＝12.48分钟(91％)
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝5.67分钟(91％)
LCMS4：(M/4)+1＝1002；(M/3)+1＝1337；准确质量＝4008；计算值＝4008
实施例15
Nε27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Arg26，Lys27，His31，Gln34)GLP-1(7-37)-肽
化学结构34：
制备方法：通过SPPS方法E制备所述肽，通过分析型UPLC和MALDI TOF-MS表征最终产物：
UPLC(方法07_B4_1)：Rt＝8.3分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝11.2分钟
MALDI-MS：4062
计算的MW＝4064
实施例16
Nε26[2-(2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构35：
在具0.22毫摩尔/g装载量的Gly-PHB Tentagel树脂上合成肽。
在Liberty合成仪上于微波条件下实施合成，其用5分钟在高达70℃与DIC/HOAt单偶联，但组氨酸在高达50℃时偶联20分钟。用标准保护基保护所有氨基酸，但待酰化的赖氨酸用Mtt保护(在Lys26情况下)。用5％哌啶/NMP在50℃脱保护3分钟。合成完成后，用10当量Boc-碳酸酯和10当量的DIPEA封闭N-末端30分钟。通过用纯六氟异丙醇处理20分钟来除去Mtt基团，在Liberty上用与上相同的方案用Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸、Fmoc-Glu-OBut和十六碳烷二酸单-叔-丁酯逐步构建侧链。用TFA/水/TIS(95∶2.5∶2.5)裂解肽2小时，并通过用二乙醚沉淀来分离。
通过在装有5u或7u C18二氧化硅的20mmx250mm柱上的制备型HPLC来纯化粗肽。让肽溶于5ml 50％乙酸中，用H2O稀释到20ml，注射入柱中，然后在40℃下在50分钟期间用40-60％CH3CN/0.1％TFA 10ml/分钟的梯度洗脱。收集含肽流分，由MALDI和UPLC估测纯度。在用水稀释洗出液后冻干纯化肽。
MALDI证实了理论分子量3863.3。
在UPLC(方法08_B4_1)上的保留时间为8.32分钟。
在UPLC(方法04_A3_1)上的保留时间为8.69分钟。
实施例17
Nε26[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构36：
Figure BDA00001770475400941
如实施例16制备该化合物。
MALDI证实了理论分子量3716.2。
在UPLC(方法08_B4_1)上的保留时间为8.48分钟。
在UPLC(方法04_A3_1)上的保留时间为9.07分钟。
实施例18
N9-{2-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙酰基}-Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][His31，Gln34]GLP-1(9-37)-肽
化学结构37：
Figure BDA00001770475400951
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联2，2-二甲基-N-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)-乙基]-丙酰胺酸、Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单-叔丁酯。
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝10.16分钟
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.76分钟
LCMS4：Rt＝2.23分钟.m/z＝1341(m/3)，1006(m/4)
实施例19
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(17-羧基-十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34]GLP-1(7-37)-肽
化学结构38：
Figure BDA00001770475400952
制备方法：SPPS方法B。用与Aib氨基酸相同的偶联条件来偶联Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单-叔丁酯。
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝11.9分钟
UPLC(方法09_B4_1)：Rt＝8.67分钟
LCMS4：(1010x4)-4＝4036，(1346x3)-3＝4036.5
计算的质量＝4036
实施例20
Nε27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Glu22，Arg26，Lys27，His31，Gln34)GLP-1(7-37)-肽
化学结构39：
Figure BDA00001770475400961
制备方法：由SPPS方法E制备所述肽，由分析型UPLC和MALDITOF-MS来表征最终产物：
UPLC(方法07_B4_1)：Rt＝8.2分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝9.9分钟
MALDI-MS：4136
计算的MW＝4135
实施例21
[Imp7，Glu22，Arg26，His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构40：
Figure BDA00001770475400962
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法05_B2_1)：Rt＝9.50分钟
UPLC(方法04_A2_1)：Rt＝13.22分钟
LCMS4(M/4)+1＝866；(M/3)+1＝1154；准确质量＝4874
实施例22
Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Imp7，Glu22，Arg26，His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构41：
Figure BDA00001770475400971
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法05_B2_1)：Rt＝14.15分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝11.41分钟
LCMS4(M/5)+1＝870；(M/4)+1＝1087；准确质量＝4345
实施例23
Nε36-[2-[2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Glu30，His31，Gln34，Lys36]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu酰胺
化学结构42：
Figure BDA00001770475400972
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法05_B2_1)：Rt＝13.32分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝10.14分钟
LCMS4：(M/5)+1＝785；(M/4)+1＝981；准确质量＝3920
实施例24
Nα([Aib8，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽基)-赖氨酸
化学结构43：
Figure BDA00001770475400973
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝9.30分钟
UPLC(方法04_A2_1)：Rt＝15.55分钟
LCMS4(M/5)+1＝690；(M/4)+1＝863；准确质量＝3449
实施例25
[Aib8，His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构44：
Figure BDA00001770475400981
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝9.28分钟
LCMS4(M/5)+1＝679；(M/4)+1＝849；准确质量＝3449
实施例26
Nε26-[(4S)-4-羧基-4-(十四酰基氨基)丁酰基]，Nε37-[(4S)-4-羧基-4-(十四酰基氨基)丁酰基]-[Aib8，His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构45：
Figure BDA00001770475400982
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝11.76分钟
LCMS4(M/5)+1＝815；(M/4)+1＝1018；准确质量＝4071
实施例27
Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构46：
Figure BDA00001770475400991
制备方法：SPPS方法B
UPLC(方法09_B4_1)：Rt＝8.08分钟
UPLC(方法04_A6_1)：Rt＝6.01分钟
LCMS4：Rt＝1.85分钟。m/z：3975；M/4＝994；M/5＝795
实施例28
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34，Lys37]GLP-1(7-37)-肽
化学结构47：
Figure BDA00001770475400992
制备：SPPS方法A，以低-载量Fmoc-Lys(Mtt)-Wang树脂开始。26位用Fmoc-Lys(Mtt)-OH，7位用Boc-His(trt)-OH。用HFIP除去Mtt，让8-(9-芴基甲氧基羰基-氨基)-3，6-二氧杂辛酸(自Iris Biotech市购)偶联2次，接着用SPPS方法A偶联Fmoc-Glu-OtBu和4-(9-羧基-壬氧基)-苯甲酸叔丁酯(如WO 2006/082204实施例25步骤2所述制备)。
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝4.95分钟(92％)
LCMS4：m/z＝4011，计算值＝4011
实施例29
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]，Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，His31，Gln34，Lys37]GLP-1(7-37)-肽
化学结构48：
Figure BDA00001770475401001
制备方法：如实施例16，但使用装载量为0.35毫摩尔/g的Lys(Mtt)-Wang树脂。
MALDI证实了4655.2的理论分子量。
UPLC(方法08_B4_1)：Rt 7.72分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt 5.70分钟
实施例30
Nε26-2，3-双[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丙酰基-[Aib8，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构49：
Figure BDA00001770475401002
制备方法：SPPS方法B
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.12分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝7.12分钟
LCMS_4：Rt＝1.42分钟。m/z：4727；M/3＝1575；M/4＝1182
实施例31
Nε18-18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[1-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Lys18，Glu22，His26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构50：
Figure BDA00001770475401011
制备方法：SPPS方法B
LCMS4：Rt＝3.62分钟，m/z：4297.0
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝12.25分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝10.68分钟
实施例32
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Glu22，Arg26，Lys27，Glu30，His31，Gln34，Pro37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构51：
Figure BDA00001770475401012
制备方法：SPPS方法B
MALDI-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)证实了4234的理论分子量；m/z：4234(1A)
UPLC(方法07_B4_1)：Rt＝8.3分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝9.2分钟
实施例33
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构52：
Figure BDA00001770475401021
制备方法：SPPS方法B
LCMS4：Rt＝1.94分钟；m/z：3994.5
UPLC(方法08_B2_1)：Rt＝12.25分钟
UPLC(方法04_A3_1)：Rt＝8.63分钟
实施例34
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构53：
Figure BDA00001770475401022
制备方法：SPPS方法B
LCMS4 Rt：＝1.92分钟；m/z：4797.3；M/4：1199.8；M/3：1599.4
UPLC(方法09_B4_1)：Rt＝8.12分钟
UPLC(方法：05_B8_1)：Rt＝2.03分钟
实施例35
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构54：
Figure BDA00001770475401031
制备方法：SPPS方法B
LCMS4：Rt＝1.99分钟；m/z：4697.0
UPLC(方法09_B2_1)：Rt＝12.20分钟
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝5.31分钟
实施例36
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构55：
Figure BDA00001770475401032
制备方法：SPPS方法B
LCMS4：Rt＝1.89分钟；m/z：4641.2
UPLC(方法09_B2_1)：Rt＝11.20分钟
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝4.00分钟
实施例37
Nε26-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]，Nε37-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]-[His31，Gln34，Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构56：
制备方法：SPPS方法B
LCMS4 Rt＝1.97分钟；m/z：4797.3；M/4：1200.1；M/5：1599.8
UPLC(方法09_B4_1)：Rt＝8.24分钟
UPLC(方法05_B8_1)：Rt＝2.88分钟
实施例38
Nε26-4-[16-(1H-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基]丁酰基-[His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构57：
Figure BDA00001770475401042
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法09_B2_1)：Rt＝8.29分钟
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝6.40分钟
LCMS4 m/z：3762
实施例39
N8-甲基，Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构58：
Figure BDA00001770475401051
制备方法：SPPS方法B
MALDI-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)证实了4037的理论分子量；m/z：4035(1A)
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝5.8分钟
UPLC(方法07_B4_1)：Rt＝8.5分钟
实施例40
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构59：
Figure BDA00001770475401052
制备方法：SPPS方法B
LCMS4：Rt＝1.89分钟；m/z：4121.6
UPLC(方法09_B2_1)：Rt＝11.97分钟
UPLC(方法05_B5_1)：Rt＝5.30分钟
实施例41
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Glu22，Lys24，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构60：
Figure BDA00001770475401061
制备方法：SPPS方法B
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝7.9分钟
UPLC(方法05_B8_1)：Rt＝3.11分钟
MALDI-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)：m/z：4194
实施例42
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Ile25，Arg26，Lys27，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构61：
Figure BDA00001770475401062
制备方法：SPPS方法B
MALDI-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)证实了4106的理论分子量；m/z：4105(1A)
UPLC(方法07_B4_1)：Rt＝8.5分钟
实施例43
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8，Lys16，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构62：
Figure BDA00001770475401071
制备方法：SPPS方法B
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝8.06分钟
LCMS4：(M/5)+1＝834；(M/4)+1＝1042；准确质量＝4167
实施例44
Nε26-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基]-[His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构63：
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法10_B14_1)：Rt＝6.66分钟
LCMS4(M/4)+1＝927；(M/3)+1＝1235；准确质量＝3704
实施例45
Nε26-[(4S)-4-羧基-4-(十六酰基氨基)丁酰基]-[His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构64：
Figure BDA00001770475401073
制备方法：SPPS方法A
UPLC(方法10_B14_1)：Rt＝10.13分钟
LCMS4(M/4)+1＝913；(M/3)+1＝1226；准确质量＝3675
实施例46
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys12，Glu22，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构65：
Figure BDA00001770475401081
制备方法：SPPS方法B
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝7.76分钟
MALDI-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)：m/z：4102
实施例47
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Glu22，Lys24，Arg26，His31，Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽
化学结构66：
制备方法：SPPS方法B
UPLC(方法08_B4_1)：Rt＝7.78分钟
MALDI-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)：m/z：4178
药理学方法
实施例48：体外效价
本实施例的目的是测定本发明GLP-1化合物的体外活性或效价。
如下所述测定实施例1-47的GLP-1的类似物和衍生物的效价，即在含有表达人GLP-1受体的膜的培养基中刺激环AMP(cAMP)的形成。
原理
用目的GLP-1类似物或衍生物刺激表达人GLP-1受体的来自稳定转染的细胞系BHK467-12A(tk-ts13)的纯化的质膜，用来自PerkinElmer Life Sciences的AlphaScreenTM cAMP测定试剂盒测量产生cAMP的效价。AlphaScreen测定的基本原理是内源cAMP和外源加入的生物素-cAMP之间的竞争。通过用与受体珠缀合的特异性抗体实现cAMP捕获。
细胞培养和膜的制备
选择稳定转染的细胞系和高表达克隆用于筛选。让细胞在DMEM、5％FCS、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和0.5mg/ml的选择标记G418中于5％CO2生长。
用PBS洗涤2X大约80％汇合的细胞，用Versene(乙二胺四乙酸四钠盐的水溶液)收获，以1000rpm离心5分钟，去掉上清液。另外的步骤都在冰上进行。通过Ultrathurax让细胞沉淀在10ml缓冲液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH＝7.4)中均质化20-30秒，以20.000rpm离心15分钟，将沉淀重悬于10ml缓冲液2(20mMNa-HEPES、0.1mM EDTA、pH＝7.4)中。让悬浮液均质化20-30秒，以20,000rpm离心15分钟。让缓冲液2中的悬浮液再次重复均质化和离心，将膜重悬于缓冲液2中。测定蛋白质浓度，将膜储存在-80℃直到使用。
在平底的1/2-面积的96-孔板(Costar货号：3693)中实施测定。最终体积为每孔50μl。
溶液和反应试剂
来自Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreen cAMP测定试剂盒(货号：6760625M)；含有抗-cAMP受体珠(10U/μl)、链霉抗生物素供体珠(10U/μl)和生物素化的-cAMP(133U/μl)。
AlphaScreen缓冲液，pH＝7.4：50mM TRIS-HCl(Sigma，货号：T3253)；5mM HEPES(Sigma，货号：H3375)；10mM MgCl2，6H2O(Merck，货号：5833)；150mM NaCl(Sigma，货号：S9625)；0.01％吐温(Merck，货号：822184)。使用前将以下加入到AlphaScreen缓冲液中(指最终浓度)：BSA(Sigma，货号：A7906)：0.1％；IBMX(Sigma，货号：I5879)：0.5mM；ATP(Sigma，货号：A7699)：1mM；GTP(Sigma，货号：G8877)：1uM。
cAMP标准(测定中稀释系数＝5)：cAMP溶液：5μL的5mMcAMP-储液+495μL AlphaScreen缓冲液。
在AlphaScreen缓冲液中制备cAMP标准以及待测GLP-1类似物或衍生物的合适的稀释系列，例如以下8种浓度的GLP-1化合物：10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13和10-14M和例如cAMP的系列10-6至3x10-11。
膜/受体珠
使用hGLP-1/BHK 467-12A膜；6μg/孔对应于0.6mg/ml(每孔所用膜量可变化)。
“无膜”：AlphaScreen缓冲液中的受体珠(最终15μg/ml)
“6μg/孔膜”：AlphaScreen缓冲液中的膜+受体珠(最终15μg/ml)。
加10μl“无膜”到cAMP标准(每孔一式二份)、阳性和阴性对照中。
加10μl“6μg/孔膜”到GLP-1和类似物(每孔一式二份/一式三份)
阳性对照：10μl“无膜”+10μl AlphaScreen缓冲液
阴性对照：10μl“无膜”+10μl cAMP储液(50μM)
因为珠对直接光照敏感，所以任何处理都在黑暗(尽可能黑)或在绿光中。在冰上进行所有稀释。
程序
1.制备AlphaScreen缓冲液；
2.在AlphaScreen缓冲液中溶解并稀释GLP-1/类似物/cAMP标准；
3.制备供体珠溶液并在R.T孵育30分钟；
4.将cAMP/GLP-1/类似物加到板中：每孔10μl；
5.制备膜/受体珠溶液，并将其加到板中：每孔10μl；
6.加入供体珠：每孔30μl；
7.用铝箔包裹板，于RT在振荡器中孵育3小时(极为缓慢)；
8.在AlphaScreen上计数-在AlphaScreen中计数前让每一板预孵育3分钟。
结果
用Graph-Pad Prism软件(版本5)计算EC50[pM]值。
体外证实了了所有化合物、类似物和衍生物的效价。44种化合物具有对应于2000pM或更低的EC50的令人满意的体外效价；40种化合物甚至具有1000pM或更低的EC50的更有效的效价；33种化合物还具有进一步改进的对应于500pM或更低的EC50的效价；21种化合物为对应于200pM或更低的EC50的极高的效价；和13种化合物具有对应于100pM或更低的EC50的极为令人满意的效价。5种类似物的EC50在40-160pM范围内。
若需要，可将与GLP-1有关的倍数变化计算为EC50(GLP-1)/EC50(类似物)-3693.2。
实施例49：GLP-1受体结合
本实验目的是研究与本发明GLP-1化合物的GLP-1受体结合，及白蛋白的存在如何潜在地影响该结合。这在体外实验中如下所述进行。
通过其从受体取代125I-GLP-1的能力来测量实施例1-47的GLP-1类似物和衍生物与人GLP-1受体的结合亲和力。为了测定所述化合物与白蛋白的结合，用低浓度白蛋白(0.005％-对应于其在示踪剂中的残留量)以及高浓度白蛋白(加2.0％)实施测定。
结合亲和力IC50的变化表明目的肽与白蛋白结合，藉此预测在动物模型中可能延长目的肽的药代动力学概况。
条件
物种(体外)：仓鼠
生物学终点：受体结合
测定方法：SPA
受体：GLP-1受体
细胞系：BHK tk-ts13
细胞培养和膜纯化
选择稳定转染的细胞系和高表达克隆用于筛选。让细胞在DMEM、10％FCS、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和1.0mg/ml的选择标记G418中于5％CO2生长。
用PBS洗涤2次细胞(大约80％汇合)，用Versene(乙二胺四乙酸四钠盐的水溶液)收获，接着以1000rpm离心5分钟来分离。在随后步骤中以尽可能的程度让细胞/细胞沉淀保持在冰上。用Ultrathurax让细胞沉淀在合适量的缓冲液1(视细胞量而定，但例如10ml)中均质化20-30秒。以20.000rpm让均质物离心15分钟。将沉淀重悬(均质化)于10ml缓冲液2中并再次离心。再次重复该步骤。将得到的沉淀重悬于缓冲液2中，测定蛋白质浓度，将膜储存在-80℃。
缓冲液1：20mM Na-HEPES+10mM EDTA，pH 7.4
缓冲液2：20mM Na-HEPES+0.1mM EDTA，pH 7.4
结合测定：
SPA：
在测定缓冲液中稀释测试化合物、膜、SPA-颗粒和[125I]-GLP-1(7-36)NH2。将25ul(微升)测试化合物加入到Optiplate中。加入(50ul)HSA(含有2％HSA的“高白蛋白”实验)或缓冲液(含有0.005％HSA的“低白蛋白”实验)。加入(50ul)对应于0.1-0.2mg蛋白/ml(优选优化每一膜制品)的5-10ug蛋白质/样品。以0.5mg/孔(50ul)的量加入SPA-颗粒(小麦胚凝集素SPA珠，Perkin Elmer，#RPNQ0001)。用[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(对应于49.880DPM的最终浓度为0.06nM，25ul)开始孵育。用板密封剂密封板，在30℃振荡孵育120分钟。让板离心(1500rpm，10min)，在Topcounter中计数。
测定缓冲剂：
50mM HEPES
5mM EGTA
5mM MgCl2
0.005％吐温 20
pH 7.4
HSA为SIGMA A1653
计算
从曲线读出IC50值，为从受体取代50％的125I-GLP-1的浓度，并测定[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]比率。
通常在低白蛋白浓度时的GLP-1受体结合应该近可能令人满意，其对应于低IC50值。
高白蛋白浓度时的IC50值是白蛋白对化合物与GLP-1受体结合的影响的量度。众所周知，GLP-1衍生物亦与白蛋白结合。这通常是所期需的效果，其延长其在血浆中的寿命。因此，对于衍生物，高白蛋白时的IC50值通常比低白蛋白时的IC50值高，这符合白蛋白结合与GLP-1受体竞争结合所引起的降低的GLP-1受体结合。
因此，高比率(IC50值(高白蛋白)/IC50值(低白蛋白))可作为以下的指示：目的衍生物良好地结合白蛋白(可具有长半衰期)，其本身亦良好地与GLP-1受体结合((高白蛋白)IC50值高，(低白蛋白)IC50值低)。
结果
获得以下结果，其中″比率″指[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA])：
除5种类似物和2种衍生物外，所有化合物都具有高于1.0的比率；35种衍生物高于10；27种衍生物高于25；23种衍生物高于50；13种衍生物高于100；7种衍生物具有高于250的比率。
此外，关于IC50(低白蛋白)，所有化合物都具有低于600nM的IC50(低白蛋白)；除1种外所有的都低于500nM；除3种外都低于100nM；39种低于50nM；34种化合物低于25.00nM；27种化合物低于10.00nM；21种化合物低于5.00nM；10种化合物低于1.00nM。5种类似物具有2-15nM范围内的IC50(低白蛋白)。
最后，关于IC50(高白蛋白)，所有化合物都具有1000.00nM或更低的IC50(高白蛋白)；41种化合物低于1000.00nM；29种化合物低于500.00nM；13种化合物低于100.00nM；10种化合物低于50.00nM。5种类似物具有0.35-2.97nM范围内的IC50(高白蛋白)。
在存在低白蛋白时，所有化合物、类似物以及衍生物都很好地与GLP-1受体结合。此外，如所希望的那样，增加的白蛋白浓度主要影响衍生物与受体的结合。
实施例50：抵抗肠酶降解的稳定性
本实施例目的是测定本发明化合物抵抗肠酶降解的稳定性。
在测定中GLP-1(7-37)作为一种标准品使用，为了比较包括利拉糖肽和司美鲁肽。
所测试的化合物为实施例1-23、27-30、32-35、38-39和41-47的类似物和衍生物。
肠中最强的蛋白降解活性来源于胰腺，包括丝氨酸内肽酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性酶以及几种类型的羧肽酶。
开发了用来自大鼠小肠提取物的测定，如下所述来使用。
来自大鼠小肠的提取物
自大鼠制备小肠，用8ml的150mM NaCl、20mM Hepes pH 7.4冲洗。让溶液以4,600rpm在带有75006445转头的Heraeus Multifuge 3S-R离心机中离心15分钟。去掉上清液，通过0.22μm Millipore MillexGV PVDF膜过滤。合并几只动物的滤液，以使个体差异平均化。
通过Bradford测定(参见例如Analytical Biochemistry(1976)，第72卷第248-254页和Analytical Biochemistry(1996)，第236第302-308页)来测定获得的提取物的蛋白含量。
降解测定
让2.5纳摩尔待测化合物与250μl体积的肠提取物在37℃经1小时时间孵育。在pH 7.4的20mM Hepes存在下测定肠样品。在试验性实验中滴定肠提取物浓度，以使GLP-1(7-37)半衰期(t1/2)在10-20分钟范围内。使用1.4μg/ml浓度的小肠提取物。混合除肠提取物外的所有组分，在37℃预温10分钟。在加入肠提取物后立即取样品50μl，并将其与同样体积的1％三氟乙酸(TFA)混合。因此，在15、30和60分钟后取另外的样品。
样品分析
UPLC分析
通过UPLC用具BEH C18 1.7μm 2.1x50mm柱的Waters Acquity系统分析10μl样品，其使用经5分钟以0.6ml/分钟流速的30-65％梯度的0.1％TFA和0.07％TFA/乙腈。在减去基线后，对在214nm波长处记录的HPLC色谱图中完整化合物的峰积分进行计算。
MALDI-TOF分析
将每一样品1μl转移到Bruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDI靶标中。用Bruker Autoflex基质辅助激光解析电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪实施分析，其使用具有延长的检测范围500-5000Da的预定方法“PAC_测量”和预定标定方法“PAC_标定”。
数据分析
用HPLC色谱图的峰积分对时间作图。通过用SigmaPlot 9.0软件和用于2-参数指数衰减的方程拟合数据来计算各个化合物的半衰期。
对于每一种测试化合物，相对半衰期(相对T1/2)计算为目的化合物的半衰期(T1/2)除以以同样方式测定的GLP-1(7-37)的半衰期(T1/2)。
结果
已知化合物利拉糖肽和司美鲁肽的相对半衰期分别为4.8和1.2。
所测试的全部38种GLP-1类似物和衍生物具有至少1的相对半衰期；36种化合物具有至少2的相对半衰期；3种化合物具有至少5的半衰期，9种化合物具有至少10的半衰期；和3种化合物具有至少15的半衰期。37种化合物具有高于司美鲁肽的相对半衰期。25种化合物具有高于利拉糖肽的相对半衰期。所测试的三种类似物的相对半衰期在3-6范围内。
实施例51：大鼠药代动力学
本实施例目的是研究本发明衍生物的大鼠体内半衰期。
用实施例2、7、14、16-17、20、30和38的衍生物如下所述在大鼠中实施体内药代动力学研究。为了比较包括司美鲁肽。
自Taconic(Denmark)获得体重400-600g的同龄雄性SpragueDawley大鼠，按体重简单随机分派处理，每组大约3-6只大鼠，使得每组的所有动物都有相似的体重。
让GLP-1衍生物(大约6纳摩尔/ml)溶于50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80、pH 7.4中。通过植入右颈静脉的导管，静脉内注射(1.0ml/kg)给予化合物。给药后5天从舌下静脉采集血液样品。将血样(200μl)采集到EDTA缓冲液(8mM)中，然后于4℃以10000G离心5分钟。将血浆样品保持在-20℃，直到用于分析各种GLP-1化合物的血浆浓度。
用光激化学发光免疫测定(LOCI)来测定GLP-1化合物的血浆浓度，其通常如Poulsen和Jensen在Journal of Biomolecular Screening2007，第12卷第240-247页中用于测定胰岛素所述。用链霉抗生物素包被供体珠，而让受体珠与识别肽的中间-/C-末端表位的单克隆抗体缀合。使特异性针对N-末端的另一单克隆抗体生物素化。将这三种反应物与被分析物混合，形成两位点的(two sited)免疫复合物。光照该复合物使从供体珠释放单峰氧原子，其从引入受体珠，并引发化学发光，在Envision读板仪上测量该发光。光量与化合物浓度成比例。
用WinNonlin(5.0版本，Pharsight Inc.，Mountain View，CA，USA)分析血浆浓度-时间曲线，用每只动物的单个血浆浓度-时间曲线计算半衰期(T1/2)(调和平均值)。
结果
司美鲁肽的半衰期为4小时。
测试的全部8种衍生物具有至少5小时的半衰期，7种具有至少10小时的半衰期。
实施例52：小型猪中的药代动力学
本研究目的是测定将本发明GLP-1衍生物i.v.给予小型猪后的体内延长，即其作用时间的延长。
这在药代动力学(PK)研究中进行，其中测定目的衍生物的终末半衰期。终末半衰期通常意即某一血浆浓度减半所需的时间，其在初始分布相后测量。
本研究使用自EllegaardMinipigs(Dalmose，Denmark)获得的雄性小型猪，大约7-14个月龄，重大约16-35kg。单独饲养小型猪，用SDS小型猪饮食(Special Diets Services，Essex，UK)每天一次或两次限制性地喂养。在适应至少2周后，在每只动物的尾侧腔静脉或颅侧腔静脉中植入两根固定的中心静脉导管。手术后让动物恢复1周，然后用于重复药代动力学研究，且在给药之间具有合适的清洗期。
在给药前让动物禁食大约18小时，给药后禁食至少4小时，但在整个期间随意饮水。
让实施例2、7、14-15和20的GLP-1衍生物溶于50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80、pH 7.4中到通常20-60纳摩尔/ml的浓度。通过导管给予静脉内注射(体积对应于通常1-2纳摩尔/kg，例如0.033ml/kg)的化合物，在预定时间点取血液样品，最多到给药后13天(优选通过另一导管)。将血样(例如0.8ml)采集到EDTA缓冲液(8mM)中，然后在4℃以1942G离心10分钟。将血浆用移液器吸取到干冰上的Micronic管中，保持在-20℃直到用ELISA或相似的基于抗体的测定或LC-MS来分析各个GLP-1化合物的血浆浓度。在WinNonlin 5.0版本(Pharsight Inc.，Mountain View，CA，USA)中通过非房室模型分析单个血浆浓度-时间曲线，测定得到的终末半衰期(调和平均值)。
结果
所有测试衍生物都具有至少12小时的半衰期，5种具有至少24小时的半衰期，4种具有至少36小时的半衰期，3种具有至少48小时的半衰期。
实施例53：估测口服生物利用度
本实验目的是估测本发明GLP-1衍生物的口服生物利用度。
为此，如下所述在大鼠体内研究将实施例2、14-17、20、28-30、38和41-47的GLP-1衍生物直接注射到肠腔后在血浆中的暴露。
以在55mg/ml癸酸钠溶液中1000uM的浓度测定GLP-1衍生物。
自Taconic(Denmark)获得体重达到大约240g以上的32只雄性Sprague Dawley大鼠，简单随机指定为不同的处理，每组4只大鼠。实验前让大鼠禁食大约18小时，施行全身麻醉(芬太尼(Hypnorm)/多美康(Dormicum))。
将GLP-1衍生物给予近心端(离十二指肠10cm的远端)空肠或中肠(离盲肠50cm的近端)。将10cm长的PE50-导管插入到空肠中，至少1.5cm插入到空肠中，给药前通过3/0号缝线在肠及导管周围绑住来固定尖端末梢，以防止渗漏或导管移位。放置的导管无注射器和针头，将2ml盐水给予腹部，然后用创缘夹关闭切口。
通过导管用1ml注射器将100μl各种GLP-1衍生物注射入空肠腔中。随后，用另一注射器将200μl空气推入空肠腔以“冲洗”导管。将该注射器保持与导管连接，以防止回流到导管中。
以所期需间隔(通常在0、10、30、60、120和240分钟时间)从尾静脉将血样(200ul)采集到EDTA管中，在20分钟内以10000G在4℃离心5分钟。将血浆(75ul)分离到Micronic管中，立即冷冻并保持在-20℃，直到用LOCI(光激化学发光免疫测定)分析各种GLP-1衍生物的血浆浓度，其通常如Poulsen和Jensen在Journal of BiomolecularScreening 2007，第12卷第240-247页中用于测定胰岛素所述。用链霉抗生物素包被供体珠，而让受体珠与识别肽的中间-/C-末端表位的单克隆抗体缀合。使特异性针对N-末端的另一单克隆抗体生物素化。让这三种试剂与被分析物混合在一起，形成两位点免疫复合物。照射该复合物使从供体珠释放单峰氧原子，将其引入受体珠并引发化学发光，在Envision读板仪中测量该发光。光量与化合物浓度成比例。
血液取样后在麻醉下处死大鼠，打开腹部以验证导管正确放置。
测定作为时间函数的平均(n＝4)血浆浓度(皮摩尔/升)。对于每一处理，计算血浆浓度比率(皮摩尔/升)除以给药溶液中的浓度(微摩尔/升)的比率，将t＝30分钟(在空肠中注射化合物30分钟后)的结果估测(30分钟时校正剂量的暴露)为肠生物利用度的替代测量。显示校正剂量暴露与实际生物利用度显著相关。
获得以下结果，其中30分钟时的校正剂量暴露指(将化合物注射到空肠后30分钟的血浆浓度(pM))除以(给药溶液中的化合物浓度(μM))：
结果
除了三种测试衍生物外所有的在30分钟时都具高于48的校正剂量暴露；8种高于100；三种高于125；1种高于150。
为了比较，WO09030771实施例69和71的化合物在30分钟时分别具有48和20的校正剂量暴露。
实施例54：对血糖和体重的作用
本研究的目的是验证本发明GLP-1化合物在糖尿病环境中对血糖(BG)和体重(BW)的作用。
在肥胖糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)的剂量反应研究中测定实施例2、4、7、14和15的GLP-1衍生物，其如下所述。
登记7-9周龄的从出生开始用饮食NIH31(NIH 31M啮齿动物饮食，可自Taconic Farms，Inc.，US市购，参见www.taconic.com)喂养的50只db/db小鼠(Taconic，Denmark)用于该研究。让小鼠自由获得标准食物(例如Altromin 1324，Brogaarden，Gentofte，Denmark)和自来水，保持在24℃。在适应1-2周后，连续两天(即在上午9点)两次估测基础血糖。将具最低血糖值的8只小鼠排除在实验之外。基于平均血糖值选择剩下的42只小鼠用于进一步实验，以血糖水平相匹配分为7组(n＝6)。在5天实验期间小鼠至多使用4次。在最后一次实验后，对小鼠实施安乐死。
7个组接受以下处理：
1：溶媒，s.c.
2：GLP-1衍生物，0.3纳摩尔/kg，s.c.
3：GLP-1衍生物，1.0纳摩尔/kg，s.c.
4：GLP-1衍生物，3.0纳摩尔/kg，s.c.
5：GLP-1衍生物，10纳摩尔/kg，s.c.
6：GLP-1衍生物，30纳摩尔/kg，s.c.
7：GLP-1衍生物，100纳摩尔/kg，s.c.
溶媒：50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80、pH 7.4。
让GLP-1衍生物溶于溶媒中到0.05、0.17、0.5、1.7、5.0和17.0纳摩尔/ml的浓度。以6ml/kg(即每50g小鼠300μl)的剂量体积对动物s.c.给药。
在给药当天，小鼠称重后，在-1/2h(上午8.30)估测血糖。在大约上午9点(0时)给予GLP-1衍生物。在给药当天的1、2、4和8小时(上午10、11点，下午1和5点)估测血糖。
在以后的日子里，于给药后的24、48、72和96小时(即在第2、3、4、5天的上午9点)估测血糖。在每一天血糖取样后都对小鼠称重。
在数字秤上单独为小鼠称重。
自意识清醒的小鼠的尾端毛细血管获得用于测量血糖的样品。将10μl血液采集到肝素化的毛细管中，并转移到500μl葡萄糖缓冲液(EKF系统溶液，Eppendorf，Germany)中。用葡萄糖氧化酶方法(葡萄糖分析仪Biosen 5040，EKF Diagnostic，GmbH，Barleben，Germany)测量葡萄糖浓度。让样品在室温保持最多1小时直到分析。若必须延迟分析，则让样品保持在4℃最多24小时。
ED50是引起半最大效应的以纳摩尔/kg表示的剂量。基于衍生物降低体重的能力以及降低血糖的能力计算该值，其如下所述。
体重ED50计算为皮下给予衍生物后24小时引起对ΔBW的半最大效应的剂量。例如，若24小时后体重降低最大值为4.0g，那么ED50体重应该为24小时后引起体重降低2.0g的以纳摩尔/kg表示的剂量。该剂量(ED50体重)可自剂量反应曲线读出。
血糖ED50计算为皮下给予类似物后8小时引起对AUCΔBG的半最大效应的剂量。
只有在存在合适的S形剂量反应关系且对最大反应有明确定义时才可计算ED50值。因此，如果不是这种情况，那么以不同的剂量范围重新测定目的衍生物，直到获得S形反曲剂量反应关系为止。
获得以下结果：
测试衍生物具有预期的对血糖以及体重的作用(两种都为降低)。此外获得S形剂量反应曲线，这使得能分别计算血糖和体重的ED50值，其如上所解释。
实施例55：对葡萄糖介导的胰岛素分泌的作用
本实施例的目的是测定本发明GLP-1化合物对葡萄糖介导的胰岛素分泌的作用。
这在
Figure BDA00001770475401211
小型猪中用静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)来实施。
在本研究中使用7-14个月龄的雄性
Figure BDA00001770475401212
小型猪(Ellegaard
Figure BDA00001770475401213
小型猪A/S，Dalmose，Denmark)。适应期间和实验期间将动物饲养在单独猪圈中。在适应至少2周后，在每只动物的尾侧腔静脉或颅侧腔静脉中植入两根固定的中心静脉导管。手术后让动物恢复1周，然后用于重复研究，在给药之间具有合适的清洗期。
用SDS小型猪饮食(Special Diets Services，Essex，UK)每天1-2次限制性地喂养猪，并允许随意饮水。
在单次给药后或在为了避免急性高剂量的有害作用以渐增剂量的时期后测定GLP-1化合物的作用。在耳后的薄皮肤中i.v.或s.c.给予GLP-1衍生物。
对于每一种所测的GLP-1化合物，有溶媒处理(或不处理)基线组和对应于2-6个不同的血浆浓度水平的2-6个GLP-1剂量组，所述浓度水平通常大约3000-80000pM(n＝5-8)。
对于每一种GLP-1化合物，实施1或2小时的静脉葡萄糖耐量试验。实验前让猪禁食大约18小时。检查中央静脉导管的明显性，取两个基线血样。在取样后0分钟经30秒的时间i.v.给予0.3g/kg葡萄糖(葡萄糖500g/L，SAD)，用10-20ml的无菌0.9％NaCl冲洗导管。通常在有关葡萄糖推注的以下时间点取血样：-10、-5、0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟，每次取血样后用含10U/ml肝素的4ml无菌0.9％NaCl冲洗导管。将用于胰岛素、葡萄糖和衍生物血浆浓度的血样转移到包被EDTA的管中。让管储存在湿冰上，直到在1小时内离心(4℃，3000rpm，10分钟)，在干冰上用移液器将血浆吸取到Micronic管中，贮存在-20℃直到分析。视GLP-1衍生物半衰期而定，在t＝0分钟或t＝0分钟及试验结束(t＝60分钟或t＝120分钟)时测量血浆浓度。用葡萄糖氧化酶方法按照厂商说明以500μL缓冲液(EBIO加自动分析仪和溶液，Eppendorf，Germany)中10μL血浆来分析葡萄糖。用合适的免疫测定(例如LOCI，参见例如Journal of Biomolecular Screening 2007，第12卷第240-247页)来分析胰岛素。用ELISA或相似的基于抗体的测定或LC-MS来分析GLP-1衍生物的血浆浓度。
对于每一研究，计算胰岛素曲线下面积(AUC胰岛素)，并用作胰岛素分泌的量度。用单向ANOVA或其它合适的统计学分析让不同剂量组与各自溶媒/基线组比较。亦可计算AUC胰岛素的EC50。
实施例56：对采食量的作用
本实验目的是研究本发明GLP-1化合物对猪采食量的影响。这在如下所述的药效(PD)研究中进行，其中在给予单剂量GLP-1衍生物后的1、2、3和4天测量与溶媒-处理对照组比较的采食量。
使用大约3个月龄的重大约30-35kg的雌性Landrace YorkshireDuroc(LYD)猪(每组n＝3-4)。动物在适应动物设备期间在小组中饲养1-2周。在实验期间，从星期一上午到星期五下午将动物安置在单猪圈中用于测量单个食物摄取。在适应期间和实验期间的所有时间都用猪饲料(Svinefoder，Antonio)随意喂养动物。通过每15分钟记录饲料重量在线监测食物摄取。所用系统为Mpigwin(Ellegaard Systems，Faaborg，Denmark)。
将GLP-1衍生物以对应于0.3、1、3、10或30纳摩尔/kg剂量的12、40、120、400或1200纳摩尔/ml浓度溶于磷酸盐缓冲液(50mM磷酸盐、0.05％吐温80、pH 8)中。将磷酸盐缓冲液用作溶媒。在第1天上午将单个皮下剂量的GLP-1衍生物或溶媒(剂量0.025ml/kg)给予动物，给药后测量采食量达4天。在每次研究的最后一天，给药后第4天自麻醉动物的心脏采集用于测量GLP-1衍生物的血浆暴露的血样。此后用心脏内过量的戊巴比妥让动物安乐死。用ELISA或相似的基于抗体的测定来分析GLP-1衍生物的血浆含量。
采食量计算为4天中24小时食物摄取的平均±SEM。
用单向ANOVA或双向-ANOVA重复测量接着是Bonferroni事后检验，进行溶媒对比GLP-1衍生物组在4天中24小时采食量的统计学比较。
实施例57：白蛋白结合亲和力
本实施例目的是测量本发明GLP-1衍生物与人血清白蛋白(HSA)的亲和力。
通常用解离常数(Kd)来阐述药物和蛋白质之间的亲和力，即药物与蛋白质结合的紧密程度。
通过竞争闪烁邻近测定(SPA)来测定实施例2、4-9、11-18、20-21、23-25和27-46衍生物与HSA的解离常数，其如下所述。
让链霉抗生物素-SPA珠(GE Healthcare RPNQ0009)与生物素化的HSA孵育5小时。用缓冲液洗涤珠以除去未结合的HSA。让珠与示踪剂在含有100mM Hepes、100mM NaCl、10mM MgSO4、0.025％吐温-20、pH 7.4的缓冲液中混合，示踪剂即125I-标记的酰化的GLP-1类似物(N-ε37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，125I-Tyr19，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1(7-37)-NH2)。将混合物用移液器吸取到Perkin Elmer Optiplate-966005290孔中(100μl每孔)，在同样缓冲液中加入待测的100μl的GLP-1衍生物稀释系列。室温温柔振荡20小时后，将板离心，在TopCounter上计数。以结合的cpm作为GLP-1衍生物浓度的函数作图。
本测定基于测试衍生物与和示踪剂相同的结合位点结合的假设。
Kd可计算为目的GLP-1衍生物的摩尔浓度乘以HSA的摩尔浓度并除以GLP-1-HSA复合物的摩尔浓度。因此，解离常数具有摩尔单位(M)，其对应于HSA上的结合位点一半被占时的GLP-1衍生物浓度，即在该GLP-1衍生物浓度时HSA-GLP-1复合物的浓度等于不含结合的GLP-1衍生物的HSA浓度。解离常数越小，GLP-1衍生物结合得越紧，或GLP-1衍生物和HSA之间的亲和力越高。
或者，可使用竞争曲线的EC50值作为衍生物对HSA的亲和力(本文″表观Kd″)的量度。
结果
除5种外所有测试衍生物与白蛋白都具有相对低的结合亲和力，这对应于1或高于1的相对高的表观解离常数(表观Kd，以μM表示)。23种为5或高于5。18种高于10，12种高于20。
尽管本文阐明并阐述了本发明的某些特征，但对本领域普通技术人员会出现很多修饰、取代、变化及等同物。因此，应该理解，所附权利要求书意欲包括落在本发明真正精神内的所有所述修饰和变化。

Claims (13)

1.GLP-1类似物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述类似物包含对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的31位位置的组氨酸残基、对应于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)的34位位置的谷氨酰胺残基，和与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)比较，所述类似物包含最多10个氨基酸修饰；其中所述组氨酸残基被命名为H31，所述谷氨酰胺残基被命名为Q34。
2.权利要求1的类似物的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
3.权利要求2的衍生物，其具有与所述类似物的赖氨酸残基连接的白蛋白结合部分。
4.权利要求3的衍生物，其中所述白蛋白结合部分包含选自化学结构1、化学结构2、化学结构3和化学结构4的延长部分：
化学结构1：CH3-(CH2)x-CO-*
化学结构2：HOOC-(CH2)x-CO-*
化学结构3：HN4C-(CH2)x-CO-*
化学结构4：HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*，
其中x为6-18范围内的整数，y为为3-17范围内的整数。
5.权利要求4的衍生物，其中所述白蛋白结合部分进一步包含选自化学结构5、化学结构6、化学结构7、化学结构8、化学结构9和化学结构10的接头：
化学结构5：*-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
化学结构6：*-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
化学结构7：*-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
化学结构8：*-NH-C6H8-CO-*
化学结构9：*-NC5H8-CO-*
化学结构10：*-NH-SO2-(CH2)3-CO-*
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数。
6.选自以下的GLP-1类似物或衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：化学结构20、化学结构21、化学结构22、化学结构23、化学结构24、化学结构25、化学结构26、化学结构27、化学结构28、化学结构29、化学结构30、化学结构31、化学结构32、化学结构33、化学结构34、化学结构35、化学结构36、化学结构37、化学结构38、化学结构39、化学结构40、化学结构41、化学结构42、化学结构43、化学结构44、化学结构45、化学结构46、化学结构47、化学结构48、化学结构49、化学结构50、化学结构51、化学结构52、化学结构53、化学结构54、化学结构55、化学结构56、化学结构57、化学结构58、化学结构59、化学结构60、化学结构61、化学结构62、化学结构63、化学结构64、化学结构65和化学结构66。
7.GLP-1类似物或衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述类似物或衍生物由其名称表征并选自本文实施例1-47的化合物名称的每一个的列表。
8.权利要求7的GLP-1类似物或衍生物，其为权利要求6的GLP-1类似物或衍生物。
9.选自以下的中间产物：
化学结构67；和
化学结构68；
其中PG表示保护基，和
其中任选化学结构67的延长部分的远端*-COOH基团亦受到保护。
10.权利要求1-8中任一项的类似物或衍生物，其用作药物。
11.权利要求1-8中任一项的类似物或衍生物，其用于以下用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
12.权利要求1-8中任一项的类似物或衍生物用于制备用于以下的药物的用途：治疗和/或预防各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。
13.一种方法，所述方法用于治疗或防止各种形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改进脂质参数、改进β-细胞功能；和/或用于延迟或防止糖尿病进展，所述方法通过给予药学上有活性的量的权利要求1-8中任一项的类似物或衍生物来进行。
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