JPWO2011136361A1 - 生理活性物質等の生体内安定性向上のためのペプチド及び生体内安定性が向上した生理活性物質 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)アミノ酸配列Ile-Asp-Glu-Ile-Leuを含み、アミノ酸数が5〜25個である、GAモジュールの部分ペプチド。
(2)前記GAモジュールが連鎖球菌G148に由来するGAモジュールである、(1)に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
(3)アミノ酸数が5〜17個である、(1)に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
[式中、Y22はLys又は欠失、Y23はAsn又は欠失、Y24はLeu又は欠失、Y25はIle又は欠失、Y26はAsn又は欠失、Y27はAsn又は欠失、Y28はAla又は欠失、Y29はLys又は欠失、Y30はThr又は欠失、Y31はVal又は欠失、Y32はGlu又は欠失、Y33はGly又は欠失、Y34はVal又は欠失、Y35はLys又は欠失、Y36はAla又は欠失、Y37はLeu又は欠失、Y43はAla又は欠失、Y44はAla又は欠失、Y45はLeu又は欠失、Y46はPro又は欠失を意味する。ただし、欠失は、Y22及び/又はY46からの連続的な欠失(Y22又はY46単独の欠失及びY22とY46の2箇所のみの欠失を含む)に限る。]
で示されるアミノ酸配列からなる(1)に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(配列番号2)
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号3)
Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号4)
Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号5)
Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号6)
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala(配列番号7)
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号8)
Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号9)
Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号10)
Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(配列番号11)
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(配列番号12)
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号13)
Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro(配列番号14)
Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro(配列番号15)
Lys-Asn-Leu-Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro(配列番号16)
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載のGAモジュールの部分ペプチドと、生理活性物質とが結合されてなる生理活性複合体。
(8)前記生理活性物質が消化管ホルモン若しくはそれらの誘導体、又は、Exendin-4若しくはそれらの誘導体である、(7)に記載の生理活性複合体。
(10)リンカーを介して、前記GAモジュールの部分ペプチドと、前記生理活性物質とが結合されてなる、(7)に記載の生理活性複合体。
His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45
[式中、X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、又はAibであり、X9は、Glu、Gly、Asp、又はLysであり、X16は、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X18は、Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X19は、Tyr、Phe、Trp、Glu、Gln、Asp、又はLysであり、X20は、Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr、又はLysであり、X22は、Gly、Ala、Glu、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Arg、Cys、又はAibであり、X23は、Gln、Arg、Glu、Asp、Asn、又はLysであり、X25は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、又はLysであり、X26は、Lys、Gln、Glu、Asp、His又はArgであり、X27は、Glu、Ala、Asp、Lys、又はLeuであり、X30は、Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Gln、Tyr、His、又はArgであり、X33は、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp又はLysであり、X34は、Lys、Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly、又はAsnであり、X35は、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro、又はAibであり、X36は、Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X37は、Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、Ile、Val、His又は欠失であり、X38は、Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X39は、Ser、Arg、 Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X40は、Gly、Glu、Lys、Asp、又は欠失であり、X41は、Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp又は欠失であり、X42は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X43は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X44は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X45は、Ser、Lys、Val、Glu、Asp、又は欠失である。]
で示されるアミノ酸配列からなりGLP-1活性を有するGLP-1又はGLP-1誘導体である、(9)に記載の生理活性複合体。
(14)前記生理活性物質がGLP-1又はその誘導体であり、前記GAモジュールの部分ペプチドをGLP-1又はその誘導体のC末端に結合することを特徴とする、(13)に記載の方法。
GAモジュールの部分ペプチドとは、配列番号1に示されたGAモジュールの部分配列からなるペプチドをいう。「GAモジュールの部分配列」とは、GAモジュール配列の一部分からなる配列をいう。具体的には、配列番号1に示されたGAモジュールの一方の末端又は両方の末端から、一アミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基が欠失した断片配列をいう。本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、配列番号2によって定められる少なくとも5つの連続したアミノ酸を含むペプチドであり、そのアミノ酸数は、5〜25個であり、5〜17個がより好ましい。本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、アミノ酸配列で示すと、
式:Y22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y30-Y31-Y32-Y33-Y34-Y35-Y36-Y37-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46
[式中、Y22はLys又は欠失、Y23はAsn又は欠失、Y24はLeu又は欠失、Y25はIle又は欠失、Y26はAsn又は欠失、Y27はAsn又は欠失、Y28はAla又は欠失、Y29はLys又は欠失、Y30はThr又は欠失、Y31はVal又は欠失、Y32はGlu又は欠失、Y33はGly又は欠失、Y34はVal又は欠失、Y35はLys又は欠失、Y36はAla又は欠失、Y37はLeu又は欠失、Y43はAla又は欠失、Y44はAla又は欠失、Y45はLeu又は欠失、Y46はPro又は欠失を意味する。ただし、欠失は、Y22及び/又はY46からの連続的な欠失(Y22又はY46単独の欠失及びY22とY46の2箇所のみの欠失を含む)に限る。]
となる。
尚、Exendin-4は、アメリカ毒トカゲの唾液腺の分泌物から発見されたGLP-1様活性を有する生理活性ペプチドであり、Exendin-4(1-39)の他に、Exendin-4(1-39)-LysLysLysLysLys、Exendin-4(1-39)-LysLysLysLysLysLys等の誘導体が知られており、GLP-1の誘導体とみなすこともできる。
X7-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45
[式中、X7はHis、X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、又はAibであり、X9は、Glu、Gly、Asp、又はLysであり、X16は、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X18は、Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X19は、Tyr、Phe、Trp、Glu、Gln、Asp、又はLysであり、X20は、Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr、又はLysであり、X22は、Gly、Ala、Glu、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Arg、Cys、又はAibであり、X23は、Gln、Arg、Glu、Asp、Asn、又はLysであり、X25は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、又はLysであり、X26は、Lys、Gln、Glu、Asp、His又はArgであり、X27は、Glu、Ala、Asp、Lys、又はLeuであり、X30は、Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Gln、Tyr、His、又はArgであり、X33は、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp又はLysであり、X34は、Lys、Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly、又はAsnであり、X35は、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro、又はAibであり、X36は、Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X37は、Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、Ile、Val、His又は欠失であり、X38は、Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X39は、Ser、Arg、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X40は、Gly、Glu、Lys、Asp、又は欠失であり、X41は、Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp又は欠失であり、X42は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X43は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X44は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X45は、Ser、Lys、Val、Glu、Asp、又は欠失である。]
これらの中でも、X7〜X37の配列を有するGLP-1又はその誘導体(X7〜X37は上述の通り)が、本発明のGAモジュールの部分ペプチドが適用される好適なGLP-1又はその誘導体である。
GLP-1(7-37),[Ser8]-GLP-1(7-37),[Gly8]-GLP-1(7-37),[Val8]-GLP-1(7-37),[Glu22]-GLP-1(7-37),[Lys22]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22]-GLP-1(7-37),[Val8,Lys22]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu22]-GLP-1(7-37),[Gly8,Lys22]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu30]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu30]-GLP-1(7-37),[Val8,His37]-GLP-1(7-37),[Gly8,His37]-GLP-1(7-37),[Arg34]-GLP-1(7-37),[Lys18]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu22,Gly36]-GLP-1(7-37),[Aib8,Aib22]-GLP-1(7-37),[Aib8,Aib35]-GLP-1(7-37),[Aib8,Aib22,Aib35]-GLP-1(7-37),[Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Val25]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Ile33]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Val25,Ile33]-GLP-1(7-37)、及びこれらの37位が欠失したGLP-1(7-36)型、並びにこれらの36位と37位とが欠失したGLP-1(7-35)型。
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2
また、VIPの誘導体として、His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2 からなるPACAP-27、His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2 からなるPACAP-38、Na-acetyl-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys*-Tyr-Leu-Asn-Asp*-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2(17位Metはノルロイシンに置換、*:21位Lysと25位Asp間でラクタム環形成)からなるRO25-1553等が知られている。
Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH2
ここで、3位と14位のシステイン残基間でジスルフィド結合している。尚、8位TrpをD-Trpに置換することが可能である。また、構造機能解析によって、ソマトスタチンの7位から10位までのPhe-Trp-Lys-Thrのβターン断片が活性に必要な配列であることが明らかとなっている[Nature,1979,280(5722),512-514、Nature,1981,292(5818),55-58]ことから、1位から6位および11位から14位のアミノ酸は削除することも可能と考えられる。そのようなソマトスタチン誘導体は、アミノ酸配列Phe-Trp-Lys-Thrを含む天然ソマトスタチンの部分ペプチド(N末及び/又はC末からの連続的な欠失が可能)ということができる。なお、他にソマトスタチン誘導体としては、D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol(システイン残基間でジスルフィド結合を形成)からなるオクトレオチドや、D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr、D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr(システイン残基間でジスルフィド結合を形成)、およびD-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thp(システイン残基間でジスルフィド結合を形成)等の報告がある。
Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2
ここで、2位と7位のシステイン残基間でジスルフィド結合している。尚、25位AlaをProに置換、28位SerをProに置換、29位SerをProに置換することが可能であり、これらは、それぞれ単独での置換だけでなく、任意の複数箇所の置換も可能である。また、N末にGLP-1を結合したペプチドアナログも知られている。
Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-NH2
この中で、グレリンの1位から5位までのアミノ酸配列Gly-Ser-Ser-Phe-Leuで十分な活性が担保されていることが知られ(Biochem Biophys Res Commun,2001,284(3),655-659)、6位から28位のアミノ酸は削除することも可能と考えられる。そのようなグレリン誘導体は、アミノ酸配列Gly-Ser-Ser-Phe-Leuを含む天然グレリンの部分ペプチド(C末からの連続的な欠失が可能)ということができる。尚、グレリンは、3位のSerがOctanoyl化されているが、このOctanoyl基を構造変換させても活性を維持する可能性がある(J Med Chem,2000,43(23),4370-4376)。
I GLP-1ペプチド複合体の合成
生体内安定性が低い生理活性物質としてGLP-1を選択し、検証を行った。GLP-1又はGLP-1誘導体のC末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、GLP-1ペプチド複合体とした。GLP-1ペプチド複合体の合成は固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
GLP-1としては、主としてGLP-1(7-35)を使用し、8位は天然のアラニンか、セリンまたはグリシンに置換したものを用いた。[Ser8]は、配列番号24で示される天然GLP-1の左から2番目、即ち8位のアラニンがセリンに変換されていることを示し、8Sと同義である。尚、この分野においては、GLP-1前駆体のN末を1位とする関係で、天然GLP-1においては、左端のN末を7位とするのが一般的である。
尚、配列番号1〜23は、GAモジュールの全配列又は部分配列からなるペプチドを示し、配列番号24〜58は、生理活性物質であるGLP-1又はその誘導体を示す。
実施例2.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(38-44)-NH2 配列番号29(GAm:配列番号3)
実施例3.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(37-44)-NH2 配列番号30(GAm:配列番号4)
実施例4.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(35-44)-NH2 配列番号31(GAm:配列番号5)
実施例5.GLP-1(7-35)-GAm(38-42)-NH2 配列番号32(GAm:配列番号2)
実施例6.GLP-1(7-35)-GAm(35-44)-NH2 配列番号33(GAm:配列番号5)
実施例7.GLP-1(7-35)-GAm(33-43)-NH2 配列番号34(GAm:配列番号7)
実施例8.GLP-1(7-35)-GAm(33-44)-NH2 配列番号35(GAm:配列番号8)
実施例9.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(33-44)-NH2 配列番号36(GAm:配列番号8)
実施例10.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(32-44)-NH2 配列番号37(GAm:配列番号9)
実施例11.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(31-44)-NH2 配列番号38(GAm:配列番号10)
実施例12.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(30-42)-NH2 配列番号39(GAm:配列番号11)
実施例13.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-42)-NH2 配列番号40(GAm:配列番号12)
実施例14.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-44)-NH2 配列番号41(GAm:配列番号13)
実施例15.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(27-46)-NH2 配列番号42(GAm:配列番号14)
実施例16.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(25-46)-NH2 配列番号43(GAm:配列番号15)
実施例17.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(22-46)-NH2 配列番号44(GAm:配列番号16)
実施例18.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-44) 配列番号41(GAm:配列番号13)
実施例19.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(33-44) 配列番号36(GAm:配列番号8)
実施例20.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(37-44) 配列番号30(GAm:配列番号4)
実施例21.GLP-1(7-35)-Gly-Pro-GAm(35-44)-NH2 配列番号45(GAm:配列番号5)
実施例22.GLP-1(7-35)-Gly-Pro-GAm(34-44)-NH2 配列番号46(GAm:配列番号6)
実施例23.GLP-1(7-35)-Gly-Pro-Ser-GAm(34-44)-NH2 配列番号47(GAm:配列番号6)
実施例24.GLP-1(7-35)-Gly-Pro-Ser-GAm(33-44)-NH2 配列番号48(GAm:配列番号8)
比較例2.[Ser8]-GLP-1(7-36)-NH2 配列番号26
比較例3.Exendin-4(1-39)-NH2 配列番号27
比較例4.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(1-46)-NH2 配列番号49(GAm:配列番号1)
比較例5.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(17-46)-NH2 配列番号50(GAm:配列番号17)
比較例6.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(21-46)-NH2 配列番号51(GAm:配列番号18)
比較例7.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-40)-NH2 配列番号52(GAm:配列番号19)
比較例8.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-37)-NH2 配列番号53(GAm:配列番号20)
比較例9.[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(39-44)-NH2 配列番号54(GAm:配列番号21)
比較例10.GLP-1(7-35)-GAm(38-41)-NH2 配列番号55(GAm:配列番号22)
比較例11.GLP-1(7-35)-GAm(38-40)-NH2 配列番号56(GAm:配列番号23)
比較例12.[Gly8]-GLP-1(7-35)-RPSS-NH2 配列番号57
比較例13.[Ser8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-35)-GPSSGAPPPS-NH2 配列番号58
GLP-1ペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroで、血漿中での安定性を評価した。
1.方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるように各GLP-1ペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、8、48時間後にサンプルを回収し、GLP-1ペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。GLP-1ペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、8時間後、48時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。
各GLP-1ペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を残存率として表1及び表2に示す。
(1)GAモジュールの部分ペプチドの効果
ペプチドを付加していない天然GLP-1(比較例1)及び8S-GLP-1(比較例2)は、48時間後には血漿中で完全に分解されていた。また、GAモジュール配列ではないペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体(比較例12及び13)でも、48時間後の血漿中残存率は0%もしくは12%であり、天然GLP-1(比較例1)や8S-GLP-1(比較例2)と同程度の極めて低い血漿安定性であった。
実施例21〜実施例24は、リンカーを介してGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体であるが、これらのGLP-1ペプチド複合体においても、48時間後において、十分な血漿中残存率を示した。このことから、リンカーを介してGAモジュールの部分ペプチドを付加した場合でも、血漿安定性が確保されることが確認された。
試験例1において、高い血漿安定性が示されたGLP-1ペプチド複合体の活性強度を評価するために、in vitroのインスリン分泌能を解析した。
1.方法
内在性のGLP-1レセプターを発現する、マウス由来のインスリノーマ細胞であるMIN6(宮崎純一氏より分与)を用いて、インスリン分泌能を評価した。MIN6をマルチプレートに播種し、48時間37℃で培養した。その後、2mMグルコース溶液を含むKRH緩衝液(NaCl 119mM,KCl 4.74mM,CaCl2 2.54mM,MgCl2 1.19mM,KH2PO4 1.19mM,10mMHEPES緩衝液pH7.3,0.1% BSAを含む)を用いて2回洗浄後、1時間37℃で静置した。上記の溶液を吸引除去後、GLP-1ペプチド複合体を含む15mMグルコース含有KRH緩衝液を添加し1時間37℃で静置し、その上澄みを回収しインスリン分泌量を測定した。インスリンの測定は酵素結合免疫固着アッセイ(ELISA)で行い、基質添加後450nm(副波長620nm)の吸光度を測定した。尚、試験は以下の4つのパートから構成される。
天然GLP-1(比較例1)と8S-GLP-1-GAm(1-46)(比較例4)について、30,100,300,1000pMの濃度で活性評価を行い、EC50値を算出した。
[Part2]
天然GLP-1(比較例1)、8S-GLP-1-GAm(17-46)(比較例5)、及び8S-GLP-1-GAm(28-44)(実施例14)について、Part1と同様にEC50値を算出した。
[Part3]
MIN6細胞における天然GLP-1の最大活性を示すのに必要と考えられる1000pMの濃度で、各GLP-1ペプチド複合体の活性評価を行い、天然GLP-1の活性強度と比較した。
中鎖型GAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体として、8S-GLP-1-GAm(32-44)(実施例10:GAm 13残基)、GLP-1-GAm(33-44)(実施例8:GAm 12残基)、GLP-1-GAm(35-44)(実施例6:GAm 10残基)、及びGLP-1-GPS-GAm(34-44)(実施例22:GAm 11残基)を選択し、短鎖型GAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体として、8S-GLP-1-GAm(38-44)(実施例2:GAm 7残基)及び8S-GLP-1-GAm(38-42)(実施例1:GAm 5残基)を選択し、Part2と同様にEC50値を算出し、GAモジュールの部分ペプチド付加による生理活性への影響を詳細に検証した。
[Part1]
全長GAモジュールであるGAm(1-46)を付加したGLP-1ペプチド複合体8S-GLP-1-GAm(1-46)(比較例4)及び天然GLP-1(比較例1)のインスリン分泌能を図2に示す。このように、8S-GLP-1-GAm(1-46)(比較例4)は、天然GLP-1(比較例1)に比べて、著しく活性が損なわれることが明らかとなった。
次に、GAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体及び天然GLP-1(比較例1)のインスリン分泌能を図3に示す。30残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体である8S-GLP-1-GAm(17-46)(比較例5)では、活性は殆ど検出されず、最高濃度の1000pMで処理した場合でも天然GLP-1(比較例1)の最大活性に対して40%未満の活性を示すのが限界であった。一方、17残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体である8S-GLP-1-GAm(28-44)(実施例14)は、天然GLP-1とほぼ同等の活性を維持していた。
これまでの試験から、30残基以上の長鎖のGAモジュールの部分ペプチドを付加した場合、GLP-1ペプチド複合体の血漿安定性は向上するものの、その生理活性は著しく損なわれることが明らかとなった。
図2および図3で示した結果をもとに、天然GLP-1の最大活性に対して50%の活性を示すのに必要な各GLP-1ペプチド複合体の濃度(EC50)を解析し、表3に示す。解析方法は以下の計算式を用いて計算した。Contorlは、1000pM濃度における天然GLP-1のインスリン分泌能を最大活性として設定した。
Control=(1000pM濃度における天然GLP-1のインスリン分泌量)-(15mM Glucoseにおけるインスリン分泌量)
活性強度(%)=[{(各GLP-1ペプチド複合体のインスリン分泌量)-(15mM Glucoseにおけるインスリン分泌量)}/Control]x100
EC50値:50% of controlを示すのに必要なGLP-1ペプチド複合体の濃度
このように、全長GAモジュール又はその部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体の内、8S-GLP-1-GAm(1-46)(比較例4)及び8S-GLP-1-GAm(17-46)(比較例5)は、8S-GLP-1-GAm(28-44)(実施例14)と比較して著しく活性が減少していることが、EC50値からも明らかである。
各GLP-1ペプチド複合体について、1000pMの濃度で天然GLP-1(実施例1)との活性強度比較を行った結果を表4及び表5に示す。25残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加した8S-GLP-1-GAm(22-46)(実施例17)が天然GLP-1(比較例1)と同等の活性を保持していたのに対し、26残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加した8S-GLP-1-GAm(21-46)(比較例6)の活性強度は45%と、著しく活性が低下していた。25残基以下のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体(実施例1〜実施例24)は、天然GLP-1(比較例1)と同等の活性を保持していることが示された。
表6に示すように、中鎖型、短鎖型、いずれの本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体においても、天然GLP−1と比較して遜色ない十分な活性を保持していることが、EC50値からも示された。以上の結果は、本発明のGAモジュールの部分ペプチドを生理活性物質に付加した場合、その生理活性を保持したまま、高い生体内安定性を得ることができることを示している。
1.方法
生体内安定性の向上を、in vivoにおける血糖低下持続作用を指標にして評価した。すなわち、2型糖尿病モデルマウスであるdb/dbマウス(日本チャールスリバー)を個別飼育し、これに、各GLP-1ペプチド複合体を皮下投与し、その後の血糖値の持続的変化を検証した。尚、GLP-1ペプチド複合体は100μMに調製し、試験時まで-80℃で保存した。試験時に生理食塩水にて所定の濃度に希釈して使用した。薬物溶液は10ml/kgの容量で、いずれのGLP-1ペプチド複合体も50nmol/kgで皮下投与した。血糖値測定のための尾採血は、ヘパリン処理ガラス管を用いてGLP-1ペプチド複合体の投与直前および投与後の所定の時間(30分、1時間、2時間、4時間、6時間)に行った。血糖値の測定はグルコーステストワコー(和光純薬工業)を用いて行った。尚、本発明のGLP-1ペプチド複合体としては、実施例1、6、8、9、10、14、及び21のGLP-1ペプチド複合体を使用し、比較対照としては、比較例1の天然GLP-1及び比較例2の8S-GLP-1を使用した。
各GLP-1ペプチド複合体を皮下投与した後の随時血糖低下作用を図4および図5に示す。天然GLP-1(比較例1)および8S-GLP-1(比較例2)の血糖低下作用は、それぞれ投与後1時間および2時間で消失した。一方で、本発明のGAモジュールの部分ペプチドをそれぞれ付加したGLP-1ペプチド複合体の血糖低下作用は、投与後1時間で最大効果に達し、その後6時間以上持続することを確認した。以上の結果は、本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体は血糖低下作用の持続性が顕著に向上していることを示している。
これらの結果から、GLP-1への本発明のGAモジュールの部分ペプチドの付加は、十分な血糖低下強度を保持し、かつ、顕著に持続的な血糖低下作用を示すことが明らかとなった。また、このようなGLP-1やその他生理活性物質への本発明のGAモジュールの部分ペプチドの付加は、生体における急速な消失というこれら生理活性物質の医療応用上の課題を解決するのに有用と考えられた。
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてVIPを選択し、検証を行った。VIPのC末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、VIPペプチド複合体とした。VIPペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例25.VIP(1-28)-GAm(37-44)-NH2 配列番号60(GAm:配列番号4)
実施例26.VIP(1-28)-GAm(32-44)-NH2 配列番号61(GAm:配列番号9)
実施例27.VIP(1-28)-GAm(28-44)-NH2 配列番号62(GAm:配列番号13)
比較例14.VIP(1-28)-NH2 配列番号59
VIPペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。
1.方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/LになるようにVIP又はVIP-ペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、8、48時間後にサンプルを回収し、VIP又はVIPペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。VIP又はVIPペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、8時間後、48時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。
VIP又はVIPペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表7に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然VIP(比較例14)は、8時間後には血漿中で完全に分解されていたのに対して、GAモジュールの部分ペプチドを付加したVIPペプチド複合体(実施例25,26,27)は、8時間後のラット血漿中では全く分解されない状態で残存しており、48時間後においてもそれぞれ、118%,47%,35%まで残存していた。このことから、GLP-1と同様に本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加により、VIPペプチド複合体は著しく高い血漿安定性を獲得できることが明らかとなった。
試験例4において、血漿安定性が示されたVIPペプチド複合体の活性強度を評価するために、in vitroのcAMP産生能を解析した。
1.方法
内在性のVIPレセプターを発現する、ヒトT細胞由来のSUP-T1細胞(ATCCより購入)を用いて、細胞内cAMP産生能を評価した。48時間以上浮遊培養したSUP-T1をチューブに移し、培地(RPMI-1640)で細胞を2回洗浄した。その後、cAMPの分解酵素阻害剤であるIBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)を添加した培地を加え、15分37℃で静置した。遠心分離後に上清を除き、VIPペプチド複合体を含むIBMX含有培地を添加して30分37℃で反応した。反応後のチューブを遠心分離し、上清を除いて細胞溶解液を添加した。30分37℃で静置して細胞を溶解し、cAMPを測定してその産生能を評価した。cAMPの測定は酵素結合免疫固着アッセイ(ELISA)を用いて化学発光により検出した。
天然VIP(比較例14)とVIPペプチド複合体(実施例25,26,27)について、3,10,30,100,300,1000,3000nMの濃度で活性評価を行い、cAMP産生量の最大値を算出した。VIPペプチド複合体の活性強度(%)は以下の式により算出した。
活性強度(%)=[{(各VIPペプチド複合体のcAMP産生量の最大値)/(天然VIPのcAMP産生量の最大値)]x100
VIP又はVIPペプチド複合体について、cAMP産生能を解析した結果を、活性強度として表8に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然VIP(比較例14)に対し、VIPペプチド複合体(実施例25,26,27)の活性強度はそれぞれ、81%,85%,67%であり、GAモジュールの部分ペプチド付加でもVIP活性を保持することを確認した。これらの結果から、本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加は、著しく高い血漿安定性の獲得と生理活性の保持により、生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できることが判明した。
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてソマトスタチン(SRIF)を選択し、検証を行った。SRIFのC末端およびN末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、SRIFペプチド複合体とした。SRIFペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例28.SRIF(1-14)-GAm(28-44)-NH2 配列番号64(GAm:配列番号13)
実施例29.GAm(28-44)-SRIF(1-14)-NH2 配列番号65(GAm:配列番号13)
比較例15.SRIF(1-14)-NH2 配列番号63
ソマトスタチンペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。
1.方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるようにソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、8、48時間後にサンプルを回収し、ソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。ソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、8時間後、48時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。
各ソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表9に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然ソマトスタチン(比較例15)は、8時間後には血漿中で完全に分解されていたのに対して、C末およびN末にGAモジュールの部分ペプチドを付加したソマトスタチンペプチド複合体(実施例28及び29)は、8時間後のラット血漿中でも56%および80%残存しており、48時間後においてもN末付加体では、23%まで残存していた。このことから、GLP-1と同様に本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加により、ソマトスタチンペプチド複合体は著しく高い血漿安定性を獲得できることが明らかとなった。以上より、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、ソマトスタチンのような14残基の短いペプチドにも応用され、C末修飾だけでなく、N末修飾においても応用可能であることが判明した。また、ソマトスタチンはシステイン残基間において分子内架橋が存在することが報告されている。本試験の結果は、環状構造を有するペプチドにおいても、本発明のGAモジュールの部分ペプチドによる生体内安定性の改善が可能であることをも示している。
試験例6において、血漿安定性が示されたソマトスタチンペプチド複合体の活性強度を評価するために、in vitroのインスリン分泌抑制能を解析した。
1.方法
内在性のSSTR5を発現する、マウス由来のインスリノーマ細胞であるMIN6(宮崎純一氏より分与)を用いて、インスリン分泌抑制を評価した。MIN6をマルチプレートに播種し、48時間37℃で培養した。その後、2mMグルコース溶液を含むKRH緩衝液(NaCl 119mM,KCl 4.74mM,CaCl2 2.54mM,MgCl2 1.19mM,KH2PO4 1.19mM,10mMHEPES緩衝液pH7.3,0.1% BSAを含む)を用いて2回洗浄後、1時間37℃で静置した。上記の溶液を吸引除去後、ソマトスタチンペプチド複合体を含む20mMグルコース含有KRH緩衝液を添加し1時間37℃で静置し、その上澄みを回収しインスリン分泌量を測定した。インスリンの測定は酵素結合免疫固着アッセイ(ELISA)で行い、基質添加後450nm(副波長620nm)の吸光度を測定した。
尚、本試験では、天然SRIF(比較例15)とGAm(28-44)-SRIF-NH2(実施例29)について、1,3,10,30,100,300,1000nMの濃度で活性評価を行い、インスリン分泌の最大抑制率(%)を算出した。ソマトスタチンペプチド複合体のインスリン分泌の最大抑制率(%)は以下の式により算出した。
インスリン分泌の最大抑制率(%)=[{(SRIFペプチド複合体のインスリン分泌抑制の最大値)/(天然SRIFのインスリン分泌抑制の最大値)]x100
ソマトスタチンペプチド複合体について、インスリン分泌抑制率を解析した結果を、活性強度として表10に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然ソマトスタチン(比較例15)に対し、ソマトスタチンペプチド複合体(実施例29)のインスリン分泌抑制率は90%であり、GAモジュールの部分ペプチド付加でもソマトスタチン活性を保持することを確認した。これらの結果から、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、生理活性物質への付加により、生理活性物質の著しく高い血漿安定性の獲得と生理活性の保持を可能にし、生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できることが判明した。
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてアミリンを選択し、検証を行った。アミリンのN末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、アミリンペプチド複合体とした。アミリンペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例30.GAm(28-44)-Amylin(1-37)-NH2 配列番号67(GAm:配列番号13)
比較例16.Amylin(1-37)-NH2 配列番号66
アミリンペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。アミリン又はアミリンペプチド複合体を血漿中で一定時間処理した後に、未分解のアミリンペプチド(複合体)の変化量をHPLC/MSで測定し、評価した。
1.方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるようにアミリン又はアミリンペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、0.5、2、8時間後にサンプルを回収し、アミリン又はアミリンペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。アミリン又はアミリンペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、0.5、2、8時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。
アミリン又はアミリンペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表11に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然アミリン(比較例16)は、2時間後には血漿中で15%に分解されていたのに対して、N末にGAモジュールの部分ペプチドを付加したアミリンペプチド複合体(実施例30)は、2時間後において、67%まで残存していた。このことから、GLP-1と同様に本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加により、アミリンペプチド複合体は著しく高い血漿安定性を獲得できることが明らかとなった。以上より、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できる。
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてグレリン[(n-Octanoyl)Ghrelin]を選択し、検証を行った。グレリンのC末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、グレリンペプチド複合体とした。グレリンペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例31.Ghrelin(1-28)-GAm(28-44)-NH2 配列番号69(GAm:配列番号13)
比較例17.Ghrelin(1-28)-NH2 配列番号68
グレリンペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。グレリン又はグレリンペプチド複合体を血漿中で一定時間処理した後に、未分解のグレリン又はグレリンペプチド複合体の変化量をHPLC/MSで測定し、評価した。
1.方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるようにグレリン又はグレリン ペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、0.5、2、8時間後にサンプルを回収し、グレリン又はグレリンペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。グレリン又はグレリンペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、0.5、2、8時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。
グレリン又はグレリンペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表12に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然グレリン(比較例17)は、2時間後には血漿中で14%に分解されていたのに対して、C末にGAモジュールの部分ペプチドを付加したグレリンペプチド複合体(実施例31)は、2時間後においても49%残存していた。以上より、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、脂肪酸付加されたペプチドにおいても応用されることが示された。このことから生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できる。
Claims (14)
- アミノ酸配列Ile-Asp-Glu-Ile-Leuを含み、アミノ酸数が5〜25個である、GAモジュールの部分ペプチド。
- 前記GAモジュールが連鎖球菌G148に由来するGAモジュールである、請求項1に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
- アミノ酸数が5〜17個である、請求項1に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
- 式:Y22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y30-Y31-Y32-Y33-Y34-Y35-Y36-Y37-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46
[式中、Y22はLys又は欠失、Y23はAsn又は欠失、Y24はLeu又は欠失、Y25はIle又は欠失、Y26はAsn又は欠失、Y27はAsn又は欠失、Y28はAla又は欠失、Y29はLys又は欠失、Y30はThr又は欠失、Y31はVal又は欠失、Y32はGlu又は欠失、Y33はGly又は欠失、Y34はVal又は欠失、Y35はLys又は欠失、Y36はAla又は欠失、Y37はLeu又は欠失、Y43はAla又は欠失、Y44はAla又は欠失、Y45はLeu又は欠失、Y46はPro又は欠失を意味する。ただし、欠失は、Y22及び/又はY46からの連続的な欠失(Y22又はY46単独の欠失及びY22とY46の2箇所のみの欠失を含む)に限る。]
で示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のGAモジュールの部分ペプチド。 - 以下の群から選択される、請求項4に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(配列番号2)
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号3)
Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号4)
Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号5)
Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号6)
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala(配列番号7)
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号8)
Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号9)
Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号10)
Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(配列番号11)
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(配列番号12)
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(配列番号13)
Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro(配列番号14)
Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro(配列番号15)
Lys-Asn-Leu-Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro(配列番号16) - 配列番号1に示されたGAモジュールのアミノ酸の22位から38位のうち1つで始まり、アミノ酸42位から46位のうち1つで終わる、請求項1に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のGAモジュールの部分ペプチドと、生理活性物質が結合されてなる生理活性複合体。
- 前記生理活性物質が消化管ホルモン若しくはそれらの誘導体、又は、Exendin-4若しくはそれらの誘導体である、請求項7に記載の生理活性複合体。
- 前記消化管ホルモンが、GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、ソマトスタチン、アミリン、及びグレリンからなる群から選択される、請求項8に記載の生理活性複合体。
- リンカーを介して、前記GAモジュールの部分ペプチドと前記生理活性物質とが結合されてなる、請求項7に記載の生理活性複合体。
- 前記GLP-1又はその誘導体が、
式:His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45
[式中、X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、又はAibであり、X9は、Glu、Gly、Asp、又はLysであり、X16は、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X18は、Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X19は、Tyr、Phe、Trp、Glu、Gln、Asp、又はLysであり、X20は、Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr、又はLysであり、X22は、Gly、Ala、Glu、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Arg、Cys、又はAibであり、X23は、Gln、Arg、Glu、Asp、Asn、又はLysであり、X25は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、又はLysであり、X26は、Lys、Gln、Glu、Asp、His又はArgであり、X27は、Glu、Ala、Asp、Lys、又はLeuであり、X30は、Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Gln、Tyr、His、又はArgであり、X33は、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp又はLysであり、X34は、Lys、Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly、又はAsnであり、X35は、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro、又はAibであり、X36は、Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X37は、Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、Ile、Val、His又は欠失であり、X38は、Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X39は、Ser、Arg、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X40は、Gly、Glu、Lys、Asp、又は欠失であり、X41は、Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp又は欠失であり、X42は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X43は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X44は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X45は、Ser、Lys、Val、Glu、Asp、又は欠失である。]
で示されるアミノ酸配列からなりGLP-1活性を有するGLP-1又はGLP-1誘導体である、請求項9に記載の生理活性複合体。 - 前記GLP-1又はGLP-1誘導体が、GLP-1(7-37),[Ser8]-GLP-1(7-37),[Gly8]-GLP-1(7-37),[Val8]-GLP-1(7-37),[Glu22]-GLP-1(7-37),[Lys22]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22]-GLP-1(7-37),[Val8,Lys22]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu22]-GLP-1(7-37),[Gly8,Lys22]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu30]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu30]-GLP-1(7-37),[Val8,His37]-GLP-1(7-37),[Gly8,His37]-GLP-1(7-37),[Arg34]-GLP-1(7-37),[Lys18]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu22,Gly36]-GLP-1(7-37),[Aib8,Aib22]-GLP-1(7-37),[Aib8,Aib35]-GLP-1(7-37),[Aib8,Aib22,Aib35]-GLP-1(7-37),[Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37),[Gly8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Val25]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Ile33]-GLP-1(7-37),[Val8,Glu22,Val25,Ile33]-GLP-1(7-37)、及びこれらの37位が欠失したGLP-1(7-36)型、並びにこれらの36位と37位とが欠失したGLP-1(7-35)型からなる群より選択される、請求項11に記載の生理活性複合体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のGAモジュールの部分ペプチドを、生理活性物質に結合することを特徴とする、生理活性物質の生体内安定性を改善する方法。
- 前記生理活性物質がGLP-1又はその誘導体であり、前記GAモジュールの部分ペプチドをGLP-1又はその誘導体のC末端に結合することを特徴とする、請求項13に記載の方法。
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