CN104053452A - 用于抑制经由胰岛素样生长因子-1的细胞活化的方法 - Google Patents

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Abstract

抑制有其需要的个体（例如患有癌症、动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变或其他疾病的个体）中经由胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的细胞活化的方法，其包括向所述个体以有效抑制经由IGF-1的细胞活化的量施用抑制IAP与SHPS-1的结合的拮抗剂。还描述了用于实施此类方法的化合物和组合物。

Description

用于抑制经由胰岛素样生长因子-1的细胞活化的方法
优先权声明
本申请要求享有于2011年8月26日提交的美国申请序列号13/219,276的优先权，其完整内容通过引用并入本文。
政府支持的声明
本发明在来自美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的授权号AG02331下由政府支持进行。美国政府对本发明拥有某些权利。
发明领域
本发明涉及用于抑制有其需要的个体中的IGF-1活性的方法，所述有其需要的个体例如患有癌症、动脉粥样硬化、肾病和/或视网膜病变的个体。
发明背景
胰岛素样生长因子-I是一般性体细胞生长所必需的，即贯穿儿童期发生的正常生长和发育需要IGF-1。如果IGF-1基因从小鼠中缺失，则小鼠以正常大小的一半出生并且在出生后生长不良，达到正常成体大小的大约30%。因此，这种生长因子是对于所有已知细胞类型的重要丝裂原。
已出现对抑制细胞中的促有丝分裂的IGF-1活化的兴趣，因为已显示高浓度的IGF-1与癌症发生联系，而低浓度的IGF-1看起来是癌症防护性的。例如，Baserga等人的美国专利号6,340,674描述了通过使癌细胞与寡核苷酸接触来抑制癌细胞增殖的反义方法，所述寡核苷酸与IGF-1受体RNA区域基本上互补，并且其与IGF-1受体RNA特异性杂交。
此外，IGF-1在涉及异常细胞修复的几种疾病中的局部微环境中合成。这一类型的重要疾病是动脉粥样硬化，其为美国的首要死亡原因。动脉粥样硬化病变中的细胞合成过量IGF-1，并且因此过量IGF-1信号传递导致病变的扩大。几项研究已显示如果这种IGF-1的效应得到抑制，则病变进展迟缓。因此，在抑制血管壁细胞类型例如平滑肌细胞中的IGF-1作用中存在显著兴趣。
抑制IGF-1的常规方法例如阻断与IGF-1受体的配体结合由于两个原因已失败：首先，该结合部位是相当大的，并且因此难以设计将有效抑制结合的化合物；其次，在IGF-1受体和胰岛素受体之间存在显著结构重叠，并且由于胰岛素受体的共抑制，已尝试通过阻断受体活性来改变IGF-1受体活性的方法已始终导致毒性。反义技术提出将活性剂递送至靶细胞内部的问题。因此，存在关于抑制需要此类治疗的个体细胞中的IGF-1活性或产生的新方法的需要。
发明概述
本发明提供了抑制有其需要的个体[例如，患有下述疾病或处于患有下述疾病的增加风险中的个体：癌症、肿瘤、动脉粥样硬化、肾病（例如糖尿病肾病）和/或视网膜病变（例如糖尿病视网膜病变）]中经由胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的细胞活化的方法。该方法包括向个体以有效抑制经由IGF-1的细胞活化的量（例如有效治疗病况或病症的量或者治疗有效量）施用抑制IAP与SHPS-1的结合的拮抗剂。
本发明的一个方面是治疗个体（例如有其需要的个体）中的肿瘤的方法，其包括向个体以有效治疗肿瘤的量（例如有效抑制IGF-1对肿瘤的作用的量）施用IAP与SHPS-1结合拮抗剂（例如本发明的抗体）。本文还包括的是治疗个体（例如有其需要的个体）中的癌症的方法，其包括向个体施用有效量的IAP与SHPS-1结合拮抗剂（例如本发明的抗体）。可以根据本发明的方法治疗的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、成胶质细胞瘤和肝细胞癌。待治疗的肿瘤包括与任何上文列出的癌症相关的肿瘤以及表达IGF-1受体的任何肿瘤。
本发明的另一个方面是在通过向个体施用治疗有效量的抗肿瘤化合物（即化学治疗剂）和/或放射疗法来治疗有其需要的个体中的肿瘤的方法中的改进，该改进包括向个体以有效抑制IGF-1介导的肿瘤细胞援救的量（即抑制IGF-1对肿瘤细胞的抗凋亡作用）施用IAP与SHPS-1结合拮抗剂。
本发明的进一步方面是治疗有其需要的个体中的动脉粥样硬化的方法，其包括向个体以有效治疗动脉粥样硬化的量施用IAP与SHPS-1结合拮抗剂。可以治疗任何类型的动脉粥样硬化病变，例如冠状动脉、颈动脉和/或股动脉粥样硬化。一般而言，待治疗的动脉粥样硬化病变是其中病变细胞表达IGF-1受体的病变。
本发明的进一步方面是治疗有其需要的个体中的糖尿病肾病（例如糖尿病肾病）的方法，其包括向个体以有效治疗肾病的量施用IAP与SHPS-1结合拮抗剂。
本发明的进一步方面是治疗有其需要的个体中的视网膜病变（例如糖尿病视网膜病变）的方法，其包括向个体以有效治疗视网膜病变的量施用IAP与SHPS-1结合拮抗剂。
本发明的进一步方面是治疗有其需要的个体中的冠心病的方法，其包括向个体以有效治疗冠心病的量施用IAP与SHPS-1结合拮抗剂。
可以在实施本文描述的方法中使用的拮抗剂，有时在本文中被称为活性剂，可以具有任何合适类型，包括蛋白质或肽，例如抗体或其抗原结合片段。可以用于实施本发明的拮抗剂的特定实例包括但不限于拮抗IAP与SHPS-1结合的抗体，包含IAP结合结构域、由IAP结合结构域组成或基本上由IAP结合结构域组成的SHPS-1片段，包含SHPS-1结合结构域、由SHPS-1结合结构域组成或基本上由SHPS-1结合结构域组成的IAP片段，其类似物和/或其非肽模拟物或类似物。在本发明的一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体B6H12。
本发明的进一步方面是包含在药学上可接受的载体中的活性剂（例如如本文描述的抗体或其抗原结合片段的药物制剂。
本发明的进一步方面是如本文描述的活性剂用于制造用于实施如本文描述的治疗方法的药剂的用途。
本发明的进一步方面是就下述中的活性筛选化合物的体外方法：（ i ）抑制经由胰岛素样生长因子-I的细胞活化（例如，抑制经由IGF-1的细胞生长，（ ii ）治疗癌症或肿瘤（如上所述），和/或（ iii ）治疗动脉粥样硬化（如上所述），该方法包括步骤：（a）将测试化合物加入体外系统或使测试化合物与体外系统接触，所述体外系统包含SHPS-1蛋白质和IAP蛋白质；随后（b）测定测试化合物是否是IAP与SHPS-1结合的拮抗剂；并且随后（c）当测试化合物是IAP与SHPS-1结合的拮抗剂时，将测试化合物鉴定为在下述中是有活性或潜在有活性的：（ i ）抑制经由胰岛素样生长因子-1的细胞活化，（ ii ）治疗癌症或肿瘤，和/或（ iii ）治疗动脉粥样硬化。
本发明还提供了单克隆抗体，其特异性结合在人IAP蛋白质（氨基酸编号基于SEQ ID NO:7的氨基酸序列）的氨基酸71-80（即肽ALNKSTVPTD，SEQ ID NO:6）内的表位，并且是IAP与SHPS-1结合的拮抗剂。该抗体的进一步特征是它不破坏IAP与β3蛋白质的结合。关于人IAP的氨基酸编号基于GenBank®数据库登记号NP_942088（通过引用并入本文）的参考氨基酸序列，并且如下，其中第一个氨基酸编号1，并且最后一个氨基酸编号305。氨基酸残基71-80在下文序列中是粗体。
上文描述的单克隆抗体可以是由杂交瘤NPG-1产生的单克隆抗体，或竞争结合与由通过所述杂交瘤NPG-1产生的单克隆抗体结合的表位相同的表位的单克隆抗体。杂交瘤NPG-1于2012年8月17日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC；Manassas，VA），并且指定登记号PTA-13161。
本文另外提供的是抑制有其需要的个体中的IGF-1作用的方法，其包括向个体施用本发明的抗体或其抗原结合片段。
进一步提供的是治疗个体（例如有其需要的个体）中的糖尿病视网膜病变、糖尿病动脉粥样硬化、糖尿病肾病和/或冠心病的方法，其包括向个体施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在此类方法中，在一些实施方案中，抗体可以通过皮下注射和/或静脉内输注进行施用。
附图简述
图1A-C. IAP与SHPS-1的共沉淀且用抗IAP抗体B6H12破坏。A. 将细胞裂解产物用抗IAP抗体免疫沉淀，并且通过用抗SHPS-1抗血清免疫印迹测定SHPS-1的共沉淀，或用SHPS-1免疫沉淀，并且通过用抗IAP抗体免疫印迹测定IAP的共沉淀。作为对照，细胞裂解产物还用无关多克隆抗体（IgG）免疫沉淀，并且用抗IAP抗体免疫印迹。B. 将休眠pSMC温育两小时±抗IAP单克隆抗体B6H12，或无关对照单克隆抗体的添加（两者均以4 µg/ml）。随后通过用SHPS-1抗体免疫沉淀且用抗IAP抗体免疫印迹来测定IAP与SHPS-1的共沉淀。每个泳道中的SHPS-1蛋白质的量显示于下图中。C. FLAG标记的IAP的表达和与SHPS-1的结合。上图：FLAG标记的IAP的表达通过使用抗FLAG抗体免疫印迹来自细胞的全细胞裂解产物进行测定，所述细胞用IAP cDNA构建体中的每一种转染。作为扫描单位的结果是：泳道1:38018、泳道2:39274、泳道3:46779。下图：细胞裂解产物用抗SHPS-1抗体免疫沉淀，随后通过用抗FLAG抗体免疫印迹测定FLAG标记的IAP的共沉淀。在每个泳道中免疫沉淀的SHPS-1量显示于下图中。
图2A-C. A. 在通过抗IAP抗体B6H12破坏IAP和SHPS-1之间的结合后，响应IGF-1的SHPS-1磷酸化和向SHPS-1的SHP-2募集。将休眠细胞温育两小时± B6H12抗体或无关对照单克隆抗体（两者均以4 µg/ml），随后如所示的暴露于IGF-1（100 ng/ml）。细胞裂解产物用抗SHPS-1抗体免疫沉淀，随后通过用抗磷酸酪氨酸抗体（p-Tyr）免疫印迹测定SHPS-1的磷酸化。SHP-2与SHPS-1的结合通过使用抗SHP-2抗体免疫印迹进行显现。每个泳道中的SHPS-1蛋白质的量显示于下图中。显示了如通过来自三次分开实验的蛋白质免疫印迹的扫描光密度法分析测定的，在IGF-1刺激后的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集中的增加。当与B6H12预温育的细胞与在单独的SFM中预温育的细胞相比较时，** p <0.05。B 在表达突变型IAP的细胞中IAP和SHPS-1之间的结合破坏后，响应IGF-1的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集。使细胞暴露于IGF-1（100 ng/ml）不同时期。细胞裂解产物用抗SHPS-1抗体免疫沉淀，并且通过用抗磷酸酪氨酸抗体（pTyr）免疫印迹测定SHPS-1的磷酸化。SHP-2的结合通过使用抗SHP-2抗体免疫印迹进行显现。每个泳道中的SHPS-1蛋白质的量显示于下图中。显示了如通过来自三次分开实验的蛋白质免疫印迹的扫描光密度法分析测定的，在IGF-1刺激后的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集中的增加。当表达突变型IAP的细胞与表达IAP fl的细胞相比较时，** p <0.05。C. 响应PDGF的SHPS-1磷酸化。使细胞暴露于PDGF（10 ng/ml）5分钟。在细胞裂解和用抗SHPS-1抗体免疫沉淀后，通过用抗磷酸酪氨酸抗体（pTyr）免疫印迹测定SHPS-1磷酸化。
图3A-B. 在IAP和SHPS-1之间的相互作用破坏后，IGF-1R磷酸化时间过程和SHP-2募集。A. 将休眠细胞温育±抗IAP抗体B6H12（4 µg/ml），随后暴露于IGF-1（100 ng/ml）不同时间长度。在裂解和用抗IGF-1R抗体免疫沉淀后，通过用抗磷酸酪氨酸抗体（pTyr）免疫印迹测定受体的磷酸化。SHP-2的结合通过用抗SHP-2抗体免疫印迹进行测定。每个泳道中的IGF-1R蛋白质的量显示于下图中。显示了如通过来自三次分开实验的蛋白质免疫印迹的扫描光密度法分析测定的，作为检测到的最大磷酸化百分比的IGF-1R的酪氨酸磷酸化水平。还显示了如通过来自三次分开实验的蛋白质免疫印迹的扫描光密度法分析测定的，在IGF-1刺激后的SHP-2募集中的增加。当与B6H12预温育的细胞与在单独的SFM中预温育的细胞相比较时，** p <0.05。B 使细胞与IGF-1（100 ng/ml）一起温育不同时间。在裂解和用抗IGF-1R抗体免疫沉淀后，通过用抗磷酸酪氨酸抗体（pTyr）免疫印迹测定受体的磷酸化。SHP-2的结合通过用抗SHP-2抗体免疫印迹进行测定。每个泳道中的IGF-1R蛋白质的量显示于下图中。显示了如通过来自三次分开实验的蛋白质免疫印迹的扫描光密度法分析测定的，在IGF-1刺激后的IGF-1R磷酸化和SHP-2募集中的改变。当表达IAPc-s的细胞与表达IAP fl的细胞相比较时，** p <0.05。
图4A-B. A. 响应IGF-1的MAPK磷酸化。在2小时温育± 抗IAP抗体B6H12抗体或无关对照单克隆抗体（两者均以4 µg/ml）前，将细胞铺平板且生长，并且随后用IGF-1（100 ng/ml）处理10分钟。通过用磷酸特异性MAPK抗体免疫印迹测定p42/44 MAPK磷酸化水平。通过用MAPK抗体免疫印迹测定每种样品中的MAPK总量。B. 在2小时温育±B6H12或无关对照单克隆抗体（两者均以4 µg/ml的浓度）前，将细胞铺平板且生长，并且随后用IGF-I（100 ng/ml）处理48小时。随后测定每个孔中的细胞数目。每个数据点代表三次独立实验的平均值。当在B6H12的存在下温育的培养物中的细胞数目与在不存在抗体的情况下温育的培养物中的细胞数目相比较时，**p = < 0.05。
图5. IGF-1在表达全长IAP和IAP C-S的细胞中刺激细胞迁移。使汇合细胞受伤并且随后温育± IGF-1（100 ng/ml）共48小时。计数在至少5个预选择的区中迁移跨越创伤边缘的细胞数目。每个数据点代表三次独立实验的平均值± S.E.M.。当在IGF-1的存在下的迁移与在单独的SFM中的温育相比较时，** p <0.05。
图6A-D. 使人内皮细胞暴露于抗IAP抗体，并且用抗SHPS-1免疫沉淀裂解产物且随后就IAP或Shc进行免疫印迹。A. 单克隆抗体NPG-1可以破坏IAP与SHPS-1的结合。使细胞与NPG-1预温育，并且随后将SHPS-1免疫沉淀且就IAP免疫印迹免疫沉淀物。B. 如果细胞与NPG-1抗体一起预温育，则必须与内皮细胞中待活化的SHPS-1结合的Shc通常不结合。C. NPG-1抗体特异性破坏IAP与SHPS-1的结合，而不破坏IAP与β3的结合。D. SHPS-1与IAP结合在来自对照大鼠（Con）、糖尿病大鼠（D）和用抗IAP抗体处理的糖尿病大鼠（R569）（D + AB）的主动脉匀浆物中进行测定。
图7A-C. 毛细血管形成的体外测定。A. 基于蓝色葡聚糖透过在体外测量的细胞通透性。IGF-1刺激透过并且这在NPG-1抗体（IAPab）的存在下得到抑制。B. 允许内皮细胞形成通透性屏障的紧密连接蛋白质闭锁蛋白（occludin）在IGF-1的存在下被破坏，导致闭锁蛋白离开通常形成的连接复合物，并且扩散到细胞内。在NPG-1抗体的存在下，IGF-1的这种效应被完全抑制。C. 内皮细胞管形成的显微照片。在IGF-1处理的细胞中，可见管形成（右上图），其中毛细血管细胞由毛细管彼此连接。在NPG-1抗体的存在下，如下面两个小图和在其中显示管数目/ cm2的条形图上所示，这被完全破坏。
图8A-B. 大鼠内皮细胞在25mM葡萄糖中进行培养。在SFM细胞中过夜后连同（AB）或不连同（Con）抗IAP抗体（R569）一起温育，使用大鼠IAP序列NKNSTTREQN（SEQ ID NO:8）制备，其为大鼠IAP序列的氨基酸71-80；编号基于NCBI参考序列登记号NP_062068的氨基酸序列
。对于抗体生产，这个序列根据已知方法与KLH连接作为免疫原。A. 对照抗体对IAP/SHPS-1结合没有作用，而抗大鼠IAP抗体完全破坏这种结合。B. 在IGF-1刺激后，存在SHPS-1的酪氨酸磷酸化、AKT的刺激和MAPK活化。这些在抗大鼠IAP抗体的存在下被抑制。
图9. 血管通透性。非糖尿病大鼠作为对照显示（N=5）。糖尿病大鼠用对照IgG（N=12）或通过蛋白A琼脂糖层析由抗血清纯化的IgG进行处理，所述抗血清含有本文描述的抗大鼠IAP抗体（N=14）。在三周后，将动物麻醉且随后测量血管通透性。抗大鼠IAP IgG显著抑制视网膜静脉血管通透性，其为在糖尿病视网膜病变中发生的首批改变之一。
发明详述
本发明在下文更详细地说明。这个说明书并不旨在是其中可以实现本发明的所有不同方法，或可以添加到本发明中的所有特点的详细目录。例如，就一个实施方案而言举例说明的特点可以掺入其他实施方案内，并且就特定实施方案而言举例说明的特点可以从该实施方案中删除。此外，对本文建议的多个实施方案的众多变化和添加在本公开内容的教导下对于本领域技术人员将是显而易见的，其不会背离本发明。因此，以下详述旨在举例说明本发明的一些特定实施方案，而不是详尽说明其所有排列、组合和变化。
可以通过本发明治疗的个体包括用于医学目的的人个体和用于兽医学以及药物筛选和开发目的的动物个体。一般而言，其他合适的动物个体是哺乳动物个体例如人、灵长类动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、犬、兔类动物、啮齿类动物（例如大鼠和小鼠）等。人个体是最优选的。人个体包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成年个体。
如本文使用的“IGF-1”意指胰岛素样生长因子-1。
如本文使用的“IGF-1R”意指IGF-1受体。
如本文使用的“IAP”意指整联蛋白相关蛋白质。IAP可以具有任何类型，但优选是哺乳动物IAP（例如人、小鼠、大鼠、兔、猴、猪等），并且最优选是人IAP。IAP（有时也称为CD47）是已知的，并且在例如下述中描述：E. Brown等人J Cell Biol 111:2785-94（1990）；C. Rosales等人J Immunol 149:2759-64（1992）；D. Cooper等人Proc Natl Acad Sci USA 92:3978-82（1995）；P. Jiang等人J Biol Chem 274:559-62（1999）；P. Oldenborg等人Science 288:2051-4（2000）；M. Seiffert等人Blood 94:3633-43（1999）；E. Vernon-Wilson等人Eur J Immunol 30:2130-2137（2000）；H. Yoshida等人J Immunol 168:3213-20（2002）；和I. Babic等人J Immunol 164:3652-8（2000）。
如本文使用的“SHPS-1”意指含有src同源区2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶底物1。SHPS-1可以具有任何类型，但优选是哺乳动物SHPS-1（例如人、小鼠、大鼠、兔、猴、猪等），并且最优选是人SHPS-1。SHPS-1（有时也称为P84）是已知的，并且在例如下述中描述：T. Noguchi等人，J Biol Chem 271，27652-8（1996）；Y. Fujioka等人，Mol Cell Biol 16，6887-99（1996）；A. Kharitonenkov等人，Nature 386，181-6（1997）；M. Stofega等人，J Biol Chem 273，7112-7（1998）；和T. Takada等人，J Biol Chem 273，9234-42（1998）。
如本文使用的“SHP-2”意指含有src同源区2的蛋白质酪氨酸磷酸酶-2。
如本文使用的“治疗（Treat）”、“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”指对个体赋予利益的任何类型的活动，所述个体患有疾病或病症或者处于发生疾病或病症的风险中，所述利益包括个体病况中（例如一种或多种症状中）的改善，疾病进展中的延迟，症状发作中的延迟和/或症状进展的减慢等。像这样，在一些实施方案中，术语“治疗（treating）”可以包括个体的预防治疗，以防止症状的发作。如本文使用的，术语“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”不必意欲暗示症状的治愈或完全取消。
如本文使用的“治疗有效量”、“有效治疗的量”、“有效量”等等意指足以对个体产生希望和/或有益作用的拮抗剂（例如抗体或其抗原结合片段）的量，所述个体患有癌症、肿瘤、动脉粥样硬化、视网膜病变、肾病或其中IGF-1诱导异常细胞生长的其他不希望有的医学病况。这包括患者病况中（例如一种或多种症状中）中的改善，疾病进展中的延迟等。
如本文使用的“药学上可接受的”意指化合物或组合物适合于按照疾病或病症的严重性和治疗的必要性施用于个体，以实现如本文描述的有益和/或治疗有效结果，而无过度的有害副作用。
申请人特别旨在本文引用的所有专利、专利公开、国际专利公开和非专利参考文献均以其整体通过引用并入本文。
A. 抗体。
如本文使用的术语“抗体”指免疫球蛋白的所有类型，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。术语“免疫球蛋白”包括这些免疫球蛋白的亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。在这些免疫球蛋白中，IgM和IgG是优选的，并且IgG是特别优选的。抗体可以具有任何物种的起源，包括（例如）小鼠、大鼠、兔、马或人，并且可以是嵌合抗体。参见例如，M. Walker等人Molec. Immunol. 26，403-11（1989）。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。此类抗体依照已知技术产生。如本文使用的术语“抗体”还包括保留与靶抗原结合的能力的抗体片段（例如其抗原结合片段，例如Fab、F（ab´）2和Fv片段，和得自除IgG外的抗体的相应片段。此类片段也通过已知技术产生。
在本发明的范围内包括的抗体片段包括例如Fab、Fab'、F（ab'）2和Fv片段；域抗体、双抗体；疫苗体、线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。此类片段可以通过已知技术产生。例如，F（ab´）2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，并且Fab片段可以通过还原F（ab´）2片段的二硫键生成。或者，可以构建Fab表达文库，以允许具有所需特异性的单克隆Fab片段的快速和简单鉴定（Huse等人Science 254:1275（1989））。
单克隆抗体可以是根据例如Reading的美国专利号4,474,893，或Cabilly等人的美国专利号4,816,567中公开的方法产生的重组单克隆抗体。抗体还可以通过根据Segel等人的美国专利号4,676,980中公开的方法制备的特异性抗体进行化学构建。
单克隆Fab片段可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌（Escherichia coli）中产生。参见例如，W. Huse，Science 246:1275-81（1989）。
用于本发明的抗体以相对高的结合亲和力与其靶特异性结合，例如具有约10-6或10-8，最高达10-12或10-13的解离常数。
其为IAP与SHPS-1结合的拮抗剂的人源化单克隆抗体是本发明的进一步方面。本发明的人源化抗体可以通过任何合适技术由如本文描述的抗体产生，使用如例如EPO公开号0239400以及美国专利号6,407,213；6,180,370；和5,693,762中公开的常规互补决定区（CDR）移植方法，其全部均以其整体通过引用并入本文。或者，人源化抗体可以通过下述产生：直接修饰抗体可变区，而不缩小结构域对于抗原的天然亲和力，同时降低其关于异源物种的免疫原性（参见例如，以其整体通过引用并入本文的美国专利号5,766,886）。
使用CDR移植方法，人源化抗体一般通过组合人构架区（FR）与来自非人（通常为小鼠或大鼠）免疫球蛋白的一个或多个CDR来产生，所述非人免疫球蛋白能够与预定抗原结合。
通常，人源化抗体包含基本上全部至少一个且通常两个可变结构域（Fab、Fab'、F（ab'）2、Fabc、Fv），其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的。通常，抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，恒定结构域是补体固定恒定结构域，其中希望人源化抗体显示出细胞毒性活性，并且种类通常为IgG1。当此类细胞毒性活性是不希望的时，恒定结构域可以具有IgG2种类。人源化抗体可以包含来自超过一个种类或同种型的序列，并且选择特定恒定结构域以优化所需效应子功能在本领域的普通技术内。
人源化抗体的FR和CDR无需精确对应于亲本序列。至少约75%的人源化抗体残基可以对应于亲本FR和CDR序列的那些，在一些实施方案中，约90%，并且在一些实施方案中，大于约95%。
本发明的抗体可以改变或突变用于与除在其中产生抗体的物种外的物种的相容性。例如，抗体可以是人源化或骆驼化（camelized）的。人源化形式的非人（例如鼠）抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（例如Fv、Fab、Fab'、F（ab'）2或抗体的其他抗原结合子序列），其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白（受者抗体(recipient antibody)），其中来自受者的互补决定区（CDR）的残基替换为来自非人物种（供者抗体(donor antibody)）（例如小鼠、大鼠或兔）的CDR的具有所需特异性、亲和力和能力的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基替换为相应的非人残基。人源化抗体还可以包含在受者抗体和输入CDR或构架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个且通常两个可变结构域，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且构架（FR）区（即，CDR区之间的序列）的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的（Jones等人，Nature 321:522（1986）；Riechmann等人，Nature ， 332:323（1988）；和Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593（1992））。
用于人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。一般地，人源化抗体具有从非人来源引入其内的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，人源化可以基本上根据Winter和同事的方法实施（Jones等人，Nature 321:522（1986）；Riechmann等人，Nature 332:323（1988）；Verhoeyen等人，Science 239:1534（1988））。相应地，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（美国专利号4,816,567），其中基本上小于一个完整的人可变结构域已由来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为这样的人抗体，其中一些CDR残基（例如CDR的全部或其部分）和可能的一些FR残基由来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基取代。
人抗体还可以使用本领域已知的多种技术产生，包括噬菌体展示文库（Hoogenboom和Winter，J. Mol. Biol. 227:381（1991）；Marks等人，J. Mol. Biol. 222:581（1991））。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体（Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第77页（1985）和Boerner等人，J. Immunol. 147:86（1991））。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物内进行制备，所述转基因动物例如其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠。在攻击后，观察到人抗体产生，其在所有方面紧密类似于在人中可见的，包括基因重排、装配和抗体谱。这种方法例如在美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和下述科学出版物中描述：Marks等人，Bio/Technology 10:779（1992）；Lonberg等人，Nature 368:856（1994）；Morrison，Nature 368:812（1994）；Fishwild等人，Nature Biotechnol. 14:845（1996）；Neuberger，Nature Biotechnol. 14:826（1996）；Lonberg和Huszar，Intern. Rev. Immunol. 13:65（1995）。
用于实施本发明的多克隆抗体可以依照已知程序通过下述产生：用抗原（针对靶的单克隆抗体与之结合）免疫合适动物（例如兔、山羊等），收集来自动物的免疫血清，且从免疫血清中分离多克隆抗体。
用于实施本发明的单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein，Nature 265:495（1975）的技术在杂交瘤细胞系中产生。例如，含有适当抗原的溶液可以注射到小鼠内，并且在足够时间后，将小鼠处死且获得脾细胞。脾细胞随后通常在聚乙二醇的存在下，通过使其与骨髓瘤细胞或与淋巴瘤细胞融合进行永生化，以产生杂交瘤细胞。杂交瘤细胞随后在合适培养基中生长，并且在上清液中筛选具有所需特异性的单克隆抗体。单克隆Fab片段可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌中产生。参见例如，Huse，Science 246:1275（1989）。
对于靶多肽特异性的抗体还可以通过本领域已知的噬菌体展示技术获得。
单克隆抗体可以是依照已知技术产生的嵌合或“人源化”抗体。例如，嵌合单克隆抗体可以是依照已知技术产生的互补决定区-移植抗体（或“CDR移植抗体”）。
本发明的抗体的实例是单克隆抗体B6H12（例如指定ATCC登记号HB-9771的B6H12.2）。
本发明还提供了单克隆抗体，其特异性结合在人IAP蛋白质（编号基于SEQ ID NO:7的氨基酸序列）的氨基酸71-80内的表位，并且是IAP与SHPS-1结合的拮抗剂。例如，抗体可以结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸
或78-80的表位。
本发明另外提供了由杂交瘤NPG-1产生并且在本文中被称为单克隆抗体NPG-1的单克隆抗体。这种杂交瘤根据如本领域众所周知的用于单克隆抗体生产的标准方案产生。施用于小鼠的免疫原是肽ALNKSTVPTDC（SEQ ID NO:10），其代表如本文提供的人IAP氨基酸序列的氨基酸残基71-80（编号基于SEQ ID NO:7的氨基酸序列）（即ALNKSTVPTD，SEQ ID NO:6），具有在羧基末端处添加的半胱氨酸残基，其用于使肽与匙孔槭血蓝蛋白（KLH）连接。因此，实际免疫原是通过半胱氨酸连接的活性肽和KLH的缀合物。将小鼠免疫接种且随后收获脾用于与骨髓瘤细胞融合。使用与BSA连接的免疫原包被板，通过ELISA筛选骨髓瘤细胞上清液。随后在选择产生高亲和力抗体的最终克隆前，将阳性上清液再分开克隆四次。关于人IAP的氨基酸编号基于GenBank®数据库登记号NP_942088（通过引用并入本文）的参考氨基酸序列，并且如下，其中第一个氨基酸编号1，并且最后一个氨基酸编号305。氨基酸残基71-80在下文序列中是粗体。
在一些实施方案中，抗体是（a）由杂交瘤NPG-1产生的单克隆抗体，或（b）竞争结合与由通过所述杂交瘤NPG-1产生的单克隆抗体结合的表位相同的表位的单克隆抗体（即特异性结合由通过杂交瘤NPG-1产生的单克隆抗体结合的表位的单克隆抗体）。
杂交瘤NPG-1于2012年8月17日由美国典型培养物保藏中心保藏于Manassas，Virginia，并且指定登记号PTA-13161。这种杂交瘤产生如本文描述的本发明的抗体。
单克隆抗体NPG-1与人IAP蛋白质结合且破坏IAP与SHPS-1的结合，而不破坏IAP与β3蛋白质的结合。β3整联蛋白亚基是αvβ3整联蛋白的组分。它在血管内皮细胞的表面上丰富表达。破坏αvβ3整联蛋白功能的试剂已显示导致内皮细胞功能中的改变以及内皮细胞生长的抑制。此外，因为这种整联蛋白亚基在血小板上表达，所以已显示抑制其在血小板中的功能的试剂已显示刺激血小板聚集，这可以导致血栓形成。这是这种单克隆抗体的重要区别特点。与人IAP反应的许多抗体还与αvβ3整联蛋白结合。破坏IAP与β3的结合可以导致副作用，使得此类抗体的治疗用途是不希望的。NPG-1抗体具有出乎意料的益处：与人IAP结合且破坏其与SHPS-1的结合，而不破坏IAP与β3的结合。
本文进一步提供的是人源化单克隆抗体NPG-1。人源化形式的抗体可以使用体外诱变进行制备。互补决定区（CDR）保持完整，除非必须改变这些区的单个氨基酸，以避免或最小化免疫原性。类似地，构架区就可能赋予免疫原性的区域进行扫描，并且将适当的小鼠氨基酸残基改变为人氨基酸残基。随后使用由来自20种HLA单倍型每一种的人HLA供体制备的淋巴细胞，测定整个抗体的免疫原性。
多种免疫测定可以用于筛选，以鉴定对于本发明的多肽具有所需特异性的抗体。竞争结合或者使用具有确定特异性的多克隆或单克隆抗体的免疫放射测定的众多方案是本领域众所周知的。此类免疫测定通常涉及抗原及其特异性抗体之间的复合物形成（例如抗原/抗体复合物形成）的测量。可以使用双位点、基于单克隆的免疫测定以及竞争结合测定，所述免疫测定利用与本发明的多肽或肽上的两个非干扰表位反应的单克隆抗体。
抗体可以依照已知技术缀合至固体载体（例如由诸如胶乳或聚苯乙烯的材料形成的珠、板、载玻片或孔）。抗体可以同样依照已知技术缀合至可检测基团，例如放射性标记（例如35S、125I、131I）、酶标记（例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）和荧光标记（例如荧光素）。如本领域众所周知的，在本发明的方法中抗体/抗原复合物形成的测定可以是通过例如沉淀、凝集、絮凝、放射性、显色或变色、荧光、发光等的检测。
在多个实施方案中，本发明的抗体是与IAP特异性结合的抗体或其片段（例如单克隆抗体）。在一些实施方案中，本发明的抗体是与SHPS-1特异性结合的抗体或其片段（例如单克隆抗体）。
在一个实施方案中，抗体是由杂交瘤细胞系NPG-1（ATCC保藏号PTA-13161；于2012年8月17日保藏）产生的单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体是单克隆抗体或其片段，其竞争结合由通过杂交瘤细胞系NPG-1（ATCC保藏号PTA-13161；于2012年8月17日保藏）产生的单克隆抗体特异性结合的相同表位。在另一个实施方案中，抗体是单克隆抗体或其片段，其特异性结合由通过杂交瘤细胞系NPG-1（ATCC保藏号PTA-13161；于2012年8月17日保藏）产生的单克隆抗体特异性结合的相同表位。在某些实施方案中，单克隆抗体或其片段是嵌合抗体或人源化抗体。在另外的实施方案中，嵌合或人源化抗体包含NPG-1（ATCC保藏号PTA-13161；于2012年8月17日保藏）的至少一部分。如本文使用的，CDR的“部分”定义为来自构成CDR（例如来自CDR的1-6）的轻链和重链每一个的三个环中的一个或多个，或包含至少三个邻接氨基酸、基本上由至少三个邻接氨基酸组成或由至少三个邻接氨基酸组成的环的一个或多个部分。例如，嵌合或人源化抗体可以包含1、2、3、4、5或6个CDR环，1、2、3、4、5或6个CDR环的部分，或其混合物。
B. 蛋白质/肽拮抗剂及其他拮抗剂。
IAP的氨基末端Ig结构域和SHPS-1的胞外Ig可变结构域对于其物理相互作用是足够的，并且这些区可以充当IAP与SHPS-1结合的蛋白质或肽拮抗剂。因此，本发明的进一步方面是活性剂，其为包含IAP的SHPS-1结合结构域（例如IAP片段；IAP的氨基末端Ig结构域）、由其组成或基本上由其组成的蛋白质或肽。具体实例包括但不限于由小鼠IAP的氨基酸1-140组成的多肽；由小鼠IAP的氨基酸1-135组成的多肽；由小鼠IAP的氨基酸5-135组成的多肽；由小鼠IAP的氨基酸5-95组成的多肽；由小鼠IAP的氨基酸19-95组成的多肽；由小鼠IAP的氨基酸1-140组成的多肽；由大鼠IAP的氨基酸1-135组成的多肽；由大鼠IAP的氨基酸5-135组成的多肽；由大鼠IAP的氨基酸5-95组成的肽；由大鼠IAP的氨基酸19-95组成的多肽；由人IAP的氨基酸1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-135和/或1-140组成的肽；由人IAP的氨基酸5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-60、5-70、5-80、5-95、5-100、5-110、5-120和/或5-135组成的肽；由人IAP的10-20、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-60、10-70、10-80、10-95、10-100、10-110、10-120和/或10-135组成的肽；由人IAP的氨基酸19-30、19-35、19-40、19-45、19-50、19-60、19-70、19-80、19-95、19-100、19-110、19-120和/或19-135组成的肽，和由人IAP的氨基酸30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-60、50-70、50-60、60-70、60-80、70-80、80-90、70-90、50-80、50-90和/或50-100组成的肽。本文还提供的是本发明的抗体，其特异性结合本文描述的任何IAP肽和/或在任何IAP肽内的表位。
小鼠、人和大鼠IAP如上所述均为已知的，并且本文编号指对全长蛋白质中的氨基酸残基指定的标准编号。关于人IAP的氨基酸编号基于GenBank®数据库登记号NP_942088（通过引用并入本文）的参考氨基酸序列，并且如下，其中第一个氨基酸编号1，并且最后一个氨基酸编号305：
在一些实施方案中，IAP肽可以包含下述、基本上由下述组成或由下述组成：具有氨基酸序列FVTNMEAQNTTEVYKWK（aa 42-59，SEQ ID NO:11）的肽、具有氨基酸序列KWKFKGRDIYTFDGALNK（aa 57-74，SEQ ID NO:12）的肽、具有氨基酸序列STVPTDFSSAKIEVSQLLKGD（aa 75-95，SEQ ID NO:13）的肽、具有氨基酸序列YTFDGALNKSTVPTDFS（aa 66-92，SEQ ID NO:14）的肽及其任何组合。
本发明的还进一步方面是活性剂，其为包含SHPS-1的IAP结合结构域（例如SHPS-1片段；SHPS-1的胞外Ig可变结构域）、由其组成或基本上由其组成的蛋白质或肽。
具体实例包括但不限于由小鼠SHPS-1的氨基酸1-160组成的多肽；由小鼠SHPS-1的氨基酸5-150组成的多肽；由小鼠SHPS-1的氨基酸29-150组成的多肽；由大鼠SHPS-1的氨基酸1-160组成的多肽；由大鼠SHPS-1的氨基酸5-150组成的多肽；由大鼠SHPS-1的氨基酸29-150组成的多肽；由人SHPS-1的氨基酸1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-135和/或1-140组成的肽；由人SHPS-1的氨基酸5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-60、5-70、5-80、5-95、5-100、5-110、5-120和/或5-135组成的肽；由人SHPS-1的10-20、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-60、10-70、10-80、10-95、10-100、10-110、10-120和/或10-135组成的肽；由人SHPS-1的氨基酸19-30、19-35、19-40、19-45、19-50、19-60、19-70、19-80、19-95、19-100、19-110、19-120和/或19-135组成的肽；由人SHPS-1的氨基酸30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-60、50-70、50-80、50-90和/或50-100组成的肽，和由人SHPS-1的氨基酸100-120、100-130、100-140、100-150、120-140、120-130、120-150、130-140和/或130-150组成的肽。本文还提供的是本发明的抗体，其特异性结合本文描述的任何SHPS-1肽和/或在任何SHPS-1肽内的表位。
小鼠、人和大鼠SHPS-1如上所述均为已知的，并且本文编号指对全长蛋白质中的氨基酸残基指定的标准编号。关于人SHPS-1的氨基酸编号基于GenBank®数据库登记号BAA12974（通过引用并入本文）的参考氨基酸序列，并且如下，其中第一个氨基酸编号1，并且最后一个氨基酸编号503：
。
在一些实施方案中，SHPS-1肽可以包含下述、基本上由下述组成或由下述组成：具有氨基酸序列RELIYNQKEGHFPRVTTVS（aa76-93，SEQ ID NO:16）的肽、具有氨基酸序列VTSLIPVGPIQWFRG（aa57-71，SEQ ID NO:17）的肽、具有氨基酸序列VKFRKGSP（aa 122-129，SEQ ID NO:18）的肽及其任何组合。
可以充当活性剂的IAP和SHPS-1片段包括其类似物。“类似物”是这样的化学化合物，其在结构中与第一化合物相似，并且具有与第一化合物相似或相反的生理学作用。具体参考本发明，肽类似物是这样的化合物，其虽然不具有相应蛋白质或肽的氨基酸序列，但能够拮抗IAP与SHPS-1结合。此类类似物可以是肽或非肽类似物，包括但不限于核酸类似物，如下文进一步详细描述的。
在与受体（例如在IAP或SHPS-1上）相互作用的蛋白质或肽分子中，在蛋白质或肽和受体之间的相互作用一般在稳定的三维分子中的表面可接近位点处发生。通过将关键结合位点残基安排在合适构象中，模拟本文描述的肽的基本表面特点的肽类似物可以依照已知技术生成且合成。用于测定肽三维结构的方法和关于其的类似物是已知的，并且有时被称为“合理药物设计技术”。参见例如Geysen的美国专利号4,833,092；Nestor的美国专利号4,859,765；Pantoliano的美国专利号4,853,871；Blalock的美国专利号4,863,857；（申请人特别旨在本文引用的所有美国专利参考文献的公开内容均以其整体通过引用并入本文）。还参见Waldrop，Science 247，28029（1990）；Rossmann，Nature 333，392（1988）；Weis等人，Nature 333，426（1988）；James等人，Science 260，1937（1993）（基于四肽配体的结构和功能的苯二氮卓拟肽化合物的开发）。
一般而言，本领域技术人员将知道可以对本发明的蛋白质或肽的氨基酸序列作出较小缺失或取代，而不会过度不利影响其活性。因此，含有此类缺失或取代的肽是本发明的进一步方面。在含有氨基酸取代或替换的肽中，肽序列的一个或多个氨基酸可以替换为一个或多个其他氨基酸，其中此类替换不影响该序列的功能。此类改变可以通过氨基酸之间在物理特点中的已知相似性加以指导，所述物理特点例如电荷密度、疏水性/亲水性、大小和构型，使得氨基酸由具有基本上相同的功能性质的其他氨基酸取代。例如：Ala可以由Val或Ser替换；Val可以由Ala、Leu、Met或Ile，优选Ala或Leu替换；Leu可以由Ala、Val或Ile，优选Val或Ile替换；Gly可以由Pro或Cys，优选Pro替换；Pro可以由Gly、Cys、Ser或Met，优选Gly、Cys或Ser替换；Cys可以由Gly、Pro、Ser或Met，优选Pro或Met替换；Met可以由Pro或Cys，优选Cys替换；His可以由Phe或Gln，优选Phe替换；Phe可以由His、Tyr或Trp，优选His或Tyr替换；Tyr可以由His、Phe或Trp，优选Phe或Trp替换；Trp可以由Phe或Tyr，优选Tyr替换；Asn可以由Gln或Ser，优选Gln替换；Gln可以由His、Lys、Glu、Asn或Ser，优选Asn或Ser替换；Ser可以由Gln、Thr、Pro、Cys或Ala替换；Thr可以由Gln或Ser，优选Ser替换；Lys可以由Gln或Arg替换；Arg可以由Lys、Asp或Glu，优选Lys或Asp替换；Asp可以由Lys、Arg或Glu，优选Arg或Glu替换；并且Glu可以由Arg或Asp，优选Asp替换。一旦制备，就可以照常规筛选改变，以测定其对酶功能的作用。
本发明的蛋白质或肽的非肽模拟物（即非肽IAP与SHPS-1结合拮抗剂）也是本发明的方面。非蛋白质模拟物可以依照已知技术生成，例如使用计算机图形建模以设计能够拮抗IAP与SHPS-1结合的非肽有机分子。参见例如，Knight，BIO/Technology 8:105（1990）；Itzstein等人Nature 363:418（1993）（流感病毒酶、唾液酸酶的拟肽抑制剂）。Itzstein等人Nature 363:418（1993）使用来自x射线晶体学研究的数据建模唾液酸酶受体蛋白质的晶体结构，并且开发将附着至模型的活性位点的抑制剂；用于建模的核磁共振（NMR）数据的使用也是本领域已知的，并且此类技术可以用于实施本发明。关于生物可用的非肽环脲（其充当HIV蛋白酶抑制剂）的合理设计，还参见Lam等人Science 263:380（1994）。Lam等人使用来自HIV蛋白酶抑制剂复合物的x射线晶体结构研究的信息，以设计非肽抑制剂。
类似物或拮抗剂还可以通过利用化合物文库的高流通量筛选进行开发，如下文进一步详细讨论的。应当指出此类化合物文库可以是完全随机的文库，或者基于信息生成和/或选择的文库，所述信息基于如上所述的抗体活性剂、IAP片段活性剂或SHPS-1片段活性剂。
可以用于实施本发明的前述的拮抗剂或类似物还可以通过下述开发：生成分子文库，选择充当拮抗剂的那些分子，并且鉴定且扩增所选拮抗剂。参见例如，Kohl等人Science 260:1934（1993）（法呢基蛋白质转移酶的抑制剂的四肽的合成和筛选，以抑制ras癌蛋白依赖性细胞转化）。Eldred等人（J. Med Chem. 37:3882（1994））描述了模拟Arg-Gly-Asp序列的非肽拮抗剂。同样地，Ku等人（J. Med Chem. 38:9（1995））进一步举例说明了一系列此类化合物的合成。用于构建且筛选寡聚生物分子的组合文库以鉴定与给定受体蛋白质特异性结合的那些的技术是已知的。合适的寡聚物包括肽、寡核苷酸、碳水化合物、非寡核苷酸（例如硫代磷酸酯寡核苷酸；参见Chem. and Engineering News，第20页， 1994年2月7日）和非肽聚合物（参见例如，Simon等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367（1992）的“类肽（peptoids）”）。还参见Schatz的美国专利号5,270,170；Scott和Smith，Science 249:386-390（1990）；Devlin等人Science 249:404406（1990）；Edgington，BIO/Technology 11:285（1993）。肽文库可以在固体载体上合成，或在细菌噬菌体病毒（噬菌体展示文库）的表面上表达。已知筛选方法可以由本领域技术人员使用，以筛选组合文库以鉴定拮抗剂。这样的技术是本领域已知的，其用于筛选合成的分子以选择具有所需活性的那些，且用于标记文库的成员，使得可以鉴定所选活性分子。参见例如，Brenner和Lerner，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381（1992）（使用遗传标签以标记组合文库中的分子）；Berger等人的PCT US93/06948（使用由病毒反式激活元件转化的重组细胞，以筛选能够抑制病毒转录起始的潜在抗病毒分子）；Simon等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367（1992）（生成和筛选“类肽”，寡聚N取代甘氨酸，以鉴定生物学受体的配体）；Fields等人的美国专利号5,283,173（使用遗传改变的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），以就相互作用筛选肽）。
如本文使用的，“组合文库”指不同序列的多种寡聚生物分子的集合，其可以同时筛选作为特定靶的配体的活性。组合文库还可以被称为“形状文库（shape libraries）”，即其为潜在配体的随机化的聚合物群体。分子的形状指支配其与其他分子的相互作用的那些分子特点，包括范德华（Van der Waals）、疏水、静电和动态的。可以与此类文库结合使用的筛选程序在下文更详细地讨论。
C. 制剂和施用。
对于施用，本发明的活性剂（例如抗体或其抗原结合片段）一般将在施用前与无毒的药学上可接受的载体物质（例如生理盐水或磷酸缓冲盐溶液）混合，并且将使用任何医学上合适的程序例如诸如经由静脉内或动脉内注射的肠胃外施用（例如注射）进行施用。在一些实施方案中，施用可以是通过注射到眼内（例如眼内、视网膜内和/或内脏内（intravisceral）注射）。在一些实施方案中，施用可以通过直接注射到治疗部位内，例如直接注射到肿瘤内。在一些实施方案中，本发明的活性剂可以连接到或缀合至载体（例如聚乙二醇），以改变活性剂的半衰期或其他性质。
上文描述的活性剂可以依照已知技术配制用于在药物载体中施用。参见例如，Remington，The Science And Practice of Pharmacy（第9版1995）。在根据本发明的药物制剂的制造中，活性化合物（包括其生理学上可接受的盐）通常尤其与可接受的载体混合。载体当然必须在与制剂中的任何其他成分相容的意义上是可接受的，并且必须对患者是无害的。载体可以是液体并且优选与化合物一起配制为单位剂量制剂，其可以含有0.01或0.5重量%至95重量%或99重量%的活性化合物。
本发明适合于肠胃外施用的制剂包含活性化合物的无菌含水和非含水注射溶液，所述制剂优选与预期接受者的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其致使制剂与预期接受者的血液等渗。
活性剂可以通过任何医学上合适的程序例如正常静脉内或动脉内施用进行施用。在某些情况下，可能希望对动脉粥样硬化血管的直接施用。
活性剂可以以在灭菌的无菌容器中的冻干形式提供，或可以在与药学上可接受的载体组合的药物制剂中提供，所述药学上可接受的载体例如灭菌无热原水或灭菌无热原生理盐水溶液。
其中，活性剂的剂量将依赖个体的病况、待治疗病症或癌症的特定类别或类型、施用途径、采用的治疗剂的性质、和肿瘤对特定治疗剂的敏感性。例如，剂量范围可以是约0.02至约5000微克/千克个体体重。本发明的抗体或其抗原片段的具体剂量不是关键的，只要它有效导致在受疾病侵袭群体内的一些个人中的一些有益效应。在一些实施方案中，剂量可以低至约0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20或50微克/千克个体体重，或更低，并且高至约60、75、90、100、250、500、1000、2000、3000、4000或5000微克/千克个体体重，或甚至更高。
本发明的活性剂可以任选与其他不同的细胞毒素剂结合施用，所述细胞毒素剂例如在本文描述的病症或病况的治疗中有用的化学治疗或抗肿瘤化合物或放射疗法（例如化学治疗剂或抗肿瘤化合物）。其他化合物可以并行施用。如本文使用的，单词“并行”意指在时间上足够紧密以产生组合效应（即，并行可以是同时，或它可以是在彼此之前或之后发生的两次或更多次施用）。如本文使用的，短语“放射疗法”包括但不限于x射线或γ射线，其从外部应用的源例如束或通过小型放射性源的植入来释放。可以与如本文描述的活性剂并行施用的其他合适的化学治疗剂的实例包括但不限于：烷化剂（包括但不限于氮芥类（nitrogen mustards）、氮丙啶衍生物、烷基磺酸盐、亚硝脲类和三氮烯）：尿嘧啶氮芥、氮芥（Chlormethine）、环磷酰胺（CytoxanTM）、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、达卡巴嗪和替莫唑胺；抗代谢物（包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂）：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁（Pentostatine）和吉西他滨；天然产物及其衍生物（例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素）：长春碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、阿糖胞苷、紫杉醇（紫杉醇作为Taxol®商购可得）、光辉霉素、脱氧柯福霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、干扰素类（尤其是IFN-a）、依托泊苷和替尼泊苷；其他抗增殖细胞毒素剂是诺维本（navelbene）、伊立替康（CPT-11）、阿那曲唑（anastrazole）、来曲唑（letrazole）、卡培他滨、雷洛昔芬（reloxafine）、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬（droloxafine）。
另外的抗增殖细胞毒素剂包括但不限于美法仑、六甲基三聚氰胺、噻替派（thiotepa）、阿糖胞苷（cytarabin）、依达曲沙（idatrexate）、三甲曲沙、达卡巴嗪、L-天冬酰胺酶、喜树碱、托泊替康、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、吡啶并苯并吲哚（pyridobenzoindole）衍生物、干扰素和白细胞介素。优选抗增殖细胞毒素剂种类是EGFR 抑制剂、Her-2 抑制剂、CDK 抑制剂和Herceptin®（曲妥珠单抗）。（参见例如美国专利号6,537,988；美国专利号6,420,377）。此类化合物可以依照目前已知用于其施用的技术给予。
D. 筛选程序。
如上所述，本发明提供了筛选程序，其可以单独利用或与关于上述多种活性剂的信息组合利用，以生产还另外的活性剂。
例如，如本文描述的，活性剂还可以这样开发，通过生成分子文库，选择充当关于指定靶的配体的那些分子，并且鉴定且扩增所选配体。
核酸分子还可以充当关于受体蛋白质的配体。参见例如，Edgington，BIO/Technology 11:285（1993）。Gold和Tuerk的美国专利号5,270,163描述了通过从具有随机化序列的RNA分子文库中选择与靶分子特异性结合的那些分子，用于鉴定关于给定靶分子的核酸配体的方法。用于与特定肽免疫学交叉反应的RNA分子的体外选择的方法公开于Tsai，Kenan和Keene，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8864（1992）以及Tsai和Keene，J. Immunology 150:1137（1993）中。在该方法中，针对肽生成的抗血清用于从RNA分子文库中选择RNA分子；所选RNA分子和肽竞争抗体结合，指示RNA表位充当抗体-抗原相互作用的特异性抑制剂。
如上所述，如所述的潜在活性剂或候选化合物可以就下述中的活性进行容易地筛选：（ i ）抑制经由胰岛素样生长因子-I的细胞活化（例如，抑制经由IGF-1的细胞生长），（ ii ）治疗癌症或肿瘤（如上所述），和/或（ iii ）治疗动脉粥样硬化（如上所述）和/或糖尿病神经病变和/或视网膜病变和/或特征在于IGF-1诱导的细胞增殖的任何其他不希望有的病症。该方法包括步骤：（a）将测试化合物加入体外系统或使测试化合物与体外系统接触，所述体外系统包含SHPS-1蛋白质和IAP蛋白质（这个术语包括其足以与其他结合的结合片段）；随后（b）测定测试化合物是否是IAP与SHPS-1结合的拮抗剂；并且随后（c）当测试化合物是IAP与SHPS-1结合的拮抗剂时，将测试化合物鉴定为在下述活性中是有活性或潜在有活性的：（ i ）抑制经由胰岛素样生长因子-1的细胞活化，（ ii ）治疗癌症或肿瘤，和/或（ iii ）治疗动脉粥样硬化（或特征在于IGF-1诱导的细胞增殖的其他病症）。体外系统可以以任何合适的形式，例如表达SHPS-1蛋白质和IAP蛋白质的细胞。在替代形式中，体外系统可以是无细胞系统，例如SHPS-1和IAP或其结合片段的含水制剂。接触、测定和鉴定步骤可以以任何合适的方式进行，所述方式例如手动、半自动或通过高通量筛选仪器。测定步骤可以通过任何合适的技术进行，所述技术例如通过沉淀、通过用可检测基团例如放射性基团标记片段之一等，其所有均可以依照本领域技术人员众所周知的程序进行。
本发明在下述非限制性实施例中更详细地说明，其中使用下述缩写：达尔伯克改良培养基（DMEM-H）、胎牛血清（FBS）、胰岛素样生长因子-I（IGF-1）、IGF-1受体（IGF-1R）、免疫球蛋白（Ig）、整联蛋白相关蛋白质（IAP）、无血清培养基（SFM）、平滑肌细胞（SMC）、含有Src同源区2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶底物1（SHPS-1）、含有src同源区2的蛋白质酪氨酸磷酸酶-2（SHP-2）。
实施例1
整联蛋白相关蛋白质和SHPS-1之间的结合调节血管平滑肌细胞中的IGF-1受体信号传递
胰岛素样生长因子-I（IGF-1）是平滑肌细胞（SMC）迁移和增殖的有效刺激物（Jones等人Proc Natl Acad Sci USA 93:2482-7（1996））。越来越多的证据显示IGF-1起始胞内信号传递的能力不仅由其与其自身跨膜受体的结合调节，还由其他跨膜蛋白质例如整联蛋白调节（B. Zheng和D. Clemmons Proc Natl Acad Sci USA 95:11217-22（1998）；L. Maile和D. Clemmons J Biol Chem 277:8955-60（2002））、整联蛋白相关蛋白质（IAP（L. Maile等人J Biol Chem 277:1800-5（2002）））和含有Src同源区2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶底物1（SHPS-1）（Maile和Clemmons，同上）。
SHPS-1鉴定为酪氨酸磷酸化蛋白质，其与v-SRC转化的成纤维细胞（T. Noguchi等人J Biol Chem 271:27652-8（1996））和胰岛素刺激的中国仓鼠卵巢细胞（Y. Fujioka等人Mol Cell Biol 16:6887-99（1996））中的SHP-2结合。SHPS-1的细胞质区含有2个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（A. Kharitonenkov等人Nature 386:181-6（1997）），其响应多种促有丝分裂刺激（参见例如，M. Stofega等人J Biol Chem 273:7112-7（1998））和整联蛋白介导的细胞附着（参见例如，T. Takada等人J Biol Chem 273:9234-42（1998））而磷酸化。这种磷酸化生成用于Src同源区2结构域酪氨酸磷酸酶（SHP-2）的募集和活化的结合位点，其依次又使SHPS-1去磷酸化。
在稳定附着的平滑肌细胞（SMC）中，SHP-2位于接近于细胞膜的位点，在IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化后，它在其中转移到SHPS-1（L. Maile和D. Clemmons J Biol Chem 277:8955-60（2002））。这种SHP-2募集随后为SHPS-1的去磷酸化和SHP-2转移至IGF-1R，在其中它随后使这种底物去磷酸化。SHPS-1磷酸化在调节IGF-1R去磷酸化中的重要性在表达截短形式的SHPS-1的细胞中加以证实，在所述截短形式的SHPS-1中，SHP-2结合位点已被缺失。在这些细胞中，SHP-2至SHPS-1和IGF-1R的转移被阻断，并且两种分子的持续磷酸化是显而易见的。
IAP首先通过其与结合（E. Brown等人J Cell Biol 111:2785-94（1990））和增加整联蛋白对于其配体的亲和力（E. Brown等人，J Cell Biol 111:2785-94（1990））的能力得到鉴定。IAP由下述组成：N末端（胞外）Ig可变型结构域，随后为五个跨膜疏水螺旋和胞质尾区（C. Rosales等人J Immunol 149:2759-64（1992）；D. Cooper等人Proc Natl Acad Sci USA 92:3978-82（1995））。
IAP已显示结合SHPS-1（P. Jiang等人J Biol Chem 274:559-62（1999）；P. Oldenborg等人Science 288:2051-4（2000）；M. Seiffert等人Blood 94:3633-43（1999）；E. Vernon-Wilson等人，Eur J Immunol 30:2130-2137（2000）；H. Yoshida等人J Immunol 168:3213-20（2002）；I. Babic等人，J Immunol 164:3652-8（2000））。IAP的氨基末端Ig结构域和SHPS-1的胞外Ig可变结构域对于其物理相互作用是足够的。IAP与SHPS-1结合对生长因子刺激的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集的作用仍未得到报道。这些研究的目的是测定IAP与SHPS-1结合对IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化和后续SHP-2募集的作用，和研究这如何改变IGF-1R依赖性SMC作用。
实验程序。
人IGF-1得自Genentech（South San Francisco，CA，USA）；聚二氟乙烯膜（IMMOBILON P™）购自Millipore Corporation（Bedford，MA，USA）。放射自显影胶片得自Eastman Kodak（Rochester，NY，USA）。胎牛血清、达尔伯克改良培养基、青霉素和链霉素购自Life Technologies,（Grand Island，NY，USA）。IGF-1R ß链抗体和单克隆磷酸酪氨酸抗体（PY99）购自Santa Cruz（Santa Cruz，CA，USA）。多克隆SHP-2和SHPS-1抗体购自Transduction Laboratories（Lexington，KY，USA）。针对IAP的单克隆抗体B6H12由购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）的B细胞杂交物（B cell hybrid）纯化，并且抗FLAG单克隆抗体购自Sigma Chemical Company（St Louis，MO，USA）。针对双重磷酸化（活性）形式的p42/p44 MAP激酶（MAPK）的抗体和针对总p42/p44 MAPK蛋白质的抗体购自Cell Signaling Technology（Beverley，MA，USA）。除非另有说明，否则所有其他试剂均购自Sigma Chemical Company（St Louis，MO，USA）。
猪主动脉SMC（pSMC）如先前描述的（A. Gockerman等人Endocrinology 136:4168-73（1995））分离，并且维持在10cm组织培养板（Falcon Laboratory，Franklin Lakes，NJ）中的达尔伯克改良培养基中，所述达尔伯克改良培养基补充有葡萄糖（4.5 gm/升）、青霉素（100单位/ml）、链霉素（100 µg/ml）（DMEM-H）和10%胎牛血清（FBS）。使用在第5到16代之间的细胞。
表达载体的生成
具有C末端FLAG表位的全长猪IAP（IAPfl）。通过RT-PCR从CDR文库中克隆全长猪IAP，所述cDNA文库已来源于已如先前描述的（A. Gockerman等人Endocrinology 136:4168-73（1995））分离的pSMC。5'引物序列5’ ATGTGGCCCTGGTGGTC（SEQ ID NO:1）对应于猪序列的核苷酸121-139。3'引物序列与核苷酸1005-1030互补，具有编码FLAG序列的碱基（加下划线的）和终止密码子的添加。序列为：
。
在测序后，将cDNA克隆到pcDNA V5 his 3.1载体（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）内。
具有在残基135处的胞外结构域截短且含有C末端FLAG表位的IAP（IAPcyto）。将含有IAPfl cDNA序列的pcDNA V5 his 3.1载体线性化，并且通过使用PCR生成突变型IAP，使用编码碱基527-556的5'寡核苷酸（5’ TCTCCAAATGAAAAATCCTCATTGTTATT 3’）（SEQ ID NO:3）和用于生成IAPfl的相同3'寡核苷酸。将PCR产物克隆到pcDNA V5 his 3.1内。
其中半胱氨酸33和261由丝氨酸残基取代的含有C末端FLAG表位的IAP（IAPc-s）。将IAPfl cDNA亚克隆到pRcRSV表达载体内，并且它用作模板以实施单链诱变，以掺入两个取代。pRcRSV载体含有新霉素衍生物（G418）抗性基因和细菌噬菌体复制起点（F1）基因，其允许cDNA的直接单链诱变。使用编码碱基取代的两条寡核苷酸。它们为：C33S：除了碱基取代以编码丝氨酸（加下划线的）之外与核苷酸204-225互补5' GTAACAGTTGTATTGGAAACGGTGAATTCTA 3’（SEQ ID NO:4）和C261S：除了碱基取代以编码丝氨酸（加下划线的）之外与核苷酸888-918互补：
。
在测序后，将DNA构建体亚克隆到pMEP4表达载体（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）内。
pSMC的转染。将已生长至70%汇合的细胞用如先前描述的（24）三种IAP cDNA构建体之一进行转染。如先前描述的（Y. Imai等人，J Clin Invest 100，2596-605（1997）），选择潮霉素抗性pSMC且维持在含有15%FBS和100 µg/ml潮霉素的DMEM-H中。如本文描述的，通过制备全细胞裂解产物且通过免疫印迹显现FLAG蛋白质表达，评估蛋白质表达水平。将得自独立实施的两次转染的经转染的pSMC用于后续实验中，并且获得的结果在两组细胞之间是一致的。
细胞裂解。将细胞以5 x 105的密度铺至10 cm皿（Falcon # 3003）中，并且随后生长至90%汇合（大约5 x 106细胞）。细胞在具有0.5%牛血清白蛋白（SFM）的无血清培养基中温育过夜，并且随后在需要时，用单克隆抗IAP抗体（B6H12）或无关对照单克隆抗体预处理2小时（4 µg/ml），并且随后在下述冰冷的裂解缓冲液中裂解前，用100 ng/ml IGF-1或10 ng/ml PDGF处理适当长的时间：50mM Tris HCl（pH 7.5）、150mM NaCl、1%NP40、0.25%脱氧胆酸钠、1mM EGTA加上1mM原钒酸钠、1mM氟化钠、1mM PMSF、1 µg/ml胃酶抑素A、1 µg/ml亮抑酶肽、1 µg/ml抑肽酶。裂解产物通过以14,000 x g离心10分钟进行澄清。
免疫沉淀。将细胞裂解产物在4℃下与适当抗体（IGF-1R、SHPS-1或B6H12，使用1:500稀释度）温育过夜。随后通过添加蛋白A琼脂糖且在4℃下温育进一步的2小时来沉淀免疫复合物。随后将样品以14,000 x g离心10分钟，并且将团块用裂解缓冲液洗涤4次。将团块重悬浮于45 µl还原或非还原Laemmeli缓冲液，煮沸5分钟，并且通过SDS-PAGE，8%凝胶分离蛋白质。
p42/p44 MAP激酶活化的评估。将pSMCS以1 x 106细胞/孔在六孔板中具有0.5%FBS的DMEM-H中铺平板，并且在37℃下温育48小时。随后将板冲洗，并且在具有0.5%FBS的新鲜DMEM-H中温育进一步的2小时。随后在暴露于IGF-1（100 ng/ml）前20分钟，使细胞在含或不含4 µg/ml B6H12或无关对照单克隆抗体的SFM中温育2小时。细胞随后用200 µl Laemelli缓冲液裂解，并且随后通过SDS-PAGE（8%凝胶）分离40 µl细胞裂解产物中的蛋白质。如本文描述的，通过用对于双重磷酸化（苏氨酸202和酪氨酸204）蛋白质特异性的抗体（以1:1000的稀释度）免疫印迹测定p42/44 MAPK的活化。为了控制蛋白质水平中的差异，将来自每种样品的等体积的细胞裂解产物装载到另外的8%凝胶上。在分离和转移后，使用多克隆p42/p44 MAPK抗体（以1:1000的稀释度）测定总p42/p44蛋白质水平。
蛋白质免疫印迹。在SDS-PAGE后，将蛋白质转移至Immobilon P膜。该膜在具有0.1%Tween的Tris缓冲盐水（TBST）中的1%BSA中在室温下封闭2小时，并且随后与六种一抗（IGF-1R、SHP-2、SHPS-1、PY99、B6H12或FLAG、1:500稀释度）之一在4℃下温育过夜，并且在TBST中洗涤三次。根据制造商的说明书（Pierce，Rockford IL，USA），使用增强化学发光显现过氧化物酶标记的二抗的结合，并且通过暴露于放射自显影胶片或使用GeneGnome CCD显像系统（Syngene Cambridge，UK Ltd）检测免疫复合物。
使用DuoScan T1200（AGFA Brussels，Belgium）扫描获得的化学发光图像，并且使用NIH Image，版本1.61分析扫描图像的条带强度。Student’s t检验用于比较处理之间的差异。所示结果代表至少三次分开的实验。
细胞受伤和迁移测定。将细胞在六孔板中铺平板，并且经过七天生长至汇合，伴随一次培养基更换。受伤如先前描述的（J. Jones等人Proc Natl Acad Sci U S A 93：2482-7（1996））实施。简言之，将剃刀刀片用于刮取细胞区域，留下剥蚀区域和尖锐的可见创伤线。选择沿着创伤边缘的六个1 mm区域且记录每种处理。受伤的单层随后与具有或不具有100 ng/ml IGF-1或PDGF（10 ng/ml）的SFM（加上0.2% FBS）一起温育。随后将细胞固定且染色（Diff Quick，Dade Behring，Inc.，Newark，DE），并且计数迁移到受伤区域内的细胞数目。对于每个数据点计数在创伤边缘处的先前选择的1 mm区域中的至少五个。
细胞增殖的评估。将细胞以5000细胞/cm2铺在24孔板中具有2%FBS的DMEM-H中，并且在将培养基更换为DMEM-H加上0.2%人贫血小板血浆前，允许附着且扩展24小时。在进一步的24小时温育后，在添加IGF-1（100 ng/ml）前，使细胞在B6H12或无关对照单克隆抗体（4 µg/ml）的存在或不存在下预温育2小时。每种处理一式三份设置。随后将细胞温育48小时，并且测定每个孔中的最终细胞数目。Student's t检验用于比较处理之间的差异。所示结果代表来自三次分开实验的平均值（+SEM）。
结果
IAP经由其胞外结构域与稳定附着的pSMC中的SHPS-1结合。图1A显示如通过使用抗IAP和抗SHPS-1抗体两者用于免疫沉淀的免疫共沉淀实验测定的，在稳定附着的休眠SMC中，存在可检测的在IAP和SHPS-1之间的结合。
为了研究IAP与SHPS-1结合在IGF-1R信号传递中的作用，开发了其中IAP和SHPS-1之间的结合被破坏的两种实验模型。第一种方法使用抗IAP单克隆抗体B6H12，以干扰两种蛋白质的结合。图1B显示休眠pSMC与抗IAP单克隆抗体（B6H12）温育后，IAP和SHPS-1之间的相互作用降低（75 ± 7.5%降低（平均值± S.E.M n = 3））。与无关对照单克隆抗体的预温育对两种蛋白质之间的结合没有作用。
IAP和SHPS-1之间的结合特别需要在IAP中在胞外结构域中的半胱氨酸33和假定跨膜结构域内的半胱氨酸261之间的完整二硫键（R. Rebres等人，J Biol Chem 276:7672-80（2001））。如果这个键被诱变破坏，则IAP与的相互作用保留，但与SHPS-1的结合被消除。生成且表达其中IAP和SHPS-1之间的结合将预期被破坏的两种突变型IAP。图1C（上图）显示在后续实验中使用的三种形式的IAP的表达水平。这些包括a）加上FLAG标签的突变型IAP，其中完整的胞外结构域已在氨基酸残基135处被缺失（IAPcyto），b）加上FLAG标签的突变型IAP，其中两个半胱氨酸残基33和261已由丝氨酸取代（IAPc-s），和c）加上FLAG标签的全长IAP（IAPfl）。
图1C（下图）中所示的代表性实验显示IAP的胞外结构域的破坏改变其与SHPS-1结合的能力。与表达IAPfl的细胞中的结合相比较，IAPcyto的表达导致IAP与SHPS-1结合中的88 ± 6.4%（平均值 ± SEM n=3）降低。因为IAP的胞外结构域的截短也破坏其与的结合，所以在表达IAPc-s突变的细胞中分析SHPS-1/IAP相互作用。在表达IAPc-s的细胞中，与表达IAPfl的细胞相比较，在IAP与SHPS-1结合中存在81 ± 4.5%（平均值 ± SEM n=3）降低。对照免疫印迹显示相似水平的SHPS-1被免疫沉淀。
阻断IAP-SHPS-1结合抑制IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集。为了测定在IAP和SHPS-1之间的物理结合丧失的功能后果，进行研究以检查在用抗IAP单克隆抗体B6H12预处理的野生型细胞中响应IGF-1的SHPS-1磷酸化。代表性实验显示于图2A中，并且可见与对照中响应IGF-1的SHPS-1磷酸化中的4.1 ± 0.9（平均值 ± SEM n = 3）倍数增加不同，用B6H12预处理的细胞显示IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化中的增加中的显著降低（0.93 ± 0.12（平均值 ± SEM n = 3 p <0.05）。在与无关对照单克隆抗体一起预温育的细胞中，IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化与对照细胞并无显著不同。另外如图2A中可见的，在B6H12的存在下SHPS-1磷酸化中的这种降低与IGF-1刺激的SHP-2至SHPS-1的募集中的显著降低相关（与对照细胞中的14 ± 1.5倍增加相比较，在B6H12的存在下SHP-2结合中的1.8 ± 1.1倍增加（平均值 ± SEM n = 3 p< 0.05）。再次，在与无关对照单克隆抗体一起预温育的细胞中，不存在对IGF-1刺激的SHP-2至SHPS-1募集的显著作用。
IAP的胞外结构域是IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集所必需的。为了证实暗示阻断IAP与SHPS-1结合抑制IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化的先前观察，将表达突变型IAP的细胞中IGF-1刺激SHPS-1磷酸化的能力与表达野生型IAP的细胞的相比较。来自代表性实验的结果显示于图2B中，并且可见与表达IAPfl的细胞中响应IGF-1的SHPS-1磷酸化中的3.6 ± 0.8（平均值 ± SEM n = 3）增加不同，在表达IAPcyto突变型或IAPc-s突变型的细胞中，无法检测到响应IGF-1的SHPS-1磷酸化中的显著增加。
与使用B6H12获得的结果一致，在表达突变型IAP的细胞中观察到的SHPS-1磷酸化的缺乏与响应IGF-1的SHP-2至SHPS-1募集的抑制相关（图2B）。
因为SHPS-1已显示响应几种生长因子而磷酸化，所以进行研究以调查IAP与SHPS-1结合的需要的特异性。图2C显示在表达IAPfl的细胞中的5分钟暴露后，PDGF诱导SHPS-1磷酸化中的显著增加。然而，与IGF-1不同，PDGF还刺激IAPc-s细胞中的SHPS-1磷酸化。
IAP的胞外结构域和SHPS-1之间的结合经由其调整SHP-2募集来调节IGF-1R磷酸化的持续时间。SHPS-1的磷酸化是SHP-2转移至IGF-1R所必需的，并且从而调节IGF-1R磷酸化的持续时间（T. Noguchi等人J Biol Chem 271:27652-8（1996））；因此，进行研究以检查在用B6H12预处理的细胞和表达突变型IAP的细胞中SHP-2的IGF-1R募集和IGF-1R磷酸化的持续时间。在对照细胞中，在用IGF-1的10分钟处理后，IGF-1刺激SHP-2至IGF-1受体的募集中的3.3 ± 0.4（平均值 ± SEM n = 3）倍增加。然而，在用B6H12预处理的细胞中的SHP-2至IGF-1R的募集，在SHP-2至IGF-1R的募集中不存在可见的显著增加（图3A）。与先前结果（L. Maile和D. Clemmons，J Biol Chem 277:8955-60（2002））一致，SHP-2至IGF-1R的募集在20分钟IGF-1刺激后观察到的受体磷酸化中的降低之前。然而，在与B6H12预温育的细胞中，与SHP-2募集的缺乏一致，在20分钟时间点无法检测到IGF-1R磷酸化中的降低。为了证实在用B6H12预处理的细胞中SHP-2至IGF-1R募集的缺乏是由于IAP/SHPS-1之间的特异性破坏，在表达IAPc-s的细胞中检查IGF-1R磷酸化。图3B显示在这些细胞中，在响应IGF-1的SHP-2至IGF-1R的募集中不存在增加，并且再次这与在表达全长IAP的细胞中用IGF-1的20分钟刺激后观察到的IGF-1R去磷酸化的量中的降低相关。
IGF-1刺激的MAPK活性在SHP-2转移破坏后得到抑制。先前研究已显示无活性形式的SHP-2的表达导致IGF-1刺激的MAPK的抑制（S. Manes等人Mol Cell Biol 4:3125-35（1999））。为了检查在IAP-SHPS-1结合破坏后SHP-2转移缺乏的后果，分析在B6H12的存在下响应IGF-1的MAPK活化。
图4A显示如通过p42/p44 MAPK的双重磷酸化评估测定的，10分钟的IGF-1处理刺激MAPK活化中的显著增加（70 ± 5% S.E.M n = 4）。然而，当细胞与B6H12一起预温育时，IGF-1不能刺激p42/p44 MAPK磷酸化中的持续增加。MAPK是IGF-1刺激细胞增殖所必需的。
为了检查IAP-SHPS-1结合中的破坏对SMC中的IGF-1作用的后果，测定B6H12对IGF-1刺激的细胞增殖的作用。图4B显示IGF-1刺激细胞增殖中的2.2 ± 0.2（平均值 ± SEM n = 3）倍增加。然而，与在不存在B6H12的情况下温育的细胞相比较，当细胞与B6H12一起温育时，在IGF-1刺激的细胞增殖中存在显著降低（1.03 ± 0.01平均值 ± SEM n = 3 p < 0.05。细胞增殖中的抑制与IGF-1刺激的MAPK活化的抑制一致。
IAP与SHPS-1相互作用的破坏抑制IGF-1刺激的细胞迁移。pSMC与B6H12预温育部分通过改变IAP和αVß3之间的相互作用来抑制IGF-1刺激的迁移（L. Maile等人J Biol Chem 277:1800-5（2002））。为了测定至少部分B6H12的效应是否也是由于IAP与SHPS-1结合的抑制，在表达IAPfl和IAPc-s突变体的细胞中比较响应IGF-1的细胞迁移。在图5中，在表达IAPfl的细胞中可见IGF-1刺激pSMC迁移中的显著增加。然而，在表达IAPc-s突变体的细胞中，IGF-1刺激的迁移显著降低。相比之下，PDGF刺激的IAPc-s细胞的细胞迁移与表达全长IAP的细胞的并无显著不同。
讨论
SHPS-1在胞内信号传递中的作用在很大程度上已归因于SHP-2募集至在SHPS-1的胞质尾区中的ITIM基序内含有的磷酸化的酪氨酸，和SHP-2磷酸酶活性的后续活化（L. Maile等人J Biol Chem 277:1800-5（2002）；T. Takada等人J Biol Chem 273:9234-42（1998）；J. Timms等人，Curr Biol 9:927-30（1999））。活化的SHP-2转移至生长因子例如IGF-1的下游信号传递分子以刺激其生理学作用的需要已由这样的研究强烈暗示，所述研究显示显性阴性形式的SHP-2的表达导致不能适当活化生长因子刺激的MAP激酶（T. Noguchi等人Mol Cell Biol 14:6674-82（1994）；K. Milarski和A. Saltiel J Biol Chem 269:21239-43（1994）；S. Xiao等人J Biol Chem 269:21244-8（1994）；K. Yamauchi等人Proc Natl Acad Sci 92:664-8（1995）；G. Pronk等人Mol Cell Biol 14:1575-81（1994）；T. Sasaoka等人J Biol Chem 269:10734-8（1994））和PI-3激酶（C. Wu等人Oncogene 20:6018-25（2001）；S. Ugi等人J Biol Chem 271:12595-602（1996）；S. Zhang等人Mol Cell Biol 22:4062-72（2002））中的增加，以及不能将SHP-2募集至下游信号传递分子。对于IGF-1，特别显示显性阴性SHP-2突变体的表达导致不能活化MAP激酶或响应IGF-1的细胞迁移（S. Manes等人Mol Cell Biol 4:3125-35（1999））。来自这项研究的结果已证实在IAP和SHPS-1之间的相互作用是IGF-1信号传递的关键调节物，因为这些数据已显示相互作用是SHP-2募集和转移所必需的。使用两种独立方法破坏两种蛋白质之间的相互作用导致SHP-2募集至SHPS-1和后续转移至IGF-1R的丧失，其在延长的IGF-1R磷酸化中反映。SHP-2募集和转移缺乏的后果在IGF-1刺激MAPK活化和后续细胞增殖或细胞迁移的无能性（inability）中是显而易见的。
SHPS-1和IAP之间的相互作用首先由实验暗示，所述实验证实抗IAP单克隆抗体阻断小脑神经元、红细胞（erthyrocytes）和胸腺细胞与含有P84（SHPS-1的脑同系物）的基底的附着（ P. Jiang等人J Biol Chem 274:559-62（1999）；M. Seiffert等人，Blood 94:3633-43（1999））。这种相互作用可能在细胞与细胞附着中起作用在实验中得到证明，所述实验证实在SIRP阴性细胞中的胞外结构域的表达支持原代造血细胞的粘附，并且这种相互作用再次通过抗IAP单克隆抗体而被抑制（E. Vernon-Wilson等人Eur J Immunol 30:2130-2137（2000））。
介导与胞外基质的细胞附着的细胞粘附分子例如整联蛋白和细胞与细胞粘附分子例如钙粘蛋白，不仅对于细胞附着而且对于细胞增殖、存活和分化的调节是重要的。通过整联蛋白受体的生长因子信号传递调节已得到充分证明。先前已报道的配体占据是IGF-1刺激的受体信号传递所必需的，并且在和PDGF受体之间的相似协作关系已得到描述（S. Miyamoto等人J. Cell. Biol. 135:16633-1642（1996））。IGF-1已显示为多种嗜同种细胞与细胞粘附分子的调节物。Guvakova等人报道IGF-1R与E-钙粘蛋白共定位，且通过增加ZO-1的表达来增加MCF-7细胞的细胞粘附，所述ZO-1与E-钙粘蛋白结合且稳定其与细胞骨架的相互作用（L. Mauro等人J. Biol. Chem. 276：3982-39897）。相反，还已显示在人结肠肿瘤细胞中，IGF-1经由其刺激E-钙粘蛋白磷酸化的能力导致降低的E-钙粘蛋白膜水平和细胞粘附中的相关降低。IGF-1也已报道下调T-钙粘蛋白表达，再次这与细胞粘附中的降低相关。尽管细胞与细胞粘附受体在调节细胞功能中的明显作用，但关于其调节生长因子作用的能力存在很少数据。先前已显示神经细胞粘附分子与成纤维细胞生长因子受体的相互作用导致通过自磷酸化的受体活化。VEGF已显示导致CEACAM表达中的增加，并且VEGF效应中的至少一些通过CEACAM-1介导。来自这些实验的结果证实细胞与细胞粘附分子IAP和SHPS-1的相互作用，除了介导细胞粘附，还在生长因子信号传递中起重要的调节作用。考虑到细胞与细胞粘附分子在调节细胞功能中的重要性，得出结论通过细胞与细胞粘附分子的生长因子信号传递调节是用于调节生长因子作用的一般机制是合理的。PDGF信号传递不受IAP-SHPS-1相互作用破坏的影响。
因为在不存在IAP与SHPS-1结合的情况下，PDGF仍可以刺激SHPS-1磷酸化，所以这暗示PDGF和IGF-1可以经由两种不同激酶刺激SHPS-1磷酸化。SHPS-1已显示直接通过胰岛素受体激酶磷酸化（Y. Fujioka等人，Mol Cell Biol 16，6887-99（1996））。考虑到胰岛素中的酪氨酸激酶结构域和IGF-1R之间的同源性（例如84%），可能SHPS-1也是IGF-1R激酶的直接底物。IAP与SHPS-1结合可以通过将SHPS-1紧密接近地定位于受体激酶来调节这个过程，或者IAP与SHPS-1结合可以改变SHPS-1胞质结构域的构象，使得它的酪氨酸对IGF-1R激酶是可接近的。
由于其刺激SMC迁移和增殖的能力，IGF-1可能是动脉粥样硬化发生的重要成因（J. Jones等人Proc Natl Acad Sci USA 93:2482-7（1996））；M. Khorsandi等人J.Clin,Invest. 90 :1926-1931（1992）；B. Cerek等人Circ.Res. 66 :1755-1760（1990）；P. Hayry等人，FASEB J. 9 :1336-1344（1995））。在其中IGF-1在SMC中过表达的小鼠中，在颈动脉损伤后存在新生内膜（neointimal）形成速率中的增加，所述颈动脉损伤看起来已产生于增加的SMC增殖和迁移。尽管与对照动物相比较在血浆中的血清IGF-1的等同水平，但该效应是明显的，暗示局部产生的IGF-1的旁分泌效应（B. Zhu等人Endocrinology 142:3598-3666（2001））。考虑到IGF-1在动脉粥样硬化发生中的明显作用和这种相互作用对IGF-1信号传递的作用，可能这种系统可以在动脉粥样硬化的发生中起作用，并且相互作用的破坏可能代表特异性抑制IGF-1作用的新治疗策略。靶向IGF-1信号传递的目前方法已集中于使用抗体或肽阻断受体自身的活性。破坏特异性抑制生长因子信号传递的细胞与细胞粘附分子相互作用提供新治疗策略。
实施例2
用破坏IAP与SHPS-1结合的单克隆抗体（NPG-1）治疗糖尿病视网膜病变
血管通透性的体内测量
大鼠用戊巴比妥（Nembutal）（80 mg/kg）（Southern Anesthesia）进行注射。一旦已实现深度麻醉，就经由尾静脉注射加温的伊文思蓝（45 mg/kg）（Fisher Scientific）溶液。在2小时后，施用致死剂量的麻醉剂（100 mg/kg）。打开胸腔并且将针插入左心室内。将右心房夹住且将血液以12,000 x g离心5分钟。将大鼠用在柠檬酸盐中的1%多聚甲醛灌注，随后取出眼且置于PBS中。取出视网膜，冻干且随后重悬浮于甲酰胺中，且在70℃下温育。在18小时后，将视网膜/甲酰胺以13,000 x g离心10分钟。
使用伊文思蓝（30 mg/ul）的系列稀释物生成标准曲线。分别使用620和740 nm的激发和发射波长，使用Nanodrop分光光度计（Thermo-Scientific）测量标准曲线以及每个视网膜的吸光度。使用下式计算来自每个视网膜的伊文思蓝透过的量：
。
糖尿病诱导方案
对照（CON）大鼠接受媒介物的注射。链脲霉素（STZ）通过腹膜内注射（50 mg/kg；100 ml）给予。在6天后，具有血糖>350 mg/dl的大鼠指示为具有糖尿病。将STZ处理的组分成两组。在注射后20天时，第一组每72小时接受对照（小鼠IgG（5.0 mg/kg））的注射，共30天。第二组每72小时接受大鼠抗IAP抗体NPG-1（5.0 mg/kg）的注射，共30天。每天将大鼠称重，并且如果重量减轻是明显的，则它们接受胰岛素（4-8单位/kg）。
细胞裂解、免疫沉淀和免疫印迹
由已暴露于多种处理的内皮细胞单层制备裂解产物。将它们免疫沉淀且通过SDS-PAGE分离免疫复合物，并且在免疫印迹以显现蛋白质前，转移至Immobilon滤器（Millipore）。用于免疫印迹的抗体是抗磷酸酪氨酸（PY99，Santa Cruz）、抗SHPS-1（BD Biosources）和抗闭锁蛋白（Invitrogen）。
体外通透性测定
将Transwell插入式板（inserts）（24孔）用胶原10 ug/cm2（BD Biosciences）在22℃下包被1小时。将HUVEC以5 x 104细胞/ml/插入式板铺至包被的插入式板上的生长培养基（15mM葡萄糖）中。在24小时后，将500 µl生长培养基置于下部室中。在24小时后，将培养基更换为含有IGF-1（50 ng/ml）加上抗IAP抗体NPG-1（1 µg/ml）的SFM-199（15mM葡萄糖）。在14小时后，加入荧光标记的葡聚糖（Sigma）（0.5 mg/ml）。在1小时后，从下部室中去除培养基，并且在荧光检测微量板阅读器（Fluor Imager 595 Molecular Dynamics）中测量FITC-葡聚糖的量（分别使用294和521 nm的激发和发射波长）。
体外管形成测定
将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生长至汇合，并且随后更换为含有IGF-1（50 ng/ml）、NPG-1（1 µg/ml）的SF M-199共14小时。将它们用胰蛋白酶处理且重悬浮于SF M-199（15mM葡萄糖）中，并且随后置于用500 µl低生长因子基质胶（growth factor reduced matrigel）（BD Sciences）包被的24孔板上（1.5 x 105细胞/ml/孔）。在4小时后，将板在10x下拍照，并且测定每个孔中的6个随机区域中的管数目/ cm2面积。一个管是两个分支点之间的区域（图7C中显示为在图像上的两个“x”标志物之间的区域）。
内皮细胞培养
使原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（Lonza，Walkersville，MD，USA）在含有5 mmol/l葡萄糖的M-199（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）加上EGM-2内皮细胞生长培养基补充物（Lonza）中生长。将HUVEC转换至含有15 mmol/l葡萄糖的生长培养基共3天。将甘露醇（10 mmol/l）加入含有5 mmol/l葡萄糖的培养基中，以控制渗透摩尔浓度中的差异。培养物在含有5或15 mmol/l葡萄糖的无血清M-199中休眠14小时，并且暴露于IGF-1（50 ng/ml；Genentech，San Francisco，CA，USA），连同或不连同抗IAP抗体NPG-1（1 μg/ml）。人细胞的使用得到University of North Carolina Ethics Committee批准。
结果
两类内皮细胞（大鼠和人）用于体外测定。针对人IAP蛋白质的氨基酸71直到80（氨基酸编号根据本文提供的参考序列）的单克隆抗体NPG-1与人IAP特异性结合。图6A显示在对照和NPG-1之间的比较，并且提供这种抗体可以破坏IAP与SHPS-1结合的直接证实。细胞与NPG-1一起预温育，并且随后将SHPS-1免疫沉淀且将免疫沉淀物对IAP进行免疫印迹。因为破坏导致IGF-1信号传递的抑制，所以将预期响应IGF-1而活化的关键信号转导元件被抑制。图6B显示如果细胞与这种抗体一起预温育，则必须与内皮细胞中待活化的SHPS-1结合的Shc不正常结合。与IAP反应的大多数抗体也破坏IAP与αvβ3结合。图6C显示NPG-1是特异性的，因为它破坏IAP与SHPS-1的结合，而不破坏IAP与β3的结合。这是重要的，因为破坏IAP与β3结合可以导致副作用例如增加的血小板聚集。这是这种抗体的重要区别特点。如图6D中所示，SHPS-1与IAP结合在来自对照大鼠（Con）、糖尿病大鼠（D）和用抗IAP抗体处理的糖尿病大鼠（R569）（D + AB）的主动脉匀浆物中进行测定。该抗体在体内是完全有活性的，并且抑制IAP/SHPS-1结合。
伴随这项研究，显示了这样的实验，其中证实人内皮细胞在毛细血管形成（其在体内发生）的体外测定中形成管的能力。内皮细胞管形成显示于图7C中。图7A显示基于葡聚糖蓝透过在体外测量的细胞通透性。内皮细胞在单层中生长与它们在血管中生长差不多，并且测量了这种染料渗透单层的能力。如由图7A可见的，IGF-1刺激透过并且这在IAP抗体的存在下被抑制。图7B显示允许内皮细胞形成通透性屏障的紧密连接蛋白质闭锁蛋白在IGF-1的存在下被破坏；即，闭锁蛋白离开通常形成的连接复合物，并且扩散到细胞内。这是在闭锁蛋白条带的免疫印迹强度中降低的原因。在抗体NPG-1的存在下，这种IGF-1效应被完全抑制。在图7C中，在IGF-1处理的细胞中，可见管形成，其中毛细血管细胞由毛细管彼此连接。在抗体NPG-1的存在下，如图7C的下面两个小图和在其中显示管数目/ cm2的柱形图上所示，这被完全破坏。
图8 和图9中所述的研究在大鼠内皮细胞中进行。这是因为IAP蛋白质的氨基酸序列71直到80在物种间不是保守的。因为与人IAP（ALNKSTVPTD，SEQ ID NO:6）相反，氨基酸71-80在大鼠IAP（NKNSTTREQN，SEQ ID NO:8）中是不同的，所以进行研究以显示这种氨基酸序列具有相同的功能重要性。这是必需的，因为如果针对IAP的人抗体在体内施用于大鼠，则它将不起作用不是因为这种氨基酸序列在物种间不是保守的因此人抗体将不被预期会破坏大鼠IAP与大鼠SHPS-1结合。因此，抗大鼠IAP抗体通过用免疫原免疫兔进行制备，所述免疫原由来自大鼠IAP的10个氨基酸的序列构成，其与用于制备单克隆抗体的人IAP序列同源。如本文所述，将这种肽缀合至KLH并且将兔免疫。随后使用蛋白A琼脂糖从兔血清中纯化IgG。这是注射到大鼠内以抑制毛细血管通透性的纯化IgG。这种大鼠抗体以与验证人抗体相同的方式进行验证，以显示大鼠抗体将抑制大鼠内皮细胞中的IAP/SHPS-1结合，并且它将抑制IGF-1信号传递。如图8A中所示，对照抗体（Con）对IAP/SHPS-1相互作用没有作用，而抗大鼠IAP抗体（AB）完全破坏其结合。图8B显示在IGF-1刺激后，存在SHPS-1的酪氨酸磷酸化、AKT的刺激和MAPK活化，并且这些在大鼠抗IAP抗体的存在下被抑制。
图9显示体内实验的结果，其中将在体外破坏大鼠内皮细胞中的SHPS1/IAP结合的相同抗体体内注射到大鼠。这个实验经过三周时期进行。如本文描述使大鼠患有糖尿病，并且随后每周两次接受纯化的抗大鼠抗体的注射。随后测量离开糖尿病大鼠的视网膜毛细血管进入视网膜内的伊文思蓝染料透过。如图9中所示，在糖尿病大鼠（血糖过多）中存在毛细血管通透性中的主要增加，这是糖尿病视网膜病变的标志。另外如图9中所示，大鼠抗IAP抗体的注射抑制通透性中的这种增加。血管通透性是在人糖尿病视网膜病变中发生的首批改变之一。这种大鼠模型证实伊文思蓝渗漏，其是用于测量血管通透性的标准测定（参见Kern “In vivo models of diabetic retinopathy” Contemporary Diabetes 2:137-151（2008；Bhatt和Addepalli “Attenuation of diabetic retinopathy by enhanced inhibition of MMP-2 and MMP-9 using aspirin and minocycline in streptozotocin-diabetic rats” Am. J. Transl. Res 2（2）:181-189（2010））。因此，它在本领域中已知作为在人糖尿病视网膜病变中发生的这些早期改变的替代动物模型。这种血管渗漏与视力丧失直接相关，因为它可以导致在黄斑周围的流体积聚，并且黄斑损害是患有糖尿病视网膜病变的患者中的严重视力丧失的已知原因。此外，因子诸如抑制这种毛细血管渗漏的血管内皮生长因子抑制剂已显示抑制在糖尿病视网膜病变中发生的其他改变。总之，因为针对大鼠IAP的氨基酸71直到80（与人IAP中的相同序列同源的区）的抗体抑制视网膜毛细血管渗漏，所以预期它将是用于人糖尿病视网膜病变的有效治疗。
实施例3
原理：整联蛋白相关蛋白质，也称为IAP和CD 47，是充当细胞上的自识别抗原的跨膜蛋白质。这意指当它与定位于巨噬细胞表面上的蛋白质（称为SHPS-1）结合时，这些细胞不分泌激活细胞杀伤的细胞因子，并且表达IAP的靶细胞保持存活。经历正常凋亡的许多类型的细胞无法表达IAP，因此使得这种杀伤能够有效发生。相反，几类癌细胞或异常表达IAP，或不从IAP中蛋白水解切割SHPS-1结合位点，并且因此抵抗通过活化的巨噬细胞的吞噬。已假定破坏IAP/SHPS-1结合将导致增加的肿瘤细胞杀伤。然而，仍未鉴定在IAP内的氨基酸序列，其具有足够的异质性以能够编码几类不同的自识别序列。本发明的研究已确定在氨基酸71-80内的区含有这种自识别信息，并且涉及IAP与SHPS-1结合。与已得到开发的破坏IAP/SHPS-1结合的其他类型的抗体相反，本发明的抗体靶向氨基酸71-80内的这种序列，从而直接干扰自识别，因此导致肿瘤细胞吞噬。重要的是，本发明的抗体不中断IAP及其他细胞表面蛋白质例如αVβ3整联蛋白的β3亚单位之间的相互作用。这是重要的，因为这些其他相互作用介导对于维持正常细胞的生理功能所需的细胞过程。
因为本发明的抗体针对这种特异性位点，所以将进行实验以确定破坏这个位点与肿瘤细胞上的SHPS-1的结合导致癌细胞生长的抑制。这些实验将在两个时期中实施。在第一个时期中，本发明的单克隆抗体或对照IgG将加入在标准条件下的培养物中生长的癌细胞中（例如如本文描述的乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌细胞等），并且用10%胎牛血清刺激生长。另外的培养物将含有生长因子胰岛素样生长因子I（IGF-I），因为IAP/SHPS-1结合已知参与IGF-I刺激的细胞增殖。将0.05-5.0 ug/ml之间的渐增浓度的抗体加入培养物中，并且48小时后通过直接计数测量细胞增殖。对照培养物将接受等浓度的IgG。IGF-I将以50 ng/mL的浓度使用。如果抗体成功抑制肿瘤细胞的增殖，则将采取体内实验。在这个实验中，无免疫应答的小鼠将用例如3百万肿瘤细胞/ml皮下注射。将有例如12只小鼠/处理。一组将接受以由体外实验结果测定的浓度的活性抗体。例如，如果100 ng /ml的抗体浓度导致细胞生长的完全抑制，则为了实现该血清浓度，将400 µg腹膜内注射到每只小鼠内。活性处理组中的所有小鼠均接受相同浓度的抗体，其将每周施用共六周到八周的时期。对照动物将接受等浓度的小鼠IgE。两组中的动物将被处死，并且测定肿瘤体积和重量。肿瘤转移将通过分析肺、肝、肾和脑的组织学切片进行测定。肿瘤组织还通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳就完整IAP的存在进行分析，并且通过SHPS-1的免疫沉淀随后为IAP的免疫印迹就IAP/SHPS-1结合进行分析。还将使用已知技术进行参与细胞增殖的激酶例如AKT和MAP激酶的活化的进一步分析，以测定其活化形式。这个实验的结果将确定破坏在IAP上的这种特异性位点与SHPS-1的结合导致肿瘤细胞增殖的抑制。
前述用作说明本发明，并且不应解释为其限制。本发明通过下述权利要求进行限定，并且权利要求的等同物包括在其中。

Claims (16)

1.单克隆抗体，其特异性结合在人IAP蛋白质的氨基酸71-80内的表位，并且是IAP与SHPS-1结合的拮抗剂。
2.权利要求1的抗体，其与可检测基团偶联。
3.权利要求1的抗体，其与治疗性基团偶联。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体不破坏IAP与β3蛋白质的结合。
5.药物制剂，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求1的抗体。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体选自（a）由杂交瘤NPG-1产生的单克隆抗体，和（b）竞争结合与由通过所述杂交瘤NPG-1产生的单克隆抗体结合的表位相同的表位的单克隆抗体。
7.权利要求6的抗体，其与可检测基团偶联。
8.权利要求6的抗体，其与治疗性基团偶联。
9.药物制剂，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求6的抗体。
10.抑制有其需要的个体中IGF-1作用的方法，其包括向所述个体施用权利要求1的抗体。
11.抑制有其需要的个体中IGF-1作用的方法，其包括向所述个体施用权利要求6的抗体。
12.治疗个体中视网膜病变的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1或权利要求6的抗体。
13.治疗个体中动脉粥样硬化的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1或权利要求6的抗体。
14.治疗个体中肾病的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1或权利要求6的抗体。
15.治疗个体中冠心病的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1或权利要求6的抗体。
16.治疗个体中癌症的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1或权利要求6的抗体。
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