CN105254720B - 一种多受体激动剂po13及应用 - Google Patents

一种多受体激动剂po13及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多受体激动剂PO13及应用。序列为His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr。本发明的多肽是OXM与PACAP的N端具有高度同源性的13个氨基酸，同时激活OXM与PACAP的受体，同时具备OXM与PACAP生物学活性，因此具有一石多鸟的作用；能同时用于治疗肥胖、糖尿病等的能量代谢失调疾病，兼并阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病及（或）抑郁症及（或）学习记忆功能衰退等疾病。13个氨基酸组成的PO13短肽采用化学合成，成本低廉；而且序列完全来自体内多肽，几乎不产生免疫反应；因此适用于长期大量的使用。

Description

一种多受体激动剂PO13及应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体地说，涉及一种多受体激动剂PO13及应用。
背景技术
胃泌酸调节肽（oxyntomodulin，OXM）是由胰高血糖素原基因在肠道L细胞和中枢神经元内转录加工后得到的37个氨基酸组成的脑肠肽。OXM通过同时激活胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体和胰高血糖素受体（glucagon receptor，GCGR）发挥显著抑制食欲，减少能量摄入，增加能量消耗，促进胰岛素释放及远期β细胞保护的功能。其中GLP-1R介导的有效降低血糖和保护胰岛β细胞的功能，是目前糖尿病药物开发的重要靶点。
垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide，PACAP）是由垂体分泌的、或目的组织自分泌和旁分泌的、具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/血管活性肠肽（vasoactive intestinalpeptide）家族中的新成员。PACAP的具有3个B类G蛋白偶联受体：PAC1-R是PACAP的特异受体；VPAC1-R和VPAC2-R是PACAP和VIP的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能。PACAP具有显著的抗细胞凋亡，调节细胞增殖分化；神经保护和促进神经修复；调节血管功能；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动调节能量代谢平衡；调节内分泌平衡；促进觉醒，帮助提升学习和记忆能力；等的作用。目前已有研究显示PACAP是预防与治疗神经退行性疾病的潜在药物，如阿尔兹海默症病人中脑部的PACAP显著下调，提示补充PACAP及其相关多肽可有效预防与治疗阿尔兹海默症。
发明内容
本发明的目的是在生物信息学分析的基础上，构建同时具备OXM和PACAP活性的短肽，或者说既能增强OXM活性，又能增强PACAP活性的短肽；本发明首次化学合成OXM与PACAP高度同源的N端13个氨基酸的多受体激动剂PO13，
其氨基酸序列如SEQ NO.1所示；并且首次尝试检测其体内生物学功能。
SEQ NO.1：His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr。
我们通过生物信息学分析方法，将OXM与PACAP进行比对后发现：它们的N端13个氨基酸高度同源，如图1所示，提示13个氨基酸可能承载OXM与PACAP共同的作用。并且作为内源性的多肽类激素，OXM和PACAP均容易受到体内二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase -4，DPP-4）的对多肽N端的水解，造成活性减退和丧失，甚至形成自身的抑制剂；因此体内额外补充OXM和PACAP的N端高同源性的13氨基酸组成的短肽，可能有效稀释DPP-4对OXM和PACAP的降解作用，从而同时增强OXM和PACAP的相关活性。
研究发现PO13具有：同时有效激活OXM受体（GLP-1R和GCGR）和PACAP的相关受体（VPAC1/2和PACAP），是一个多向受体的激动剂；同时具备OXM和PACAP的生物学功能；显著抑制摄食，降低体重，提高机体糖耐受，具有治疗肥胖、糖尿病等能量代谢失调疾病的潜能；并且显著抑制东莨菪碱诱导的学习记忆损伤，降低脑部氧化损伤，提高脑部神经递质活性，提高觉醒，促进学习记忆；而且有效抵抗抑郁产生；能够同时抵抗谷氨酸钠造成的摄食障碍、肥胖、神经损伤与抑郁；具有治疗神经退行性疾病及抑郁症的潜能；因此PO13具备同时治疗能量代谢失调如肥胖、糖尿病合并神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症；及（或）抑郁症及（或）学习记忆功能衰退等疾病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的多肽是OXM与PACAP的N端具有高度同源性的13个氨基酸，同时激活OXM与PACAP的受体，同时具备OXM与PACAP生物学活性，因此具有一石多鸟的作用；能同时用于治疗肥胖、糖尿病等的能量代谢失调疾病，兼并阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病及（或）抑郁症及（或）学习记忆功能衰退等疾病。13个氨基酸组成的PO13短肽采用化学合成，成本低廉；而且序列完全来自体内多肽，几乎不产生免疫反应；因此适用于长期大量的使用。
附图说明
图1 为PO13序列的设计思路；
图2为化学合成PO13的质谱图（A）和高效液相纯度分析图（B） ；
图3为PO13的受体选择性鉴定, （A）PO13有效竞争[125I]OXM对GLP-1R和GCGR的结合，（B）PO13有效激活PAC1R、VPAC1R和VPAC2R；
图4为PO13抑制摄食（A）、减低体重（B）；
图5为PO13有效提高糖耐受，减低血糖指数；
图6为PO13保护脑部抗氧化（A）、提高脑部神经递质活性（B）；
图7为PO13抑制东莨菪碱诱导的学习记忆损伤（A）并且缩短悬尾绝望模型的不动时间（B）；
图8 为PO13抑制谷氨酸钠诱导的肥胖、神经损伤与抑郁：抑制体重增加（A）,减低脑部脂质过氧化物水平（B），缩短被迫游泳的静止时间（C）及延长避暗实验的潜伏期（D）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1：PO13的化学合成与鉴定
PO13的序列为： HSQGTFTSDYSKY，如SEQ NO.1所示；采用化学合成的方法制备，PO13序列的设计思路如图1。如图2A所示，质谱结果显示化学合成多肽分子量为1520.59，与理论值相符；HPLC结果显示纯度大于99%（图2B）。
实施例2： PO13是多向激动剂
受体竞争性结合实验结果表明：如图3A所示，PO13竞争125I标记的OXM对GLP-1R的半有效浓度EC50为35.1±2.3nM，而对GCGR的EC50为23.1±1.9nM，因此PO13与OXM相同，既能激活GLP-1R又能激活GCGR。
如图3B所示，PO13均有效促进分别高表达PAC1、VPAC1和VPAC2的CHO细胞的增殖，而且活性与浓度呈正比，显示PO13能同时有效激活PACAP的3个受体。
综上所述，PO13能够有效激活OXM和PACAP的受体，是两者的有效替代物。
实施例3： PO13有效抑制摄食、降低体重
小鼠禁食过夜后，腹腔注射10nmol/kg PO13后给予食物，没隔1h测定消耗的食物量，共计6h，已注射生理盐水（saline）作为对照，结果如图4A显示，PO13显著抑制了小鼠摄食量（*，p<0.01, PO13 vs. saline）；小鼠连续腹腔注射PO13（10nmol/kg/d）14天后，测定小鼠的体重，结果如图4B所示，与注射生理盐水相比，PO13显著减轻了小鼠的体重（*，p<0.01, PO13 vs. saline）。
实施例4： PO13有效提高糖耐受，减低血糖指数
当PO13(10nmol/kg)与高浓度葡萄糖（5mg/kg）共同腹腔注射小鼠，收集注射前（0h）和注射后0.5-2h内每隔0.5h的血糖，血糖指数（如图5）显示，与生理盐水相比，PO13显著降低了血糖指数（*，p<0.01, PO13 vs. saline），提高机体处理高糖的能力。
实施例5： PO13降低脑部氧化水平，提高神经递质活性
小鼠连续腹腔注射PO13（10nmol/kg/d）14天后，对小鼠脑部的脂质过氧化物（MDA）的测定显示，PO13注射小鼠脑部氧化水平显著降低（图6A，*，p<0.01, PO13 vs. saline），并且分解神经递质的乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶浓度显著降低，提示脑部神经递质浓度提高（图6B，*，p<0.01, PO13 vs. saline）。
实施例6 ：PO13提高学习记忆能力和抵抗抑郁
小鼠连续腹腔注射PO13（10nmol/kg/d）14天后，东莨菪碱（Scop）（3mg/kg）注射小鼠，小鼠避暗实验测定小鼠潜伏期，发现如图6A所示，PO13有效提高延长小鼠避暗实验的潜伏期，抵抗东莨菪碱对学习记忆的损伤（图7A，*，p<0.01,PO13 vs. Scop）。进行悬尾绝望实验，发现在5min内PO13显著减少悬尾后的不动时间（图7B，*，p<0.01, PO13 vs. saline），显示PO13具有抑制抑郁的功能。
实施例7 ：PO13同时抑制肥胖与神经损伤及抵抗抑郁
高剂量谷氨酸钠不仅诱导肥胖，而且导致脑部神经损伤并造成抑郁，利用谷氨酸钠诱导的小鼠肥胖模型，发现PO13能够有效抑制谷氨酸钠造成的体重增加（图8A，*，p<0.01, Glu+PO13 vs. Glu）、降低大脑海马区的脂质过氧化物（MDA）的水平（图8B，*，p<0.01, Glu+PO13 vs. Glu），减少小鼠被迫游泳的抑郁实验的不动时间（图8C，*，p<0.01,Glu+PO13 vs. Glu），并且提高小鼠的避暗实验的认知测定的潜伏期（图8D，*，p<0.01, Glu+PO13 vs. Glu）；因此，证明PO13同时具备抑制摄食障碍、肥胖等代谢失调兼和抵抗神经损伤，提高认知与预防抑郁症的活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120> 一种多受体激动剂PO13及应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr
1 5 10

Claims (1)

1.多受体激动剂PO13在制备治疗肥胖、糖尿病、阿尔兹海默症、帕金森症、抑郁症或学习记忆功能衰退药物中的应用；所述多受体激动剂PO13的氨基酸序列如SEQ NO.1所示：
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr。
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KAHA Ligations That Form Aspartyl Aldehyde Residues as Synthetic Handles for Protein Modification and Purification;Claudia E.Murar等;《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》;20141204;第136卷;摘要、Scheme 1 *

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