DE69916811T2

DE69916811T2 - Glp-1 derivate mit einem helix-gehalt über 25 %, die partiell strukturierte mizellenartige aggregate bilden

Info

Publication number: DE69916811T2
Application number: DE69916811T
Authority: DE
Inventors: Bjerre Liselotte KNUDSEN; Olaf Per HUUSFELDT; Franklin Per NIELSEN; C. Niels KAARSHOLM; Birk Helle OLSEN; Erik Soren BJORN
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: JP2002504518A; EP1061946B1; EP1061946A1; AU2610799A; DE69916811D1; WO1999043341A1; ATE265224T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel, das ein GLP-1-Derivat mit verbesserter Löslichkeit und/oder Stabilität umfasst, und ein Verfahren zum Verbessern der Löslichkeit und/oder Stabilität von GLP-1 oder eines Fragments oder eines Analogons davon.
Hintergrund der Erfindung
Peptide werden weit verbreitet in der medizinischen Praxis verwendet, und da sie durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden können, ist zu erwarten, dass deren Wichtigkeit auch in den kommenden Jahren steigt.
Die Hormone, welche die Insulinsekretion regulieren, gehören zu der enteroinsulären Achse, die eine Gruppe von Hormonen benennt, die aus der gastrointestinalen Schleimhaut als Reaktion auf die Gegenwart und Absorption von Nährstoffen im Darm freigesetzt werden, die eine frühe und potenzierte Freisetzung von Insulin unterstützen. Die verbessernde Wirkung auf die Insulinsekretion, die so genannte Inkretinwirkung, ist möglicherweise für eine normale Glukosetoleranz wichtig. Viele der gastrointestinalen Hormone, einschließlich Gastrin und Sekretin sind insulinotrop (Cholecystokinin ist bei Menschen nicht insulinotrop), jedoch handelt es sich bei den einzigen physikalisch wirksamen, welche für die Inkretinwirkung verantwortlich sind, um das Glukose-abhängige insulinotrope GIP und das Glucagon-ähnliche Peptid-1 (GLP-1). Aufgrund seiner insulinotropen Wirkung zog GIP, das 1973 (1) isoliert wurde, sofort ein deutliches Interesse der Diabetologen auf sich. Jedoch wurden zahlreiche Untersuchungen innerhalb der folgenden Jahre durchgeführt, die deutlich zeigten, dass eine mangelnde Sekretion von GIP bei der Pathogenese von insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) oder nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) (2) nicht beteiligt war. Weiterhin wurde gefunden, dass GIP als insulinotropes Hormon bei NIDDM (2) nahezu unwirksam ist. Das andere Inkretinhormon, GLP-1, ist die wirkungsvollste bekannte insulinotrope Substanz (3). Im Gegensatz zu GIP ist es beim Stimulieren von Insulinsekretion bei NIDDM-Patienten überraschend wirksam. Zudem und im Gegensatz zu anderen insulinotropen Hormonen (vielleicht mit der Ausnahme von Sekretin) hemmt es wirksam die Glucagonsekretion. Aufgrund dieser Wirkungen kündigten sich insbesondere bei Patienten mit NIDDM blutzuckersenkende Wirkungen an.
GLP-1, ein Produkt des Proglucagons (4), ist eines der jüngsten Vertreter der Sekretin-VIP-Familie von Peptiden, ist jedoch als wichtiges Darmhormon mit regulierender Funktion beim Glukosestoffwechsel und bei gastrointestinaler Sekretion und beim gartrointestigmalen Stoffwechsel (5) schon etabliert. Das Glucagongen wird verschiedenartig in der Bauspeicheldrüse und im Darm verarbeitet. In der Bauchspeicheldrüse (9) führt die Verarbeitung zur Bildung und parallelen Sekretion von 1) Glucagon selbst, das die Positionen 33–61 von Proglucagon (PG) belegt, 2) einem N-terminalen Peptid mit 30 Aminosäuren (PG (1–30)), häufig als Glicentin-verwandtes Bauchspeicheldrüsenpeptid, GRPP (10, 11), bezeichnet; 3) einem Hexapeptid, das PG (64–69) entspricht; 4) und schließlich dem so genannten Haupt-Proglucagonfragment (PG (72–158)), in welchem die zwei Glucagonähnliche Sequenzen verdeckt sind (9). Glucagon scheint das einzige biologisch aktive Produkt zu sein. Im Gegensatz dazu ist es in der Darmschleimhaut Glucagon, das in einem größeren Molekül verdeckt ist, während die zwei Glucagonähnlichen Peptide getrennt gebildet werden (8). Die folgenden Produkte werden parallel gebildet und sekretiert: 1) Glicentin, entsprechend PG (1–69) mit den Glucagonsequenz-belegenden Resten Nr. 33–61 (12); 2) GLP-1(7–36)amid (PG(78–107))amid (13), nicht wie ursprünglich angenommen PG(72-107)amid oder 108, das unwirksam ist). Geringe Mengen an C-terminalem Glycinerweitertem, jedoch gleich bioaktivem GLP-1(7–37), (PG (78–108)) werden ebenso gebildet (14); 3) Störungspeptid-2 (PG (111–122)amid) (15); und 4) GLP-2 (PG (126–158)) (15, 16). Eine Fraktion von Glicentin wird ferner in GRPP (PG (1–30)) und Oxyntomodulin (PG (33–69)) (17,18) aufgespaltet. Unter diesen Peptiden weist GLP-1 die auffälligsten biologischen Aktivitäten auf.
Die Aminosäuresequenz von GLP-1 ist unter anderem von Schmidt et al. (Diabetologia 28 704–707 (1985)) angegeben. Obwohl die interessanten pharmakologischen Eigenschaften von GLP-1(7–37) und Analoga davon in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit auf sich zogen, ist nur wenig über die Struktur dieser Moleküle bekannt. Die sekundäre Struktur von GLP-1 in Mizellen wurde von Thorton et al. (Biochemistry 33 3532–3539 (1994)) beschrieben, jedoch wird angenommen, dass in normaler Lösung GLP-1 ein sehr flexibles Molekül ist. Überraschend fanden wir, dass die Derivatisierung dieses relativ kleinen und sehr flexiblen Moleküls zu Verbindungen führte, deren Plasmaprofil stark verzögert war, und die immer noch Aktivität beibehielten (PCT-Anmeldung Nr. DK97/00340).
Während viel Aufmerksamkeit auf die pharmakologischen Eigenschaften von acylierten GLP-1-Derivaten gelenkt wurde, ist bisher wenig über ihre physikalisch-chemischen und Struktureigenschaften in Lösung bekannt. Eine solche Kenntnis ist eine Bedingung für eine vernünftige Handhabung, z. B. während der Herstellung, Reinigung und Formulierungsarbeit und letztendlich für das Verständnis der strukturellen Grundlage für den Schutzmechanismus wichtig.
GLP-1 und Analoga von GLP-1 und Fragmente davon sind möglicherweise unter anderem bei der Behandlung von Diabetes des Typs 1 und Typs 2 nützlich. Jedoch beschränken Löslichkeitsbeschränkungen und die geringe Stabilität gegenüber den Wirkungen von endogener Diaminopeptidylpeptidase die Nützlichkeit dieser Verbindungen und folglich besteht Bedarf nach Verbesserungen auf diesem Gebiet. Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Lösungen bereitzustellen, die GLP-1-Derivate mit verbesserter Löslichkeit und Stabilität umfassen.
Literaturangaben

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Zusammenfassung der Erfindung
Menschliches GLP-1 ist ein Peptid mit 37 Aminosäureresten, das aus Preproglucagon stammt, das unter anderem in den L-Zellen im Distalileum, in der Bauchspeicheldrüse und im Gehirn synthetisiert wird. Eine Verarbeitung des Preproglucagons und der Erhalt von GLP-1(7–36)amid, GLP-1(7–37) und GLP-2 finden hauptsächlich in den L-Zellen statt. Ein einfaches System wird zum Beschreiben von Fragmenten und Analoga dieses Peptids verwendet. Folglich bezeichnet z. B. Gly⁸-GLP-1(7–37) ein Fragment von GLP-1, das formal von GLP-1 durch dilettieren der Aminosäurereste Nr. 1 bis 8 und substituieren der natürlich vorkommenden Aminosäurereste in Position 8 (Ala) durch Gly abgeleitet ist. Gleichermaßen bezeichnet Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7–37) GLP-1(7–37) wobei die ε-Aminogruppe des Lys-Rests in Position 34 tetradecanoyliert wurde. Dort, wo in diesem Text auf C-terminal verlängerte GLP-1-Analoga Bezug genommen ist, ist, wenn nicht anders angegeben, der Aminosäurerest in Position 38 Arg, wenn nicht anders angegeben, der optionale Aminosäurerest in Position 39 ebenso Arg und, wenn nicht anders angegeben, der optionale Aminosäurerest in Position 40 Asp. Auch wenn ein C-terminal verlängertes Analogon zu Pos 41, 42, 43, 44 oder 45 verlängert wird, ist die Aminosäuresequenz dieser Verlängerung, wenn nicht anders angegeben, wie in der entsprechenden Sequenz im menschlichen Preglucagon vor.
Die PCT-Anmeldung Nr. DK97/00340 beschreibt verschiedene GLP-1-Derivate, die als sehr verzögert befunden wurden. Während GLP-1 und GLP-1-Analoga Moleküle sind, welchen keine definierte Lösungsstruktur zugeschrieben werden kann, fanden wir, dass diese verzögerten GLP-1-Derivate in einer teilweise strukturierten mizellenartigen Aggregatform vorliegen, die gegenüber einem breiten Konzentrationsbereich stabil ist.
Zirkulardichroismus (CD) kann verwendet werden, um zu zeigen, dass die GLP-1-Derivate abhängig von deren Konzentration eine bestimmte partiell strukturierte Konfirmation aufweisen. Im Gegensatz dazu ist für normales GLP-1(7–37) eine Zunahme im Helixgehalt mit einer steigenden Konzentration von 10–15% auf 30–35% (bei 500 μM Konzentration) parallel zur Peptidselbstassoziation ersichtlich. Für die GLP-1-Derivate, die partiell strukturierte, mizellenartige Aggregate in wässriger Lösung bilden, bleibt der Helixgehalt bei Konzentrationen von 10 μM über 30% konstant. Die Aggregat-strukturierte Konfirmation ist eine Eigenschaft des in Wasser oder verdünntem wässrigen Puffer vorliegenden Derivats ohne den Bedarf von beliebigen zusätzlichen Struktur-induzierenden Komponenten.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in breitesten Aspekt ein Arzneimittel, umfassend ein GLP-1-Derivat mit einem Helixgehalt, gemessen mittels CD bei 222 nm in H₂O bei 22 ± 2°C, von über 25%, vorzugsweise im Bereich von 25% bis 50%, bei einer Peptid-Konzentration von etwa 10 μM, wobei die Konzentration des GLP-1-Derivates nicht weniger als 0,5 mg/ml beträgt, und ein Konservierungsmittel.
Die Größe der partiell helikalen, mizellenartigen Aggregaten kann durch Größenausschlusschromatographie bestimmt werden. Gleichermaßen können die sichtbaren (kritische Mizellenkonzentration) CMCs der Peptide aus der konzentrations abhängigen Fluoreszenz in Gegenwart von geeigneten Farbstoffen bestimmt werden (z. B. Brito, R. & Vaz, W. (1986) Anal. Biochem. 152, 250–255).
Dass die Derivate eine partiell strukturierte, mizellenartige Aggregatkonformation in wässrigen Lösungen aufweisen, macht sie in Lösung verglichen mit den nativen Peptiden löslicher und stabiler. Die erhöhte Löslichkeit und Stabilität ist durch Vergleichen der Löslichkeit nach 9-tägigem Stehenlassen eines Derivates und des normalen GLP-1(7–37) in einer pharmazeutischen Formulierung, z. B. 5 mM Phosphatpuffer, pH 6,9 zugesetzt 0,1 M NaCl, ersichtlich.
Im vorliegenden Text wird die Bezeichnung "ein Analogon" verwendet, um ein Peptid zu bezeichnen, in welchem ein oder mehrere Aminosäurereste des Stammpeptids durch einen anderen Aminosäurerest substituiert wurden und/oder wobei ein oder mehrere Aminosäurereste des Stammpeptids deletiert wurden und/oder wobei ein oder mehrere Aminosäurereste am Stammpeptid addiert wurden. Eine solche Addition findet entweder am N-terminalen Ende oder am C-terminalen Ende des Stammpeptids oder an Beidem statt.
Der Begriff „Derivat" wird im vorliegenden Text verwendet, um ein Peptid zu bezeichnen, in welchem ein oder mehrere der Aminosäurereste des Stammpeptids z. B. Durch Alkylierung, Acylierung, Esterbildung oder Amidbildung chemisch modifiziert wurden.
Der Begriff "ein GLP-1-Derivat" wird im folgenden Text verwendet, um ein Derivat von GLP-1 oder ein Analogon davon zu bezeichnen. Im vorliegenden Text wird das Stammpeptid, von welchem ein solches Derivat formal abgeleitet ist, an manchen Stellen als „GLP-1-Einheit" der Derivats bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei die Konzentration von GLP-1-Derivat nicht weniger als 0,5 mg/ml, vorzugsweise nicht weniger als etwa 5 mg/ml, stärker be vorzugt nicht weniger als etwa 10 mg/ml und vorzugsweise nicht mehr als etwa 100 mg/ml beträgt.
Das Arzneimittel der Erfindung umfasst vorzugsweise eine GLP-1-Derivat, in welchem mindestens ein Aminosäurerest des Stammpeptids einen daran angehängten lipophilen Substituenten aufweist. Stärker bevorzugt sind Zusammensetzungen, die ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, der an einen beliebigen der Aminosäurereste in Position 18–38, vorzugsweise 26–34 angehängt ist, umfassen.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel umfasst vorzugsweise ferner einen oder mehrere der folgenden Substanzen:

– ein pharmazeutisch verträgliches Vehikulum oder einen pharmazeutisch verträglichen Träger;
– ein isotonisches Mittel, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid, Mannit und Glycerin;
– ein Konservierungsmittel, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phenol, m-Cresol, Methyl-p-hydroxybenzoat, Butyl-p-hydroxybenzoat und Benzylalkohol;
– einen Puffer, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumacetat, Citrat, Glycylglycin, Histidin, 2-Phenylethanol und Natriumphosphat; und
– ein oberflächenaktives Mittel, das die Löslichkeit und/oder die Stabilität des GLP-1-Derivats verbessern kann, vorzugsweise ausgewählt aus Poloxymer 188, Tween 20 und Tween 80.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Arzneimittel der Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei ein lipophiler Substituent 4 bis 40 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 8 bis 25 Kohlenstoffatome umfasst.
Der lipophile Substituent ist vorzugsweise an einem Aminosäurerest in solcher Weise angehängt, dass eine Carboxylgruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests bildet, oder ist der lipophile Substituent an einen Aminosäurerest in solcher Weise angehängt, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung mit einer Carboxylgruppe des Aminosäurerests bildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Arzneimittel ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent an das Stammpeptid mittels eines Spacers angehängt ist.
Der Spacer ist in einer Ausführungsform vorzugsweise eine unverzweigte Alkan-α,ω-dicarbonsäuregruppe mit 1 bis 7 Methylengruppen, vorzugsweise zwei Methylengruppen, die eine Brücke zwischen einer Aminogruppe des Stammpeptids und einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bilden.
Der Spacer ist in einer anderen Ausführungsform vorzugsweise ein Aminosäurerest mit der Ausnahme von Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys oder eine beliebige unverzweigte Alkan-α,ω-aminosäure mit 1 bis 7 Methylengruppen, vorzugsweise 2 bis 4 Methylengruppen, die eine Brücke zwischen einer Aminogruppe des Stammpeptids und einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bilden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der lipophile Substituent ein partiell oder vollständig hydriertes Cyclopentanophenathrengerüst.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent ein geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe.
Der lipophile Substituent ist vorzugsweise die Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Fettsäure, wobei die Acylgruppe stärker bevorzugt:

– ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend CH₃(CH₂)_nCO-, wobei n 4 bis 38 beträgt, vorzugsweise CH₃(CH₂)₆CO-, CH₃(CH₂)₈CO-, CH₃(CH₂)₁₀CO-, CH₃(CH₂)₁₂CO-, CH₃(CH₂)₁₄CO-, CH₃(CH₂)₁₆CO-, CH₃(CH₂)₁₈CO-, CH₃(CH₂)₂₀CO- und CH₃(CH2)₂₂CO-; oder
– eine Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Alkan-α,ω-dicarbonsäure ist; oder
– ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH₂)_mCO-, wobei m 4 bis 38, vorzugsweise 4 bis 24 beträgt, stärker bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH2)₁₄CO-, HOOC(CH₂)₁₆CO-, HOOC(CH₂)₁₈CO-, HOOC(CH₂)₂₀CO- und HOOC(CH₂)₂₂CO-.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_p((CH₂)_qCOOH)CHNH-CO(CH₂)₂CO-, wobei p und q ganze Zahlen sind und p + q eine ganze Zahl von 8 bis 33, vorzugsweise 12 bis 28 ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_rCO-NHCH(COOH)(CH₂)₂CO-, wobei r eine ganze Zahl von 10 bis 24 ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_sCO-NHCH((CH₂)₂COOH)CO, wobei s eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)_uCH₃, wobei u eine ganze Zahl von 8 bis 18 ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-COCH((CH₂)₂COOH)NH-CO(CH₂)_wCH₃, wobei w eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COOH)NH-CO(CH₂)_xCH₃, wobei x eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COOH)NH-CO(CH₂)_yCH₃, wobei y 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Arzneimittel ein GLP-1-Derivat, wobei das Stammpeptid GLP-1(A–B) beträgt, wobei A eine ganze Zahl von 1 bis 7 und B eine ganze Zahl von 38 bis 45, oder ein Analogon davon ist.
Das Stammpeptid ist vorzugsweise in einer Ausführungsform ausgewählt aus der Gruppe, umfassend GLP-1(7–35); GLP-1(7–36); GLP-1(7–36)amid; GLP-1(7–37); GLP-1(7–38); GLP-1(7–39); GLP-1(7–40) und GLP-1(7–41); und Analoga davon.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Stammpeptid ein GLP-1-Analogon der Formel I:
wobei
Xaa an Position 8 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 9 Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 11 Thr, Ala, GJy, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 14 Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 16 Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ite, Tyr, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 17 Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 18 Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 19 Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 20 Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 21 Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 22 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 23 Gln, Asn, Arg, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 24 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 25 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 26 Lys, Arg, Gln, Glu, Asp oder His ist,
Xaa an Position 27 Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 30 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 31 Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 32 Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 33 Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Met, Leu, Ile, Glu, Asp, oder Lys ist,
Xaa an Position 34 Lys, Arg, Glu, Asp, oder His ist,
Xaa an Position 35 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist,
Xaa an Position 36 Arg, Lys, Glu, Asp, oder His ist,
Xaa an Position 37 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp oder Lys ist oder deletiert ist,
Xaa an Position 38 Arg, Lys, Glu, Asp oder His oder deletiert ist,
Xaa an Position 39 Arg, Lys, Glu, Asp oder His oder deletiert ist,
Xaa an Position 40 Asp, Glu oder Lys oder deletiert ist,
Xaa an Position 41 Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp oder Lys oder deletiert ist,
Xaa an Position 42 Pro, Lys, Glu oder Asp oder deletiert ist,
Xaa an Position 43 Glu, Asp oder Lys oder deletiert ist,
Xaa an Position 44 Glu, Asp oder Lys oder deletiert ist, und
Xaa an Position 45 Val, Glu, Asp oder Lys oder deletiert ist, oder
ein C-1-6-Ester, -Amid, C-1-6-Alkylamis, C-1-6-Dialkylamid und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon,
mit der Maßgabe, dass

(i) wenn die Aminosäure an Position 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 oder 44 deletiert ist, jede Aminosäure stromabwärts der Aminosäure ebenso deletiert ist,
(ii) das Derivat des GLP-1-Analogons nur ein Lys enthält,
(iii) die ε-Aminogruppe des Lys mit einem lipophilen Substituenten substituiert ist,
(iv) die Gesamtzahl der verschiedenen Aminosäuren zwischen dem Derivat des GLP-1-Analogons und der entsprechenden nativen Form von GLP-1 nicht sechs übersteigt.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel umfasst vorzugsweise ein GLP-1-Derivat, in welchem insgesamt bis zu 15, vorzugsweise bis zu 10, stärker bevorzugt bis zu 6 Aminosäurereste mit einem α-Aminosäurerest ausgetauscht wurden, der einen genetische Code kodieren kann.
Das Stammpeptid ist besonders bevorzugt ausgewählt aus den folgenden der Gruppen

– Arg²⁶-GLP-1(7–37); Arg³⁴GLP-1(7–37); Lys³⁶-GLP-1(7–37); Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1-(7–37); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7–37); Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7–37); Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7–39); Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7–39); Arg^28,34Lys^36,40-GLP-1(7–40); Gly⁸Arg²⁶-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg³⁴-GLP-1(7–37); Gly⁸Lys³⁶-GLP-1(7–37); Gly⁸g^26,34Lys³⁹-GLP-1(7–39); Gly⁸Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7–39); Gly⁸Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Gly⁸Arg^26,34Lys^36,30-GLP-1(7–39) und Gly⁸Arg^26,34Lys^35,40-GLP-1(7–40) oder
– Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–38); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(7–41); Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(7–42); Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(7–43); Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(7–44); Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(7–45); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(1–38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(1–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(1–40); Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(1–41); Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(1–42); Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(1–43); Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(1–44); Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(1–45); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(2–38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(2–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(2–40); Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(2–41); Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(2–42); Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(2–43); Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(2–44); Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(2–45); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(3–38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(3–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(3–40); Arg^26,34Lys⁴¹- GLP-1(3–41); Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(3–42); Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(3–43); Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(3–44); Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(3–45); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(4–38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(4–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(4–40); Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(4–41); Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(4–42); Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(4–43); Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(4–44); Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(4–45); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(5–38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(5–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(5–40); Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(5–41); Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(5–42); Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(5–43); Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(5–44); Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(5–45); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(6–38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(6–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(6–40); Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(6–41); Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(6–42); Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(6–43); Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(6–44); Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(6–45); Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(1–38); Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(1–38); Arg^26,34Lys^36,38-GLP-1(1–38); Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(7–38); Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(7–38); Arg^26,34 Lys^36,38-GLP-1(7–38); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–38); Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(1–39); Arg³⁴Lys³⁹-GLP-1(1–39); Agr^26,34Lys^38,39-GLP-1(1–39); Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7–39); Arg³⁴Lys³⁹-GLP-1(7–39) und Arg^26,34Lys^38,39-GLP-1(7–39).

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit und/oder der Stabilität von GLP-1 oder ein Fragment oder ein Analogon davon, dadurch gekennzeichnet, dass ein lipophiler Substituent an einem beliebigen der Aminosäurerest des Stammpeptids eingebracht ist.
Durch dieses Verfahren ist der lipophile Substituent vorzugsweise an einem beliebigen der Aminosäurereste in Position 18–38, vorzugsweise 26–34 eingebracht.
Der lipophile Substituent umfasst vorzugsweise 4 bis 40 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt 8 bis 25 Kohlenstoffatome.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der lipophile Substituent die Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Fettsäure, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend CH(CH₂)_nCO-, wobei n 4 bis 38 beträgt, vorzugsweise CH₃(CH₂)₆CO-, CH₃(CH₂)₈CO-, CH₃(CH₂)₁₀CO-, CH₃(CH₂)₁₂CO-, CH₃(CH₂)₁₄CO-, CH₃(CH₂)₁₆CO-, CH₃(CH₂)₁₈CO-, CH₃(CH₂)₂₀CO-, und CH₃(CH₂)₂₂CO-.
Das GLP-1-Stammpeptid ist vorzugsweise GLP-1(A–B) wobei A eine ganze Zahl von 1 bis 7 und B eine ganze Zahl von 38 bis 45 ist oder ein Analogon davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das GLP-1 ausgewählt aus der Gruppe, umfassend GLP-1(7–35); GLP-1(7–36); GLP-1(7–36)amid; GLP-1(7–37); GLP-1(7–38); GLP-1(7–39); GLP-1(7–40) und GLP-1(7–41) und Analoga davon.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das GLP-1 ausgewählt aus der Gruppe, umfassend GLP-1(1–35); GLP-1(1–36); GLP-1(1–36)amid; GLP-1(1–37); GLP-1(1–38); GLP-1(1–39); GLP-1(1–40); GLP-1(1–41) und Analoga davon.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1: Zirkulardichroismus (CD) bei 222 nm als Funktion der Peptidkonzentration für acylierte GLP-1-Derivate, gelöst in 10 mM Tris-Puffer, pH 8 und 23°C.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zum Erhalt eines zufrieden stellenden verzögerten Wirkungsprofils des GLP-1-Derivats umfasst der an die GLP-1-Einheit angehängte lipophile Substituent vorzugsweise 4–40 Kohlenstoffatome, insbesondere 8–25 Kohlenstoffatome. Der lipophile Substituent kann an eine Aminogruppe der GLP-1-Einheit mittels einer Carboxylgruppe des lipophilen Substituenten angehängt sein, die eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerestes, an welchen sie angehängt, ist bildet. In einer anderen Ausführungsform können der lipophile Substituent and den Aminosäurerest in solcher Weise angehängt sein, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung mit einer Carboxylgruppe des Aminosäurerests bildet. Als weitere Option kann der lipophile Substituent an die GLP-1-Einheit über eine Esterbindung gebunden sein. Formal kann der Ester entweder durch Reaktion zwischen einer Carboxylgruppe der GLP-1-Einheit und einer Hydroxygruppe des zukünftigen Substituenten oder durch Reaktion zwischen einer Hydroxygruppe der GLP-1-Einheit und einer Carboxylgruppe des zukünftigen Substituenten gebildet werden. Als weitere Alternative kann der lipophile Substituent eine Alkylgruppe sein, die in eine primäre Aminogruppe der GLP-1-Einheit eingebracht ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der lipophile Substituent an die GLP-1-Einheit mittels eines Spacers in solcher Weise angehängt, dass eine Carboxylgruppe des Spacers eine Amidbindung mit einer Aminogruppe der GLP-1-Einheit bildet. Beispiele für geeignete Spacer sind Bernsteinsäure, Lys, Glu oder Asp oder eine Dipeptidbindung wie Gly-Lys. Ist der Spacer Bernsteinsäure, kann eine Carboxylgruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests bilden und die andere Carboxylgruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bilden. Ist der Spacer Lys, Glu oder Asp, kann die Carboxylgruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests und die Aminogruppe davon eine Amidbindung mit einer Carboxylgruppe des lipophilen Substituenten bilden. Wird Lys als Spacer verwendet, kann in manchen Fällen ein weiterer Spacer zwischen die ε-Aminogruppe von Lys und dem lipophilen Substituenten eingefügt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein solcher weiterer Spacer eine Bernsteinsäure, die eine Amidbindung mit der ε-Aminogruppe; von Lys und mit einer im lipophilen Substituenten vorliegenden Aminogruppe bildet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein solcher weiterer Spacer Glu oder Asp, der eine Amidbindung mit der ε-Aminogruppe von Lys und eine andere Amidbindung mit einer Carboxylgruppe, die im lipophilen Substituenten vorliegt, bildet, d. h. der lipophile Substituent ist ein N^ε-acylierter Lysinrest.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der lipophile Substituent eine Gruppe auf, die negativ geladen sein kann. Eine bevorzugte Gruppe, die negativ geladen sein kann, ist eine Carbonsäuregruppe.
Das Stammpeptid kann durch ein Verfahren hergestellt werden, welches das Züchten einer Wirtszelle umfasst, die eine DNA-Sequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert und das Polypeptid in einem geeigneten Nährstoffmedium unter die Expression des Peptids gewährenden Bedingungen exprimieren kann, wonach das erhaltene Peptid aus der Kultur wiedergewonnen wird.
Bei dem zum Züchten der Zellen verwendeten Medium kann es sich um jedes beliebige herkömmliche Medium, das zum Wachsen der Wirtszellen geeignet ist, wie minimale oder komplexe Medien, die geeignete Ergänzungen enthalten, handeln. Geeignete Medien sind im Handel erhältlich oder können gemäß veröffentlichten Rezepturen (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden. Das durch die Zellen hergestellte Peptid kann dann aus dem Kulturmedium durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Abtrennung der Wirtszellen von den Medien durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen der Proteinkomponenten des Überstands oder Filtrat mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, Reinigung durch eine Vielzahl an chromatographischen Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, abhängig von der fraglichen Peptidart gewonnen werden.
Die das Stammpeptid kodierende DNA-Sequenz kann geeigneterweise genomischen oder cDNA-Ursprungs sein und z. B. erhalten durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Genbank und Screenen nach DNA-Sequenzen, die den gesamten oder einen Teil des Peptids durch Hybridisierung unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken, erhalten werden (siehe z. B. Sambrook, J, Fritsch, EF und Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). Die das Peptid kodierende DNA-Sequenz kann auch synthetisch durch etablierte Standardverfahren, z. B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben durch Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859–1869, oder das Verfahren, beschrieben durch Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801–805 hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerasekettenreaktion durch Verwendung von spezifischen Primern, z. B. wie in US 4,683,202 oder Saiki et al., Science 239 (1988), 487–491 beschrieben, hergestellt werden.
Die DNA-Sequenz kann in einen beliebigen Vektor eingefügt werden, der günstigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Vektorwahl hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor sein, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei die Replikation davon von chromosomaler Replikation, z. B. einem Plasmid abhängt. In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor einer sein, der beim Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert wird und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welches) er integriert wurde repliziert wird.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem die das Peptid kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig an zusätzliche Segmente, die zur Transkription der DNA erforderlich sind wie ein Promoter gebunden ist, sein. Der Promoter kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt und von Genen abgeleitet sein, die Proteine entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodieren. Beispiele für geeignete Promoter zum Leiten der Transkription der das Peptid der Erfindung kodierenden DNA in eine Vielzahl an Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet bekannt, vergleiche z. B. Sambrook et al., vorstehend.
Die das Peptid kodierende DNA-Sequenz kann auch gegebenenfalls funktionsfähig an einen geeigneten Terminator, an Polyadenylierungssignale, Transskriptionsverstärkersequenzen und Translationsverstärkersequenzen gebunden sein. Der rekombinante Vektor der Erfindung kann ferner eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, in die fragliche Wirtszelle zu replizieren.
Der Vektor kann auch eine geeignete Markierung, z. B. ein Gen, wobei das Produkt davon einen Fehler in der Wirtszelle ergänzt, oder eines, das Resistenz gegenüber einem Arzneimittel z. B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat verleiht, umfassen.
Zum Leiten des Stammpeptids der vorliegenden Erfindung in den Sekretionsweg der Wirtszelle kann eine Sekretionssignalsequenz (auch bekannt als Leadersequenz, Prepro-Sequenz oder Presequenz) im rekombinanten Vektor bereitgestellt werden. Die Sekretionssignalsequenz ist an die das Peptid kodierende DNA-Sequenz in genauem Ablesegerüst gebunden. Sekretionssignalsequenzen sind allgemein in der 5'-Position an der das Peptid kodierenden DNA-Sequenz positioniert. Die Sekretionssignalsequenz kann eine sein, die gewöhnlich mit dem Peptid assoziiert ist oder von einem Gen stammen, das ein anderes Sekretionsprotein kodiert.
Die Verfahren, die zum Binden der das vorliegende Peptid kodierenden DNA-Sequenzen, der Promoter- und gegebenenfalls der Terminator- bzw. Sekretionssignalsequenz und zu ihrem Einfügen in geeignete Vektoren, welche die zur Replikation nötige Information enthalten, verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., vorstehend).
Die Wirtszelle, in welche die DNA-Sequenz oder der rekombinante Vektor eingebracht werden soll, kann eine beliebige Zelle sein, die das vorliegende Peptid herstellen kann, und schließt Bakterien-, Hefe-, Pilz- und höhere eukaryotische Zellen ein. Beispiele für geeignete Wirtszellen, die bekannt sind und auf dem Fachgebiet verwendet werden, sind ohne Beschränkung E. coli, Saccharomyces cervisiae oder Säuger-BHK oder -CHO-Zellreihen.
Beispiele für Verbindungen, die als erfindungsgemäße GLP-1-Einheiten nützlich sein können, sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 87/06941 (The General Hospital Corporation) beschrieben, die ein Peptidfragment betrifft, das GLP-1(7–37) und funktionelle Derivate davon umfasst, und die Verwendung eines insulinotropischen Mittels betrifft.
Ferner sind GLP-1-Analoga in der Internationalen Patentanmeldung Nr. 90/11296 (The General Hospital Corporation) beschrieben, die Peptidfragmente, die GLP-1(7–36) und funktionelle Derivate davon umfassen, und eine insulinotrope Aktivität aufweisen, welche die insulinotrope Aktivität von GLP-1(1–36) oder GLP-1(1–37) übersteigt, und deren Verwendung als insulinotrope Mittel betrifft.
Die Internationale Patentanmeldung Nr. 91/11457 (Buckley et al.) offenbart Analoga der aktiven GLP-1-Peptide 7–34, 7–35, 7–36 und 7–37 die ebenso als erfindungsgemäße GLP-1-Einheiten nützlich sein können.
Herstellung und Verabreichung der Zusammensetzungen
Arzneimittel, die ein erfindungsgemäßes GLP-1-Derivat enthalten, können parenteral oder oral an eine solche Behandlung benötigende Patienten verabreicht werden. Eine parenterale Verabreichung kann durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion mittels einer Spritze, gegebenenfalls einer Pen-artigen Spritze durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine parenterale Verabreichung mittels einer Infusionspumpe durchgeführt werden. Eine weitere Option ist eine Zusammensetzung, die in Form eines Pulvers oder einer Flüssigkeit zur Verabreichung des GLP-1-Derivats in Form eines Nasen- oder Pulmonalsprays vorliegen kann. Als noch weitere Option können die Arzneimittel, welche die GLP-1-Derivate der Erfindung enthalten, auch auf eine transdermale Verabreichung, z. B. von einem Pflaster, gegebenenfalls einem iontophoretischen Pflaster oder transmucosal, z. B. bukkale Verabreichung angepasst sein.
Arzneimittel, die ein GLP-1-Derivat der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch herkömmliche Techniken, z. B. wie in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1085 oder in Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 19. Ausgabe 1995 beschrieben, hergestellt werden.
Folglich können die injizierbaren Zusammensetzungen des GLP-1-Derivats der Erfindung unter Verwendung der herkömmliche Techniken der pharmazeutischen Industrie hergestellt werden, die das Lösen und Mischen der Zusätze wie geeignet zum Erhalt des gewünschten Endprodukts beinhalten.
Gemäß einem Verfahren wird das GLP-1-Derivat in einer Wassermenge gelöst, die etwas geringer als das Endvolumen der herzustellenden Zusammensetzung ist. Ein isotonisches Mittel, ein Konservierungsmittel und ein Puffer werden, falls erforderlich, zugesetzt und der pH-Wert der Lösung wird gegebenenfalls unter Verwendung einer Säure, z. B. von Salzsäure oder einer Base, z. B. von wässrigem Natriumhydroxid nach Bedarf eingestellt. Schließlich wird das Volumen der Lösung mit Wasser eingestellt, um die gewünschte Konzentration der Zusätze zu erhalten.
Eine Zusammensetzung zur nasalen Verabreichung von bestimmten Peptiden kann z. B. wie im Europäischen Patent Nr. 272097 (an Novo Nordisk A/S) oder in WO 93/18785 beschrieben hergestellt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Arzneimittel, die ein GLP-1-Derivat enthalten, in Form einer Zusammensetzung bereitgestellt, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist. Eine solche Injektion kann entweder eine gebrauchsfertige injizierbare Lösung oder eine Menge einer Feststoffzusammensetzung, z. B. ein lyophilisiertes Produkt, das in einem Lösungsmittel zu lösen ist, bevor es injiziert werden kann, sein. Die injizierbare Lösung enthält vorzugsweise nicht weniger als 0,5 mg/ml, vorzugsweise nicht weniger als 5 mg/ml, stärker bevorzugt nicht weniger als etwa 10 mg/ml des GLP-1-Derivats und vorzugsweise nicht mehr als 100 mg/ml des GLP-1-Derivats.
Die Arzneimittel, die ein GLP-1-Derivat der Erfindung enthalten, können zur Behandlung einer Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen verwendet werden. Das zu verwendende besondere GLP-1-Derivat und der optimale Dosisgehalt für einen beliebigen Patienten hängt von der zu behandelnden Erkrankung und von einer Vielzahl an Faktoren, einschließlich der Effizienz des eingesetzten spezifischen Peptidderivats, dem Alter, Körpergewicht, der physikalischen Aktivität und der Ernährung des Patienten, von einer möglichen Kombination mit anderen Arzneimitteln und von der Schwere des Falles ab. Es wird empfohlen, dass die Dosierung des GLP-1-Derivats dieser Erfindung für jeden einzelnen Patienten vom Fachmann bestimmt wird.
Insbesondere ist es vorgesehen, dass die Arzneimittel, die ein GLP-1-Derivat enthalten, zur Behandlung von nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus und/oder zur Behandlung von Fettsucht nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die vorliegenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch den Schutzumfang nicht beschränken sollen.
Beispiele
Zirkulardichroismus (CD) bei 222 nm als Funktion der Peptidkonzentration für Peptide, die in 10 mM TrisPuffer, pH 8 und 23°C gelöst sind, wurde für GLP-1(7–37) und die folgenden acht GLP-1-Derivate, die für erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen geeignet sind, gemessen:

Derivat Position des lipophilen Substituenten

(a) 26

(b) 26

(c) 23

(d) 34

(e) 38

(f) 26

(g) 26

(h) 18

(a): ist Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH;
(b): ist Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-lithochoyl)))GLP-1(7–37)-OH;
(c): ist Arg^26,34,Lys²³(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH;
(d): ist Arg²⁶,Lys³⁴(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH;
(e): ist Gly⁸,Glu3⁷,Arg^26,34,Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–38)-OH;
(f): ist Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(hexadecanoyl))GLP-1(7–37)-OH;
(g): ist Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(γ-aminobutyroyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH;
(h): ist Arg^26,34,Lys¹⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH.

Die Ergebnisse sind in 1 dargelegt. Man bemerke, dass das CD-Signal zu dem mittleren Gehalt an α-Helix in den Peptiden proportional ist, das heißt ein CD-Wert von –1 entspricht einem 10%igen α-Helixgehalt unter diesen Bedingungen. Die Abbildung zeigt, dass wenn die Konzentration von unmodifiziertem GLP-1(7–37) zwischen 25 und 1000 μM ansteigt, der Gehalt von α-Helix von etwa 15% bis auf etwa 30–35% parallel zur Bildung von höheren Oligomeren erhöht ist. Im Gegensatz zu diesem konzentrationsabhängigen Verhalten zeigt die Abbildung, dass der Helixgehalt hoch bleibt und im Wesentlichen von der Konzentration im Bereich von 1–200 μM für eine Reihe von acylierten GLP-1- Derivaten, die partiell strukturierte mizellenartige Aggregate unter denselben Bedingungen bilden, unabhängig ist.

Die folgenden Abkürzungen für im Handel erhältliche Chemikalien werden verwendet:

DMF:	N,N-Dimethylformamid.
DCC:	N,N-Dicyclohexylcarbodiimid.
NMP:	N-Methyl-2-pyrrolidon.
EDPA:	N-Ethyl-N,N-diisopropylamin.
EGTA:	Ethylenglycolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure.
GTP:	Guanosin-5'-triphosphat.
TFA:	Trifluoressigsäure.
THF:	Tetrahydrofuran.
H-Glu(OH)-OBu^t:	L-Glutaminsäure-α-tert-butylester.
Cap-ONSu:	Octansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
Lau-ONSu:	Dodecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
Myr-ONSu:	Tetradecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
Pal-ONSu:	Hexadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
Ste-ONSu	Octadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.

Abkürzungen

PDMS:	Plasmadesorptionsmassenspektrometrie
MALDI-MS:	Matrix-assistierte Laserdesorptions/Ionisierungsmassenspektrometrie
HPLC:	Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
amu:	Atommasseneinheiten
Lit-Glu(ONSu)-OBu^t:	N^α-Litochoyl-L-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester

Cap-Glu(ONSu)-OBu^t:	N^α-Octanoyl-L-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Cac-Glu(ONSu)-OBu^t:	N^α-Decanoyl-L-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Lau-Glu(ONSu)-OBu^t:	N^α-Dodecanoyl-L-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Myr-Glu(ONSu)-OBu^t:	N^α-Tetradecanoyl-L-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Pal-Glu(ONSu)-OBu^t:	N^α-Hexadecanoyl-L-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-yldiester
Ste-Glu(ONSu)-OBu^t:	N^α-Hexadecanoyl-L-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-yldiester
Lau-β-Ala-ONSu:	N^β-Dodecanoyl-β-alanin-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Pal-β-Ala-ONSu:	N^β-Hexadecanoyl-β-alanin-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Lau-GABA-ONSu:	N^γ-Dodecanoyl-γ-aminobuttersäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Myr-GABA-ONSu:	N^γ-Tetradecanoyl-γ-aminobuttersäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Pal-GABA-ONSu:	N^γ-Hexadecanoyl-γ-aminobuttersäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Ste-GABA-ONSu:	N^γ-Octadecanoyl-γ-aminobuttersäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Pal-lsonip-ONSu:	N-Hexadecanoylpiperidin-4-carabonsäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Pal-Glu(OBu')-ONSu:	N^α-Hexadecanoyl-L-glutaminsäure-α-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester-γ-t-butylester
HOOC-(CH₂)₈-COONSu:	ω-Carboxyheptansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester

HOOC-(CH₂)₁₀-COONSu:	ω-Carboxyundecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
HOOC-(CH₂)₁₂-COONSu:	ω-Carboxytridecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu:	ω-Carboxypentadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
HOOC-(CH₂)₁₆-COONSu:	ω-Carboxyheptadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
HOOC-(CH₂)₁₈-COONSu:	ω-Carboxynonadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.

Analytisches
Plasmadesorptionsmassenspektrometrie
Probenherstellung
Die Probe wird in 0,1% TFA/EtOH (1 : 1) mit einer Konzentration von 1 μg/μl gelöst. Die Probelösung (5–10 μl) wird auf ein Nitrozellulose-Target (Bio-ion AB, Uppsala, Schweden) gegeben und man lässt es auf der Target-Oberfläche für eine Dauer von 2 Min. adsorbieren. Das Target wird anschließend mit 2 × 25 μl 0,1% TFA gespült und Spin-getrocknet. Schließlich wird das Nitrozellulose-Target in ein Target-Karussel gegeben und in das Massenspektrometer eingebracht.
MS Analyse
Die PDMS-Analyse wurde unter Verwendung eines Geschwindigkeitsinstruments des Typs Bio-Ion 20 (Bio-ion Nordic AB, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Eine Beschleunigungsspannung von 15 kV wurde angelegt und Molekülionen, die durch Beschuss der Nitrozelluloseoberfläche mit 252-Cf-Fissionsfragmenten gebildet wurden, wurden in einem Stopdetektor beschleunigt. Das erhaltene Geschwindigkeitsspektrum wurde in einem tatsächlichen Massenspektrum unter Verwendung der H⁺ und NO⁺-Ionen mit m/z 1 bzw. 30 kalibriert. Die Massenspektren wurden allgemein für 1,0 × 10⁶-Fisssionsvorfälle entsprechend 15–20 Min. akkumuliert. Unter Erhalt der zugewiesenen Massen entsprachen alle den isotopisch gemittelten Molekularmassen. Die Genauigkeit der Massenzuweisung ist im allgemeinen besser als 0,1%.
MALDI-MS
Die MALDI-TOF-MS-Analyse wurde unter Verwendung einer Apparatur des Typs Voyager RP Instrument (PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA), ausgestattet mit einer verzögerten Extraktion und bedient im linearen Modus, durchgeführt. Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wurde als Matrix verwendet, und die Massenzuordnungen basierten auf externer Kalibrierung.
Weitere Beispiele für Verbindungen, die als GLP-1-Derivate im erfindungsgemäßen Arzneimittel nützlich sein können, sind:
Beispiel 1
Synthese von Arg^24,34,Lys³⁶(N^β-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–36)-OH
Einem Gemisch aus Arg^24,34,Lys³⁶-GLP-1(7–38)-OH (12,2 mg, 3,67 μmol), EDPA (13,3 mg, 103 μmol), NMP (1,71 ml) und Wasser (855 μl) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (5,94 mg, 11 μmol), wie in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/DK97/00340 beschrieben, in NMP (148 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6 mg, 81 μmol) in Wasser (0,6 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (38 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (20 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (3,1 mg, 23%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3695 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3694 ± 3 amu (theoretischer Wert 3694 amu).
Beispiel 2
Synthese von Arg^24,34,Lys³⁶(N^β-(γ-glutamyl(N^α-octadecanoyl)))GLP-1(7–36)-OH
Einem Gemisch aus Arg^24,34,Lys³⁶-GLP-1(7–36)-OH (12,2 mg, 3,67 μmol), EDPA (13,3 mg, 103 μmol), NMP (1,71 ml) und Wasser (855 μl) wurde eine Lösung von Ste-Glu(ONSu)-OBu^t (6,25 mg, 11 μmol), wie in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/DK97/00340 beschrieben, in NMP (1 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6 mg, 81 μmol) in Wasser (0,6 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (54 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (20 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (3,7 mg, 27%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekuülion wurde als 3723 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3722 ± 3 amu (theoretischer Wert 3722 amu).
Beispiel 3
Synthese von Lithocholinsäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Einer Lösung von Lithocholinsäure (5,44 g, 14,3 mmol) in einem Gemisch aus wasserfreiem THF (120 ml) und wasserfreiem Acetonitril (30 ml) wurde N-Hydroxysuccinimid (1,78 g, 15 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 10°C abgekühlt, eine Lösung von DCC (3,44 g, 16,7 mmol) in wasserfreiem THF (30 ml) wurde zugetropft und das erhaltene Reaktionsgemisch für eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und zwischen Dichlormethan (450 ml) and 10%iger, wässriger Na₂CO₃ (150 ml) aufgeteilt. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit 10%iger, wässriger Na₂CO₃ (150 ml), Wasser (2 × 150 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Dichlormethan (30 ml) und n-Heptan (30 ml) kristallisiert. Der Niederschlag wurde in einem Vakuumofen für eine Dauer von 36 Std. getrocknet, um die Titelverbindung (3,46 g, 51%) zu erhalten.
Beispiel 4
Synthese von Lit-Glu(ONSu)-OBu^t
Eine Suspension von H-Glu(OH)-OBu^t (1,28 mg, 6,33 mmol), DMF (88 ml) und EDPA (0,82 g, 6,33 mmol) und wie in Beispiel 3 hergestelltem Lithocholsäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester wurde für eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand in Ethylacetat (40 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 5%iger Zitronensäure (2 × 25 ml), Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen und filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand in DMF (12 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde zu einer 10%igen, wässrigen Lösung von Zitronensäure zugetropft, wodurch das Produkt ausfiel. Der Niederschlag wurde aufgefangen und mit Eiswasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das rohe Produkt wurde aus einem Gemisch aus n-Heptan (40 ml) und 2-Propanol (17 ml) umkristallisiert. Der Niederschlag wurde in einem Vakuumofen für eine Dauer von 4 Std. getrocknet, um die freie Säurezwischenverbindung zu erhalten. Zu einer Lösung der freien Säurezwischenverbindung in DMF (18 ml) wurde Hydroxysuccinimid (0,45 g, 3,91 mmol), gefolgt von einer Lösung von DCC (0,73 g, 3,56 mmol) in Dichlormethan (18 ml) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Feststoff eingeengt und der Rückstand in Dichlormethan (25 ml) gelöst und die Filtration wiederholt, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um einen Schaum zu erhalten. Der Rückstand wurde in unter Rückfluss kochendem n-Heptan (35 ml) gelöst und das Produkt durch Zugabe von 2-Propanol kristallisiert. Der Niederschlag wurde aufgefangen, mit kaltem n-Heptan gewaschen, bei 35°C im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung (1,34 g, 57%) zu erhalten.
Beispiel 5
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-lithochoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg³⁴,Lys²⁶-GLP-1(7–37)-OH (41,1 mg, 12,2 μmol), EDPA (44 mg, 340 μmol), NMP (5,76 ml) und Wasser (2,88 ml) wurde eine Lösung von Lit-Glu(ONSu)-OBu^t (24 mg, 37 μmol), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, in NMP (600 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 75 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (20 mg, 268 μmol) in Wasser (2 ml) abge schreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (128 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch in zwei gleiche Portionen aufgeteilt und jede Portion auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (2 × 25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (2 × 25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (5 mg, 11%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3872 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 37871 ± 3 amu (theoretischer Wert 3871 amu).
Beispiel 6
Synthese von Arg²⁶,Lys³⁴(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-lithochoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg²⁶,Lys³⁴-GLP-1(7–37)-OH (18 mg, 5,3 μmol), EDPA (19,3 mg, 149 μmol), NMP (2,52 ml) und Wasser (1,26 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (8,6 mg, 16 μmol) in NMP (600 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (8,8 mg, 117 μmol) in Wasser (0,88 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (6 mg, 30%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3752 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3751 ± 3 amu (theoretischer Wert 3751 amu).
Beispiel 7
Synthese von Desamino-His⁷,Arg²⁶,Lys³⁴(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))-GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Desamino-His⁷,Arg²⁶,Lys³⁴-GLP-1(7–37)-OH (114,3 mg, 4,2 μmol), EDPA (15,3 mg, 119 μmol), NMP (2 ml) und Wasser (1 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (6,84 mg, 12,7 μmol) in NMP (171 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (7 mg, 99 μmol) in Wasser (700 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (42 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (5,6 mg, 35%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3738 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3737 ± 3 amu (theoretischer Wert 3737 amu).
Beispiel 8
Synthese von Gly⁵,Arg^26,34,Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–38)-OH
Einem Gemisch aus Gly⁵,Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–38)-OH (11,8 mg, 3,4 μmol), EDPA (12,1 mg, 94 μmol), NMP (1,65 ml) und Wasser (0,83 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (5,4 mg, 10 μmol) in NMP (135 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 75 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (5,5 mg, 73,7 μmol) in Wasser (533 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (36 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (5 mg, 38%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3895 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3894 ± 3 amu (theoretischer Wert 3894 amu).
Beispiel 9
Synthese von Gly⁵,Glu³⁷Arg^26,34,Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–38)-OH
Einem Gemisch aus Gly⁵,Glu³⁷,Arg^26,34,Lys³⁸-GLP-1(7–38)-OH (9 mg, 2,48 μmol), EDPA (9 mg, 69,4 μmol), NMP (1,25 ml) und Wasser (0,63 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (4 mg, 7,4 μmol) in NMP (100 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 105 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,1 mg, 54,6 μmol) in Wasser (410 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (27 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (15 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (15 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (2,9 mg, 29%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3967 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3966 ± 3 amu (theoretischer Wert 3997 amu).
Beispiel 10
Synthese von Gly⁸,Glu³⁷Arg^26,34,Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-octadecanoyl)))GLP-1(7–38)-OH
Einem Gemisch aus Gly⁸,Glu³⁷,Arg^26,34,Lys³⁸-GLP-1(7–38)-OH (9 mg, 2,5 μmol), EDPA (9 mg, 69,4 μmol), NMP (1,25 ml) und Wasser (0,63 ml) wurde eine Lösung von Ste-Glu(ONSu)-OBu^t (4,2 mg, 7,4 μmol) in NMP (105 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 105 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,1 mg, 54,6 μmol) in Wasser (409 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (27 ml) wurde zugesetzt und das erhalte ne Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (15 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (15 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (3,2 mg, 32%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3995 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3994 ± 3 amu (theoretischer Wert 3995 amu).
Beispiel 11
Synthese von Cap-Glu(ONSu)-OBu^t
Einer Lösung von Octansäure (5 g, 34,8 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (4 g, 34,7 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (10 ml) wurde eine Lösung von DCC (7,15 g, 34,7 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (15 ml) zugesetzt und das erhaltene Reaktionsgemisch für eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefällte Feststoff wurde abfiltriert und aus einem Gemisch aus n-Heptan (40 ml) und 2-Propanaol (2 ml) umkristallisiert. Der Niederschlag wurde in einem Vakuumtrocknungsofen für eine Dauer von 16 Std. getrocknet, um die Zwischenverbindung Cap-ONSu zu erhalten. Eine Suspension aus der rohen Esterzwischenverbindung (3,9 g, 16,2 mmol), (L)-H-Glu(OH)-OBu^t (3,28 g, 16,2 mmol), DMF (268 ml) und EDPA (2,1 g, 16,2 mmol) wurde für eine Dauer von 64 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand in Ethylacetat (50 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 5%iger, wässriger Zitronensäure (2 × 25 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand in DMF (36 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde einer wässrigen 10%igen Lösung von Zitronensäure (357 ml) zugetropft und mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert und getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt, um die rohe Glutaminsäurezwischenverbindung zu erhalten. Einem Gemisch aus der rohen Glutaminsäurezwischenverbindung, N-Hydroxysuccinimid (1,85 g, 16,1 mmol) und DMF (25 ml) wurde eine Lösung von DCC (3,32 g, 16,1 mmol) in Dichlormethan (15 ml) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 20 Std. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde über einer Silicagelsäule (40–63 μ) gereinigt, mit einem Gemisch aus Dichlormethan und Acetonitril (1 : 1) eluiert, um die Titelverbindung (0,63 g, 6% insgesamt) zu erhalten.
Beispiel 12
Synthese von Desamino-His⁷,Arg²⁶,Lys³⁴(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-octadecanoyl)))-GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Gly⁸-Desamino-His⁷,Arg²⁶,Lys³⁴-GLP-1(7–37)-OH (14,3 mg, 4,2 μmol), EDPA (15,3 mg, 119 μmol), NMP (2 ml) und Wasser (1 ml) wurde eine Lösung von Cap-Glu(ONSu)-OBu^t (6,8 mg, 12,7 μmol), hergestellt wie in Beispiel 11 beschrieben, in NMP (135 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (7 mg, 93 μmol) in Wasser (698 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (42 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (4,1 mg, 27%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3626 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3625 ± 3 amu (theoretischer Wert 3625 amu).
Beispiel 13
Synthese von Glu³⁷Arg^26,34,Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Glu³⁷,Arg^26,34,Lys³⁸-GLP-1(7–38)-OH (17,6 mg, 4,9 μmol), EDPA (17,6 mg, 136 μmol), NMP (1,23 ml) und Wasser (2,64 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (7,9 mg, 14,6 μmol) in NMP (197 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (8 mg, 107 μmol) in Wasser (804 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (49 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verwindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (5,1 mg, 26%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3981 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3980 ± 3 amu (theoretischer Wert 3981 amu).
Beispiel 14
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-octadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (41,1 mg, 12,2 μmol), EDPA (44 mg, 341 μmol), NMP (5,76 ml) und Wasser (2,88 ml) wurde eine Lösung von Ste-Glu(ONSu)-OBu^t (20,7 mg, 36,5 μmol) in NMP (517 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (20,1 mg, 268 μmol) in Wasser (2,01 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (120 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (15,4 mg, 34%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3781 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3780 ± 3 amu (theoretischer Wert 3779 amu).
Beispiel 15
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-decanoyl)GLP-1(7–37)
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (20 mg, 5,9 μmol), EDPA (21,4 mg, 165 μmol), NMP (2,8 ml) und Wasser (1,4 ml) wurde eine Lösung von Cac-ONSu (4,8 mg, 17,7 μmol) in NMP (119 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (9,8 mg, 130 μmol) in Wasser (98 μl) abgeschreckt. Das erhaltene Gemisch wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (7,4 mg, 35%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3539,6 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3538,6 ± 3 amu (theoretischer Wert 3538 amu).
Beispiel 16
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-hexadecanoyl)GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (41,1 mg, 12,2 μmol), EDPA (44 mg, 340 μmol), NMP (2,88 ml) und Wasser (2,88 ml) wurde eine Lösung von Pal-ONSu (12,9 mg, 36,5 μmol) in NMP (3,3 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 110 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (20,1 mg, 268 μmol) in Wasser (201 μl) abgeschreckt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (15 mg, 34%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 17
Synthese von Arg^26,34,Lys²⁷(N^ε(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg^26,34,Lys²⁷-GLP-1(7–37)-OH (11,6 mg, 3,4 μmol), EDPA (12,3 mg, 94,9 μmol), NMP (1,6 ml) und Wasser (0,8 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (5,5 mg, 10,2 μmol) in NMP (137 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (5,6 mg, 74,6 μmol) in Wasser (560 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (34 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (15 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (2,1 mg, 16%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 18
Synthese von Arg^26,34,Lys²³(N^ε(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg^26,34,Lys²³-GLP-1(7–37)-OH (11,6 mg, 3,4 μmol), EDPA (12,3 mg, 94,9 μmol), NMP (1,6 ml) und Wasser (0,8 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (5,5 mg, 10,2 μmol) in NMP (137 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (5,6 mg, 74,6 μmol) in Wasser (560 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (34 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (15 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (3,1 mg, 24%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 19
Synthese von Arg^26,34,Lys¹⁸(N^ε(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg^26,34,Lys¹⁸-GLP-1(7–37)-OH (11,7 mg, 3,4 μmol), EDPA (12,2 mg, 94,6 μmol), NMP (1,6 ml) und Wasser (0,8 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (5,5 mg, 10,2 μmol) in NMP (137 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (5,6 mg, 74,6 μmol) in Wasser (560 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (34 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (1,9 mg, 15%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 20
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(octanoyl)GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg³⁴,Lys²⁶-GLP-1(7–37)-OH (41,1 mg, 12,2 μmol), EDPA (44 mg, 341 μmol), NMP (5,76 ml) und Wasser (2,88 ml) wurde eine Lösung von Cap-ONSu (8,8 mg, 36,5 μmol), hergestellt wie in Beispiel 11 beschrieben, in NMP (106 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 115 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (20 mg, 268 μmol) in Wasser (200 μl) abgeschreckt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (18,8 mg, 44%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 21
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(dodecanoyl)GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (41,1 mg, 12,2 μmol), EDPA (44 mg, 341 μmol), NMP (5,76 ml) und Wasser (2,88 ml) wurde eine Lösung von Lau-ONSu (8,8 mg, 36,5 μmol), hergestellt in ähnlicher Weise wie beschreiben für Cap-ONSu in Beispiel 11, in NMP (271 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 100 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (20,1 mg, 268 μmol) in Wasser (200 μl) abgeschreckt. Das Lösungsmittel wurde im Vaku um eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (18 mg, 42%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 22
Synthese von Pal-GABA-ONSu
Ein Gemisch aus Pal-ONSu (3 g, 8,48 mmol), γ-Aminobuttersäure (0,87 g, 8,48 mmol) in DMF (200 ml) wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 60 Std. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat 10%iger Zitronensäure (500 ml) zugetropft. Die ausgefällte N-acylierte Zwischenverbindung wurde aufgefangen und im Vakuum getrocknet. Einer Suspension der getrockneten Zwischenverbindung in DMF (35 ml) wurde eine Lösung von DCC (1,45 g, 7,0 mmol) in Dichlormethan (20 ml) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 20 Std. gerührt und dann filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um einen festen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde aus einem Gemisch aus n-Heptan (50 ml) und 2-Propanol (2,5 ml) umkristallisiert, um die Titelverbindung (2,5 g, 75%) zu erhalten.
Beispiel 23
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(γ-aminobutyrol(N^γ-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Einem Gemisch aus Arg³⁴,Lys²⁶-GLP-1(7–37)-OH (41,1 mg, 12,2 μmol), EDPA (44 mg, 341 μmol), NMP (5,76 ml) und Wasser (2,88 ml) wurde eine Lösung von Pal-GABA-ONSu (16 mg, 36,5 μmol, hergestellt wie in Beispiel 22 beschrieben, in NMP (400 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 100 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (20 mg, 268 μmol) in Wasser (200 μl) abgeschreckt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (15,8 mg, 35%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 24
Synthese von N^ε-Hexadecanoyl-D-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
Einem Gemisch aus Pal-ONSu (6,64 mg, 18,8 mmol), D-Glutaminsäure-α-tert-butylester (4,5 g, 18,8 mmol) und EDPA (4,85 mg, 37,5 mmol), in DMF (538 ml) wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 60 Std. gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand in Ethylacetat (175 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 10%iger, wässriger Zitronensäure (2 × 125 ml) extrahiert und die organische Phase im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in DMF (60 ml) gelöst und das erhaltene Gemisch langsam zu 10%iger, wässriger Zitronensäure (500 ml) zugesetzt. Die ausgefällte Verbindung wurde aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um rohe N-acetylierte Glutaminsäurezwischenverbindung zu erhalten. Die rohe Zwischenverbindung wurde in DMF (35 ml) gelöst und eine Lösung von DCC (3,5 g, 17 mmol) in Dichlormethan (70 ml) wurde zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 20 Std. gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus einem Gemisch aus n-Heptan (75 ml) und 2-Propanol (5 ml) umkristallisiert, um die Titelverbindung (5,2 g, 50%) zu erhalten.
Beispiel 25
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(γ-D-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)-OH
Ein Gemisch aus Arg³⁴,Lys²⁶-GLP-1(7–37)-OH (41,1 mg, 12,2 μmol), EDPA (44 mg, 341 μmol), NMP (5,76 ml) und Wasser (2,88 ml) wurde eine Lösung von N^α-Hexadecanoyl-D-glutaminsäure-α-t-butylester-γ-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester (19,7 mg, 36,5 μmol) in NMP (491 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 95 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (20 mg, 268 μmol) in Wasser (2 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (120 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch in gleiche Portionen aufgeteilt und jede Portion auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Die kombinierten Eluate wurden im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (10,5 mg, 23%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Beispiel 26
Synthese von Lys³⁴(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-tetradecanoyl)))GLP-1(7–37)
Ein Gemisch aus GLP-1(7–37)-OH (33,6 mg, 8,9 μmol), EDPA (32,4 mg, 250 μmol), NMP (2,1 ml) und Wasser (2,1 ml) wurde eine Lösung von Myr-Glu(ONSu)-OBu^t (9,1 mg, 17,9 μmol), hergestellt wie in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/DK97/00340 beschrieben, in NMP (228 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 80 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (14,8 mg, 197 μmol) in Wasser (1,47 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (100 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch in zwei gleiche Portionen aufgeteilt und jede Portion auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (2 × 25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (2 × 25 ml) freigesetzt. Die kombinierten Eluate wurden im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (0,19 mg, 0,6%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3693 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3692 ± 3 amu (theoretischer Wert 3695 amu).
Beispiel 27
Synthese von Arg^26,34,Lys⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)
Ein Gemisch aus Arg^26,34,Lys⁸-GLP-1(7–37)-OH (10,3 mg, 3 μmol), EDPA (10,8 mg, 83 μmol), NMP (1,44 ml) und Wasser (0,72 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu(ONSu)-OBu^t (4,8 mg, 8,9 μmol), hergestellt wie in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/DK97/00340 beschrieben, in NMP (120 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 70 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,9 mg, 65,3 μmol) in Wasser (490 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (30 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (3,2 mg, 28%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3836 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3835 ± 3 amu (theoretischer Wert 3836 amu).
Beispiel 28
Synthese von Lau-Glu(ONSu)-OBu^t
Einer Lösung von H-Glu-OBu^t (3 g, 15 mmol) in DMF (344 ml) wurde EDPA (2,58 ml, 15 mmol) zugesetzt und eine Lösung von Lau-ONSu (4,5 g, 15 mmol), hergestellt in ähnlicher Weise wie für Cap-ONSu in Beispiel 11 beschrieben, in DMF (74 ml) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der ölige Rückstand wurde zwischen Ethylacetat (150 ml) und 5%iger, wässriger Zitronensäure (250 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in DMF (40 ml) gelöst und die Lösung einer 10%igen, wässrigen Zitronensäurelösung (350 ml) zugetropft. Das ausgefällte Produkt wurde aufgefangen, mit Wasser gewaschen und im Vakuum für eine Dauer von 18 Std. getrocknet, um die freie Säurezwischenverbindung zu erhalten. Der Lösung der freien Säurezwischenverbindung in DMF (25 ml) wurde N-Hydroxysuccinimid (1,7 g, 14,8 mmol) und eine Lösung von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (2,58 g, 13,5 mmol) in Dichlormethan (52 ml) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt und die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der ölige Rückstand wurde zwischen Dichlormethan (80 ml) und Wasser (80 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde mit 5%iger, wässriger Zitronensäure gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem Feststoff eingeengt. Der feste Rückstand wurde aus einem Gemisch aus n-Heptan (77 ml) und 2-Propanol (50 ml) umkristallisiert und schließlich auf n-Heptan (76 ml) umkristallisiert, um die Titelverbindung (2,96 g, 46%) zu erhalten.
Beispiel 29
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-dodecanoyl)))GLP-1(7–37)
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (20,6 mg, 6,1 μmol), EDPA (22 mg, 171 μmol), NMP (2,88 ml) und Wasser (1,44 ml) wurde eine Lösung von Lau-Glu(ONSu)-OBu^t (10,2 mg, 21,2 μmol), hergestellt wie in Beispiel 28 beschrieben, in NMP (255 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 75 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (10 mg, 134 μmol) in Wasser (100 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (61 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (8,2 mg, 36%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3693 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3692 ± 3 amu (theoretischer Wert 3693 amu).
Beispiel 30
Synthese von Lau-β-Ala-ONSu
Einer Lösung von Lau-ONSu (4,25 g, 14,3 mmol), hergestellt in ähnlicher Weise wie in DMF (400 ml) wurde EDPA (1,84 g, 14,3 mmol) und β-Alanin (1,27 g, 14,3 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt. Wasser (250 ml) und DMF (50 ml) wurden zugesetzt und die Lösung für eine Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Der feste Rückstand wurde in DMF (50 ml) gelöst und die Lösung einer 5%igen, wässrigen Lösung von Zitronensäure (200 ml) zugetropft. Der Niederschlag wurde aufgefangen, mit Wasser gewaschen (50 ml) und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung (3,6 g, 93%) zu erhalten.
Beispiel 31
Synthese von Pal-β-Ala-ONSu
Einer Lösung von Pal-ONSu (4,25 g, 14,3 mmol) in DMF (400 ml) wurde EDPA (1,84 g, 14,3 mmol) und β-Alanin (1,27 g, 14,3 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt. Wasser (250 ml) und DMF (50 ml) wurden zugesetzt und die Lösung für eine Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Der feste Rückstand wurde in DMF (50 ml) gelöst und die Lösung einer 5%igen, wässrigen Lösung von Zitronensäure (200 ml) zugetropft. Der Niederschlag wurde aufgefangen, mit Wasser gewaschen (50 ml) und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung (3,6 g, 93%) zu erhalten.
Beispiel 32
Synthese von Myr-GABA-ONSu
Einer Lösung von Myr-ONSu (4 g, 12,3 mmol) in DMF (350 ml) wurde EDPA (1,58 g, 12,3 mmol) und γ-Aminobuttersäure (1,26 g, 12,3 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt. Wasser (50 ml) wurde zugesetzt und die Lösung für eine Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Der feste Rückstand wurde in DMF (75 ml) gelöst und die Lösung einer 5%igen, wässrigen Lösung von Zitronensäure (250 ml) zugetropft. Der Niederschlag wurde aufgefangen, mit Wasser gewaschen (100 ml) und im Vakuum getrocknet, um die freie Säurezwischenverbindung (3,65 g, 95%) zu erhalten. Eine Lösung aus der freien Säurezwischenverbindung (3 g, 9,6 mmol), N-Hydroxysuccinimid (1,65 g, 14,4 mmol) und N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (3,67 g, 19,1 mmol) in DMF (330 ml) wurde über einen Zeitraum von 18 Std. bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Der feste Rückstand wurde in Dichlormethan (100 ml) gelöst und mit Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt, um einen Feststoff zu erhalten. Der feste Rückstand wurde aus n-Heptan (75 ml) umkristallisiert, um die Titelverbindung (2,8 g, 71%) zu erhalten.
Beispiel 33
Synthese von Pal-β-Ala-ONSu
Einer Lösung von Pal-ONSu (0,9 g, 2,8 mmol) in DMF (100 ml) N-Hydroxysuccinimid (0,35 g, 3 mmol) und N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (0,79 g, 4,1 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 40 Std. gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Lösung wurde zwischen Wasser (50 ml) und Dichlormethan (50 ml) aufgeteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung (1,1 g, 94%) zu erhalten.
Beispiel 34
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^β-(β-alanyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (19,2 mg, 5,7 μmol), EDPA (20,5 mg, 159 μmol), NMP (2,7 ml) und Wasser (1,35 ml) wurde eine Lösung von Pal-β-Ala-ONSu (7,2 mg, 17 μmol), hergestellt wie in Beispiel 33 beschrieben, in NMP (181 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (9,3 mg, 125 μmol) in Wasser (93 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (11,6 mg, 55%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3694 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3693 ± 3 amu (theoretischer Wert 3693 amu).
Beispiel 35
Synthese von Pal-Glu(OBu^t)-ONSu
Einer Lösung von H-Glu(OH)-OBu^t (2,7 g, 11,3 mmol) und Pal-ONSu (3,98 g, 11,3 mmol) in DMF (300 ml) wurde EDPA (3,2 g, 24,3 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt und die Lösung im Vakuum eingeengt, um ein Öl zu erhalten. Der ölige Rückstand wurde in DMF (60 ml) gelöst und die Lösung 10%iger, wässriger Zitronensäure (300 ml) zugetropft, wodurch ein Niederschlag erhalten wurde. Der Niederschlag wurde aufgefangen, mit kaltem Wasser (25 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um ein freies Säurezwischenprodukt (4,44 g, 69%) zu erhalten. Das freie Säurezwischenprodukt (4 g, 9,1 mmol) wurde in DMF (50 ml) gelöst and N-Hydroxysuccinimid (1,15 g, 10 mmol) und N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethytcarbodiimidhydrochlorid (2,6 g, 13,6 mmol) wurden zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 60 Std. gerührt, das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt, um die rohe Titelverbindung (8,2 g) zu erhalten.
Beispiel 36
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(α-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (25,6 mg, 7,6 μmol), EDPA (27,4 mg, 212 μmol), NMP (3,5 ml) und Wasser (1,75 ml) wurde eine Lösung von Pal-Glu-(OBu^t)-ONSu (12,2 mg, 22,7 μmol) hergestellt, wie in Beispiel 35 beschrieben, in NMP (305 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 100 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (12,5 mg, 168 μmol) in Wasser (125 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (72,5 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (30 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule würde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (6,1 mg, 22%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3751 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3750 ± 3 amu (theoretischer Wert 3751 amu).
Beispiel 37
Synthese von Ste-GABA-ONSu
Einer Lösung von Ste-ONSu (3 g, 7,9 mmol) in DMF (270 ml) wurde EDPA (1 g, 7,9 mmol) und eine Lösung von γ-Aminobuttersäure (0,81 g, 7,9 mmol) in Wasser (40 ml) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt und dann im Vakuum zu einem Endvolumen von 50 ml eingeengt. Die erhaltene Suspension wurde zu einer 5%igen, wässrigen Lösung von Zitronensäure (500 ml) zugesetzt, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. Der Niederschlag wurde aufgefangen, mit Wasser gewaschen (50 ml) und im Vakuum für eine Dauer von 4 Std. getrocknet, um die freie Säurezwischenverbindung (2,8 g, 97%) zu erhalten. Ein Gemisch aus der freien Säurezwischenverbindung (2,6 g, 7 mmol), N-Hydroxysuccinimid (1,21 g, 10,5 mmol) und N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,69 g, 14 mmol) in NMP (300 ml) wurde über einen Zeitraum von 70 Std. gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Der feste Rückstand wurde in Dichlormethan (100 ml) gelöst und mit Kochsalzlösung (2 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt, um einen Feststoff zu erhalten. Der feste Rückstand wurde aus n-Heptan (75 ml) umkristallisiert, um die Titelverbindung (2,2 g, 67%) zu erhalten.
Beispiel 38
Synthese von Pal-Isonip-ONSu
Einer Suspension von 1-Hexadecanoylbenzotriazol (3 g, 8,4 mmol), hergestellt wie in der Literatur beschrieben (Kreutzberger; van der Goot, Arch. Pharm., 307,1974), in DMF (350 ml) wurde EDPA (1,08 g, 8,4 mmol) und eine Lösung von Piperidin-4-carbonsäure in Wasser (20 ml) zugesetzt. Die erhaltene Suspension wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 12 Tagen gerührt und dann im Vakuum zu einem Öl eingeengt. Der ölige Rückstand wurde einer 5%igen, wässrigen Lösung von Zitronensäure (300 ml) zugetropft, wodurch sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde aufgefangen und mit Wasser (50 ml) gewaschen, im Vakuum für eine Dauer von 2 Std. getrocknet, um die freie Säurezwischenverbindung (3 g, 97%) zu erhalten. Einer Lösung der freuen Säurezwischenverbindung (2,8 g, 7,6 mmol), N-Hydroxysuccinimid (1,31 g, 11,4 mmol) in DMF (250 ml) wurde N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,92 g, 15,2 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 18 Std. gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein Öl zu erhalten. Der ölige Rückstand wurde in Dichlormethan (100 ml) gelöst, mit Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt um die rohe Titelverbindung (4,1 g, quant.) zu erhalten.
Beispiel 39
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(piperidinyl-4-carbonyl(N-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37)
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (25 mg, 7,4 μmol), EDPA (26,7 mg, 207 μmol), NMP (3,5 ml) und Wasser (1,75 ml) wurde eine Lösung von Pal-Isonip-ONSu (13,7 mg, 30 μmol), hergestellt wie in Beispiel 38 beschrieben, in NMP (343 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 90 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (12,2 mg, 163 μmol) in Wasser (122 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (12 mg, 44%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3734 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3733 ± 3 amu (theoretischer Wert 3733 amu).
Beispiel 40
Synthese von Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-decanoyl)))GLP-1(7–37)
Einem Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7–37)-OH (25 mg, 7,4 μmol), EDPA (26,7 mg, 207 μmol), NMP (3,5 ml) und Wasser (1,75 ml) wurde eine Lösung von Cac-Glu(ONSu)-OBu^t (10 mg, 22,1 μmol) in NMP (252 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine Dauer von zusätzlichen 140 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (12,2 mg, 162 μmol) in Wasser (122 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Lösung von Ammoniumacetat (73 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf einem Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich von der Kartusche durch Elution mit TFA (25 ml) freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines Standard-Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt und der Acetonitrilgradient war innerhalb von 60 Min. 0–100%ig. Die Titelverbindung (12,2 mg, 45%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z- Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3669,7 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3668,7 ± 3 amu (theoretischer Wert 3667 amu).
Beispiele für pharmazeutische Formulierungen
Im Folgenden soll „8 mM Phosphatpuffer von pH 7,4" bedeuten:
4 mM NaH₂PO₄, 2H₂O und 4 mM Na₂HPO₄, 2H,O;
pH-Wert, eingestellt auf 7,4 (unter Verwendung von Natriumhydroxid und/oder Salzsäure).
Im Folgenden soll „Verbindung 1" Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(^γ-Glu(N^α-tetradecanoyl)))GLP-1(7–37) bedeuten.
Im Folgenden soll „Verbindung 2" Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε-(^γ-Glu(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37) bedeuten.
Im Folgenden soll „Verbindung 3" Arg^26,34,Lys³⁶(N^ε-(^γ-Glu(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–36) bedeuten.
Im Folgenden soll „Verbindung 4" Arg²⁶,Lys³⁴(N^ε-(^γ-Glu(N^α-hexadecanoyl)))GLP-1(7–37) bedeuten.
Im Folgenden soll „Verbindung 5": Gly⁸,Glu³⁷,Arg^26,34,Lys³⁸(N^α-(^γ-Glu(N^α-hexadecanoyl))) GLP-1(7–38) bedeuten. Allgemeines Beispiel A

Verbindung 2–7,5 mg/ml

Mannit 34–50 mg/ml

Phenol 5–7,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4
Mannit und Phenol wurden im Phosphatpuffer, der auf einen pH-Wert von 7,4 voreingestellt war, gelöst. Anschließend wurde die Verbindung unter langsamem Rühren gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7,4 unter Verwendung von Natriumhydroxid und/oder Salzsäure eingestellt. Schließlich wurde die Formulierung durch Filtration durch einen geeigneten Filter sterilisiert.
Die folgenden spezifischen Formulierungen wurden unter Verwendung des Verfahrens unter Allgemeines Beispiel A hergestellt: Beispiel A1

Verbindung 1 2,0 mg/ml

Mannit 38 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A2

Verbindung 1 5 mg/ml

Mannit 36,9 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

6 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A3

Verbindung 1 7,5 mg/ml

Mannit 34 mg/ml

Phenol 7,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A4

Verbindung 2 2,0 mg/ml

Mannit 38 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A5

Verbindung 2 5 mg/ml

Mannit 36,9 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A6

Verbindung 2 7,5 mg/ml

Mannit 34 mg/ml

Phenol 7,6 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von ph-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A7

Verbindung 3 2,0 mg/ml

Mannit 38 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH 7,4 auf 100 ml Beispiel A8

Verbindung 3 5 mg/ml

Mannit 36,9 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A9

Verbindung 3 7,5 mg/ml

Mannit 34 mg/ml

Phenol 7,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A10

Verbindung 4 2,0 mg/ml

Mannit 38 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A11

Verbindung 4 5 mg/ml

Mannit 36,9 mg/ml

Phenol 5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel A12

Verbindung 4 7,5 mg/ml

Mannit 34 mg/ml

Phenol 7,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Allgemeines Beispiel B

Verbindung 2–7,5 mg/ml

Mannit 19–25 mg/ml

Benzylalkohol 14–18 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4
Mannit und Benzylalkohol wurden in Phosphatpuffer, der auf einen pH-Wert von 7,4 voreingestellt war, gelöst. Anschließend wurde die Verbindung unter langsamem Rühren gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7,4 unter Verwendung von Natrium hydroxid und/oder Salzsäure eingestellt. Schließlich wurde die Verbindung durch Filtration durch einen geeigneten Filter sterilisiert.
Die folgenden spezifischen Formulierungen wurden unter Verwendung des Verfahrens unter Allgemeinem Beispiel B hergestellt: Beispiel B1

Verbindung 1 2,0 mg/ml

Mannit 25 mg/ml

Benzylalkohol 14 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH 7,4-Wert auf 100 ml Beispiel B2

Verbindung 1 7,5 mg/ml

Mannit 19 mg/ml

Benzylalkohol 18 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel B3

Verbindung 2 2,0 mg/ml

Mannit 25 mg/ml

Benzylalkohol 14 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH 7,4-Wert auf 100 ml Beispiel B4

Verbindung 2 7,5 mg/ml

Mannit 19 mg/ml

Benzylalkohol 18 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel B5

Verbindung 3 2,0 mg/ml

Mannit 25 mg/ml

Benzylalkohol 14 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH 7,4-Wert auf 100 ml Beispiel B6

Verbindung 3 7,5 mg/ml

Mannit 19 mg/ml

Benzylalkohol 18 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH 7,4-Wert auf 100 ml Beispiel B7

Verbindung 5 2,0 mg/ml

Mannit 25 mg/ml

Benzylalkohol 14 mg/ml

6 mM Phosphatpuffer von pH 7,4-Wert auf 100 ml Beispiel B8

Verbindung 5 7,5 mg/ml

Mannit 19 mg/ml

Benzylalkohol 18 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Allgemeines Beispiel C

Verbindung 2–7,5 mg/ml

Mannit 42–44 mg/ml

meta-Cresol 2,5–4,0 mg/ml

6 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4
Mannit und meta-Cresol wurden in Phosphatpuffer, der auf einen pH-Wert von 7,4 voreingestellt war gelöst. Anschließend wurde die Verbindung unter langsamem Rühren gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7,4 unter Verwendung von Natriumhydroxid und/oder Salzsäure eingestellt. Schließlich wurde die Verbindung durch Filtration durch einen geeigneten Filter sterilisiert.
Die folgenden spezifischen Formulierungen wurden unter Verwendung des Verfahrens unter Allgemeinem Beispiel C hergestellt: Beispiel C1

Verbindung 1 2,0 mg/ml

Mannit 44 mg/ml

meta-Cresol 2,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel C2

Verbindung 1 7,5 mg/ml

Mannit 42 mg/ml

meta-Cresol 4 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH 7,4-Wert auf 100 ml Beispiel C3

Verbindung 2 2,0 mg/ml

Mannit 44 mg/ml

meta-Cresol 2,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel C4

Verbindung 2 7,5 mg/ml

Mannit 42 mg/ml

meta-Cresol 4 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel C5

Verbindung 3 2,0 mg/ml

Mannit 44 mg/ml

meta-Cresol 2,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel C6

Verbindung 3 7,5 mg/ml

Mannit 42 mg/ml

meta-Cresol 4 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel C7

Verbindung 5 2,0 mg/ml

Mannit 44 mg/ml

meta-Cresol 2,5 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml Beispiel C8

Verbindung 5 7,5 mg/ml

Mannit 42 mg/ml

meta-Cresol 4 mg/ml

8 mM Phosphatpuffer von pH-Wert 7,4 auf 100 ml

Claims

Arzneimittel, umfassend ein GLP-Derivat mit einem Helix-Gehalt, gemessen mittels CD bei 222 nm in H₂O bei 22 ± 2°C, von über 25%, vorzugsweise im Bereich von 25% bis 50%, bei einer Peptidkonzentration von etwa 10 μM, wobei die Konzentration des GLP-1-Derivats nicht weniger als 0,5 mg/ml beträgt, und ein Konservierungsmittel.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des GLP-1-Derivats nicht weniger als 5 mg/ml ist, stärker bevorzugt nicht weniger als 10 mg/ml und vorzugsweise nicht mehr als 100 mg/ml.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei mindestens ein Aminosäurerest des Stammpeptids einen angehängten lipophilen Substituenten aufweist.
Arzneimittel nach Anspruch 3, umfassend ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, der an einem der Aminosäurereste in Position 18–38, vorzugsweise 26–34, angehängt wird.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche ferner umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Bindemittel oder einen Träger.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche ferner umfassend ein isotonisches Mittel, das vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid, Mannit und Glycerin, gewählt wird.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Konservierungsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Phenol, m-Kresol, Methyl-p-Hydroxybenzoat, Butyl-p-Hydroxybenzoat und Benzylalkohol, gewählt wird.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend einen Puffer, der vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Natriumacetat, Citrat, Glycylglycin, Histidin, 2-Phenylethanol und Natriumphosphat, gewählt wird.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend ein oberflächeaktives Mittel, das in der Lage ist, die Löslichkeit und/oder die Stabilität des GLP-1-Derivats, das vorzugsweise aus Poloxymer 188, Tween 20 und Tween 80 gewählt wird, zu verbessern.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent 4 bis 40 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 8 bis 25 Kohlenstoffatome, umfasst.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei ein lipophiler Substituent an einem Aminosäurerest so angehängt ist, dass der lipophile Substituent eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests bildet.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei ein lipophiler Substituent an einem Aminosäurerest so angehängt ist, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung mit einer Carboxylgruppe des Aminosäurerests bildet.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent am Stammpeptid mittels eines Spacers angehängt ist.
Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei der Spacer eine nicht-verzweigte Alkan-α,ω-Dicarbonsäuregruppe mit 1 bis 7 Methylengruppen ist, vorzugsweise zwei Methylengruppen, die eine Brücke zwischen einer Aminogruppe des Stammpeptids und einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bildet.
Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei der Spacer ein Aminosäurerest außer Cys oder ein Dipeptid, wie Gly-Lys, oder eine nicht-verzweigte Alkan-α,ω-Aminosäure mit 1 bis 7 Methylengruppen ist, vorzugsweise 2 bis 4 Methylengruppen, die eine Brücke zwischen einer Aminogruppe des Stammpeptids und einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bildet.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent ein teilweise oder komplett hydriertes Cyclopentanophenathren-Skelett umfasst.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, wobei der lipophile Substituent eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent die Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Fettsäure ist.
Arzneimittel nach Anspruch 18, wobei die Acylgruppe aus der Gruppe, bestehend aus CH₃(CH₂)_nCO-, wobei n 4 bis 38 ist, vorzugsweise CH₃(CH₂)₆CO-, CH₃(CH₂)₈CO-, CH₃(CH₂)₁₀CO-, CH₃(CH₂)₁₂CO-, CH₃(CH₂)₁₄CO-, CH₃(CH₂)₁₆CO-, CH₃(CH₂)₁₈CO-, CH₃(CH₂)₂₀CO- und CH₃(CH₂)₂₂CO-, gewählt wird.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Alkan-α,ω-Dicarbonsäure ist.
Arzneimittel nach Anspruch 20, wobei die Acylgruppe aus der Gruppe, bestehend aus HOOC(CH₂)_mCO-, wobei m 4 bis 38 ist, vorzugsweise 4 bis 24, gewählt wird, stärker bevorzugt aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH₂)₁₄CO-, HOOC(CH₂)₁₆CO-, HOOC(CH₂)₁₈CO-, HOOC(CH₂)₂₀CO- und HOOC(CH₂)₂₂CO-.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_p((CH₂)_qCOOH)CHNH-CO(CH₂)₂CO- ist, und wobei p und q ganze Zahlen sind, und p + q eine ganze Zahl von 8 bis 33, vorzugsweise von 12 bis 28, ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_rCO-NHCH(COOH)(CH₂)₂CO- ist, und wobei r eine ganze Zahl von 10 bis 24 ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_sCO-NHCH((CH₂)₂COOH)CO- ist, und wobei s eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)_uCH₃ ist, und wobei u eine ganze Zahl von 8 bis 18 ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-COCH((CH₂)₂COOH)NH-CO(CH₂)_wCH₃ ist, und wobei w eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COCH)NH-CO(CH₂)_xCH₃ ist, und wobei x eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei der lipophile Substituent eine Gruppe der Formel NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO((CH₂)₂CH(COOH)NH-CO(CH₂)_yCH₃ ist, und wobei y Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei das Stammpeptid GLP-1(A–B), und wobei A eine ganze Zahl von 1 bis 7 und B eine ganze Zahl von 38 bis 45 ist, oder ein Analogon davon ist.
Arzneimittel nach Anspruch 29, wobei das Stammpeptid aus der Gruppe, bestehend aus GLP-1(7–35); GLP-1(7–36); GLP-1(7–36)-Amid; GLP-1(7–37); GLP-1(7–38); GLP-1(7–39); GLP-1(7–40) und GLP-1(7–41) und Analoga davon gewählt wird.
Arzneimittel nach Anspruch 29, wobei das Stammpeptid aus der Gruppe, bestehend aus GLP-1(1–35); GLP-1(1–36); GLP-1(1–36)-Amid; GLP-1(1–37); GLP-1(1–38); GLP-1(1–39); GLP-1(1–40) und GLP-1(1–41) und Analoga davon gewählt wird.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei insgesamt bis 15, vorzugsweise bis 10, stärker bevorzugt bis 6, Aminosäurereste mit einem α-Aminosäurerest, der mit dem genetischen Code kodiert werden kann, ausgetauscht ist.
Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei das Stammpeptid aus der Gruppe, bestehend aus Arg²⁶-GLP-1(7–37); Arg³⁴-GLP-1(7–37); Lys³⁸-GLP-1(7–37); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–37); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–38); Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(7–37); Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(7–37); Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(7–39); Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Arg^26,34Lys^38,39-GLP-1(7–39); Arg^26,34Lys^38,40-GLP-1(7–40); Gly⁸Arg²⁶-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg³⁴-GLP-1(7–37); Gly⁸Lys³⁸-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7–39); Gly⁸Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(7–37); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7–39); Gly⁸Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7–40); Gly⁸Arg^26,34Lys^38,39-GLP-1(7–39) und Gly⁸Arg^26,34Lys^38,40-GLP-1(7–40) gewählt wird.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 32, umfassend ein GLP-1-Derivat, wobei das Stammpeptid aus der Gruppe, bestehend aus Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7–38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(7–39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(7–40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(7–41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(7–42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(7–43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(7–44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(7–45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(1–38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(1–39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(1–40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(1–41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(1–42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(1–43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(1–44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(1–45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(2–38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(2–39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(2–40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(2–41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(2–42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(2–43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(2–44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(2–45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(3–38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(3–39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(3–40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(3–41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(3–42); Arg^26,34Lys⁴³GLP- 1(3–43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(3–44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(3–45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(4–38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(4–39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(4–40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(4–41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(4–42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(4–43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(4–44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(4–45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(5–38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(5–39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(5–40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(5–41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(5–42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(5–43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(5–44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(5–45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(6–38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(6–39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(6–40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(6–41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(6–42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(6–43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(6–44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(6–45); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(1–38); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(1–38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(1–38); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(7–38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(7–38); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7–38); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(1–39); Arg³⁴Lys³⁹-GLP-1(1–39); Arg^26,34Lys^38,39GLP-1(1–39); Arg²⁶Lys³⁹GLP-1(7–39); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(7–39) und Arg^26,34Lys^38,39GLP-1(7–39) gewählt wird.
Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit und/oder Stabilität von GLP-1, eines Fragments oder eines Analogons davon, dadurch gekennzeichnet, dass ein lipophiler Substituent in einen der Aminosäurereste des Stammpeptids eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei ein lipophiler Substituent in einen der Aminosäurereste in Position 18–38, vorzugsweise 26–34, eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei der lipophile Substituent 4 bis 40 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 8 bis 25 Kohlenstoffatome, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei der lipophile Substituent die Acylgruppe einer geradekettigen oder verzweigten Fettsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Acylgruppe aus der Gruppe, bestehend aus CH₃(CH₂)_nCO-, und wobei n 4 bis 38 ist, vorzugsweise CH₃(CH₂)₆CO-, CH₃(CH₂)₈CO-, CH₃(CH₂)₁₀CO-, CH₃(CH₂)₁₂CO-, CH₃(CH₂)₁₄CO-, CH₃(CH₂)₁₆CO-, CH₃(CH₂)₁₈CO-, CH₃(CH₂)₂₀CO- und CH₃(CH₂)₂₂CO-, gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 39, wobei das GLP-1 GLP-1(A–B), und wobei A eine ganze Zahl von 1 bis 7 und B eine ganze Zahl von 38 bis 45 ist, oder ein Analogon davon ist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das GLP-1 aus der Gruppe, bestehend aus GLP-1(7–35); GLP-1(7–36); GLP-1(7–36)-Amid; GLP-1(7–37); GLP-1(7–38); GLP-1(7–39); GLP-1(7–40); GLP-1(7–41); und Analoga davon gewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das GLP-1 aus der Gruppe, bestehend aus GLP-1(1–35); GLP-1(1–36); GLP-1(1–36)-Amid; GLP-1(1–37); GLP-1(1–38); GLP-1(1–39); GLP-1(1–40); GLP-1(1–41); und Analoga davon gewählt wird.