CN106146667A - 一种Exendin-4融合蛋白及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明要解决的技术问题是延长Exendin-4多肽的半衰期及提高现有的含Exendin-4多肽的融合蛋白的稳定性及安全性的问题。本发明解决技术问题的方案是提供一种新的含Exendin-4多肽的融合蛋白。该融合蛋白的结构为：从氮端起依次含有Exendin-4、连接肽、Exendin-4、连接肽、IgG4Fc突变体。本发明提供的含Exendin-4的融合蛋白具有更好的稳定性和更长的半衰期，同时具有更低的毒副作用。本发明融合蛋白能用于I型、II型糖尿病以及肥胖症的治疗，具有很高的临床应用价值。

Description

一种Exendin-4融合蛋白及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及一种长效Exendin-4融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

糖尿病是一种慢性终身性疾病，目前认为是由遗传和后天生活习惯导致，已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。

临床以高血糖为主要标志，糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病。糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用缺陷导致血糖升高。1型糖尿病因胰岛β细胞的免疫性破坏造成胰岛素分泌缺乏，依赖外源性胰岛素补充；而2型糖尿病发病的重要机制为胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌胰岛素相对不足所致，胰岛β细胞量显著减少，残存的胰岛β细胞功能显著异常，因此，保护β细胞量和改善β细胞功能对2型糖尿病的治疗尤为关键。

目前2型糖尿病的治疗主要以口服降糖药为主，有磺脲类药物如格列本脲、格列齐特、格列吡嗪等、二甲双胍、α-糖苷酶抑制剂、胰岛素等。长期使用这些药物治疗会产生药物耐受，无法长期控制血糖和细胞功能的紊乱。因此，研发一种更加安全、有效的针对糖尿病发病机制的新型药物尤为重要。

早在上世纪60年代，麦金太尔(Mclntyre)和埃尔里克(Elrick)等人就发现口服葡萄糖对胰岛素分泌的促进作用明显高于静脉注射，这种额外效应被称为“肠促胰岛素效应”。此后研究进一步证实，这种效应所产生的胰岛素占进食后胰岛素总量的50％以上。正常人进餐后，肠促胰岛素分泌，进而引起胰岛素分泌以维持正常血糖水平。在1970年发现控制胰岛素分泌的激素——肠促胰岛素，肠促胰岛素是人体内一种肠源性激素，在进食后，该类激素可促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖依赖性降糖作用。肠促胰岛素主要包括葡萄糖依赖性促胰岛素激素(GIP)和胰高血糖素样-1(GLP-1)。小肠上端分泌的GIP和小肠下部分分泌的GLP-1都是控制胰岛素分泌的激素，它们通过影响血浆胰岛素水平来控制饭后血糖水平，其作用是由相应的特异性受体介导。小肠上端的GIP分泌到血液中的量较多，它促进胰岛素的分泌，但是患糖尿病后GIP作用减弱。小肠下端分泌的GLP-1较GIP具有更强的促胰岛素分泌的作用，特点是在进餐后马上分泌，增加胰岛素分泌及生物合成，降低胰高血糖素分泌，有效的减低血糖；能够减弱胃肠道蠕动，延缓胃排空速度，增加饱腹感，降低食欲和减少食物摄入减轻体重；直接降低血糖；降低三酰甘油、游离脂肪酸；降低血压；保护心血管等。GLP-1的分泌是血糖依赖性促胰岛素分泌，不会增加低血糖风险等GIP所不具有的生理作用，从而显示出GLP-1延缓糖尿病进展及减少糖尿病心血管并发症的潜力。

GLP-1具有保护β细胞的作用，GLP-1可作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌，并且还可以刺激胰岛β细胞的增值和分化，增加胰岛β细胞数量，抑制胰岛β细胞凋亡，改善胰岛素敏感性，增加葡萄糖的利用。此外，GLP-1还可以作用于α细胞，抑制α细胞分泌胰高血糖素的释放，从而抑制肝脏葡萄糖生成，调节营养素代谢和营养素清除。

GLP-1是胰高血糖素肽家族的成员，是由胰高血糖素原基因表达，位于17号染色体上,是一种肠促胰岛素，由37个氨基酸组成的肽链。GLP-1基因表达于胰腺α细胞、小肠神经内分泌L细胞和下丘脑。主要由回肠、结肠中的L细胞合成。GLP-1有两种形式：GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)酰胺，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)。

然而，天然的GLP-1在体内很快被二肽基肽酶4(DPP-4)降解，DPP-4切断自N端的Ala8-Glu9间位点，降解生成的片段GLP-1(9～36)是GLP-1受体拮抗剂，使得GLP-1与其受体的亲和力降至原来的1％，使GLP-1的半衰期仅1～2分钟左右，必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效，这大大限制了GLP-1的临床应用。

根据GLP-1和GLP-1受体在治疗糖尿病中的作用靶点，学者们研究开发了三类药物：(1)GLP-1类似物，让其既保有GLP-1的功效，又能抵抗降解；(2)GLP-1受体激动剂；(3)GLP-1降解酶抑制剂(DPP-4抑制剂)，使体内自身分泌的GLP-1不被降解。目前，这三方面的研究都已经取得了一定的进展。

Exendin-4是一种胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物，是从希腊毒蜥蜴唾液中分离的一种多肽激素，含39个氨基酸的多肽分子，其氨基酸序列与GLP-1有53％同源性。Exendin-4的二级结构主要分为三部分：(1)N端1～8位氨基酸残基形成一段不规则的卷曲。该区域高度保守，只有Gly²与GLP-1的Ala²不同，可拮抗DPP-4的降解作用，所以半衰期较GLP-1更长；(2)中间9～30位氨基酸残基构成规则的α螺旋，此区域相反电荷侧链的氨基酸在同一侧面上相互交替的排列，其α螺旋比GLP-1更稳定；(3)C端31～39位氨基酸残基是GLP-1所没有的序列，这几位氨基酸残基折回到α螺旋上，以Trp²⁵为中心形成一个“Trp-Cage”。随后的研究表明，Exendin-4在哺乳动物内具有与GLP-1相同的生理功能，它们作用于同一受体。Exendin-4能以葡萄糖浓度依赖方式分泌胰岛素降低血糖水平，刺激胰岛β细胞再生，诱导前胰岛基因的转录，促进胰岛素的成熟和分泌；还可以抑制餐后胰高血糖素的产生，延迟胃排空，抑制食欲等。因为GLP-1无论是口服还是皮下注射，都易被DPP-4迅速降解，半衰期仅有1～2分钟，限制了其在临床上的应用，而Exendin-4半衰期却长达几个小时，因此在糖尿病治疗方面有广阔的前景。

虽然Exendin-4在哺乳动物内具有与GLP-1相同的生理功能，且不易被DPP-4水解，使得其具有较长的半衰期，但病人仍需每天注射两次，导致病人的依从性较差。因此，基于Exendin-4开发出长效药物是目前糖尿病治疗领域研究的热点。

随着生物技术的飞速发展，延长药物在体内的半衰期并阻止其被快速清除已成为近年来的研究热点。已建立的提高药物半衰期的技术包括化学修饰、微囊化、糖基化、抗蛋白酶突变体、蛋白质融合等，许多长效蛋白药物已经研制成功并且应用于临床治疗。

为了延长药物在体内的半衰期，免疫球蛋白IgG的Fc片段应用最为广泛。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，半衰期约为20～30天。其稳定性好的原因主要是由于IgG的Fc片段可与新生Fc受体结合，避免IgG进入溶酶体中被降解，以pH依赖的方式结合后再循环有关。因此，IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白体内半衰期，达到长效目的。但IgG1、IgG2和IgG3的Fc片段能通过经典途径活化补体，产生补体依赖性细胞毒作用(CDC)；并可与巨噬细胞、NK细胞表面的Fc受体结合，发挥调理作用及抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。Fc片段介导的CDC和ADCC活性对于延长药物半衰期的作用毫无意义，并可能导致不良反应的产生。与其他型的IgG相比，IgG4的Fc片段具有最低的补体结合活性和FcR结合活性。但为了避免CDC和ADCC活性的出现，仍需要对其Fc片段进行突变得到IgG4Fc突变体。而如何进行突变既能明显延长目标蛋白的体内半衰期，提高融合蛋白的稳定性，又能使获得的融合蛋白尽量减少CDC和ADCC活性，也是解决该问题的核心要点。

同时，目前已上市的Fc融合蛋白往往采用一个目的蛋白与IgG的Fc片段融合，这样会降低目的蛋白的体外活性，尤其是自身分子量较小的多肽。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的含Exendin-4多肽的融合蛋白的稳定性还不够好以及安全性不足的问题。本发明解决技术问题的方案是提供一种新的含Exendin-4多肽的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的结构为：从氮端起依次含有Exendin-4、连接肽、Exendin-4、连接肽、IgG4的Fc段突变体。即本发明含Exendin-4多肽的融合蛋白的结构从氮端起为Ex-4-连接肽-Ex-4-连接肽-IgG4的Fc段突变体。

其中，人IgG4的Fc段突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。突变位置具体为Ser228Pro/Phe234Ala/Leu235Ala/△Lys447，这些突变能有效降低IgG4Fc片段的ADCC和CDC效应。

SEQ ID No.1：

ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。

其中，上述的Exendin-4多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.2：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。

上述融合蛋白为2个Exendin-4-连接肽与人IgG4Fc突变体重组而成。融合蛋白之间的连接肽需要具有足够的长度和较好的柔性，以保证连接的2个分子能正确折叠，保证其生物学活性。一般采用5-25个氨基酸的柔性肽段。可使用本领域常用的连接肽。

比如，上述的连接肽的氨基酸序列可如SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.3：GGGGSGGGGSGGGGS。

进一步的，上述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.4：

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。

更进一步的，上述的融合蛋白还在氮端包含有信号肽。

同时，本发明还提供了编码上述的融合蛋白的核酸。

进一步，上述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.5或其简并序列所示。

SEQ ID No.5：

CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAG TGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCA TCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCCATGGTGAAG GAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATT GAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCAGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT。

本发明还提供了含有权利要求7所述核苷酸序列的基因载体。

本发明还提供了含有权利要求8所述基因载体的宿主细胞。

本发明还提供了上述的融合蛋白、或上述核苷酸序列、或上述基因载体在制备糖尿病或肥胖症的药物的用途。

其中，上述的糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。

此外，本发明还提供了一种治疗糖尿病或肥胖症的药物，该药物是以上述的融合蛋白为主要活性成分制备而成。即含有上述融合蛋白及药学上可接受的辅料。

其中，上述药物还可以包含其他的治疗糖尿病或者肥胖症的药物。

其中，上述的糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。

为了更好的实施本发明，本发明还提供了一种制备上述融合蛋白的方法。该方法包括以下步骤：将编码融合蛋白的基因可操作地装入表达载体，将表达载体转入宿主，宿主培养增殖后即从宿主和/或其培养上清液分离纯化得到含Exendin-4的融合蛋白。

其中，上述融合蛋白的制备方法中所述的表达载体为真核质粒表达载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

其中，上述融合蛋白的制备方法中所述的宿主为真核细胞。

其中，上述融合蛋白的制备方法中所述的分离纯化方法为将大规模培养宿主的上清液用Protein A亲和层析柱进行纯化，再过SP柱层析得到含Exendin-4的融合蛋白。

显然，上述方法中的表达载体可使用常用的真核表达载体、各种基因工程常用的宿主细胞，分离纯化方法也可以参考使用现有的常用方法以获得较纯的本发明含Exendin-4的融合蛋白。而将编码融合蛋白的基因可操作地装入表达载体，以及将表达载体转入宿主，则可以参照各种基因工程手册和具体使用的载体与宿主细胞的说明进行。

本发明提供的含Exendin-4的融合蛋白是由Exendin-4与特定突变的人免疫球蛋白IgG4的Fc片段突变体融合而成。该融合蛋白具有更好的稳定性和更长的半衰期，同时具有更低的毒副作用。本发明融合蛋白能用于I型、II型糖尿病以及肥胖症的治疗，有明显长效化特征，保留了Exendin-4生物学活性，能够通过血糖依赖的胰岛素分泌改善血糖水平控制，不会造成低血糖的危险；抑制胰高血糖素分泌；减轻胃排空率；减少体重以及增加饱腹感，延长其在血清中的半衰期。同时该融合蛋白具有针对Exendin-4进行了突变的Fc片段，能够最大程度降低天然IgG Fc所带来的CDC和ADCC效应，从而降低药物的不良反应，因此具有很高的临床应用价值。

附图说明

图1真核表达载体pAAV2-neo的图谱。

图2双酶切鉴定电泳图谱(1％琼脂糖电泳)。1：1Kb Ladder；2：pAAV2-E4F4(Kpn I+Bgl II)。

图3RT-PCR扩增IgG4Fc DNA片段的电泳图谱(1％琼脂糖电泳)。1：1kb DNA ladder maker；2：CHO；3：CHO-E4F4；4：阳性对照(pAAV2-E4F4)。

图4E4F4融合蛋白的12％SDS-PAGE电泳图谱。1：蛋白分子量标准；2：E4F4非还原型；3：E4F4还原型。

图5E4F4融合蛋白的体外活性测定结果。

图6E4F4融合蛋白对饮食诱导的肥胖小鼠体重及摄食量的影响。A：肥胖小鼠体重；B：肥胖小鼠摄食量。

图7E4F4融合蛋白对饮食诱导的肥胖小鼠胰岛素耐量及曲线下面积的影响。A：肥胖小鼠胰岛素耐量；B：肥胖小鼠胰岛素耐量的曲线下面积。

图8E4F4融合蛋白对饮食诱导的肥胖小鼠葡萄糖耐量及曲线下面积的影响。A：肥胖小鼠葡萄糖耐量；B：肥胖小鼠葡萄糖耐量的曲线下面积。

图9E4F4融合蛋白对血浆中胰岛素含量的影响。

图10E4F4融合蛋白在大鼠体内的药物代谢动力学。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

本发明的目的在于提供一种含Exendin-4的融合蛋白。该融合蛋白是由Exendin-4与人免疫球蛋白IgG4的Fc片段突变体融合而成。该融合蛋白具有更好的稳定性和更长的半衰期，能够明显促进胰岛素的分泌，并且提高机体对胰岛素的敏感性，同时具有减轻体重的作用。

由于Exendin-4的分子量小，能被肾脏快速清除，需要每天注射两次以维持其治疗效果，在临床上受到一定的限制，为了更好的发挥概要的疗效，因此本发明利用Exendin-4与人免疫球蛋白IgG4的Fc片段突变体融合延长其半衰期。与现有技术中一个目的蛋白与IgG融合不同，这样降低了蛋白的活性，有效剂量变大，不良反应风险提高。本发明中，有两个Exendin-4蛋白与IgG4融合，延长融合蛋白在体内的半衰期，同时维持Exendin-4的活性。

本发明提供一种用于治疗糖尿病和肥胖症的融合蛋白，所述融合蛋白为2个Exendin-4-连接肽与人IgG4Fc突变体重组而成。

其中，连接肽为一组由氨基酸组成的无二级结构的柔性肽段，其氨基酸的个数不大于25个。

常用的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

IgG4Fc突变体采用点突变将Fc段中与补体和FcR结合的位点突变，即Ser228Pro/Phe234Ala/Leu235Ala/△Lys447。具体来说，将第228位丝氨酸(Ser)突变为脯氨酸(Pro)，第234位的苯丙氨酸(Phe)突变为丙氨酸(Ala)，第235的亮氨酸(Leu)突变为丙氨酸(Ala)；同时，为了保证C-末端的均一性，缺失第447位的赖氨酸(Lys)。

融合蛋白之间的连接肽因具有足够的长度和较好的柔性，以保证连接的2个分子能正确折叠，保证其生物学活性。一般采用5-25个氨基酸的柔性肽段。

本发明的融合蛋白全长为Exendin-4-连接肽-Exendin-4-连接肽-IgG4Fc突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。该融合蛋白以下简称为rhE4F4融合蛋白。

显然，在上述公开的本发明内容的指导下，本领域技术人员使用本领域常规的分子生物学技术和免疫学技术足以能够实施本发明。

以下则通过实施例进行更进一步的详细说明。

实施例一E4F4融合蛋白的设计及重组表达载体的构建

融合蛋白序列设计，将突变人IgG4Fc片段((aa.99-327)融合于两个Exendin-4片段的C-端。同时，为了实现融合蛋白的分泌表达，在N-端加上小鼠信号肽序列，得到最终的融合蛋白为：ssmIg-Ex-4-(G4S)₃-Ex-4-(G4S)₃-human mutant IgG4Fc(aa.99-327)。

含信号肽的融合蛋白序列如下(SEQ ID No.6)：

MGWSCIILFLVATATGVHSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。

对应的编码核苷酸序列如下(SEQ ID No.7)所示：

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGC GGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCCATGGTGAAGGAA CATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAG TGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCAGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA。

采用全基因合成的方法得到含小鼠信号肽的E4F4融合蛋白的DNA片段(SEQ ID No.7)(上海英骏公司)，将合成的片段直接插入表达载体pAAV2-neo，其质粒图谱见图1。重组克隆经进行Bgl II和Kpn I双酶切鉴定，切出1100bp左右的片段，见图2。经上海英骏公司测序验证与设计序列一致。

实施例二CHO稳定表达株(CHO-E4F4细胞)筛选及鉴定

取10μg大量制备的实施例1中的pAAV2-E4F4质粒，采用脂质体Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen公司)转染CHO细胞(购自美国ATCC公司)。通过ELISA检测培养上清中融合蛋白的表达情况，经四轮筛选后，优选出高表达E4F4细胞，将稳定表达的细胞命名为CHO-E4F4细胞。

抽提CHO-E4F4细胞的RNA，用RT-PCR鉴定插入片段的转录情况。结果如图3所示，CHO-E4F4为正确的重组表达E4F4的稳定细胞株。

实施例三rhE4F4融合蛋白的制备

大规模培养CHO-E4F4细胞，上清液经Protein A Sepharose F.F.(购自美国GE公司)亲和层析柱进行纯化，纯化得到蛋白的电泳图谱见图4，纯度可达到90％以上。

具体步骤如下：

(1)表达上清液预处理：用1M的NaOH将上清液缓慢调节pH至7.2，在4℃下4000rpm离心10min，收集上清。

(2)离心上清经Protein A Sepharose F.F.亲和层析柱，用0.1M柠檬酸缓冲液(pH3.0)将融合蛋白洗下，洗下的融合蛋白用1M的NaOH调节pH至7.2。

(3)将得到的rhE4F4融合蛋白经10mM磷酸缓冲液透析，-20℃保存。

实施例四rhE4F4融合蛋白体外生物学活性测定

采用cAMP酶联测定法来检测rhE4F4融合蛋白的体外生物学活性。所选用的cAMP检测试剂盒为美国R&D公司产品，操作方法也按照试剂盒说明书进行，细胞系为大鼠胰岛瘤RIN-5F细胞(购自美国ATCC公司)，细胞的传代培养按照常规方法进行，阳性对照品为Exendin-4(购自美国Sigma公司)。

rhE4F4融合蛋白体外生物学活性测定方法如下：

(1)在96孔板中接种RIN/5F细胞1.2×10⁴细胞/孔，将接种好的96孔板先放于室温1hr，再放于37℃，5％C0₂中培养72hr。

(2)样品稀释：用样品稀释液把各样品稀释到1μg/ml的起始浓度；从起始浓度做等3倍稀释，共12个稀释度，每个梯度3个复孔，同时设定样品稀释液和1×DMEMH为对照孔。

(3)弃去96孔板中上清，各取稀释好的样品100μl加到96孔板中，于37℃，5％C0₂中培养0.5hr。

(4)cAMP的提取：R&D的cAMP检测试剂盒裂解细胞提取cAMP，取出96孔板，弃上清，用PBS洗3遍；加入试剂盒中的1×裂解液，冻融3次。

(5)cAMP含量测定：混合复孔中的裂解液，取100μl用RD的cAMP检测试剂盒检测cAMP含量。

E4F4融合蛋白的体外生物学活性测定见图5，Exendin-4的ED₅₀为3.79ng/ml，rhE4F4融合蛋白的ED₅₀为2.74ng/ml。结果表明，IgG4Fc片段的融合并不影响Exendin-4的活性，即激活GLP-1受体(GLPR)的能力。

实施例五rhE4F4融合蛋白的初步药效学研究

建立小鼠饮食诱导的肥胖模型(DIO)研究E4F4融合蛋白体内的对小鼠糖尿病模型的治疗效果。

实验方法：选择体重为40～45g的C57/B6雄性小鼠(购自北京维通利华公司)，随机分成3组：生理盐水组(NS组)和E4F4融合蛋白组(E4F4组)用高脂饲料喂养8周形成肥胖，胰岛素抵抗和血糖升高的症状，再开始对小鼠进行治疗。而正常组小鼠同期不饲喂高脂饲料。

治疗方式为生理盐水组(NS组)和E4F4融合蛋白组(E4F4组)均为皮下给药，rhE4F4融合蛋白组为一周给药一次1.8mg/kg。然后每天称三组的体重和摄食量。

治疗后14天，对小鼠进行胰岛素耐量和葡萄糖耐量的检测，然后处死小鼠后，眼眶静脉取血，分离血清，负80度冰箱保存。

胰岛素耐量(ITT)的检测，检测前将小鼠禁食4小时(自由饮水)，然后对小鼠腹腔注射0.5U/kg的胰岛素，分别在注射胰岛素后0、30、60、120min四个时间点进行尾尖采血，测定血糖含量。

葡萄糖耐量(IPGTT)检测，检测前将小鼠禁食16小时(自由饮水)，然后对小鼠腹腔注射2g/kg的葡萄糖溶液，分别在注射葡萄糖0、30、60、120min四个时间点进行尾尖采血，测定血糖含量。

实验结果：各组小鼠体重及摄食量的变化见图6，结果显示，rhE4F4融合蛋白组，即一周给药1次E4F4融合蛋白能够明显抑制小鼠体重的增长；并且rhE4F4融合蛋白组与NS组相比都有非常显著的统计学差异(P<0.001)；每天对小鼠摄食量进行称量，与NS组相比，rhE4F4融合蛋白组对小鼠摄食量有一定的抑制作用。

小鼠胰岛素耐量检测如图7所示，小鼠治疗周期结束时，将小鼠禁食4小时，对小鼠腹腔注射0.5U/kg的胰岛素，分别在0、30、60、120min四个时间点对血糖进行检测。实验结果显示，与NS组相比，rhE4F4融合蛋白组能够明显改善胰岛素耐量情况，rhE4F4融合蛋白组的曲线下面积(AUC)与NS组的曲线下面积(AUC)也具有非常显著的统计差异(P<0.001)。

小鼠葡萄糖耐量检测如图7所示，小鼠治疗周期结束时，将小鼠禁食16小时，对小鼠腹腔注射2g/kg的葡萄糖，分别在0、30、60、120min四个时间点对血糖进行检测；实验结果显示，在30min时，rhE4F4融合蛋白组分泌的胰岛素能够明显控制葡萄糖的含量，提高DIO小鼠的葡萄糖耐量；在30、60、120min三个时间点时，rhE4F4融合蛋白组与NS组相比也有具有非常显著的统计差异(P<0.001)；rhE4F4融合蛋白组的曲线下面积(AUC)与NS组的曲线下面积(AUC)也具有非常显著的统计差异(P<0.001)。

DIO小鼠治疗前后胰岛素含量结果如图9，结果显示，与NS组相比，rhE4F4融合蛋白组DIO小鼠治疗后，胰岛素含量明显降低，具有非常显著的统计差异(P<0.001)。

实施例六rhE4F4融合蛋白的体内初步药代学研究

选择8周龄的SD雄性大鼠(购自四川大学动物实验中心)，随机分成3组：Exendin-4组、rhE4F4融合蛋白组和NS组，每组3只，分别注射Exendin-4:100μg/kg、rhE4F4融合蛋白:450μg/kg和生理盐水，检测42天内Exendin-4含量的变化，在不同的时间点0、1、2、4、6、14、21、28、35、42天取血，采用Exendin-4检测试剂盒(购自美国phoenix pharmaceuticals公司)检测血清中Exendin-4的含量。

在取样的各个时间点中，NS组的血清中一直未检测出Exendin-4；Exendin-4组的血清在第1天和第2天能检测到少量Exendin-4，其后时间点检测不到。而rhE4F4融合蛋白组的血清在Exendin-4含量一直可持续检测到35天(如图9所示)，经计算rhE4F4融合蛋白在体内的半衰期t_1/2为6.6天。

Claims (18)

1.含Exendin-4多肽的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的结构为：从氮端起依次为Exendin-4多肽、连接肽、Exendin-4多肽、连接肽、IgG4的Fc段突变体。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的IgG4的Fc段突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的Exendin-4多肽的氨基酸序列为如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的连接肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No.4所示。

6.根据权利要求1～5任一项所述的融合蛋白，其特征在于，在氮端还含有信号肽。

7.根据编码权利要求1～6任一项所述的融合蛋白的核酸。

8.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.5或其简并序列。

9.含有权利要求7或8所述核酸的基因载体。

10.含有权利要求9所述基因载体的宿主细胞。

11.权利要求1～6任一项所述的融合蛋白在制备治疗糖尿病或肥胖症的药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于所述的糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。

13.治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其特征在于：含有权利要求1～6任一项所述的融合蛋白及药学上可接受的辅料。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于：通过气雾剂、注射剂的方式施用。

15.权利要求1～6任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将编码Exendin-4多肽的融合蛋白的基因装入表达载体，将表达载体转入宿主细胞，稳定表达株大规模培养后从培养上清液分离纯化得到Exendin-4多肽的融合蛋白。

16.根据权利要求15所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的表达载体为真核质粒表达载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。

17.根据权利要求15所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为真核细胞。

18.根据权利要求15所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的分离纯化方法为将大规模培养宿主细胞的上清液用Protein A亲和层析柱进行纯化得到Exendin-4多肽的融合蛋白。