BR122023024819A2 - Uso de um polipeptídeo para inibir a clivagem de c5 em um sistema celular - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece moduladores de atividade de complemento. Também são fornecidos métodos para utilizar tais moduladores como terapêuticos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório no U.S. 62/011.368, depositado em 12 de junho de 2014, intitulado Modulation of Complement Activity, para o Pedido de Patente Provisório no U.S. 62/077.460, depositado em 10 de novembro de 2014, intitulado Modulation of Complement Activity, e para o Pedido de Patente Provisório no U.S. 62/108.772, depositado em 28 de janeiro de 2015, intitulado Modulation of Complement Activity, em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e está incorporada ao presente documento em sua totalidade a título de referência. A dita cópia ASCII, criada em 11 de junho de 2015, é denominada 20111005PCT_SL.txt e tem um tamanho de 130.110 bytes.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a compostos, incluindo poli- peptídeos, que são úteis como inibidores e/ou antagonistas de atividade de complemento. Também são fornecidos métodos para utilizar os inibidores como terapêuticos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A resposta imunológica de vertebrados é compreendida de componentes de imunidade inata adaptativa. Embora a resposta imu- nológica adaptativa seja seletiva para patógenos particulares e seja lenta para responder, os componentes da resposta imunológica inata reconhecem uma ampla faixa de patógenos e respondem rapidamente mediante infecção. Um tal componente da resposta imunológica inata é o sistema de complemento.

[005] O sistema de complemento inclui cerca de 20 proteínas circulantes, sintetizadas principalmente pelo fígado. Os componentes dessa resposta imunológica particular foram primeiro denominados "complemento" devido à observação de que complementaram a resposta de anticorpo na destruição de bactérias. Essas proteínas permanecem em uma forma inativa antes da ativação em resposta à infecção. A ativação ocorre por meio de uma via de clivagem proteolítica iniciada por reconhecimento de patógeno e que leva à destruição de patógeno. Três de tais vias são conhecidas no sistema de complemento e são denominadas como a via clássica, a via de lectina e a via alternativa. A via clássica é ativada quando uma molécula de IgG ou de IgM se liga à superfície de um patógeno. A via de lectina é iniciada pelaproteína lectina ligadora de manose que reconhece os resíduos de açúcar de uma parede celular bacteriana. A via alternativa permanece ativa em baixos níveis na ausência de quaisquer estímulos específicos. Embora todas as três vias difiram em relação aos eventos iniciais, todas as três vias convergem com a clivagem de componente C3 do complemento. C3 é clivado em dois produtos denominados C3a e C3b. Desses, o C3b se torna covalentemente ligado à superfície de patógeno enquanto C3a atua como um sinal difusível para promover inflamação e recrutar células imunológicas circulantes. O C3b associadoà superfície forma um complexo com outros componentes para iniciar uma cascata de reações entre os componentes posteriores do sistema de complemento. Devido à exigência para afixação de superfície, a atividade de complemento permanece localizada e minimiza a destruição para células não alvejadas.

[006] O C3b associado ao patógeno facilita a destruição de pató- geno de duas formas. Em uma via, o C3b é reconhecido diretamente por células fagocíticas e leva ao engolfamento do patógeno. Na segunda via, o C3b associado ao patógeno inicia a formação do complexo de ataque à membrana (MAC). Na primeira etapa, C3b complexa com outros componentes de complemento para formar o complexo C5 convertase. Dependendo da via de ativação de complemento inicial, os componentes desse complexo podem diferir. A C5-convertase formada como o resultado da via clássica do complemento compreende C4b e C2a além de C3b. Quando formada pela via alternativa, a C5- convertase compreende duas subunidades de C3b assim como um componente Bb.

[007] O componente C5 do complemento é clivado por qualquer complexo C5 convertase em C5a e C5b. O C5a, muito semelhante ao C3a, se difunde na circulação e promove a inflamação, ao atuar como um quimioatraente para células inflamatórias. O C5b permanece afixadoà superfície celular onde dispara a formação do MAC através de interações com C6, C7, C8 e C9. O MAC é um poro hidrofílico que abrange a membrana e promove o fluxo livre de fluido dentro e fora da célula, destruindo, assim, a mesma.

[008] Um componente importante de toda a atividade imunológica é a capacidade do sistema imunológico para distinguir entre células próprias e células não próprias. A patologia surge quando o sistema imunológico é incapaz de fazer essa distinção. No caso do sistema de complemento, células de vertebrado expressam proteínas que protegem as mesmas dos efeitos da cascata de complemento. Isso garante que alvos do sistema de complemento sejam limitados às células patogênicas. Muitos distúrbios e doenças relacionados ao complemento são associados à destruição anormal de células próprias pela cascata de complemento. Em um exemplo, indivíduos que sofrem de hemoglo- binúria paroxística noturna (PNH) são incapazes de sintetizar versões funcionais das proteínas regulamentadoras de complemento CD55 e CD59 em células-tronco hematopoiéticas. Isso resulta em hemólise mediada por complemento e uma variedade de complicações a jusante. Outros distúrbios e doenças relacionados ao complemento incluem, mas sem limitação, doenças e distúrbios autoimunes, doenças e distúrbios neurológicos, doenças e distúrbios sanguíneos e doenças e distúrbios infecciosas. Evidências experimentais sugerem que muitos distúrbios relacionados ao complemento são aliviados através de inibição de atividade de complemento. Portanto, há uma necessidade para o desenvolvimento de compostos com capacidade para bloquear sele-tivamente a destruição de célula mediada por complemento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção fornece compostos, inclusive polipep- tídeos (por exemplo, peptidomiméticos, polipeptídeos cíclicos e pepti- domiméticos cíclicos), moléculas pequenas, anticorpos, fragmentos de anticorpo e aptâmeros, e métodos para usar os ditos compostos para a modulação de complemento. De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos podem ter as sequências apresentadas em SEQ ID NOs 1 a 201 ou 211. Os mesmos podem ser lineares ou cíclicos e podem compreender um laço cíclico formado por uma porção química em ponte entre dois aminoácidos. As porções químicas em ponte podem compreender uma característica selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação dissulfeto, uma ligação amida (lactama), uma ligação tioéter, um anel aromático, uma cadeia de hidrocarboneto alifática insaturada, uma cadeia de hidrocarboneto alifática saturada, um anel triazol ou combinações dos mesmos. Além disso, o laço cíclico pode variar em comprimento e pode ter 1 aminoácido, 2 aminoáci- dos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos, 11 ami- noácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 ami- noácidos, 16 aminoácidos ou mais.

[0010] A porção química em ponte pode compreender um dissulfe- to entre dois resíduos de cisteína ou um anel aromático produzido por reação com um poli(bromometil)benzeno, e tal po- li(bromometil)benzeno pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2-bis(bromometil)benzeno, 1,3-bis(bromometil)benzeno e 1,4-bis(bromometil)benzeno.

[0011] A porção química em ponte também pode compreender um anel aromático produzido por reação com um composto selecionado a partir do grupo que consiste em 2,6-bis(bromometil)piridina, (E)-1,4- dibromobut-2-eno e 1,2-bis(bromometil)-4-alquilbenzeno.

[0012] A porção química em ponte também pode compreender uma ligação amida produzida pela reação das cadeias laterais dos pares seguintes de aminoácidos: lisina e glutamato, lisina e aspartato, ornitina e glutamato, ornitina e aspartato, homolisina e ácido glutâmico, homolisina e ácido aspártico, outras combinações de aminoácidos, aminoácidos não naturais ou resíduos não aminoácido que compreendem uma amina primária e um ácido carboxílico.

[0013] De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos são úteis pelo fato de que os mesmos podem exibir atividade inibitória de complemento C5. Em alguns casos, tal atividade pode variar de uma metade de concentração inibitória máxima (IC50) de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm ou ser inferior a 50 nm.

[0014] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece po- lipeptídeos que têm triptofano ou um ou mais análogos de triptofano selecionados a partir do grupo que consiste em 5-fluorotriptofano, 5- metil-O-triptofano, 1-metiltriptofano, D-triptofano e 7-azatriptofano presentes dentro da sequência de aminoácidos. Tais compostos incluem aqueles de SEQ ID NOs: 3, 9, 11, 19, 45, 46, 50 e 59, dentre outros.

[0015] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção podem se ligar a uma região em C5, em que a dita região é distal ao sítio de clivagem C5a-C5b. Em alguns casos, os polipeptí- deos da presente invenção podem inibir a clivagem de C5 em produtos de clivagem C5a e C5b.

[0016] Em alguns casos, os polipeptídeos da presente invenção podem ser parte de um anticorpo.

[0017] Os polipeptídeos da presente invenção podem estar compreendidos em composições. Tais composições podem compreender um ou mais carreadores ou excipientes aceitáveis. Tais polipeptídeos podem ser adicionalmente conjugados com outra porção química não polipeptídica, tal como, por exemplo, um polímero solúvel em água. Esses polímeros podem ser hidrofílicos ou hidrofóbicos. Em algumas modalidades, o polímero hidrofílico é selecionado a partir do grupo que consiste em homopolímeros de óxido de polialquileno, polipropileno glicóis, polióis polioxietilenados e copolímeros dos mesmos. Também pode compreender polietileno glicol (PEG). As composições podem compreender adicionalmente polipeptídeos conjugados com um poli- peptídeo de ligação de albumina selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 202 a 204. Em alguns casos, as composições podem compreender polipeptídeos conjugados com um polipep- tídeo de penetração em célula selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 205 a 210. As composições podem compreender adicionalmente polipeptídeos conjugados com uma porção química lipídica. As porções químicas lipídicas podem inclui, mas sem limitação, ácidos graxos, fosfolipídeos e esteróis. Em algumas modalidades, as porções químicas lipídicas podem ser diretamente conjugadas com polipeptídeos da invenção ou ligadas a um conjugado de polipeptídeo- PEG. Algumas composições podem compreender um excipiente far- maceuticamente aceitável.

[0018] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para inibir a clivagem de C5 em um sistema celular que compreende o uso de uma composição, de acordo com a presente invenção, tal como as descritas acima. Alguns tais métodos podem reduzir níveis de C5a. Métodos adicionais podem reduzir a formação de complexo de ataque à membrana (MAC).

[0019] Alguns métodos da invenção podem levar à inibição de clivagem de C5 com um IC50 de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm. Em alguns casos, os métodos da presente invenção podem compreender a inibição de clivagem de C5 com um IC50 inferior a 50 nm.

[0020] Alguns métodos da presente invenção podem ser aplicados a sistemas celulares que são selecionados dentre um sistema in vitro, um sistema in vivo e um sistema ex vivo. Alguns sistemas in vivopodem incluir indivíduos, tal como indivíduos humanos. Em alguns casos, os polipeptídeos e as composições de polipeptídeo podem ser usadas no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio e/ou afecção relacionada ao complemento em um indivíduo. A administração a um indivíduo pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em bucal, intranasal, oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica e intravítrea. Em alguns casos, as composições podem ser usadas para tratar hemoglobinúria paroxística noturna e/ou síndrome urêmica hemolítica atípica. Em alguns casos, as composições da invenção podem ser usadas para tratar uma ou mais dentre uma indicação inflamatória, uma ferida, uma lesão, uma doença au- toimune, uma indicação vascular, uma indicação neurológica, uma indicação relacionada ao rim e uma doença ocular.

[0021] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para inibir a ativação de complemento induzida por trombina em sistemas celulares que compreendem colocar tais sistemas em contato com os polipeptídeos da invenção. São fornecidos, adicionalmente, métodos para tratar hemólise em indivíduos, que compreende administrar um polipeptídeo descrito no presente documento. De acordo com alguns tais métodos, a hemólise tratada é provocada por ativação de complemento induzida por trombina.

[0022] Em algumas modalidades, são fornecidos kits para o diagnóstico, prognóstico, profilaxia ou tratamento de uma doença, distúrbio e/ou afecção em um mamífero, inclusive um humano. Tais kits podem conter um ou mais polipeptídeos ou composições de polipeptídeo da presente invenção e, opcionalmente, reagentes e/ou instruções para uso. Em tais kits, os polipeptídeos podem compreender uma marcação detectável ou a capacidade de se ligar a uma marcação detectável para formar um complexo detectável. De acordo com uma modalidade, a marcação compreende uma marcação BODIPY-TMR.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] O supracitado e outros objetivos, características e vantagensserão evidentes a partir da seguinte descrição de modalidades particulares da invenção, conforme ilustrado nos desenhos anexos nos quais caracteres de referência semelhantes se referem às mesmas partes ao longo das diferentes vistas. Os desenhos não estão necessariamente em escala, sendo colocada, em vez disso, ênfase na ilustração dos princípios de várias modalidades da invenção.

[0024] A Figura 1 é um gráfico que exibe os resultados de um imunoensaio de enzima (EIA) para a detecção de C5a em supernatan- te a partir de um ensaio de hemólise de glóbulos vermelhos (RBC) humanos com concentrações crescentes de inibidores R3002 (SEQ ID NO: 3) e R3008 (SEQ ID NO: 9). Os níveis de C5a se correlacionam à atividade de complemento e são, portanto, um indicador da capacidade dos compostos testados de para inibir a atividade de complemento. O supernatante do ensaio de hemólise foi diluído a 1:50 e examinado para níveis de C5a. Os níveis de C5a diminuíram em amostras de su- pernatante de ensaio de hemólise humana com níveis crescentes de qualquer inibidor examinado. R3002 (SEQ ID NO: 3) teve um IC50 de 5,4 nm, enquanto R3008 (SEQ ID NO: 9) teve um IC50 de 54,5 nm. Conforme usado no presente documento, o termo "IC50" se refere à metade de concentração inibitória máxima, um valor usado para indicar a quantidade do inibidor necessária para reduzir uma dada reação ou processo ao meio.

[0025] A Figura 2 é um gráfico que exibe os resultados de um EIA para a detecção do complexo de ataque à membrana (MAC) em su- pernatante a partir de um RBC ensaio de hemólise de RBC humano com concentrações crescentes de R3008 (SEQ ID NO: 9). Os níveis do MAC se correlacionam à atividade de complemento e são, portanto, um indicador da capacidade de R3008 (SEQ ID NO: 9) para inibir a atividade de complemento. O supernatante do ensaio de hemólise foi diluído a 1:5 e examinado para níveis de MAC. Os níveis de MAC diminuíram em amostras de supernatante de ensaio de hemólise com níveis crescentes do inibidor examinado com um IC50 de 33 nm.

[0026] A Figura 3 é um gráfico que exibe dados de polarização de fluorescência (FP) competitiva para artigos de teste R3003 (SEQ ID NO: 4), R3011 (SEQ ID NO: 31), R3014 (SEQ ID NO: 55), R3023 (SEQ ID NO: 104), R3043 (SEQ ID NO: 50) e R3050 (SEQ ID NO: 23). A FP permite que eventos de ligação sejam medidos em uma solução homogênea. Conduziu-se um ensaio de ligação competitiva em que uma solução de 25 nm de composto R3076 (SEQ ID NO: 40), que tem uma etiqueta fluorescente, foi combinada com quantidades crescentes dos artigos de teste e medida para alterações em FP (em unidades de milipolarização; mP). Níveis de mP decrescentes se correlacionam à competição bem-sucedida para C5 pelos artigos de teste. As médias de dois experimentos independentes conduzidos em triplicata (+/- desviopadrão) são mostradas. Dos artigos testados, R3003 (SEQ ID NO: 4) foi o mais potente, enquanto R3023 (SEQ ID NO: 104), um polipep- tídeo de controle, não mostrou atividade na concentração mais alta testada.

[0027] A Figura 4 retrata resultados de um estudo em macacos cynomolgus. Alterações em concentração plasmática de R3152 (SEQ ID NO: 153) (círculos) após uma dose de 2 mg/kg IV única em macacos cynomolgus são mostradas. Também são mostradas alterações em atividade hemolítica (quadrados) nos mesmos pontos no tempo.

[0028] A Figura 5 retrata resultados de monitoramento de composto em plasma após administração intravenosa (IV; quadrados) ou sub-cutânea(SC; círculos) de 2 mg/kg de R3152 (SEQ ID NO: 153) em ratos-machos Sprague-Dawley. O monitoramento compreendeu a determinação de concentrações de plasma combinadas de R3152 (SEQ ID NO: 153) assim como seu metabólito diamidado de terminal C equi- potente, R3201 (SEQ ID NO: 211.)

[0029] A Figura 6 mostra a farmacocinética de compostos da presente invenção em ratos. Esquerda: Ratos-machos Sprague-Dawley (n=3) foram injetados de modo intravenoso com uma dose única de 2 mg/kg. As amostras sanguíneas foram coletadas em pontos de tempo indicados, processadas em plasma e analisadas para o composto indicado por LC-MS. Círculos pretos: R3176 (SEQ ID NO: 177) (composto não lipidado); Círculos abertos: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 composto lipidado). Direita: Ratos-machos Sprague-Dawley (n=3) foram injetados de modo subcutâneo com uma dose de 15 mg/kg única. As amostras sanguíneas foram coletadas em pontos de tempo indicados, processadas em plasma e analisadas para o composto indicado por LC-MS. Círculos pretos: R3176 (SEQ ID NO: 177) (composto não lipi- dado); Círculos abertos: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 composto lipi- dado).

[0030] A Figura 7 é um gráfico que apresenta os efeitos de R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 composto lipidado) ou um anticorpo monoclonal anti-C5 similar ao ECULIZUMAB® em inibição de hemólise por meio da via de complemento induzido por trombina.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] A presente invenção se refere à constatação de compostos modulatórios de C5 inovadores. Tais compostos podem incluir, mas sem limitação, polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos cíclicos, pep- tidomiméticos e peptidomiméticos cíclicos, moléculas pequenas, anti-corpos, fragmentos de anticorpo e aptâmeros. Em alguns casos, os compostos modulatórios de C5 são polipeptídeos, tais como polipeptí- deos cíclicos, peptidomiméticos e peptidomiméticos cíclicos, que são úteis no diagnóstico e/ou tratamento de doenças nas quais a inibição de ativação de complemento é desejável. Em algumas modalidades, os polipeptídeos da invenção se ligam especificamente ao componente C5 do complemento. Em modalidades adicionais, os polipeptídeos da invenção reduzem a lise celular mediada por complemento impedindo-se a clivagem de C5 em fragmentos de C5a e C5b.

[0032] Conforme usado no presente documento, um "mimético"se refere a uma molécula que exibe algumas das propriedades ou características de outra molécula. Um "peptidomimético"ou "polipeptídeo mimético" é um mimético no qual a molécula contém elementos estruturais que não são encontrados em polipeptídeos naturais (isto é, poli- peptídeos compreendidos de somente os 20 aminoácidos proteinogê- nicos). Em uma modalidade preferencial, peptidomiméticos têm capacidade para recapitular ou imitar a ação (ou ações) biológica de um peptídeo natural. Um peptidomimético pode diferir de muitas formadas dos polipeptídeos naturais, incluindo, mas sem limitação, alterações em estrutura de cadeia principal e a presença de aminoácidos que não ocorrem na natureza. Em alguns casos, os peptidomiméticos podem incluir aminoácidos com cadeias laterais que não são encontradas dentre os 20 aminoácidos proteinogênicos conhecidos, porções químicas em ponte sem base em polipeptídeo usadas para efetuar a cicliza- ção entre as extremidades ou porções internas da molécula, substituições da porção química de hidrogênio de ligação amida por grupos metila (N-metilação) ou outros grupos alquila, substituição de uma ligação peptídica por um grupo químico ou ligação que seja resistente a tratamentos químicos ou enzimáticos, modificações de N e C-terminal e conjugação com uma extensão não peptídica (tal como polietileno glicol, lipídios, carboidratos, nucleosídeos, nucleotídeos, bases nu- cleosídicas, várias moléculas pequenas ou grupos fosfato ou sulfato).

[0033] Alguns polipeptídeos da invenção podem ser cíclicos. Os polipeptídeos cíclicos incluem quaisquer polipeptídeos que tenham, como parte de sua estrutura, uma ou mais características cíclicas, tal como um laço, uma porção química em ponte e/ou uma ligação interna. Conforme usado no presente documento, o termo "porção química em ponte" se refere a um ou mais componentes de uma ponte formada entre dois aminoácidos adjacentes ou não adjacentes, aminoácidos não naturais ou não aminoácidos em um polipeptídeo. As porções químicas em ponte podem ser de qualquer tamanho ou composição. Em algumas modalidades, as porções químicas em ponte podem compreende uma ou mais ligações químicas entre dois aminoácidos adjacentes ou não adjacentes, aminoácidos não naturais, resíduos não aminoácido ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, tais ligações químicas podem ser entre um ou mais grupos funcionais em aminoácidos adjacentes ou não adjacentes, aminoácidos não naturais,resíduos não aminoácido ou combinações dos mesmos. As porções químicas em ponte podem compreender um ou mais características que incluem, mas sem limitação, uma ligação amida (lactama), uma ligação dissulfeto, uma ligação tioéter, um anel aromático, um anel triazol e cadeia de hidrocarboneto. Em algumas modalidades, as porções químicas em ponte compreendem uma ligação amida entre uma funcionalidade amina e uma funcionalidade carboxilato, cada um presente em uma cadeia lateral de resíduo de aminoácido, de aminoá- cido não natural ou de não aminoácido. Em algumas modalidades, as funcionalidades amina ou carboxilato são parte de um resíduo de não aminoácido ou resíduo de aminoácido não natural. Em alguns casos, as porções químicas em ponte podem compreender ligações formadas entre resíduos que podem incluir, mas sem limitação, ácido (S)-2- amino-5-azidopentanoico (também denominado no presente documento como "X02"), ácido (S)-2-aminohept-6-enoico (também denominado no presente documento como "X30"), ácido (S)-2-aminopent-4-inoico (também denominado no presente documento como "X31") e ácido (S)-2-aminopent-4-enoico (também denominado no presente documento como "X12"). As porções químicas em ponte podem ser formadas através de reações de ciclização com o uso de metátese de olefi- na. Em alguns casos, tais porções químicas em ponte podem ser formadas entre resíduos de X12 e X30. Em algumas modalidades, a porção química em ponte compreende uma ligação dissulfeto formada entre dois resíduos que contêm tiol. Em algumas modalidades, a porção química em ponte compreende uma ou mais ligações tioéter. Tais ligações tioéter pode incluir as encontradas em compostos ciclotioal- quila. Essas ligações são formadas durante uma reação de ciclização química entre ácido cloroacético (também denominado no presente documento como "X35") grupos modificados de N-terminal e resíduos de cisteína. Em alguns casos, as porções químicas em ponte compreendem um ou mais anéis triazol. Tais anéis triazol podem incluir, mas sem limitação, os formados por reação de ciclização entre X02 e X31. Em algumas modalidades, as porções químicas em ponte compreendemporções sem base em proteína ou polipeptídeo, que incluem, mas sem limitação, anéis cíclicos (que incluem, mas sem limitação, estrutu- ras de anel aromático (por exemplo, xililas)). Tais porções químicas em ponte podem ser introduzidas por reação com reagentes que contêm múltiplos haletos reativos, que incluem, mas sem limitação, po- li(bromometil)benzenos, poli(bromometil)piridinas, po- li(bromometil)alquilbenzenos e/ou (E)-1,4-dibromobut-2-eno. Em algumas modalidades, as porções químicas em ponte da presente invenção incluem, mas sem limitação, as seguintes estruturas: em que cada X é independentemente N ou CH, de modo que nenhum anel contenha mais do que 2 N; cada Z está independentemente ausente ou é selecionado dentre uma ligação, NR, O, S, CH2, C(O)NR, NRC(O), S(O)vNR e NRS(O)v; cada m é independentemente selecionado dentre 0, 1, 2 e 3; cada v é independentemente selecionado den- tre 1 e 2; cada R é independentemente selecionado dentre H e C1 a C6; e cada porção química em ponte é conectada ao polipeptídeo por uma ligação ou espaçadores C1 a C6 independentemente selecionados.

[0034] Em certas modalidades desta invenção, os polipeptídeos são macrocíclicos renderizados por formação de ligações covalentes entre átomos presentes dentro do polipeptídeo linear e átomos de uma porção química em ponte. Essa porção química em ponte serve o propósito de amarrar quimicamente dois sítios reativos no polipeptídeo linear de modo a fornecer produto de polipeptídeo cíclico. As modalidades da presente invenção incluem polipeptídeos ciclizados da maneira supracitada e que compreendem uma porção química em ponte que contém um anel aromático de 6 membros. Nessas modalidades, os átomos do polipeptídeo linear que formam ligações químicas explícitas com a porção química em ponte podem ser heteroátomos (que incluem, mas sem limitação, nitrogênio, oxigênio e enxofre), ou átomos de carbono saturados ou insaturados. Em cada uma dessas modalidades desta invenção, os átomos da cadeia lateral de polipeptídeo podem ser ligados diretamente a um átomo de carbono dentro do anel aromático da porção química em ponte. Em formas alternativas, os átomos da cadeia lateral de polipeptídeo podem ser ligados a um grupo CH2 saturado que está, por sua vez, diretamente ligado a um átomo de carbono dentro do anel aromático da porção química em ponte. Em certos casos, o anel aromático de 6 membros dentro da porção química em ponte é benzeno, tal como nas estruturas seguintes em que Z pode ser selecionado dentre NH, S, O e (CH)2:

[0035] Em formas alternativas desta invenção, o anel aromático de 6 membros que compreende a porção química em ponte é heterocícli- co e contém um ou mais átomos de nitrogênio. Nessas modalidades, o heterociclo aromático pode ser piridina, que contém um único átomo de nitrogênio no anel aromático [por exemplo, qualquer uma das estruturas abaixo em que Z pode ser selecionado dentre NH, S, O e (CH)2]:

[0036] Os heterociclos aromáticos podem, alternativamente, ser piridazina, que contém dois átomos de nitrogênio adjacentes em uma orientação 1,2 dentro do anel aromático [por exemplo, qualquer uma das estruturas abaixo em que Z pode ser selecionado dentre NH, S, O e (CH)2]:

[0037] Em outras modalidades, o heterociclo aromático pode ser pirimidina, que contém dois átomos de nitrogênio em uma orientação 1,3 dentro do anel aromático [por exemplo, qualquer uma das estruturas abaixo em que Z pode ser selecionado dentre NH, S, O e (CH)2]:

[0038] Alternativamente, o heterociclo aromático pode ser pirazina, que contém dois átomos de nitrogênio em uma orientação 1,4 dentro do anel aromático [por exemplo, qualquer uma das estruturas abaixo em que Z pode ser selecionado dentre NH, S, O e (CH)2]:

[0039] Em formas alternativas desta invenção, os polipeptídeos são macrocíclicos renderizados como um resultado da formação de ligações covalentes entre átomos do polipeptídeo linear e átomos de uma porção química em ponte que consistem em um anel aromático heterocíclico de 5 membros. Nessas modalidades, os átomos do poli- peptídeo linear que formam ligações químicas explícitas com a porção química em ponte podem ser heteroátomos (que incluem, mas sem limitação, nitrogênio, oxigênio e enxofre), ou átomos de carbono saturados ou insaturados. Em cada uma dessas modalidades desta invenção, os átomos da cadeia lateral de polipeptídeo podem ser ligados diretamente a um átomo de carbono ou a um átomo de nitrogênio dentro do anel aromático da porção química em ponte. Em formas alternativas, os átomos da cadeia lateral de polipeptídeo podem ser ligados a um grupo CH2 saturado que está, por sua vez, diretamente ligado a um átomo de carbono ou a um átomo de nitrogênio dentro do anel aromático da porção química em ponte. Em certos casos, o anel aromático heterocíclico de 5 membros dentro da porção química em ponte é 1,2,3-triazol. Nessas modalidades, o anel aromático pode ser substituído nas posições 1 e 4 pela funcionalidade química do polipeptídeo linear que está sendo amarrado. Alternativamente, a armação 1,2,3- triazol pode ser substituída nas posições 1 e 4 por grupos CH2 que são diretamente ligados aos átomos do polipeptídeo linear que é amarrado [por exemplo, qualquer uma das estruturas abaixo em que Z pode ser selecionado dentre NH, S, O e (CH)2]:

[0040] Em outras modalidades desta invenção, o anel aromático heterocíclico de 5 membros que compreende a porção química em ponte é pirazol. Nessas modalidades, o anel aromático pode ser substituído nas posições 1 e 3 ou nas posições 1 e 4 pela funcionalidade química do polipeptídeo linear que está sendo amarrado. Alternativamente, a armação de pirazol pode ser substituída nas posições 1 e 3 ou nas posições 1 e 4 com grupos CH2 que são diretamente ligados aos átomos do polipeptídeo linear que é amarrado [por exemplo, qualquer uma das estruturas abaixo em que Z pode ser selecionado dentre NH, S, O e (CH)2]:

[0041] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido pelo versado na técnica à qual pertence esta invenção. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste dos polipeptídeos cíclicos e métodos apre-sentados na invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo.

Polipeptídeos como Fármacos

[0042] Em virtude de seu tamanho e complexidade, os polipeptí- deos têm capacidade para formar inúmeros contatos altamente específicos com seus alvos biológicos e podem mostra um alto nível de seletividade para o alvo correto ou desejado em comparação a um alvo estreitamente relacionado dentro da mesma família. Efeitos fora de alvo (também conhecidos como efeitos colaterais) fazem, frequentemente, com que fármacos altamente eficazes falhem na aprovação regulamentar devido a preocupações de segurança.

[0043] Inúmeros polipeptídeos (que incluem, mas sem limitação, peptidomiméticos) foram desenvolvidos em fármacos eficazes. Esses incluem, mas sem limitação, insulina, peptídeo 1 semelhante ao gluca- non (GLP-1), somatostina, vasopressina, ciclosporina A e semelhantes. O polipeptídeo terapêutico pode ser idêntico à molécula de ocorrência natural (isto é, a que circula em humanos e é considerada "de tipo selvagem" na população humana). Em muitos outros casos, o po- lipeptídeo não é adequado ou subideal para uso terapêutico devido a uma meia-vida de circulação curta que se deve frequentemente à instabilidademetabólica no corpo. Nesses casos, uma forma modificada ou variante do polipeptídeo (peptidomimético) é usada, o que resulta em comportamento farmacocinético e farmacodinâmico aprimorado. Em outros casos, um polipeptídeo derivado de uma fonte natural tem um mecanismo equivalente de ação e um perfil farmacêutico preferencial e pode ser usado como uma terapia. Por exemplo, a exenatida, uma versão sintética de exedina-4, tem propriedades biológicas similares ao peptídeo-1 semelhante ao glucanon (GLP-1) humano, mas far- macocinética aprimorada, e foi aprovada pela FDA para o tratamento de diabetes mellitus tipo 2. Como outro exemplo, a calcitonina de salmão, calcitonina extraída das Glândulas ultimobranquiais de salmão, assemelha-se à calcitonina humana, mas é mais ativa do que calcito- nina humana, e pode ser usada para tratar osteoporose pós- menopausa, hipercalcemia, doença de Paget, metástases ósseas e dor do membro fantasma.

[0044] Os polipeptídeos são tipicamente limitados a rotas não orais de administração. Em quase todos os casos, os polipeptídeos devem ser distribuídos por injeção, visto que mesmo polipeptídeos muito curtos (por exemplo, polipeptídeos com 4 a 10 resíduos de ami- noácido) são incapazes ou têm pouca capacidade de passar através das membranas celulares que revestem o trato intestinal. Para disponibilidade oral eficaz, fármacos tipicamente precisam passar através das membranas tanto luminal quanto basolateral de células epiteliais intestinais a fim de entrar na circulação sistêmica. A fraca permeabilidade de membrana e a falta de biodisponibilidade oral de polipeptí- deos limitam significativamente o seu uso terapêutico.

[0045] A eficácia de um polipeptídeo como um fármaco pode ser influenciada por sua estabilidade proteolítica. Dentro do corpo, os poli- peptídeos podem ser modificados ou degradados por enzimas, que podem limitar sua eficácia para interagir com um alvo pretendido.

[0046] A estabilidade metabólica de polipeptídeos é importante, visto que está relacionada à sua flexibilidade global, às flutuações in- tramoleculares, aos vários processos dinâmicos internos, assim como às muitas funções biológicas. A estabilidade metabólica de polipeptí- deos pode ser crítica no desenvolvimento de produtos farmacêuticos, o que afeta parâmetros tais como, mas sem limitação, depuração, meia-vida e biodisponibilidade dos fármacos.

[0047] O mantimento de um dado nível de um polipeptídeo tera- pêutico dentro do corpo ou da corrente sanguínea pode ser difícil devido ao efluxo. A taxa de efluxo de um polipeptídeo a partir do corpo pode variar e deve ser monitorada quando considerada a administração de polipeptídeos terapêuticos.

[0048] Existe uma necessidade médica significativa para inibidores de ativação de complemento ou inibidores de atividade de complemento e formulações de inibidor que são altamente potentes e altamente específicas.

Constatação de peptidomiméticos

[0049] Os peptidomiméticos podem ser identificados por uma variedade de meios. Em alguns casos, um peptídeo de ocorrência natural ou uma sequência encontrada em uma proteína natural é usada como um ponto de partida. Nesses exemplos, a sequência de peptídeo de partida foi escolhida pois sabe-se que a mesma interage fisicamente com uma molécula-alvo desejada. Um peptídeo natural pode ser escolhido visto que é um agonista ou um antagonista para um receptor, inibe uma enzima ou modula um canal. Uma sequência encontrada em uma proteína natural pode ser escolhida visto que compreende um domínio que participa de uma interação com outra proteína ou alguma outra molécula em um humano ou animal. Em muitos casos, dados estruturais em proteínas de interação podem ser obtidos a partir de bancos de dados públicos (por exemplo, o Banco de Dados de Proteínas RCSB - RCSB Protein Data Bank; H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000) The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242) e a região específica de uma proteína que interage com o alvo desejado pode ser identificada a partir de dados cristalográficos no complexo de proteína. Em outros casos, polipeptídeos que correspondem às várias porções de uma proteína podem ser preparados e testados quanto à ligação a um alvo de interesse. Uma vez identificados, modificações químicas são introduzidas para aprimorar sua estabilidade e potência, com o peptidomimético resultante tendo parâmetros farmacocinéticos ou farmacodinâmicos aprimorados.

[0050] Em outros casos, um polipeptídeo é isolado por um dentre diversos métodos para isolar sequências de polipeptídeos a partir de bibliotecas de polipeptídeos com base em suas afinidades para especificarproteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios ou células inteiras alvejados. Tais métodos incluem exibição de fagos, exibição de mRNA, exibição de ribossomas, exibição de DNA, montagem codificada por DNA e triagem de dois híbridos, assim como suas modificações (Consultar, por exemplo, Takashashi, T.T et al. (2003). Trends in Bio- chem. Sci. 28(3):159-165; Kay, B.K. et al. (2001). Methods. 24:240246; He, M e Taussig, M (2002). Briefs in Functional Genomics and Proteomics. 1(2): 204-212; Rothe, A. et al. (2006). The FASEB Journal. 20(10):1.599-1.610; todos os quais estão incluídos no presente documento em sua totalidade a título de referência).

[0051] Os polipeptídeos podem adotar estruturas tridimensionais que têm a capacidade de se ligar a outras moléculas biológicas com certos graus de afinidade e especificidade. Alguns se ligarão com afinidade e especificidade muito altas. Uma biblioteca de sequências de polipeptídeos aleatórias será populada por moléculas com uma ampla variedade de estruturas tridimensionais. A fim de isolar um polipeptí- deo com uma conformação que interaja com uma proteína-alvo específica, sequências individuais da biblioteca podem ser preparadas e testadas ou triadas para sua afinidade em relação ao alvo. Entretanto, para bibliotecas muito grandes (>106 membros), a triagem de sequências individuais para afinidade de ligação não é viável. Para superar essa limitação, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para selecionar novos polipeptídeos a partir de misturas complexas extremamente grandes em virtude de sua afinidade de ligação com um alvo. Visto que se prevê que polipeptídeos de ligação de alta afinidade estão pre-sentes em uma frequência muito baixa dentro da população, esses métodos de seleção se baseiam em manter um enlace físico entre o polipeptídeo e o material genético (geralmente um ácido nucleico tal como DNA ou RNA) que cripta o polipeptídeo de modo que a seleção do polipeptídeo inclua automaticamente a seleção de um ácido nuclei- co que cripta o mesmo. O ácido nucleico que cripta o polipeptídeo selecionado pode ser amplificado e sequenciado para revelar a sequência tanto do ácido nucleico quanto do polipeptídeo. Em uma abordagem,exibição de fagos (consultar Cwirla, S.E. et al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:6.378-6.382; Dower, W.J. e Cwirla, S.E. Patentes no U.S. 5.427.908 e no U.S. 5.580.717), cada membro polipeptídico aleatório da biblioteca é exibido na superfície de uma partícula bacteriofá- gica como parte de uma proteína de fusão entre o polipeptídeo e uma dentre as proteínas de revestimento de fago. A partícula de fago fornece o enlace entre o polipeptídeo e o DNA de criptação colocalizan- do-os dentro da mesma entidade física, e o DNA de criptação pode ser subsequentemente amplificado infectando-se bactérias com o fago selecionado. Em outra abordagem, exibição de ribossomas (consultar Kawasaki, G.H. Patentes no U.S. 5.658.754 e no U.S. 5.643.768), uma mistura de moléculas de RNA mensageiro (mRNA) é traduzida in vitro de uma maneira que produza, para cada mRNA na mistura, um complexo estabilizado de ribossoma, mRNA e polipeptídeo recentemente sintetizado que se projeta a partir do ribossoma. A estabilização do complexo permite que o mesmo seja mantido em conjunto enquanto os polipeptídeos são triados para se ligarem a um alvo de interesse. Os mRNAs que criptam os polipeptídeos selecionados podem ser amplificados com o uso de reação em cadeia de polimerase (PCR) e, então, distinguidos, por exemplo, por sequenciamento.

[0052] Em ainda outra abordagem, exibição de mRNA (consultar Szostak, J.W. e Roberts, R.W., Patente no U.S. 6.258.558, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência), cada molécula de mRNA na biblioteca é modificada pela adição covalente de uma porção química semelhante à puromici- na em seu terminal 3’. A porção química semelhante à puromicina é um análogo de haste aceitadora de aminoacil-tRNA que funciona como um aceitador de peptidil, e pode ser adicionado a uma cadeia de polipeptídeo crescente pela atividade de peptidil transferase de um ri- bossoma que traduz o mRNA. Durante a tradução in vitro, o mRNA e o polipeptídeo codificado se tonam covalentemente ligados através da porção química semelhante à puromicina, o que cria uma fusão de RNA-peptídeo. Após selecionar uma molécula de fusão através de ligação de seu componente de polipeptídeo a um alvo, o componente de RNA da molécula de fusão selecionada pode ser amplificado com o uso de PCR e, então, distinguido. Diversos outros métodos foram desenvolvidos para produzir uma ligação física entre um polipeptídeo e seu ácido nucleico de codificação para facilitar a seleção e a amplificação (consultar Yanagawa, H., Nemoto, N., Miyamoto, E., e Husimi, Y., Patente no U.S. 6.361.943; Nemoto, H., Miyamoto-Sato, E., Husimi, H., e Yanagawa, H. (1997). FEBS Lett. 414:405-408; Gold, L., Tuerk, C., Pribnow, D., e Smith, J.D., Patentes no U.S. 5.843.701 e no U.S. 6.194.550; Williams, R.B., Patente no U.S. 6.962.781; Baskerville, S. e Bartel, D.P. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 99:9.154-9.159; Bas-kerville, D.S. e Bartel, D.P., Patente no U.S. 6.716.973; Sergeeva, A. et al. (2006). Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1.622-1.654; em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência).

[0053] A exibição de mRNA é um método particularmente útil para criar grandes bibliotecas de polipeptídeos. Consequentemente, no presente documento são fornecidos métodos para selecionar um poli- peptídeo (ou um mRNA que cripta um polipeptídeo) que interage com proteína de complemento C5. Uma biblioteca irá, em geral, conter pelo menos 102 membros, mais preferencialmente, pelo menos 106 membros e, mais preferencialmente, pelo menos 109 membros (por exemplo, qualquer um dos complexos mRNA-polipeptídeo). Em algumas modalidades, a biblioteca incluirá pelo menos 1012 membros ou pelo menos 1014 membros. Em geral, os membros irão diferir entre si; en-tretanto, espera-se que haja algum grau de redundância em qualquer biblioteca. A biblioteca pode existir como uma mistura única de todos os membros, ou pode ser dividida em diversos grupamentos mantidos em recipientes ou cavidades separadas, em que cada uma contém um subconjunto da biblioteca, ou a biblioteca pode ser uma coleção de recipientes ou cavidades em uma placa, sendo que cada recipiente ou cavidade contém somente um ou poucos membros da biblioteca.

[0054] Cada mRNA na biblioteca compreende preferencialmente uma sequência de iniciação de tradução, um códon inicial e um poli- peptídeo variável (por exemplo, proteína ou peptídeo curto) que codifica a região que é gerada, por exemplo, por uma montagem aleatória ou semialeatória de nucleotídeos, e varia de mRNA para mRNA na biblioteca (embora provavelmente haja algum grau de redundância dentro da biblioteca). A sequência de iniciação de tradução, o códon inicial e o polipeptídeo variável que codifica a região podem ser flanqueados por sequências fixas conhecidas que podem ser usadas para amplificação por PCR do mRNA, por exemplo, após a seleção. Outras sequências fixas que podem estar presentes incluem as que correspondemàs sequências que criptam aminoácidos que podem participar de reações de reticulação químicas ou enzimáticas, de modo que o polipeptídeo produzido possa ser modificado ou derivado após a tradução, ou de modo que encripte uma extensão C-terminal fixa tal como uma etiqueta de polipeptídeo que pode facilitar a purificação das fusões peptídeo-mRNA.

[0055] Uma vez que uma biblioteca de mRNA derivada com puro- micina seja gerada, a biblioteca pode ser traduzida. Os polipeptídeos resultantes (por exemplo, polipeptídeos exibidos) serão ligados aos seus mRNAs correspondentes, conforme descrito no presente documento (por exemplo, como um complexo mRNA-polipeptídeo).

[0056] Inúmeros sistemas de tradução in vitro foram descritos na literatura. Os sistemas mais comuns utilizam lisados de reticulócitos de coelho, extratos de germe de trigo, ou extratos de E. coli, que estão disponíveis em inúmeras fontes comerciais em forma de kit (por exemplo, Ambion, Austin, TX, EUA; Promega, Madison, WI, EUA; No- vagen/EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, EUA; Qiagen, Valencia, CA, EUA).

[0057] Diferente da exibição de fagos ou outros sistemas que se baseiam em tradução dentro de células, a exibição de mRNA pode ser adaptada para produzir diretamente bibliotecas de peptidomiméticos realizando-se a tradução in vitro com aminoácidos não naturais ou não convencionais. Os 20 aminoácidos proteinogênicos naturais são identificados e denominados no presente documento por designações de uma letra ou de três letras conforme se segue: ácido aspártico (Asp:D), isoleucina (Ile:I), treonina (Thr:T), leucina (Leu:L), serina (Ser:S), tirosina (Tyr:Y), ácido glutâmico (Glu:E), fenilalanina (Phe:F), prolina (Pro:P), histidina (His:H), glicina (Gly:G), lisina (Lys:K), alanina (Ala:A), arginina (Arg:R), cisteína (Cys:C), triptofano (Trp:W), valina (Val:V), glutamina (Gln:Q) metionina (Met:M), asparagina (Asn:N). Os aminoácidos de ocorrência natural existem em suas formas estere- oisomérica levorrotatórias (L). Os aminoácidos mencionados no presente documento são estereoisômeros L, exceto quando indicado de outra forma.

[0058] Os aminoácidos não naturais têm cadeias laterais ou outras características não presentes nos 20 aminoácidos de ocorrência natural listados acima e incluem, mas sem limitação: N-metil aminoácidos, N-alquil aminoácidos, alfa, alfa-aminoácidos substituídos, beta- aminoácidos, alfa-hidróxi aminoácidos, D-aminoácidos e outros ami- noácidos não naturais conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Josephson et al., (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11.727-11.735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 100: 6.353-6.357; Subtelny et al., (2008) J. Am. Chem. Soc. 130: 6.131-6.136; Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972; e Hartman et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 103:4.356-4.361).

[0059] Essencialmente qualquer aminoácido que, quando afixado a um tRNA apropriado, possa ser montado em um polímero por ribos- somas naturais ou mutantes pode ser usado (consultar Sando, S. et al., (2007) J. Am. Chem. Soc. 129:6.180-6.186; Dedkova, L. et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 6.616-6.617; Josephson, K., Hartman, M.C.T. e Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127:11.727-11.735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 100:6.353-6.357; Subtelny, A.O., Hartman, M.C.T. e Szostak, J.W. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130:6.131-6.136; e Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972).

[0060] Quando aminoácidos não naturais são desejados, pode ser vantajoso usar um sistema de tradução purificado que que seja carente de tRNAs endógenos aminoacilados (Shimizu, Y. et al. (2001) Nat. Biotech. 19:751-755; Josephson, K., Hartman, M.C.T. e Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11.727-11.735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 100: 6.353-6.357). Caso aminoáci- dos não naturais sejam usados com um sistema de tradução in vitro com base em um lisado ou extrato, pode ser desejável esgotar o extrato de tRNAs endógenos, conforme anteriormente descrito (consultar Jackson, R.J., Napthine, S. e Brierley, I. (2001) RNA 7:765-773). Um sistema com base em fatores de tradução de E. coli purificado está comercialmente disponível (PUREXPRESS™; New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA). Esses sistemas são particularmente úteis para tra-dução com aminoácidos não naturais para produzir peptidomiméticos.

[0061] Ao usar aminoácidos naturais com um sistema de tradução in vitro com base em um lisado ou extrato, a tradução depende da car-gaenzimática de aminoácidos em tRNAs por tRNA sintetases, todos os quais são componentes dos extratos. Alternativamente, sistemas de tradução in vitro que usam ribossomas e fatores de tradução purificados, ou extratos esgotados de tRNA, exigem que tRNAs aminoacila- dos sejam fornecidos. Nesses exemplos, tRNAs sintetizados purificados ou in vitro podem ser carregados com aminoácidos que usam produtoquímico (consultar Frankel, A., Millward, S.W. e Roberts, R.W. (2003) Chem. Biol. 10:1.043-1.050) ou procedimentos enzimáticos (Josephson, K., Hartman, M.C.T. e Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11.727-11.735; Murakami, H. et al. (2006) Nat. Methods 3:357-359).

[0062] Inúmeras publicações descrevem a recuperação de poli- peptídeos exibidos por mRNA de complexos de tradução, e esses são adequados para uso com os métodos descritos no presente documento (Liu, R. et al. (2000). Methods Enzymol. 318:268-293; Baggio, R. et al. (2002). Mol. Recognit. 15:126-134; Patente no U.S. 6.261.804). A recuperação de polipeptídeos exibidos por mRNA pode ser facilitada pelo uso de várias "etiquetas" que são incluídas no polipeptídeo por tradução de sequências fixas do polipeptídeo que codifica a sequência e que se liga aos substratos ou moléculas específicos. Inúmeros reagentes para capturar tais etiquetas estão comercialmente disponíveis, incluindo reagentes para capturar a etiqueta His, etiqueta FLAG, etiqueta glutationa-S-transferase (GST), etiqueta estreptocócica, etiqueta HSV, etiqueta T7, etiqueta S, etiqueta DsbA, etiqueta DsbC, etiqueta Nus, etiqueta myc, etiqueta hemaglutinina (HA) ou etiqueta Trx (Novagen, Gibbstown, NJ; Pierce, Rockford, IL). Os polipeptídeos exibidos por mRNA também podem ser isolados através de ligação de uma cauda poliA no mRNA à resina polidT, ou uma combinação de uma cauda poliA e uma etiqueta His.

[0063] Após a reação de tradução in vitro ter sido realizada, e antes da etapa de seleção, a porção de mRNA do RNA funcionalizado é tipicamente transcrita inversamente para produzir uma molécula híbrida de RNA-DNA. Isso serve para proteger o RNA de degradação, e também impede que o RNA se dobre em uma estrutura secundária que pode ser ligar ao alvo de seleção, o que levaria à seleção de produtos inapropriados (por exemplo, a seleção de aptâmeros de RNA em vez de aptâmeros de polipeptídeo).

[0064] Após a tradução in vitro e isolamento de fusões de polipep- tídeo-mRNA, a porção química polipeptídica pode ser modificada por reticulação intramolecular ou intermolecular, conjugação química, cli-vagemenzimática, truncamento ou extensão com monômeros de ami- noácidos adicionais. Uma forma de realizar isso é incorporar aminoá- cidos não naturais com cadeias laterais reativas nos polipeptídeos que constituem a biblioteca. Após a tradução, os polipeptídeos recentemente formados podem ser reagidos com moléculas que reagem es-pecificamente com a cadeia lateral reativa do aminoácido incorporado. Por exemplo, um aminoácido com uma cadeia lateral de alcino terminal pode ser incorporado na biblioteca de polipeptídeo e subsequentemente reagido com um azido açúcar, que cria uma biblioteca de po- lipeptídeos exibidos com açúcares afixados nas posições das cadeias laterais de alquinila (Josephson, K., Hartman, M.C.T. e Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11.727-11.735). Uma variedade de cadeias laterais reativas pode ser usada para tal conjugação pós- traducional, que inclui aminas, grupos carboxila, azidas, alcinos termi- nais, alcenos e tióis.

[0065] Uma modificação particularmente útil se baseia na reticula- ção de aminoácidos para produzir estruturas cíclicas. Regiões cíclicas em um polipeptídeo contêm um domínio rígido, que reduz a flexibilidade conformacional e graus de liberdade rotacional, o que leva à ligação de afinidade muito alta à proteínas-alvo. Inúmeros métodos para ciclização de um polipeptídeo estão disponíveis para os indivíduos versados na técnica e são incorporados no presente documento a título de referência. Tipicamente, a reatividade química de cadeias laterais de aminoácido específicas e/ou os terminais carboxila ou amina do polipeptídeo são explorados para reticular dois sítios do polipeptídeo para produzir uma molécula cíclica. Em um método, o grupo tiol de um resíduo de cisteína é reticulado com outro resíduo de cisteína para formar uma ligação dissulfeto. Em algumas modalidades, grupos tiol de resíduos de cisteína reagem com grupos brometila de moléculas de poli(bromometil)benzeno para formar ligações estáveis (consultar Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência). As moléculas de poli(bromometil)benzeno da presente invenção podem incluir, mas sem limitação, 1,2-bis(bromometil)benzeno, 1,3-bis(bromometil)benzeno e 1,4-bis(bromometil)benzeno. As moléculas bis, tris e tetrakis(bromometil)benzeno, por exemplo, podem ser usadas para gerar porções químicas em ponte para produzir polipeptí- deos com um, dois ou três laços, respectivamente. Os grupos brometi- la de uma molécula de poli(bromometil)benzeno podem estar dispostos no anel benzeno em carbonos de anel adjacentes (orto- ou o-), sendo que um carbono de anel separa os dois grupos (meta- ou m-) ou em carbonos de anel opostos (para- ou p-). Em algumas modalidades, m-bis(bromometil)benzeno (também denominado no presente documento como m-dibromoxileno) é utilizado na formação de polipeptí- deos cíclicos. Em algumas modalidades, o-bis(bromometil)benzeno (também denominado no presente documento como o-dibromoxileno) ou p-bis(bromometil)benzeno (também denominado no presente documento como p-dibromoxileno) são utilizados na formação de poli- peptídeos cíclicos. Em algumas modalidades, grupos tiol de resíduos de cisteína reagem com outros reagentes que compreendem um ou mais grupos funcionais bromo para formar ligações estáveis. Tais reagentes podem incluir, mas sem limitação, poli(bromometil)piridinas (incluindo, mas sem limitação, 2,6-bis(bromometil)piridina), po- li(bromometil)alquilbenzenos (incluindo, mas sem limitação, 1,2- bis(bromometil)-4-alquilbenzeno) e/ou (E)-1,4-dibromobut-2-eno.

[0066] Em outro método exemplificativo, um grupo amina de cadeia lateral e um grupo amina terminal são reticulados com glutarato de disuccinimidila (consultar Millward, S.W. et al., J. Am. Chem. Soc. 127:14.142-14.143, 2005). Em outras abordagens, a ciclização é realizada formando-se uma ligação tioéter entre dois sítios no polipeptídeo (consultar Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824; in-corporado ao presente documento em sua totalidade a título de refe-rência). Um método enzimático se baseia na reação entre (1) uma cis- teína e (2) um grupo dehidroalanine ou dehidrobutirina, catalisada por uma sintetase lantibiotica, para criar a ligação tioéter (consultar Leven- good, M.R. and Van der Donk, W.A., Bioorg. e Med. Chem. Lett. 18:3.025-3.028, 2008). O grupo funcional dehidro também pode ser gerado quimicamente pela oxidação de selênio que contém cadeias laterais de aminoácido incorporadas durante a tradução (consultar Seebeck, F.P. e Szostak, J.W. J. Am. Chem. Soc. 2006).

[0067] Uma biblioteca de fusões de mRNA-polipeptídeo (também denominado no presente documento como uma biblioteca de exibição de mRNA) gerada com o uso dos métodos descritos acima, e que pode ou não ter sido submetida a uma modificação pós-traducional (tal como ciclização do polipeptídeo, conforme descrito acima), pode ser submetida a uma etapa de seleção de lote para isolar esses complexos que exibem polipeptídeos desejáveis.

[0068] Tipicamente, C5 é conjugado com um substrato sólido, tal como uma agarose ou microesfera de polímero sintético. Inúmeros métodos para imobilizar C5 a um suporte sólido estão disponíveis. Em um método particularmente útil, C5 é conjugado com biotina, e micro- esferas de estreptavidina são usadas para imobilizar a proteína. As microesferas que compreendem o C5 imobilizado são misturadas com a biblioteca de exibição de mRNA e incubadas sob condições (por exemplo, temperatura, força iônica, cátions divalentes e moléculas de ligação concorrentes) que permitem que membros específicos da biblioteca se liguem ao alvo. Alternativamente, a enzima biotinilada pode ser livre em solução e, após se ligar a um polipetídeo apropriado, as fusões de mRNA-polipeptídeo ligadas ao C5 são capturadas por mi- croesferas apropriadamente modificadas.

[0069] As condições de ligação podem ser variadas a fim de alterar a severidade da seleção. Por exemplo, baixas concentrações de um agente de ligação competitivo podem ser adicionadas para garantir que os polipeptídeos selecionados tenham uma afinidade relativamente mais alta. Alternativamente, pode-se escolher que um período de incubação seja muito breve, de modo que somente polipeptídeos com taxas kon altas (taxa de associação) sejam isolados. Dessa maneira, as condições de incubação desempenham um papel importante na determinação das propriedades dos polipeptídeos selecionados. Seleções negativas também podem sem empregadas. Nesse caso, uma seleção para remover polipeptídeos com afinidade para o substrato ao qual o alvo está ligado (por exemplo, Sepharose) é realizada aplicando-se a biblioteca exibida às microesferas de substrato que carecem da proteína-alvo. Essa etapa pode remover mRNAs e seus polipeptí- deos criptados que não são específicos para a proteína-alvo. Inúmeras referências que descrevem como conduzir experimentos de seleção estão disponíveis. (Consultar, por exemplo, Patente no U.S. 6.258.558, Smith, G.P. e Petrenko, V.A., (1997) Chem. Rev. 97:391-410; Keefe, A.D. e Szostak, J.W. (2001) Nature 15:715-718; Baggio, R. et al. (2002) J. Mol. Recog. 15:126-134 e Sergeeva, A. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1622-1654; em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência).

[0070] Espera-se que a frequência na qual moléculas de ligação estão presentes em uma biblioteca de sequências aleatórias seja muito baixa. Assim, na etapa de seleção inicial, muito poucos polipeptí- deos que cumprem os critérios de seleção (e seus mRNAs associados) devem ser recuperados. Tipicamente, a seleção é repetida com mRNAs selecionado a partir da primeira série de seleção. Isso é realizado com o uso de PCR para amplificar os mRNAs ou cDNAs correspondentes selecionados na primeira série, seguido por transcrição in vitro para produzir uma nova biblioteca de mRNAs. São usados iniciadores de PCR que correspondem às extremidades 5’ e 3’ dos mRNAs na biblioteca. Tipicamente, o iniciador 5’ se estenderá na direção 5’ além da extremidade do mRNA de modo que um promotor bacteriano, tal como um promotor T7, seja adicionado à extremidade 5’ de cada molécula amplificada. Uma vez amplificado, o DNA de dupla hélice pode ser usado em uma reação de transcrição in vitro para gerar o mRNA para uma série subsequente de seleção.

[0071] O processo de seleção envolve tipicamente inúmeras séries ou ciclos, em que o grupamento de moléculas selecionado é enriquecido incrementalmente em um conjunto específico de sequências no final de cada série. As condições de seleção podem ser a mesma para cada série, ou as condições podem alterar, por exemplo, a fim de au- mentar a severidade de seleção em séries posteriores. O progresso de seleção pode ser monitorado pelo uso de aminoácidos isotipicamente marcados, tais como metionina 35S. A quantidade de polipeptídeo ra- diomarcado ligada ao alvo em cada série é medida, e um aumento progressivo em radiomarcação recuperada é indicativo de um enrique-cimento progressivo em moléculas de RNA que criptam polipeptídeos com afinidade de ligação ao alvo. Após qualquer série, os produtos de PCR podem ser clonados e sequenciados. Em geral, a clonagem e o sequenciamento são realizados após uma série na qual quantidades apreciáveis (por exemplo, >2% em relação ao segundo plano para mi- croesferas que carecem de C5 imobilizado) de polipeptídeo radiomar- cado são recuperadas no grupamento ligado ao alvo. As sequências que são encontradas em múltiplos isolados são candidatas para criptar polipeptídeos que se ligam especificamente ao alvo. Alternativamente, o sequenciamento de alto rendimento de milhares de clones pode ser realizado após a primeira série ou séries subsequentes. As sequências que aumentam em frequência entre, por exemplo, a terceira e a quarta séries são candidatas para criptar polipeptídeos se se ligam especifi-camente ao alvo. O polipeptídeo criptado por qualquer sequência pode ser traduzido ou sintetizado e testado para afinidade de ligação com a proteína-alvo original usada na seleção.

[0072] As bibliotecas e métodos da presente invenção podem ser usados para otimizar a função ou propriedades de um polipeptídeo. Em uma abordagem, PCR mutagênica (Keefe, A.D. e Szostak, J.W. (2001). Nature 15:715-718) é usada para introduzir variação de sequência na biblioteca, uma vez que a população é enriquecida em po- lipeptídeos com um certo nível de afinidade de ligação. Alternativamente, uma sequência de RNA única que cripta um polipeptídeo com propriedades de ligação definidas pode ser replicada, mas com um nível definido de mutações, ou a PCR mutagênica pode ser realizada para produzir um grupamento de moléculas mutantes. Mediante a tradução in vitro, espera-se que a mistura resultante de moléculas de mRNA produzida a partir de tal grupamento cripte polipeptídeos com uma faixa de afinidades aprimoradas, similares ou reduzidas em comparação à sequência de partida, e espera-se que uma seleção realizada em mRNAs a partir de tal grupamento identifique polipeptídeos com afinidade aprimorada caso um regime de severidade apropriado seja usado durante a seleção.

[0073] Em uma segunda abordagem, a otimização é realizada de uma maneira direcionada. Uma sequência que cripta um polipeptídeo com propriedades de ligação ou funcionais estabelecidas é submetida à mutagênese direcionada ao sítio, através da qual uma série de se-quências é produzida, em que cada sequência tem um códon substituído, por exemplo, por um códon de alanina. A quantidade de sequências no conjunto é igual à quantidade de resíduos de aminoácido que devem ser mutados. Após a tradução in vitro, o produto de polipeptí- deo de cada mutante de "varredura de alanina"é testado para propriedades de ligação ou funcionais. Os sítios nos quais uma substituição de alanina afeta a ligação ou a função do polipeptídeo são consideradosresíduos críticos. De modo similar, uma varredura de N-metila pode ser realizada, de modo que cada resíduo seja substituído por um derivado de N-metila, e posições na cadeia principal de polipeptídeo que podem tolerar substituições N-metila podem ser identificadas.

[0074] Alternativamente, as sequências podem ser agrupadas, submetidas a uma ou mais séries de uma seleção de severidade alta e um grupamento de sequências que representa polipeptídeos de ligação de alta afinidade é isolado. Os resíduos críticos são identificados após o sequenciamento de DNA do DNA recuperado como aqueles que não podem ser substituídos por um resíduo de alanina sem perda de atividade. Uma vez que os resíduos críticos sejam identificados, um grupamento de moléculas de mRNA que cripta uma ampla variedade de aminoácidos naturais (ou não naturais) em cada posição crítica é produzido. O grupamento resultante é submetido a uma ou mais séries de uma seleção de severidade alta (com a mistura apropriada de tRNAs carregados com aminoácidos naturais ou não naturais), e sequências que representam polipeptídeos de ligação de alta afinidade são isoladas após a tradução in vitro. Dessa maneira, um polipeptídeo ideal pode ser identificado. Visto que a sequência ideal não pode necessariamente ser identificada combinando-se resíduos ideais em sítios individuais, é útil testar mutações em múltiplos sítios em combinação.

[0075] A varredura tanto de alanina quanto de N-metila também pode ser realizada com o uso de abordagens de síntese química, tais como síntese de polipeptídeo em fase sólida (consultar, por exemplo, Coin, I et al. (2007); Nature Protocols 2(12):3.247-56, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência).

[0076] Uma vez que um grupamento, população ou subconjunto de polipeptídeos é identificado, o mesmo pode ser avaliado para aplicações terapêuticas ou de diagnóstico, que incluem propriedades far- macocinéticas e/ou farmacodinâmicas aprimoradas.

[0077] Em uma modalidade, os polipeptídeos são avaliados para um ou mais dentre afinidade de ligação ao alvo, atividade em ensaios com base em bioquímica ou célula, resistência à protease, permeabilidadein vitro ou in vivo, propriedades relacionadas à adequação para uso como um agente farmacêutico tal como ligação de proteína plas- mática, metabolismo (em microssomas, hepatócitos ou plasma), inibição de P-glicoproteína (Pgp) e inibição de Citocroma P450. Os poli- peptídeos da presente invenção também podem passar por testes para biodisponibilidade oral, toxicidade, inibição de produto de gene rela- cionado à éter-à-go-go humano (hERG), meia-vida de circulação, ou-trosparâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos e eficácia em modelos animais de doença. Polipeptídeos da invenção

[0078] De acordo com a presente invenção, uma vez que um poli- peptídeo único ou um grupamento de moléculas de polipeptídeo can-didatasé identificado, o mesmo pode passar por uma ou mais séries de otimização de relação entre estrutura-atividade (SAR) com o uso de técnicas padrão de síntese de polipeptídeo e químicas. Tal otimização pode incluir considerações, tais como evitar cadeias laterais polares carregadas (Asp, Glu, Arg, Lys) que podem inibir penetração de célula, evitar cadeias laterais que representam passivos metabólicos (Tyr, Met, Trp, Cys), aprimorar a solubilidade, evitar peso molecular desnecessário, evitar ligações giratórias e alterar a capacidade lipofílica.

[0079] Em uma modalidade, fornecer peptidomiméticos cíclicos projetados para serem metabolicamente estáveis, permeáveis em célula e/ou oralmente disponíveis é uma meta da presente invenção. Variantes de aminoácido

[0080] Conforme usado no presente documento, o termo "aminoá- cido" inclui os resíduos dos aminoácidos naturais, assim como amino- ácidos não naturais. O termo também inclui aminoácidos que portam um grupo amina de proteção convencional (por exemplo, acetila ou benziloxicarbonila), assim como aminoácidos naturais e não naturais protegidos no terminal carboxila (por exemplo, como um éster (C1-C6) alquila, fenila ou benzila ou amida; ou como uma alfa-metilbenzil ami- da). Outros grupos amina e carbóxi de proteção adequados são conhecidos pelos versados na técnica (Consultar, por exemplo, Greene, T. W.; Wutz, P. G. M., Protecting Groups In Organic Synthesis; 2a edição, 1991, Nova York, EUA, John Wiley & sons, Inc., e documentos citados no mesmo). Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptí- deo da presente invenção também podem incluir aminoácidos modifi-cados.

[0081] Os aminoácidos não naturais úteis para a otimização de polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção incluem, mas sem limitação, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-1- carboxílico, ácido 1-amino-2,3-hidro-1H-indeno-1-carboxílico, homolisina, homoarginina, homoserina, ácido 2-aminoadípico, ácido 3- aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiônico, ácido 2- aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 5-aminopentanoico, ácido 5-aminohexanoico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2- aminopimélico, desmosina, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, allo-hidroxilisina, 3- hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, allo-isoleucina, N- metilpentilglicina, naftilalanina, ornitina, pentilglicina, tioprolina, norvalina, terc-butilglicina, fenilglicina, azatriptofano, 5-azatriptofano, 7- azatriptofano, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homociste- ína, ácido 1-aminociclopropano carboxílico, ácido 1-aminociclobutano carboxílico, ácido 1-aminociclopentano carboxílico, ácido 1- aminociclohexano carboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-pirano-4- carboxílico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclopen- tilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, n-w-metil-arginina, 4— clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptofano, 5- clorotriptofano, citrulina, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4- aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleu- cina, ácido tranexâmico, ácido 2-amino pentanoico, ácido 2-amino he- xanoico, ácido 2-amino heptanoico, ácido 2-amino octanoico, ácido 2- amino nonanoico, ácido 2-amino decanoico, ácido 2-amino undecanoi- co, ácido 2-amino dodecanoico, ácido aminovalérico e ácido 2-(2- aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi azetidina, hexafluoro- leucina, 3-Fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3- fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil- fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino- 5-azidopentanoico (também denominado no presente documento como "X02"), ácido (S)-2-aminohept-6-enoico (também denominado no presente documento como "X30"), ácido (S)-2-aminopent-4-inoico (também denominado no presente documento como "X31"), ácido (S)- 2-aminopent-4-enoico (também denominado no presente documento como "X12"), ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3- (aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2- aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc- leucinol, (R)-3-metilbutano-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropano-1-amina e (S)-N,2-dimetil-1-(piridina-2-l)propano-1-amina, ácido (S)-2-amino-3- (oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-l)propanoico, ácido (S)-2- amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5- fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico e ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3- il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il), ácido (S)-2-amino-3- (oxazol-5-il)butanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2- il)butanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)butanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)butanoico e ácido (S)-2-amino- 3-(1H-indazol-3-il)butanoico, ácido 2-(2’MeOfenil)-2-amino acético, ácido tetrahidro 3-isoquinolina carboxílico e estereoisômeros dos mesmos (incluindo, mas sem limitação, para isômeros D e L).

[0082] Os aminoácidos não naturais adicionais que são úteis na otimização de polipeptídeos ou composições de polipeptídeo da invenção incluem, mas sem limitação, aminoácidos fluorados em que um ou mais átomos de hidrogênio ligados a carbono são substituídos por flúor. A quantidade de átomos de flúor incluída pode variar de 1 até e in- cluindo todos os átomos de hidrogênio. Exemplos de tais aminoácidos incluem, mas sem limitação, 3-fluoroprolina, 3,3-difluoroprolina, 4- fluoroprolina, 4,4-difluoroprolina, 3,4-difluoroprolina, 3,3,4,4- tetrafluoroprolina, 4-fluorotriptofano, 5-fluorotriptofano, 6- fluorotriptofano, 7-fluorotriptofano e estereoisômeros dos mesmos.

[0083] Aminoácidos não naturais adicionais que são úteis na otimização de polipeptídeos ou composições de polipeptídeo da invenção incluem, mas sem limitação, aqueles que são dissubstituídos no a- carbono. Esses incluem aminoácidos em que os dois substituintes no a-carbono são iguais, por exemplo, ácido a-amino isobutírico e ácido 2-amino-2-etil butanoico, assim como aqueles em que os substituintes são diferentes, por exemplo, a-metilfenilglicina e a-metilprolina. Adicionalmente, os substituintes no a-carbono podem ser tomados em conjunto para formar um anel, por exemplo, ácido 1-aminociclopentano carboxílico, ácido 1- aminociclobutano carboxílico, ácido 1- aminociclohexano carboxílico, ácido 3-aminotetrahidrofuran-3-ácido carboxílico, ácido 3-aminotetrahidropirano-3-carboxílico, ácido 4- aminotetrahidropirano-4-carboxílico, ácido 3-aminopirrolidina-3- carboxílico, ácido 3-aminopiperidina-3-carboxílico, ácido 4- aminopiperidina-4-carboxílico e estereoisômeros dos mesmos.

[0084] Os aminoácidos não naturais adicionais que são úteis na otimização de polipeptídeos ou composições de polipeptídeo da invenção incluem, mas sem limitação, análogos de triptofano em que o sistema de anel indol é substituído por outro sistema de anel bicíclico com 9 ou 10 membros que compreende 0, 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre N, O ou S. Cada sistema de anel pode ser saturado, parcialmente insaturado ou totalmente insatu- rado. O sistema de anel pode ser substituído por 0, 1, 2, 3 ou 4 substi- tuintes em qualquer átomo substituível. Cada substituinte é independentemente selecionado dentre H, F, Cl, Br, CN, COOR, CONRR’, oxo, OR, NRR’. Cada R e R’ é independentemente selecionado dentre H, C1-C20 alquil, C1-C20 alquil-O-Cl-20 alquil.

[0085] Em algumas modalidades, análogos de triptofano (também denominado no presente documento como "análogos triptofano") que são úteis na otimização de polipeptídeos ou composições de polipeptí- deo da invenção incluem, mas sem limitação, 5-fluorotriptofano [(5- F)W], 5-metil-O-triptofano [(5-MeO)W], 1-metiltriptofano [(1-Me-W) ou (1-Me)W], D-triptofano (D-Trp), azatriptofano (que inclui, mas sem limitação, 4-azatriptofano, 7-azatriptofano e 5-azatriptofano), 5- clorotriptofano, 4-fluorotriptofano, 6-fluorotriptofano, 7-fluorotriptofano e estereoisômeros dos mesmos. Exceto onde indicado ao contrário, o termo "azatriptofano" e sua abreviação, "azaTrp", conforme usado no presente documento, se refere ao 7-azatriptofano.

[0086] Resíduos de aminoácido modificado úteis para a otimização de polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção incluem, mas sem limitação, aqueles que são quimicamente blo-queados,reversíveis ou irreversíveis, ou quimicamente modificados em seu grupo amina N-terminal ou seus grupos de cadeia lateral, ou quimicamente modificados na cadeia principal de amida como, por exemplo, estereoisômeros ou resíduos D (aminoácidos não naturais) e L (aminoácidos naturais) N-metilados, em que os grupos funcionais de cadeia lateral são quimicamente modificados para outro grupo funcional. Por exemplo, aminoácidos modificados incluem, sem limitação, sulfóxido de metionina; metionina sulfona; ácido aspártico-(beta-metil éster), um aminoácido modificado de ácido aspártico; N-etilglicina, um aminoácido modificado de glicina; ou alanina carboxamida e um ami- noácido modificado de alanina. Os aminoácidos não naturais podem ser adquiridos na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), na Bachem (Torrance, CA, EUA) ou outros fornecedores. Os aminoácidos não naturais podem incluir adicionalmente qualquer um dentre aqueles lista- dos na Tabela 2 da publicação de patente no US 2011/0172126, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0087] Em algumas modalidades, as sequências de aminoácido de polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem compreender somente aminoácidos de ocorrência natural. Embora seja conhecido na técnica que os termos peptídeos, polipeptídeos e/ou fragmentos dos mesmos implicam tamanho relativo, esses termos, conforme usados no presente documento, não devem ser considerados limitativos em relação ao tamanho das várias moléculas com base em polipeptídeo referenciadas no presente documento e que são abrangidas dentro desta invenção, a menos que indicado de outra forma. Em algumas modalidades da presente invenção, os polipeptí- deos podem compreender aminoácidos tanto de ocorrência natural e não natural quanto aminoácidos modificados ou ser exclusivamente compreendidos de aminoácidos de ocorrência não natural. Variantes de polipeptídeo

[0088] De acordo com a presente invenção, qualquer molécula com base em aminoácido (natural ou não natural) pode ser denominada como um "polipeptídeo" e esse termo abrange "peptídeos", "pepti- domiméticos" e "proteínas". Os polipeptídeos também são uma categoria de proteína e são tradicionalmente considerados com tamanhos que variam de cerca de 4 a cerca de 50 aminoácidos. Dipeptídeos, aqueles que têm dois resíduos de aminoácido, são uma categoria de polipeptídeo assim como os tripeptídeos (polipeptídeos que compreendem três aminoácidos). Os polipeptídeos maiores do que 50 amino- ácidos são geralmente denominados como "proteínas". As sequências de polipeptídeos podem ser lineares ou cíclicas. Por exemplo, um poli- peptídeo cíclico pode ser preparado ou pode resultar da formação de ligações dissulfeto entre dois resíduos de cisteína em uma sequência. Um polipeptídeo pode ser ciclizado através do terminal carboxila, do terminal amina ou através de qualquer outro ponto conveniente de afi-xação,tal como, por exemplo, através do enxofre de uma cisteína ou qualquer cadeia lateral de um resíduo de aminoácido ou outra ligação que inclui, mas sem limitação, uma ligação maleimida, uma ligação amida, uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação éter tiol, uma ligação hidrazona ou uma ligação acetamida. Em algumas modalida-des,polipeptídeos cíclicos são formados quando uma molécula atua como uma porção química em ponte para ligar duas ou mais regiões do polipeptídeo.

[0089] O termo "variante de sequência de aminoácidos"se refere a polipeptídeos com algumas diferenças em suas sequências de ami- noácido em comparação a uma sequência de partida de referência ou sequência nativa. As variantes de sequência de aminoácidos podem processar substituições, deleções e/ou inserções em certas posições dentro da sequência de aminoácidos. Ordinariamente, as variantes processarão pelo menos cerca de 70% de homologia para uma sequência nativa ou de partida e, preferencialmente, as mesmas serão pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente, pelo menos cerca 90% de homólogas a uma sequência nativa ou de partida.

[0090] A "homologia", conforme se aplica às sequências de ami- noácido, é definida como a porcentagem de resíduos na sequência de aminoácidos candidata que são idênticos aos resíduos na sequência de aminoácidos de uma segunda sequência após alinhar as sequências e introduzir lacunas, caso necessário, para alcançar a homologia de porcentagem máxima. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Compreende-se que essa homologia depende de um cálculo de identidade percentual, mas pode diferir em valor devido às lacunas e penalidades introduzidas no cálculo.

[0091] Por "homólogos", conforme se aplica às sequências de aminoácido, entende-se a sequência correspondente de outras espécies que têm identidade substancial a uma segunda sequência de uma segunda espécie.

[0092] "Análogos"significa incluir variantes de sequência de ami- noácidos que diferem por uma ou mais alterações de aminoácido, por exemplo, substituições, adições ou deleções de resíduos de aminoáci- do que ainda mantêm uma ou mais das propriedades do polipeptídeo parental ou de partida.

[0093] A presente invenção contempla diversos tipos de composições que incluem polipeptídeos, incluindo variantes e derivados. Esses incluem variantes e derivados de substituição, de inserção, de deleção e covalentes. O termo "derivado"é usado de modo sinônimo ao termo "variante" e se refere a uma molécula que foi modificada ou alterada de qualquer forma em relação a uma molécula de referência ou molécula de partida.

[0094] Sendo assim, polipeptídeos que contêm substituições, inserções e/ou adições, deleções e modificações covalentes estão incluídos dentro do escopo desta invenção. Por exemplo, aminoácidos ou etiquetas de sequência, tal como uma ou mais lisinas, podem ser adicionadosàs sequências de polipeptídeos da invenção (por exemplo, nas extremidades N-terminal ou C-terminal). As etiquetas de sequência podem ser usadas para purificação ou localização de polipeptídeo. As lisinas podem ser usadas para aumentar a solubilidade de polipep- tídeo ou para permitir modificações específicas de sítio, tais como, mas sem limitação, biotinilação ou PEGilação. Em alguns casos, os polipeptídeos podem ser destiobiotinilados. Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo que é destiobiotinilado pode compreender uma porção química de destiobiotina (Dtb) conjugada com um grupo epsilon-amina de um resíduo de lisina. Tais resíduos de lisi na podem ser resíduos C-terminal em alguns exemplos. Alternativa-mente,resíduos de aminoácido localizados nas regiões de terminal carbóxi e amina da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo podem, opcionalmente, ser deletados, o que fornece sequências truncadas. Certos aminoácidos (por exemplo, resíduos C-terminal ou N- terminal) pode, alternativamente, ser deletados dependendo do uso da sequência como, por exemplo, expressão da sequência como parte de uma sequência maior, que é solúvel, ou ligada a um suporte sólido.

[0095] "Variantes de substituição", quando em referência a poli- peptídeos, são aquelas que têm pelo menos um resíduo de aminoáci- do em uma sequência nativa ou de partida removido e um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição. As substituições podem ser simples, em que somente um aminoácido na molécula foi substituído, ou podem ser múltiplas, em que dois ou mais aminoácidos foram substituídos na mesma molécula.

[0096] Conforme usado no presente documento, o termo "substituição de aminoácido conservativa" se refere à substituição de um aminoácido que normalmente está presente na sequência por um ami- noácido diferente de tamanho, carga ou polaridade similar. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina e leucina por outro resíduo não polar. De modo semelhante, exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por outro, tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagi- na e entre glicina e serina. Adicionalmente, a substituição de um resíduobásico, tal como lisina, arginina ou histidina, por outro, ou a substituição de um resíduo ácido, tal como, ácido aspártico ou ácido glutâ- mico, por outro resíduo ácido são exemplos adicionais de substituições conservativas. Exemplos de substituições não conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) de aminoácido, tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina, por um resíduo polar (hidrofílico), tal como cisteína, glutamina, ácido glutâmico ou lisina e/ou de um resíduo polar por um resíduo não polar.

[0097] "Isósteros" são uma dentre duas ou mais moléculas que exibem alguma similaridade de propriedades biológicas como resultado de ter a mesma quantidade de elétrons totais ou de valência na mesma disposição e que consistem em átomos diferentes, não necessariamente a mesma quantidade de átomos. Há duas classes de isós- teros, clássica e não clássica. Isósteros clássicos têm a mesma quantidade de átomos e/ou a mesma quantidade de elétrons de valência enquanto que isósteros não clássicos são moléculas que produzem um efeito biológico similar in vivo, mas não têm a mesma quantidade de átomos e/ou elétrons de valência.

[0098] De acordo com a presente invenção, "isósteros de ligação peptídica" são definidos como isósteros que têm propriedades que se assemelham às ligações peptídicas. Os isósteros de ligação peptídica podem ser de um tipo linear que compreende pelo menos uma substi-tuição de ligação peptídica ou podem ser cíclicos e compreendem uma função amina e ácido carboxílico. Tal substituição pode ser com qual-querporção química que aprimore as propriedades fisioquímicas, es-truturais ou funcionais da molécula. A substituição da ligação peptídica pode aumentar a estabilidade metabólica dos polipeptídeos e reduzir ou aumentar a flexibilidade. Os isósteros de ligação peptídica descritos no presente documento podem ser isósteros de ligação mono, di, tri, tetra, penta, hexa, hepta, octa, nona ou decapeptídica, o que significa que pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações peptídicas podem ser substituídas. Exemplos não limitativos de isósteros de ligação dipeptídica lineares para ligações amida (peptídica) incluem tioamida, sulfonamida, sulfonato, fosfonamida, fosfonato, fosfotioato, fosfinato, alcano, 1 ou 2 hidroxietileno, dihidroxiletileno, ligação simples C-C (al- cano), ligação dupla C-C (alceno), ligação tripla C-C (alcino), ligação C-O (metilenoxi), ligação O-N ou N-O, (metilenemina), triazol, hidrazi- da, ureia, cetona, ligação uretano, (di)haloalceno, metilenomercapto, metilenoamina, trifluoroetilamina, hidrazida, amidoxi e outros conhecidos pelos versados na técnica.

[0099] Isósteros de ligação peptídica também podem ser molécu-lascíclicas que são decoradas com uma função amina e ácido carbo- xílico. Exemplos não limitativos de isósteros de ligação peptídica cíclicos com tamanhos de anel variados incluem carbaciclos, azaciclos e oxaciclos. Os azaciclos podem se basear em um núcleo alcaloide que forma um isóstero de estrutura bicíclica. Um exemplo de um isóstero azacíclico inclui um isóstero com base em um anel triazol formado por uma cicloadição de azida-alcino catalisada por cobre. Os isósteros de ligação peptídica cíclicos descritos no presente documento podem ser isósteros cíclicos bi, tri, tetra, penta, hexa, hepta, octa ou nonadeca- peptídicos.

[00100] As "variantes de inserção", quando em referência aos poli- peptídeos, são aquelas com um ou mais aminoácidos inseridos imedi-atamente adjacentes a um aminoácido em uma posição particular em uma sequência nativa ou de partida. "Imediatamente adjacente" a um aminoácido significa conectado ao grupo funcional alfa-carbóxi ou alfa- amino do aminoácido.

[00101] As "variantes de deleção", quando em referência aos poli- peptídeos, são aquelas com um ou mais aminoácidos na sequência nativa ou de partida de aminoácidos removidos. Ordinariamente, as variantes de deleção terão um ou mais aminoácidos deletados em uma região particular da molécula.

[00102] As "variantes truncadas", quando em referência aos poli- peptídeos, são aquelas com um ou mais aminoácidos na sequência nativa ou de partida de aminoácidos removidos a partir de qualquer terminal do polipeptídeo.

[00103] De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos podem ser modificados pela adição de um ou mais grupos de conjugados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administrados em combinação com uma ou mais moléculas adicionais.

[00104] Conforme usado no presente documento, um "conjugado" se refere a qualquer molécula ou porção química anexada à outra molécula. Na presente invenção, os conjugados podem ser à base de po- lipeptídeo (aminoácido) ou não. Os conjugados podem compreender lipídios, moléculas pequenas, RNA, DNA, polipeptídeos, polímeros ou combinações dos mesmos. Funcionalmente, os conjugados podem servir como moléculas-alvo ou podem servir como carga útil a ser entregue a uma célula, órgão ou tecido. Os conjugados são tipicamente modificações covalentes introduzidas reagindo-se resíduos de amino- ácido alvejados ou os terminais do polipeptídeo com um agente de derivação orgânico que tem capacidade para reagir com resíduos terminais ou de cadeias laterais selecionados. Tais modificações estão dentro da habilidade comum na técnica e são realizadas sem experimento indevido.

[00105] O processo de conjugação pode envolver PEGilação, lipi- dação, albuminação, biotinilação, destiobiotinilação, a adição de outras caudas de polipeptídeo, ou graftização em domínios de anticorpo Fc, regiões de CDR de anticorpos intactos, ou domínios de anticorpo produzidos por qualquer quantidade de meios. O conjugado pode incluir âncoras que incluem porção química de oleato de colesterol, porção química de laurato de colesteril, uma porção química de a-tocoferol, uma porção química de fitol, uma porção química de oleato ou uma porção química de éster de colesterol insaturado ou um composto lipo- fílico selecionado dentre acetanilidas, anilidas, aminoquinolinas, compostos de benzidrila, benzodiazepinas, benzofuranos, canabinoides, polipeptídeos cíclicos, dibenzazepinas, gicosídeos digitalis, alcaloides de ergot, flavonoides, imidazóis, quinolinas, macrolídeos, naftalenos, opiáceos (tais como, mas sem limitação, morfinas ou outros fármacos psicoativos), oxazinas, oxazóis, fenilalquilaminas, piperidinas, hidro- carbonetos aromáticos policíclicos, pirrolidinas, pirrolidinonas, estilbe- nos, sulfonilureias, sulfonas, triazóis, tropanos e alcaloides de vinca.

[00106] Conforme usado no presente documento, o termo "derivado covalente", quando em referência a um polipeptídeo, inclui a modificação de um polipeptídeo nativo ou de partida com um agente de derivação proteico ou não proteico e/ou modificação pós-traducional. As mo-dificações covalentes são tradicionalmente introduzidas reagindo-se resíduos de aminoácido alvejados do polipeptídeo com um agente de derivação orgânico que tem capacidade para reagir com resíduos ter-minais ou de cadeias laterais selecionados, ou por mecanismos de aproveitamento de modificações pós-traducionais que funcionam em células hospedeiras recombinantes selecionadas. Os derivados cova-lentes resultantes são úteis em programas direcionados para identifi-carresíduos importantes para atividade biológica, para imunoensaios ou para a preparação de anticorpos antiproteínas para purificação por imunoafinidade da proteína recombinante. Tais modificações estão dentro da habilidade comum na técnica e são realizadas sem experimento indevido.

[00107] Certas modificações pós-traducionais são o resultado da ação de células hospedeiras recombinantes em um polipeptídeo expressado. Os resíduos de glutaminil e asparaginil são frequentemente diamidados de modo pós-traducional para os resíduos de glutamil e aspartil correspondentes. Alternativamente, esses resíduos são diami- dados sob condições moderadamente ácidas. Qualquer forma desses resíduos pode estar presente nos polipeptídeos produzidos de acordo com a presente invenção.

[00108] Outras modificações pós-traducionais incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de tiro- sinil, seril ou treonil, metilação dos grupos alfa-amina de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (Creighton, T. E., Porteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, USA, 1983, pp. 79-86).

[00109] As modificações covalentes incluem especificamente a ligação de polímeros não proteicos aos polipeptídeos da invenção. Os polímeros não proteicos podem incluir um polímero sintético hidrofílico, isto é, um polímero não encontrado de outra forma na natureza. Entretanto, os polímeros que existem na natureza e são produzidos por métodos recombinantes ou in vitrosão úteis, assim como os polímeros que são isolados da natureza. Os polímeros de polivinila hidrofílicos estão dentro do escopo desta invenção, por exemplo, álcool polivinílico e polivinilpirrolidona. Os polipeptídeos podem ser ligados a vários polímeros não proteicos, tais como polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira apresentada nas Patentes no U.S. 4.640.835; no U.S 4.496.689; no U.S 4.301.144; no U.S 4.670.417; no U.S 4.791.192 ou no U.S 4.179.337.

[00110] As "características", quando em referência aos polipeptí- deos, são definidas como componentes com base em sequência de aminoácidos distintos de uma molécula. As características do polipep- tídeo da presente invenção incluem manifestações de superfície, formato de conformação local, dobras, laços, meio-laços, domínios, meio- domínios, sítios, terminais ou qualquer combinação dos mesmos.

[00111] Conforme usado no presente documento, quando em referência aos polipeptídeos, o termo "dobra" se refere à conformação resultante de uma sequência de aminoácidos mediante minimização de energia. Uma dobra pode ocorrer no nível secundário ou terciário do processo de dobragem. Exemplos de dobras de nível secundário in- cluem folhas beta e hélices alfa. Exemplos de dobras terciárias inclu-emdomínios e regiões formadas devido à agregação ou separação de regiões fisicoquimicamente distintas. As regiões formadas dessa forma incluem bolsos hidrofóbicos e hidrofílicos, e semelhantes.

[00112] Conforme usado no presente documento, o termo "volta", relacionado à conformação de proteína, significa uma curva que altera a direção da cadeia principal de um polipeptídeo e pode envolver um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido.

[00113] Conforme usado no presente documento, quando em referência aos polipeptídeos, o termo "laço"se refere a uma característica estrutural de um polipeptídeo que pode servir para reverter a direção da cadeia principal de um polipeptídeo. Onde o laço é encontrado em um polipeptídeo e somente altera a direção da cadeia principal, o mesmo pode compreender quatro ou mais resíduos de aminoácido. Oliva et al. identificaram pelo menos 5 classes de laços de proteína (Oliva, B. et al., J Mol Biol. 7 de março de 1997;266(4):814-30; cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência). Os laços podem ser abertos ou fechados. Laços fechados ou laços "cíclicos"podem ser formados quando dois aminoá- cidos estiverem conectados por uma porção química em ponte. O laço cíclico compreende os aminoácidos ao longo do polipeptídeo presente entre os aminoácidos em ponte. Os laços cíclicos podem compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos.

[00114] Conforme usado no presente documento, quando em referência aos polipeptídeos, o termo "meio-laço"se refere a uma porção de um laço identificado que tem pelo menos metade da quantidade de resíduos de aminoácido como o laço a partir do qual é derivado. Compreende-se que os laços podem nem sempre conter uma quantidade igual de resíduos de aminoácido. Portanto, nesses casos em que um laço contém ou é identificado para compreender um número ímpar de aminoácidos, um meio-laço do laço com número ímpar compreenderá a porção de número inteiro ou a porção de número inteiro seguinte do laço (quantidade de aminoácidos do laço/2+/-0,5 aminoácidos). Por exemplo, um laço identificado como um laço de 7 aminoácidos pode produzir meio-laços de 3 aminoácidos ou 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 igual a 3 ou 4).

[00115] Conforme usado no presente documento, quando em referência às proteínas, o termo "região"se refere a uma zona ou área geral. Em algumas modalidades, quando em referência a uma proteína, uma região pode compreender uma sequência linear de aminoácidos ao longo da proteína ou pode compreender uma estrutura secundária ou terciária específica e/ou uma ou mais características ou domínios de proteína.

[00116] Conforme usado no presente documento, o termo "domínio", quando em referência às proteínas, se refere a um motivo de um polipeptídeo que tem uma ou mais características funcionais ou estru-turaisidentificáveis (tais como estruturas secundárias ou terciárias) ou propriedades (por exemplo, capacidade de ligação, que serve como um sítio para interações proteína-proteína).

[00117] Conforme usado no presente documento, o termo "meio- domínio", quando em referência às proteínas, se refere a uma porção de um domínio identificado que tem pelo menos metade da quantidade de resíduos de aminoácido como o domínio a partir do qual é derivado. Compreende-se que os domínios podem nem sempre conter uma quantidade igual de resíduos de aminoácido. Portanto, nesses casos em que um domínio contém ou é identificado para compreender um número ímpar de aminoácidos, um meio-domínio do domínio com númeroímpar compreenderá a porção de número inteiro ou a porção de número inteiro seguinte do domínio (quantidade de aminoácidos do domínio/2+/-0,5 aminoácidos). Por exemplo, um domínio identificado como um domínio de 7 aminoácidos pode produzir meio-domínios de 3 aminoácidos ou 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 igual a 3 ou 4). Compre-ende-se,também, que subdomínios podem ser identificados dentro de domínios ou meio-domínios, sendo que esses subdomínios processam menos do que todas as propriedades estruturais ou funcionais identifi-cadas nos domínios ou meio-domínios a partir dos quais foram derivados. Compreende-se, também, que os aminoácidos que compreendem qualquer um dos tipos de domínio no presente documento não precisa ser contíguo ao longo da cadeia principal do polipeptídeo (isto é, ami- noácidos não adjacentes podem se dobrar estruturalmente para produzir um domínio, meios-domínio ou subdomínio).

[00118] Conforme usado no presente documento, quando em referência aos polipeptídeos, o termo "sítio", no que diz respeito a modalidades com base em aminoácido, é usado de modo sinônimo ao "resíduo de aminoácido"e "cadeia lateral de aminoácido". Um sítio representa uma posição dentro de um polipeptídeo que pode ser modificada, manipulada, alterada, derivada ou variada dentro das moléculas com base em polipeptídeo da presente invenção.

[00119] Conforme usado no presente documento, os termos "terminais" ou "terminal", quando em referência aos polipeptídeos, se referem a uma extremidade de um polipeptídeo. Tal extremidade não é limitada somente ao primeiro sítio ou ao sítio final do polipeptídeo, mas pode incluir aminoácidos adicionais nas regiões terminais. As moléculas com base em polipeptídeo da presente invenção podem ser distinguidas como tendo tanto um N-terminal quanto um C-terminal. Os po- lipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção são, em alguns casos, constituídos de múltiplas cadeias de polipeptí- deo reunidas por ligações dissulfeto ou por forças não covalentes (multímetros, oligômeros). Esses tipos de proteínas terão múltiplos Ne C-terminais. Alternativamente, os terminais dos polipeptídeos podem ser modificados de modo que comecem ou terminem, conforme o caso, com uma porção química sem base em polipeptídeo tal como um conjugado orgânico.

[00120] Em uma modalidade, os polipeptídeos da presente invenção podem incluir uma região terminal. Conforme usado no presente documento, "região terminal"é uma região terminal de aminoácidos que pode incluir uma cisteína. A região terminal pode ser uma região N- e/ou a C-terminal. Em algumas modalidades, as regiões terminais podem ser conectadas aos polipeptídeos parentes com o uso de uma porção química em ponte. Conforme usado no presente documento, "polipeptídeo parente" se refere à parte do polipeptídeo que não inclui a região terminal. A região terminal pode ser separada do polipeptídeo parente por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos. Os resíduos adicionados podem ser selecionados dentre, mas sem limitação, qualqueraminoácido natural ou não natural, a forma N-metilada de qualqueraminoácido natural ou não natural, o D-estereoisômero de qualqueraminoácido natural ou não natural, norvalina, terc-butilglicina, fe- nilglicina, azatriptofano, 7-azatriptofano, 4-fluorofenilalanina, penicila- mina, sarcosina, homocisteína, ácido 1-aminociclopropano carboxílico, ácido 1-aminociclobutano carboxílico, ácido 1-aminociclopentano car- boxílico, ácido 1-aminociclohexano carboxílico, ácido 4- aminotetrahidro-2H-pirano-4-carboxílico, ácido aminoisobutírico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclopentilglicina, ciclohexi- lglicina, ciclopropilglicina, n-w-metil-arginina, 4-clorofenilalanina, 3- clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptofano, 5-clorotriptofano, citru- lina, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil- fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleucina, ácido tranexâmico, ácido 2-amino pentanoico, ácido 2-amino hexanoico, ácido 2-amino heptanoico, ácido 2-amino octanoico, ácido 2-amino nona- noico, ácido 2-amino decanoico, ácido 2-amino undecanoico, ácido 2- amino dodecanoico, ácido aminovalérico e ácido 2-(2- aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi azetidina, hexafluoro- leucina, 3-Fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3- fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil- fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino- 5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4- (aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3- (aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2- aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc- leucinol, (R)-3-metilbutano-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropano-1-amina e (S)-N,2-dimetil-1-(piridina-2-il)propano-1-amina, ácido (S)-2-amino-3- (oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2- amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5- fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico e ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3- il)propanoico.

[00121] Os aminoácidos não naturais adicionais que são úteis na otimização de polipeptídeos da invenção incluem, mas sem limitação, aminoácidos fluorados em que um ou mais átomos de hidrogênio ligados a carbono são substituídos por flúor. A quantidade de átomos de flúor incluída pode variar de 1 até e incluindo todos os átomos de hidrogênio. Exemplos de tais aminoácidos incluem, mas sem limitação, 3-fluoroprolina, 3,3-difluoroprolina, 4-fluoroprolina, 4,4-difluoroprolina, 3,4-difluoroprolina, 3,3,4,4-tetrafluoroprolina, 4-fluorotriptofano, 6- fluorotriptofano, 7-fluorotriptofano e estereoisômeros dos mesmos.

[00122] Aminoácidos não naturais adicionais que são úteis na otimização de polipeptídeos da invenção incluem, mas sem limitação, aqueles que são dissubstituídos no a-carbono. Esses incluem aminoá- cidos em que os dois substituintes no a-carbono são iguais, por exemplo,ácido a-amino isobutírico e ácido 2-amino-2-etil butanoico, assim como aqueles em que os substituintes são diferentes, por exemplo, a- metilfenilglicina e a-metilprolina. Adicionalmente, os substituintes no a- carbono podem ser tomados em conjunto para formar um anel, por exemplo, ácido 1-aminociclopentano carboxílico, ácido 1- aminociclo- butano carboxílico, ácido 1-aminociclohexano carboxílico, ácido 3- aminotetrahidrofuran-3-ácido carboxílico, ácido 3- aminotetrahidropirano-3-carboxílico, ácido 4-aminotetrahidropirano-4- carboxílico, ácido 3-aminopirrolidina-3-carboxílico, ácido 3- aminopiperidina-3-carboxílico, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico e estereoisômeros dos mesmos.

[00123] Os aminoácidos não naturais adicionais que são úteis na otimização de polipeptídeos da invenção incluem, mas sem limitação, análogos de triptofano em que o sistema de anel indol é substituído por outro sistema de anel bicíclico com 9 ou 10 membros que compreende 0, 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre N, O ou S. Cada sistema de anel pode ser saturado, parcialmente insaturado ou totalmente insaturado. O sistema de anel pode ser substituído por 0, 1, 2, 3 ou 4 substituintes em qualquer átomo substituível. Cada substituinte é independentemente selecionado dentre H, F, Cl, Br, CN, oxo, COOR, CONRR’, OR, NRR’. Cada R e R’ é independentemente selecionado dentre H, C1-C20 alquil, C1-C20 al- quil-O-Cl-20 alquil.

[00124] Em algumas modalidades, análogos de triptofano (também denominado no presente documento como "análogos triptofano") que são úteis na otimização de polipeptídeos da invenção incluem, mas sem limitação, 5-fluorotriptofano [(5-F)W], 5-metil-O-triptofano [(5- MeO)W], 1-metiltriptofano [(1-Me-W) ou (1-Me)W], D-triptofano (D-Trp), azatriptofano (que inclui, mas sem limitação, 4-azatriptofano, 7- azatriptofano e 5-azatriptofano), 5-clorotriptofano, 4-fluorotriptofano, 6- fluorotriptofano, 7-fluorotriptofano e estereoisômeros dos mesmos. Ex- ceto onde indicado ao contrário, o termo "azatriptofano" e sua abreviação, "azaTrp", conforme usado no presente documento, se refere ao 7- azatriptofano.

[00125] Em uma modalidade, os polipeptídeos da presente invenção podem incluir uma modificação de terminal nos N- ou C-terminais com a adição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos e/ou uma cisteína na região terminal. Os resíduos adicionados podem ser selecionados dentre, mas sem limitação, qualquer aminoácido natural ou não natural, a forma N-metilada de qualquer aminoácido natural ou não natural, o D-estereoisômero de qualquer aminoácido, norvalina, terc-butilglicina, fenilglicina, azatriptofano, 7-azatriptofano, 4- fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homocisteína, ácido 1- aminociclopropano carboxílico, ácido 1-aminociclobutano carboxílico, ácido 1-aminociclopentano carboxílico, ácido 1-aminociclohexano car- boxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-pirano-4-carboxílico, ácido ami- noisobutérico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclo- pentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, n-^-metil-arginina, 4- clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptofano, 5- clorotriptofano, citrulina, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4- aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleu- cina, ácido tranexâmico, ácido 2-amino pentanoico, ácido 2-amino he- xanoico, ácido 2-amino heptanoico, ácido 2-amino octanoico, ácido 2- amino nonanoico, ácido 2-amino decanoico, ácido 2-amino undecanoi- co, ácido 2-amino dodecanoico, ácido aminovalérico e ácido 2-(2- aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi azetidina, hexafluoro- leucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3- fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil- fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino- 5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4- (aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3- (aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2- aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc- leucinol, (R)-3-metilbutano-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropano-1-amina e (S)-N,2-dimetil-1-(piridina-2-il)propano-1-amina, ácido (S)-2-amino-3- (oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2- amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5- fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico e ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3- il)propanoico.

[00126] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser conjugados com um polipeptídeo que aumenta ou diminui a ligação de proteí-naplasmática que inclui, mas sem limitação, os descritos em Dennis, M.S. et al., Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem. 20 de setembro de 2002; 277(38):35035-43; Nguyen, A. et al., os farmacocinéticos de um Fab de ligação de albumina (AB Fab) podem ser modulados como uma função de afinidade para albumina. Protein Eng Des Sel. Julho de 2006;19(7):291-7 e Langerheim, J.F. et al., Improving the pharmacoki- netics/pharmacodynamics of prolactin, GH, and their antagonists by fusion to a synthetic albumin-binding polypeptide. J Endocrinol. Dezembro de 2009;203(3):375-87. Em algumas modalidades, tais poli- peptídeos se ligam à albumina sérica (denominados no presente documento como "polipeptídeos de ligação de albumina"). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de ligação de albumina são ciclizados por formação de ligação dissulfeto entre resíduos de cisteína presentes em suas sequências de polipeptídeos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de ligação de albumina são conjugados por suas extremidades N ou C-terminais. Em algumas modalidades, a conjugação com um polipeptídeo de ligação de albumina modula a quantidade de tempo que um polipeptídeo da presente invenção permanece intacto em um indivíduo. Em uma modalidade preferencial, a conjugação com um polipeptídeo de ligação de albumina aumenta a quantidade de tempo que um polipeptídeo da presente invenção permanece no sangue de um indivíduo. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser conjugados com polipeptídeos que têm propriedade de penetração de célula (denominados no presente documento como "polipeptídeos de penetração celular") que incluem, mas sem limitação, as reveladas em Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today. Agosto de 2012;17(15-16):850-60. Po- lipeptídeos de penetração celular adicionais são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser conjugados com qualquer um dos conjugados de polipeptí- deo ensinados, por exemplo, nas publicações de patente no US20110172126 ou no US20030040472, o conteúdo das quais está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser conjugados com uma molécula lipofílica que aumenta a ligação de proteína plas- mática, tal como os substituintes lipofílicos ensinados, por exemplo, na Patente no US 6.268.343 ou na Publicação no US US2013/0053311, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00127] Uma vez que qualquer uma das características tenha sido identificada ou definida como um componente desejado de um poli- peptídeo, qualquer uma dentre diversas manipulações e/ou modificações dessas características pode ser realizada por movimento, troca, inversão, deleção, randomização ou duplicação. Além disso, compreende-se que a manipulação de características pode resultar na mesma conclusão que uma modificação nas moléculas da invenção. Por exemplo, uma manipulação que envolveu a deleção de um domínio resultaria na alteração do comprimento de uma molécula tal como a modificação de um ácido nucleico para criptar menos do que uma mo-lécula de comprimento total resultaria.

[00128] As modificações e manipulações podem ser realizadas por métodos conhecidos na técnica, tais como, mas sem limitação, muta- gênese direcionada ao sítio. As moléculas modificadas resultantes po-dem,então, ser testadas para atividade com o uso de ensaios in vitro ou in vivo, tais como os descritos no presente documento ou qualquer outro ensaio de triagem adequados conhecido na técnica.

[00129] De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos podem compreender uma sequência de consenso que é constatada através de séries de experimento. Conforme usado no presente documento, uma sequência de "consenso"é uma sequência única que representa uma população coletiva de sequências que permitem variabilidade em um ou mais sítios.

[00130] O termo "identidade", conforme conhecido na técnica, se refere a uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptí- deos, conforme determinados por comparação das sequências. Na técnica, a identidade também significa o grau de relação de sequência entre polipeptídeos, conforme determinado pela quantidade de correspondências entre cadeias de dois ou mais resíduos de aminoácido. A identidade mede a porcentagem de correspondências idênticas entre as menores entre duas ou mais sequências com alinhamentos de lacuna (caso haja) abordadas por um modelo matemático particular ou programa de computador (isto é, "algoritmos"). A identidade de poli- peptídeos relacionados pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas sem limitação, os descritos anteriormente por outros (Lesk, A. M., ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nova York, EUA, 1988; Smith, D. W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, Nova York, EUA, 1993; Griffin, A. M. et al., ed., Computer Analysis of Sequence Data, parte 1, Human Press, Nova Jersey, EUA, 1994; von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, 1987; Gribskov, M. et al., ed., Sequence Analysis Primer, M. Stockton Press, Nova York, EUA, 1991; e Carillo et al., Applied Math, SIAM J, 1988, 48, 1073).

[00131] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo pode ter atividade igual ou similar ao polipeptídeo de referência. Alternativamente, uma variante pode ter uma atividade alterada (por exemplo, aumentada ou diminuída) em relação a um polipeptídeo de referência. Em geral, as variantes de um polipeptídeo particular da invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, mas menos do que 100% de identidade de sequência de um polipeptídeo de referência particular, conforme determinado por parâmetros e programas de alinhamento de sequência descritos no presente documento e conhecido pelos versados na técnica. Tais ferramentas para alinhamento incluem aquelas do conjunto BLAST (Al- tschul, S.F. et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 1997, 25:3.389-3.402). Outras ferramentas são descritas no presente documento, especificamente na definição de "identidade".

[00132] Parâmetros padrão no algoritmo BLAST incluem, por exemplo, um limiar esperado de 10, Tamanho de palavra de 28, Contagem de Correspondência/Disparidade 1, -2, Custos de lacuna, Linear. Qualquer filtro pode ser aplicado assim como uma seleção para repetições de espécie específica, por exemplo, Homo sapiens. Abreviações usadas em polipeptídeos

[00133] Conforme usado no presente documento, as abreviações têm os seguintes significados: "Ac" e "NH2" indicam terminais acetila e amidada, respectivamente; "Nvl" representa norvalina; "Phg" represen- ta fenilglicina; "Tbg" representa terc-butilglicina; "Chg" representa ci- clohexilglicina; "(N-Me)X" representa a forma N-metilada do aminoáci- do indicado pelo código de aminoácido de letra ou três letras no lugar da variável "X" escrito como N-metil-X [por exemplo, (N-Me)A ou (N- Me)Ala representam a forma N-metilada de alanina ou N-metil- alanina]; "azaTrp" representa azatriptofano; "(4-F)Phe" representa 4- fluorofenilalanina; "Tyr(OMe)" representa O-metil tirosina, "Aib"representaácido amino isobutírico; "(homo)F" ou "(homo)Phe" representam homofenilalanina; "(2-OMe)Phg" se refere a 2-O-metilfenilglicina; "(5- F)W" se refere a 5-fluorotriptofano; "D-X" se refere ao D- estereoisômero do dado aminoácido "X" [por exemplo, (D-Chg) representa D-ciclohexilglicina]; "(5-MeO)W" se refere a 5-metil-O-triptofano; "homoC" se refere à homocisteína; "(1-Me-W)" ou "(1-Me)W" se referem a 1-metiltriptofano; "Nle" se refere à norleucina; "Tiq" se refere a um resíduo de tetrahidroisoquinolina; "Asp(T)" se refere ao ácido (S)-2- amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico; "(3-Cl-Phe)" se refere a 3- clorofenilalanina; "[(N-Me-4-F)Phe]""(N-Me-4-F)Phe" se referem a N- metil-4-fluorofenilalanina; "(m-Cl-homo)Phe" se refere a meta-cloro homofenilalanina; "(des-amino)C" se refere ao ácido 3-tiopropiônico; "(alfa-metil)D" se refere ao ácido alfa-metil L-aspártico; "2Nal" se refere a 2-naftilalanina; "(3-aminometil)Phe" se refere a 3-aminometil-L- fenialanina; "Cle" se refere à cicloleucina; "Ac-pirano" se refere ao ácido4-amino-tetrahidro-pirano-4-carboxílico; "(Lys-C16)" se refere à N-e- palmitoil lisina; "(Lys-C12)" se refere à N-e-lauril lisina; "(Lys-C10)" se refere à N-e-capril lisina; "(Lys-C8)" se refere à N-e-caprilico lisina; "[xXilila(y, z)]" se refere à porção química em ponte xilila entre dois tióis que contêm aminoácidos, em que x pode ser m, p ou o para indicar o uso de meta, para ou ortodibromoxilenos (respectivamente) para gerar porções químicas em ponte e os identificadores numéricos, y e z, estão na posição de aminoácido dentro do polipeptídeo dos aminoá- cidos que participam da ciclização; "[ciclo(y,z)]" se refere à formação de uma ligação entre dois resíduos de aminoácido em que os identifi-cadoresnuméricos, y e z, estão na posição dos resíduos que participam da ligação; "[ciclo-olefinil(y,z)]" se refere à formação de uma ligação entre dois resíduos de aminoácido por metátese de olefina em que os identificadores numéricos, y e z, estão na posição dos resíduos que participam da ligação; "[ciclo-tioalquil(y,z)]" se refere à formação de uma ligação tioéter entre dois resíduos de aminoácido em que os iden-tificadoresnuméricos, y e z, estão na posição dos resíduos que participam da ligação; "[ciclo-triazolil(y,z)]" se refere à formação de um anel triazol entre dois resíduos de aminoácido em que os identificadores numéricos, y e z, estão na posição dos resíduos que participam da ligação. "B20" se refere a N<-(PEG2-Y-ácido glutâmico-N-a-ácido octa- decanodioico)lisina [também conhecido como ácido (1S,28S)-1-amino- 7,16,25,30-tetraoxo-9,12,18,21-tetraoxa-6,15,24,29- tetraazahexatetracontano-1,28,46-tricarboxílico]. "K14" se refere a N-e-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)-3- metilbutil-L-lisina. Todos os outros símbolos se referem ao código padrão de aminoácido de uma letra.

Anticorpos

[00134] Em algumas modalidades, os compostos e/ou composições da presente invenção podem compreender anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo"é mencionado no sentido mais amplo e cobre especificamente várias modalidades que incluem, mas sem limitação, anticorpos mono- clonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos formados de pelo menos dois anticorpos intactos), e fragmentos de anticorpo, tais como diacorpos desde que exibam uma atividade biológica desejada. Os anticorpos da presente invenção também podem compreender anticorpos humano ou anticorpos humanizados. Os anticorpos são principalmente moléculas com base em aminoácidos, mas também podem compreender uma ou mais modificações (incluindo, mas sem limitação, a adição de porções quí-micas de açúcar, porções químicas fluorescentes, etiquetas químicas, etc.)

[00135] Conforme usado no presente documento, o termo "fragmento de anticorpo" se refere a qualquer porção de um anticorpo intacto. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo compreendemregiões de ligação ao antígeno a partir de anticorpos intactos. Exemplos de fragmentos de anticorpo podem incluir, mas sem limitação, fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares;moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecí- ficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão de pa- paína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um sítio de ligação ao antígeno único. Também é produzido um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade para cristalizar prontamente. O tratamento de pepsina rende um fragmento F(ab’)2 que tem dois sítios de ligação ao antígeno e tem, ainda, capacidade de reticular o antíge- no. Os compostos e/ou composições da presente invenção podem compreender um ou mais desses fragmentos. Para os propósitos no presente documento, um "anticorpo" pode compreender um domínio variável entre pesado e leve assim como uma região Fc.

[00136] Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo nativo" se refere a uma glicoproteína normalmente heterotetraméri- ca de cerca de 150.000 daltons, composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, embora a quantidade de ligações dissulfeto varie entre as cadeias pesadas de isotipos de imunoglobulina diferentes. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por uma quantidade de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável de cadeia pesada.

[00137] Conforme usado no presente documento, o termo "domínio variável"se refere a domínios de anticorpo específicos que diferem extensivamente na sequência entre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Conforme usado no presente documento, o termo "Fv" se refere a fragmentos de anticorpo que compreendem reconhecimento de antígeno completo e sítios de ligação ao antígeno. Essas regiões consistem em um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação não covalente estreita

[00138] Conforme usado no presente documento, o termo "cadeia leve" se refere a um componente de um anticorpo de qualquer espécie vertebrada atribuído a um dentre dois tipos claramente distintos, cha-mados kappa e lambda com base em sequências de aminoácido de domínios constantes.

[00139] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser atribuídos a classes diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversas dessas podem ser divididas adicionalmente em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.

[00140] Conforme usado no presente documento, o termo "Fv de cadeia única"ou "scFv" se refere a uma proteína de fusão de domínios de anticorpo VH e VL, em que esses domínios são ligados em conjunto em uma cadeia de polipeptídeo única. Em algumas modalidades, o ligante de polipeptídeo Fv permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno.

[00141] Conforme usado no presente documento, o termo "diacor- po" se refere a um pequeno fragmento de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno. Os diacorpos compreendem um domínio variável de cadeia pesada VH conectado a um domínio variável de cadeia leve VL na mesma cadeia de polipeptídeo. Com o uso de um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois sítios de ligação ao antígeno. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, nos documentos no EP 404.097; no WO 93/11161; e Hollinger et al. (Hollinger, P. et al., "Diabodies": Small bivalent and bispecific antibody fragments. PNAS. 1993. 90:6444-8), em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00142] Conforme usado no presente documento, o termo "anticor- po monoclonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de células substancialmente homogêneas (ou clones), isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para variantes possíveis que podem surgir durante a produção dos anticorpos monoclonais, tais como variantes que geralmente estão presentes em quantidades menores. Em contrapartida às preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um determinante único no antígeno.

[00143] O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem anticorpos "quiméricos"(imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, em que o remanescente da cadeia (ou cadeias) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos.

[00144] Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo humanizado" se refere a um anticorpo quimérico que compreende uma porção mínima de uma ou mais fontes de anticorpo não humano (por exemplo, murino) com o restante derivado de uma ou mais fontes de imunoglobulina humana. Para a maior parte, anticorpos humanizadossão imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos da região hipervariável de um anticorpo do recipiente são substi- tuídos por resíduos da região hipervariável de um anticorpo de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho, primara não humano que tenha a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas.

[00145] Conforme usado no presente documento, o termo "região hipervariável"se refere às regiões dentro do domínio de ligação de an- tígeno de um anticorpo que compreende resíduos de aminoácido res-ponsáveis por ligação de antígeno. Os aminoácidos presentes dentro das regiões hipervariáveis determinam a estrutura da região de determinação complementar (CDR). Conforme usado no presente documento, o termo "CDR" se refere às regiões de anticorpos que compreendem uma estrutura que é complementar ao seu antígeno ou epítopo alvo.

[00146] Em algumas modalidades, os compostos e/ou composições da presente invenção podem ser ou compreender miméticos de anticorpo. Conforme usado no presente documento, o termo "mimético de anticorpo" se refere a qualquer molécula que imite a função ou efeito de um anticorpo e que se ligue especificamente e com alta afinidade a seus alvos moleculares. Em algumas modalidades, os miméticos de anticorpo podem ser monocorpos, projetados para incorporar o domínio de fibronectina de tipo III (Fn3) como uma armação de proteína (documentos no US 6.673.901 e no US 6.348.584, em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência). Em algumas modalidades, mimé- ticos de anticorpo podem incluir aqueles conhecidos na técnica, incluindo, mas sem limitação, moléculas affibody, affilins, affitins, anticalins, avimers, Centyrins, DARPINSTM, Fynomers, Adnectins e peptídeos de domínio Kunitz. Em outras modalidades, os miméticos de anticorpo podem incluir uma ou mais região não peptídica.

[00147] Conforme usado no presente documento, o termo "variante de anticorpo" se refere a uma biomolécula que se assemelha a um an-ticorpo em estrutura e/ou função que compreende algumas diferenças em sua sequência de aminoácidos, composição ou estrutura em comparação a um anticorpo nativo.

[00148] A preparação de anticorpos, monoclonais ou policlonais, é conhecida na técnica. As técnicas para a produção de anticorpos são bem conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 e Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

[00149] Em algumas modalidades, as sequências de polipeptídeos fornecidas no presente documento podem ser utilizadas na produção de um ou mais anticorpos. Em alguns casos, tais sequências de poli- peptídeos podem ser incorporadas em domínios variáveis de anticorpo. Tais domínios variáveis podem ser incorporados em anticorpos, miméticos de anticorpo ou variantes de anticorpo. Moléculas pequenas

[00150] Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção podem ser moléculas pequenas. Tais compostos podem compreender um tamanho de cerca de 100 a cerca de 2.000 Daltons (por exemplo, de cerca de 100 a cerca de 200, a cerca de 300, a cerca de 400, a cerca de 500, a cerca de 600, a cerca de 700, a cerca de 800, a cerca de 900, a cerca de 1.000, a cerca de 1.100, a cerca de 1.200, a cerca de 1.300, a cerca de 1.400, a cerca de 1.500, a cerca de 1.600, a cerca de 1.700, a cerca de 1.800, a cerca de 1.900 ou a cerca de 2.000 Daltons). As moléculas pequenas podem ser não peptídicas ou compartilhar algumas ou muitas características de polipeptídeos e po- lipeptídeos cíclicos, inclusive ligações amida, estruturas cíclicas e substituintes semelhantes a aminoácido. Aptâmeros

[00151] Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção podem compreender aptâmeros (Keefe, A.D., Pai, S. e Ellington, A. (2010). Nat. Rev. Drug Discovery 9:537-550). Conforme usado no presente documento, o termo "aptâmero"se refere às moléculas oligonucleicas ou polipeptídicas que têm capacidade para ligar moléculas-alvoespecíficas. Alguns aptâmeros podem adotar uma conformação tridimensional com capacidade para ligar tais moléculas-alvo com alta afinidade e especificidade.

Variações Isotópicas

[00152] Os polipeptídeos da presente invenção podem compreender um ou mais átomos que são isótopos. Conforme usado no presente documento, o termo "isótopo"se refere a um elemento químico que tem um ou mais nêutrons adicionais. Em uma modalidade, os polipep- tídeos da presente invenção podem ser deuterados. Conforme usado no presente documento, o termo "deuterado" se refere a uma substância que teve um ou mais átomos de hidrogênio substituídos por isótopos de deutério. Os isótopos de deutério são isótopos de hidrogênio. O núcleo de hidrogênio contém um próton enquanto núcleos de deutério contêm tanto um próton quanto um nêutron. Os compostos e composições farmacêuticas da presente invenção podem ser deuterados a fim de alterar uma propriedade física, tal como estabilidade, ou para permitir que os mesmos sejam usados em aplicações de diagnóstico e experimentais.

Formulação e entrega

[00153] O termo "composição farmacêutica"se refere a uma composição que compreende pelo menos um ingrediente ativo (por exemplo, tal como um polipeptídeo) em uma forma e quantidade que permitam que o ingrediente ativo seja terapeuticamente eficaz.

[00154] As formulações de polipeptídeo da presente invenção in-cluemformulações de liberação duodenal controladas, formulações de liberação de tempo, sistemas de entrega de liberação controlada os- mótica, microemulsões, microesferas, lipossomas, nanopartículas, emplastos, bombas, depósitos de fármaco e semelhantes. Formas sólidas de dosagem oral, tais como pós, géis suaves, cápsulas de gel, cápsulas, pílulas e comprimidos, estão especificamente incluídas na presente invenção.

[00155] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer rota que resulte em um resultado terapeuticamente eficaz. Essas incluem, mas sem limitação, entérica, gastroentérica, epidural, oral, peridural, intracerebral (no cérebro), in- tratraqueal (nas vias aéreas para entrega aos pulmões), intracerebro- ventricular (nos ventrículos cerebrais), epicutânea (aplicação na pele), intradérmica, (na própria pele), subcutânea (sob a pele), administração nasal (através do nariz), intravenosa (em uma veia), intra-arterial (em uma artéria), intramuscular (em um músculo), intracardíaca (no coração), infusão intraóssea (na medula óssea), intratecal (no canal espinhal), intraperitoneal, (infusão ou injeção no peritônio), infusão intravesical, intravítrea, (na câmara posterior do olho), injeção intracavernosa, (na base do pênis), administração intravaginal, intrauterina, administração extra-amniótica, transdérmica (difusão através da pele intacta para distribuição sistêmica), transmucosa (difusão através de uma membrana mucosa), insuflação (cheirar), bucal, sublingual, sublabial, enema, gotas em olho (na conjuntiva) ou gostas em ouvido.

[00156] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são formulados em uma solução estéril aquosa. Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são formulados em uma formulação lipídica ou não lipídica. Em outra modalidade, os polipeptídeos da presente invenção são formulados em uma formulação lipídica catiônica ou não catiônica. Em qualquer modalidade, a solução estéril aquosa pode conter componentes ativos ou inativos adici- onais. Os componentes inativos, também denominados no presente documento como "excipientes", podem incluir, mas sem limitação, sais fisiologicamente compatíveis, açúcares, agentes dilatadores, tensoati- vos ou tampões.

[00157] Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem compreender, ou ser formulados ou entregues em conjunto com um ou mais agentes carreadores. Conforme usado no presente documento, o termo "carreador" se refere a uma substância que auxilia na entrega ou aprimora a eficácia dos polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção. O agente carreador pode ser uma substância de ocorrência natural, tal como uma proteína (por exemplo, albumina sérica humana (HSA), lipoprote- ína de baixa densidade (LDL) ou globulina); carboidrato (por exemplo, um dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina ou ácidohialurônico); ou lipídico. A molécula carreadora também pode ser um recombinante ou uma molécula sintética, tal como um polímero sintético, por exemplo, um poliaminoácido sintético. Exemplos de poli- aminoácidos incluem poli-L-lisina (PLL), ácido poli-L-aspártico e ácido poli-L-glutâmico, assim como polímeros que compreendem os D- estereoisômeros desses aminoácidos. Outros carreadores incluem co- polímero de poli(L-lactida-co-glicolida), polietileno glicol (PEG), álcool polivinílico (PVA), poli(ácido 2-etilacrílico) e polímeros de N- isopropilacrilamida. Outras moléculas carreadoras úteis podem ser identificadas por métodos de rotina.

[00158] Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção podem ser combinados com um ou mais excipientes farmaceu- ticamente aceitáveis para formar uma composição farmacêutica. Conforme usado no presente documento, o termo "farmaceuticamente aceitável"se refere àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de bom julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de seres hu-manos e animais sem excesso de toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação proporcional a uma razão ris- co/benefício razoável. A frase "excipiente farmaceuticamente aceitável", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer ingrediente diferente dos compostos inventivos descritos no presente documento (por exemplo, um veículo com capacidade para suspender ou dissolver um composto ativo) e que tem as propriedades de ser substancialmente não tóxico e não inflamatório em um paciente. Os excipientes podem incluir, por exemplo: antiaderentes, antioxidantes, aglutinantes, revestimentos, auxiliares de compressão, desintegrado- res, corantes (cores), emolientes, emulsificantes, cargas (diluentes), formadores de película ou revestimentos, aromatizantes, fragrâncias, deslizantes (intensificadores de fluxo), lubrificantes, conservantes, tintas de impressão, sorventes, agentes de suspensão ou dispersão, edulcorantes e águas de hidratação. Excipientes exemplificativos incluem, mas sem limitação: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de cálcio, fosfato de cálcio (dibásico), estearato de cálcio, croscarmelose, polivil pirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etil- celulose, gelatina, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, lactose, estearato de magnésio, maltitol, manitol, metionina, metilcelu- lose, metil parabeno, celulose microcristalina, polietileno glicol, polivinil pirrolidona, povidona, amido pré-gelatinizado, propil parabeno, palmita- to de retinila, goma laca, dióxido de silício, carboximetilcelulose sódica, citrato de sódio, glicolato de amido de sódio, sorbitol, amido (milho), ácido esteárico, sacarose, talco, dióxido de titânio, vitamina A, vitamina E, vitamina C e xilitol. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um ou mais ingredientes polipeptídicos ativos juntos com etanol, mono-di-triglicerídeos de óleo de milho, óleo de rícino hidrogenado, DL-tocoferol, propileno glicol, gelatina, glicerol, pigmentos, aromatizantes e edulcorantes.

[00159] Em outras modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um ou mais ingredientes polipeptídicos ativos juntos com um agente de entrega, tal como ácido 4-(2-hidroxi-4- metoxibenzamido)butanoico (ou qualquer um dos agentes de entrega descritos na Patente no US 7.744.910B2, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência), um tampão farmaceuticamente aceitável, um desintegrante, um detergente, hidroxipropilmetilcelulose, pigmentos, aromatizantes e edulco- rantes.

[00160] Em outras modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um ou mais ingredientes polipeptídicos ativos juntos com etanol, fosfatidilcolina de soja, diolato de glicerol que é injetado em um excesso de solução salina conforme descrito no pedido de patenteno US 2008/0146490A1, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00161] A entrega de um ou mais polipeptídeos a um indivíduo que precisa dos mesmos pode ser alcançada de diversas formas diferentes. A entrega in vivo pode ser realizada diretamente, administrando- se uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos, para um indivíduo. Alternativamente, a entrega pode ser realizada indiretamente, administrando-se um ou mais vetores que criptam e direcionam a expressão dos polipeptídeos.

[00162] A entrega local evita a permeabilidade intestinal e a exposição sistêmica. Por exemplo, polipeptídeos e/ou composições de poli- peptídeo da presente invenção podem ser usados no olho como uma gota ou na seção posterior do olho por injeção direta. Os mesmos podem ser aplicados no intestino às enzimas-alvo. Os mesmos podem ser usados topicamente em aplicações dermatológicas (por exemplo, cremes, pomadas, emplastos transdérmicos).

[00163] Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem compreender ou ser formulados com um ou mais agentes fusogênicos. Conforme usado no presente documento, o termo "agente fusogênico"se refere a um agente que é responsivo a alterações, tais como alterações de pH no ambiente, por exemplo. Ao encontrar o pH de um endossoma, um agente fusogênico pode provocar uma alteração física, por exemplo, uma alteração em propriedades osmóticas que perturba ou aumenta a permeabilidade da membrana de endossoma. Preferencialmente, o agente fusogênico altera a carga, por exemplo, se torna protonado, em pH inferior à faixa fisiológica. Por exemplo, o agente fusogênico pode ser tornar protonado em pH 4,5 a 6,5. Um agente fusogênico pode servir para liberar um polipeptídeo no citoplasma de uma célula após uma composição ter sido tomada, por exemplo, por meio de endocitose, pela célula, aumentando, assim, a concentração celular do polipeptídeo na célula.

[00164] Em algumas modalidades, os agentes fusogênicos podem ter uma porção química, por exemplo, um grupo amino, que, quando exposta a uma faixa de pH específica, sofrerá uma alteração, por exemplo, em carga, por exemplo, protonação. Alterações em carga de agentes fusogênicos pode disparar alterações, por exemplo, alterações osmóticas, em vesículas, por exemplo, vesículas endocíticas, por exemplo, endossomas. Por exemplo, o agente fusogênico, ao ser exposto ao ambiente de pH de um endossoma, provocará uma solubilidade ou alteração osmótica substancial o suficiente para aumentar a porosidade (preferencialmente, romper) da membrana endossômica.

[00165] Os agentes fusogênicos podem ser polímeros, preferencialmente cadeias poliamina, por exemplo, polietilenoimina (PEI). PEI pode ser linear, ramificada, sintética ou natural. PEI pode ser, por exemplo, PEI substituída por alquila, ou PEI substituída por lipídio.

[00166] Em outras modalidades, os agentes fusogênicos podem ser substâncias poliistidina, poliimidazol, polipiridina, polipropilenoimina, melitina ou poliacetal, por exemplo, poliacetais catiônicos. Em algumas modalidades, os agentes fusogênicos podem ter uma estrutura alfa helicoidal. Os agentes fusogênicos podem ser agentes perturbadores de membrana, por exemplo, melitina. Outros agentes fusogênicos adequados podem ser testados e identificados por um versado na técnica.

[00167] Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem compreender ou ser formulados com um ou mais agentes de condensação. Os agentes de condensação das composições descritas no presente documento podem interagir com (por exemplo, atrair, reter ou se ligar a) polipeptídeos e atuar para (a) condensar, por exemplo, reduzir o tamanho ou a carga de polipeptídeos e/ou (b) proteger polipeptídeos, por exemplo, proteger polipeptídeos contra degradação. Os agentes de condensação podem incluir uma porção química, por exemplo, uma porção química carregada, que pode interagir com polipeptídeos por interações iônicas. Os agentes de condensação são, preferencialmente, polímeros carregados, por exemplo, cadeias policatiônicas. Os agentes de condensação podem ser polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptí- deo-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrimérica, arginina, amidina, protamina, lipídio catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina, ou um peptídeo alfa helicoidal.

[00168] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção podem ser bipolipeptídeos cíclicos. Conforme usado no presente documento, o termo "bipolipeptídeo cíclico"se refere a um poli- peptídeo com dois laços. Como um exemplo não limitativo, inibidores de bipolipeptídeo cíclico de C5 podem ser produzidos em bibliotecas combinatórias. Os bipolipeptídeos cíclicos podem ter 2, 3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos por laço.

[00169] Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem ser fornecidos como pró-fármacos. Conforme usado no presente documento, o termo "pró-fármaco"se refere a um fármaco que é fornecido em uma forma inativa que se torna ativa em algum ponto após a administração. Em algumas modalidades em que polipeptídeos são administrados na forma de um pró-fármaco, aminoácidos críticos para atividade inibitória de polipeptídeo estão indisponíveis para interagir com o alvo devido a uma ligação química reversível, por exemplo, uma ligação éster. Mediante a administração, tais pró-fármacos podem ser submetidos à clivagem da ligação química reversível, por exemplo, através de hidrólise enzimática ou ácida no estômago, sangue e/ou células de um dado tecido-alvo.

Inibidores de C5

[00170] Alguns polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção inibem a ativação de complemento no nível de componente C5 do complemento, denominado no presente documento como "inibidores de C5". Alguns inibidores de C5 funcionam através de impedimento da clivagem de C5 para os produtos de clivagem C5a e C5b, tais inibidores são denominados no presente documento como "inibidores de clivagem de C5". Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção podem compreender inibir a clivagem de C5 em um sistema. Conforme usado no presente documento, um "sistema" se refere a um gripo de partes relacionadas que funcionam em conjunto. Tais sistemas incluem aqueles que compreendem C5, denominados no presente contexto como "sistemas de C5". Os sistemas de C5 podem incluir, mas sem limitação, soluções, matrizes, células, tecidos, órgãos e fluidos corporais (incluindo, mas sem limitação, sangue). Em alguns casos, sistemas de C5 podem ser sistemas celulares. Conforme usado no presente documento, o termo "sistema celular" se refere a um sistema que compreende uma ou mais células ou um ou mais componentes de produtos de uma célula. Em alguns casos, os sistemas de C5 podem incluir sistemas in vivo, sistemas in vitro e sistemas ex vivo. Os sistemas de C5 in vivo podem compreender ou estar com-preendidos em um indivíduo. Conforme usado no presente documento, o termo "indivíduo"se refere a qualquer organismo ao qual um composto, de acordo com a invenção, possa ser administrado, por exemplo, para propósitos experimentais, de diagnóstico, profiláticos e/ou terapêuticos. Típicos indivíduos incluem animais (por exemplo, mamíferos tais como camundongos, ratos, coelhos primatas não humanos e humanos).

[00171] Em alguns casos, os inibidores de C5 da invenção podem incluir qualquer um dos polipeptídeos listados na Tabela 1. Tabela 1. Compostos da invenção

[00172] Em sistemas de C5, C5 e outros componentes de sistema podem estar em solução ou podem ser fixos, tal como em uma cavidade de ensaio. Os sistemas de C5 podem compreender adicionalmente outros componentes de complemento, em alguns casos incluir todos os componentes necessários para formar o complexo de ataque à membrana (MAC.) Em alguns casos, os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da invenção podem ser usados para inibir a clivagem de C5 em um indivíduo humano. Tais polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo podem encontrar utilidade no tratamento de vários distúrbios relacionados ao complemento e/ou doenças, assim como afecções inflamatórias associadas. Certos inibidores de C5 são conhecidos na técnica e são ensinados nas Patentes no U.S. 7.348.401 e no U.S. 6.355.245; em que ambas são incorporadas ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00173] A clivagem de C5 rende os produtos proteolíticos C5a e C5b. O sítio de clivagem de C5 que é clivado para render esses produtos é denominado no presente documento como o sítio de clivagem de C5a-C5b. C5b contribui para a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) enquanto C5a estimula o sistema imunológico e a resposta inflamatória. Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção impedem a clivagem de C5 e, portanto, podem ser úteis no tratamento de inflamação através da inibição de eventos inflamatórios que incluem, mas sem limitação, quimiotaxia e ativação de células inflamatórias (por exemplo, macrófagos, mastócitos, neutrófilos e plaquetas), proliferação de células endoteliais e edema.

[00174] Muitos dos componentes do sistema de complemento, que incluem, mas sem limitação, C3, C4 e C5, são funcionalmente inertes em seu estado nativo até serem alvejados para clivagem em múltiplos componentes ativos. A clivagem de C3 ou C4 provoca uma alteração conformacional que expõe um domínio tioéster interno. Dentro do domínio, uma ligação tioéster interna entre cadeias laterais de resíduo de cisteína e glutamina é uma ligação quimicamente lábil que confere a capacidade de C3 e C4 de se ligar à superfície celular e/ou às moléculasbiológicas. A clivagem de C3 e C4 também fornece os componentes da C5 convertase, C3bC4bC2a ou (C3b)2Bb. (Law, S.K., et al. (1997). Protein Science. 6:263-274; van den Elsen, J.M.H., (2002). J. Mol. Biol. 322:1103-1115; em que o conteúdo de cada um dos mesmosestá incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência).

[00175] A estrutura de múltiplos domínios de C5 é similar ao C3 e C4. A C5 convertase cliva C5 nos componentes C5a e C5b. A clivagem de C5 provoca uma alteração conformacional que expões o domínio do tipo tioéster de C5, que desempenha um papel em C5 que se liga a C6, seguido por interações com C7 e C8 para formar o MAC ci- tolítico. As estruturas de domínio de C5 compreendem características reguladoras que são críticas para o processamento e a atividade a ju- sante de complemento. (Fredslund, F. et al. (2008). Nature. 9:753-760; Hadders, M.A. et al. (2012). Cell Reports. 1:200-207).

[00176] Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção podem se ligar a C5 e impedir a clivagem de C5 em produtos de clivagem C5a e C5b.

[00177] Recentemente, um novo paradigma para ativação de complemento foi proposto, com base na constatação de que trombina gera produtos de C5 anteriormente não identificados que suportam a via de ativação de complemento terminal (Krisinger, et al., (2014). Blood. 120(8):1717-1725).

[00178] A trombina atua na cascata de coagulação, um segundo processo com base em circulação através do qual organismos, em resposta à lesão, têm capacidade para limitar o sangramento, restaurar a integridade vascular e promover a cura. Subsequente ao dano de vaso, o fator de tecido é exposto à circulação, o que desencadeia uma cascata de reações proteolíticas que leva à geração da enzima trom- bina de coagulação central, que converte fibrinogênio em um coágulo de fibrina.

[00179] Historicamente, a via de ativação de complemento foi observada separadamente a partir da cascata de coagulação; entretanto, a interação desses dois sistemas é digna de nova consideração. A coagulaçãoe o complemento são ativados de modo coordenado de uma maneira espaçotemporal sobreposta em resposta aos estímulos fisio- patológicos comuns para manter a homeostase, e a doença emerge quando há ativação não verificada das respostas imunológicas e de coagulação inatas, conforme evidenciado, por exemplo, por ateroscle- rose, derrame, doença cardíaca coronariana, diabetes, lesão de es- quemia-reperfusão, trauma, hemoglobinúria paroxística noturna, degeneraçãomacular relacionada à idade e síndrome heomlítica-urêmica atípica. De fato, constatou-se que a introdução de inibidores de com- plemento trata simultaneamente perturbações inflamatórias e trombóti- cas associadas a alguns desses distúrbios.

[00180] Conforme observado acima, o sistema de complemento é ativado por meio de três vias principais, em que todas convergem com ativação proteolítica do componente C3 do complemento central. Sub-sequentemente, a formação de C5 convertases resulta em clivagem de C5 em arginina 751 (R751) para liberar um fragmento de C5a qui- miotático e anafilatóxico e gerar C5b. C5b é o fator iniciante para mon-tagem do complexo de ataque à membrana lítica dependente de C5b (MAC; também conhecido como C5b-9), responsável por destruir células e patógenos danificados.

[00181] Diversos enlaces moleculares entre complemento e coagu-laçãoforam identificados. Mais notavelmente no que foi descrito como uma nova via de ativação de complemento, constatou-se que a trom- bina tem capacidade para promover diretamente a ativação de complementoatravés da clivagem de C5, presumivelmente em R751, liberando, assim, C5a a ausência de C3 (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med. 12(6):682-687). Entretanto, esses estudos não compararam trombina com a C5 convertase genuína, e somente análises bioquímicas limitadas foram realizadas; assim, a relevância fisiológica da via não foi avaliada.

[00182] Com o uso de sistemas purificados e com base em plasma, os efeitos de trombina e C5 convertase em C5 foram avaliados medindo-se a liberação de anafilatoxina C5a e a geração do componente de MAC C5b. Constatou-se que, embora a trombina tenha clivado C5 pobremente em R751, o que rendeu C5a e C5b mínimos, a mesma clivou C5 de modo eficaz em um sítio altamente conservado recentemente identificado R947, gerando os intermediários não descritos anteriormente C5T e C5bT. A coagulação induzida por fator de tecido de plasma levou à proteólise de C5 em um sítio sensível à trombina que correspondem a esse novo sítio R947 e não a R751. O tratamento combinado de C5 com trombina e C5 convertase rendeu C5a e C5bT, sendo que o último formou um complexo de ataque à membrana C5bT-9 com atividade lítica significativamente mais do que com C5b-9. Assim, um novo paradigma foi proposto para ativação de complemento, em que a trombina é um parceiro invariante e crítico com C5 con- vertase em formação iniciante de um MAC mais ativo por meio de formação de produtos de C5 anteriormente não identificados que são gerados por meio de proteólise cooperativa através das duas enzimas. Essas constatações fornecerem novas percepções sobre a regulação de imunidade inata no contexto de ativação de coagulação que ocorre em muitas doenças. (Krisinger, et al., (2014). Blood. 120(8):1717- 1725).

[00183] Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da invenção podem inibir a ativação de complemento induzida por trombina. Tais polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo podem, portanto, ser usados para tratar a hemólise que resulta da ativação de complemento induzida por trombina.

[00184] Dadas as constatações de enlaces moleculares entre as vias de complemento e coagulação, acredita-se que o complemento pode ser ativado por componentes adicionais das cascatas de coagulaçãoe/ou inflamação. Por exemplo, outras serina proteases com especificidade de substrato levemente diferente podem atuar de uma forma similar. Huber-Lang et al. (2006) mostraram que a trombina não só clivou C5, mas também C3a gerado in vitro quando incubado com C3 nativo (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med. 12(6):682-687; cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência). De modo similar, constatou-se que outros componentes da via de coagulação, tais como FXa, FXIa e plasmina, clivam tanto C5 quanto C3.

[00185] Especificamente, em um mecanismo similar ao observado por meio de ativação de trombina, observou-se que plasmina, FXa, FIXa e FXIa têm capacidade para clivar C5 para gerar C5a e C5b (Amara, et al., (2010). J. Immunol. 185:5628-5636; Amara, et al., (2008) "Interaction Between the Coagulation and Complement System" em Current Topics in Complement II, J.D. Lambris (ed.), páginas 7179). Constatou-se que as anafilatoxinas produzidas são biologicamente ativas, conforme mostrado por uma resposta quimiotática dependente de dose de neutrófilos e células HMC-1, respectivamente. A atividade de clivagem induzida por plasmina pode ser bloqueada dependentemente de dose pelo inibidor de serina protease, aprotinina e leu- peptina. Essas constatações sugerem que várias serina proteases que pertencem ao sistema de coagulação têm capacidade para ativar a cascata de complemento independentemente das vias estabelecidas. Além disso, C5a e C3a funcionais são gerados (conforme detectado por imunoblotting e ELISA), ambos conhecidos como sendo crucialmente envolvidos na resposta inflamatória.

[00186] Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou polipeptí- deos composições da invenção podem inibir a ativação de C5 por plasmina, FXa, FIXa, FXIa e outras proteases da via de coagulação.

[00187] Há muito se sabe que a elastase de leucócitos humanos (HLE), uma enzima secretada por neutrófilos e macrófagos durante processos inflamatórios também liberar a partir de C5, um fragmento quimiotático semelhante a C5. Entretanto, esse fragmento semelhante a C5a não é idêntico ao C5a, visto que HLE não cliva ligações peptídi- cas no sítio de clivagem que normalmente cliva C5 em C5a e C5b após a exposição às convertases de complemento. Em vez disso, também constatou-se que a clivagem de complemento C5 por HLE também constatou gera uma molécula semelhante a C5b funcionalmente ativa que tem capacidade para participar da formação de MAC (Vogt, (1999). Immunobiology. 201:470-477).

[00188] Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou polipeptí- deos composições da invenção podem inibir a ativação de C5 por HLE e outras proteases da cascata de inflamação.

[00189] Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, distúrbios e/ou condições em que a clivagem de C5 leva à progressão da doença, distúrbio e/ou afecção. Tais doenças, distúrbios e/ou afecções podem incluir, mas sem limitação, doenças, distúrbios e/ou condições imunes e autoimunes, neurológicas, cardiovasculares, pulmonares e oculares. As doenças e/ou distúrbios imunes e autoimunes podem incluir, mas sem limitação Encefalomielite Disseminada Aguda (ADEM), Leucoencefalite hemorrágica aguda necro- sante, doença de Addison, Agamaglobulinemia, Alopecia areata, Ami- loidose, Espondilite anquilosante, Rejeição aguda mediada por anticorpoapós transplante de órgãos, Nefrite Anti-GBM/Anti-TBM, Sín- drome Antifosfolipídica (APS), Angioedema autoimune, Anemia aplás- tica autoimune, Disautonia autoimune, Hepatite autoimune, Hiperlipi- demia autoimune, Imunodeficiência autoimune, Doença autoimune da orelha interna (AIED), Miocardite autoimune, Pancreatite autoimune, Retinopatia autoimune, Púrpura trombocitopênica autoimune (ATP), Doença autoimune da tiroide, Urticária autoimune, Neuripatias axonais e neuronais, Sepse bacteriana e choque séptico, doença de Baló, Doença de Behçet, Penfigoide bolhoso, Cardiomiopatia, Doença de Castleman, Doença celíaca, Doença de Chagas, Síndrome da fadiga crônica, Polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), Oste- omielite multifocal recorrente crônica (CRMO), Síndrome de Churg- Strauss, Penfigoide cicatricial/penfigoide mucoso benigno, Doença de Crohn, Síndrome de Cogan, Doença por aglutininas a frio, Bloqueio cardíaco congênito, Miocardite de Coxsackie, Doença de CREST, Cri- oglobulinemia mista essencial, Neuropatias desmielinizantes, Dermatite herpetiforme, Dermatomiosite, Doença de Devic (neuromielite óptica), Diabetes Tipo I, Lúpus discoide, Síndrome de Dressler, Endome- triose, Esofagite eosinofílica, Fascite eosinofílica, Eritema nodoso, En- cefalomielite alérgica experimental, Síndrome de Evans, Fibromialgia, Alveolite fibrosante, Arterite de células gigantes (arterite temporal), Glomerulonefrite, Síndrome de Goodpasture, Granulomatose com po- liangeíte (GPA) consultar Granulomatose de Wegener, Doença de Graves, Síndrome de Guillain-Barre, Encefalite de Hashimoto, Tireoidi- te de Hashimoto, Anemia hemolítica (incluindo síndrome urêmica he- molítica atípica e síndrome hemolítico-urêmica atípica resistente à terapia de plasma), Púrpura de Henoch-Schonlein, Herpes gestacional, Hipogamaglobulinemia, Púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Ne- fropatia IgA, Doença de esclerose relacionada a IgG4, Lipoproteínas imunorreguladoras, Miosite do corpo de inclusão, Diabetes dependente de insulina (tipo 1), Cistite intersticial, Artrite juvenil, Diabetes juvenil, Síndrome de Kawasaki, Síndrome de Lambert-Eaton, Vasculopatia em vasos grandes, Vasculite leucocitoclástica, Líquen plano, Líquen escle- roso, Conjuntivite lenhosa, Doença linear de IgA (LAD), Lúpus (SLE), Doença de Lyme, Doença de Meniere, Poliangiite microscópica, Doença do tecido conjuntivo misto (MCTD), Úlcera de Mooren, Doença de Mucha-Habermann, Síndromes de neoplasia endócrina múltipla, Esclerose múltipla, Neuropatia motora multifocal, Miosite, Miastenia grave, Narcolepsia, Neuromielite óptica (doença de Devic), Neutropenia, Penfigoide cicatricial ocular, Neurite óptica, Osteoartrite, Reumatismo palindrômico, PANDAS (Distúrbios Neuropsiquiátricos Autoimunes Pe-diátricos Associados a Streptococcus), Degeneração cerebelar para- neoplásica, Hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), Síndrome de Parry Romberg, Síndrome de Parsonnage-Turner, Pars Planitis (uveíte periférica), Pênfigo, Neuropatia periférica, Encefalomielite perivenosa, Anemia perniciosa, Síndrome de POEMS, Poliarterite nodosa, Sín- dromes poliglandulares autoimunes tipo I, II e III, Poliendocrinopatias, Polimialgia reumática, Polimiosite, Síndrome do infarto pós-miocárdio, Síndrome pós-pericardiotomia, Dermatite de progesterona, Cirrose biliar primária, Colangite esclerosante primária, Psoríase, Artrite psoriáti- ca, Fibrose pulmonar idiopática, Pioderma gangrenoso, Aplasia de células vermelhas puras, Fenômeno de Raynaud, Artrite reativa, Distrofia simpática reflexa, Síndrome de Reiter, Policondrite recidivante, Sín- drome das pernas inquietas, Fibrose retroperitoneal, Febre reumática, Artrite reumatóide, Sarcoidose, Síndrome de Schmidt, Esclerite, Escle- rodermia, Síndrome Hemolítico-Urêmica de Escherichia Coli Produzida por Shiga-Toxina (STEC-HUS), Síndrome de Sjogren, Vasculopatia em vasos pequenos, Sêmen e autoimunidade testicular, Síndrome da pessoa rígida, Endocardite bacteriana subaguda (SBE), Síndrome de Susac, Oftalmia simpática, Arterite de Takayasu, Arterite temporal / Arterite de células gigantes, Púrpura trombocitopênica (TTP), Síndro- me de Tolosa-Hunt, Mielite transversa, Distúrbio autoimune tubular, Colite ulcerativa, Doença do tecido conjuntivo não diferenciado (UCTD), Uveíte, Dermatose vesiculobolhosa, Vasculite, Vitiligo e Gra- nulomatose de Wegener (também chamada de Graulomatose com po- liangiite (GPA)). Doenças, distúrbios e/ou afecções neurológicas podem incluir, mas sem limitação, Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, Demência do corpo de Lewy e Esclerose múltipla. Doenças, distúrbios e/ou afecções cardiovasculares podem incluir, mas sem limitação, aterosclerose, infarto do miocárdio, derrame, vasculite, trauma e afecções decorrentes de intervenção cardiovascular (que inclui, mas sem limitação, cirurgia de bypass cardíaco, enxerto arterial e angio- plastia). Doenças, distúrbios e/ou afecções pulmonares podem incluir, mas sem limitação, asma, fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutivacrônica (COPD) e síndrome do desconforto respiratório em adul- tos. Aplicações relacionadas ao ocular incluem, mas sem limitação: Degeneração macular relacionada à idade, conjuntivite alérgica e papi- lar gigante, doença de Behçet, inflamação coroidal, complicações rela-cionadasà cirurgia intraocular, rejeição de transplante de córnea, úlceras da córnea, retinite por citomegalovírus, síndrome do olho seco, en- doftalmite, doença de Fuch, Glaucoma, Vasculite complexa imune, conjutivite inflamatória, doença retiniana isquêmica, ceratite, edema macular, infestação/migração parasitária ocular, retinite pigmentosa, esclerite, doença de Stargardt, fibrose subretiniana, uveíte, inflamação vítreo-retiniana e doença de Vogt-Koyanagi-Harada.

[00190] Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem ser particularmente úteis no tratamento de pacientes com PNH que mostram uma resposta pobre às terapias com anticorpo monoclonal, tais como terapia de ECULIZUMAB®, devido às mutações no gene C5 que impedem a ligação do anticorpo ao C5 (Nishimura, J-I. (2012). 54° Encontro Anual ASH (54th ASH Annual Meeting), Resumo 3197).

[00191] Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, distúrbios e/ou afecções infecciosas, por exemplo, em um indivíduo que tem uma infecção. Em algumas modalidades preferenciais, o indivíduo tem uma infecção e está em risco de desenvolver sepse ou síndrome séptica. Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção são particularmente úteis no tratamento de sepse.

[00192] Os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção também podem ser administrados para aprimorar o resultado de procedimentos clínicos em que a inibição de complementoé desejada. Tais procedimentos podem incluir, mas sem limitação, enxerto, transplante, implante, cateterização, intubação e semelhantes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo da invenção são usados para revestir dispositivos, materiais e/ou biomateriais usados em tais procedimentos. Em algumas modalidades, a superfície interna de um tubo pode ser revestida com polipeptídeos e/ou composições de polipeptídeo para impedir a ativação de complemento dentro de um fluido corporal que passa através do tubo, in vivo ou ex vivo, por exemplo, desvio extracorporal, por exemplo, diálise e bypass cardíaco.

Métodos de uso Indicações terapêuticas

[00193] A invenção se refere, em particular, ao uso de polipeptídeo (por exemplo, peptidomiméticos e polipeptídeos cíclicos) e composições que contêm pelo menos um polipeptídeo, para o tratamento de um distúrbio, afecção ou doença. Em alguns casos, os compostos e composições da invenção podem ser usados para tratar indivíduos que sofrem de hemoglobinúria paroxística noturna (PNH). Os indivíduos com PNH têm capacidade para sintetizar versões funcionais das proteínas regulamentadoras de complemento CD55 e CD59 em células-troncohematopoiéticas. Isso resulta em hemólise mediada por complemento e uma variedade de complicações a jusante. Outros dis-túrbios e doenças relacionados ao complemento incluem, mas sem limitação, doenças e distúrbios autoimunes, doenças e distúrbios neu-rológicos, doenças e distúrbios sanguíneos e doenças e distúrbios in-fecciosas.Evidências experimentais sugerem que muitos distúrbios relacionados ao complemento são aliviados através de inibição de ati-vidade de complemento.

[00194] Uma mutação adquirida na biossíntese de âncora de fosfa- tidilinositol glicano, gene de classe A (PIG-A) que se origina a partir de uma célula-troco hematopoiética multipotente, resulta em uma doença rara conhecida como hemoglobinúria paroxística noturna (PNH) (Pu, J.J. et al., Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria from bench to bedsi de. Clin Transl Sci. 2011 Jun;4(3):219-24). PNH é distinguida por distúrbio de medula óssea, anemia hemolítica e trombose. O produto de gene PIG-A é necessário para a produção de uma âncora de glicolípi- dos, glicosilfosfatidilinositol (GPI), utilizada para unir proteínas à mem-branaplasmática. Duas proteínas reguladoras de complementos, CD55 e CD59, se tornam não funcionais na ausência de GPI. Isso levarà destruição mediada por complemento dessas células. Os poli- peptídeos e/ou composições de polipeptídeo da presente invenção são particularmente úteis no tratamento de PNH. Conforme usado no presente documento, os termos "tratar", "tratamento" e semelhantes, se referem à libertação ou ao alívio de processos patológicos. No contexto da presente invenção, à medida em que se relaciona a qualquer uma das outras afecções descritas no presente documento abaixo, os termos "tratar", "tratamento" e semelhantes significam libertar ou aliviar pelo menos um sintoma associado a tal afecção, ou retardar ou reverter a progressão ou a progressão antecipada de tal afecção, tal como retardar a progressão de uma malignidade ou câncer, ou aumentar a depuração de um organismo infecioso para aliviar/reduzir os sintomas provocados pela infecção, por exemplo, hepatite provocada por infecção com um vírus de hepatite ou reduzir a destruição de glóbulos vermelhos (como medido por exigências de transfusão reduzidas ou níveis aumentados de hematócrito ou hemoglobina) que resulta de he- moglobinúria paroxística noturna.

[00195] Por "diminuir" ou "reduzir" no contexto de um marcador ou sintoma de doença entende-se uma diminuição estatisticamente significativa em tal nível. A diminuição pode ser, por exemplo, de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou mais, e é preferencialmente inferior a um nível aceito dentro da faixa normal para um indivíduo sem tal distúrbio.

[00196] Por "aumentar" ou "elevar" no contexto de um marcador ou sintoma de doença entende-se uma elevação estatisticamente signifi-cativa em tal nível. O aumento pode ser, por exemplo, de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou mais, e vai, preferencialmente, até um nível aceito dentro da faixa normal para um indivíduo sem tal distúrbio.

[00197] Conforme usado no presente documento, as frases "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quantidade profilaticamente eficaz" se referem a uma quantidade que fornece um benefício terapêutico no tratamento, prevenção ou gerenciamento de processos patológicos ou um sintoma evidente de um ou mais processos patológicos. A quantidadeespecífica que é terapeuticamente eficaz pode ser prontamente determinada por um profissional da área médica ordinário, e pode variar dependendo de fatores conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, o tipo de processos patológicos, histórico do paciente e idade, o estágio de processos patológicos e a administração de outros agentes que inibem processos patológicos.

[00198] Conforme usado no presente documento, uma "composição farmacêutica"compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de um polipeptídeo e um carreador farmaceuticamente aceitável. Conforme usado no presente documento, "quantidade farmacologicamente eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou simplesmente "quantidade eficaz" se refere à quantidade eficaz de um polipeptídeo para produzir os resultados farmacológico, terapêutico ou preventivo pretendidos. Por exemplo, se um dado tratamento clínico for considerado eficaz quando houver pelo menos uma alteração de 10% (aumento ou diminuição) em um parâmetro mensurável associado a uma doença ou distúrbio, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco para o tratamento dessa doença ou distúrbio é a quantidade necessária para efetuar pelo menos uma alteração de 10% nesse parâmetro. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo pode ser uma que altere a ligação de um alvo a seu parceiro de ligação natural por pelo menos 10%.

[00199] O termo "carreador farmaceuticamente aceitável"se refere a um carreador para administração de um agente terapêutico. Tais carreadores incluem, mas sem limitação, solução fisiológica, solução fisiológica tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e combinações dos mesmos. O termo exclui especificamente meio de cultura celular. Para fármacos administrados oralmente, carreadores farmaceutica- mente aceitáveis incluem, mas sem limitação, excipientes farmaceuti- camente aceitáveis tais como diluentes inertes, agentes desintegran- tes, agentes aglutinantes, agentes lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes e conservantes. Diluentes inertes adequados incluem carbonato de sódio e de cálcio, fosfato de sódio e de cálcio e lactose, enquanto amido de milho e ácido algínico são agentes desintegrantes adequados. Agentes aglutinantes podem incluir amido e gelatina, enquanto o agente lubrificante, se presente, serão geralmente estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Caso desejado, os comprimidos podem ser revestidos com um material, tal como monoestearato de glicerila ou disestearato de glicerila, para atrasar a absorção no trato gastrointestinal. Os agentes incluídos em formulação de fármaco são descritos adicionalmente no presente documento abaixo.

[00200] A eficácia de tratamento ou melhora de doença pode ser avaliada, por exemplo, medindo-se a progressão da doença, a remissão da doença, a severidade dos sintomas, a redução em dor, a qualidade de vida, a dose de um medicamento exigido para sustentar um efeito de tratamento, o nível de um marcador de doença ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma dada doença a ser tratada ou alvejada para prevenção. Está bem dentro da capacidade de uma pessoa versada na técnica, monitorar a eficácia de tratamento ou prevenção medindo-se qualquer um dentre tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conjunto com a administração de um polipeptídeo ou composição farmacêutica do mesmo, "eficaz contra" uma doença ou distúrbio indica que a administração de uma maneira clinicamente apropriada resulta em um efeito benéfico para pelo menos uma fração de pacientes, tal como um melhoramento de sintomas, uma cura, uma redução na carga de doença, redução em massa de tumor ou quantidade de células, extensão da vida, aprimoramento em qualidade de vida, uma redução na necessidade para transfusões de sangue ou outro efeito geralmente reconhecido como positivo por médicos familiarizados com o tratamento do tipo particular de doença ou distúrbio.

[00201] Um tratamento ou efeito preventivo é evidente quando houver um aprimoramento estatisticamente significativo em um ou mais parâmetros de situação de doença, ou por uma falha em piorar ou desenvolver sintomas onde os mesmos seriam, de outra forma, antecipados. Como um exemplo, uma alteração favorável de pelo menos 10% em um parâmetro mensurável de doença e, preferencialmente, de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais pode ser indicativa de tratamento eficaz. A eficácia para um dado fármaco polipeptídico ou formulação desse fármaco também pode ser julgada com o uso de um modelo animal experimental para a dada doença, conforme conhecido na técnica. Ao usar um modelo animal experimental, a eficácia de tratamentoé evidenciada quando uma modulação estatisticamente significativa em um marcador ou sintoma for observada.

[00202] O polipeptídeo e um agente terapêutico adicional podem ser administrados em combinação na mesma composição, por exemplo, parentericamente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou por outro método descrito no presente documento.

Indicações inflamatórias

[00203] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar indivíduos com doenças, distúrbios e/ou afecções relacionadas à inflamação. A inflamação pode ser regulada positivamente durante a cascata proteolítica do sistema de complemento. Embora a inflamação possa ter efeitos benéficos, o excesso de inflamação pode levar a uma variedade de patologias (Markiewski et al. 2007. Am J Pathol. 17: 715-27). Consequentemente, os compostos e as composições da presente invenção podem ser usados para reduzir ou eliminar a inflamação associada à ativação de complemento.

Inflamação estéril

[00204] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da presente invenção podem ser usados para tratar, prevenir ou atrasar o desenvolvimento de inflamação estéril. A inflamação estéril é a inflamação que ocorre em resposta aos estímulos diferentes de infecção. A inflamação estéril pode ser uma resposta comum ao estresse, tal como estresse genômico, estresse hipóxico, estresse de nutriente ou estresse de retículo endoplasmático, provocado por estímulos nocivosfísicos, químicos ou metabólicos. A inflamação estéril pode contribuir para patogênese de muitas doenças, tais como, mas sem limitação, lesões induzidas por isquemia, artrite reumatóide, lesões pulmonares agudas, lesões hepáticas induzidas por fármaco, doenças inflamatóriasintestinais e/ou outras doenças, distúrbios ou afecções. O mecanismo de inflamação estéril e métodos e composições para tratamento,prevenção e/ou atraso de sintomas de inflamação estéril podem incluir qualquer um dentre os ensinados por Rubartelli et al. em Frontiers in Immunology, 2013, 4:398-99, Rock et al. em Annu Rev Immunol. 2010, 28:321-342 ou na Patente no US 8.101.586, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente do- cumento em sua totalidade a título de referência. Resposta inflamatória sistêmica (SIRS) e sepse

[00205] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar e/ou prevenir síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS). SIRS é uma inflamação que afeta todo o corpo. Onde SIRS é provocada por uma infecção, é referido como sepse. SIRS também pode ser provocada por eventos não infecciosos, tais como trauma, lesão, queimaduras, isquemia, hemorragia e/ou outras afecções. Durante a sepse e SIRS, a ativação de complemento leva à geração excessiva de ativação de produtos de complemento que podem provocar falência múltipla dos órgãos (MOF) em indivíduos. Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para controlar e/ou equilibrar a ativação de complemento para prevenção e tratamento de SIRS, sepse e/ou MOF. Os métodos de aplicação de inibidores de complemento para tratar SIRS e sepse podem incluir aqueles ensinados por Rittirsch et al. em Clin Dev Immunol, 2012, 962927, na publicação no U.S. US2013/0053302 ou na Patente no US 8.329.169, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS)

[00206] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar e/ou prevenir o desenvolvimento de síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS). A ARDS é uma inflamação generalizada dos pulmões e pode ser provocada por trauma, infecção (por exemplo, sepse), pneumonia severa e/ou inalação de substâncias nocivas. A ARDS é tipicamente uma complicação severa com risco de vida. Estudos sugerem que neutrófi- los podem contribuir para desenvolvimento de ARDS ao influenciar o acúmulo de células polimorfonucleares nos alvéolos pulmonares lesio- nados e tecido intersticial dos pulmões. Consequentemente, os com-postos e composições da invenção podem ser administrados para reduzir e/ou prevenir produção de fator de tecido em neutrófilos alveola- res. Os compostos e as composições da invenção podem ser adicionalmente usados para tratamento, prevenção e/ou atraso de ARDS, em alguns casos, de acordo com qualquer um dos métodos ensinados na Publicação internacional no WO2009/014633, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Periodontite

[00207] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar ou prevenir o desenvolvimento de periodontite e/ou afecções associadas. A periodontite é uma inflamação crônica generalizada que leva à destruição de tecido periodontal que é o tecido que suporta e circunda os dentes. A afecção também envolve perdas do osso alveolar (o osso que retém os dentes). A periodontite pode ser provocada por uma falta de higiene oral que leva ao acúmulo de bactérias na linha das gengivas, também conhecido como placa dentária. Certas condições de saúde tal como diabetes ou desnutrição e/ou hábitos, tal como tabagismo, podem aumentar o risco de periodontite. A periodontite pode aumentar o risco de derrame, infarto do miocárdio, aterosclerose, diabetes, osteoporose, parto prematuro, assim como outros problemas de saúde. Estudos demonstram uma correlação entre periodontite e atividade local de complemento. As bactérias periodontais podem inibir ou ativar certos componentes da cascata de complemento. Consequentemente, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar periodontite e doenças e afecções associadas. Os inibidores de ativação de complemento e métodos de tratamento podem incluir qualquer um dentre os ensinados por Hajishengallis em Biochem Pharmacol. 2010, 15; 80(12): 1 and Lambris ou na Publicação no US US2013/0344082, em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Feridas e lesões

[00208] Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar e/ou promover cura de tipos diferentes de feridas e/ou lesões. Conforme usado no presente documento, o termo "lesão" se refere tipicamente ao trauma físico, mas pode incluir infecção localizada ou processos de doença. As lesões podem ser distinguidas por prejuízo, dano ou destruição provocada por eventos externos que afetam partes do corpo e/ou órgãos. As feridas são associadas a cortes, pancadas, queimaduras e/ou outros impactos na pele, o que deixa a pele rompida ou danificada. As feridas e lesões são frequentemente agudas, mas caso não sejam curadas apropriadamente, as mesmas podem levar a complicações crônicas e/ou inflamação. Feridas e feridas por queimadura

[00209] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar e/ou promover a cura de feridas. Uma pele saudável fornece uma barreira protetora a prova d’água contra patógenos e outros efetores ambientais. A pele também controla a temperatura do corpo e a evaporação de fluido. Quando a pele for ferida, essas funções são interrompidas, o que torna a cura da pele um desafio. O ferimento inicia um conjunto de processos fisiológicos relacionado ao sistema imunológico que repara e regenera o tecido. A ativação de complemento é um desses processos. Estudos de ativação de complemento identificaram diversos componentes de complemento envolvidos com a cura de ferida conforme ensinado por Van de Goot et al. em J Burn Care Res 2009, 30:274-280 e Cazander et al. Clin Dev Immunol, 2012, 2012:534291, em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Em alguns casos, a ativação de complemento pode ser excessiva, o que provoca a morte celular e in-flamação aumentada (que leva ao comprometimento de cura da ferida e a feridas crônicas). Em alguns casos, os compostos e as composições da presente invenção podem ser usados para reduzir ou eliminar tal ativação de complemento para promover a cura de ferida. O tratamento com compostos e composições da invenção pode ser realizado de acordo com qualquer um dos métodos para tratar feridas revelado na Publicação internacional no WO2012/174055, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Trauma de cabeça

[00210] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usadas para tratar e/ou promover a cura de trauma de cabeça. Traumas de cabeça incluem lesões ao coro cabeludo, ao crânio ou ao cérebro. Exemplos de trauma de cabeça incluem, mas sem limitação, concussões, contusões, fraturas cranianas, lesões cerebrais traumáticas e/ou outras lesões. Traumas de cabeça podem ser menores ou severos. Em alguns casos, o trauma de cabeça pode levar a complicações físicas e/ou mentais a longo prazo ou à morte. Estudos indicam que traumas de cabeça podem induzir ativação de cascata de complemento intracraniana imprópria, que pode levar a respostas inflamatórias locais que contribuem para dano cerebral secundário por desenvolvimento de edema cerebral e/ou morte neuronal (Stahel et al. em Brain Research Reviews, 1998, 27: 243-56, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência). Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar trauma de cabeça e/ou para reduzir ou prevenir complicações secundárias relacionadas. Os métodos de uso de compostos e composições da invenção para controlar a ativação de cascata de complemento em trauma de cabeça podem incluir qualquer um dos métodos ensinados por Holers et al. Na Patente no US 8.911.733, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Lesão por esmagamento

[00211] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar e/ou promover a cura de lesões por esmagamento. As lesões por esmagamento são lesões provocadas por uma força ou uma pressão colocada no corpo que provoca sangramento, hematomas, fraturas, lesões nervosas, feridas e/ou outros danos ao corpo. Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para reduzir a ativação de complemento após as lesões por esmagamento, promovendo, assim, a cura após lesões por esmagamento (por exemplo, promovendo-se regeneração de nervo, promovendo-se cura de fratura, prevenindo-se ou tratando- se a inflamação e/ou outras complicações relacionadas). Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para promover a cura de acordo com qualquer um dos métodos ensinados na Patente no US 8.703.136; Publicações internacionais no WO2012/162215; no WO2012/174055; ou Publicação no US US2006/0270590, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Doença autoimune

[00212] Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar indivíduos com doenças e/ou distúrbios autoimu- nes. O sistema imunológico pode ser dividido em sistemas inatos e adaptativos, em referência a mecanismos de defesa imediatos não específicos e sistemas mais complexos de antígeno específico, respectivamente. O sistema de complemento é parte do sistema imunológico inato, que reconhece e elimina patógenos. Adicionalmente, proteínas de complemento podem modular a imunidade adaptativa, o que conecta respostas inatas e adaptativas. As doenças e distúrbios autoimunes são anormalidades imunitárias que fazem com que o sistema alveje os próprios tecidos e as próprias substâncias. A doença autoimune pode envolver certos tecidos ou órgãos do corpo. Os compostos e as com-posições da invenção podem ser usados para modular o complemento no tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes. Em alguns casos, tais compostos e composições podem ser usados de acordo com os métodos apresentados em Ballanti et al. Immunol Res (2013) 56:477-491, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Síndrome antifosfolipídica (APS) e síndrome antifosfolipídica catastrófica (CAPS)

[00213] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar síndrome anti- fosfolipídica (APS) por controle de ativação de complemento. A APS é uma afecção autoimune provocada por anticorpos antifosfolipídicos que fazem com que o sangue coagule. A APS pode levar à trombose venosa ou arterial recorrente em órgãos, e complicações em circulações placentárias que provocam complicações relacionadas à gravidez tais como aborto espontâneo, natimorto, pré-eclâmpsia, nascimento prematuro e/ou outras complicações. A síndrome antifosfolipídica catastrófica (CAPS) é uma versão extrema e aguda de uma afecção similar que leva à oclusão de veias em diversos órgãos simultaneamente. Estudos sugerem que a ativação de complemento pode contribuir para complicações relacionadas à APS que incluem complicações relacionadasà gravidez, complicações trombóticas (coagulação) e complicações vasculares. O composto e as composições da invenção podem ser usados para tratar afecções relacionadas à APS reduzindo-se ou eliminando-se a ativação de complemento. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar APS e/ou complicações relacionadas à APS de acordo com os métodos ensinados por Salmon et al. Ann Rheum Dis 2002;61(Suppl II):ii46-ii50 e Mackworth-Young em Clin Exp Immunol 2004, 136:393401, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Doença por aglutininas a frio

[00214] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar doença por aglutininas a frio (CAD), também denominada como hemólise mediada por aglutini- nas a frio. A CAD é uma doença autoimune que resulta de uma alta concentração de anticorpos IgM que interagem com glóbulos vermelhos em baixas temperaturas corporais [Engelhardt et al. Blood, 2002, 100(5):1922-23]. A CAD pode levar a afecções, tais como anemia, fadiga, dispneia, hemoglobinúria e/ou acrocianose. A CAD está relacionadaà ativação de complemento robusta e estudos mostraram que a CAD pode ser tratada com terapias inibidoras de complemento. Consequentemente, a presente invenção fornece métodos para tratar a CAD com o uso de compostos e composições da invenção. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar a CAD de acordo com os métodos ensinados por Roth et al em Blood, 2009, 113:3885-86 ou na Publicação internacional no WO2012/139081, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Indicações vasculares

[00215] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar indicações vasculares que afetam vasos sanguíneos (por exemplo, artérias, veias e capilares). Tais indicações podem afetar a circulação sanguínea, a pressão san-guínea, o fluxo sanguíneo, a função de órgão e/ou outras funções cor-porais.

Microangiopatia trombótica (TMA)

[00216] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar e/ou prevenir microangiopa- tia trombótica (TMA) e doenças associadas. Microangiopatias afetam vasos sanguíneos pequenos (capilares) do corpo que fazem com que as paredes capilares se tornem espessas, fracas e propensas a sangrar e a retardar a circulação sanguínea. As TMAs tendem a levar ao desenvolvimento de trombos vasculares, danos às células endoteliais, trombocitopenia e hemólise. Os órgãos tais como o cérebro, rins, mús-culos, sistema gastrointestinal, pele e pulmões podem ser afetados. As TMAs podem surgir de operações médicas e/ou afecções que incluem, mas sem limitação, transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT), distúrbios renais, diabetes e/ou outras afecções. As TMAs podem ser provocadas por disfunção de sistema de complemento ad-jacente, conforme descrito por Meri et al. no Jornal Europeu de Medicina Interna (European Journal of Internal Medicine), 2013, 24: 496502, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Em geral, as TMAs podem resultar de aumento de níveis de certos componentes de complemento, o que leva à trombose. Em alguns casos, isso pode ser provocado por mutações em proteínas de complemento ou enzimas relacionadas. A disfunçãode complemento resultante pode levar ao alvejamento de complemento de células endoteliais e plaquetas, o que leva ao aumento de trombose. Em algumas modalidades, as TMAs podem ser prevenidas e/ou tratadas com os compostos e as composições da invenção. Em alguns casos, os métodos para tratar TMAs com os compostos e as composições da invenção podem ser realizados de acordo com aque- les descritos na Publicação no US US2012/0225056 ou no US2013/0246083, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de refe-rência.

Coagulação intravascular disseminada (DIC)

[00217] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar coagulação intravascular disseminada (DIC) controlando-se a ativação de com-plemento. A DIC é uma afecção patológica em que a cascata de coa-gulação no sangue é amplamente ativada e resulta na formação de coágulos de sangue especialmente nos capilares. A DIC pode levar a um fluxo sanguíneo obstruído de tecidos e pode, eventualmente, danificar órgãos. Adicionalmente, a DIC afeta o processo normal de coagulação sanguínea que pode levar a sangramento severo. Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar, prevenir ou reduzir a severidade de DIC modulando-se a atividade de complemento. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de DIC ensinado no documento de Patente no US 8.652.477, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Vasculite

[00218] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar vasculite. Em geral, a vasculite é um distúrbio relacionado à inflamação de vasos sanguíneos, incluindo veias e artérias, distinguido por glóbulos brancos que atacam o tecido provocam o inchaço dos vasos sanguíneos. A vasculite pode estar associada a uma infecção, tal como febre maculosa das Montanhas Rochosas ou autoimunidade. Um exemplo de vasculite associada à autoimunidade é vasculite de Autoaticorpo de Anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA). A vasculite ANCA é provocada por anticorpos anormais que atacam as próprias células e os próprios tecidos do corpo. Os ANCAs atacam o citoplasma de certos glóbulos brancos e neutrófilos, o que faz com que os mesmos ataquem as paredes dos vasos em certos órgãos e tecidos do corpo. A vasculite ANCA pode afetar a pele, pulmões, olhos e/ou rins. Estudos sugerem que a doença ANCA ativa uma via de complemento alternativa e gera certos componentes de complemento que criam um laço de amplificação de inflamação que resulta em uma lesão vascular (Jennette et al. 2013, Semin Nephrol. 33(6): 557-64, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência). Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar vasculite ANCA inibindo-se a ativação de complemento.

Indicações neurológicas

[00219] Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir, tratar e/ou amenizar os sintomas de indicações neurológicas, que incluem, mas sem limitação, doenças neurodegene- rativas e distúrbios relacionados. Neurodegeneração geralmente se refere a uma perda de estrutura ou função de neurônios, que inclui a morte de neurônios. Esses distúrbios podem ser tratados inibindo-se o efeito de complemento em células neuronais com o uso de compostos e composições da invenção. Os distúrbios neurodegenerativos relacionados incluem, mas sem limitação, Esclerose Lateral Amielotrófica (ALS), Esclerose Múltipla (MS), doença de Parkinson e doença de Alzheimer.

Esclerose lateral amielotrófica (ALS)

[00220] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir, tratar e/ou amenizar os sintomas de ALS. A ALS é uma doença neuromotora fatal distinguida pela degeneração de neurônios de medula espinhal, troncos cerebrais e córtex motor. A ALS provoca perdas de força muscular, o que leva, eventualmente, a uma falha respiratória. A disfunção de complemento pode contribuir para a ALS e, portanto, a ALS pode evitada, tratada e/ou os sintomas podem ser reduzidos por terapia com os compostos e as composições da invenção que alvejam a atividade de complemento. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para promover a regeneração do nervo. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados como inibidores de complemento de acordo com qualquer um dos métodos ensinados na publicação no US US2014/0234275 ou no US2010/0143344, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Doença de Alzheimer

[00221] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar a doença de Alzheimer controlando-se a atividade de complemento. A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa crônica com sintomas que podem incluir desorientação, perda de memória, oscilações de humor, problemas comportamentais e, eventualmente, perda de funções cor-porais. Acredita-se que a doença de Alzheimer seja provocada por de-pósitos extracelulares de amiloide no cérebro que estão associados às proteínas relacionadas à inflamação, tais como proteínas de complemento (Sjoberg et al. 2009. Trends in Immunology. 30(2): 83-90, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência). Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados como inibidores de complemento de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento do Alzheimer ensinado na publicação no US2014/0234275, cujo conteúdo está in- corporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Indicações relacionadas aos rins

[00222] Os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar certas doenças, distúrbios e/ou afecções relacionadas aos rins, em alguns casos, inibindo-se a atividade de complemento. Os rins são órgãos responsáveis pela remoção de resíduos metabólicosda corrente sanguínea. Os rins regulam a pressão sanguínea, o sistema urinário e funções homeostáticas e são, portanto, essenciais para uma variedade de funções corporais. Os rins podem ser afetados mais seriamente por inflamação (em comparação aos outros órgãos) devido às características estruturais exclusiva e à exposição ao sangue. Os rins também produzem suas próprias proteínas de complemento que podem ser ativadas mediante infecção, doença renal e transplantes renais. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados como inibidores de complemento no tratamento de certas doenças, afecções e/ou distúrbios dos rins de acordo com os métodos ensinados por Quigg, J Immunol 2003; 171:3319-24, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Lúpus Nefrite

[00223] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar lúpus nefrite inibindo-se a atividade de complemento. O lúpus nefrite é uma inflamação renal provocada por uma doença autoimune chamada lúpus eritematoso sistêmico (SLE). Os sintomas de lúpus nefrite incluem alta pressão sanguínea; urina espumosa; inchaço das pernas, dos pés, das mãos ou da face; dor nas articulações; dor muscular; febre; e erupções cutâneas. O lúpus nefrite pode ser tratado por inibidores que controlam a atividade de complemento, incluindo os compostos e as composições da presente invenção. Os métodos e composições para prevenir e/ou tratar lúpus nefrite por inibição de complemento podem incluir qualquer um dos métodos ensinados na publicação no US US2013/0345257 ou na Patente no US 8.377.437, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Glomerulonefrite membranosa (MGN)

[00224] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar distúrbio de glomerulonefrite membranosa (MGN) inibindo-se a ativação de certos componentes de complemento. A MGN é um distúrbio do rim que pode levar à inflamação e alterações estruturais. A MGN é provocada por anticorpos que se ligam a um antígeno solúvel em capilares renais (glomérulo). A MGN pode afetar as funções renais, tal como a filtragem de fluidos, e pode levar à falha renal. Os compostos e as composições da invenção podem ser usados de acordo com métodos para prevenir e/ou tratar MGN por inibição de complemento ensinados na publicação no U.S. US2010/0015139 ou na publicação internacional no WO2000/021559, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Complicações de hemodiálise

[00225] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar complicações associadas à hemodiálise inibindo-se a ativação de complemento. A hemodiálise é um procedimento médico usado para manter a função renal em indivíduos com falha renal. Em hemodiálise, a remoção de resíduos tais como creatinina, ureia e água livre do sangue é realizada externamente. Uma complicação comum de tratamento por hemodiálise é a inflamação crônica provocada por contato entre o sangue e a membrana de diálise. Outra complicação comum é a trombose relacionada a uma formação de coágulos de sangue que obstruem a circulação sanguínea. Estudos sugeriram que essas complicações estão relacionadas à ativação de complemento. A hemodiálise pode ser combinada com terapia inibidora de complemento para fornecer meios para controlar respostas inflamatórias e patologias e/ou para prevenir ou tratar trombose em indivíduos que passam por hemodiálise devido à falha renal. Os métodos para usar os compostos e as composições da invenção para tratamento de complicações de hemodiálise podem ser realizados de acordo com qualquer um dos métodos ensinados por DeAngelis et al em Immunobiology, 2012, 217(11): 1097-1105 ou por Kourtzelis et al. Blood, 2010, 116(4):631-639, em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Doenças oculares

[00226] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar certas doenças, distúrbios e/ou afecções relacionadas ao ocular. Em um olho saudável o sistema de complemento é ativado em um baixo nível e é continuamente regulado por proteínas intraoculares solúveis e ligadas à membrana que protegem contra patógenos. Portanto, a ativação de complemento desempenha um papel importante em diversas complicações relacionadas ao olho e o controle da ativação de complemento pode ser usado para tratar tais doenças. Os compostos e as composições da invenção podem ser usados como inibidores de complemento no tratamento de doença ocular de acordo com qualquer um dos métodos ensinados por Jha et al. em Mol Immunol. 2007; 44(16): 39013908 ou na Patente no US 8.753.625, em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Degeneração macular relacionada à idade (AMD)

[00227] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar degeneração macular relacionada à idade (AMD) inibindo-se a ativação de complemento ocular. A AMD é uma doença ocular crônica que provoca visão central turva, pontos cegos na visão central e/ou eventual perda de visão central. A visão central afeta a capacidade de ler, dirigir um veículo e/ou reconhecer faces. A AMD é geralmente dividida em dois tipos,não exsudativa (seca) e exsudativa (úmida). A AMD seca se refereà deterioração da mácula que é o tecido no centro da retina. A AMD úmida se refere à falha de vasos sanguíneos sob a retina que leva ao vazamento de sangue e fluido. Diversos estudos com humanos e animais identificaram proteínas de complemento que estão relacionadas à AMD e estratégias terapêuticas inovadoras incluíram o controle de vias de ativação de complemento, conforme discutido por Jha et al. em Mol Immunol. 2007; 44(16): 3901-8. Os métodos da invenção que envolvem o uso dos compostos e das composições da invenção para prevenção e/ou tratamento de AMD podem incluir qualquer um dos métodos ensinados nas publicações no US2011/0269807 ou no US2008/0269318, em que o conteúdo de cada uma das mesmas está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Doença da córnea

[00228] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar doenças da córnea inibindo-se a ativação de complemento ocular. O sistema de complemento desempenha um papel importante na proteção da córnea contra partículas patogênicas e/ou antígenos inflamatórios. A córnea é a parte frontal mais externa do olho que cobre e protege a íris, a pupila e a câmara anterior e está, portanto, exposta a fatores externos. As doenças da córnea incluem, mas sem limitação, ceratocone, ceratite, herpes ocular e/ou outras doenças. Complicações da córnea podem provocar dor, visão turva, lacrimejamento, vermelhidão, sensibilidadeà luz e/ou cicatrização da córnea. O sistema de complemento é crítico para a proteção da córnea, mas a ativação de complemento provocar danos ao tecido da córnea após uma infecção ser eliminada, visto que certos compostos de complemento são fortemente expressados. Os métodos da presente invenção para modular a atividade de complemento no tratamento de doença da córnea podem incluir qualquer um dos métodos ensinados por Jha et al. em Mol Immunol. 2007; 44(16): 3901-8, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Uveíte autoimune

[00229] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar uveíte, que é uma inflamação da camada uveal do olho. A úvea é a área pigmentada do olho que compreende os coroides, a íris e o corpo ciliar do olho. A uveíte provoca vermelhidão, visão turva, dor, sinequia e pode eventualmente provocar cegueira. Estudos indicaram que os produtos de ativação de complemento estão presentes nos olhos de pacientes com uveíte autoimune e o complemento desempenha um papel importante no desenvolvimento da doença. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para tratar e/ou prevenir uveíte de acordo com qualquer um dos métodos identificados em Jha et al. em Mol Immunol. 2007. 44(16): 3901-8, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Retinopatia diabética

[00230] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar retinopatia diabética que é uma doença provocada por alterações em vasos san-guíneos de retina em pacientes diabéticos. A retinopatia pode provocar inchaço de vasos sanguíneos e vazamento de fluidos e/ou crescimento de vasos sanguíneos anormais. A retinopatia diabética afeta a visão e pode, eventualmente, levar à cegueira. Estudos sugeriram que a ativação de complemento tem um papel importante no desenvolvimento de retinopatia diabética. Em alguns casos, os compostos e as composições da invenção podem ser usados de acordo com os métodos de tratamento de retinopatia diabética descritos em Jha et al. Mol Immunol. 2007; 44(16): 3901-8, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Pré-eclâmpsia e síndrome de HELLP

[00231] Em algumas modalidades, os compostos e as composições da invenção podem ser usados para prevenir e/ou tratar pré-eclâmpsia e/ou síndrome de HELLP (abreviação permanente para características de síndrome de 1) hemólise, 2) enzimas hepáticas elevadas e 3) baixa contagem de plaquetas) por terapia inibidora de complemento. A pré- eclâmpsia é um distúrbio de gravidez com sintomas que incluem pressão sanguínea elevada, inchaço, dificuldade em respirar, disfunção renal, função hepática reduzida e/ou baixa contagem de plaquetas. A pré-eclâmpsia é tipicamente diagnosticada por um alto nível de proteína na urina e alta pressão sanguínea. A síndrome de HELLP é uma combinação de hemólise, enzimas hepáticas elevadas e baixa e condições baixas de plaqueta. A hemólise é uma doença que envolve a ruptura de glóbulos vermelhos, o que leva à liberação de hemoglobina dos glóbulos vermelhos. As enzimas hepáticas elevadas podem indicar uma afecção hepática induzida por gravidez. Baixos níveis de plaquetas levam à capacidade de coagulação reduzida, o que provoca perigo de sangramento excessivo. HELLP é associada a uma pré- eclâmpsia e a um distúrbio hepático. A síndrome de HELLP ocorre ti- picamente durante os últimos estágios da gravidez ou após o parto. É tipicamente diagnosticada por testes sanguíneos que indicam a presença das três condições que envolve. Tipicamente, a HELLP é tratada induzindo-se o parto.

[00232] Estudos sugerem que a ativação de complemento ocorre durante a síndrome de HELLP e a pré-eclâmpsia e que certos componentes de complemento estão presentes em níveis aumentados durante a HELLP e a pré-eclâmpsia. Os inibidores de complemento podem ser usados como agentes terapêuticos para prevenir e/ou tratar essas afecções. Os compostos e as composições da invenção podem ser usados de acordo com métodos de prevenção e/ou tratamento de HELLP e pré-eclâmpsia ensinados por Heager et al. em Obstetrics & Gynecology, 1992, 79(1):19-26 ou na publicação internacional no WO201/078622, em que o conteúdo de cada um dos mesmos está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Dosagem e administração

[00233] Para uso como tratamento de indivíduos humanos, os poli- peptídeos podem ser formulados como composições farmacêuticas. Dependendo do indivíduo a ser tratado, o modo de administração e o tipo de tratamento desejado (por exemplo, prevenção, profilaxia ou terapia), os polipeptídeos são formulados de formas consonantes com esses parâmetros. Um resumo de tais técnicas é encontrado em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edição, Lippincott Williams & Wilkins, (2005); e Enciclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nova York, EUA, cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência.

[00234] As composições da presente invenção são preferencialmente fornecidas em uma quantidade terapeuticamente eficaz, que pode ser, por exemplo, uma quantidade diária de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg, de cerca de 0,5 mg a cerca de 200 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 300 mg, de cerca de 5 mg a cerca de 500 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 750 mg, de cerca de 50 mg a cerca de 1.000 mg ou pelo menos 1.000 mg. Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreende uma cápsula, por exemplo, em forma de dosagem unitária.

Formas de dosagem unitária

[00235] Os polipeptídeos da invenção podem estar presentes em quantidade que totalizam de 0,1 a 95% em peso do peso total da com-posição. A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que é adequada para administração oral. Assim, a composição farma-cêutica pode estar na forma de, por exemplo, cápsulas rígidas (por exemplo, cápsulas rígidas de gelatina ou cápsulas rígidas de hidroxi- propil metilcelulose), cápsulas macias de gelatina, comprimidos, cápsulas revestidas, comprimidos de revestimento entérico, comprimidos mastigáveis, cápsulas de gelatina rígidas de revestimento entérico, cápsulas de gelatina macias de revestimento entérico, minicápsulas, pastilhas, películas, tiras, cápsulas de gel, dreageias, soluções, emul-sões, suspensões, xaropes ou pulverizações.

[00236] Os indivíduos podem ser administrados com quantidade terapêutica de um polipeptídeo, tal como 0,01 mg/kg, 1,0 mg/kg ou 15 mg/kg. Para a administração em indivíduos humanos, a dosagem de polipeptídeos da presente invenção é tipicamente de 0,01 a 15 mg/kg, mais preferencialmente, de 3 a 5 mg/kg. Entretanto, os níveis de dosagem podem ser altamente dependentes da natureza da afecção; da eficácia de fármaco; da afecção do paciente; do julgamento do profissional; e da frequência e modo de administração.

[00237] Em outras modalidades, os polipeptídeos são administrados em uma frequência de, por exemplo, a cada 4 h, a cada 6 h, a ca- da 12 h, a cada 18 h, a cada 24 h, a cada 36 h, a cada 72 h, a cada 84 h, a cada 96 h, a cada 5 dias, a cada 7 dias, a cada 10 dias, a cada 14 dias, a cada 3 semanas ou mais. As composições podem ser administradas uma vez por dia ou o polipeptídeo pode ser administrado duas, três ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia ou entregue através de uma formação de liberação controlada. Nesse caso, o polipeptídeo contido em cada subdose deve ser correspondentemente menor a fim de alcançar a dosagem diária total. A unidade de dosagem também pode ser composta para entrega ao longo de diversos dias, por exemplo, com o uso de uma formulação de liberação sustentada, que fornece a liberação sustentada do polipeptídeo ao longo de um período de diversos dias.

[00238] Formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para entrega de agentes em um sítio particular, tal como deve ser usado com as composições de poli- peptídeo da presente invenção. O efeito de uma dose única pode ser duradouro, de modo que doses subsequentes sejam administradas em não mais do que 3, 4 ou 5 intervalos de dia, ou em não mais do que 1, 2, 3 ou 4 intervalos de semana.

[00239] O polipeptídeo pode ser administrado por infusão intravenosa ao longo de um período de tempo, tal como ao longo de um período de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos ou 25 minutos. A administração pode ser repetida, por exemplo, em uma base regular, tal como bissemanal (isto é, a cada duas semanas) durante um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Por exemplo, após a administração bissemanal durante três meses, a administração pode ser repetida uma vez por mês, durante seis meses ou um ano ou mais. A administração do poli- peptídeo ou da composição pode reduzir, diminuir, aumentar ou elevar a ligação ou qualquer processo fisiologicamente deletério, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento de um paciente por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou mais.

[00240] Antes da administração de uma dose completa do polipep- tídeo e/ou da composição de polipeptídeo, os pacientes podem ser administrados com uma dose menor, tal como 5% de uma dose completa, e monitorados para efeitos adversos, tais como uma reação alérgica ou reação à infusão, ou para níveis de lipídio ou pressão sanguínea elevados. Em outro exemplo, o paciente por ser monitorado para efeitos imunoestimulatórios indesejados, tais como aumento de níveis de citocina (por exemplo, TNF-alfa, Il-1, Il-6 ou Il-10).

[00241] A predisposição denética desempenha um papel no desen-volvimento de algumas doenças ou distúrbios. Portanto, um paciente que precisa de um polipeptídeo e/ou composição de polipeptídeo pode ser identificado tomando-se um histórico familiar, ou, por exemplo, triagem para um ou mais marcadores ou variantes genéticas. Um fornecedor de serviços de saúde, tal como um médico, uma enfermeira ou membro da família, pode tomar um histórico familiar antes de prescrever ou administrar uma composição terapêutica da presente invenção. Kits

[00242] Qualquer uma das composições descritas no presente documento pode estar compreendida em um kit. Em um exemplo não limitativo, os polipeptídeos podem ser incluídos em um kit para tratar uma doença. O kit pode incluir uma ampola de pó de polipeptídeo seco estéril, uma solução estéril para dissolver o pó seco e uma seringa para conjunto de infusões para administrar o polipeptídeo.

[00243] Quando polipeptídeos forem fornecidos como um pó seco, contempla-se que entre 10 microgramas e 1.000 miligramas de poli- peptídeo, ou pelo menos ou no máximo essas quantidades são fornecidas em kits da invenção

[00244] Os meios de recipiente geralmente incluirão pelo menos uma ampola, um tubo de teste, um frasco, uma garrafa, uma seringa e/ou outro meio de recipiente, no qual as formulações de polipeptídeo são colocadas, preferencialmente, adequadamente alocadas. Os kits também podem compreender um segundo meio de recipiente para conter um tampão farmaceuticamente aceitável estéril e/ou outro dilu- ente.

[00245] Um kit pode incluir instruções para implantar os componentes de kit assim como o uso de qualquer outro reagente não incluído no kit. As instruções podem incluir variações que podem ser implantadas.

[00246] Embora várias modalidades da invenção tenham sido parti-cularmente mostradas e descritas, será compreendido pelas pessoas versadas na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas nas mesmas sem se desviar do espírito e escopo da invenção conforme definido pelas reivindicações anexas.

EQUIVALENTES E ESCOPO

[00247] As pessoas versadas na técnica reconhecerão, ou terão capacidade de determinar com o uso de mais do que experimentos de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas, de acordo com a invenção descrita no presente documento. O escopo da presente invenção não se destina a ser limitado à descrição acima, mas sim conforme é apresentado nas reivindicações anexas.

[00248] Nas reivindicações, artigos tais como "um", "uma", "o" e "a" podem significar um ou mais do que um a menos que indicado ao con-trário ou esteja evidente de outra forma a partir do contexto. As reivin-dicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um ou os membros do grupo estão presentes, são empregados ou de outra forma relevantes a um dado produto ou processo a mesmos que indicado ao contrário ou esteja evidente de outra forma a partir do contexto. A invenção inclui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente, empregado ou de outra forma relevante a um dado produto ou processo. A invenção inclui modalidades nas quais mais do que um, ou todos os membros do grupo estão presentes, empregados ou de outra forma relevantes a um dado produto ou processo.

[00249] Também se observa que o termo "que compreende" se destina ser aberto e permite, mas não exige, a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Quando o termo "que compreende"é usado no presente documento, os termos "que consiste em" e "ou que inclui"são, assim, também abrangidos e revelados.

[00250] Onde intervalos são fornecidos, pontos finais estão incluídos.Além disso, também deve-se compreender que a menos que de outra forma indicado, ou de outra forma evidente a partir do contexto e da compreensão de uma pessoa versada na técnica, valores que são expressados como faixas podem assumir qualquer valor específico ou subfaixa dentro das faixas mencionadas em diferentes modalidades da invenção, até o décimo da unidade do limite inferior da faixa, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.

[00251] Além disso, deve-se compreender que qualquer modalidade particular da presente invenção que se encaixe na técnica anterior pode ser explicitamente excluída a partir de qualquer uma ou mais dentre as reivindicações. Visto que tais modalidades são consideradas como sendo conhecidas por uma pessoa versada na técnica, as mesmas podem ser excluídas mesmo que a exclusão não seja apresentada explicitamente no presente documento. Qualquer modalidade parti cular das composições da invenção (por exemplo, qualquer ácido nu- cleico ou proteína criptada através do mesmo; qualquer método de produção; qualquer método de uso; etc.) pode ser excluída de qualquer uma ou mais reivindicações, por qualquer razão, que esteja ou não relacionada à existência da técnica anterior.

[00252] Todas as fontes mencionadas, por exemplo, referências, publicações, bancos de dados, entrada de banco de dados e técnica citadas no presente documento, estão incorporadas neste pedido a título de referência, mesmo que não esteja expressamente estabelecido na citação. Em caso de declarações conflituosas de uma fonte mencionada e do presente pedido, a declaração no presente pedido deve controlar.

[00253] Os cabeçalhos de seção e de tabela não se destinam a ser limitativos.

EXEMPLOS Exemplo 1. Preparação de C5 biotinilado

[00254] Uma razão molar final eficaz entre C5 e biotina de 1:4 foi usada para biotinilação em grande escala. Uma solução de 10 mm de EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotina (Thermo Scientific, Billerica, MA) foi preparada conforme as instruções do fabricante. Para 1 mg de 1 mg/ml de C5 (Complement Tech, Tyler TX), 2,1 µl da solução de 10mm de biotina foram adicionados e incubados em gelo durante 2 horas. A reação foi recozida durante 30 minutos a 4 °C após a adição de 100 µl de Tris a 1 M de HCl pH de 7,5. A reação foi dialisada durante a noite contra PBST frio (solução fisiológica tamponada com fosfato (PBS) + 0,1% de Tween 80). O C5 biotinilado foi aliquotado e armazenado a -80 °C. O C5 biotinilado foi distinguido por SDS-PAGE sob condições de redução e não redução e distinguido para atividade por um ensaio de hemólise de glóbulos vermelhos. O C5 biotinilado também foi verificado para recuperação em microesferas de estreptavidina (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). A captura foi realizada com o uso de condições recomendadas pelo fabricante. Para capturar 4 µg de C5 biotinilado a partir de uma solução de 100 nm, 40 µl de pasta aquosa de microesfera foram usados e incubados a 4 °C durante 1 hora. A concentração do C5 biotinilado capturada foi calculada executando-se uma quantidade conhecida de C5 em um NuPage de 4 a 12% de BisTris gel (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA).

Exemplo 2. Ensaio de hemólise humana para QC de C5 biotinilado

[00255] Um ensaio de hemólise foi realizado com soro depletado de C5 e C5 biotinilado e C5 não biotinilado para comparar as atividades de lise de C5 antes e depois da biotinilação. Eritrócitos de ovelha sensibilizados por anticorpo (Complement Technology, Tyler, TX, EUA) em solução a 5 x 108células/ml foram centrifugados a 2.090 x gravi-dade durante 3 minutos e ressuspensos em tampão GVB++ (Complement Technology, Tyler, TX, EUA). Soro humano depletado de C5 (Complement Technology, Tyler, TX, EUA) foi rapidamente descongelado a 37 °C e colocado em gelo até diluído em GVB++. A proteína C5 não biotinilada (Complement Technology, Tyler, TX, EUA) e a proteína C5 biotinilada (biotinilação interna) foram rapidamente descongeladas a 37 °C e colocadas em pasta aquosa de gelo úmido até diluídas em GVB++. 100 µl de células (a uma concentração final de 2,5 x 107 célu- las/ml) foram combinadas com soro humano depletado de C5 e 50 µl de C5 biotinilado ou C5 não biotinilado (com concentrações finais de 10 µg/ml, 3 µg/ml ou 1 µg/ml) em uma placa de microtitulação de 96 cavidades transparente tratada por cultura de tecido (USA Scientific, Ocala, FL). A placa foi incubada durante 1 hora a 37 °C. Após a incubação, placas foram, então, centrifugadas a 2.090 x gravidade durante 2 minutos antes de transferir 100 µl de supernatante para uma nova placa de microtitulação. A absorvância foi lida em 412 nm e a porcentagem de atividade de lise de C5 não biotinilado e C5 biotinilado foi comparada.

Exemplo 3. A seleção de polipeptídeos que se ligam a C5

[00256] Inibidores de C5 foram identificados através de diversas séries de exibição e seleção de mRNA. A exibição de mRNA foi realizada geralmente conforme descrito (Roberts, R.W., e Szostak, J.W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12.297-12.302; documento no WO2009067191; incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência) com modificações conforme descrito no presente documento. Grupamentos de RNA foram gerados por transcrição in vitro a partir de DNA sintetizado com códons fixos de metionina e cisteína N-terminais, seguido por três posições de uma mistura de dezesseis códons de fosforamidita, seguido por oito posições de uma segunda mistura de códons que também contém o códon de cisteína. A biblioteca de mRNA resultante tem uma metitionina inicial fixa seguida por um resíduo de cisteína, seguido por três posições carentes de cisteína, seguido por oito posições nas quais cisteína ocorre com uma frequência de 12,5%. Para conduzir a seleção, a primeira série de enriquecimento compreendeu uma primeira etapa na qual grupamentos de RNA que contêm um oligonucleotídeo reticulado por UV de terminal 3’ que contém puromicina foram traduzidos in vitro com os componentes de tradução purificados listados na Tabela 2. A tradução foi realiza sob duas condições separadas para gerar duas bibliotecas exclusivas com base em variação de aminoácido. A primeira afecção utilizou somente os 20 aminoácidos naturais enquanto a segunda afecção utilizouaminoácidos naturais (0,1 mm de histidina, treonina, prolina, lisina, asparagina, tirosina, ácido glutâmico e cisteína), aminoácidos não naturais (2 mm de tercbutil-glicina (Tbg), 0,8 mm de 7-azatriptofano (abreviado para "azaTrp" nesse exemplo) e 1 mm de norvalina (Nvl), azaleucina e fenil-glicina (Phg)) e N-metil aminoácidos (mistura de 450 µm de N-serina metilada [(N-Me)S], alanina [(N-Me)A], glicina [(N- Me)G] e 4-fluoro-N-metilfenilalanine [(N-Me-4-F)Phe]). Resíduos de cisteína marcados com 35S foram incluídos em ambas as condições para permitir o monitoramento de enriquecimento de polipeptídeo por série. Tabela 2. Componentes de tradução in vitro

[00257] Os tRNAs foram carregados enzimaticamente com seus respectivos aminoácidos com o uso de tRNA sintetases. Os quatro N- metil tRNAs foram pré-carregados, enquanto todos os outros tRNAs foram enzimaticamente carregados durante a reação de tradução in vitro. As tRNA sintetases foram adicionadas em uma base de volume independente de suas concentrações. 0,1 µl de cada tRNA sintetase (exceto para metionina tRNA sintetase, que foi adicionada a 0,4 µl por 25 µl de reação de tradução) foi adicionado para carregamento in situ durante a tradução para uma reação de tradução de 25 µl. mRNA reticulado foi adicionado a uma concentração final de 0,75 µM. A reação de tradução foi mantida a 37 °C por 1 hora. Após a tradução, a fusão dos polipeptídeos traduzidos a seus respectivos mRNAs foi executada adicionando-se alto teor de sal à mistura de tradução e incubando-se a 37 °C por 1,5 hora. Uma biblioteca para a seleção de polipeptídeos naturais foi preparada a partir de oito bibliotecas individuais com um códon de cisteína fixo nas posições 5 a 11. As posições aleatórias nessas bibliotecas, com todos os 20 aminoácidos possíveis, foram realizadas de modo combinatório com as unidades de códon de repetição de NNS (N é A,G,C ou T; S é G ou C) (Devlin, J.J., et. al., (1990). Science 249, 404 a 406.) A tradução dessas bibliotecas em polipeptídeos naturais foi realizada com o uso de um kit de tradução in vitro de reti- culócito de coelho em vez do sistema reconstituído descrito acima.

[00258] A recuperação dos polipeptídeos exibição em mRNA foi realizada com o uso de afinidade tanto de Oligo dT como de Ni-NTA, para isolar moléculas de fusão contendo tanto polipeptídeos etiquetados com His como poliA mRNA. Os polipeptídeos ligados a microesfera Oligo dT foram, então, ciclizados com dibromoxileno conforme descrito por outros (J. Am. Chem. Soc. 127:1 1.727 (2005)).

[00259] A seleção direta dos polipeptídeos por afinidade alvo foi, então, realizada. Os polipeptídeos exibidos em mRNA foram deixados se ligar por 1 hora a 4 °C a C5 biotinilado em uma solução a 100 nM de C5 biotinilado em PBST. O RNA correspondente aos polipeptídeos selecionados por afinidade foi transcrito reversamente e amplificado por PCR para criar um grupamento de DNA de dupla hélice. O grupamento de DNA foi transcrito in vitro para gerar mRNA, e o mRNA produzido foi reticulado como anteriormente em sua terminação 3’ com um oligonucleotídeo contendo puromicina. As fusões de mRNA- puromicina foram submetidas à tradução in vitro para gerar a segunda série da biblioteca, que está agora enriquecida em polipeptídeos que ligam o componente complementar C5. O ciclo de seleção foi repetido por seis séries. Após a sexta série, o grupamento de DNA que representa os polipeptídeos selecionados foi clonado e sequenciado, e as sequências de aminoácidos de inibidores de C5 candidatos foram determinadas com base nas sequências de DNA. As sequências de poli- peptídeos identificadas estão listadas na Tabela 3.

[00260] Conforma uado em todas as tabelas seguintes assim como na listagem de sequências, as abreviações têm os seguintes significa-dos:"Ac" e "NH2" indicam as terminações acetil e amidada, respecti-vamente;"Nvl" significa norvalina; "Phg" significa fenilglicina; "Sar"sig-nifica sarcosina; "Tbg" significa terc-butilglicina; "Trt" significa tritila ou trifenilmetila; "Chg" significa ciclo-hexilglicina; "(N-Me)X" significa a forma N-metilada do aminoácido indicado pela letra ou pela abreviação de três letras para esse aminoácido no lugar da variável "X" escrita como N-metil-X [por exemplo, (N-Me)A e (N-Me)Ala ambos significam a forma N-metilada de alanina ou N-metil-alanina]; 7-aza-triptofano é incorporado nos casos em que "azaTrp"é indicado; "(4-F)Phe"significa 4-fluorofenilalanina; "Tyr(OMe)" significa O-metil tirosina, "Aib"significaácido amino isobutírco; "(homo)F" or "(homo)Phe" significa homo- fenilalanina; "(2-OMe)Phg" refere-se a 2-O-metilfenilglicina; "Propar- gilGly" refere-se a propargil-glicina; "(5-F)W" ou "(5-F)Trp" refere-se a 5-fluorotriptofano; "D-X" refere-se ao esteroisômero D do dado amino- ácido "X", em que o aminoácido pode ser abreviado com o uso de um código de uma ou três letras [por exemplo, (D-Chg) significa D-ciclo- hexilglicina e (D-W) significa D-triptofano]; "(5-MeO)W" ou "(5- MeO)Trp" refere-se a 5-metil-O-triptofano; "homoC" refere-se a homo- cisteína; "(1-Me-W)" ou "(1-Me)W" ou "(1-Me-Trp)" ou "(1-Me)Trp"refere-se a 1-metiltriptofano; "Nle" refere-se a norleucina; ácido 1,2,3,4- tetra-hidroisoquinolina-1-carboxílico está incorporado nos casos em que "Tiq"é indicado; "Asp(T)" refere-se a ácido (S)-2-amino-3-(1H- tetrazol-5-il)propanoico; "(3-Cl-Phe)" refere-se a 3-clorofenilalanina; "[(N-Me-4-F)Phe]" ou "(N-Me-4-F)Phe" refere-se a N-metil-4- fluorofenilalanina; "Boc"é um grupo protetor terc-Butiloxicarbonila; "[xXilil(y, z)]" refere-se à porção química de ligação em ponte entre duascisteínas, em que x pode ser m, p ou o para indicar o uso de meta, para ou orto-dibromoxilenos (respectivamente) para gerar porções de ligação m ponte e os identificadores numéricos, y e z, indicam a posição do aminoácido dentro do polipeptídeo das cisteínas que participam da ciclização; "[ciclo(y,z)]" refere-se à formação de uma ligação entre dois resíduos, em que os indicadores numéricos, y e z, indicam a posição dos resíduos que participam da ligação; "[mXilil-biciclo]" indica que o polipeptídeo compreende dois laços e que a porção de ligação em ponte é gerada por reação com um meta-dibromoxileno. Todos os outrossímbolos referem-se ao código de aminoácido de uma letra padrão. Adicionalmente, os polipeptídeos que compreendem as etiquetas de sequência PEG2000 ou BODIPY-TMR-X são indicados. Tabela 3. Sequências de polipeptídeos

Exemplo 4. Síntese de polipeptídeo

[00261] Os polipeptídeos são sintetizados com o uso de métodos de Fmoc/tBu de fase sólida padrão. A síntese é tipicamente realizada em um sintetizador de peptídeo de micro-ondas automatizado Liberty (CEM, Matthews NC) com o uso de protocolos padrão com resina de amida Rink, embora outros sintetizadores automatizados sem capacidade de micro-ondas possam ser também usados. Todos os aminoá- cidos são obtidos junto a fontes comerciais a não ser que indicado de outro modo. O reagente de acoplamento usado é hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3,-tetrametilamínio (HCTU), e a base é diisopropiletilamina (DIEA). Os polipeptídeos são clivados da resina com 95% de TFA, 2,5% de TIS e 2,5% de água por 3 horas e isolados por precipitação com éter. Os polipeptídeos brutos são purificados em uma HPLC preparativa de fase reversa com o uso de uma coluna C18, com um gradiente de acetonitrila/água 0,1% de TFA de 20% a 50% durante 30 min. As frações contendo o polipeptídeo puro são coletadas e liofilizadas, e todos os polipeptídeos são analisados por LC-MS.

Exemplo 5. Formação de polipeptídeos ciclizados por dissulfeto

[00262] Para produzir polipeptídeos ciclizados por dissulfeto, o poli- peptídeo linear é dissolvido em uma mistura de água e DMSO, e a solução resultante é agitada vigorosamente sob uma atmosfera de ar por 12 horas.

Exemplo 6. Ciclização de polipeptídeo de dibromoxileno

[00263] Um frasco de 100 ml é carregado com acetonitrila (12 ml) e água (24 ml) e é desgaseificado com argônio por cerca de 5 min. Poli- peptídeo linear (0,01 mmol) e bicarbonato de amônio a 200 mM (6 ml) são adicionados seguidos por 0,012 mmol ou 1,3-bis(bromometil) benzeno, 1,2-bis(bromometil)benzeno, 1,4-bis(bromometil)benzeno, 2,6- bis(bromometil)piridina ou (E)-1,4-dibromobut-2-eno. A mistura de reação é agitada sob argônio à temperatura ambiente por aproximadamente 2 horas e monitorada por LC-MS. Após a reação ser concluída, a solução de reação é congelada e liofilizada. A purificação por HPLC do produto cru liofilizado seguida por liofilização das frações contendo polipeptídeo puro renderam o produto ciclizado final como um pó branco.

Exemplo 7. Ciclização de polipeptídeo de lactama

[00264] A ciclização de polipeptídeos com o uso de uma porção química lactama foi realizada na fase sólida. Um polipeptídeo foi primeiramente sintetizado em uma resina Wang de suporte sólido por química de Fmoc padrão. Fmoc-ASP(alil)-OH e Fmoc-LYS(alloc)-OH foram incorporados no polipeptídeo nas posições indicadas como os dois monômeros precursores para a formação de ponte de lactama. Após alongamento completo, a resina foi lavada com diclorometano seco (3x) e purgada com gás nitrogênio seco por 10 min. Para remover os grupos protetores alila e alloc, a resina foi tratada com um excesso molar de 5 vezes de fenilsilano e purgada com nitrogênio por 10 min. Uma quantidade catalítica de tetracis Pd(0) foi dissolvida em di- clorometano seco e adicionada à suspensão de resina. Após uma hora, a resina foi lavada sequencialmente com diclorometano (3x), dime- tilformamida (3x), dietilditiocarbamato de sódio tri-hidrato (3x), dimetil- formamida (3x) e diclorometano (3x). A ciclização de lactama foi atingida em dimetilformamida (DMF) tratando-se a resina contendo poli- peptídeo desprotegido com PyAOP (hexafluorofosfato de (3-Hidroxi- 3H-1,2,3-triazol[4,5-b]piridinato-O)tri-1-pirrolidinil-fósforo) e diisopropi- letilamina e deixado reagir de um dia para o outro. A resina foi enxaguada com DMF e tratada com PyAOP e diisopropiletilamina frescos por mais 60 minutos a 45 °C. A resina foi enxaguada e lavada com di- metilformamida cinco vezes. O polipeptídeo foi clivado e purificado conforme descrito no exemplo 4.

Exemplo 8. Ciclização de polipeptídeo de triazol

[00265] A ciclização de polipeptídeos contendo azida e uma porção química alcino foi realizada na fase sólida. A resina contendo polipep- tídeo (0,05 mmol) foi tratada com diclorometano e deixada expandir por 10 min. O solvente foi, então, trocado para DMF (3 a 5 ml) e, após 10 min, uma solução de ligante Cu-TBTA foi adicionada (125 µl de uma solução a 20 mM). A suspensão foi purgada com gás argônio e, então, ácido ascórbico (5 µmoles) foi adicionado. A solução foi agitada por 2 h, e os reagentes em excesso removidos, a resina foi lavada com uma solução de EDTA em DMF para remover o cobre em excesso. O polipeptídeo foi clivado e purificado conforme descrito no Exemplo 4.

Exemplo 9. Polipeptídeos da presente invenção

[00266] Os polipeptídeos da presente invenção foram sintetizados. Os mesmos incluem os compostos listados na Tabela 4. Tabela 4. Compostos da invenção

[00267] Os polipeptídeos R3183 (SEQ ID NO: 184) e R3193 (SEQ ID NO: 194) foram sintetizados de acordo com as sequências de ami- noácidos de R3176 (SEQ ID NO: 177) com a exceção da substituição de Nvl-NH2 por Lys. O grupo amina de cadeia lateral do resíduo Lys foi modificado com as diferentes porções químicas liofílicas resultando em polipeptídeos lipidados.

Exemplo 10. Otimização e teste de inibidores de C5

[00268] Os polipeptídeos selecionados de acordo com o Exemplo 3 e listados na Tabela 3 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a lise celular mediada por complemento. Adicionalmente, uma variedade de polipeptídeos otimizados foi sintetizada de acordo com os métodos dos Exemplos 4 a 8 e testada também (consultar a Tabela 4). As sequências de polipeptídeos otimizadas incluem aquelas obtidas produzindo-se uma variedade de truncamentos, deleções, adições e/ou substituições aos compostos R3002 (SEQ ID NO: 3), R3008 (SEQ ID NO: 9) e R3021 (SEQ ID NO: 11) ou através da formação de polipeptídeos híbridos que compreendem combinações de regiões selecionadas dentre qualquer um dos três. Ensaio de hemólise humana (ensaio de lise de RBC com o uso de soro humano completo)

[00269] Os polipeptídeos listados na Tabela 3, assim como seus derivados otimizados (consultar a Tabela 4), foram avaliados quanto à atividade inibitória com o uso de um ensaio de hemólise de glóbulos vermelhos. Eritrócitos de ovelha sensibilizados para anticorpo (Com-plement Technology, Tyler, TX) foram colocados em placas a 2,5 x 107 células/cavidade com soro humano completo (Complement Technology, Tyler TX) e polipeptídeos para determinar o efeito inibitório dos polipeptídeos sobre a lise de glóbulos vermelhos. As células foram centrifugadas por 3 minutos a 2.090 x gravidade e ressuspensas em tampão GVB++ fresco (Complement Technology, Tyler TX). O soro humano foi rapidamente descongelado a 37 °C e, então, armazenado em gelo até ser diluído em GVB++. Dez diluições em série em 6 vezes de polipeptídeos (10 mM de solução estoque, DMSO) foram realizadas em DMSO e, então, adicionadas ao tampão. 50 µl de cada diluição de polipeptídeo foram combinados com soro e 100 µl de células em cavi- dades individuais de uma placa de microtitulação clara tratada com cultura de tecido de 96 cavidades (USA Scientific, Ocala, FL) e res- suspensos por pipetagem. As amostras foram incubadas a 37 °C por uma hora. Após a incubação, as placas foram centrifugadas a 2.090 x gravidade por 2 minutos. 100 µl de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa, e a absorbância foi lida a 412 nm. Os dados foram ajustados com uma fórmula log-logística, produzindo uma curva de resposta por dose e IC50. Conforme usado no presente documento, o termo "IC50" refere-se à metade da concentração inibitória máxima, um valor usado para indicar a quantidade de inibidor necessária para reduzir uma dada reação ou processo pela metade. Os compostos testados são listados na Tabela 5. Tabela 5. Compostos analisados

Exemplo 11. Ensaio de hemólise humana alternativa com o uso de soro depletado de C5

[00270] Os polipeptídeos listados na Tabela 6 foram testados quanto à atividade funcional em um ensaio de hemólise de glóbulos vermelhos com o uso de soro depletado de C5 humano e C5 humano purificado em vez do soro humano completo. Para avaliar a atividade, eri- trócitos de ovelha sensibilizados para anticorpo (Complement Technology, Tyler, TX) foram colocados em placas a 2,5 x 107célu- las/cavidade com 1,5% de soro depletado de C5 humano (Complement Technology, Tyler, TX) e 0,5 nM de C5 humano purificado (Complement Technology, Tyler, TX). Os eritrócitos de ovelha sensibilizados para anticorpo foram centrifugados a 2.090 x gravidade por 3 minutos e, então, ressuspensos em GVB ++ fresco (Complement Technology, Tyler, TX). O soro depletado de C5 humano e C5 humano purificado foram rapidamente descongelados a 37 °C e, então, armazenados em gelo ou gelo úmido, respectivamente. A solução estoque de polipeptí- deo (10 mM, DMSO) foi diluída em série em DMSO a fim de obter 10 diluições em 6 vezes e, então, GVB++ foi adicionado às mesmas. 50 µl de cada diluição de polipeptídeo foram combinados com 25 µl de soro depletado de C5, 25 µl de C5 humano purificado e 100 µl de células em cavidades individuais de uma placa de microtitulação clara tratada com cultura de tecido de 96 cavidades (USA Scientific, Ocala, FL) e ressuspensos por pipetagem. As amostras foram incubadas a 37 °C por uma hora. Ao concluir a incubação, as placas foram centrifugadas a 2.090 x gravidade por 2 minutos. 100 µl de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa, e a absorbância foi lida a 412 nm. Os dados foram ajustados com uma fórmula log-logística, produzindo uma curva de resposta por dose e IC50. Tabela 6. Compostos analisados

Exemplo 12. Imunoensaio de enzima para avaliar a inibição de C5

[00271] A atividade inibitória de C5 foi avaliada por imunoensaio de enzima (EIA). A inibição da produção de C5a e o complexo de ataque de membrana (MAC) foram medidos por kits MicroVue EIA (Quidel Corporation, San Diego, CA).

EIA de C5a

[00272] Sobrenadante de um ensaio de hemólise de RBC humano de R3002 (SEQ ID NO: 3) e R3008 (SEQ ID NO: 9) foi diluído a 1:50 e avaliado por EIA de C5a (Figura 1). Ambos os polipeptídeos inibiram a formação de C5a. R3002 (SEQ ID NO: 3) teve um IC50 de 5,4 nM, R3008 (SEQ ID NO: 9) teve um IC50 de 54,5 nM.

EIA de complexo de ataque de membrana (MAC)

[00273] O EIA de MAC foi realizado no sobrenadante diluído (1:5) de R3008 (SEQ ID NO: 9) de um ensaio de hemólise de RBC humano (Figura 2). Esse polipeptídeo mostrou inibir a formação do MAC com um IC50 de 33 nM.

Exemplo 13. Caracterização de ligação peptidomimética por polarização de fluorescência

[00274] A polarização de fluorescência (FP) permite que eventos de ligação sejam medidos em uma solução homogênea (Banks, P. et al., Impact of a red-shifted dye label for high throughput fluorescence pola-rization assays of G protein-coupled receptors. J Biomol Screen. Outubro de 2000;5(5):329 a 334 e Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays. J Biomol Screen. Abril de 2000;5(2):77 a 88). O conceito principal de FP é que o grau em que um fluoróforo polariza a luz está inversamente relacionado a sua rotação molecular (Lea, W.A. et al., Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert Opin Drug Discov. Janeiro de 2011;6(1):17 a 32), e um fluoróforo ligado a uma proteína-alvo muito maior gira mais lentamente que um fluoróforo não ligado, resultando em um aumento em polarização que pode ser quantificado. A FP tem sido usada de modo crescente em campanhas de alto rendimento como um método para medir a ligação entre ligante e alvo (Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and ki- nase/phosphatase assays. J Biomol Screen. Abril de 2000;5(2):77 a 88), para determinação de constante de dissociação em equilíbrio (KD) (Prystay, L. et al., Determination of equilibrium dissociation constants in fluorescence polarization. J Biomol Screen. Junho de 2001;6(3):141 a 150), e levou à revelação através de ensaios de ligação competitiva (Tian, W. et al., Development of novel fluorescence polarization-based assay for studying the ß-catenin/Tcf4 interaction. J Biomol Screen. Abris de 2012;17(4):530 a 504). Materiais e métodos

[00275] A FP foi usada para triar inibidores de polipeptídeo competitivos da proteína C5. A sonda R3076 (SEQ ID NO: 40) foi gerada incubando-se o polipeptídeo original, R3072 (SEQ ID NO: 20), com BO- DIPY-TMR-X, SE (Life Technologies, Grand Island, NY) in DMF (Sigma, Saint Louis, MO) por 4 horas. O corante BODIPY-TMR ligou-se à lisina C-terminal da proteína e a sonda identificada subsequente foi purificada por HPLC.

[00276] A constante de dissociação em equilíbrio (KD) para ligação de R3076 (SEQ ID NO: 40) à proteína C5 humana (Complement Technology, Tyler, TX) foi determinada incubando-se uma solução de 25 nM de R3076 (SEQ ID NO: 40) com concentrações crescentes de proteína C5. A polarização foi medida ao longo do tempo, até a ligação atingir o equilíbrio. A KD foi determinada com o uso de Graphpad Prism (com o uso de "Curvas de Ligação por Saturação, Um Sítio - Ligação Específica com Inclinação" como o ajuste de curva para determinar a KD). O específico foi atingido após 10 minutos, com valores para KD, inclinação e ligação máxima permanecendo estáveis durante 60 minutos. Um valor de KD final de 8,07 nM (0,53 de desvio padrão) foi determinado calculando-se a média de valores de KD de 10 a 60 minutos. Com base nessas informações, concentrações de 25 nM e 50 nM para R3076 (SEQ ID NO: 40) e proteína C5, respectivamente, foram escolhidas para uso no ensaio de competição. Essas concentrações representaram o nível aproximado de proteína necessário para 95% de ligação de sonda à proteína C5. R3023 (SEQ ID NO: 104) é uma variante de polipeptídeo embaralhada de R3002 (SEQ ID NO: 3) e foi incluída em todos os ensaios como um controle negativo.

[00277] A proteína humana C5 foi diluída até 200 nM em tampão de ensaio, composto por TBS (EMD Millipore, Billerica, MA) + 0,005% de Triton-X (Sigma, Saint Louis, MO). 10 µl de tampão de ensaio foram adicionados a as cavidades de uma placa de ensaio de 384 cavidades, de não ligação, preta (Greiner, Monroe, NC) e 10 µl de solução estoque de proteína C5 diluída foram adicionados às cavidades de controle experimentais e projetadas.

[00278] A sonda R3076 (SEQ ID NO: 40) foi diluída a 1 para 10 em DMSO (Life Technologies, Grand Island, NY) e 30 µl dessa solução estoque foram diluídos em 3 ml de tampão de ensaio para render uma solução estoque a 100 nM. 10 µl dessa solução estoque de trabalho foram, então, adicionados a cada cavidade na placa de ensaio. A placa de ensaio foi incubada à temperatura ambiente, protegida da luz, por 20 minutos para permitir que a ligação atinja o equilíbrio.

[00279] Os artigos de teste listados na Tabela 7 foram subsequentemente diluídos em DMSO, então, tampão de ensaio, compreendendo 10 diluições em 2 vezes, e foram, então, adicionados à placa de no em triplicata, rapidamente. A placa de ensaio foi, então, incubada no leitor de placa Paradigm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) por 60 minutos a 25 °C.

[00280] Após a incubação por 60 minutos, a placa foi liga com o uso do protocolo de FP Paradigm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e os valores de polarização brutos foram importados para Graphpad Prism. Ki (com o uso do modelo de ajuste de Curva Ki de Um Sítio, concentração de sonda = 25 nM, KD = 8,07 nM, com linha de base restrita à média do controle de ligação a 0%) e IC50 (inibidor vs resposta em log, ajuste de curva com 4 parâmetros) foram determinados em Gra- phpad.

Resultados

[00281] Todos os artigos de teste tiveram capacidade de competir com a sonda identificada pela ligação à proteína humana C5 (Figura 3, Tabela 7). R3003 (SEQ ID NO: 4) foi o polipeptídeo mais potente testado, com um valor de Ki de 9,54 nM. A ligação de R3023 (SEQ ID NO: 104) não foi detectada na concentração mais alta testada. Tabela 7. Dados de polarização de fluorescência competitive

[00282] Os dados mostrados na Tabela 7 foram obtidos a partir da análise de ajuste de curva realizada pelo software Graphpad Prism, conforme descrito acima. Os valores em triplicata tiveram a média calculada para render os pontos de dados apresentados em cada experimento. Dos polipeptídeos testados, R3003 (SEQ ID NO: 4) foi identificado originalmente por seleção de exibição de mRNA. A afinidade de R3003 (SEQ ID NO: 4) para C5 foi verificada pelos resultados da análise de FP que exibiu valores baixos de Ki assim como IC50. Os inibidores R3011 (SEQ ID NO: 31) e R3050 (SEQ ID NO: 23) também exibiram afinidade relativamente forte para C5. Um polipeptídeo de controle, R3023 (SEQ ID NO: 104), exibiu afinidade para C5, enquanto os inibidores R3014 (SEQ ID NO: 55) e R3043 (SEQ ID NO:50) exibiram afinidade fraca.

Exemplo 14. Análise de estabilidade de composto em plasma

[00283] Os compostos foram avaliados quanto à estabilidade em plasma humano sob as seguintes condições. O plasma humano foi obtido junto à Bioreclamation (Westbury, NY) e coletado em heparina sódica. O plasma foi ajustado a pH 7,4. Soluções estoque de DMSO em concentração de 10 mM foram preparadas para os compostos de teste. Alíquotas das soluções de DMSO foram dosadas em 1 ml de plasma, que foi pré-amornado até 37 °C, a uma concentração final de composto de teste de 10 µM. Os frascos foram mantidos em uma bancada Thermomixer® (Eppendorf, Hauppauge, NY) pela duração do experimento. As alíquotas (100 µl) foram coletadas em cada ponto no tempo e adicionadas a uma placa de 96 cavidades que foi pré- preenchida com 300 µl de uma mistura contendo solução de acetonitri- la dos padrões internos (metoprolol, propranolol e varfarina, cada um a 500 ng/ml). As amostras foram armazenadas a 4 °C até o final do experimento. Após o ponto no tempo final ter a amostra coletada, a placa foi misturada e, então, centrifugada a 3.000 rpm por 10 minutos. As alíquotas do sobrenadante foram removidas e analisadas por LC- HRAMS. As definições da cromatografia líquida estão listadas na Tabela 8, e as definições da espectrometria de massa estão listadas na Tabela 9. Tabela 8. Definições da cromatografia líquida Tabela 9. Definições da espectrometria de massa

[00284] A concentração do composto de teste R3050 (SEQ ID NO: 23) foi determinada por comparação a uma curva de calibração anteri-ormente determinada (Tabela 10). Tabela 10. Perfil de estabilidade

[00285] Sob essas condições, R3050 (SEQ ID NO: 23) mostrou ser altamente estável.

Exemplo 15. Variantes de polipeptídeo que compreendem análogos de triptofano

[00286] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção compreendem 7-azatriptofano. Para determinar a importância desse resíduo na inibição de C5, foi executada uma análise de substituição de aminoácido em que 7-azatriptofano foi substituído por triptofano natural assim como vários outros análogos de triptofano, incluindo 5-fluorotriptofano [(5-F)W], 1-metil-triptofano [(1-Me)W], D- triptofano e 5-metil-O-triptofano [(5-MeO)W]. Polipeptídeos similares com substituições de não triptofano foram também analisados.

[00287] Variantes de polipeptídeo R3002 (SEQ ID NO: 3) e R3008 (SEQ ID NO: 9) foram sintetizadas e testadas quanto á sua capacidade de inibir a lise de glóbulos vermelhos, conforme descrito no Exemplo 10 (consultar as Tabelas 11 e 12). Das variantes testadas, todas com substituição do resíduo de 7-azatriptofano demonstraram uma capacidade aumentada de inibir a lise de glóbulos vermelhos, conforme indicado por aumento de valores médios de IC50 (uma medida da metade da concentração inibitória máxima, um valor usado para indicar a quantidade do inibidor necessária para reduzir uma dada reação ou processo pela metade). Tabela 11. Polipeptídeos de variante de 7-azatriptofano de R3002 (SEQ ID NO: 3) analisados por ensaio de hemólise humana Tabela 12. Polipeptídeos de variante de 7-azatriptofano de R3008 (SEQ ID NO: 9) analisados por ensaio de hemólise humana

Exemplo 16. Efeito de truncamento de polipeptídeo e deleção de ami- noácido analisado por ensaio de hemólise humana

[00288] Variantes de polipeptídeo truncadas no C-terminal de R3021 (SEQ ID NO: 11) foram sintetizadas e avaliadas pelo ensaio de hemólise humana descrito no Exemplo 10 quanto à sua capacidade de inibir a lise de glóbulos vermelhos dependente de C5. Os valores médios de IC50 (uma medida da metade da concentração inibitória, um valor usado para indicar a quantidade do inibidor necessária para reduzir uma dada reação ou processo pela metade) para cada polipeptí- deo testado são listados na Tabela 13. Os polipeptídeos truncados demonstraram capacidade diminuída (conforme indicado por um aumento no valor de IC50) de inibir a lise de glóbulos vermelhos com aquelas variantes carentes de triptofano que têm os valores mais altos de IC50.

[00289] Adicionalmente, as variantes de polipeptídeo R3021 (SEQ ID NO: 11) com deleções de aminoácido internas foram sintetizadas e avaliadas (consultar a Tabela 14) quanto à sua capacidade de inibir a lise de glóbulos vermelhos dependente de C5 de acordo com os métodos descritos no Exemplo 10. Adicionalmente, a metionina N-terminal nessas variantes foi substituída por um grupo acetila. Os valores mé- dios de IC50 para cada polipeptídeo testado são listados na Tabela 14. De modo interessante, a substituição de grupo acetila da metionina N- terminal sozinha [R3048 (SEQ ID NO: 19)] aumentou a capacidade do polipeptídeo de inibir a lise de glóbulos vermelhos. A remoção de resíduo interno D [R3124 (SEQ ID NO: 130)] ou resíduo interno DVY [R3125 (SEQ ID NO: 131), correspondentes aos resíduos 8, 9 e 10 de R3021 (SEQ ID NO: 11)], levou a uma diminuição na capacidade do polipeptídeo de inibir a lise de glóbulos vermelhos. Tabela 13. Variantes de polipeptídeo truncadas no C-terminal de R3021 (SEQ ID NO: 11) analisados por ensaio de hemólise humana Tabela 14. Variantes de polipeptídeo R3021 (SEQ ID NO: 11) com de- leções de aminoácido internas analisadas por ensaio de hemólise hu-mana

Exemplo 17. Incorporação de polipeptídeos de ligação à albumina

[00290] Os polipeptídeos são conjugados a um ou mais polipeptí- deos que modulam a ligação de proteína plasmática. Esses polipeptí- deos, referidos no presente documento como "polipeptídeos de ligação à albumina"estão listados na Tabela 15. Tabela 15. Polipeptídeos de ligação à albumina

[00291] Os polipeptídeos de ligação à albumina são ciclizados por formação de ligação de dissulfeto nos resíduos de cisteína. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de ligação à albumina são conjugados por qualquer uma de suas extremidades N ou C-terminais, tendo assim, estruturas ligeiramente diferentes (por exemplo, nenhum grupo acetila). Exemplo 18. Incorporação de polipeptídeos penetrantes em célula

[00292] Os polipeptídeos sã conjugados a um polipeptídeo que tem propriedades de penetração em célula. Esses polipeptídeos são listados na Tabela 16 e são descritos em Milletti, F., Cell-penetrating polypeptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today. Agosto de 2012;17(15 a 16):850 a 860. Tabela 16. Polipeptídeos penetrantes em célula

Exemplo 19. Análise de misturas de polipeptídeos que compreendem estereoisômeros de aminoácido

[00293] Os polipeptídeos R3136 (SEQ ID NO: 137) e R3137 (SEQ ID NO: 138) foram sintetizados de acordo com as sequências de ami- noácidos de R3085 (SEQ ID NO: 90) e R3082 (SEQ ID NO: 116), respectivamente, com exceção da substituição de Phg em cada um por D-Phg (consultar a Tabela 17). As composições que compreendem R3136 (SEQ ID NO: 137) e R3085 (SEQ ID NO: 90) ou R3137 (SEQ ID NO: 138) e R3082 (SEQ ID NO: 116) foram analisadas quanto à sua capacidade de inibir a lise de glóbulos vermelhos de acordo com o ensaio de hemólise humana descrito no Exemplo 10. A composição que compreende R3136 (SEQ ID NO: 137) e R3085 (SEQ ID NO: 90) rendeu um IC50 médio (nM) de >50.000, enquanto a composição que compreende R3137 (SEQ ID NO: 138) e R3082 (SEQ ID NO: 116) rendeu um IC50 médio (nM) de >100.000. Tabela 17. Compostos usados em misturas polipeptídicas de estereoi- sômero de aminoácido

Exemplo 20. Estudos farmacocinéticos em primatas não humanos

[00294] Estudos farmacocinéticos foram realizados em primatas não humanos com o uso dos compostos listados na Tabela 18. Na ta-bela,"Cmpd" refere-se ao composto, e "Med" refere-se à média. Tabela 18. Compostos testados em estudos in vivo

[00295] A concentração plasmática de polipeptídeo R3152 (SEQ ID NO: 153) foi determinada em macacos cynomolgus após uma dose intravenosa (IV) única. Três animais machos receberam 3 mg/kg de polipeptídeo, e as concentrações plasmáticas de polipeptídeo foram determinadas com o uso de LC/MS-MS após a precipitação e extração de acetonitrila em Placa de Precipitação de Proteína Sirocco (Waters Corporation, Milford, MA.) Os parâmetros farmacocinéticos (PK) foram calculados a partir do curso do tempo (consultar a Figura 4) das con-centrações plasmáticas combinadas de R3152 (SEQ ID NO: 153) de-terminadasapós a dose até 48 h após a dose. Os níveis plasmáticos de fármaco caíram rapidamente durante uma fase inicial de distribuição (<1 hora) e, então, se estabilizaram e foram detectáveis por até 48 horas. R3152 (SEQ ID NO: 153) teve uma meia-vida terminal média de 10,9 ± 0,8 horas. A taxa de eliminação média foi 0,129 ± 0,0122 l/h/kg, que é aproximadamente 5% do fluxo sanguíneo do fígado de um macaco típico (2,6 l/h/kg). O volume médio de distribuição foi 1,49 ± 0,152 l/kg, que é aproximadamente o dobro da água total sangue para um macaco típico (0,7 l/kg). A AUC~ média foi 23.319 ± 2.120 h*ng/ml.

[00296] R3152 (SEQ ID NO: 153) se liga com alta afinidade à prote ína C5 de primata e bloqueia a via de complemento, impedindo a geração dos produtos de C5a e C5b e a produção de um Complexo de Ataque de Membrana (MAC) multimérico. A inibição de formação de MAC mediada por complemento em amostras de plasma do estudo PK acima foi examinado com o uso de um ensaio ex vivo estabelecido (consultar o ensaio de hemólise humana descrito no Exemplo 10), em que o plasma foi diluído a 1:100 e incubado com glóbulos vermelhos de ovelha ativados (Complement Technology, Tyler, TX). Em cada ponto no tempo, a atividade hemolítica foi determinada como um indicador de complemento sérico ativo (consultar a Figura 4). Em plasma contendo >200 ng/ml de R3152 (SEQ ID NO: 153), houve uma inibição clara de hemólise mediada por complemento, indicando um bloqueio da formação de MAC. R3152 exógeno (SEQ ID NO: 153) adicionado ao plasma de cynomolgus normal tem um IC50 = 2 a 20 ng/ml. A atividadehemolítica retornou aos níveis normais 48 horas após a dosagem conforme os níveis plasmáticos de R3152 (SEQ ID NO: 153) caíam abaixo de 100 ng/ml.

Exemplo 21. Estudos farmacocinéticos em rato

[00297] R3152 (SEQ ID NO: 153) foi entregue como uma dose in travenosa (IV) ou subcutânea (SC) a ratos-machos a 2 e 30 mg/kg, respectivamente (Figura 5) após dosagem IV, R3152 (SEQ ID NO: 153) foi monitorado com o uso de LC/MS-MS após a precipitação e extração de acetonitrila em placa de Precipitação de Proteína Sirocco (Waters Corporation, Milford, MA), conforme descrito acima. Os parâ-metrosfarmacocinéticos (PK) foram calculados a partir do curso do tempo das concentrações plasmáticas combinadas (consultar a Figura 5) de R3152 (SEQ ID NO: 153) e seu metabólito desamidado em C- terminal equipotente, R3201 (SEQ ID NO: 211).

[00298] R3152 (SEQ ID NO: 153)/R3201 (SEQ ID NO: 211) exibi ram uma fase de distribuição rápida, seguida por uma eliminação lenta com um t1^ = 5,3 horas. Uma taxa de eliminação similar foi observada após dosagem SC de 30 mg/kg, com aproximadamente 65% de bio- disponibilidade de dose, com base em AUC. O Tmax de 4 horas e a exposição prolongada a fármaco vistos em doses SC permitiram a co- bertura estendida da concentração terapêutica em plasma. Como R3152 (SEQ ID NO: 153) e R3201 (SEQ ID NO: 211) não se ligam a C5 de rato, pouquíssima atividade inibitória foi observada em ensaios de hemólise ex vivo.

[00299] Os compostos lipidados e não lipidados R3183 (SEQ ID NO: 184) e R3176 (SEQ ID NO: 177), respectivamente, foram avaliados quanto às propriedades farmacocinéticas em Ratos-Machos Sprague-Dawley após administração intravenosa ou subcutânea. A Figura 6 mostra os resultados. O painel esquerdo da Figura 6 mostra ratos- machos Sprague-Dawley (n=3) injetados por via intravenosa com uma dose única de 2 mg/kg. As amostras sanguíneas foram coletadas nos pontos no tempo indicados, processadas em plasma e analisadas quanto ao composto indicado por LC-MS. Círculo pretos: R3176 (SEQ ID NO: 177) (composto não lipidado); Círculos abertos: R3183 (SEQ ID NO: 184) (composto lipidado C16). O painel direito da Figura 6 mostra ratos-machos Sprague-Dawley (n=3) injetados por via subcutânea com uma dose única de 15 mg/kg. As amostras sanguíneas foram coletadas nos pontos no tempo indicados, processadas em plasma e analisadas quanto ao composto indicado por LC-MS. Círculos pretos: R3176 (SEQ ID NO: 177) (composto não lipidado); Círculos abertos: R3183 (SEQ ID NO: 184) (composto lipidado C16). A lipidação resultou em um aumento em exposição conforme avaliado por determinação da Área sob a curva (AUC) em 2,1 vezes pela via intravenosa e 2,7 vezes pela via subcutânea.

Exemplo 22. Inibição de hemólise na Via de Complemento Induzida por Trombina

[00300] A trombina pode induzir a atividade de complemento clivando-se C5 e C5T, que será, então, clivada em C5a e C5bT. C5bT, como C5b, será associada a C6 e os componentes terminais restantes da via de complemento, C7, C8 e C9, o que levará à formação do Complexo de Ataque de Membrana (MAC) que causa a lise de glóbulos vermelhos (Krisinger, et al., (2014). Blood. 120(8):1.717 a 1.725). Assim, R3183 e um anticorpo monoclonal anti-C5 similar a ECULIZU- MAB® foram testados quanto à sua capacidade de inibir a hemólise através da via de complemento induzida por trombina.

[00301] Para avaliar a atividade inibitória, C5 (Complement Technology, Tyler, TX) foi adicionado até atingir uma concentração de 400 nM, e a amostra foi incubada com C6 a uma concentração final de 600 nM (Complement Technology, Tyler, TX) e trombina a uma concentração de 50 nM (Enzyme Research Laborites, South Bend, IN) a 37 °C por 30 minutos, na presença de R3183 ou do anticorpo monoclonal anti-C5 similar a ECULIZUMAB®, ou nenhum inibidor. A reação foi interrompida com a adição de hirudina a 150 nM (Cell Sciences, Canton, MA) no tampão GVB+EDTA (Complement Technology, Tyler, TX) e incubada 5 minutos à temperatura ambiente. Essas amostras diluídas foram misturadas com eritrócitos de ovelha sensibilizados para anticorpo (Complement Technology, Tyler, TX) em uma placa de microtitu- lação de 96 cavidades (USA Scientific, Ocala, FL) e incubadas a 37 °C por 5 minutos. C7 (Complement Technology, Tyler, TX) foi, então, adicionadoàs cavidades para atingir uma concentração de 15 nM, e a placa foi retornada a 37 °C por 15 minutos. Um complexo de C8 (10 nM; Complement Technology, Tyler, TX) e C9 (25 nM; Complement Technology, Tyler, TX) foi, então, adicionado à mistura de ensaio, e as amostras foram incubadas por 30 minutos a 37 °C. Após a incubação, a placa foi centrifugada a 1.000 x g, e 100 µl de sobrenadantes foram transferidos para uma nova placa de microtitulação, e a absorbância foi lida a 412 nm. Os dados resultantes são mostrados na Figura 7. R3183 mostrou inibir a hemólise via de complemento induzida por trombina em concentrações mais altas que 6 ng/ml, enquanto o anticorpo monoclonal anti-C5 não o fez.

Claims (6)

1. Uso de um polipeptídeo selecionado dentre: SEQ ID NOs: 177, 184 e 191-195, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para inibir a clivagem de C5 em um sistema celular, compreendendo colocar o dito sistema celular em contato com a composição.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo inibe a clivagem de C5 com um IC50 menor do que 50 nm.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito sistema celular é um indivíduo humano.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo humano compreende uma doença, distúrbio e/ou condição relacionada ao complemento.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita doença, distúrbio e/ou condição relacionada ao complemento é selecionada a partir do grupo que consiste em uma indicação inflamatória, uma ferida, uma lesão, uma doença autoimune, uma indicação vascular, uma indicação neurológica, uma indicação relacionada ao rim, uma doença ocular, hemoglobinúria paroxística noturna e síndrome urêmica hemolítica atípica.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida doença, distúrbio e/ou condição relacionada ao complemento é miastenia grave, vasculite, pré-eclâmpsia ou síndrome de HELLP.