JP6174071B2 - 代謝疾患および肥満の治療のためのgipに基づいた混合アゴニスト - Google Patents
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Description
(A)例えば、天然グルカゴンのC末端部分、好ましくは位置27C末端側の位置への1、2、3個又はそれ以上の荷電アミノ酸の導入により溶解性を向上させること。そのような荷電アミノ酸は、例えば位置28又は29で天然アミノ酸を荷電アミノ酸により置換する、あるいは位置27、28又は29の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、1、2、3個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。他の実施態様において、1、2、3個又は全ての荷電アミノ酸は、正に荷電されている。そのような修飾は溶解性を増加し、例えば、25℃で24時間後に測定したとき、約5.5〜8の所定のpH、例えばpH7で、天然グルカゴンを基準として少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍又はそれ以上の溶解性をもたらす。
(B)例えばペプチドの位置16、17、20、21、24若しくは29、C末端延長内、又はC末端アミノ酸への、本明細書に記載されているポリエチレングリコール鎖のような親水性部分の付加により、溶解性及び作用持続時間又は循環半減期を増加すること。
(C)本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのアシル化又はアルキル化により、溶解性及び/若しくは作用持続時間若しくは循環半減期を増加すること、並びに/又は作用開始を遅延すること。
(D)本明細書に記載されている位置1又は2のアミノ酸の修飾により、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)への耐性を導入することを介して、作用持続時間又は循環半減期を増加すること。
(E)位置15のAspの修飾により、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸による欠失又は置換により、溶解性を増加すること。そのような修飾は、5.5〜8の範囲内のpHにおいて分解又は切断を低減することができ、例えば25℃で24時間後に元のペプチドの少なくとも75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%を保持することができる。そのような修飾は、Asp15−Ser16のペプチド結合の切断を低減する。
(F)位置16のSerの修飾により、例えばThr又はAIBでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾も、Asp15−Ser16のペプチド結合の切断を低減する。
(G)位置27のメチオニンの修飾により、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾は酸化分解を低減することができる。安定性は、位置20又は24のGlnの修飾により、例えば、Ala又はAIBでの置換により増強することもできる。そのような修飾は、Glnの脱アミド化を介して生じる分解を低減することができる。安定性は、位置21のAspの修飾により、例えばGluでの置換により増強することができる。そのような修飾は、Aspの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することによって生じる分解を低減することができる。
(H)実質的に活性に影響を与えない非保存的若しくは保存的置換、付加又は欠失、例えば、位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28若しくは29の1つ以上での保存的置換;Alaによるこれらの位置の1つ以上での置換;位置27、28若しくは29の1つ以上でのアミノ酸の欠失;又は、C末端カルボン酸基の代わりにC末端アミド若しくはエステルと組み合わせてもよい、アミノ酸29の欠失;Argによる位置12のLysの置換;Val若しくはPheによる位置10のTyrの置換。
(a)位置1でのアミノ酸修飾、
(b)(i)位置iおよびi+4のアミノ酸の側鎖の間または位置jおよびj+3のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋(ここで、iは、12、13、16、17、20または24であり、jは17である)、あるいは(ii)位置16、20、21または24のうちの1、2、3つ、または全てにおけるα,α−二置換によるアミノ酸置換、
(c)位置27、28および29のうちの1、2つ、または全てにおけるアミノ酸修飾、ならびに
(d)1、2、3、4、5、6または8個の更なるアミノ酸修飾
を含む、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴン(配列番号1)の類縁体を提供し、
ここで、GIP受容体活性化における類縁体のEC50は、約100nM以下である。
(a)位置1でのアミノ酸修飾は、大型の芳香族アミノ酸(Tyr、Phe、Trp、アミノ−Phe、ニトロ−Phe、クロロ−Phe、スルホ−Phe、4−ピリジル−Ala、メチル−Tyr、または3−アミノTyrでもよい)による位置1のHisの置換である、
(b)(i)ラクタム架橋は、位置16および20のアミノ酸の間にあり、位置16および20のアミノ酸の一方はGluで置換され、位置16および20のアミノ酸の他方はLysで置換されている、または(ii)α,α−二置換アミノ酸はAIBである、
(c)位置27のMetは、大型の脂肪族アミノ酸(Leuでもよい)で置換されている、
(d)位置28のAsnは、小型の脂肪族アミノ酸(Alaでもよい)で置換されている、ならびに
(e)位置29のThrは、小型の脂肪族アミノ酸(Glyでもよい)で置換されている。
(a)位置12のアミノ酸修飾(Ileによる置換でもよい)、
(b)位置17および18のアミノ酸修飾(位置17のQによる置換、および位置18のAによる置換でもよい)、
(c)C末端へのGPSSGAPPPS(配列番号95)の付加、または
これらの任意の組み合わせ
を含む(但しこれらに限定されない)、更なる修飾を含むことができる。
(a)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Valまたはα−アミノ−N−酪酸で置換されている位置2のSer;
(b)Trp、Lys、Orn、Glu、PheまたはValで置換されている位置10のTyr;
(c)位置10のLysへのアシル基の結合;
(d)Argで置換されている位置12のLys;
(e)Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、GlyまたはAIBで置換されている位置16のSer;
(f)Gln、LysまたはGluで置換されている位置17のArg;
(g)Ala、Ser、ThrまたはGlyで置換されている位置18のArg;
(h)Ala、Ser、Lys、シトルリン、Arg、OrnまたはAIBで置換されている位置20のGln;
(i)Glu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている位置21のAsp;
(j)Ileで置換されている位置23のVal:
(k)Asn、Ala、Ser、Thr、Glu、LysまたはAIBで置換されている位置24のGln;ならびに
(l)位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,24、27、28、および29のいずれかでの保存的置換;あるいは
これらの任意の組み合わせ
を含む(但しこれらに限定されない)、更なる修飾を、代替的にまたは追加的に含むことができる。
本出願は、以下に対する優先権を請求する:
米国仮出願第61/073,274号(2008年6月17日出願)、米国仮出願第61/078,171号(2008年7月3日出願)、米国仮出願第61/090,448号(2008年8月20日出願)、および米国仮出願第61/151,349号(2009年2月10日出願)。それぞれの出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明を説明し、特許請求するに際し、以下に記載される定義に従って下記の語法が使用される。
I.小型で脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性の負荷電残基及びそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln、システイン酸及びホモシステイン酸;
III.極性の正荷電残基:
His、Arg、Lys、オルニチン(Orn);
IV.大型で脂肪族の非極性残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys、ノルロイシン(Nle)、ホモシステイン;
V.大型の芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp、アセチルフェニルアラニン。
本明細書に開示される修飾は、グルカゴン(配列番号1)の操作によって、増加されたGIP活性、グルカゴン活性および/またはGLP−1活性を示すグルカゴンペプチドを作り出すことを可能にする。本明細書に開示される他の修飾は、得られるペプチドの半減期を延長する、溶解性を増加する、または安定性を増加する。本明細書に開示される更に他の修飾は、活性に対して何も効果を有さないか、または所望の活性(単数または複数)を破壊することなく実施することができる。同じ目的を果たす(例えば、GIP活性を増加する)任意の組み合わせを、個別にまたは組み合わせて適用することができる。増強された特性を付与する単一または一連の組み合わせのいずれかを、個別にまたは組み合わせて適用することができ、例えば、GIPおよび/またはGLP−1活性の増加を、半減期の増加と組み合わせることができる。
GIP受容体に対して増強された活性は、位置1でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、位置1のHisは、大型の芳香族アミノ酸(Tyr、Phe、Trp、アミノ−Phe、ニトロ−Phe、クロロ−Phe、スルホ−Phe、4−ピリジル−Ala、メチル−Tyr、または3−アミノTyrでもよい)で置換されている。予想外なことに、位置1のTyrと、アミノ酸12−29に対応する領域内のアルファ−へリックスの安定化との組み合わせは、GIP受容体、またGLP−1受容体およびグルカゴン受容体を活性化するグルカゴンプチドを提供する。アルファ−へリックス構造を、例えば共有若しくは非共有分子内架橋の形成によって、またはアルファ−へリックス安定化アミノ酸(例えば、α,α−二置換アミノ酸)による位置12〜29周辺のアミノ酸の置換および/若しくは挿入によって、安定化することができる。
幾つかの実施態様において、増強された効力を有し、更に向上した溶解性および安定性を有してもよい、グルカゴンの類縁体が提供される。一つの実施態様において、増強されたグルカゴン効力は、天然グルカゴン(配列番号1)の位置16のアミノ酸修飾によりもたらされる。非限定例によると、そのような増強された効力は、位置16の天然型のセリンを、グルタミン酸により置換する、または4原子の長さの側鎖を有する別の負に帯電したアミノ酸により置換する、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより置換する、または少なくとも1個のヘテロ原子(例えば、N、O、S、P)を含有し約4(若しくは3〜5)原子長さの側鎖を有する荷電アミノ酸により置換することによって、もたらすことができる。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、元々の、GLP−1受容体と比べたグルカゴン受容体への選択性を保持する。
GLP−1受容体に対する増強された活性は、また、例えば、2個のアミノ酸の側鎖の間の分子内架橋の形成を介して、またはアルファ−へリックス安定化アミノ酸(例えば、α,α−二置換アミノ酸)による位置12〜29周辺のアミノ酸置換および/若しくは挿入を介して、グルカゴンのC末端部分(アミノ酸12−29周辺)のアルファ−へリックス構造を安定化することによって、もたらされる。これらのアミノ酸の側鎖は、水素結合、または塩架橋の形成などのイオン相互作用、または共有結合を介して互いに結合することができる。幾つかの実施態様において、架橋は、3個の介在アミノ酸で隔てられているアミノ酸同士、すなわち位置「i」のアミノ酸と位置「i+4」のアミノ酸との間に形成され、ここでiは、12〜25(例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25)の任意の整数である。例示的な実施態様において、アミノ酸対12と16、13と17、16と20、17と21、20と24、または24と28(i=12、16、20また24のアミノ酸対)の側鎖は、互いに結合しており、したがってグルカゴンのアルファ−へリックスを安定化する。
グルカゴン受容体、GLP−1受容体およびGIP受容体のそれぞれに対して増強された活性は、(i)式IV:
位置1および/または2の修飾は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)切断に対するペプチドの耐性を増加することができる。例えば、位置2のアミノ酸は、D−セリン、D−アラニン、バリン、グリシン、N−メチルセリン、N−メチルアラニン、またはアミノイソ酪酸で置換されていることができる。幾つかの実施態様において、位置1のアミノ酸は、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ,アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸(DMIA)で置換されていることができる。
なお更なる例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドのいずれかを、配列番号1の位置15および/または16のアミノ酸を修飾して、特に酸性またはアルカリ性の緩衝液におけるペプチドの経時的な分解を低減することによって更に修飾して、その安定性を向上させることができる。そのような修飾は、Asp15−Ser16のペプチド結合の切断を低減する。例示的な実施態様において、位置15のアミノ酸修飾は、Aspの欠失、または、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、若しくはホモシステイン酸によるAspの置換である。他の例示的な実施態様において、位置16のアミノ酸修飾は、Serの欠失、またはThr若しくはAIBによるSerの置換である。他の例示的な実施態様において、位置16のSerは、グルタミン酸により、または4原子長の側鎖を有する別の負に帯電したアミノ酸により、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸またホモシステイン酸のいずれかにより、置換されている。
天然グルカゴンペプチドの幾つかの位置を、母体となるペプチドの少なくとも幾つかの活性を保持しつつ、修飾することができる。したがって、出願者たちは、位置2、5、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28または29に配置された1個以上のアミノ酸を、天然グルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換し、グルカゴン受容体に対して依然として活性を保持することができると予測する。
別の実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドの溶解性は、ペプチドへの親水性部分の共有結合により増強される。親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴンペプチドに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化またはPEG部分の反応性基(例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基)と標的化合物の反応性基(例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基)との他の化学選択的結合/連結方法を含む、当該技術において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを1つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、5−ピリジルおよびアルファ−ハロゲン化アシル基(例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸)が含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によりペプチドに結合する場合、選ばれるポリマーは、重合の程度が制御されるように単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug.Delivery Rev. 54: 477-485 (2002);Roberts et al., Adv.Drug Delivery Rev.54: 459-476 (2002)、およびZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182(1995)を参照すること。
別の実施態様において、グルカゴンペプチドのいずれかの溶解性を、ペプチドのC末端部分、好ましくは配列番号1の位置27のC末端側の位置、において荷電アミノ酸を導入するアミノ酸置換及び/又は付加によって、改善することができる。更に、1、2又は3個の荷電アミノ酸を、C末端部分の範囲内に、好ましくは位置27のC末端側に導入してもよい。幾つかの実施態様において、位置28及び/又は29の天然アミノ酸が1又は2個の荷電アミノ酸で置換されている、並びに/或いは更なる実施態様において、1〜3個の荷電アミノ酸もまたペプチドのC末端に付加されている。例示的な実施態様において、1、2個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。幾つかの実施態様において、負荷電アミノ酸(酸性アミノ酸)は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合体部分に結合しているような他の結合体も包含し、この結合は、場合により共有結合を介してでもよく、場合によりリンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力、又は疎水性若しくは親水性相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド/受容体、酵素/基質、核酸/核酸結合タンパク質、脂質/脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー、又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することができる。
幾つかの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは修飾されて、アシル基またはアルキル基、例えば天然型のアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基を含む。アシル化またはアルキル化は、循環しているグルカゴンペプチドの半減期を増加することができる。アシル化またはアルキル化は、有利には、グルカゴンおよび/若しくはGLP−受容体に対して作用の開始を遅延するおよび/若しくは作用の持続時間を延長する、ならびに/またはDPP−IVなどのプロテアーゼに対する耐性を向上させる、ならびに/または溶解性を向上させることができる。グルカゴンペプチドのグルカゴンおよび/またはGLP−1および/またはGIP受容体に対する活性を、アシル化の後で維持することができる。幾つかの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、非アシル化型のグルカゴンペプチドに匹敵する。代替的な実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、非アシル化型のグルカゴンペプチドと比較して増加される。
本発明の幾つかの実施態様によると、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴン(配列番号1)の類縁体は、配列番号1であって、(a)GIPアゴニスト活性を付与する位置1でのアミノ酸修飾、(b)類縁体のC末端部分(アミノ酸12−29)のアルファ−へリックス構造を安定化する修飾を含み、(c)更に、1〜10個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)の更なるアミノ酸修飾を有してもよい、配列番号1を含む。幾つかの実施態様において、類縁体は、GIP受容体に対する天然GIPのの活性少なくとも約1%の活性、または本明細書に記載されるGIP受容体に対する他の任意の活性レベルを示す。
(a)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸で置換されている、位置2のSer;
(b)Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、またはValで置換されている、位置10のTyr;
(c)位置10のLysへのアシル基の結合;
(d)ArgまたはIleで置換されている位置12のLys;
(e)Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly、またはAIBで置換されている、位置16のSer;
(f)Glnで置換されている位置17のArg;
(g)Ala、Ser、Thr、またはGlyで置換されている、位置18のArg;
(h)Ser、Thr、Ala、Lys、シトルリン、Arg、Orn、またはAIBで置換されている、位置20のGln;
(i)Glu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置21のAsp;
(j)Ileで置換されている位置23のVal:
(k)Asn、Ser、Thr、Ala、またはAIBで置換されている、位置24のGln;ならびに
(l)位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,24、27、28、および29のいずれかでの保存的置換
のうちの任意の1つまたは組み合わせを含む。
(a)GIPアゴニスト活性を付与する位置1でのアミノ酸修飾、
(b)位置iとi+4のアミノ酸の側鎖の間、または位置jとj+3のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋(ここで、iは12、13、16、17、20または24であり、jは17である)、
(c)位置27、28および29のうちの1、2つ、または全てでのアミノ酸修飾、例えば位置27および/または28でのアミノ酸修飾、ならびに
(d)1〜9個または1〜6個の更なるアミノ酸修飾、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8または9個の更なるアミノ酸修飾
を含み、
GIP受容体活性化における類縁体のEC50は、約10nM以下である。
(a)GIPアゴニスト活性を付与する位置1でのアミノ酸修飾、
(b)類縁体の位置16、20、21および24のうちの1、2、3つ、または全てのアミノ酸が、α,α−二置換アミノ酸で置換されている、
(c)位置27、28および29のうちの1、2つ、または全てでのアミノ酸修飾、例えば位置27および/または28でのアミノ酸修飾、ならびに
(d)1〜9個または1〜6個の更なるアミノ酸修飾、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8または9個の更なるアミノ酸修飾
を含み、
GIP受容体活性化における類縁体のEC50は、約10nM以下である。
(a)GIPアゴニスト活性を付与する位置1でのアミノ酸修飾、
(b)式IV:
で示されるアミノ酸による位置26のSerのアミノ酸置換、
(c)アルファ,アルファ二置換アミノ酸による位置20のGlnのアミノ酸置換、
(d)位置27、28および29のうちの1、2つ、または全てのアミノ酸修飾、例えば位置27および/または28のアミノ酸修飾、ならびに
(e)1〜9個または1〜6個の更なるアミノ酸修飾、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8または9個の更なるアミノ酸修飾
を含み、
GIP受容体活性化における類縁体のEC50は、約10nM以下である。
(a)GIPアゴニスト活性を付与する位置1でのアミノ酸修飾、および
(b)位置29のアミノ酸のC末端側への約1〜約21個のアミノ酸の延長部(ここで延長部の少なくとも1個のアミノ酸はアシル化またはアルキル化されている)
を含み、
ここで、GIP受容体活性化における類縁体のEC50は、約10nM以下である。
(i)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸で置換されている、位置2のSer;
(ii)Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、またはValで置換されている、位置10のTyr;
(iii)位置10のLysへのアシル基の結合;
(iv)Argで置換されている位置12のLys;
(v)Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly、またはAIBで置換されている、位置16のSer;
(vi)Glnで置換されている位置17のArg;
(vii)Ala、Ser、Thr、またはGlyで置換されている、位置18のArg;
(viii)Ala、Ser、Thr、Lys、シトルリン、Arg、Orn、またはAIBで置換されている、位置20のGln;
(ix)Glu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置21のAsp;
(x)Ileで置換されている位置23のVal:
(xi)Asn、Ala、Ser、Thr、またはAIBで置換されている、位置24のGln;ならびに
(xii)位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,24、27、28、および29のいずれかでの、保存的置換、
のうちの1つ以上を含むことができる。
類縁体は、幾つかの実施態様において、(i)から(xii)の修飾の組み合わせを含む。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置3にアミノ酸修飾(例えば、GluによるGlnのアミノ酸置換)を含むことができ、ここで類縁体は、グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の1%未満の活性を有する。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置7にアミノ酸修飾(例えば、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばAbuまたはIleによる、Thrのアミノ酸置換)を含むことができ、ここで類縁体は、GLP−1受容体に対するGLPの活性の10%未満の活性を有する。
(a)場合により、GIPアゴニスト活性を付与する位置1でのアミノ酸修飾も含んでもよく、また、
(b)位置29のアミノ酸のC末端側への約1〜約21個のアミノ酸の延長部(ここで延長部の少なくとも1個のアミノ酸はアシル化またはアルキル化されている)、および
(d)6個までの更なるアミノ酸修飾
を更に含む、配列番号227、228、229または230のいずれかのアミノ酸配列を含み、
ここで、GIP受容体活性化における類縁体のEC50は、約10nM以下である。
(i)位置2のアミノ酸は、D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Valまたはα−アミノ−N−酪酸のいずれか1つである;
(ii)位置10のアミノ酸は、Try、Trp、Lys、Orn、Glu、PheまたはValである;
(iii)位置10のLysへのアシル基の結合;
(iv)位置12のアミノ酸は、Ile、LysまたはArgである;
(v)位置16のアミノ酸は、Ser、Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、GlyまたはAIBのいずれか1つである;
(vi)位置17のアミノ酸はGlnまたはArgである;
(vii)位置18のアミノ酸は、Ala、Arg、Ser、ThrまたはGlyのいずれか1つである;
(viii)位置20のアミノ酸は、Ala、Ser、Thr、Lys、シトルリン、Arg、Orn若しくはAIBまたは他のアルファ,アルファ二置換アミノ酸のいずれか1つである;
(ix)位置21のアミノ酸は、Glu、Asp、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか1つである;
(x)位置23のアミノ酸はValまたはIleである;
(xi)位置24のアミノ酸は、Gln、Asn、Ala、Ser、ThrまたはAIBのいずれか1つである;ならびに
(xii)位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,24、27、28、および29のいずれか1つ以上での保存的置換
の1つ以上を更に含むことができる。
類縁体は、幾つかの実施態様において、(i)から(xii)の修飾の組み合わせを含む。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置3にアミノ酸修飾(例えば、GluによるGlnのアミノ酸修飾)を含むことができ、ここで類縁体は、グルカゴン受容体に対してグルカゴンの活性の1%未満の活性を有する。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置7にアミノ酸修飾(例えば、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばAbuまたはIleによるThrのアミノ酸置換)を含むことができ、ここで類縁体は、GLP−1受容体に対してGLPの活性の10%未満の活性を有する。
(A)類縁体は、位置iとi+4のアミノ酸の側鎖の間、または位置jとj+3のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋(ここで、iは12、13、16、17、20または24であり、jは17である)を含む;
(B)類縁体の位置16、20、21および24のうちの1、2、3個または全てのアミノ酸が、α,α−二置換アミノ酸で置換されている;あるいは
(C)類縁体は、下記(i)〜(ii)を含む、すなわち、(i)式IV:
ならびに
(iv)6個までの更なるアミノ酸修飾。
(i)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸で置換されている、位置2のSer;
(ii)Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、またはValで置換されている、位置10のTyr;
(iii)位置10のLysへのアシル基の結合;
(iv)Argで置換されている位置12のLys;
(v)Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly、Lys、またはAIBで置換されている、位置16のSer;
(vi)Glnで置換されている位置17のArg;
(vii)Ala、Ser、Thr、またはGlyで置換されている、位置18のArg;
(viii)Ala、Ser、Thr、Lys、シトルリン、Arg、Orn、またはAIBで置換されている、位置20のGln;
(ix)Glu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置21のAsp;
(x)Ileで置換されている位置23のVal:
(xi)Asn、Ala、Ser、Thr、またはAIBで置換されている、位置24のGln;ならびに
(xii)位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,24、27、28、および29のいずれかでの、保存的置換
のうちの1つ以上を含むことができる。
類縁体は、幾つかの実施態様において、(i)から(xii)の修飾の組み合わせを含む。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置3にアミノ酸修飾(例えば、GluによるGlnのアミノ酸置換)を含むことができ、ここで類縁体は、グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の1%未満の活性を有する。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置7にアミノ酸修飾(例えば、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばAbu若しくはIleによるThrのアミノ酸置換)、27若しくは28アミノ酸ペプチドを生じる、位置27若しくは28のアミノ酸のアミノ酸(複数若しくは単数)C末端の欠失、またはこれらの組み合わせを含むことができ、ここで類縁体は、GLP−1受容体に対するGLP−1活性の約10%未満の活性を有する。
幾つかの態様において、本発明は、好ましくは滅菌され、好ましくは少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の純度レベルを有する、本明細書に開示されている任意の新規グルカゴンペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、少なくともAの濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでAは、0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/mlまたはそれ以上である。他の実施態様において、そのような組成物は、最大でもBの濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでBは、30mg/ml、25mg/ml、24mg/ml、23mg/ml、22mg/ml、21mg/ml、20mg/ml、19mg/ml、18mg/ml、17mg/ml、16mg/ml、15mg/ml、14mg/ml、13mg/ml、12mg/ml、11mg/ml、10mg/ml、9mg/ml、8mg/ml、7mg/ml、6mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/mlまたは0.1mg/mlである。幾つかの実施態様において、組成物はA〜Bのmg/ml、例えば0.001〜30.0mg/mlの濃度範囲でグルカゴンペプチドを含有することができる。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌され場合より多様な容器に保存されている水性液剤を含む。本発明の化合物を、幾つかの実施態様おいて使用して、注射用の予備処方液剤を調製することができる。別の実施態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与する使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。容器またはキットにラベルを付けて周囲温度または冷蔵温度で保存することができる。
本発明の化合物を、標準的な合成方法、組み換えDNA技術またはペプチドおよび融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができる。特定の非天然アミノ酸は、標準的な組み換えDNA技術によっては発現することはできないが、それらを調製する技術は当該技術において知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適用可能であれば、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応により合成することができる。グルカゴンペプチドのグルカゴンおよびGLP−1活性についての追加的なデータは、PCT/US2008/053857、2008年2月13日出願にも開示されており、その全体は参照として本明細書に組み込まれる。
一般的合成プロトコール:
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430 Aペプチド合成機により、0.2mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発し、HBTU活性化「Fast Boc」単一カップリングを使用して合成した。Bocアミノ酸及びHBTUは、Midwest Biotech(Fishers, IN)から得た。使用した側鎖保護基は、Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl−Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br−Z)及びTrp(CHO)であった。N末端Hisの側鎖保護基はBocであった。
一般的ペグ化プロトコール:(Cys−マレイミド)
典型的には、グルカゴンCys類縁体をリン酸緩衝食塩水(5〜10mg/ml)に溶解し、0.01Mエチレンジアミン四酢酸を加える(総容量の10〜15%)。過剰(2倍)マレイミドメトキシPEG試薬(Nektar)を加え、反応を室温で撹拌し、その間、HPLCで反応進行をモニタリングする。8〜24時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために、0.1%TFA/アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化類縁体を得た。
グルカゴンCys17(1−29)及び同様のモノCys類縁体の合成
60mlの反応容器中の0.2mmolのBoc Thr(OBzl) Pam樹脂(SynChem Inc)及び以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、FastBoc HBTU活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT
以下の側鎖保護基を使用した:Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl−Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)及びTyr(Br−Z)。合成の完了したペプチジル樹脂を20%ピペリジン/ジメチルホルムアミドで処理して、Trpホルミル保護を除去し、次にHF反応容器に移し、真空下で乾燥した。1.0mlのp−クレゾール及び0.5mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をHF装置(Pennisula Labs)に取り付け、ドライアイス/メタノール浴で冷却し、排気し、およそ10mlの液体フッ化水素を圧入した。反応を氷浴で1時間撹拌し、次にHFを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを50mlの酢酸水溶液に抽出した。分析HPLC〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm、A緩衝液は0.1%TFA、B緩衝液は0.1%TFA/90%ACN、10分間かけて10%Bから80%Bの勾配〕を少量の切断抽出物試料により実施した。残りの抽出物を2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLCシステムを使用してアセトニトリル勾配を実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%アセトニトリル。勾配=450分間かけて30%Bから100%B。
グルカゴン−Cex及び他のC末端延長部類縁体の合成
285mg(0.2mmol)のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂(Midwest Biotech)を60mlの反応容器に入れ、以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、FastBoc HBTU活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS
以下の側鎖保護基を使用した:Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl−Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)及びTyr(Br−Z)。合成の完了したペプチジル樹脂を20%ピペリジン/ジメチルホルムアミドで処理して、Trpホルミル保護を除去し、次にHF反応容器に移し、真空下で乾燥した。1.0mlのp−クレゾール及び0.5mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をHF装置(Pennisula Labs)に取り付け、ドライアイス/メタノール浴で冷却し、排気し、およそ10mlの液体フッ化水素を圧入した。反応物を氷浴で1時間撹拌し、次にHFを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを50mlの酢酸水溶液に抽出した。分析HPLC〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm、A緩衝液は0.1%TFA、B緩衝液は0.1%TFA/90%ACN、10分間かけて10%Bから80%Bの勾配〕を切断抽出物のアリコートにより実施した。残りの抽出物を2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLCシステムを溶出に使用してアセトニトリル勾配を実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%アセトニトリル。勾配=450分間かけて30%Bから100%B。画分58〜65をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、198.1mgを得た。
グルカゴンCys17Mal−PEG−5K
15.1mgのグルカゴンCys17(1−29)及び27.3mgの平均分子量5000のメトキシポリ(エチレングリコール)マレイミド(mPEG−Mal−5000、Nektar Therapeutics)を、3.5mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、0.5mlの0.01Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えた。反応物を室温で撹拌し、反応の進行をHPLC分析〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm(0.5A)、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/90%ACN、勾配=10分間かけて10%Bから80%B〕によりモニターした。
グルカゴンCys21Mal−PEG−5K
21.6mgのグルカゴンCys21(1−29)及び24mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、0.5mlの0.01Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えた。反応物を室温で撹拌した。2時間後、更なる12.7mgのmPEG−Mal−5000を加えた。8時間後、反応混合物を2.2×25cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を4ml/分のPharmacia FPLCにより実施し、その間、5分毎の画分を収集した。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。勾配=450分間かけて20%から80%B。
グルカゴンCys24Mal−PEG−5K
20.1mgのグルカゴンC24(1−29)及び39.5mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのPBSに撹拌しながら溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを加えた。反応物を室温で7時間撹拌し、次に更なる40mgのmPEG−Mal−5000を加えた。およそ15時間後、反応混合物を、2.2×25cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLCを使用して実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A緩衝液=0.1%TFA、B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN、勾配=450分間かけて30%Bから100%B。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、45.8mgを得た。MALDI質量スペクトル分析は、最大値が9175.2のPEGに典型的な幅広いシグナルを示し、これはグルカゴンC24(3457.8)よりもおよそ5,000amu多い。
グルカゴンCys24Mal−PEG−20K
25.7mgのグルカゴンC24(1−29)及び40.7mgのmPEG−Mal−20K(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのPBSに撹拌しながら室温で溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを加えた。6時間後、出発物質と生成物の比率は、HPLCにより決定すると、およそ60:40であった。更なる25.1mgのmPEG−Mal−20Kを加え、反応物を更に16時間撹拌した。生成物比率が有意に改善されなかったので、反応混合物を、2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、450分かけて30%Bから100%Bへの勾配を使用するPharmacia FPLCにより精製した。A緩衝液=0.1%TFA、B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN、流量=4ml/分、5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。均質な生成物を含有する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、25.7mgを得た。分析HPLCにより決定された純度は約90%であった。MALDI質量スペクトル分析は、23,000〜27,000の幅広のピークを示し、これは出発グルカゴンC24(3457.8)よりもおよそ20,000amu多い。
グルカゴンCys29Mal−PEG−5K
20.0mgのグルカゴンCys29(1−29)及び24.7mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのPBSに撹拌しながら室温で溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを加えた。4時間後、更なる15.6mgのmPEG−Mal−5000を加えて、反応の完了を促進した。8時間後、反応混合物を、2.2×25cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLCシステムにより実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分75−97を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、HPLCにより回収された出発物質(画分58−63)と異なる、40.0mgの生成物を得た。分析HPLC〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm(0.5A)、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/90%ACN、勾配=10分間かけて10%Bから80%B〕によるこの生成物の分析は、95%を超える純度を示した。MALDI質量スペクトル分析は、8,000〜10,000(最大9025.3)の範囲の質量を有するPEG成分の存在を示し、これは出発物質(3484.8)よりも5,540amu多い。
グルカゴンCys24(2−ブチロラクトン)
24.7mgのグルカゴンCys24(1−29)に、4mlの0.05M重炭酸アンモニウム/50%アセトニトリル及び5.5ulの2−ブロモ−4−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトンの溶液(アセトニトリル900ul中100ul)を加えた。室温で3時間撹拌した後、更なる105ulのラクトン溶液を反応混合物に加え、更に15時間撹拌した。反応混合物を、10%酢酸水溶液で10mlに希釈し、2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配(450分かけて20%Bから80%B)をPharmacia FPLCにより実施し、その間、5分毎の画分を収集し、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。流量=4ml/分、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分74−77を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、7.5mgを得た。HPLC分析は、95%の純度を示し、MALDI質量スペクトル分析は、3540.7の質量又は出発物質よりも84質量単位多い質量を示した。この結果は、単一ブチロラクトン部分の付加と一致している。
グルカゴンCys24(S−カルボキシメチル)
18.1mgのグルカゴンCys24(1−29)を、9.4mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=9.2)に溶解し、0.6mlのブロモ酢酸溶液(アセトニトリル中1.3mg/ml)を加えた。反応を室温で撹拌し、反応の進行を分析HPLCにより追跡した。1時間後、更なる0.1mlのブロモ酢酸溶液を加えた。反応を更に60分間撹拌し、酢酸水溶液で酸性化し、精製のために2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLC(流量=4ml/分)により実施し、その間、5分毎の画分を収集し、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分26−29を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、数mgの生成物を得た。分析HPLCは、90%の純度を示し、MALDI質量スペクトル分析は、所望の生成物の質量3515を確認した。
グルカゴンCys24マレイミド,PEG−3.4K−二量体
16mgのグルカゴンCys24及び1.02mgのMal−PEG−Mal−3400、平均分子量3400のポリ(エチレングリコール)−ビス−マレイミド(Nektar Therpeutics)を、3.5 のリン酸緩衝食塩水及び0.5mlの0.01M EDTAに溶解し、反応を室温で撹拌した。16時間後、更なる16mgのグルカゴンCys24を加え、撹拌を続けた。およそ40時間後、反応混合物をPharmcia PepRPC 16/10カラムに装填し、アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、2分毎の画分を収集し、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。流量=2ml/分、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分69−74を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、10.4mgを得た。分析HPLCは、90%の純度を示し、MALDI質量スペクトル分析は、9500〜11,000の範囲の成分を示し、これは所望の二量体と一致する。
グルカゴンラムタムの合成
285mg(0.2mmol)のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂(Midwest Biotech)を60mLの反応容器に入れ、以下の配列を、Boc DEPBT活性化単一結合を使用する改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機により構築した。
HSQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNT−NH2(12−16ラクタム)
グルカゴン溶解性アッセイ:
グルカゴン(または類縁体)の溶液(1mg/mlまたは3mg/ml)を0.01NのHClで調製する。100ulの保存液を、0.01NのHClで1mlに希釈し、UV吸光度(276nm)を決定する。残りの保存液のpHを、200〜250ulの0.1M Na2HOP4(pH9.2)を使用して、pH7に調整する。溶液を4℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に100ulの上澄みを、0.01NのHClで1mlに希釈し、UV吸光度を決定する(2回繰り返す)。
最終吸光度/初期吸光度×100=パーセント溶解率
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液(0.05Mのトリス−HCl、pH7.5、0.15MのNaCl、0.1%w/vのウシ血清アルブミン)により作製したペプチドの一連の3倍希釈を、96ウエル白色/透明底プレート(Corning Inc.,Acton, MA)において、0.05nMの(3−〔125I〕−ヨードチロシル)Tyr10グルカゴン(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、1ウエル当たり1〜6マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分および1mg/ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素A型シンチレーション近接アッセイビーズ(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)と混合した。ロータリー振とう器により800rpmで5分間振とうしてから、プレートを室温で12時間インキュベートし、次にMicroBeta1450液体シンチレーションカウンター(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)で読み取った。非特異的結合(NSB)放射能を、試験サンプルの最高濃度よりも4倍高い濃度の「非放射性」天然リガンドを有するウエルで測定し、総結合放射能を、競合物質を有さないウエルで検出した。特異的結合の率を以下のように計算した:特異的結合%=((結合−NSB)/(総結合−NSB))×100。IC50値は、Originソフトウェア(OriginLab, Northampton, MA)を使用して決定した。
機能アッセイ−cAMP合成
cAMPを誘導するグルカゴン類縁体の能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。グルカゴン受容体又はGLP−1受容体のいずれかと、cAMP応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたHEK293細胞から、0.25%ウシ増殖血清(HyClone, Logan, UT)が補充されたDMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)における16時間の培養により血清を取り除き、次にグルカゴン、GLP−1又は新規グルカゴン類縁体のいずれかによる一連の希釈と共に、96ウエルポリ−D−リシン被覆「バイオコート」プレート(BD Biosciences, San Jose, CA)において37℃、5%CO2で5時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、100マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で10分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)で測定した。有効50%濃度を、Originソフトウェア(OriginLab, Northampton, MA)を使用して計算した。
グルカゴンCys−マレイミドPEG類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はPBSに溶解し、初期HPLC分析を実施した。pHを調整した後(4、5、6、7)、試料を37℃で特定の時間インキュベートし、HPLCにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定した。特定の目的のペプチドの濃度を決定し、無傷のまま残っている率を初期分析と比較して計算した。
アシル化および/またはペグ化ペプチドを以下のように調製した。ペプチドは、CS Bio 4886ペプチド合成機またはApplied Biosystems 430Aペプチド合成機のいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成した。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)に記載されている現場中和化学を使用した。アシル化ペプチドでは、アシル化される標的アミノ酸残基(例えば、位置10)をNε−FMOCリシン残基で置換した。DMF中の20%ピペリジンによる、合成の完了したN末端BOC保護ペプチドの30分間の処理によって、FMOC/ホルミル基を除去した。遊離ε−アミノLys残基へのカップリングは、FMOC保護スペーサーアミノ基(例えば、FMOC−(N−BOC)−トリプトファン−OH)またはアシル鎖(例えば、C17−COOH)のいずれかの10倍モル過剰との、およびDMF/DIEA中のPyBOPまたはDEPBTカップリング試薬とのカップリングにより達成した。その後のスペーサーアミノ酸のFMOC基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングを繰り返した。100%TFAによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基およびN末端BOC基の除去をもたらした。ペプチド樹脂を、5%DIEA/DMFで中和し、乾燥し、次にHF/p−クレゾールの95:5を0℃で1時間使用して支持体から切断した。エーテル抽出の後、5%HOAc溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和した。次に溶液の試料を、正確な分子量のペプチドを含有しているかについてESI−MSにより確認した。正確なペプチドを、100%CH3CN中の10%CH3CN/0.1%TFAから0.1%TFAの直線勾配を使用してRP−HPLCにより精製した。Vydac C18の22mm×250mmタンパク質カラムを精製に使用した。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝液比の20:80で完全に溶出した。一部を一緒にプールし、分析RP−HPLCにより純度を調べた。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得た。収量は、合成に応じて10mg〜100mgの範囲であった。
体重増加、食欲および血中グルコースレベルに対するインビボ効果
以下のペプチドを実質的に上記に記載されたように合成した。
(A)ペグ化グルカゴン/GLP−1コアゴニストペプチド(位置2のAIBにより、40K PEG基に結合している位置24のCysによりさらに修飾されているキメラ2ペプチド(実施例21を参照すること)である、キメラ2 AIB2 C24 40K PEG);
(B)ペグ化GIPアンタゴニスト(位置3におけるPro、40K PEG基に結合している位置24におけるCys、およびC末端カルボキシレートを置換するアミドにより修飾されている、GIPのアミノ酸1−42(天然GIPの配列は配列番号4)である、Pro3 C24 GIP NH2(1−42)40K PEG);ならびに
(C)GIPアゴニスト(位置2におけるAIBおよび40K PEG基に結合している位置24におけるCysにより修飾されている、GIPのアミノ酸1−42(天然GIPの配列は配列番号4)である、AIB2 C24 GIP(1−42)40K PEG)。
ペプチドのGIP、GLP−1およびグルカゴン活性
配列番号5〜94のペプチド(それぞれC末端カルボキシレートの代わりにアミドを含む)を、実質的に上記に記載されたように合成し、実施例16によって、GIP受容体、GLP−1受容体およびグルカゴン受容体に対する活性についてインビトロで試験した。それぞれのペプチドのEC50を表1に示す。
実施例21のGLP−1/GIP/グルカゴントリアゴニストペプチド(mt−170)、GlP−1/GIPコアゴニストペプチド(mt−178)、および2つのGIP/グルカゴンコアゴニストペプチド(mt−182およびmt−179)について、これらのペプチドか、グルカゴン/GLP−1コアゴニストペプチド(キメラ2 AIB2(次の修飾:位置17にGln、位置28にAla、位置20にLys、位置21にGlu、位置23にIleおよび位置24にAla、ならびに位置2にAIBの更なる修飾を有するC末端アミド(「キメラ2」)を含む天然グルカゴンアミド配列(配列番号1))か、キメラ2 AIB2 ラクタム(キメラ2 AIB2と同じであるが、位置16のGluおよび位置20のLysの更なる修飾を有し、ラクタムがGlu16とLys20の側鎖を架橋する))、またはビヒクルのみを、食餌誘導肥満(DIO)マウスに毎週一度ずつ(QW)(70または210nmol/kg/週)皮下注射することにより、インビボで試験した。各群は、8匹のマウスを含有し、それぞれ初期平均体重の50gを有した。体重を周期的に決定した。
GLP−1/GIP/グルカゴントリアゴニストペプチド(mt−170)およびGLP−1/GIPコアゴニストペプチド(mt−178)について、これらのペプチドか、GLPアゴニスト(位置16にGluを有する配列番号3を含む)か、またはビヒクルのみを、食餌誘導肥満(DIO)マウスに毎週一度ずつ(10nmol/kg/週を4週間または35nmol/kg/週を2週間)皮下注射することによって、インビボで試験した。各群は、8匹のマウスを含有し、マウスはそれぞれ初期平均体重の49gを有した。体重および血中グルコースレベルを周期的に決定した。図5および6に示されているように、GLP−1/GIPコアゴニストおよびトリアゴニストは両方とも、GLP−1アゴニストよりも、体重および血中グルコースレベルの低減において効果があった。
ラクタムの代わりにアルファ,アルファ二置換アミノ酸を有するグルカゴンに基づいた類縁体の、アルファ−へリックスを安定化する効果は、mt−165(配列番号64)およびmt−170(配列番号69)のラクタムを位置16のAIBに代えることによって調査した。ラクタムの代わりに位置16のAIBを有するmt−165の配列を含むペプチドは、「mt−241」と呼ばれ、配列番号167のアミノ酸配列を有し、一方、ラクタムの代わりに位置16のAIBを有するmt−170の配列を含むペプチドは、「mt−248」と呼ばれ、配列番号173のアミノ酸配列を有した。
ラクタム環を欠いており、位置16にLysまたは同様の残基および位置20にAIBを有する直鎖ペプチドを、実質的に上記に記載されたように作製した。ペプチドは、配列番号99〜141、144〜164および166のアミノ酸配列を有した。ペプチドを、グルカゴン、GLP−1およびGIP受容体に対する生物学的活性について、実施例16に実質的に記載されたようにインビトロで試験した。結果を表3に示す。
ペグ化環状ラクタム含有ペプチドmt−178(配列番号75)およびペグ化直鎖ラクタム欠失ペプチドmt−274(配列番号99)のインビボ活性を、DIOマウスで試験し、配列番号179のGLP−1に基づいた構造を有する純粋なGLP−1アゴニスト対照のインビボ活性と比較した。ペプチドまたはビヒクル対照を、0日目に1、3または10nmol/kg/週でマウスに腹腔内注射した。
より高い用量(10または35nmol/kg/週)のペプチドをマウスに皮下注射したこと以外は、実施例26に記載されたものと同様にして、同じペプチドをマウスにおいて試験した。以下の2つの追加的なペプチドも、これらの用量で試験した:第1のペプチドは、mt−179と同じ構造を有するが、mt−178において見出されるようなマイケル付加を介してマレイミドPEGにより形成される伝統的なチオエーテル結合を介してではなく、求核置換により形成されるより安定したチオエーテル結合(−SCH2CO−)を介して位置40のCysに結合している、PEG基を含み、第2ペプチドは、m−274と同じ構造を有するが、求核置換により形成されるチオエーテル結合(−SCH2CO−)を介して位置40のCysに結合しているPEG基を含む。これらのペプチドは、本明細書において、それぞれmt−178(TE)およびmt−274(TE)と呼ばれる。
実施例26に記載されたペプチドのインビボ活性を、アシル化型の直鎖mt−274ペプチドのインビボ活性と比較した。さらに具体的には、C末端アミノ酸(Lys残基)がC16脂肪アシル基、C14脂肪アシル基またはC18脂肪アシル基に共有結合している3つのアシル化型のmt−274を作製し、試験した。これらのペプチドは、本明細書において、それぞれmt−298、mt−309およびmt−310と呼ばれる。母体ペプチドと同様に、アシル化ペプチドmt−274も、40kDa PEG基を含んだ。しかし、アシル化ペプチドのPEG基は、ペプチドの位置24のCys残基の側鎖に共有結合していた。アシル化ペプチドmt−298、mt−309およびmt−310のアミノ酸配列は、本明細書において、それぞれ配列番号101〜103として提供される。
アシル化されているがペグ化されていない直鎖グルカゴンに基づいたラクタム欠失ペプチドを、実質的に上記に記載されたように作製した。具体的には、C末端アミノ酸(配列番号104)にC14脂肪アシル基を含むmt−260、C末端アミノ酸(配列番号105)にC16脂肪アシル基を含むmt−261、およびC末端アミノ酸(配列番号106)にC18脂肪アシル基を含むmt−262を作製した。これらのペプチドのそれぞれの構造は、mt−298、mt−309およびmt−310と同様であったが、mt−260、mt−261およびmt−262が位置24においてペグ化Cys残基の代わりにAsn残基を含む点において異なっていた。
直鎖グルカゴンに基づいたペプチドmt−261(配列番号105)を、異なる用量でDIOマウス(1群当たりN=8匹;平均初期体重=48g)において試験した。マウスには、ビヒクルのみ、リラグルチド(30nmol/kg体重)またはmt−261(0.3、1、3、10若しくは30nmol/kg体重)を毎日一度ずつ1週間注射した。
直鎖アシル化グルカゴンに基づいたペプチドmt−277、mt−278およびmt−279のインビボ効果を試験し、リラグルチドと比較した。DIOマウス(1群当たり8匹のマウス;平均初期体重=51.4g)には、ビヒクル対照、または10nmol/kgのリラグルチド、mt−277、mt−278若しくはmt−279を毎日、1週間皮下注射した。
GLP−1受容体活性のグルカゴンに基づいた類縁体を修飾して、配列番号95のアミノ酸配列のC末端延長部を含ませ、更に修飾して、配列番号95のC末端にLysを含ませた。類縁体の位置40に配置したLys残基を、C14脂肪アシル基でアシル化した。このアシル化類縁体を、グルカゴン、GLP−1およびGIP受容体に対するインビトロ活性について、実質的に実施例16に記載されたように試験した。そのインビトロ活性は、母体である、C末端延長部を欠き、位置40でアシル化されている、GLP−1受容体活性のグルカゴンに基づいた類縁体のインビトロ活性と比較した。C末端延長アシル化類縁体は、GIP受容体に対する活性のおよそ15%の増加を示し、グルカゴン受容体に対する活性のおよそ52%の増加を示した。GLP−1受容体に対する活性は、C末端延長アシル化類縁体により刺激されると、実際に減少した。しかし、活性は、依然として、GLP−1受容体に対する天然GLP−1により達成される活性の100%超であった。
アシル化グルカゴン類縁体ペプチド(それぞれ、C末端カルボキシレートの代わりにアミドを含む)を実質的に上記に記載されたように合成した。ペプチドmt−358、mt−367、mt−368およびmt−369は、アシル化単量体であり、一方、mt−354、mt−376およびmt−377は、アシル化二量体であり、ここで二量体は、それぞれ、C末端Cys残基を介して結合する2つの単量体を含んだ。ペプチドmt−367、mt−368およびmt−369は、アシル基を結合する目的でγGlu−γGluジペプチドスペーサーを含み、一方、mt−358はスペーサーの不在下でアシル化された。ペプチドmt−225、mt−227およびmt−294は、位置16のグルタミン酸と位置20のリシンの間にラクタム架橋を含む、ペグ化単量体であった。ペプチドmt−225およびmt−227は、PEGを結合する目的で、ジペプチドスペーサーを含み、一方、mt−294は、ハロアセチルとの反応により作製されるチオエーテルを介してアシル化された。ペプチドmt−356およびmt−357は、非アシル化対照ペプチドとして機能し、mt−357は位置7にIleを含んだが、mt356はThrを含んだ。全てについて、GIP受容体、GLP−1受容体およびグルカゴン受容体に対するインビトロ活性を、実質的に実施例16に記載されたように試験した。それぞれのペプチドの天然ホルモンに関するEC50(nM)および活性を表4に示す。
同じアミノ酸配列を有するが、ペグ化リンカーが異なる、以下の2つのアシル化グルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されたように作製した:mt−331(配列番号153)は、下記構造:
アミノ酸配列が同じであるが、位置40のLysに結合しているアシル基が不在である(mt−331(配列番号153))またはC14脂肪アシル基が存在する(mt−353(配列番号166))ことにより異なる、これら2つのペプチドの、体重、食物摂取、血中グルコースレベルおよび脂肪量に対するインビボ効果を、7か月齢のC57BI/6マウスにおいて試験した。マウスは糖尿病誘発性食餌を5か月摂り、平均初期体重は53gであった。ペプチドまたはビヒクル対照を、0.1、0.3、3または10nmol/kgの用量で1週間皮下注射することによってマウスに投与した。
配列番号123、124および125の構造をそれぞれ有する3つのアシル化トリアゴニストペプチドmt−277、mt−278およびmt−279の、体重、血中グルコースレベルおよび食物摂取に対するインビボ効果を、DIOマウスの8群(1群当たり8匹のマウス)において試験した。ペプチドは、同じアミノ酸構造を有したが、それらが結合している脂肪アシル基の大きさが異なっていた。濃度が10nM/kgのリラグルチドを対照として使用した。ペプチドまたはビヒクル対照を、皮下注射により毎日、1週間投与した。
ペグ化アシル化ペプチド(mt−309;配列番号102)および非ペグ化アシル化ペプチド(mt−261;配列番号105)の効能に対する、投与頻度の効果を、平均体重の58gを有するDIOマウスマウスの7群(1群当たり8匹のマウス)により試験した。ペプチドは、5nmol/kgの用量を毎日一度ずつ、10nmol/kgの用量を2日毎に、または30nmol/kgの用量を毎週一度ずつ、マウスに皮下注射した。マウスの各群が試験期間の終了までに30nmol/kgを摂取するように、研究を6日間続けた。体重および血中グルコースレベルを、最初の投与の0および6日後に測定した。
効能に対する投与頻度の効果を、アシル化グルカゴンアゴニストペプチドmt−261(配列番号105)について、初期体重56gを有するDIOマウスの8群(1群当たり8匹のマウス)に、各群が1週間当たり30nmol/kgの総用量を摂取するように、5nmol/kgを毎日、10nmol/kgを2日毎、15nmol/kgを3日毎、または30nmol/kgを1日、それぞれ皮下注射することにより試験した。マウスは8か月齢であり、糖尿病誘発性食餌を6か月間摂っていた。各群の体重、食物摂取、血中グルコースレベルおよび脂肪量を測定した。図38に示されているように、3日毎にペプチドを注射したマウスは、最大の体重減少を示した。興味深いことに、ペプチドを毎日注射したマウスおよびペプチドを2日毎に注射したマウスは、ほぼ同じ体重減少を示した。
グルカゴン受容体に対してのみ測定可能なアゴニスト活性を有し、GIP受容体に対しては活性を有さず、下記のペプチドJ:
HS−X−GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(Nle)DE(配列番号240)の主鎖、または、
ペプチドK:
HS−X−GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE(配列番号241)
の主鎖を含み、位置3に付加的修飾を有する、グルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されているように、固相ペプチド合成により作製した。ペプチドを、実質的に実施例16に記載されているように、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれのペプチドのEC50(nM)を表6に示す。
グルカゴン受容体に対しては検出可能な活性を有するが、GIP受容体に対しては活性を有さず、多様なグルカゴン類縁体主鎖上の位置3にDab(Ac)を含む、グルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されているように作製し、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性を試験した。それぞれのペプチドの構造および活性を表7に示す。
C末端カルボキシレートの代わりにC末端アミドを有するグルカゴンの類縁体を実質的に本明細書に記載されたように作製した。
Claims (9)
- 下記(a)〜(c)の修飾または下記(a)〜(d)の修飾を有し、
GIP受容体に対する天然GIPの活性の少なくとも1%の活性を示す、
GIPアゴニスト活性を有する、グルカゴン(配列番号1)の類縁体。
(a)位置1はチロシンで、位置2はアミノイソ酪酸(AIB)
(b)下記から成る群から選ばれる修飾:
(i) 位置16と20のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋、および
(ii) 位置20はアミノイソ酪酸(AIB)
ならびに、
(c)1〜10個の更なるアミノ酸修飾であって、下記から成る群から選ばれる修飾:
(i) 位置3において、GlnからGluへの置換
(ii) 位置10のアミノ酸がTrp,Lys,Orn,Glu,PheまたはVal
(iii) 位置10のLysへのアシル基の結合
(iv) 位置12のアミノ酸がIle,LysまたはArg
(v) 位置16のアミノ酸がSer,Lys,Glu,Gln,ホモグルタミン酸,
ホモシステイン酸,Thr,GlyまたはAIB
(vi) 位置17のアミノ酸がGlnまたはArg
(vii) 位置18のアミノ酸がAla,Arg,Ser,ThrまたはGly
(viii)位置20のアミノ酸がAla,Lys,シトルリン,Arg,OrnまたはAIB
(ix) 位置21にアミノ酸がGlu,Asp,ホモグルタミン酸,ホモシステイン酸
(x) 位置23のアミノ酸がValまたはIle
(xi) 位置24のアミノ酸がGln,Asn,AlaまたはAIB
(xii) 位置27において、MetからLeuへの置換
(xiii)位置28において、AsnからAlaへの置換
(xiv) 位置29において、ThrからGlyへの置換
(xv)C末端のアミノ酸のカルボキシル基からアミド基への置換
(d)位置29のアミノ酸のC末端におけるGPSSGAPPPS(配列番号95)の付加 - 配列番号123〜125、231〜239、257〜259からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の類縁体。
- 配列番号167〜169、173〜178、225からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の類縁体。
- 位置10に存在するリジンがアシル化されており、アシル基はスペーサーで前記リジンと結合している、請求項1に記載の類縁体。
- 位置29のアミノ酸のC末端にGPSSGAPPPS(配列番号95)が付加され、さらに配列番号95のC末端に、アシル化されたアミノ酸が付加された、請求項1に記載の類縁体。
- 前記アシル化されたアミノ酸は、アシル基とスペーサーで結合している、請求項5に記載の類縁体。
- 前記スペーサーは、Ala−Ala、β−Ala−β−Ala、Leu−Leu、Pro−Pro、γ−Glu−γ−Gluからなる群から選択されるジペプチドである、請求項6に記載の類縁体。
- 前記アシル基はC14またはC16脂肪アシル基である、請求項7に記載の類縁体。
- 位置20にアミノイソ酪酸(AIB)を有し、
位置29のアミノ酸のC末端にGPSSGAPPPS(配列番号95)が付加されていて、
C末端のアミノ酸のカルボキシル基がアミド基に置換されていて、
位置20又は位置40のアミノ酸がC14またはC16脂肪アシル基でアシル化されている、
請求項1に記載の類縁体。
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