CN117186206A - 新型不同glp1类似肽共价聚合体及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN117186206A CN202311372601.0A CN202311372601A CN117186206A CN 117186206 A CN117186206 A CN 117186206A CN 202311372601 A CN202311372601 A CN 202311372601A CN 117186206 A CN117186206 A CN 117186206A
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唐松山
杜艳
谭宏梅
余立城
刘涛
罗群
黄惠娴
唐婧晅
周雅曼
王剑云
王新瑞
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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种GLP‑1类似肽的二聚体和四聚体及其应用。本发明所述的GLP‑1类似肽二聚体或四聚体可提高降糖时间，具有超级降糖活性，可用于制备预防和/或治疗代谢性疾病的药物，如预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物；与单链思美格鲁肽相比，本发明所述GLP‑1类似肽二聚体或四聚体在降糖活性中，相同摩尔浓度下能够产生更高浓度的内源性胰岛素，用于降糖或保护神经细胞；本发明所述GLP‑1类似肽二聚体或四聚体能够维持21、35天的血浆稳定性；本发明所述GLP‑1类似肽二聚体或四聚体在治疗第五周和第十周产生降糖峰效应。

Description

新型不同GLP1类似肽共价聚合体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及新型不同GLP1类似肽共价聚合体及其制备方法和应用。
背景技术
肠L细胞加工胰高血糖素前体基因，产生一种30氨基酸残基的胰高血糖素样肽1(GLP-1，氨基酸序列标示为7-37)。所述GLP-1促进胰腺β细胞释放内源性胰岛素，产生降糖效应。GLP-1作用于下丘脑饮食中心，抑制摄食，减低体重和降血脂，治疗肥胖或脂肪肝。
以阿尔兹海默症(AD)为代表的认知功能障碍严重损害人类的记忆功能。老年痴呆症是神经退行性疾病，它的发病机制涉及多个因素，主要包括中枢胆碱能损伤、Aβ级联学说、衰老假说、代谢障碍、自由基凋亡、Tau蛋白磷化、抗氧化应激、钙失衡、基因遗传学等。美国专利US20220033457A1和US20220111010A1公开了GLP-1R激动剂可激活特定部位的神经元通路，显著增加海马、下丘脑旁室核、腹内侧核及脑桥臂旁的神经兴奋性，起到认知功能调节等作用。糖尿病是AD的危险因素(Holscher C.2014.Peptide drugs that have beendeveloped to treat type 2diabetes show neuroprotective effects.Regul Pept；192-193:55-6.)，胰岛素信号通路对AD有显著性调节(Craft S,Watson GS.Insulin andneurodegenerative disease:shared and specific mechanisms.LancetNeurol.2004Mar；3(3):169-78.doi:10.1016/S1474-4422(04)00681-7)。据研究表明，因为AD病人脑胰岛素受体磷酸化导致失活脱敏，引起认知障碍。在糖尿病中，GLP-1治疗引起高浓度内源性胰岛素，后者能够通过血脑屏障，作用于几乎存在所有神经细胞上的胰岛素受体，进而治疗老年痴呆症。
目前，经美国FDA或中国SFDA批准的GLP-1类似物有每日1次给药的利拉鲁肽(Liraglutide)、每日两次给药的Exenatide和每周1次给药阿必鲁肽(Albiglutide)，杜拉鲁肽(Dulaglutide)，利西拉肽(Lixisenatide)和思美格鲁肽(Semaglutide)。其中，利拉鲁肽和思美格鲁肽进入中国市场。聚乙二醇洛塞那肽(Polyethylene Glycol Loxenatide)是聚乙二醇修饰GLP-1，Albiglutide是两个GLP-1序列与人白蛋白串联形成，杜拉鲁肽是GLP-1序列融合到Fc片段形成。它们表现较低比活性，与利拉鲁肽或思美格鲁肽比较，需要较大剂量，才能产生相同降糖效应。长效思美格鲁肽一上市，其他品种几乎退市。
GLP-1类似物研究仍然需要进行优化，因为目前的长效激活剂在比活性和体重降低方面，已证明都不如天然GLP-1有效。
发明内容
本发明的目的在于提供新型不同GLP1类似肽共价聚合体及其制备方法和应用，所述GLP1类似肽共价聚合体在比活性和体重降低方面均有较大提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种GLP-1类似肽二聚体，其特征在于，原料包括第一链GLP-1类似肽单体和第二链GLP-1类似肽单体；
所述第一链GLP-1类似肽单体和第二链GLP-1类似肽单体独立地为：
(N端)H-X8-EGTFTSDV-X17-X18-Y19-X20-E21-X22-X23-X24-X25-X26-EFIAWLV-X34-GR-X37(C端)；
所述C端为酰胺基结构或羧基结构；
所述X8、X17、X18、X20、X22、X23、X24、X25、X26、X34和X37均为氨基酸，下角标数据为氨基酸残基的排列顺序；
X8为L-ɑ-丙氨酸、β-丙氨酸、α-氨基异丁酸或β-氨基异丁酸；
所述X17、X18、X20、X22、X23、X24或X25为双氨基-氨基酸；
X26为赖氨酸、侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸、侧链ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸或其他双氨基-氨基酸；
X34为精氨酸或赖氨酸；
X37为Gly-OH、Gly-NH2、NH2或OH。
优选的，所述GLP-1类似肽二聚体的原料还包括连接剂；
所述连接剂为含巯基的氨基酸或乙二酸；
所述第一链GLP-1类似肽单体中的X17、X18、Y19、X20、E21、X22、X23、X24或X25中任一氨基酸残基通过所述连接剂与第二链GLP-1类似肽单体中X17、X18、Y19、X20、E21、X22、X23、X24或X25中任一氨基酸残基连接。
优选的，所述双氨基-氨基酸为二氨基丙氨酸Dap、鸟氨酸Orn或赖氨酸K。
优选的，当所述X26为双氨基-氨基酸侧链氨基上烷基酸修饰时，如ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸，所述烷基酸修饰为[2×AEEAC-γ-Glu(N-α-脂肪二酸)]修饰，所述X26的结构式如式1所示：
所述式1中，n＝16～18。
优选的，当所述X26为双氨基-氨基酸侧链氨基上烷基酸修饰时，如ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸，所述烷基酸修饰为[γ-Glu(N-α-脂肪酸)]修饰，所述X26的结构式如式2所示：
所述式2中，n＝16～18。
优选的，所述含巯基的氨基酸为半胱氨酸C、苏氨酸T或同型半胱氨酸HCY。
本发明还提供了一种GLP-1类似肽四聚体，所述GLP-1类似肽四聚体由第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体通过二硫键连接得到；
所述第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体独立地为上述技术方案所述的GLP-1类似肽二聚体。
本发明还提供了上述技术方案所述GLP-1类似肽二聚体或上述技术方案所述的GLP-1类似肽四聚体在制备预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物，活性成分包括上述技术方案所述GLP-1类似肽二聚体或上述技术方案所述的GLP-1类似肽四聚体及其在药学上可接受的盐。
与现有技术相比，本发明所述技术方案具有以下有益效果：
1)本发明提供的GLP-1类似肽二聚体或四聚体可延长降糖时间，产生超级降糖活性，可用于制备预防和/或治疗代谢性疾病和老年痴呆症的药物，如治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物；
2)与单链思美格鲁肽相比，本发明所述GLP-1类似肽二聚体或四聚体在降糖活性中，相同摩尔浓度下能够产生更高浓度的内源性胰岛素，用于降糖或保护神经细胞；
3)本发明所述GLP-1类似肽二聚体或四聚体能够维持21、35天的血浆稳定性；
4)本发明所述GLP-1类似肽二聚体或四聚体在对Ⅱ型糖尿病小鼠进行治疗实验的第五周和第十周产生降糖峰效应。
附图说明
图1为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的体重变化图(与思美格鲁肽比较，2G21-L/M/H和4G18-L/M/H有0.7/-4.3/-1％和-2.6/-1.9/-2.8％程度的体重降低)；
图2为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的肝脏重量变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应
P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图3为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的FPG水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应
P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图4为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的糖化血红蛋白水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图5为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的胰岛素水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**对应
P<0.05,0.01，t检验)；
图6为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的CHE水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应
P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图7为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的ALT水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应
P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图8为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的TG水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应
P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图9为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的AST水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图10为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的HDL水平变化图(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**对应P<0.05,0.01，t检验)；
图11为测试例中经过T2D治疗后不同实验组的AMY水平变化图(其中a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图12为测试例中进行小鼠Morris水迷宫测试时小鼠进入各盲端的错误次数和潜伏期(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，**对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图13为测试例中12周给药后的空腹胰岛素水平(其中a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图14为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的血糖水平(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*对应P<0.05，t检验)；
图15为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的海马Tau信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图16为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的皮质Tau信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图17为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的海马GFAP信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图18为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的皮质GFAP信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图19为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的海马Aβ信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图20为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的皮质Aβ信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图21为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的海马SYN信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)；
图22为测试例中APP/PS1转基因小鼠在12周给药后的皮质SYN信号分析结果(a,b,c,d,e,f,g,h,i对应NaCl-PB,Model Control,Semaglutide,2G21-L/M/H,4G18-L/M/H组；*，**，***对应P<0.05,0.01,0.001，t检验)。
具体实施方式
本发明提供了一种GLP-1类似肽二聚体，原料包括第一链GLP-1类似肽单体和第二链GLP-1类似肽单体；
所述第一链GLP-1类似肽单体和第二链GLP-1类似肽单体独立地为：
(N端)H-X8-EGTFTSDV-X17-X18-Y19-X20-E21-X22-X23-X24-X25-X26-EFIAWLV-X34-GR-X37(C端)；
所述C端为酰胺基结构或羧基结构；
所述X8、X17、X18、X20、X22、X23、X24、X25、X26、X34和X37均为氨基酸，下角标数据为氨基酸残基的排列位点；
X8为L-ɑ-丙氨酸、β-丙氨酸、α-氨基异丁酸或β-氨基异丁酸；
所述X17、X18、X20、X22、X23、X24或X25为双氨基-氨基酸；
X26为赖氨酸、侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸、侧链ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸或其他双氨基-氨基酸；
X34为精氨酸或赖氨酸；
X37为Gly-OH、Gly-NH2、NH2或OH。
在本发明中，X17、X18、X20、X22、X23、X24或X25为双氨基-氨基酸，所述双氨基-氨基酸优选为二氨基丙氨酸Dap、鸟氨酸Orn或赖氨酸K。
在本发明中，所述GLP-1类似肽单体优选为在(N端)H-X8-EGTFTSDV-S17-S18-Y19-L20-E21-G22-Q23-A24-A25-X26-EFIAWLV-X34-GR-X37(C端)的基础上对S17、S18、L20、G22、Q23、A24和A25中的一种替换为Dap或Orn。
在本发明中，当所述X26为双氨基-氨基酸侧链氨基上烷基酸修饰时，如ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸，所述烷基酸修饰为[2×AEEAC-γ-Glu(N-α-脂肪二酸)]修饰，所述X26的结构式优选如式1所示：
所述式1中，n＝16～18，AEEAC与AEEA相同。
在本发明中，当所述X26为双氨基-氨基酸侧链氨基上烷基酸修饰时，如ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸，所述烷基酸修饰为[γ-Glu(N-α-脂肪酸)]修饰，所述X26的结构式优选如
式2所示：
所述式2中，n＝16～18。
在本发明中，当所述X26为其他双氨基-氨基酸时，所述其他双氨基-氨基酸优选为二氨基丙氨酸Dap或鸟氨酸Orn。
在本发明中，所述X26为侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸、侧链ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸时，由于侧链修饰可以进一步提高二聚体的降糖时间，且修饰基团上的脂肪链越长，降糖时间越长，以脂肪链C18-20(即n＝16～18)为最佳。
在本发明中，当所述X17、X18、Y19、X20、E21、X22、X23、X24或X25中包括含有巯基的氨基酸时，所述第一链GLP-1类似肽单体中的巯基与所述第二链GLP-1类似肽单体中的巯基进行二硫键连接，形成GLP-1类似肽二聚体。
在本发明中，所述GLP-1类似肽二聚体的原料还包括连接剂；所述连接剂优选为含巯基的氨基酸或乙二酸；所述第一链GLP-1类似肽单体中的X17、X18、Y19、X20、E21、X22、X23、X24或X25中任一氨基酸残基优选通过所述连接剂与第二链GLP-1类似肽单体中X17、X18、Y19、X20、E21、X22、X23、X24或X25中任一氨基酸残基连接。在本发明中，所述含巯基的氨基酸优选为半胱氨酸C、苏氨酸T或同型半胱氨酸HCY。
在本发明中，所述第一链GLP-1类似肽单体和第二链GLP-1类似肽单体优选相同。
以所述第一链GLP-1类似肽单体中的X17通过所述连接剂与所述第二链GLP-1类似肽单体中的X17结合为例，所述GLP-1类似肽二聚体为：
或
在本发明中，所述X38为含巯基的氨基酸。
本发明还提供了一种GLP-1类似肽四聚体，所述GLP-1类似肽四聚体由第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体通过二硫键连接得到；
所述第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体独立地为上述技术方案所述的GLP-1类似肽二聚体。
在本发明中，所述第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体的连接剂均为含巯基的氨基酸。
以所述第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体中的各GLP-1类似肽单体中的X17之间结合为例，所述GLP-1类似肽四聚体为：
在本发明中，所述X38为含巯基的氨基酸。
本发明对所述GLP-1类似肽二/四聚体的制备方法采用本领域技术人员熟知的常规固相多肽合成法进行制备合成即可。
本发明还提供了上述技术方案所述GLP-1类似肽二聚体或GLP-1类似肽四聚体在制备预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物中的应用，活性成分包括上述技术方案所述GLP-1类似肽二聚体或GLP-1类似肽四聚体及其在药学上可接受的盐。
下面结合实施例对本发明提供的GLP-1类似肽的二聚体和四聚体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：GLP-1类似肽单体、二聚体或四聚体及其制备：
一、GLP-1类似肽二聚体的制备：
步骤一：称取2g的RinkAmideAm Resin(AM树脂,实施例中C端为酰胺基CONH2或-NH2的肽，用AM树脂合成)或2-氯树脂(2-Cl-Trtresin，以下凡是C端为羧基COOH或-OH的肽，用2-氯树脂合成)，用二氯甲烷(DCM)浸泡15min，抽干，加入20％(V/V)哌啶DMF溶液搅拌反应20min，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤2次，甲醇洗涤2次，再用DMF洗涤2次，待用；
步骤二：称取164mg的Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-NH2或Fmoc-R-NH2(C端第一个适合氨基酸)，3倍重量2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)加入20mL装有步骤一处理后树脂的固相反应器中，DCM溶解，加入0.1mL DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)，反应2小时；
步骤三：加入吡啶和醋酸酐(吡啶：乙酸酐＝1：1)溶液10mL封闭反应0.5h，然后用DMF洗涤1次，甲醇洗涤1次，再用DMF洗涤2次，抽干；
步骤四：向反应器中加入20％(V/V)哌啶DMF溶液反应20min，用DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为蓝色；
步骤五：称取424mg的Fmoc-R-OH(按照多肽氨基酸排序的适合氨基酸)，HOBT81mg，用DMF溶解，并且加入0.1mL的DIC，混匀，加入到反应器中反应2h，抽干，DMF洗涤1次，甲醇洗涤1次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为无色；
步骤六：加入20％(V/V)的哌啶DMF溶液反应20min，用DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为蓝色。
步骤七：重复步骤五和步骤六，直至序列单体长链：[H-X8-EGTFTSDV-X17-X18-Y19-X20-E21-X22-X23-X24-X25-X26-EFIAWLV-X34-GR-X37-树脂]的最后一个氨基酸残基Fmoc-His-OH，并且茚三酮检测为无色。
步骤八：加入2％(V/V)水合肼溶液反应30min去除步骤七长链中X26的Fmoc-Lys(Dde)-OH的保护基Dde，侧链氨基裸露，用DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为蓝色；
步骤九：称取Fmoc-Glu-Otbu 255mg，HOBT 81mg，用DMF溶解，并且加入0.1mL的DIC，混匀，加入到反应器中与赖氨酸侧链氨基反应2h，抽干，DMF洗涤1次，甲醇洗涤1次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为无色。
步骤十：向反应器中加入20％(V/V)哌啶DMF溶液反应20min，去除Fmoc-Glu-Otbu的氨基保护基团Fmoc，用DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为蓝色；
步骤十一：称取二十烷二酸单叔丁酯或[(AEEA)2-γ-Glu-20碳二酸]239mg，HOBT81mg，用DMF溶解，并且加入0.1mL的DIC，混匀，加入到反应器中反应1h，抽干，DMF洗涤1次，甲醇洗涤1次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为无色；
步骤十二：以乙二酸为连接剂的H型二聚体合成：按照如下序列，用2-氯树脂合成第一条全保护单体长链：
(N端)H-X8-EGTFTSDV-X17-X18-Y19-X20-E21-X22-X23-X24-X25-X26-EFIAWLV-X34-GR-X37(C端)，完成X26侧链氨基脂肪酸修饰。
步骤十三：脱除X17、X18、X20、X22、X23、X24或X25的Fmoc-Dap(ALLOC)-OH或Fmoc-Orn(ALLOC)-OH侧链氨基ALLOC保护基，具体操作为：用DCM洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd(PPh3)4，反应120分钟，抽干，DMF洗涤1次，甲醇洗涤1次，再用DMF洗涤2次，茚三酮检测为无色。
步骤十四：步骤十三得到的肽粗品溶解在DCM中，用50℃温水反复抽提DCM相，DCM相经Sephadex G-25层析(1*60cm，第1洗脱峰)纯化，收集有效峰，加入5倍量摩尔的乙二酸，反应10小时，形成如下二聚体：
步骤十五：含GLP-1序列H型肽合成：按照如下序列，用AM树脂合成第一条链单体长链：
(N端)H-X8-EGTFTSDV-X17-X18-Y19-X20-E21-X22-X23-X24-X25-X26-EFIAWLV-X34-GR-X37(C端)；
步骤十六：继续共价延长上述步骤十五得到的肽链：实施步骤八～十一，将含有X26侧链氨基的保护基Dde水解，与γGlu结合，再加入脂肪酸，形成脂肪酸修饰侧链；
步骤十七：将含有双氨基的X17、X18、X20、X22、X23、X24或X25之一的侧链氨基保护基ALLOC水解，其侧链氨基与X38 Boc-Cys(phacm)-OH或Boc-Thr(phacm)-OH、Boc-HCY(phacm)-OH的ɑ-羧基反应，以X38的ɑ-氨基做反应基团依次延长第二条链的如下S17→H氨基酸序列，完成如下“J”型结构(该J型结构长链C端仍在树脂上)：
步骤十八：在新的2-氯树脂上合成序列(N端)S18-Y19-L20-E21-G22-Q23-A24-A25-X26-EFIAWLV-X34-X35-R-X37-OH(C端)，从树脂上裂解该多肽。在活性基团全保护状态下，收集多肽与5倍摩尔的甘氨酰胺混合，在二氯甲烷反应24小时，用分液漏斗反复洗涤分离DCM相溶液3次，收集DCM相溶液为短肽S19-X37-NH2；
步骤十九：将步骤十八中获得的短肽序列加入20％(V/V)哌啶-DMF溶液，脱去N端的Fmoc保护基，暴漏N端氨基。肽反应液经过G25脱盐，收集多肽峰，冻干。将多肽溶解在DCM溶液，与步骤十七中的“J”型结构序列进行固相反应6小时，与第二条链的S17ɑ羧基反应，将步骤十七多肽的J结构右侧结合，完成第二条链的第18-37氨基酸序列，序列如下：
步骤二十：最后合成的多肽-树脂，加入15mL的95％的裂解液室温反应2h，侧链保护基完全水解，乙醚沉降，离心，得粗品，质谱鉴定；
步骤二十一：上述肽粗品溶解在水中，用50度温水反复抽提水相，水相经SephadexG-25(层析柱1*60cm，0.02M的PB洗脱液pH 8，第1洗脱峰为有效峰)和SP-Sepharose层析柱【层析柱3*10cm，含有不同浓度氯化钠的0.02M的PB溶液为洗脱液(氯化钠-PB液)】，在氯化钠浓度为0.22M的氯化钠-PB液600毫升分段洗脱，其洗脱峰为有效峰)纯化，收集有效峰。
二、用HPLC或常压层析纯化
取上述制备的肽单体粗品放入器皿中。用2-5mL的50％的乙腈水溶液溶清，配成1微克/微升，可以稍微超声2min，用0.45μm膜过滤溶解液。
样品分析：上述制备的肽样品上样10μL，用分析级HPLC分析。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％，结束比例水5％，乙腈95％。
二/四聚体样品鉴定：将二或四聚体样品在没有巯基乙醇情况下，进行肽SDS-PAGE电泳测定分子量和纯度。
最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。
三、GLP-1类似肽二聚体或四聚体的制备：将上述含硫的单体/二聚体肽，配置浓度为1mg/mL，在pH＝9.5磷酸氢二钠水溶液中，37℃保温过夜，形成同源二/四聚体肽。保温液每分钟4000转离心20分钟，沉淀为纯二/四聚体肽。其上清液通过Sephadex G-25层析分离(在1×60cm G-25层析柱和自然流速下，用NaCl-PB溶液为流动项，二/四聚体组份通常为第1峰)。将沉淀和柱层析分离获得有效组份混合，用NaCl-PB溶液做最大溶解，注射实验动物。四聚体肽可以通过无巯基还原剂的肽-SDS-PAGE电泳加以鉴定，具体方法参见中国专利ZL201410612382.3。按照上述方法合成的GLP-1类似肽参见表1。
实施例2GLP-1类似肽单体、二聚体或四聚体人血浆中稳定性:
测试过程：GLP-1ELISA试剂盒【GLP-1ELISA Kit High Sensitive(Code No.299-75501】，GLP1试剂盒对检测整个GLP-1聚合体更为敏感。3μg GLP-1类似肽单体、GLP-1类似肽二聚体和GLP-1类似肽四聚体在1.7mL正常人新鲜血浆(购自广东省武警医院血液科)中37±0.5℃孵育0、5、10、14、16、18、20、22、24、26、28、30、31、32、33、34、35、36、37天。在每个保温时间点，分别取样50μL的肽-血浆混合溶液放在-80℃保存。在保温结束后，全部样品一起进行GLP-1ELISA测量。本实验在每个孵育点设计空白血浆对照和复孔试验。以波长为450nm的读数数据为y轴，GLP-1标准浓度为x轴，根据方程y＝ax+b计算最终肽量。通过与肽-血浆混合物和空白血浆的0天数据进行比较，得到了单体和聚合体活性的持续稳定性天数。结果显示，H型肽单/双/四链维持7/21/35天血浆稳定性(如表1所示)；
实施例3:GLP-1类似肽峰效应:
GLP-1类似肽峰效应：所述GLP-1类似肽单体、二聚体和四聚体对Ⅱ型糖尿病小鼠进行治疗实验，记录降糖峰值的时间(如表1所示)，由表1可知，阳性对照思美格鲁肽的降糖峰值在给药后第一周第三天，实施例4～19所述GLP-1类似肽二聚体的降糖峰值在给药后第五周，实施例20～27所述GLP-1类似肽四聚体的降糖峰值在给药后第十周，表明本申请所述H型聚合体(GLP-1类似肽二聚体和四聚体)较思美格鲁肽有更强的稳定性：
表1GLP-1类似肽单体、二聚体和四聚体的肽序列以及高糖模型治疗产生降糖效应时间和血浆稳定性
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注：CFA(carbon fatty acid)为碳脂肪酸，CFDA(carbon fatty diacid)为碳脂肪二酸；所述K[N-ε-(γ-Glu-N-α-CFA或CFDA)]、K[N-ε-(2×AEEA)-γ-Glu-N-α-CFDA)]表示赖氨酸K侧链ε-氨基的脂肪酰或脂肪二酸谷氨酰修饰，具体结构如式1或2所示。“-S-S-”表示二硫键。鸟氨酸Orn、赖氨酸K和二氨基丙酸Dap是二氨基氨基酸，O＝C-C＝O为丙二酰化，其它单字母为氨基酸缩写。AIB为ɑ或β-氨基异丁酸，AEEAC与AEEA相同。
实施例4:GLP-1类似肽单/二/四聚体在II糖尿病、老年痴呆症、肥胖症和脂肪肝治疗效应：
一.实验动物的饲养和繁殖：APP/PS1转基因小鼠和其基因阴性对照鼠C57BL/6，小鼠由常州卡文斯实验动物有限公司【SCXK(苏)2016-0010】提供，实施老年痴呆症实验。转基因鼠在广东省武警医院动物房饲养和繁殖。繁殖过程：将青春期8周龄APP/PS1转基因雄鼠和其阴性对照C57雌鼠1：1同笼交配2周，雌鼠被分别喂养2周，待鼠宝宝出生。仔鼠与母鼠同笼两周，分笼饲养。实验中所有鼠都是在该动物房里饲养和繁殖的，转基因小鼠按照厂家提供的方式，进行PCR技术鉴定基因鼠。转基因小鼠按照实验动物护理和使用指南进行造模和治疗。实验动物在恒温(25℃)的14小时光照/10小时黑暗下饲养，自由提供饲料。
二.剂量设计：APP/PSI转基因鼠或糖尿病小鼠与60kg成年人的临床剂量转换率为12.33：1。思美格鲁肽(Semaglutide)剂量：3毫升思美格鲁肽溶液笔含有4毫克思美格鲁肽(分子量4113.58D，瑞典生产，批号202302BGE1)，其临床剂量为每周皮下注射0.25mg/60kg人，每只小鼠以20克计算，计算每只小鼠需要1.0275微克剂量(相当于0.25nmol)。二聚体和四聚体肽：2G21(分子量8256.18D)和4G18(分子量15461.82D)。分别设置低中高剂量组0.083、0.25、0.749nmol。其治疗每只鼠每1周1次皮下注射二聚体或四聚体肽。
三.建模和实验:从II型糖尿病、老年痴呆症模型，肥胖症和脂肪肝效应四方面进行。
1.II型糖尿病：将雄性C57Bl6/J小鼠【购自广东省实验动物中心，SCXK(粤)2018-0010】放置于标准饮食的SPF级别环境中，自由饮水。所有的实验操作按照实验动物伦理与使用制度指导原则。按照标准饮食饲养天后，将5周龄的C57B16/J雄性小鼠分为12组：NaCl-PB组、Model Control组(模型对照组)、思美格鲁肽组、二聚体2G21低中高剂量组(2G21-L/M/H)和四聚体4G18低中高剂量组(4G18-L/M/H)。NaCl-PB组为空白对照和Model Control组为T2D模型对照，它们注射NaCl-PB溶液。所有T2D模型组喂60kcal％的高脂饮食(D12492,常州鼠一鼠二生物技术有限公司，常州，中国)，直到实验结束，空白对照组保持标准饮食直到实验结束。II型糖尿病模型的建立方法：高脂喂养小鼠4周后，腹腔注射75mg/kg链脲佐菌素(STZ，美国西格玛化学公司)，3和6天后分别再次用50mg/kg剂量的STZ重新腹腔注射两次。在最后注射STZ后3周，血糖等于或大于11mM的小鼠视为糖尿病小鼠(T2D模型)。这些糖尿病组在高脂饮食的基础上，进行10周的治疗研究。
0.25nmol/200μL的思美格鲁肽可诱导T2D糖尿病模型(餐后血糖PPG达20mM)的饥饿血糖值(FPG)有明显降低，阳性药思美格鲁肽和GLP-1二/四聚体的效应-剂量关系很容易被观察到。在T2D治疗研究中，在30min内，按每只200μL剂量臀部皮下注射T2D模型鼠，每7天测量实验鼠血糖值，整个测试在40min内完成。
1.1.T2D治疗后的体重(如图1所示)和肝脏重量(如图2所示)变化：给药前，T2D模型组体重无显著性差异。实验结束后，与NaCl-PB组或思美格鲁肽组比较，二聚体2G21低中高剂量组(2G21-L/M/H)和四聚体4G18低中高剂量组(4G18-L/M/H)有不同程度体重降低。以思美格鲁肽组体重改变为0做标准，2G21-L/M/H和4G18-L/M/H有0.7/-4.3/-1％和-2.6/-1.9/-2.8％程度的降低(负值表示降低)；与Model Control组比较，2G21-M/H和4G18-L/M/H组有不同程度显著性肝重降低(P<0.05或0.01、0.001)。显示，二或四聚体具有显著降低体重和保护肝脏现象；
1.2.T2D治疗中的降血糖作用：给药前，与NaCl-PB组比较，各模型组的饥饿血糖(FPG)有显著性差异(P<0.001)，模型组之间的FPG无显著性差异(P>0.001)。给药后整个治疗周期内，与NaCl-PB组比较，Model Control、思美格鲁肽，2G21-L/M/H或4G18-L/M/H各组的饥饿血糖(FPG)有显著性增加(P<0.001或0.01、0.05)(如图3所示)。
在治疗实验的第一周，与Model Control、思美格鲁肽、2G21-H或4G18-L/M/H组比较，2G21-M组出现显著性血糖降低(P<0.01)。在第二周，与Model Control、思美格鲁肽、2G21-H或4G18-L/M/H组比较，2G21-M组出现显著性血糖降低(P<0.01)。与2G21-L比较，4G18-M显示显著性血糖增加(P<0.05)。在第三周，与2G21-H比较，4G18-L组的FPG显著性增加，或4G18-M显著性降低(P<0.05)。与Model Control组比较，4G18-H组出现显著性血糖降低(P<0.05)。在第四周，与Model Control或思美格鲁肽组比较，2G21-H组的FPG显著性降低，或者与Model Control或思美格鲁肽、2G21-L组比较，2G21-M的FPG显著性增加或降低(P<0.001或0.01、0.05)。与2G21-M/H比较，4G18-L/M/H组的FPG显示显著性增加(P<0.001或0.01、0.05)。在第五周，与Model Control比较，2G21-H、4G18-L/H组的FPG显著性降低(P<0.05或0.01)。与2G21-M/H组比较,4G18-M组的FPG显示显著性增加(P<0.05)。在第六周，与Model Control比较，思美格鲁肽、2G21-L/M/H组的FPG显著性降低(P<0.05或0.001)。与思美格鲁肽和/或2G21-H组比较，4G18-L/M/H组的FPG显示显著性降低或增加(P<0.05)。与2G21-L组比较，2G21-H组的FPG显示显著性降低(P<0.05)。在第八周，2G21-L/M的FPG显著低于Model Control，思美格鲁肽或2G21-L组(P<0.05或0.01)。2G21-M组的FPG显著低于ModelControl和2G21-L组(P<0.05)。在第十周，2G21-M/H的FPG显著低于Model Control或思美格鲁肽、2G21-L组(P<0.05)。4G18-L/M/H的FPG显著低于Model Control或思美格鲁肽、2G21-L、G21-M组(P<0.05或0.01、0.001)。结果显示，单体峰效应在第一周，二聚体降糖峰效应在第五周，四聚体在第十周；
1.3.T2D治疗中的糖化血红蛋白改变：给药后第十周，与NaCl-PB组比较，各模型组的糖化血红蛋白(HbAlc)显著性增加(P<0.001)。2G21和4G18各组HbAlc水平随剂量降低。与Model Control组比较，思美格鲁肽、2G21-M/H或4G18-L/M/H各组的HbAlc有显著性降低(P<0.001或0.01、0.05)。与2G21-L组比较，2G21-H或4G18-L/M/H组的HbAlc有显著性降低(P<0.001或0.01、0.05)。以思美格鲁肽HbAlc为标准，2G21-L/M/H或4G18-L/M/H组的HbAlc分别改变7.1/-3.8/-8.8％或-4.5/-11.4/-15.0％(如图4所示)；
1.4.T2D治疗中的胰岛素改变：与NaCl-PB组比较，Model Control、思美格鲁肽、2G21-L/M组的血胰岛素(insulin)显著性降低(P<0.05)。2G21和4G18各组血胰岛素水平随剂量增加，与Model Control、思美格鲁肽、2G21-L组比较，4G18-H组血胰岛素水平显著性升高(P<0.001或0.05)。以思美格鲁肽血胰岛素为标准，2G21-L/M/H或4G18-L/M/H组的胰岛素分别改变-14/5/30％或32/23/76％(如图5所示)；
1.5.血液生化指标检测：在T2D治疗实验后，CHE(cholinesterase，血清胆碱酯酶)如图6所示:与NaCl-PB组比较，Model Control、思美格鲁肽、2G21-L/M/H组的胆碱酯酶显著性增加(P<0.05或0.001)。与Model Control、思美格鲁肽、2G21-L/M/H或4G18-L/H组比较，4G18-M组的胆碱酯酶显著性降低(P<0.05或0.01、0.001)；ALT(谷丙转氨酶)水平变化如图7所示：与NaCl-PB组比较，所有模型组的ALT显著性增加(P<0.05或0.01、0.001)，2G21-L显著高于思美格鲁肽(P<0.05)，4G18-L/M/H组ALT有所降低，但没有统计学差异；TG(甘油三酯)水平变化如图8所示:如图8可知，与NaCl-PB组比较，思美格鲁肽没有显示显著性差异，2G21-L/H或4G18-L/M/H组的TG显著性降低(P<0.05或0.01、0.001)。4G18-H组显著低于思美格鲁肽或2G21-H组(P<0.05或0.01)；AST(谷草转移酶)水平变化如图9所示，4G18-L/M/H组的AST出现剂量依赖性降低；HDL(高密度脂蛋白)水平变化如图10所示：4G18-L/H组的HDL显著性低于思美格鲁肽或2G21-M组；AMY(淀粉酶)水平变化如图11所示，与NaCl-PB组比较，2G21-L/H或4G18-L/M/H组的血淀粉酶显著性降低(P<0.05或0.01、0.001)，4G18-H组的淀粉酶显著性低于思美格鲁肽或2G21-H组；
由上可知，GLP-1类似肽四聚体较GLP-1类似肽二聚体具有持续时间最长和效果更好的降血糖效应，所述GLP-1类似肽四聚体对减轻体重、降低甘油三酯、胆固醇和胆碱酯酶，保护肝和胰腺器官，产生更多胰岛素；
2.脂肪肝治疗：上述糖尿病模型经过思美格鲁肽、2G21或4G18治疗后，GLP-1类似肽二聚体和GLP-1类似肽四聚体较思美格鲁肽产生更大降低体重、降低肝脏重量、降低TG和胆固醇、肝心胰器官保护。GLP-1类似肽四聚体效果又优于二聚体，所以对高脂肥胖引起脂肪肝有显著治疗效果；
3.老年痴呆症治疗：对认知障碍和神经降解性紊乱有效，如老年痴呆症，帕金森综合征，肌萎缩侧索硬化，周围神经病变，亨廷顿综合征，克雅氏病等：
3.1.APP/PSI转基因模型与实验：将80只转基因鼠(4周龄)按体重无统计学差异随机分为8组(NaCl-PB组和7个模型组)(n＝10)。NaCl-PB组为正常对照，注射NaCl-PB溶液。每只模型鼠背部皮下注射0.09、0.25、0.81nmol剂量的2G21(L/M/H)组，4G18-M组为0.25nmol剂量，每7天注射一次。阳性药思美格鲁肽(Semagl utide)组注射1.03μg/20g(0.25nmol/20g)剂量做阳性对照，所有动物注射体积350微升。12周后，实验结束，分别取出动物大脑皮质和海马，用H-E、TUNEL、Ki67、GHSR、GFAP、Aβ、TAU和SYN荧光染色。肝脏、卵巢、脾脏、心脏和肺称重。血GH和生化分析等方法评价大脑功能变化。每组荧光染色三个动物组织，每张切片荧光拍照5-40张，用IPP软件计数荧光强度。
3.2.小鼠Morris水迷宫测试：APP/PS1转基因小鼠在12周给药后进行Morris水迷宫实验训练，小鼠训练7天，从圆形水迷宫不同方向起点逃避水面游泳达到终点楼梯，水迷宫自动记录小鼠进入各盲端的错误次数与到达终点时间(潜伏期)，取平均错误次数和平均潜伏期值，实验数据为平均数±标准差(Mean±SD)，t检验统计分析，测试结果如图12所示。由图12可知，逃避潜伏期随着训练天数的延长均有不同程度的下降。第一天，一个象限释放小鼠入水，各组间没有显著性。第二天，四个象限分别释放小鼠，思美格鲁肽组较ModelControL组潜伏期显著性缩短(P<0.05)。第3天，与NaCl-PB对照比较，思美格鲁肽、2G21或4G18组的转基因小鼠平均潜伏期显著性变长(P<0.05或0.01、0.001)。4G18-H组较ModelControL组小鼠潜伏期显著性变长(P<0.05)。第4天，与NaCl-PB对照比较，Model ControL、2G21-L/M/H或4G18-L组小鼠平均潜伏期显著性变长(P<0.05或0.001)，而思美格鲁肽组或4G18-M/H组没有显著性；在第5天，与NaCl-PB对照比较，Model ControL、2G21-L/M/H或4G18-L组小鼠平均潜伏期显著性变长(P<0.05或0.01、0.001)，而4G18-M/H组小鼠平均潜伏期没有显著性。与Model ControL组比较，4G18-M/H组小鼠平均潜伏期显著性缩短(P<0.05)。在第6天，与NaCl-PB对照比较，Model ControL或2G21-L组小鼠平均潜伏期显著性变长(P<0.05或0.001)，而思美格鲁肽、2G21-M/H或4G18-L/M/H组小鼠平均潜伏期没有显著性。与Model ControL组比较，2G21-M/H组或4G18-M/H组小鼠平均潜伏期显著性缩短(P<0.05)。第七天，小鼠穿过平台次数没有显著性差异；
3.3.血胰岛素测定：12周给药取血测定空腹胰岛素水平，测试结果如图13所示，由图13可知，与NaCl-PB对照组比较，Model ControL、思美格鲁肽或2G21-L/M组空腹胰岛素小鼠水平显著性降低(P<0.05)。与Model ControL、思美格鲁肽或2G21-L/M组比较，2G21-H，4G18-L/M/H组逐渐升高，但仅4G18-H组空腹胰岛素水平显著性升高(P<0.05或0.01)。由此可见，GLP1共价聚合体随聚合度增加，内源性胰岛素分泌呈现增加，在相同摩尔浓度给药下，聚合度增加与胰岛素分泌呈正比；
3.4.血糖：APP/PS1转基因小鼠是老年痴呆症小鼠，其血糖在正常范围。在12周给药后，内眦取血测定血糖，测试结果如图14所示，由图14可知，除了4G18-H组血糖较2G21-M组显著性降低外，其他组间没有显著性差异，这显示思美格鲁肽、2G21或4G18对正常血糖动物没有调控作用；
3.5.海马和皮质TAU：Tau蛋白是微管相关蛋白，正常成熟脑中Tau蛋白分子含2-3个磷酸基，而阿尔茨海默症患者脑Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5-9个磷酸基，并丧失正常生物功能。Tau蛋白的异常积累才是阿尔茨海默氏症(AD)患者认知衰退和记忆丧失的真正源头。海马Tau信号分析结果如图15所示，由图15可知，与NaCl-PB组比较，模型对照组或思美格鲁肽组海马Tau显著性增加，或2G21-H、4G18-H组海马Tau指标显著性降低(P<0.001)。与模型对照组比较，思美格鲁肽、2G21-L/M/H、4G18-M/H组显著性降低(P<0.05或0.001)。与思美格鲁肽组比较，2G21-L/M/H或4G18-M/H组呈剂量依赖性显著性降低(P<0.01或0.001)。与2G21-H组比较，4G18-L/M组显著性增加(P<0.01或0.001)；
皮质Tau信号分析结果如图16所示，由图16可知，与NaCl-PB组比较，模型对照或4G18-L组皮质Tau显著性增加(P<0.01或0.001)。与模型对照组比较，4G18-M/H组的皮质Tau显著性降低P<0.05或0.01)；
3.6.海马和皮质GFAP：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是检测和跟踪反应性星形胶质细胞病变和AD病理的敏感生物标志物。海马GFAP信号分析结果如图17所示，由图17可知，与NaCl-PB组比较，模型对照组的海马GFAP显著性增加，或2G21-H、4G18-H组海马GFAP指标显著性降低(P<0.001)。与模型对照组比较，2G21和4G18各组的海马GFAP呈剂量依赖性显著降低(P<0.01或0.001)。与2G21-H组比较，4G18-L/M/H组的海马GFAP呈剂量依赖性显著降低(P<0.05或0.001)；
皮质GFAP信号分析结果如图18所示，由图18可知，与NaCl-PB组比较，模型对照或2G21-L组皮质GFAP显著性增加(P<0.001)。与模型对照组比较，思美格鲁肽、2G21-M/H或4G18-L/M/H组皮质GFAP显著性降低(P<0.05或0.01)；
3.7.海马和皮质Aβ:淀粉样前体蛋白-APP集中在神经元突触。APP可以被α-，β-，γ-蛋白酶分解，β-蛋白酶和γ-蛋白酶连续作用可使APP被分解产生Aβ。Aβ1-42具有更强毒性，容易聚集，形成Aβ沉淀的核心。海马Aβ信号分析如图19所示，由图19可知，与NaCl-PB组比较，模型对照组、2G21-L组的海马Aβ显著性增加(P<0.05)。与模型对照组比较，2G21-M/H或4G18-L/M/H组的海马Aβ呈剂量依赖性显著降低(P<0.05或0.01、0.001)。2G21-H或4G18-M/H组的海马Aβ显著低于2G21-L(P<0.01或0.001)；
皮质Aβ信号分析如图20所示，由图20可知，与NaCl-PB组比较，模型对照组或4G18-L/M/H组的皮质Aβ显著性增加(P<0.05或0.01、0.001)。与模型对照组、思美格鲁肽或2G21-L组比较，2G21-M/H或4G18-M/H呈剂量依赖性降低(P<0.01或0.001)。4G18-L组皮质Aβ显著高于4G18-M/H组，或者低于模型对照组(P<0.05或0.01)；
3.8.海马和皮质SYN：突触素SYN是一种突触前标志物，通常用于检测突触的密度和分布。突触素丢失是AD的早期事件，被认为是突触改变的标志物，突触可塑性被认为是大脑学习和记忆能力的基础。海马SYN信号分析如图21所示，由图21可知，与NaCl-PB组相比，模型组的海马SYN显著性降低(P＜0.001)，与模型对照组比较，2G21-L/M/H或4G18-H组的海马SYN显著增加(P＜0.05或0.01、0.001)，4G18-L/M/H组的海马SYN呈剂量依赖性增加；
皮质SYN信号分析如图22所示，由图22可知，与NaCl-PB组比较，模型对照(ModelControl)、2G21或4G18各组的皮质SYN显著性降低(P<0.001)。与模型对照组比较，思美格鲁肽、2G21-L/M/H或4G18-M/H组显著性增加皮质SYN(P<0.05或0.001)。与思美格鲁肽比较，2G21-L/M/H或4G18-L/M组皮质SYN显著性降低(P<0.05或0.01、0.001)。2G21-L/M/H或4G18-L/M/H组皮质SYN呈剂量依赖性显著性增加(P<0.05或0.001、0.001)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种GLP-1类似肽二聚体，其特征在于，原料包括第一链GLP-1类似肽单体和第二链GLP-1类似肽单体；
所述第一链GLP-1类似肽单体和第二链GLP-1类似肽单体独立地为：(N端)H-X8-EGTFTSDV-X17-X18-Y19-X20-E21-X22-X23-X24-X25-X26-EFIAWLV-X34-GR-X37(C端)；
所述C端为酰胺基结构或羧基结构；
所述X8、X17、X18、X20、X22、X23、X24、X25、X26、X34和X37均为氨基酸，下角标数据为氨基酸残基的排列顺序；
X8为L-ɑ-丙氨酸、β-丙氨酸、α-氨基异丁酸或β-氨基异丁酸；
所述X17、X18、X20、X22、X23、X24或X25为双氨基-氨基酸；
X26为赖氨酸、侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸、侧链ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸或其他双氨基-氨基酸；
X34为精氨酸或赖氨酸；
X37为Gly-OH、Gly-NH2、NH2或OH。
2.如权利要求1所述的GLP-1类似肽二聚体，其特征在于，所述GLP-1类似肽二聚体的原料还包括连接剂；
所述连接剂为含巯基的氨基酸或乙二酸；
所述第一链GLP-1类似肽单体中的X17、X18、Y19、X20、E21、X22、X23、X24或X25中任一氨基酸残基通过所述连接剂与第二链GLP-1类似肽单体中X17、X18、Y19、X20、E21、X22、X23、X24或X25中任一氨基酸残基连接。
3.如权利要求1所述的GLP-1类似肽二聚体，其特征在于，所述双氨基-氨基酸为二氨基丙氨酸Dap、鸟氨酸Orn或赖氨酸K。
4.如权利要求1所述的GLP-1类似肽二聚体，其特征在于，当所述X26为双氨基-氨基酸侧链氨基上烷基酸修饰时，如ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸，所述烷基酸修饰为[2×AEEAC-γ-Glu(N-α-脂肪二酸)]修饰，所述X26的结构式如式1所示：
所述式1中，n＝16～18。
5.如权利要求1所述的GLP-1类似肽二聚体，其特征在于，当所述X26为双氨基-氨基酸侧链氨基上烷基酸修饰时，如ε氨基上烷基酸修饰的赖氨酸，所述烷基酸修饰为[γ-Glu(N-α-脂肪酸)]修饰，所述X26的结构式如式2所示：
所述式2中，n＝16～18。
6.如权利要求2所述的GLP-1类似肽二聚体，其特征在于，所述含巯基的氨基酸为半胱氨酸C、苏氨酸T或同型半胱氨酸HCY。
7.一种GLP-1类似肽四聚体，其特征在于，所述GLP-1类似肽四聚体由第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体通过二硫键连接得到；
所述第一GLP-1类似肽二聚体和第二GLP-1类似肽二聚体独立地为权利要求1～6任一项所述的GLP-1类似肽二聚体。
8.权利要求1～6任一项所述GLP-1类似肽二聚体或权利要求7所述的GLP-1类似肽四聚体在制备预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物中的应用。
9.一种预防和/或治疗治疗II型糖尿病、肥胖症、老年痴呆症或脂肪肝药物，其特征在于，活性成分包括权利要求1～6任一项所述GLP-1类似肽二聚体或权利要求7所述的GLP-1类似肽四聚体及其在药学上可接受的盐。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100048468A1 (en) * 2006-04-20 2010-02-25 Amgen Inc. Glp-1 compounds
AU2012203915A1 (en) * 2006-04-20 2012-07-26 Amgen Inc. GLP-1 compounds
CN103087174A (zh) * 2011-11-03 2013-05-08 华东师范大学 一种glp-1衍生物dlg3312及其固相化学合成方法
CN104945500A (zh) * 2008-06-17 2015-09-30 印第安纳大学研究及科技有限公司 基于gip的混合激动剂用于治疗代谢紊乱和肥胖症
CN110845601A (zh) * 2019-10-12 2020-02-28 广东药科大学 不同构型的glp-1类似肽修饰二聚体及其制备方法在治疗ii型糖尿病中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100048468A1 (en) * 2006-04-20 2010-02-25 Amgen Inc. Glp-1 compounds
AU2012203915A1 (en) * 2006-04-20 2012-07-26 Amgen Inc. GLP-1 compounds
CN104945500A (zh) * 2008-06-17 2015-09-30 印第安纳大学研究及科技有限公司 基于gip的混合激动剂用于治疗代谢紊乱和肥胖症
CN103087174A (zh) * 2011-11-03 2013-05-08 华东师范大学 一种glp-1衍生物dlg3312及其固相化学合成方法
CN110845601A (zh) * 2019-10-12 2020-02-28 广东药科大学 不同构型的glp-1类似肽修饰二聚体及其制备方法在治疗ii型糖尿病中的应用
CN112898406A (zh) * 2019-10-12 2021-06-04 南京枫璟生物医药科技有限公司 不同构型的glp-1类似肽修饰二聚体及其制备方法在治疗ii型糖尿病中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YINGYING PAN ET AL.: ""A novel GLP-1 analog, a dimer of GLP-1 via covalent linkage by a lysine, prolongs the action of GLP-1 in the treatment of type 2 diabetes"", 《PEPTIDES》, vol. 88, 10 December 2016 (2016-12-10), pages 46 - 54, XP029893886, DOI: 10.1016/j.peptides.2016.11.009 *
夏文静等: ""胰高血糖素样肽 －1 结构改造的专利技术综述"", 《安徽农业科学》, vol. 43, no. 20, 31 December 2015 (2015-12-31), pages 12 - 15 *

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