MX2012012383A - Peptido para mejorar la bioestabilidad de una sustancia bioactica y sustancia bioactiva que tiene bioestabilidad mejorada. - Google Patents

Abstract

La presente invención tiene como objetivo proporcionar un fragmento de péptido capaz de mejorar la bioestabilidad de una sustancia bioactiva mientras que mantiene la actividad de la sustancia bioactiva, y una sustancia bioactiva a la cual se agrega el fragmento de péptido. La presente invención se refiere a un péptido parcial de un módulo GA que tiene de 5 a 25 aminoácidos, que incluye una secuencia parcial de un módulo GA (SEQ ID NO; 1) y la secuencia de aminoácidos Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO:2), y un complejo bioactivo en el cual el péptido parcial del módulo GA se enlaza a una sustancia bioactiva. La sustancia bioactiva incluye GLP-1, GLP-2, GIP, VIP, somatostatina, amilina, grelina y derivados de los mismos.

Description

PEPTIDO PARA MEJORAR LA BIOESTABILIDAD DE UNA SUSTANCIA BIOACTIVA Y SUSTANCIA BIOACTIVA QUE TIENE BIOESTABILIDAD MEJORADA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un péptido para mejorar la bioestabilidad de sustancias bioactivas y similares, y un complejo de péptido en el cual el péptido se enlaza a una sustancia bioactiva.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La rápida eliminación de sustancias bioactivas (tales como proteínas, péptidos, y similares) in vivo algunas veces puede restringir las eficacias de la medicina cuando las sustancias se aplican para medicina. Por ejemplo, se cree que las acciones fisiológicas del GLP-1 (péptido-1 similar a glucagón) son útiles en la medicina para diabetes, pero la vida media de eliminación en la sangre del mismo es de 2 a 3 minutos, y por lo tanto es necesaria una infusión continua o administración frecuente para obtener una ' eficacia suficiente. Como una solución de la misma, se estudian los GLP-1 modificados con ácido graso (Documento No. de Patente 1 y Documento de Patente 1) . Es decir, como resultado de la modificación del GLP-1 .con ácido graso que imparte en consecuencia una afinidad a la albúmina, que es una proteína sanguínea, se evita la enzimolisis y la excreción renal y se puede lograr la mejora de la vida media de eliminación en la sangre. Cuando la modificación se lleva a cabo usando un ácido graso, una molécula de cadena larga hidrofóbica tal como polietilenglicol ' (PGE) , o un poliéter, sin embargo, surgen los problemas de etapas de producción complicadas y rendimientos de producción disminuidos.

Se sabe . que algunas clases de proteínas derivadas de bacterias Gram-positivas tal como la proteína G tienen una región que tiene una alta afinidad a la albúmina, y un péptido de 46 residuos de aminoácido llamado un módulo GA o un ABD (Dominio de enlace a albúmina) son conocidos como una región mínima que tiene la capacidad descrita en lo anterior (Documento no de Patente -2) . De hecho, se sabe que algunas clases de proteínas de anticuerpo a las cuales el módulo GA se agrega tienen bioestabilidad más mejorada que aquellas de las proteínas de anticuerpo que no tienen módulo GA (Documento no de Patente 3) . Similarmente, también se sabe que cuando un segmento de péptido derivado de una proteína A estafilocócica o proteína G estreptocócica y enlazada · a la albúmina de suero o inmunoglobulina G se enlaza a una proteína bioactiva, la vida media in vivo se puede prolongar (Documento de Patente 3) . Se sabe que un péptido compuesto de una secuencia de módulo GA tiene una capacidad de enlace a albúmina en la segunda parte de la hélice y la tercera parte de la hélice del módulo GA (Documento de Patente 2 y Documento no de Patente 4).

Documentos Técnicas del Arte Anterior Documento de Patentes Documento de Patente 1 WO1996/029342 Documento de Patente 2 WO2009/016043 Documento de Patente 3 O91/001743 Documento no de Patentes Documento no de Patente 1 J Med Chem, 2000, 43 (9), 1664-1669 Documento no de Patente 2 Biochemistry, 1992, 31 (5), 1451-1457 Documento no de Patente 3 Protein Eng Des Sel, 2007, 20 (11), 569-576 Documento no de Patente 4 Protein Eng Des Sel, 2008, 21 (8), 515-527 SUMARIO DE LA INVENCIÓN Problema Técnico Como se establece en lo anterior, se puede esperar que cuando el módulo GA se agregue a una sustancia bioactiva, se mejora la bioestabilidad de la sustancia bioactiva. Sin embargo, como resultado del estudio de los presentes inventores, han descubierto un nuevo problema de que si el péptido del residuo 46 de módulo GA se agrega a la sustancia bioactiva o similar, la actividad del mismo se disminuye notablemente comparado con aquellos que no tienen péptido de los 46 residuos del módulo .GA. La presente invención, por consiguiente, tiene . como objetivo proporcionar un fragmento de péptido capaz de mejorar la bioestabilidad mientras que mantiene la actividad de la sustancia bioactiva.

Solución al Problema Los presentes inventores han considerado que la disminución notable de la actividad provocada por la adición del péptido de los 46 residuos de módulo GA a la sustancia bioactiva resulta de una diferencia en la longitud de la secuencia de aminoácidos agregada, y se ha estudiado cuidadosamente para encontrar un sitio particularmente esencial para la mejora de la bioestabilidad de la sustancia bioactiva, con un enfoque en la tercera parte de la hélice en los 46 residuos de módulo GA. Como resultado, han descubierto un péptido que incluye una secuencia parcial del módulo GA (a partir de ahora referido como el "péptido parcial del módulo GA") capaz de evitar significativamente la disminución de la actividad de la sustancia bioactiva y de bioestabilidad de la misma, y han completado la presente invención.

Es decir, las presentes invenciones tienen características constituyentes principales como sigue: (1) Un péptido parcial de un módulo GA, que comprende la secuencia' de aminoácidos: Ile-Asp-Glu-Ile-Leu y que tienen 5 a 25 aminoácidos. (2) El péptido parcial de acuerdo con el artículo (1) anterior, en donde el módulo GA se deriva de un estreptococo G148. (3) El péptido parcial de acuerdo con el artículo (1) anterior, que tiene de 5 a 17 aminoácidos. (4) El péptido parcial de acuerdo con el artículo (1) anterior, que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: Y22-Y23-Y24-Y25- Y26-Y27-Y28-Y29- Y30- 31- 32-Y33- 34-Y35 - 36-Y37-Ile- sp- Glu-Ile-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46 en donde: Y22 es Lys o supresión; Y23 es Asn o supresión; Y24 es Leu o supresión; Y2s es lie o supresión; Y26 es Asn o supresión; Y27 es Asn o supresión; Y28 es Ala o supresión; Y29 es Lys o supresión; Y30 es Thr o supresión; Y3i es Val o supresión; Y32 es Glu o supresión; Y33 es Gly o supresión; Y34 es Val o supresión; Y35 es Lys o supresión; Y36 es. Ala o supresión; Y37 es Leu o supresión; Y43 es Ala o supresión; Y44 es Ala o supresión; Y45 es Leu o supresión; y Y4¾ es Pro o supresión, con la condición que la supresión se limite a una supresión continua de Y22 y/o Y46 (que incluye una sola supresión de Y22 o Y46, y supresiones en dos porciones de Y22 y Y46 solas) . (5) El péptido parcial de acuerdo con el articulo (4) anterior, que se selecciona del grupo que consiste de: Ile--Asp--Glu--lie--Leu (SEQ ID NO : 2 ) ; Ile--Asp--Glu--lie--Leu--Ala-Ala (SEQ ID NO: 3) ; Leu--lie--Asp--Glu--Ile--Leu-Ala--Ala (SEQ ID NO: 4) ; Lys--Ala--Leu--lie--Asp--Glu-Ile--Leu-Ala-Ala (SEQ ID 1 NO: 5) Val--Lys--Ala--Leu--lie--Asp-Glu--Ile-Leu-Ala--Ala (SEQ ID NO : .6) ; Gly--Val--Lys--Ala--Leu--Ile-Asp--Glu-Ile-Leu--Ala (SEQ ID NO : 7); Gly--Val--Lys--Ala--Leu--Ile-Asp--Glu-Ile-Leu--Ala-Ala (SEQ ID NO: 8 ) ; Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (SEQ ID NO: 9) ; Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (SEQ ID NO: 10) ; Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 11); Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu ( SEQ ID NO: 12) ; Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (SEQ ID NO: 13); Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (SEQ ID NO: 14); Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (SEQ ID NO: 15); y Lys-Asn-Leu-Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (SEQ ID NO: 16) . (6) El péptido parcial, que inicia con una de las posiciones de aminoácidos 22 a 38 del módulo GA representado en SEQ ID NO: 1 y termina con una de las posiciones de aminoácidos 42 a 46 de los mismos. (7) Un complejo bióactivo que comprende el péptido parcial de acuerdo con cualquiera de los artículos (1) a (6) y una sustancia bioactiva enlazada al péptido parcial. (8) El complejo bióactivo de acuerdo con el artículo (7) anterior, en donde la sustancia bioactiva es una hormona gastrointestinal o un derivado de la misma, o Exendina-4 o un derivado de la misma. (9) El complejo bióactivo de acuerdo con el artículo (8) anterior, en donde la hormona gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste de GLP-1, GLP-2, GIP, VIP, somatostatina, amilina y grelina. (10) El complejo bi activo de acuerdo con el artículo (7) anterior, que comprende además una ligadura a través de la cual el péptido parcial y la sustancia bioactiva se enlazan. (11) El complejo bióactivo de acuerdo con el articulo (9) anterior, en donde el GLP-1 o el derivado del mismo tiene actividad de gel de GLP-1 y consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-Xi9-X2o-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26-X27-Phe-Ile-X3o- rp-Leu-X33-X34-X35-X36- 37-X38- 39-X4o- X41~X42~X43- ~ 5 en donde: X8 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys o Aib; X9 es Glu, Gly, Asp o Lys; Xi6 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Tyr, Glu, Asp, Trp o Lys; Xi8 es Ser, Ala, Arg, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp o Lys; Xi9 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Gln, Asp o Lys; X2o es Leu, Met, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr o Lys; X22 es Gly, Ala, Glu, Ser, Thr, Leu, Tle, Val, Asp, Lys, Arg, Cys o Aib; X23 es Gln, Arg, Glu, Asp, Asn o Lys; X25 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp o Lys; X26 es Lys, Gln, Glu, Asp, His o Arg; X27 es Glu, Ala, Asp, Lys o Leu; X30 es Ala, Glu, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Asp, Lys, Gln, Tyr, His o Arg; X33 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Glu, Asp o Lys; X34 es Lys, Arg, Glu, Asp, His, Ala, Gly o Asn; X35 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys, His, Pro o Aib; X36 es Arg, Gly, Lys, Glu, Asp, His o supresión; X37 es Gly, Pro, Glu, Lys, Ala, Thr, Ser, Asp, Leu, lie, Val, His o supresión; X38 es Ser, Lys, Arg, Glu,' Asp, His o supresión; X39 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His o supresión; X40 es Gly, Glu, Lys, Asp o supresión; X4i es Ala, Lys, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp o supresión; X42 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; X43 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; X44 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; y X45 es Ser, Lys, Val, Glu, Asp o supresión. (12) El complejo bioactivo de acuerdo con el articulo (11) anterior, en donde el GLP-1 o el derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste de: tipo GLP-1 (7-37); [Ser8] -GLP-1 (7-37); [Gly8] -GLP-1 (7-37); [Val8] -GLP-1 (7-37); [Glu22] -GLP-1 (7-37); [Lys22 ] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22] -GLP-1 (7-37); [Val8, Lys22] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22]-GLP-1 (7-37); . [Gly8, Lys22]-GLP-1 (7-37); [Val8, Glu30] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu30] -GLP-1 (7-37); [Val8, His37] -GLP-1 (7-37); [Gly8, His37] -GLP-1 (7-37); [Arg34]-GLP-1 (7-37); [Lysl8] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22, Gly36]-GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib22] -GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib35] -GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib22, Aib35] -GLP-1 (7-37); [Glu22, Glu23] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22, Glu23]-GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Glu23] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Val25]-GLP-1 (7-37); [Vale, Glu22, Ile33] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Val25, Ile33] -GLP-1 (7-37); GLP-1 (7-36) del mismo en el cual la posición 37 se suprime; y tipo GLP-1 (7-35) del mismo en el cual las posiciones 36 y 37 se suprimen. (13) Un método para mejorar la bioestabilidad de una sustancia bioactiva, que comprende la etapa de enlazar el péptido parcial de acuerdo con una de los artículos (1) a (6) a una sustancia bioactiva. (14) El método de acuerdo con el artículo (13), en donde la sustancia bioactiva es GLP-1 o un derivado del mismo, y el péptido parcial se enlaza a una C-terminal del GLP-1 o el derivado del mismo.

Efectos Ventajosos de la Invención Cuando el péptido parcial del módulo GA de la presente invención se enlaza a una sustancia bioactiva, la mejora de bioestabilidad tal como estabilidad en la sangre de la sustancia bioactiva se puede lograr mientras que la actividad de la ruisma se m. t r.t i n<_ . ü'.l. péptido parcial es particularmente efectivo para hormonas gastrointestinales y derivados de las mismas como la sustancia bioactiva.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una secuencia de aminoácidos de un módulo GA, en donde el GAm (1-46) muestra una longitud completa de los 46 residuos de módulo GA 46, GAm (17-46) muestra una secuencia de la posición 17 a la posición 46 del módulo GA, y GAm (28-44) muestra una secuencia de la posición 28 a la posición del rr.ódulo GA.

La Figura 2 muestra cantidades de insulina secretadas de células · MIN 6 tratadas con cada complejo de péptido GLP-1 como valores relativos, suponiendo que una cantidad de insulina secretada de las células tratadas con 1000 pM de GLP-1 nativo es de 100%.

La Figura 3 muestra cantidades de insulina secretadas de células MIN 6 tratadas cada una con complejo de péptido GLP-1 como valores i e ! t. i. vo.*¡ , suponiendo que una cantidad de insulina secretada de las células tratadas con 1000 pM de GLP-1 nativo es 100%.

La Figura 4 muestra los resultados del efecto reductor de glucosa en sangre con tiempo cuando cada complejo de péptido GLP-1 se administra subcutáneamente a ratones db/db, que son ratones modelo de diabetes mellitus tipo 2.

La Figura 5 muestra los resultados del efecto reductor de glucosa en sangre con tiempo cuando, cada complejo de péptido GLP-1 se administra subcutáneamente a ratones db/db, que son ratones modelo de diabetes mellitus tipo 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente descripción, el péptido representado en la secuencia de aminoácidos tiene una N-terminal en el extremo izquierdo y una C-terminal en el extremo derecho de acuerdo con la notación habitual.

El péptido parcial del módulo GA se refiere a un péptido formado de una secuencia parcial de un módulo GA representado en SEQ ID NO: 1. La "secuencia parcial del módulo GA" se refiere a una secuencia formada de una parte de la secuencia del módulo GA. Específicamente, se refiere a una secuencia de fragmentos en la cual un solo residuo de aminoácido o residuos de aminoácido continuos se suprimen de uno o ambos extremos del módulo GA representado en SEQ ID NO: 1. El péptido parcial del módulo GA de la presente invención es un péptido que incluye por lo menos cinco aminoácidos continuos definidos por SEQ ID NO: 2, y que tienen de 5 a 25, de manera más preferente de 5 a 17 aminoácidos del mismo. El péptido parcial del módulo GA de la presente invención se representa como la secuencia de aminoácidos como sigue fórmula: y22-Y23-Y24 -Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y30-Y31-Y32-Y33-Y34-Y35-Y36-Y37-Ile-Asp-GlU-Ile-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46 en donde: Y22 es Lys o supresión; Y23 es Asn o supresión; Y2 es Leu o supresión; Y25 es lie o supresión; Y26 es Asn o supresión; Y27 es Asn o- supresión; Y28 es Ala o supresión; Y29 es Lys o supresión; Y 30 es Thr o supresión; Y31 es Val o supresión; Y32 es Glu o supresión; Y i .¡ es Gly o supresión; Y34 es Val o supresión; Y35 es Lys o supresión; Y36 es Ala o supresión; Y37 es Leu o supresión; Y43 es Ala o supresión; Y4 es Ala o supresión; Y45 es Leu o supresión; y Y46 es Pro o supresión, con la condición que la supresión se limite a una supresión continua de Y22 y/o Y46 (incluyendo una sola supresión de Y22 o Y46, y supresiones en dos porciones de Y22 y Y46 solas) .

Se sabe que el módulo GA tiene una alta afinidad a la albúmina, y algunas veces es llamado como ABD (Dominio de enlace a albúmina) . Dieciséis clases de secuencias de péptidos se reportan como el módulo GA en bacterias nativas (Biochemistry, 2006, 45 (10), 3263-3271). Como uno de los módulos GA, existe una secuencia que es una región especifica en la proteína G de la cepa de Estreptococo G148 (proteína G estreptocócica ) y se compone de 46- residuos de aminoácidos, que se representan en SEQ ID NO: 1. En los ejemplos de la presente invención, se · usaron módulos GA derivados del estreptococo G148.

El péptido parcial del módulo GA de la presente invención es un péptido que refuerza las funciones de una sustancia bioactiva al ser agregado a la sustancia bioactiva. El sitio de sustitución o adición' del péptido depende de la sustancia bioactiva, y se puede seleccionar arbitrariamente un sitio óptimo de acuerdo con un método conocido sobre la base de las propiedades y características de la sustancia bioactiva. Por ejemplo, para el GLP-1, es preferible agregar el péptido a la C-terminal del mismo, debido a que la actividad se deteriora notablemente cuando el péptido se agrega a la N-terminal del mismo. Para amilina, la modificación en la N-terminal de la amilina es posible, debido a que se sabe que la actividad se muestra aún si la N-terminal se modifica (WO 2007/022123) . Además, para VIP, se sabe que la actividad se muestra cuando la N-terminal se acetila o se convierte en un p ptido cíclico, o la C-terminal se modifica con un aminoácido, y es posible la modificación en la C-terminal del VIP ( O2008/003612) .

El término "sustancia bioactiva" se refiere originalmente a sustancias que controlan acciones in vivo, pero se refiere usualmente a un péptido, proteínas o una sustancia que tiene funciones muy similares a las mismas, que se pueden usar para el propósito de tratamiento o diagnosis de enfermedades. En lo acostumbrado, algunas veces se puede ser llamado como un péptido bioactivo, debido a que existen muchas sustancias peptídicas. La sustancia bioactiva puede incluir hormonas gastrointestinales, hormonas de crecimiento y derivados de las mismas. La hormona gastrointestinal puede incluir glucagón, GLP-1 (péptido-1 similar a glucagón) , GLP-2, GIP (polipéptido inhibidor gástrico), gastrina, selectina, colecistocinina, motilina, neurotensina, somatostatina, amilina, grelina, VIP (Polipéptido Intestinal Vasoactivo) , y similares. En este punto, la sustancia bioactiva no incluye solamente sustancias nativas sino también productos sintéticos. En otras palabras, incluye sustancias en las cuales un aminoácido que es una parte de una sustancia bioactiva nativa, se sustituye o se suprime, o a la cual se le agrega un aminoácido (por ejemplo se inserta) . Tal diseño de' péptido se lleva a cabo para el propósito de aumento de efectos, agrandamiento de selectividad, y obtención de estabilidad a la descomposición de péptidos, y similares, y se puede llevar a cabo en un método bien conocido por aquellas personas expertas en la técnica, aunque depende de la sustancia bioactiva. Además, también se: pueden usar sustancias bioactivas a las cuales una cadena de azúcar, ácido graso, lipido, ácido nucleico, o similares se enlaza a una cadena de péptido.

La Exendina-4 es un péptido bioactivo que se encuentra en una . secreción en la glándula salival del Heloderma Suspectum, y tiene actividad similar a GLP-1. Además de la Exendina-4 (1-39), son conocidos derivados tales como Exendina-4 ( 1-39) -LysLysLysLysLys, Exendina-4 (1-39)-LysLysLysLysLysLys , y se pueden considera como un derivado de GLP-1.

El término "derivado de GLP-1" se refiere a un derivado en el cual una parte de los aminoácidos del GLP-1 (que algunas veces puede ser llamado como un GLP-1 nativo, a fin de enfatizar una diferencia del derivado de GLP-1) se sustituyen o se suprimen, o a los cuales se aqregan los aminoácidos, y tienen sustancialmente la misma actividad como aquella del GLP-1. En otras palabras, los derivados de GLP-1 tienen de manera preferente de 50% a 150% de actividad de aquella del GLP-1 nativo. Se sabe que una resistencia enzimática del derivado de GLP-1 se incrementa por la sustitución en la posición 8, en las posiciones 22 y 23, o en las posiciones 26 y 34. Además de esto, el GLP-1 y derivados de GLP-1 también se describen en los documentos W091/11457, 096/29342, WO98/08871, W099/43341, WO99/43708, WO99/43707, WO99/43706, WO99/43705, WO00/07617, WOO /005527, WO00/34331, WO02/046227, WO02/098348, WO03/087139, WO03/018516, O05/000892, O05/027978, WO06/087354, y similares. Se puede decir a partir de estos documentos que los derivados de GLP-1 que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada posteriormente son derivados de GLP-1 que tienen sustancialmente la misma actividad como aquella del GLP-1 nativo. Ya que el GLP-1 que tiene la misma actividad, se muestran no solo el GLP-1 (7-36) sino también el GLP-1 (7-37) y GLP-1 (7-35) , y tienen la misma actividad, sin considerar si su C-termina les son una forma de amida o una forma de ácido carboxilico.

Las secuencias de aminoácidos de los derivados de GLP-1 se conocen como aquellas que representan las siguientes diversidades.

X7-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xi6-Ser-Xi8-Xi9-X2o-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26- 27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33- 34- 35- 36- 37-X38- 39-X40- X41~ 42_X43-X44_ 45 en donde: X7 es His; X8 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys o Aib; X9 es Glu, Gly, Asp o Lys; . Xi6 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Tyr, Glu, Asp, Trp o Lys; X1B es Ser, Ala, Arg, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp o Lys; X19 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Gln, Asp o Lys; X20 es Leu, et, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr o Lys; X22 es Gly, Ala, Glu, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Asp, Lys, Arg, Cys o Aib; X23 es Gln, Arg, Glu, Asp, Asn o Lys; X25 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp o Lys; X26 es Lys, Gln, Glu, Asp, His o Arg; X27 es Glu, Ala, Asp, Lys o Leu; X30 es Ala, Glu, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Asp, Lys, Gln, Tyr, His o Arg; X33 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Glu, Asp o Lys; X34 es Lys, Arg, Glu, Asp, His, Ala, Gly o Asn; X35 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys, His, Pro o Aib; X36 es Arg, Gly, Lys, Glu, Asp, His o supresión; X37 es Gly, Pro, Glu, Lys, Ala, Thr, Ser, Asp, Leu, lie, Val, His o supresión; X3s es Ser, Lys, Arg, Glu, Asp, His o supresión; X39 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His o supresión; X40 es Gly, Glu, Lys, Asp o supresión; X4i es Ala, Lys, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp o supresión; X42 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; X43 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; X44 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; y X45 es Ser, Lys, Val, Glu, Asp o supresión.

De estos, el. GLP-1 que tiene una secuencia de X7 a X37 o los derivados de los mismos (X7 a X37 son como se describen en lo anterior) son preferibles el GLP-1 y derivado del mismo al cual se aplica el péptido parcial del módulo GA de la presente invención.

Como el GLP-1 y los derivados del mismo, específicamente las siguientes sustancias son bien conocidas: Tipo GLP-1 (7-37); [Ser8]-GLP-1 (7-37); [Gly8]-GLP- 1 (7-37); [Val8] -GLP-1 (7-37); [Glu22] -GLP-1 (7-37); [Lys22]-GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22]-GLP-1 (7-37); [Val8, Lys22]-GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Lys22] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu30] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu30] -GLP-1 (7-37); [Val8, His37]-GLP-1 (7-37); [Gly8, His37]-GLP-1 (7-37); [Arg34] -GLP-1 (7-37.); [Lysl8 ] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22, Gly36]-GLP-1 (7-37); . [Aib8, Aib22]-GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib35] -GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib22, Aib35] -GLP-1 (7-37); [Glu22, Glu23] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22, Glu23] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Glu23] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Val25]-GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Ile33] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Val25, Ile33] -GLP-1 (7-37); GLP-1 (7-36) de los mismos en la cual la posición 37 se suprime; y el tipo GLP-1 (7-35) de las mismas en la cual las posiciones 36 y 37 se suprimen.

El VIP nativo se conoce como un péptido de 28 residuos de aminoácido, que tiene la siguiente secuencia.

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 Como el derivado del VIP, son conocidos PACAP-27 compuesto de His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2; el PACAP-38 compuesto · de His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2; y R025-1553 compuesto de Na-acetil-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys*-Tyr-Leu-Asn-Asp*-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2 (en el cual Met en la posición 17 se sustituye a norleucina, y *: un anillo de lactama se forma entre Lys en la posición 21 y Asp en la posición 25) .

La somatostatina nativa se conoce como un péptido de 14 residuos de aminoácido, que tienen la siguiente secuencia: Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH2 En este punto, un enlace de disulfuro se forma entre los residuos de cisteina en las posiciones 3 y 14. Es posible sustituir Trp en la posición 8 por D-Trp. Además, un análisis estructural y funcional muestra que un fragmento de ß-vuelta del Phe-Trp-Lys-Thr en las posiciones 7 a 10 de la somatostatina es necesaria para la actividad [Nature, 1979, 280 (5722), 512-514; y 'Nature, 1981, 292 ( 5818 ) , ' 55-58 ] , y por lo tanto parecería que los aminoácidos en las posiciones 1 a 6 y las posiciones 11 a 14 se pueden suprimir. Tal derivado de somatostatina se puede decir que es un péptido parcial de la somatostatina que incluye una secuencia de aminoácidos: Phe-Trp-Lys-Thr (es posible la supresión continua de la N terminal y/o la C-terminal) . Como otros derivados de somatostatina, se reporta la octreotida compuesta de D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol . (un enlace de disulfuro se forma entre los residuos de cisteína) , D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr, D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr (un enlace de disulfuro se forma entre los residuos de cisteína) , y D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thp (un enlace de disulfuro se forma entre los residuos de cisteína) .

La amilina nativa es conocida como un péptido de 37 residuos de aminoácido, que tienen la siguiente secuencia: Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2 En este punto, un enlace de disulfuro se forma entre los residuos de cisteína en las posiciones 2 y 7. Es posible sustituir Ala en la posición 25 por Pro, Ser en la posición 28 por Pro, y Ser en la posición 29 por Pro. La sustitución se puede llevar a cabo en un solo sitio o en múltiples sitios opcionales. También se conoce un análogo de péptido en el cual el GLP-1 se enlaza a la N-terminal .

La grelina nativa es conocida como un péptido de 28 residuos de aminoácido, que tienen la siguiente secuencia: Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-A.la-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-NH2 En este punto, se sabe que se asegura la suficiente actividad por la secuencia de aminoácidos: Gly-Ser-Ser-Phe-Leu en las posiciones 1 a 5 de la grelina (Biochem Biophys Res Commun, 2001, 284(3), 655-659), y por lo tanto parecería que los aminoácidos en las posiciones 6 a 28 se pueden suprimir. Tal derivado de grelina se puede decir que es un péptido parcial de la grelina nativa que incluye una secuencia de aminoácidos: Gly-Ser-Ser-Phe-Leu (es posible la supresión continua de la C-terminal) . En la grelina, Ser en la posición 3 se octanoila, pero aún si este grupo octanoilo se cambia en la estructura, puede ser posible mantener la actividad (J Med Ghem, 2000, 43 (23), 4370-4376).

En la presente invención, el término "complejo bioactivo" se refiere a una sustancia en la cual una sustancia bioactiva y el péptido parcial del módulo GA de la presente invención se enlazan entre si. En lo usual, una molécula del péptido parcial del módulo GA de- la presente invención se enlaza a una molécula de la sustancia bioactiva. La C-terminal de complejo bioactivo puede ser ya sea una forma de amida o una forma de ácido carboxilico. Esto es debido a que es importante para la sustancia bioactiva enlazarse al péptido parcial del módulo GA de la presente invención para reforzar la bioestabilidad de la sustancia bioactiva, sin considerar la forma de la C-terminal.

Una secuencia de ligadura de aminoácidos corta se puede insertar entre la sustancia bioactiva y el péptido parcial del módulo GA · de la invención, como un método para enlazar el péptido parcial del módulo GA de la invención a la sustancia bioactiva. El término "ligadura" se refiere a todas las cosas que pueden servir principalmente como un espaciador. La ligadura se forma de manera preferente de aminoácidos enlazados con un enlace de péptido. Entre ello, las ligaduras formadas de ' 1 a 3 aminoácidos son preferibles, y Gly-Pro (GP) y Gly-Pro-Ser (GPS) son especial mente óptimos.

En la presente descripción, el término "bioestabilidad" se refiere a una estabilidad de una sustancia en sangre circulante, plasmas y sueros recolectados, varios tejidos corporales vivos, y varios homogenados de tejido recolectados. Como un índice de las estabilidad en la sangre,' por ejemplo, se usa una vida media de eliminación en la sangre . (que algunas veces puede ser llamada como una vida media en la sangre o concentración de vida media en la sangre) , es el tiempo requerido para disminuir la concentración de la sustancia a la mitad de la concentración máxima de la sustancia.

El método . para sintetizar el péptido parcial del módulo GA o el complejo bioactivo de la presente invención no se limita particularmente, y se pueden usar métodos convencionales. Por ejemplo, los métodos de síntesis química tales una síntesis de fase sólida y una síntesis de fase liquida, métodos sintéticos que usan una enzima, tecnologías de DNA recombinante se pueden usar. Cualquier célula que pueda el péptido de la invención se puede usar como una célula hospedera que introduce una secuencia de DNA o un vector recombinante, y la .célula hospedera puede incluir bacterias, levadura, células eucarióticas que son más avanzadas. Las células hospederas se ejemplifican por, por ejemplo, líneas de células BHK o CHO. En todos los ejemplos descritos posteriormente, se usan los métodos de síntesis sólida con amplio uso general, pero el método no se limita necesariamente al mismo.

El complejo de péptido GLP-1 en el cual el péptido parcial del módulo GA de la presente invención se aplica al GLP-1 es aplicable a varias enfermedades contra las cuales la estimulación del receptor GLP-1 es efectiva. En otras palabras, el complejo de péptido GLP-1 de dimensión se puede usar para, por ejemplo,- tratamiento de diabetes mellitus tipo 2, tratamiento de diabetes mellitus tipo 1, tratamiento de obesidad y/o supresión de apetito, y similar. La cantidad de administración del complejo del péptido GLP-1 complejo es aproximadamente decidida por aquellas personas expertas en la técnica de acuerdo con un paciente individual con una enfermedad. En general, la cantidad de administración se puede creer que es de aproximadamente 1 pg/dia a aproximadamente 10 mg/dia. También se puede administrar Exendina-4 en una cantidad dentro del intervalo descrito en lo anterior. El complejo de péptido GLP-1 de la presente invención tiene una estabilidad alta y prolongada in vivo, y por lo tanto se puede determinar un régimen de dosificación con base en la bioestabilidad del complejo de péptido GLP-1 individual .

Además, un complejo bioactivo en' el cual el péptido parcial del módulo GA de la presente invención se aplica a VIP, somatostatina , amilina o grelina es aplicable a varias enfermedades contra las cuales cada una de las sustancias bioactivas es efectiva. Las cantidades de administración de estos complejo bioactivas son de. aproximadamente 50 µ?/ ?3 a aproximadamente 1 mg/dia para VIP; de aproximadamente 50 µ?/dia a aproximadamente 1 mg/dia para somatostatina ; de aproximadamente 5 g/dia a aproximadamente 500 g/dia para amilina; y de aproximadamente 100 g/dia a aproximadamente 1 mg/dia para grelina. Cuando el péptido parcial del módulo GA de la presente invención se aplica a una sustancia bioactiva diferente a la anterior, la cantidad de administración de tal complejo se puede determinar fácilmente con base en la cantidad de administración conocida de la sustancia bioactiva. En otras palabras, la cantidad de administración se establece como la cantidad equivalente medida en moles, de la cual se puede seleccionar un valor óptimo.

El complejo bioactivo de la presente invención se puede administrar a través de varias vías de administración. En general, se administra subcutáneamente, intravenosamente o pulmonarmente a un paciente quien requiere el tratamiento. Además, una via de administración selecciona apropiadamente de una administración oral, administración por la mucosa nasal, administración epidérmica, administración oftálmica, y similares. Dependiendo del intervalo de aplicación, el carácter del complejo bioactivo y la combinación de técnica de administración. Se puede seleccionar la via de administración ya conocida de la sustancia bioactiva.

EJEMPLOS La presente invención se explicará con más detalle por los Ejemplos Experimentales descritos a continuación, pero la presente invención no se' limita a los mismos, y cualquier modificación se puede hacer dentro del alcance de la presente invención.

I Síntesis del Complejo de Péptido GLP-1 El GLP-1 se seleccionó como una sustancia bioactiva que tiene baja bioestabilidad, y se inspeccionó. El péptido parcial del módulo GA de la presente invención se agregó a la C-terminal del GLP-1 o el derivado de GLP-1 para formar un complejo de péptido GLP-1. El complejo de GLP-1 se sintetizó en un método de síntesis sólida, y se confirmó un producto sintetizado mediante una espectrometría de masas después de la purificación usando una HPLC. -NH2 representa que la C-terminal se amidó.

El GLP-1. (7-35) se usó principalmente como GLP-1, la posición 8 del cual fue una alanina nativa, o se sustituyó por serina o lisina. [Ser8] representa que la alanina en la segunda posición de la izquierda del GLP-1 nativo representado por SEQ ID NO: 24, es decir, en la posición 8, se cambió por serina y tiene el mismo significado como 8S. En este campo, la N-terminal del extremo izquierdo se define en general como la posición 7 en el GLP-1, debido a que la N-terminal del precursor del GLP-1 no se define como la posición 1.

Un módulo GA de 46 residuos representado por SEQ ID NO: 1, o un péptido parcial del mismo se usa como un péptido que se agrega. El péptido representado pro SEQ ID NO: 1 se abrevió como GAm (1-46), debido a que fue un péptido que tiene una secuencia que comienza con un aminoácido en la primera posición del módulo GA, y termina con un aminoácido en la posición 46. El péptido parcial del módulo GA se abrevió como GAm (X-Y) , que puede un péptido que tiene una secuencia que comienza con un aminoácido en la posición X el módulo GA representado por SEQ ID NO: 1, y termina con una aminoácido en la posición Y.

La SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 23 representa los péptidos compuestos de la secuencia completa o secuencia parcial del módulo GA, y SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 58 representan el GLP-1 o derivado del mismo, que son sustancia bioactivas .

Ejemplo 1. [Ser8] -GLP-1 (7-35) -GAm(38-42) -NH2 SEQ ID NO: 28 (GAm: SEQ ID NO: 2) Ejemplo 2. [Ser8 ] -GLP-1 (7-35 ) -GAm ( 38-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 29 (GAm: SEQ ID NO: 3) Ejemplo 3. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 37-4 ) -NH2 SEQ ID NO: 30 (GAm: SEQ ID NO: 4) Ejemplo 4. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 35-44 ) -NH2 SEQ ID O: 31 (GAm: SEQ ID NO: 5) Ejemplo 5. GLP-1 (7-35) -GAm (38-42) -NH2 SEQ ID NO: 32 (GAm: SEQ ID NO: 2) Ejemplo 6.' GLP-1 (7-35 ) -GAm (35-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 33 (GAm: SEQ ID NO: 5) Ejemplo 7. GLP-1 (7-35) -GAm (33-43) -NH2 SEQ ID NO: 34 (GAm: SEQ ID NO: 7) Ejemplo 8. GLP-1 ( 7-35 ).-GAm ( 33-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 35 (GAm: SEQ ID NO: 8) Ejemplo 9. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7 -35 ) -GAm (33-44) -NH2 SEQ ID NO: 36 (GAm: SEQ ID NO: 8) Ejemplo 10. [ Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 32-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 37 (GAm: SEQ ID NO: 9) Ejemplo 11. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 31-4 ) -NH2 SEQ ID NO: 38 (GAm: SEQ ID NO:. 10) Ejemplo 12. [ Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 30-42 ) -NH2 SEQ ID NO: 39 (GAm: SEQ ID NO: 11) Ejemplo 13. [ Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 28-42 ) -NH2 SEQ ID NO: 40 (GAm: SEQ ID NO: 12) Ejemplo 14. [Ser8 ] -GLP-1 (7-35) -GAm (28-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 41 (GAm: SEQ ID NO: 13) Ejemplo 15. [Ser8]-GLP-1 (7-35) -GAm (27-46) -NH2 SEQ ID NO: 42 (GAm: SEQ ID NO: 14) Ejemplo 16. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 25-46 ) -NH2 SEQ ID NO: 43 (GAm: SEQ ID NO: 15) Ejemplo 17. [ Ser8 ] -GLP-1 ( -35 ) -GAm (22-46) -NH2 SEQ ID NO: 44 (GAm: SEQ ID NO: 16) Ejemplo 18. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 28-44 ) SEQ ID NO: 41 (GAm: SEQ ID NO: 13) Ejemplo 19. [Ser8 ] -GLP-1 ( -35 ) -GAm ( 33-44 ) SEQ ID NO: 36 (GAm: SEQ ID NO: 8) Ejemplo 20. [Ser8 ] -GLP-1 (7-35) -GAm ( 37-44 ) SEQ ID NO: 30 (GAm: SEQ ID NO: 4) Ejemplo 21. GLP-1 ( 7-35 ) -Gly-Pro-GAm ( 35-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 45 (GAm: SEQ ID NO: 5) Ejemplo 22. GLP-1 ( 7-35 ) -Gly-Pro-GAm (34-44) -NH2 SEQ ID NO: 46 (GAm: SEQ ID NO: 6) Ejemplo 23. GLP-1 ( 7-35 ) -Gly-Pro-Ser-GAm ( 34 -44 ) -NH2 SEQ ID NO: 47 (GAm: SEQ ID NO: 6) Ejemplo 24. GLP-1 ( 7-35 ) -Gly-Pro-Ser-GAm ( 33-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 48 (GAm: SEQ ID NO: 8) Ejemplo Comparativo 1. GLP-1 (7-36) -NH2 SEQ ID NO: 24 Ejemplo Comparativo 2. [Ser8 ] -GLP-1 (7-36) -NH2 SEQ ID NO: 26 Ejemplo Comparativo 3. Exendin-4 ( 1-39) -NH2 SEQ ID NO: 27 Ejemplo Comparativo 4. [Ser8] -GLP-1 (7-35) -GAm(l-46)-NH2 SEQ ID NO: 49(GAm:SEQ ID NO: 1) Ejemplo Comparativo 5. [Ser8] -GLP-1 (7-35) -GAm(17-46)-NH2 SEQ ID NO: 50(GAm:SEQ ID NO: 17) Ejemplo Comparativo 6. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm (21- 46)-NH2 SEQ ID NO: 51 (GAm: SEQ ID NO: 18) Ejemplo Comparativo 7. [Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35) -GAm (28-40)-NH2 SEQ ID NO: 52 (GAm: SEQ ID NO: 19) Ejemplo Comparativo 8. [Ser8] -GLP-1 (7-35) -GAm(28-37)-NH2 SEQ ID NO: 53 (GAm: SEQ ID NO: 20) Ejemplo Comparativo 9. [ Ser8 ] -GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 39-44)-NH2 SEQ ID NO: 54(GAm:SEQ ID NO: 21) Ejemplo Comparativo 10. GLP-1 ( 7-35 ) -GAm ( 38-41 ) -NH2 SEQ ID NO: 55(GAm:SEQ ID NO: 22) Ejemplo Comparativo 11. GLP-1 (7-35) -GAm (38-40) -NH2 SEQ ID NO: 56 (GAm: SEQ ID NO: 23) Ejemplo Comparativo 12. [Gly8 ] -GLP-1 (7-35) -RPSS-NH2 SEQ ID NO: 57 Ejemplo Comparativo 13. [ Ser8 , Glu22 , Glu23 ] -GLP-1 ( 7-35) -GPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO: 58 <Ejemplo Experimental 1> Evaluación de la Estabilidad en Plasma del Complejo de Péptido GLP-1 La estabilidad en plasma se evaluó in vitro, a fin de inspeccionar la bioestabilidad del complejo de péptido GLP-1. 1. Procedimiento Ratas SD se anestesiaron con éter dietilico, se recolectó sangre entera y la fracción de plasma se separó de la misma. Cada complejo de péptido GLP-1 se agregó al plasma de modo que la concentración final fue de 37 °C. Una muestra se recuperó después de 0, 8 o 48 horas, y se evaluó una proporción restante por la medición de HPLC/MS de una cantidad del complejo de .péptido GLP-1. La proporción restante del complejo de péptido GLP-1 se evaluó al calcular una proporción de un resultado de medición HPLC/MS del complejo restante en el plasma recuperado después de 8 horas o 48 horas relativo con el resultado de medición de HPLC/MS del complejo en la muestra recuperadas a 0 horas, que se asumió como 100%. 2. Resultados y Discusión Los resultados del análisis de la estabilidad en plasmas de los complejos de péptido GLP-1 se muestran en la Tabla 1 y Tabla 2 como una proporción restante. (1) Efecto del Péptido Parcial del módulo GA El GLP-1 nativo en el cual el péptido no se agregó (Ejemplo Comparativo 1), y 8S-GLP-1 (Ejemplo Comparativo 2) se degradaron completamente en el plasma después de 48 horas. Las proporciones restantes de los complejos de péptido GLP-1 en los cuales no se agregó el péptido, se agregó la secuencia del módulo GA (Ejemplos Comparativos 12 y 13) fueron de 0% y 12% en el plasma después de 48 horas. Hubo una estabilidad en plasma notablemente baja que fue casi igual al GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1) o el 8S-GLP-1 (Ejemplo Comparativo 2) .

Por otra parte, se agregan los complejos de GLP-1 en los cuales el péptido parcial del módulo GA (Ejemplo 1 al Ejemplo 20) permanecieron en un estado donde apenas se degradaron en el plasma de la rata después de 48 horas, y obtuvieron una estabilidad en plasma notablemente más alta que aquella de GLP-1 (Ejemplo Comparativo 1) y el 8S-GLP-1 (Ejemplo Comparativo 2) . Como se muestra en los Ejemplos 5 a 8, fue evidente que la estabilidad en plasma igual aquella obtenida en el caso de la adición al 8S-GLP-1 se podría obtener, y aún si el péptido descrito en lo anterior se agregó al GLP-1 nativo. Es sorprendente mostrar tales resultados aunque el GLP-1 nativo tiene la estabilidad en plasma notablemente baja. En los Ejemplos 18 a 20, se usaron las formas de ácido carboxílico en la C-terminal, pero podrían obtener el efecto igual a aquel obtenido en la forma de amida.

Con respecto a la longitud de cadena del módulo GA, los complejos de péptido GLP-1 en los cuales un GAm (1-46) y GAm (17-46) de cadena larga se agregaron respetivamente (Ejemplos Comparativos 4 y 5) mostraron una estabilidad en plasma notablemente alta, es decir, una proporción estante de 105% en plasma después de 48 horas. Además, los complejos de péptido GLP-1 en los cuales se agregó el GAm (38-42) (Ejemplos 1 y 5) mostraron, sorprendentemente, estabilidad en plasma notablemente altas, es decir, proporciones restantes de 71% y 83%, respectivamente, en el plasma después de 48 horas. Fue evidente que aunque el péptido parcial del módulo GA de cinco residuos podría impartir la estabilidad en plasma casi igual a aquella obtenida del péptido parcial del módulo GA de 30 residuos o el péptido de longitud completa del módulo GA.

Por el contrario, los complejos de péptido GLP-1 en los cuales GAm (39-44), GAm (38-41) y GAm (38-40) se agregaron respectivamente (Ejemplo Comparativos 9, 10 y 11) se degradaron completamente, es decir, todas las proporciones restantes fueron 0% en el plasma después de 48 horas. Los complejos de péptido GLP-1 en los cuales se agregaron respectivamente el GAm (28-40) y el (28-37) (Ejemplos Comparativos 7 y 8) se degradaron casi completamente, es decir, las proporciones ' restantes fueron 4% y 0% respectivamente, en el plasma .después de 48 horas. Esto muestra que lie en la posición 38 y Leu en la posición 42 son esenciales para obtener la estabilidad en plasma en el péptido parcial del módulo GA. En otras palabras, se mostró que la secuencia de aminoácidos mínima necesaria para obtener la estabilidad en plasma fueron los cinco residuos: Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (IDEIL) representado por el GAm (38-42) . (2) Adición del Péptido Parcial del- Módulo GA de la Invención a través de la Ligadura En el Ejemplo 21 al Ejemplo 24, se mostraron los complejos de péptido GLP-1 en los cuales el péptido parcial del módulo GA se agregó a través de una ligadura. Estos complejos de péptido GLP-1 también mostraron proporciones restantes suficientes en el plasma después de 48 horas. Esto mostró que la estabilidad en plasma se puede asegurar aún si el péptido parcial del módulo GA se agregó a través de la ligadura .

Tabla 1 Estabilidad En Plasma Tabla 2 Estabilidad En Plasma Ejemplo Experimental 2. Comparación en la Intensidad de la Actividad del Complejo de Péptido GLP-1 Una capacidad de secreción de insulina se analizó in vitro, a fin de evaluar la intensidad de actividad de los complejos de péptido GLP-1 que muestran la alta Estabilidad en plasma en el Ejemplo Experimental 1. 1. Procedimiento La capacidad de secreción de insulina se evaluó usando la MIN 6 (obtenida de Mr. Junichi Miyazaki) que fue una célula de insulinoma derivada de un ratón, que expresa un receptor de GLP-1 endógeno. La MIN 6 se sembró en una multiplaca, que se cultivó a 37°C durante 48 horas. Después de eso, el cultivo se lavó dos veces con una solución amortiguadora de KRH incluyendo una solución de glucosa 2 mM (incluyendo NaCl 119 mM, 1 KC1 4.74 mM, CaC12 2.54 mM, MgC12 1.19'mM, KH2P04 1.19 mM; solución amortiguadora de HEPES 10 mM pH 7.3, y BSA al 0.1%), y posteriormente se incubó a 37 °C durante una hora. Después de la aspiración y remoción de la solución anterior, se agregó a la misma una solución amortiguadora KRH que contiene glucosa 15 mM que incluye el complejo de péptido GLP-1, y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante una hora. Se recuperó del mismo un sobrenadante, y se midió una cantidad de insulina secretada. La medición de la insulina se llevó a .cabo en un ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) , y se midió la absorbancia a 450 nm (una sub-longitud de onda: 620 nm) después de la adición de un substrato. La prueba se compuso de las siguientes cuatro partes.

Parte 1 Las actividades del GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1) y 8S-GLP-l-GAm¦ (1-46) (Ejemplo Comparativo 4) se evaluaron en una concentración de 30, 100, 300 o 1000 pM, y se calcularon los valores EC50.

Parte 2 Los valores EC50' del GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1), 8S-GLP-l-GAm (17-46) (Ejemplo Comparativo 5) y 8S-GLP-l-GAm (28-44) (Ejemplo 14) se calcularon de la misma manera como en la Parte 1.

Parte 3 La actividad de cada complejo de péptido GLP-1 se evaluó en una concentración de 1000 pM, la concentración que se cree fue necesaria para mostrar la actividad máxima del GLP-1 en las MIN 6 células, y se comparó la actividad obtenida con la intensidad de la actividad del GLP-1.

Parte 4 El 8S-GLP-l-GAm (32-44). (Ejemplo 10: 13 residuos de GAm), GLP-l-GAm (33-44) (Ejemplo 8: 12 residuos de GAm), GLP-1-GAiu (35-44) (Ejemplo -6: 10 residuos de GAm) y GLP-l-GPS-GAm (34-44) (Ejemplo 22: 11 residuos de GAm) se seleccionaron como un complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó un péptido parcial de un módulo de GA de tipo de cadena media, y el 8S-GLP-l-GAm (38-44) (Ejemplo 2: 7 residuos de GAm) y 8S-GLP-l-GAm (38-42) (Ejemplo 1: 5 residuos de GAm) se seleccionaron como un complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó un péptido parcial de un módulo GA de tipo de cadena corta. Los valores EC50 de los mismos se calcularon de la misma manera como en ' la parte 2, y la influencia en la bioactividad provocada por la adición del péptido parcial del módulo GA se inspeccionaron con detalle. 2. Resultados y Discusión Parte 1 Las capacidades de la secreción de insulina del complejo de péptido GLP-1: 8S-GLP-l-GAm (1-46) en el cual se agregó el módulo de longitud completa GA, GAm (1-46), (Ejemplo Comparativo 4) y el GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1) se muestran en la Figura 2. Como se muestra en este documento, fue evidente que la actividad- del 8S-GLP-1-GAm (1-46) (Ejemplo Comparativo 4) se deterioró notablemente comparado con el GLP-1 (Ejemplo Comparativo 1) .

Parte 2 Después, las capacidades de secreción de insulina del complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó el péptido parcial del módulo GA y el GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1) se muestran en la Figura 3. La actividad del 8S-GLP-1-Gam (17-46) (Ejemplo Comparativo 5), el complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó en el péptido parcial del módulo GA de 30 residuos, a penas se detectó, y aún si el tratamiento de la concentración máxima de 1000 pM se llevó a cabo, el complejo podría mostrar la actividad de únicamente menor que 40% de la actividad máxima de GLP-1 (Ejemplo Comparativo 1) . Por otra parte, el complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó el péptido parcial del módulo GA de 17 residuos, el 8S-GLP-l-GAm (28-44) . (Ejemplo 14) , mantuvo casi la misma actividad como aquella del GLP-1 nativo.

A partir de los experimentos llevados a cabo en lo anterior, fue evidente cuando se agregó el péptido parcial del módulo GA de cadena larga que tiene 30 o más residuos, se mejoró la estabilidad en plasma del complejo de péptido GLP-1, pero la bioactividad del mismo se deterioró notablemente.

Una concentración (EC5o) de cada complejo de péptido GLP-1 necesaria para mostrar 50% de la actividad máxima del GLP-1 se analizó con base en los resultados mostrados en la Figura 2 y la Figura 3, y los valores se muestran en la Tabla 3. El análisis se llevó a cabo usando la siguiente fórmula de cálculo. En el control, la capacidad de secreción de insulina del GLP-1 en una concentración de 1000 pM se estableció como la actividad máxima.

Control = (una cantidad de insulina se.cretada de GLP-1 en una concentración de 1000 pM) - (una cantidad de insulina secretada en glucosa 15 raM) Intensidad de la actividad (%) = [{(una cantidad de insulina secretadas de cada complejo de péptido GLP-1) - (una cantidad de insulina secretada en glucosa 15mM) } /control ] x 100 Valor EC50: una concentración del complejo de péptido GLP-1 necesaria para la exhibición de 50% de control.

También es evidente de los valores EC5o que las actividades del 8S-GLP-l-GAm (1-46) (Ejemplo Comparativo 4) y el 8S-GLP-l-GAm (17-46) (Ejemplo Comparativo 5), entre los complejos de péptido GLP-1 en los cuales el módulo de GA de longitud completa o el péptido parcial del mismo se agregó, se disminuyeron notablemente comparados con aquellos del 8S-GLP-l-GAm (28-44) (Ejemplo 14).

Tabla 3 Capacidad de Secreción de Insulina del Complejo de Péptidos GLP-1 en Células MIN6 (valor EC50) Parte 3 Los resultados de la comparación de la intensidad de la actividad entre cada complejo de péptido GLP-1 y el GLP-1 nativo (Ejemplo 1) en una concentración de 1000 pM se muestran en la Tabla 4 y Tabla 5. El 8S-GLP-l-GAm (22-46) en el cual el péptido parcial del módulo GA de 25 residuos se agregó (Ejemplo 17) tuvo actividad¦ igual a aquella del GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1), mientras que la intensidad de la actividad del 8S-GLP-l-GAm (21-46) en el cual se agregó el péptido parcial del módulo de GA de 26 residuos (Ejemplo Comparativo 6) tuvo una actividad notablemente disminuida de 45%. Se mostró que el complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó el péptido parcial del · módulo GA de 25 o menos residuos (Ejemplo 1 a Ejemplo 24) tuvo la actividad igual a aquella del GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1).

Tabla 4 Capacidad de Secreción de Insulina del Complejo de Péptido GLP-1 en Células MIN 6 (% de control) Tabla 5 Capacidad de Secreción de Insulina del Complejo de Póptido 6LP-1 en Células MIN 6 (% de control) Parte 4 Como se muestra en la Tabla 6, se mostró de los valores EC50 que los complejos de péptido GLP-1 en los cales se agregó el péptido parcial del módulo GA de ya sea de tipo de cadena media o de tipo de cadena corta de la presente invención tuvo actividad suficiente que se compara favorablemente con el e GLP-1 nativo. Los resultados anteriores muestran que cuando se agregó el péptido parcial del módulo GA de la presente invención a la sustancia bioactiva, se puede obtener la alta bioestabilidad aunque se mantiene la bioactividad .

Tabla 6 Capacidad de Secreción de Insulina del Complejo de Péptido GLP-1 en Células MIN 6 (Valor EC50) Ejemplo Experimental 3. Efecto Reductor de Glucosa en Sangre Sostenido del Complejo de Péptido GLP-1 del Modelo de Ratones de Diabetes mellitus Tipo 2 1. Procedimiento La mejora de la bioestabilidad se evaluó usando un tiempo de duración de efecto reductor de glucosa en sangre in vivo como un indicador. Es decir, ratones db/db que fueron ratones modelo de diabetes mellitus tipo 2 (Charles River Laboratories Japan, Inc.) se reprodujeron separadamente, y cada complejo de péptido GLP-1 se administró subcutáneamente a los mismos, y posteriormente se inspeccionó un cambio sostenido en un nivel de glucosa en sangre. El complejo de péptido GLP-1 se preparó a una concentración de 100 µ?, y se almacenó a -80°C hasta que se llevó a cabo la prueba. El complejo de péptido GLP-1 se diluyó con solución salina a una concentración predeterminada- y se usó en la prueba. El volumen de una solución de fármaco fue 10 ml/kg, y cualquier complejo de péptido GLP-1 se administró subcutáneamente en una concentración de 50 nmol/kg. A fin de medir el nivel de glucosa en sangre, la sangre se muestreó de una cola usando un tubo de vidrio tratado con heparina antes y en un tiempo predeterminado después de la administración del complejo de péptido GLP-1 (30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, y 6 horas) . El nivel de glucosa en sangre se midió usando la Prueba de Glucosa Wako (Wako Puré Chemical Industries, Ltd. ) . Los complejos de péptido GLP-1 de los Ejemplos 1, 6, 8, 9, 10, 14 y 21 se usaron como el complejo de péptido GLP-1 de la presente invención', y el GLP-1 nativo del Ejemplo Comparativo 1 y el 8S-GLP-1 del Ejemplo Comparativo 2 se usaron como control . 2. Resultados y Discusión Efecto reductor de glucosa en sangre con tiempo de cada complejo de péptido GLP-1 después de¾ la administración subcutánea se muestra en la Figura 4 y Figura 5. El efecto reductor de glucosa del GLP-1 nativo (Ejemplo Comparativo 1) y el 8S-GLP-1 (Ejemplo Comparativo 2) desaparecieron una hora y dos horas después de la administración, respectivamente. Por otra parte, se confirmó que el efecto reductor de glucosa del complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó el péptido parcial del módulo GA de la presente invención alcanzó el efecto máximo una hora después de la administración, y el efecto se mantuvo durante 6 horas. Estos resultados muestran que el complejo de péptido GLP-1 en el cual se agregó el péptido parcial del módulo GA de la presente invención tuvo sostenibilidad notablemente mejorada del efecto reductor de glucosa en sangre.

Fue evidente a partir de estos resultados que la adición del péptido parcial del módulo GA de la presente invención al GLP-1 permitió mantener la intensidad reductora de glucosa en sangre suficiente y mostrar el efecto reductor de glucosa en sangre notablemente sostenido. Se podría creer que la adición del péptido parcial del módulo GA de la presente invención al GLP-1 y otra sustancia bioactiva fue útil para resolver los problemas en las aplicaciones médicas de la sustancia bioactiva, tal como rápida desaparición in vivo .

II Síntesis del Complejo de Péptido. VIP El VIP se seleccionó como una sustancia bioactiva que tiene baja bioestabilidad diferente al GLP-1, y se inspeccionó. El péptido parcial del módulo GA de la presente invención se agregó a la C-terminal del VIP para formar un complejo de péptido VIP. El complejo de péptido VIP se sintetizó en una síntesis de fase sólida se purificó a través de un HPLC, y posteriormente el producto sintetizado se confirmó por una espectrometría de masas. El NH2 muestra que la C-terminal está amidada .

Ejemplo 25. VIP ( 1-28 ) -GAm (37-44) -NH2 SEQ ID NO: 60 (GAm: SEQ ID NO: 4) Ejemplo 26. VIP ( 1-28 ) -GAm (32- ) -NH2 SEQ ID NO: 61 (GAm: SEQ ID NO: 9) Ejemplo 27. VIP ( 1-28 ) -GAm (28-4 ) -NH2 SEQ ID NO: 62 (GAm: SEQ ID NO: 13)· Ejemplo Comparativo 14. VIP ( 1-28 ) -NH2 SEQ ID NO: 59 Ejemplo Experimental 4 Evaluación de Estabilidad en Plasma del Complejo de Péptido VIP Estabilidad en plasma se evaluó in vitro, a fin de inspeccionar la bioestabilidad del complejo de péptido VIP. 1. Procedimiento Ratas SD se anestesiaron con éter dietilico, se recolectó la sangre entera, y se separó de la misma la fracción de plasma. El VIP o complejo de péptido VIP se agregó al plasma de modo que la concentración final del mismo fue de 0.5 µp???/L, y la mezcla se incubó a 37 °C. Una muestra se recuperó después de 0, 8 o 48 horas, y la proporción restante se evaluó por una medición de HPLC/MS de una cantidad de VIP o complejo de péptido VIP. La proporción restante del VIP o complejo de péptido VIP se evaluó al calcular una proporción del VIP o complejo de péptido VIP que permanece en el plasma recuperado después de 8 horas o 48 horas relativo con un resultado de medición de HPLC/MS del mismo en la muestra recuperada a 0 hora que se asumió como 100%. 2. Resultados y Discusión Los resultados del análisis de la estabilidad en plasma del VIP y los complejos de péptido VIP se muestran en la Tabla 7 como una proporción restante. El VIP nativo en el cual se agregó el péptido parcial del módulo GA (Ejemplo Comparativo 14) se degradó completamente en el plasma después de 8 horas, mientras que los complejos de péptido VIP en los cuales se agregó el péptido parcial del módulo GA (Ejemplos 25, 26 y 27) no se degradó totalmente en el plasma de la rata después de 8 horas, y 118%, 47%, y 35% del mismo permaneció respectivamente aún después de 48 horas. Fue evidente a partir de estos resultados que los complejos de péptido VIP podrían obtener notablemente una alta estabilidad en plasma por la adición del péptido parcial del módulo GA de la presente invención, similar al GLP-1.

Tabla 7 Estabilidad en Plasma Ejemplo Experimental 5. Comparación en la Intensidad de la Actividad del Complejo de- Péptido VIP Una productividad de cAMP se analizó in vitro, a fin de evaluar la intensidad de la actividad de los complejos de péptido VIP que muestran la estabilidad en plasma en el Ejemplo Experimental 4. 1. Procedimiento Una productividad de cAMP intracelular se evaluó usando células SUP-T1 que se derivaron de células T humanas, que expresan un receptor VIP endógeno (comprado de ATCC) . Las células SUP-T1 que se sometieron al cultivo de suspensión durante 48 horas o más se movieron a un tubo, y las células se lavaron dos veces con un medio (RPMI-1640) . Después de eso, un medio que incluye IBMX ( 3-isobutil-l-metilxantina ) , que fue un inhibidor de una enzima catabólica de cAMP, se agregó al mismo, la mezcla se incubó a 37°C durante 15 minutos. Después de centrifugación, el sobrenadante se removió, y el medio que contiene IBMX incluyendo el complejo de péptido VIP se agregó al mismo. La reacción se llevó a cabo a 37°C durante 30 minutos. Después de la reacción, el tubo se centrifugó, el sobrenadante se removió, y el lisado celular se agregó al mismo. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos para disolver las células, y la productividad se evaluó por la medición del cAMP. La medición del cAMP se llevó a cabo- usando un ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) mediante detección por quimioluminiscencia .

Las actividades del VIP nativo (Ejemplo Comparativo 14) y los complejos de .péptido VIP (Ejemplos 25, 26, y 27) se evaluaron a una concentración de 3, 10, 30, 100, 300, 1000 o 3000 nM, y la cantidad máxima del cAMP producido se calculó. La intensidad de la actividad (%) del complejo de péptido VIP se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula.

Intensidad de la Actividad (%) = [{(la cantidad máxima del cAMP producido en cada complejo de péptido VIP) /(la cantidad máxima del cAMP producido en el VIP nativo) ] x 100 2. Resultados y Discusión Los resultados del análisis de la productividad de cAMP en el VIP o complejo de péptido VIP se muestran en la Tabla 8 como intensidad de la actividad. Se confirmó que las intensidades de la actividad de los complejos de péptido VIP (Ejemplos 25, 26 y 27) fueron de 81%, 85% y 67%, respectivamente, relativos con el VIP en el cual el péptido parcial del módulo GA no se agregó (Ejemplo Comparativo 14), y la actividad de VIP se ' podría mantener aún si el péptido parcial del módulo GA. Se descubrió a partir de estos resultados que la .adición del péptido parcial del módulo GA de la presente invención se podría usar como un medio muy útil para usar prácticamente 'una sustancia bioactiva cuyo defecto fue la bioestabilidad al obtener la estabilidad en plasma notablemente alta y al mantener la bioactividad.

Tabla 8 Productividad de cAMP en células SUP-Tl III Síntesis del Complejo de Somatostatina (SRIF) La Somatostatina -(SRIF) se seleccionó como una sustancia bioactiva que tiene baja bioestabilidad diferente al GLP-1, y se inspeccionó. Los péptidos parciales del módulo GA de la presente invención se agregaron a la C-terminal y a la N-terminal de SRIF para formar un complejo de péptido SRIF. El complejo ¦ de péptido SRIF se sintetizó en una síntesis de fase sólida, se purificó a través de una HPLC, y posteriormente el producto sintetizado se confirmó por una espectrometría de masas. El -NH2 muestra que la C-terminal se amida.

Ejemplo 28. SRIF ( 1-14 ) -GAm (28-44 ) -NH2 SEQ ID NO: 64 (GAm: SEQ ID NO: 13) Ejemplo 29. GAm(28-44) -SRIF(1-14) -NH2 SEQ ID NO: 65 (GAm: SEQ ID NO: 13) Ejemplo Comparativo 15. SRIF ( 1-14 ) -NH2 SEQ ID NO: 63 Ejemplo Experimental 6.. Evaluación de la Estabilidad en Plasma del Complejo de Péptido de Somatostatina La estabilidad en plasma se evaluó in vitro, a fin de inspeccionar la bioestabilidad del complejo de péptido de somatostatina. 1. Procedimiento Ratas SD se anestesiaron con éter dietilico, se recolectó sangre entera, y se separó de la misma una fracción de plasma. La somatostatina o complejo de péptido de somatostatina se agregó al plasma de modo que la concentración final del mismo fue de 0.5 µ????/L, y la mezcla se incubó a 37°C. Una muestra se recuperó después de 0, 8 o 48 horas, y una proporción restante se evaluó por una medición de HPLC/MS de una cantidad de la somatostatina o complejo de péptido de somatostatina. La proporción restante de la somatostatina complejo de péptido de somatostatina se evaluó al calcular una proporción de la somatostatina o complejo de péptido de somatostatina que permanece en el plasma recuperado después de 8 horas o 48 horas relativo con un resultado de la medición de HPLC/MS del mismo eh la muestra recuperada a 0 horas/ que se asumió como 100%. 2. Resultados y Discusión Los resultados del análisis de la estabilidad en plasma de la somatostatina y los complejos de péptido de somatostatina se muestran en la Tabla 9 como una proporción restante. La somatostatina nativa en la cual el péptido parcial del módulo GA no se agregó (Ejemplo Comparativo 15) se degradó completamente en el plasma después de 8 horas, mientras que los complejos de péptido de somatostatina en los cuales los péptidos parciales del módulo GA se agregaron a la C-terminal y la N-terminal (Ejemplos 28 y 29) permanecieron en el plasma de rata en una . proporción de 56% y 80%, respectivamente, después de 8 horas, y el aducto en la N-terminal permaneció en- una proporción de 23% aún después de 48 horas. Fue evidente a partir de estos resultados que los complejos de péptido de somatostatina podrían obtener una estabilidad en plasma notablemente alta por la adición del péptido parcial del módulo GA de la presente invención, similar al GLP-1. Se descubrió a partir de lo anterior que el péptido parcial del módulo GA de la presente invención se podría aplicar al péptido corto de 14 residuos tal como la somatostatina, y no solo a la C-terminal sino también a la N-terminal. Además, se ha reportado que la somatostatina tiene una reticulación intermolecular entre los residuos de cisteina. Los resultados de este experimento muestran que la bioestabilidad del péptido que tiene una estructura cíclica se puede mejorar por el péptido parcial del módulo GA de la presente invención.

Tabla 9 Estabilidad En Plasma Ejemplo Experimental 7. Comparación en la Intensidad en la Actividad del Complejo de Péptido de Somatostatina La capacidad de supresión de la secreción de insulina se analizó in vitro, a fin de evaluar la intensidad de la actividad del complejo de péptido de la somatostatina que muestra la estábilidad en plasma en el Ejemplo Experimental 6. 1. Procedimiento La capacidad de supresión de la secreción de insulina se evaluó usando la MIN 6 (obtenida de Mr. Junichi Miyazaki) que fue una célula insulinoma derivada de un ratón, que expresa un SSTR 5 endógeno. La MIN 6 se sembró en una multiplaca, que se cultivó a 37°C durante 48 horas. Después de eso, el cultivo se lavó dos veces con una solución amortiguadora de KRH incluyendo una solución de glucosa 2 mM (que incluye NaCl 119 mM, KC1 4:74 mM, CaC12 2.54 mM, MgCl2 1.19 mM, KH2P04 1.19 mM, solución amortiguadora de HEPES lOmM pH 7.3, y BSA al 0.1%), y posteriormente se incubó a 37 °C durante una hora. Después de la aspiración y remoción de la solución anterior, una solución amortiguadora de KGH que contiene glucosa 20 mM. que incluye el complejo de péptido de somatostatina se agregó a la misma, y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante una hora. Se recuperó de la misma un sobrenadante, y se midió una cantidad de insulina secretada, la medición de la insulina se llevó a cabo en un ensayo inmunoabsorbente enlazada a ' enzimas (ELISA) , y una absorbancia se midió a 450 nm (una sub-longitud de onda: 620 nm) después de la adición de un substrato.

En este experimento, las evaluaciones de la actividad de SRIF nativo (Ejemplo Comparativo 15) y el GAm (28-44) -SRIF-NH2 (Ejemplo 29) se llevó a cabo en una concentración¦ de 1, . 3, 10, 30, 100, 300, y 1000 nM, y se calculó la proporción de supresión máxima (%) de la secreción de insulina. La proporción de supresión máxima (%) de la secreción de insulina en el complejo de péptido de somatostatina se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula. Proporción de Supresión Máxima (%) de la Secreción de la Insulina (%) = [{(el valor máximo de la supresión de la secreción de la insulina en el complejo de péptido SRIF)/(el valor máximo de la supresión' de la secreción de insulina en el SRIF nativo) ] x 100 2. Resultados y Discusión Los resultados del análisis de la proporción de supresión de la secreción de insulina en el complejo de péptido de somatostatina se muestran en la Tabla 10 como una intensidad de la actividad. Sé confirmó que la proporción de supresión de la secreción de la insulina en el complejo de péptido de somatostatina (Ejemplo 29) fue de 90% relativo con aquella de la somatostatina en la cual el péptido parcial del módulo GA no se agregó (Ejemplo Comparativo 15) , y la actividad de la somatostatina se podría mantener aún si el péptido parcial del módulo GA se agregó. Se descubrió a partir de estos resultados que el péptido parcial del módulo GA de la invención permitió que la sustancia bioactiva obtenga estabilidad en plasma notablemente alta y mantenga la bioactividad al agregarla a la sustancia bioactiva, y se podría usar como un medio muy útil para usar prácticamente la sustancia bioactiva cuyo defecto fue la bioestabilidad .

Tabla 10 Capacidad de Supresión de la Secreción de Insulina en Células MIN 6 IV Síntesis del Complejo de Amilina La amilina se seleccionó como una sustancia bioactiva que tiene baja bioestabilidad diferente al GLP-1, y se inspeccionó. El péptido parcial del módulo GA de la presente invención se -agregó a la N-terminal de la amilina para formar un complejo de péptido de amilina. El complejo de péptido de amilina se sintetizó en una síntesis de fase sólida, se purificó a través de una HPLC, y posteriormente el producto sintetizado se confirmó por una espectrometría de masas. El -NH2 muestra que la C-terminal se amida.

Ejemplo 30. GAm (28-4 ) -Amilin ( 1-37 ) -NH2 SEQ ID NO: 67 (GAm: SEQ ID NO: 13) Ejemplo Comparativo 16. Amilin ( 1-37 ) -NH2 SEQ ID NO: 66 Ejemplo Experimental 8. Evaluación de la Estabilidad en Plasma del Complejo de Amilina La estabilidad en plasma se evaluó in vitro, a fin de inspeccionar la bioestabilidad del complejo de péptido amilina. La evaluación se llevó a cabo de una manera en la cual después del tratamiento de la amilina o complejo de péptido de amilina con plasma durante un tiempo predeterminado, una cantidad de cambio del péptido de amilina (complejo) no se degradó, se midió por un HPLC/MS. 1. Procedimiento Ratas SD se anestesiaron con éter dietilico, se recolectó sangre entera y ' se separó de la misma una fracción de plasma. La amilina o el complejo de péptido de amilina se agregó al plasma de modo que la concentración final del mismo fue 0.5 µp???/L, y la mezcla se incubó a 37 °C. Una muestra se recuperó después de 0/ 0.5, 2 o 8 horas, y una proporción restante se evaluó por una medición de HPLC/MS de una cantidad de la amilina o el complejo de péptido de amilina. La proporción restante de la amilina o complejo de péptido de amilina se evaluó al calcular una proporción de la amilina o complejo de péptido de amilina que permanece en el plasma recuperado después de 0.5, 2 u 8 horas relativo con el resultado de la medición HPLC/MS del mismo en la muestra recuperada a 0 horas, que.se asumió como 100%. 2. Resultados y Discusión Los resultados del análisis de la estabilidad en plasma de la amilina o complejo de péptido de amilina se muestra en la Tabla 11 como una proporción restante. La amilina nativa en la cual el péptido parcial del módulo GA no se agregó (Ejemplo Comparativo 16) se degradó en el plasma para disminuir a 15% después de 2 horas, mientras que el complejo de amilina en el cual el péptido parcial del módulo GA se agregó a la N-terminal (Ejemplo 30) permaneció hasta 67% después de 2 horas.. Fue evidente a partir de estos resultados que el complejo de péptido de amilina podría obtener una estabilidad en plasma notablemente alta por la adición del péptido parcial del módulo GA de la presente invención, similar al GLP-1. Se descubrió a partir de lo anterior que la adición del anterior que la adición del péptido parcial del módulo GA de la presente invención se podría usar como un medio muy útil para usar prácticamente una sustancia bioactiva cuyo defecto fue la bioestabilidad .

Tabla 11 Estabilidad En Plasma V Síntesis del Complejo de Péptido de Grelina [ (n-Octanoil) Grelina] La Grelina [ (n-Octanoil) Grelina] se seleccionó como una sustancia bioactiva que tiene baja estabilidad diferente al GLP-1, y se inspeccionó. El péptido parcial del módulo GA de la presente invención se agregó a la C-terminal de la grelina para un complejo de péptido de grelina. El complejo de péptido de grelina se sintetizó en una síntesis de fase sólida, se purificó a través de una HPLC, y posteriormente el producto sintetizado se confirmó por una espectrometría de masas. El -NH2 muestra que la C-terminal se amida.

Ejemplo 31. Grelin ( 1-28 ) -GAm (28-4 ) -NH2 SEQ ID NO: 69 (GAm: SEQ ID NO: 13) Ejemplo Comparativo 17. Grelin (1-28) -NH2 SEQ ID NO: 68 Ejemplo Experimental 9. Evaluación de la Estabilidad en Plasma del Complejo de Péptido de Grelina La estabilidad en plasma se evaluó in vitro, a fin de inspeccionar la bioestabilidad del complejo de péptido grelina. La evaluación se llevó a cabo de una manera en la cual después del tratamiento de la grelina o complejo de péptido de grelina en ' plasma durante un tiempo predeterminado, una cantidad de . cambio de la grelina o el complejo de péptido de grelina no degradado se midió por un HPLC/MS. 1. Procedimiento Ratas SD se anestesiaron con éter dietilico, se recolectó sangre entera y se separó de la misma una fracción de plasma. La grelina o complejo de péptido de grelina se agregó al plasma de modo que la concentración final del mismo fue 0.5 µ?t???/L, y la mezcla se incubó a 37 °C. Una muestra se recuperó después de 0.5, 2, u 8. horas, y se evaluó una proporción restante por la medición de HPLC/MS de una cantidad de la grelina o complejo de péptido de grelina. La proporción restante de- la grelina o complejo de péptido de grelina se evaluó al calcular una proporción de la grelina o complejo de péptido de grelina que permanece en el plasma recuperado después de 0.5, 2 u 8 horas relativo con un resultado de medición de HPLC/MS del mismo en la muestra recuperada a O horas, que se asumió como 100%. 2. Resultados y Discusión Los resultados del análisis de la estabilidad en plasma de la Grelina o complejo de péptido de grelina se muestran en la Tabla 12 como una proporción restante. La Grelina nativa en la cual el péptido parcial del módulo GA no se agregó (Ejemplo Comparativo 17) se degradó en el plasma para disminuirse a 14% después de 2 horas, mientras que el complejo de péptido de grelina en el cual el péptido parcial del módulo GA se agregó a la C-terminal (Ejemplo 31) permaneció a 49% después de 2 horas. Se muestra a partir de estos resultados que el péptido parcial del módulo GA de la presente invención se podría aplicar a un péptido de ácido graso agregado. A partir de lo anterior, la presente invención se puede usar como un medio muy útil para usar prácticamente una sustancia bioactiva cuyo defecto fue la estabilidad.

Tabla 12 Estabilidad En Plasma [SECUENCIA] Inyección de liberación sostenida de PCT-GLP-l (SECUENCIA) . txt

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un péptido parcial de un módulo GA, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos: Ile-Asp-Glu-Ile-Leu y que tiene de 5 a 25 aminoácidos.

2. El péptido parcial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el módulo GA se deriva de un estreptococo G148.

3. El péptido parcial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene de 5 a 17 aminoácidos.

4. El péptido parcial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: Y22- Y23-Y24-Y25-Y26 - Y27-Y28-Y29~ Y30 ~Y 31 ~ Y 32 - Y33 -Y3 - Y3S - Y36~ Y37--Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Y43 - Y44 - Y45-Y46 en donde: Y22 es Lys o supresión; Y23 es Asn o supresión; Y2 es Leu o supresión; Y25 es lie o supresión; Y26 es Asn o supresión; Y27 es Asn o supresión; Y28 es Ala o supresión; Y29 es Lys o supresión; Y30 es Thr o supresión; Y3i es Val o supresión; Y32 es Glu o. supresión; Y33 es Gly o supresión; Y34 es Val o supresión; Y35 es Lys o supresión; Y36 es Ala o supresión; Y37 es Leu o supresión; Y43 es Ala o supresión; Y44 es Ala o supresión; Y45 es Leu o supresión; y Y46 es Pro o supresión, con la condición que la supresión se limite a una supresión continua de Y22 y/o ' Y 6 (que incluye una sola supresión de Y22 o Y46, y supresiones en dos porciones de Y22 y Y46 solas ) .

5. El péptido parcial de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: . Ile-•Asp--Glu--lie--Leu (SEQ ID NO: 2) ; Ile-¦Asp--Glu--He--Leu--Ala-•Ala (SEC » ID NO: 3) ; Leu-¦He--Asp--Glu--He--Leu-¦Ala--Ala (SEQ ID NO: 4) ; Lys-¦Ala--Leu--He--Asp--Glu-¦He--Leu-•Ala-¦Ala (SEQ ID NO: Val-¦Lys--Ala--Leu--lie--Asp--Glu--Ile-•Leu--Ala--Ala (SEQ ID NO : 6 ) ; Gly-¦Val--Lys--Ala--Leu--Ile--Asp--Glu-¦Ile--Leu--Ala (SEQ ID NO: 7); Gly-•Val--Lys--Ala--Leu--Ile-¦Asp--Glu-¦Ile-•Leu--Ala--Ala (SEQ ID ): 8) Glu-¦Gly -Val--Lys--Ala--Leu-¦He--Asp-¦Glu-¦He--Leu--Ala-Ala (SEQ ID NO: 9) ; Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (SEQ ID NO: 10); Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 11) ; Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 12); · Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (SEQ ID NO: 13); Asn-Ala-Lys-T.hr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (SEQ ID NO: 14); Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (SEQ ID NO: 15); y Lys-Asn-Leu-Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (SEQ ID NO: 16) .

6. El péptido parcial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inicia con una de las posiciones de aminoácidos 22 a 38 del módulo GA representado en SEQ ID NO: 1 y termina con una de las posiciones de aminoácidos 42 a 46 del mismo.

7. Un complejo bioactivo caracterizado porque comprende el péptido parcial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una sustancia bioactiva enlazada al péptido parcial.

8. El complejo bioactivo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sustancia bioactiva es una hormona gastrointestinal o un derivado de la misma, o Exendina-4 o un derivado de la misma.

9. El complejo bioactivo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la hormona gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste de GLP-1, GLP-2, GIP, VIP, somatostatina , amilina y Grelina.

10. El complejo bioactivo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende una ligadura a través de la cual el péptido parcial y la sustancia bioactiva se enlazan.

11. El complejo bioactivo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el GLP-1 o el derivado del mismo tiene actividad de GLP-1 y consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-XiB-Xi9-X2o-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26- 27-P e-Ile-X30- rp-Leu-X33-X34 - 35- 36 - 37- 38- 39 - 40 - 1~ 42-X 3~ 44~ 5 en donde: X8 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys o Aib; 9 es Glu, Gly, Asp o Lys; Xi6 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Tyr, Glu, Asp, Trp o Lys; Xia es Ser, Ala, Arg, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp o Lys; X19 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Gln, Asp o Lys; X20 es Leu, Met, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr o Lys X22 es Gly, Ala, Glu, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Asp, Lys, Arg, Cys o Aib; X23 es Gln, Arg, Glu, Asp, Asn o Lys; X25 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp o Lys; X26 es Lys, Gln, Glu, Asp, His o Arg; X27 es Glu, Ala, Asp, Lys o Leu; X30 es Ala, Glu, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Asp, Lys, Gln, Tyr, His o Arg; X33 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Glu, Asp o Lys; X34 es Lys, Arg, Glu, Asp, His, Ala, Gly o Asn; X35 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys, His, Pro o Aib; X36 es Arg, Gly, Lys, Glu, Asp, His o supresión;' X37 es Gly, Pro, Glu, Lys, Ala, Thr, Ser, Asp, Leu, ¦ lie, Val, His o supresión; X38 es Ser, Lys, Arg, Glu, Asp, His o supresión; X39 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His o supresión; X40 es Gly, Glu, Lys, Asp o supresión; X4i es Ala, Lys, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp o supresión; X42 es Pro, -Lys, Glu, Asp o supresión; X43 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; X44 es Pro, Lys, Glu, Asp o supresión; y X45 es Ser, Lys, Val, Glu, Asp o supresión.

12. El complejo bioactivo de conformidad con la reivindicación 11, en donde el GLP-1 o el derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste de: tipo GLP-1 (7-37); [Ser8]-GLP-1 (7-37); [Gly8]-GLP-1 (7-37); [Val8]-GLP-1 (7-37); [Glu22] -GLP-1 (7-37); [Lys22 ] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22]-GLP-1 (7-37); [Val8, Lys22]-GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22] -GLP-1 (7-37); [Gly8, Lys22] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu30]-GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu30]-GLP-1 (7-37); [Val8, His37]-GLP-1 (7-37); [Gly8, His37]-GLP-1 (7-37); [Arg34]-GLP-1 (7-37); [Lysl8] -GLP-1 (7-37);· [Gly8, Glu22, Gly36]-GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib22]-GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib35]-GLP-1 (7-37); [Aib8, Aib22, Aib35] -GLP-1 (7-37); [Glu22, Glu23]-GLP-1 (7-37); [Gly8, Glu22, Glu23]-GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Glu23]-GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Val25] -GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Ile33]-GLP-1 (7-37); [Val8, Glu22, Val25, Ile33]-GLP-1 (7-37); GLP-l(7-36) del mismo en el cual la posición 37 se suprime; y el tipo GLP-1 (7-35) del mismo en el cual las posiciones 36 y 37 se suprimen.

13. Un método para mejorar la bioestabilidad de una sustancia bioactiva, caracterizado porque la etapa de enlazar el péptido parcial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 a una sustancia bioactiva.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la sustancia bioactiva es GLP-1 o un derivado del mismo, y el péptido parcial se enlaza a la C-terminal del GLP-1 o el derivado del mismo.