CN104023746A - Rspo结合剂和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及RSPO结合剂和使用该结合剂治疗诸如癌等疾病的方法。本发明还提供特异性结合人RSPO蛋白并调节β连环素活性的抗体。本发明还提供使用调节RSPO蛋白的活性的试剂的方法，所述试剂例如为特异性结合RSPO1、RSPO2和/或RSPO3并抑制肿瘤生长的抗体。还描述了治疗癌的方法，所述方法包括对具有肿瘤或癌的患者施用治疗有效量的本发明的试剂或抗体。

Description

RSPO结合剂和其应用
背景技术
技术领域
本发明的领域大体上涉及结合包括RSPO1、RSPO2和RSPO3在内的R-反应蛋白(RSPO)(特别是人R-反应蛋白)的抗体和其他试剂，以及使用所述抗体或其他试剂来治疗诸如癌等疾病的方法。
背景技术
蛋白质的R-反应蛋白(RSPO)家族在脊椎动物中是保守的，并且包括四个成员，RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。这些蛋白被以各种名称相称，包括顶板特异性反应蛋白、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin1-4和Futrin1-4。RSPO是小的分泌蛋白，其共享约40%至60%的序列同源性和结构域组织。所有的RSPO蛋白在N-末端含有两个弗林蛋白酶(furin)样富半胱氨酸结构域，其连着血小板反应蛋白结构域以及碱性带电C末端尾部(Kim等，2006,Cell Cycle,5:23-26)。
研究已经显示，RSPO蛋白在脊椎动物发育(Kamata等,2004,Biochim.BiophysActa,1676:51-62)期间和在非洲爪蟾肌发生(Kazanskaya等,2004,Dev.Cell,7:525-534)中起作用。RSPO1还据显示充当胃肠上皮细胞用的强效丝裂原(Kim等,2005,Science,309:1256-1259)。已知RSPO蛋白激活与Wnt信号传导相似的β连环素信号传导，但是仍正在研究RSPO蛋白和Wnt信号传导之间的关系。已经报道RSPO蛋白对Wnt配体拥有正向调节活性(Nam等,2006,JBC281:13247-57)。该研究报道了RSPO蛋白能够充当Frizzled8和LRP6受体配体，并诱导β连环素信号传导(Nam等,2006,JBC281:13247-57)。近期研究已经鉴定了RSPO蛋白和诸如LGR5等LGR(富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体)蛋白之间的相互作用(美国专利公开第2009/0074782和2009/0191205号)，这些数据提出了β-连环素信号传导的激活的替代途径。
Wnt信号传导途径已被鉴定为癌治疗的潜在靶标。Wnt信号传导途径是胚胎模式形成、胚胎后组织维持和干细胞生物学的数种关键调节因素之一。更具体而言，Wnt信号传导在细胞极性的产生和细胞命运特化(包括干细胞群的自我更新)中起重要作用。不受调节的Wnt途径的激活与许多人类癌症有关，据信在所述癌症中这样的激活能够改变细胞的发育命运。Wnt途径的激活可以将肿瘤细胞保持在未分化状态和/或导致不受控的增殖。因此癌变可以通过压制控制正常发育和组织修复的体内平衡机制进行(在Reya&Clevers,2005,Nature,434:843-50;Beachy等,2004,Nature,432:324-31中综述)。
Wnt信号传导途径首次在果蝇发育突变无翼体(wg)中阐明，并且来自鼠类原癌基因int-1(现在的Wnt1)(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109;Van Ooyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40;Cabrera等,1987,Cell,50:659-63;Rijsewijk等,1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因编码分泌的脂修饰的糖蛋白，所述糖蛋白在哺乳动物中已被鉴定出其中的19个。这些分泌的配体激活由Frizzled(FZD)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LRP5/6)组成的受体复合物。FZD受体是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的7个跨膜结构域蛋白，并且含有具有10个保守性半胱氨酸的大的细胞外N末端配体结合结构域，该结构域被称为富半胱氨酸结构域(CRD)或Fri结构域。存在10种人FZD受体，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10。不同的FZD CRD对特定的Wnt蛋白具有不同的结合亲和性(Wu&Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277:41762-9)，因此将FZD受体分类为激活典型β连环素途径的受体和激活非典型途径的受体(Miller等,1999,Oncogene,18:7860-72)。
在经附近注射鼠类病毒而转化的乳腺瘤中将Wnt1(最初称为int1)鉴定为致癌基因后，首次揭示了Wnt信号传导在癌中的作用(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109)。近期还已经积累了Wnt信号传导在乳腺癌中的作用的额外证据。例如，乳腺中β-连环素的转基因过表达导致增生和腺癌(Imbert等,2001,J.Cell Biol.,153:555-68;Michaelson&Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，而Wnt信号传导的丧失干扰正常的乳腺发育(Tepera等,2003,J.Cell Sci.,116:1137-49;Hatsell等,2003,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,8:145-58)。在人乳腺癌中，β-连环素累积在超过50%的癌中涉及激活的Wnt信号传导，虽然尚未鉴定出具体的突变，但是观察到Frizzled受体表达的上调(Brennan&Brown,2004,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,9:119-31;Malovanovic等,2004,Int.J.Oncol.,25:1337-42)。
Wnt途径的激活还与结直肠癌相关。所有结直肠癌中的约5%至10%遗传有作为家族性腺瘤性息肉病(FAP)的主要形式之一，该疾病是一种常染色体显性疾病，其中约80%的受影响个体含有腺瘤性结肠息肉病(APC)基因中的种系突变。还在包括Axin和β-连环素在内的其他Wnt途径组分中鉴定出突变。个体的腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮细胞的克隆外生长物，大量的FAP腺瘤必然通过致癌基因和/或肿瘤抑制基因的另外突变导致腺癌的发展。此外，Wnt信号传导途径的激活，包括APC中的功能丧失突变和β-连环素中的稳定化突变，能够诱导小鼠模型中的增生性发育和肿瘤生长(Oshima等,1997,Cancer Res.,57:1644-9;Harada等,1999,EMBO J.,18:5931-42)。
与乳腺癌和结肠癌相似，黑素瘤经常具有Wnt途径的组成性激活，这可以通过β-连环素的细胞核累积表明。将Wnt/β-连环素途径在一些黑素瘤和细胞系中的激活归因于诸如APC、ICAT、LEF1和β-连环素等途径组分的修饰(例如参见Larue等，2006,Frontiers Biosci.,11:733-742)。但是，关于Wnt/β-连环素信号传导在黑素瘤中的确切作用在文献中存在矛盾的报道。例如，一个研究从黑素瘤发现细胞核β-连环素的水平升高与存活率提高相关，并且发现激活的Wnt/β-连环素信号传导与细胞增殖减少相关(Chien等,2009,PNAS,106:1193-1198)。
癌药物研究的焦点正在转向以参与人癌的基因、蛋白质和途径为目标的靶向治疗。对于靶向信号传导途径的新型试剂和靶向能够为癌患者提供治疗益处的多种途径的新型试剂组合存在需要。因此，干扰β-连环素信号传导的生物分子(例如抗-RSPO抗体)是癌以及其他β-连环素相关疾病的新型治疗剂的潜在来源。
发明内容
本发明提供诸如抗体等结合RSPO蛋白的结合剂，以及包含所述结合剂的组合物，例如药物组合物。在一些实施方式中，RSPO-结合剂是诸如抗体、抗体片段等新型多肽以及涉及此类抗体的其他多肽。在一些实施方式中，所述结合剂是特异性结合人RSPO1、RSPO2和/或RSPO3的抗体。本发明还提供通过对具有肿瘤的受试对象施用所述RSPO-结合剂而抑制肿瘤生长的方法。本发明还提供通过对有需要的受试对象施用所述RSPO-结合剂而治疗癌的方法。在一些实施方式中，治疗癌或抑制肿瘤生长的方法包括用所述RSPO-结合剂靶向癌干细胞。在一些实施方式中，所述方法包括减少肿瘤中癌干细胞的频率、减少肿瘤中癌干细胞的数量、减少肿瘤的致瘤性(tumorigenicity)和/或通过减少肿瘤中癌干细胞的数量或频率来减少肿瘤的致瘤性。
在一个方面，本发明提供诸如抗体等特异性结合人RSPO1的结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂在人RSPO1的21～263位氨基酸内结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂在人RSPO1的34～135位氨基酸内结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂在人RSPO1的91～135位氨基酸内结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂(例如抗体)特异性结合选自由RSPO2、RSPO3和RSPO4组成的组中的至少一种其他人RSPO。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂或抗体调节β-连环素活性，是β-连环素信号传导的拮抗剂，抑制β-连环素信号传导和/或抑制β-连环素的激活。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂抑制RSPO1信号传导。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂抑制或干扰RSPO1与一种或多种LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂抑制RSPO1与LGR5的结合。
在另一个方面，本发明提供诸如抗体等特异性结合人RSPO2的结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂在人RSPO2的22～243位氨基酸内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂在人RSPO2的22～205位氨基酸内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂在人RSPO2的34～134位氨基酸内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂在人RSPO2的90～134位氨基酸内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂(例如抗体)特异性结合选自由RSPO1、RSPO3和RSPO4组成的组中的至少一种其他人RSPO。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂或抗体调节β-连环素活性，是β-连环素信号传导的拮抗剂，抑制β-连环素信号传导和/或抑制β-连环素的激活。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂抑制RSPO2信号传导。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂抑制或干扰RSPO2与一种或多种LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂抑制RSPO2与LGR5的结合。
在各个上述方面和实施方式中的一些实施方式以及本文所述的其他方面和实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体结合人RSPO1。在一些实施方式中，所述抗体结合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些实施方式中，所述抗体以小于1nM的KD结合人RSPO1和以小于1nM的KD结合小鼠RSPO1。
在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体，所述抗体含有包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3。在一些实施方式中，所述抗体还含有包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体，所述抗体含有包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体，所述抗体含有：(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(b)包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(c)包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(d)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(e)包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和(f)包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ IDNO:10具有至少80%序列同一性的重链可变区和/或(b)与SEQ ID NO:11具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQID NO:11具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ IDNO:55具有至少80%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:59具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:55具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:59具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是单克隆抗体89M5，由在2011年6月30日保藏的ATCC保藏号为PTA-11970的杂交瘤细胞系89M5产生。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5的人源化形式。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是人源化单克隆抗体h89M5-H2L2。
在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是结合人RSPO2的抗体。在一些实施方式中，所述抗体结合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些实施方式中，所述抗体含有包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ IDNO:30)的重链CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3。在一些实施方式中，所述抗体还含有包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQID NO:34)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体含有包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ IDNO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体含有：(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(b)包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重链CDR2，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(c)包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(d)包含KASQDVSSAVA(SEQID NO:32)的轻链CDR1，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(e)包含WASTRHT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR2，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和(f)包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3，或者其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ IDNO:27具有至少80%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:28具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:27具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:28具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ IDNO:63具有至少80%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:67具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:63具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:67具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ IDNO:63具有至少80%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:76具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:63具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:76具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是单克隆抗体130M23，由在2011年8月10日保藏的ATCC保藏号为PTA-12021的杂交瘤细胞系130M23产生。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23的人源化形式。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是人源化单克隆抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是人源化单克隆抗体h130M23-H1L6。
在另一方面，本发明提供与本发明的抗体竞争与人RSPO蛋白的特异性结合的结合剂(例如抗体)。在一些实施方式中，所述结合剂(例如抗体)与含有包含SEQ IDNO:10的重链可变区和包含SEQ ID NO:11的轻链可变区的抗体竞争与人RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，所述结合剂(例如抗体)与含有包含SEQ ID NO:55的重链可变区和包含SEQ ID NO:59的轻链可变区的抗体竞争与人RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，与所述RSPO1-结合剂竞争的抗体是89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述结合剂在体外竞争性结合检验中与本发明的抗体竞争与RSPO1的特异性结合。
在一些实施方式中，所述抗体与本发明的抗体(例如89M5)所结合的RSPO1上的表位相同或基本上相同。
在又一方面，所述结合剂是抗体，所述抗体结合的RSPO1上的表位与本发明的抗体(例如89M5)结合的RSPO1上的表位重叠。
在另一方面，本发明提供与本发明的抗体竞争与人RSPO2的特异性结合的结合剂(例如抗体)。在一些实施方式中，所述结合剂(例如抗体)与含有包含SEQ ID NO:27的重链可变区和包含SEQ ID NO:28的轻链可变区的抗体竞争与人RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，所述结合剂(例如抗体)与含有包含SEQ ID NO:63的重链可变区和包含SEQ ID NO:67的轻链可变区的抗体竞争与人RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，所述结合剂(例如抗体)与含有包含SEQ ID NO:63的重链可变区和包含SEQ ID NO:76的轻链可变区的抗体竞争与人RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，与所述RSPO2-结合剂竞争的抗体是130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述结合剂在体外竞争性结合检验中与本发明的抗体竞争与RSPO2的特异性结合。
在一些实施方式中，所述抗体与本发明的抗体(例如89M5)所结合的RSPO2上的表位相同或基本上相同。
在又一方面，所述结合剂是抗体，所述抗体结合的RSPO2上的表位与本发明的抗体(例如130M23)结合的RSPO2上的表位重叠。
在各个上述方面以及本文别处描述的其他方面和/或和实施方式中的一些实施方式中，RSPO-结合剂或抗体是分离的。
在另一方面，本发明提供包含SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11的多肽。在另一方面，本发明提供包含SEQ ID NO:55和/或SEQ ID NO:59的多肽。在另一方面，本发明提供包含SEQ ID NO:27和/或SEQ ID NO:28的多肽。在另一方面，本发明提供包含SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:67的多肽。在另一方面，本发明提供包含SEQID NO:63和/或SEQ ID NO:76的多肽。在一些实施方式中，结合RSPO1的多肽含有包含SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:26的多肽。在一些实施方式中，结合RSPO1的多肽含有包含SEQ ID NO:68和/或SEQ ID NO:69的多肽。在一些实施方式中，结合RSPO2的多肽含有包含SEQ ID NO:41和/或SEQ ID NO:42的多肽。在一些实施方式中，结合RSPO2的多肽含有包含SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:71的多肽。在一些实施方式中，结合RSPO2的多肽含有包含SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:74的多肽。在一些实施方式中，所述多肽是分离的。在一些实施方式中，所述多肽基本上是纯的。在一些实施方式中，所述多肽是抗体。
在另一方面，本发明提供分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码各个上述方面以及本文描述的其他方面和/或实施方式的抗体和/或多肽。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58组成的组中的序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:75组成的组中的序列。本发明还提供包含所述多核苷酸的表达载体以及包含所述表达载体和/或多核苷酸的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是杂交瘤细胞系。在一些实施方式中，所述细胞是ATCC保藏号为PTA-11970的杂交瘤细胞系。在一些实施方式中，所述细胞是ATCC保藏号为PTA-12021的杂交瘤细胞系。
在其他方面，本发明提供抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的RSPO-结合剂或抗体(包括本文描述的每种RSPO-结合剂或抗体)接触。
在另一方面，本发明提供抑制受试对象中肿瘤生长的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂或抗体(包括本文描述的每种RSPO-结合剂或抗体)。
在另一方面，本发明提供抑制细胞中β-连环素信号传导的方法，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的RSPO-结合剂或抗体(包括本文描述的每种RSPO-结合剂或抗体)接触。在一些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述肿瘤是结直肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是卵巢瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是胰腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤表达的RSPO蛋白中的至少一种的水平升高。在一些实施方式中，所述肿瘤表达的RSPO1水平升高。在一些实施方式中，所述肿瘤表达的RSPO2水平升高。在一些实施方式中，所述肿瘤表达的RSPO3水平升高。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂例如通过减少肿瘤中癌干细胞的数量和/或频率而抑制肿瘤生长。
在另一方面，本发明提供治疗受试对象中的癌的方法。在一些实施方式中，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的上述RSPO-结合剂或抗体以及本文别处描述的RSPO-结合剂或抗体中的任一种。在一些实施方式中，所述癌是胰腺癌。在一些实施方式中，所述癌是结直肠癌。在一些实施方式中，所述结直肠癌包含在腺瘤性结肠息肉病(APC)基因中的失活突变。在一些实施方式中，所述结直肠癌不包含所述APC基因中的失活突变。在一些实施方式中，所述结直肠癌包含野生型APC基因。在一些实施方式中，所述癌是卵巢癌。在一些实施方式中，所述癌是乳腺癌。在一些实施方式中，所述癌是肺癌。在一些实施方式中，所述癌表达的至少一种RSPO蛋白的水平升高。在一些实施方式中，所述癌是表达升高水平的RSPO1的卵巢癌。在一些实施方式中，所述癌是表达升高水平的RSPO2的结肠癌。在一些实施方式中，所述癌是表达升高水平的RSPO2的胰腺癌。在一些实施方式中，所述癌是表达升高水平的RSPO2的乳腺癌。在一些实施方式中，所述癌是表达升高水平的RSPO2的肺癌。
在另一方面，本发明提供治疗受试对象中疾病的方法，其中所述疾病与β-连环素的激活和/或异常的β-连环素信号传导相关，所述方法包括施用治疗有效量的RSPO-结合剂或抗体(包括本文所述的每种RSPO-结合剂或抗体)。
在各个上述方面以及本文别处描述的其他方面和/或实施方式中的一些实施方式中，所述治疗方法包括将RSPO-结合剂与至少一种另外的治疗剂组合施用。在一些实施方式中，所述治疗方法包括将RSPO1-结合剂与诸如RSPO2-结合剂、RSPO3-结合剂和/或RSPO4-结合剂等第二RSPO-结合剂组合施用。在一些实施方式中，所述治疗方法包括将RSPO2-结合剂与诸如RSPO1-结合剂、RSPO3-结合剂和/或RSPO4-结合剂等第二RSPO-结合剂组合施用。在一些实施方式中，所述治疗方法包括将RSPO1-结合剂与RSPO2-结合剂组合施用。在一些实施方式中，所述治疗方法包括施用RSPO1-结合剂、RSPO2-结合剂和化学治疗剂的组合。
在各个上述方面以及本文别处描述的其他方面和/或实施方式中的一些实施方式中，所述治疗方法还包括确定所述肿瘤或癌中至少一种RSPO蛋白的水平的步骤。
在另一方面，本发明提供鉴定人受试对象或选择人受试对象以用RSPO-结合剂或抗体(包括但不限于本文描述的每种RSPO-结合剂或抗体)进行治疗的方法。在一些实施方式中，所述方法包括确定所述受试对象是否具有肿瘤，所述肿瘤具有的特定RSPO(例如RSPO1或RSPO2)的表达水平与正常组织中相同的RSPO蛋白的表达相比升高。在一些实施方式中，如果所述肿瘤具有升高的RSPO表达水平，则所述方法包括鉴定治疗用受试对象或选择治疗用受试对象。在一些实施方式中，所述方法包括确定所述受试对象是否具有包含APC基因中的失活突变的肿瘤。在一些实施方式中，如果所述肿瘤具有APC基因中的失活突变，则所述方法包括鉴定治疗的受试对象或选择治疗的受试对象。
还提供了包含本文所述的RSPO-结合剂或抗体以及药学上可接受的载剂的药物组合物，以及产生所述RSPO-结合剂的细胞系。还提供了治疗受试对象(例如人)中的癌和/或抑制受试对象(例如人)中的肿瘤生长的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的包含所述RSPO-结合剂的组合物。
如果本发明的方面或实施方式根据马库什分组或其他替代分组进行描述，则本发明不仅涵盖了作为整体列出的整个组，还单独涵盖了所述组的每个成员以及主要组的所有可能的亚组，还涵盖了缺少一个或多个组成员的主要组。本发明还设想明确排除了在所要求保护的发明中的任意一个或多个组成员。
附图说明
图1.肿瘤和正常组织中的RSPO表达。显示了来自正常组织人样品、良性组织人样品和恶性组织人样品的微阵列数据的总结。各个刻度标记(tick mark)表示RSPOmRNA的表达水平。A)RSPO1B)RSPO2C)RSPO3
图2.RSPO蛋白和LGR5的结合研究。表达LGR5的HEK-293细胞的FACS分析。将HEK-293细胞用编码FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表达载体瞬时转染，然后与可溶性RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc或RSPO4-Fc融合蛋白混合。使用抗FLAG抗体作为阳性对照，使用可溶性FZD8-Fc作为阴性对照。通过在各个FACS图上的黑线框重叠区(dark lined box overlay)内信号的存在表示特异性结合。
图3.肺瘤细胞条件培养基中抑制活性的鉴定。使用6xTCF-荧光素酶报告基因检验来测定HEK-293细胞中的β-连环素信号传导。在可溶性LGR5-Fc的存在下使HEK-293细胞暴露至含有Wnt3a L细胞条件培养基的对照培养基(DMEM培养基)或含有肺瘤细胞条件培养基和Wnt3a L细胞条件培养基的培养基。使用可溶性Jag-Fc和抗体LZ1作为阴性对照。使用可溶性FZD8-Fc和阻断Wnt3a的抗-FZD抗体作为阳性对照。以10μg/ml使用可溶性LGR5-Fc、Jag-Fc和FZD8-Fc融合蛋白。以40μg/ml使用抗-FZD抗体和LZ1抗体。
图4.β-连环素信号传导的诱导的抑制。使用6xTCF-荧光素酶报告基因检验来测定HEK-293细胞中的β-连环素信号传导。在可溶性LGR5-Fc在20μg/ml～0.02μg/ml的四倍稀释液存在下，使HEK-293细胞暴露至含有10ng/ml RSPO2和25%Wnt3a L细胞条件培养基的培养基(“RSPO2”)或含有25%肺瘤细胞条件培养基和25%Wnt3a L细胞条件培养基的培养基(“LT”)；具有LGR5-Fc的RSPO2(-□-)和具有LGR5-Fc(-■-)的LT。具有RSPO2(-△-)或LT(-▲-)的20μg/ml的可溶性Jag-Fc用作阴性对照。具有RSPO2(-○-)或LT(-●-)的20μg/ml的阻断Wnt3a的可溶性FZD8-Fc用作阳性对照。
图5.结合RSPO1的抗体的鉴定。A)融合蛋白FLAG-RSPO1弗林蛋白酶-CD4TM-GFP的图示。B)所产生的针对人RSPO1的抗体的FACS分析。y轴显示相对抗体结合，x轴表示FLAG-RSPO1弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表达。通过在各个FACS图上的黑线框重叠区内信号的存在表示阳性结合。使用抗-FLAG抗体作为阳性对照。使用抗-PE抗体作为阴性对照。
图6.抑制由RSPO1诱导的β-连环素信号传导的抗-RSPO1抗体的鉴定。在浓度渐增的抗-RSPO1抗体(89M2、89M4、89M5、89M7、89M19或89M25)或无关对照抗体(254M14或254M26)的存在下，在将HEK-293细胞暴露至Wnt3a(5ng/ml)和RSPO1(10ng/ml)的组合后，使用TOPflash荧光素酶报告基因检验来测定所述HEK-293细胞中的β-连环素信号传导。抗体以10μg/ml～0.625μg/ml范围内的2倍稀释液使用。对照包括在不存在抗体时暴露至对照培养基(无Wnt3a和无RSPO)、单独Wnt3a或者Wnt3a和RSPO的组合。
图7.阻断RSPO1/LGR5结合的抗-RSPO1抗体的鉴定。表达LGR5的HEK-293细胞的FACS分析。将HEK-293细胞用编码FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表达载体瞬时转染，然后与组合有各种抗-RSPO1抗体的可溶性RSPO1-Fc融合蛋白混合。用缀合有PE的抗人Fc二抗检测结合。y轴显示相对RSPO1-Fc结合，x轴表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表达。通过在各个FACS图上的黑线框重叠区内信号的存在表示阳性结合。使用抗-PE抗体作为阴性对照。
图8.用抗-RSPO1抗体抑制肿瘤生长。将OV19卵巢瘤细胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用89M5(-●-)、89M25紫杉醇(-◆-)、抗体89M5和紫杉醇的组合(-○-)、抗体89M25和紫杉醇的组合(-□-)或者对照抗体1B7.11(-■-)治疗小鼠。数据显示为治疗后天数与肿瘤体积(mm3)。
图9.抗-RSPO1抗体的表位作图。A)含有RSPO1结构域的缺失系列的所构建的融合蛋白的图。这些构建体都包含允许所述蛋白的细胞表面表达的CD4TM结构域。B)抗-RSPO1抗体与用所述融合蛋白转染的细胞的结合的FACS分析。y轴显示相对抗体结合，x轴表示所述融合蛋白的表达。使用抗-FLAG抗体作为阳性对照。使用抗-PE抗体作为阴性对照。
图10.结合RSPO2的抗体的鉴定。所产生的针对人RSPO2的抗体的FACS分析。y轴显示相对抗体结合，x轴表示FLAG-RSPO2弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表达。使用抗-FLAG抗体作为阳性对照。使用抗-PE抗体作为阴性对照。
图11.抑制RSPO2诱导β-连环素信号传导的抗-RSPO2抗体的鉴定。在针对RSPO2的抗体(mAbs130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28)的存在下，在将HEK-293细胞暴露至Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO2(10ng/ml)的组合或Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO3(10ng/ml)的组合后，使用TOPflash荧光素酶报告基因检验来测定所述HEK-293细胞中的β-连环素信号传导。对照包括在不存在抗体时暴露至对照培养基(不添加Wnt3a和没有RSPO标记的“细胞”)、单独Wnt3a(经标记的“W3A”)或者Wnt3a和RSPO的组合。
图12.阻断RSPO2/LGR5结合的抗-RSPO2抗体的鉴定。表达LGR5的HEK-293细胞的FACS分析。将HEK-293细胞用编码FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表达载体瞬时转染，然后与组合有各种抗-RSPO2抗体的可溶性RSPO2-Fc融合蛋白混合。用缀合有PE的抗人Fc二抗检测结合。y轴显示相对RSPO2-Fc结合，x轴表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表达。通过在各个FACS图上的黑线框重叠区内信号的存在表示阳性结合。使用抗FLAG抗体作为阳性对照，使用抗-PE抗体作为阴性对照。
图13.肿瘤细胞条件培养基中抑制活性的鉴定。在可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc或对照融合Fc蛋白的存在下，将STF-293细胞暴露至对照培养基(DMEM培养基)、含有Wnt3a L细胞条件培养基的培养基、含有肿瘤细胞条件培养基的培养基或含有肿瘤细胞条件培养基和Wnt3a L细胞条件培养基的培养基。以10μg/ml使用可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc和对照-Fc融合蛋白。从肺瘤LU2(图13A)、肺瘤LU25(图13B)和卵巢瘤OV38(图13C)制备肿瘤细胞条件培养基。
图14.β-连环素信号传导的诱导的抑制。使STF-293与LU2细胞和25%的肺瘤细胞条件培养基以及25%Wnt3a-L细胞条件培养基一起温育。将抗体130M23(-■-)和可溶性LGR5-Fc(-●-)以50μg/ml～0.0006μg/ml范围内的5倍连续稀释液添加至所述细胞。使用经过类似稀释的无关单克隆抗体(-□-)和对照Fc融合蛋白(-△-,50μg/ml)作为阴性对照。
图15.用抗-RSPO抗体抑制肿瘤生长。将PN31胰腺瘤细胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用抗-RSPO1抗体89M5(-□-)、抗-RSPO2抗体130M23(-▲-)、吉西他滨(-■-)、抗体89M5和吉西他滨的组合抗体130M23和吉西他滨的组合(-◇-)或对照抗体1B7.11(-○-)治疗小鼠。数据显示为植入后天数与肿瘤体积(mm3)。
图16.用抗-RSPO抗体抑制肿瘤生长。将PN7胰腺瘤细胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用抗-RSPO2抗体130M23抗-FZD抗体18R5(-▲-)、吉西他滨(-●-)、130M23和18R5的组合(-○-)、130M23和吉西他滨的组合(-□-)、18R5和吉西他滨的组合(-△-)、130M23、18R5和吉西他滨的组合(-◇-)或对照抗体1B7.11(-■-)治疗小鼠。数据显示为治疗后天数与肿瘤体积(mm3)(图16A)。用Wnt途径抑制剂FZD8-Fc和吉西他滨的组合(-△-)、130M23和吉西他滨的组合130M23、FZD8-Fc和吉西他滨的组合(-◇-)、吉西他滨(-●-)或对照抗体1B7.11(-■-)治疗小鼠。数据显示为治疗后天数的肿瘤体积(mm3)(图16B)。将所得到的肿瘤处理成单细胞悬浮液，并连续移植到小鼠中。将获自每个治疗组的90个肿瘤细胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。在不进行治疗时使肿瘤生长。数据显示为第40天的肿瘤体积(mm3)(图16C)。
图17.人源化RSPO抗体的FACS分析。A)人源化89M5抗体(h89M5-H2L2)和亲本89M5抗体的FACS分析。测试每种抗体的5倍连续稀释液。y轴显示相对抗体结合，x轴表示FLAG-RSPO1弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表达。B)人源化130M23抗体(h130M23-H1L2)和亲本130M23抗体的FACS分析。测试每种抗体的5倍连续稀释液。y轴显示相对抗体结合，x轴表示FLAG-RSPO2弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表达。
图18.用抗-RSPO1和抗-RSPO2抗体抑制肿瘤生长。将B39三重阴性(triplenegative)乳腺癌肿瘤细胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用抗-RSPO1抗体89M5和抗-RSPO2抗体130M23的组合(-○-)、顺铂89M5、130M23和顺铂的组合(-●-)或对照抗体1B7.11(-■-)治疗小鼠。数据显示为治疗后天数的肿瘤体积(mm3)。
具体实施方式
本发明提供结合RSPO蛋白(例如人RSPO1、RSPO2和/或RSPO3)的新型试剂，包括但不限于多肽，例如抗体。所述RSPO-结合剂包括β-连环素信号传导的拮抗剂。还提供了相关多肽和多核苷酸、包含所述RSPO-结合剂的组合物以及制造所述RSPO-结合剂的方法。进一步提供了使用上述新型RSPO-结合剂的方法，例如抑制肿瘤生长的方法、治疗癌的方法、减少癌干细胞在肿瘤中的频率的方法、抑制β-连环素信号传导的方法和/或鉴定和/或选择治疗用受试对象的方法。
已经鉴定出特异性结合人RSPO1的单克隆抗体：单克隆抗体89M2、89M4、89M5、89M7、89M19和89M25(实施例5、图5)。抗-RSPO1抗体89M2、89M4、89M5和89M25抑制β-连环素信号传导(实施例6、图6)。抗-RSPO1抗体89M2、89M4、89M5和89M25阻断可溶性RSPO1与LGR5的结合(实施例7、图7)。随后，序列数据证明抗体89M2、89M4、89M5和89M25含有相同的重链和轻链可变区，并且据推断这些抗体会包含相同的抗原结合位点。抗-RSPO1抗体89M4、89M5、89M7和89M25对人和小鼠RSPO1的结合亲和性都小于0.1nM(实施例8)。产生了89M5的人源化版本h89M5-H2L2(实施例19)，其对人RSPO1的结合亲和性小于0.1nM(实施例20)。已经发现抗-RSPO1抗体89M5和89M25在卵巢瘤异种移植物模型中作为单独的试剂和与化学治疗剂组合在体内抑制肿瘤细胞生长(实施例9、图8)。抗-RSPO1抗体89M5显示在胰腺瘤异种移植物模型中与化学治疗剂组合在体内抑制肿瘤细胞生长(实施例17、图15)。初步的表位作图研究表明，抗-RSPO1抗体89M5的结合位点涉及RSPO1的弗林蛋白酶2结构域内的氨基酸(实施例10、图9)。
此外，已经鉴定出特异性结合人RSPO2的单克隆抗体：单克隆抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28(实施例11、图10)。抗-RSPO2抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28据显示会减少或完全阻断β-连环素信号传导(实施例12、图11)。抗-RSPO2抗体130M23和130M24阻断可溶性RSPO2与LGR5的结合(实施例13、图12)。抗-RSPO2抗体130M23对人RSPO2的结合亲和性为0.14nM，对小鼠RSPO2的结合亲和性为0.35nM(实施例15)。产生了130M23的人源化版本h130M23-H1L2和h130M23-H1L6(实施例19)。抗-RSPO2抗体h130M23-H1L2对人RSPO2的结合亲和性为0.13nM，h130M23-H1L6对人RSPO2的结合亲和性为0.15nM(实施例20)。抗-RSPO2抗体130M23显示在胰腺瘤异种移植物模型中作为单独试剂和与另外的化学治疗剂组合在体内抑制肿瘤细胞生长(实施例17和18、图15和16)。
I.定义
为了便于理解本发明，将许多术语和短语如下定义。
本文所用的术语“拮抗剂”和“拮抗的”是指任何部分或完全阻断、抑制、减少或中和靶标和/或信号传导途径(例如，β-连环素信号传导)的分子。本文使用术语“拮抗剂”来包括任何部分或完全阻断、抑制、减少或中和蛋白质的活性(例如，RSPO蛋白)的分子。合适的拮抗剂分子具体包括但不限于拮抗性抗体或抗体片段。
本文使用的术语“调节”和“调整”是指生物活性的改变或变化。调节包括但不限于刺激或抑制活性。调节可以是活性的增加或降低(例如RSPO信号传导的降低、β-连环素信号传导的降低)、结合特性的改变、或者与蛋白活性、途径或其他所关注生物点有关的生物、功能或免疫性质上的任何其他改变。
本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别和特异性结合靶标，例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或者前述的组合。如本文所述，该术语涵盖了完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(例如由至少两个完整抗体产生的双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他经修饰免疫球蛋白分子，只要该抗体展现所需的生物活性即可。基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的抗体的重链恒定结构域，抗体可以是免疫球蛋白的五个主要类别中的任一个：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或者其亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同且公知的亚基结构以及三维构型。抗体可以是裸露的，或缀合至其他分子，包括但不限于毒素和放射性同位素。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本文使用的“抗体片段”包括抗原结合位点或表位结合位点。
术语抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为“超变区”)连接的四个框架区(FR)组成。各链中的CDR通过框架区而保持得相互靠近，并与来自其他链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。确定CDR的技术至少有两种技术：(1)基于交叉物种序列可变性的方法(即，Kabat等,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,National Institutes of Health,Bethesda MD)和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体研究的方法(Al-Lazikani等,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。此外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指参与高特异性识别和结合单一抗原决定簇或表位的均匀抗体群体。这与多克隆抗体相反，多克隆抗体通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物。术语“单克隆抗体”涵盖了完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如,Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)抗体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点(抗原结合位点)的任何其他经修饰免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指通过任意数量的技术制造的此类抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤技术、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
本文使用的术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠类)抗体的形式，其是特异性的免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人序列的片段。通常，人源化抗体是其中CDR残基被具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR残基替换的人免疫球蛋白(Jones等,1986,Nature,321:522-525;Riechmann等,1988,Nature,332:323-327;Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536)。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。人源化抗体可以通过Fv框架区中和/或所替换的非人残基中的另外残基的取代而被进一步修饰，从而改善和优化抗体特异性、亲和性和/或结合能力。通常，人源化抗体会包含至少一个、通常2个或3个含有所有或基本上所有对应于非人免疫球蛋白的CDR的可变结构域，但所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。用于生成人源化抗体的方法的实例描述于例如美国专利5,225,539。
本文使用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体，或者具有对应于使用任何本领域已知的技术制造的由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文使用的术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种以上物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区对应于源自一个具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)，而恒定区与源自另一物种(通常为人)的抗体中的序列是同源的，以避免引起该物种中的免疫响应。
文使用的短语“亲和性成熟抗体”是指在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致与不拥有这些改变的亲本抗体相比，该抗体与抗原的亲和性得到改善。优选的亲和性成熟抗体会对靶抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔的亲和性。亲和性成熟抗体通过本领域已知的步骤产生。例如，Marks等,1992,Bio/Technology10:779-783中描述了通过VH和VL结构域重排产生的亲和性成熟。Barbas等,1994,PNAS,91:3809-3813;Schier等,1995,Gene,169:147-155;Yelton等,1995,J.Immunol.155:1994-2004;Jackson等,1995,J.Immunol.,154:3310-9；和Hawkins等,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896中描述了CDR和/或框架残基的随机诱变。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文可以相互替换地使用，并且是指抗原的能够被特定抗体识别和特异性结合的部分。当抗原是多肽时，表位可以由相邻的氨基酸以及通过蛋白质的三维折叠而并排的非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在蛋白质变性时保留，而由三维折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在蛋白质变性时丢失。表位通常在独特的空间构象中包括至少3个、更经常至少5个或8～10个氨基酸。
术语“选择性结合”或“特异性结合”是指与替代物质(包括不相关蛋白)相比，抗体与表位、蛋白质或靶分子反应或结合得更频繁、更迅速、更持久、更具亲和性或以上情况的一些组合。在一些实施方式中，“特异性结合”例如是指抗体与蛋白结合的KD为约0.1mM以下，更通常小于约1μM。在一些实施方式中，“特异性结合”有时是指抗体与靶标结合的KD为至少约0.1μM以下，其他情况下是指为至少约0.01μM以下，另外的情况下为至少约1nM以下。由于不同物种的同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括在超过一个物种(例如人RSPO1和小鼠RSPO1)中识别蛋白质的抗体。类似地，由于不同蛋白质的多肽序列的特定区域内的同源性，特异性结合可以包括识别超过一种蛋白质(例如人RSPO1和人RSPO2)的抗体(或其他多肽或结合剂)。应该理解的是，在一些实施方式中，抗体或特异性结合第一靶标的结合部分可以或不可以特异性结合第二靶标。因此，“特异性结合”不必然要求(但其包括)专一性结合(即与单一靶标结合)。所以，在一些实施方式中，抗体可以特异性结合超过一种靶标。在一些实施方式中，多种靶标可以被抗体上的同一抗原结合位点结合。例如，在一些情况下，抗体可以包括两个相同的抗原结合位点，每个抗原结合位点特异性结合两种以上蛋白质(例如RSPO1和RSPO2)上的相同表位。在一些替代实施方式中，抗体可以是双特异性的或多特异性的，并且包含至少两个具有不同特异性的抗原结合位点。非限制性举例而言，双特异性抗体可以包括识别一种蛋白质(例如人RSPO1)上的表位的一个抗原结合位点，还包含第二个不同的识别第二蛋白质上的不同表位的抗原结合位点。通常提到结合是指特异性结合，但并非必然如此。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可以相互替换地使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可以包含经修饰氨基酸，并且其可以间插非氨基酸。该术语还涵盖了通过天然或干预而进行修饰的聚合物，例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记成分缀合。该定义中还涵盖了例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸)以及其他本领域已知的修饰的多肽。应该理解的是，由于本发明的多肽可以基于抗体，在一些实施方式中，所述多肽可以作为单链或结合链出现。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可以相互替换地使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸、经修饰核苷酸或碱基和/或他们的类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶引入聚合物中的任何物质。
“高严谨条件”可以通过以下鉴定：(1)使用低离子强度和高温以用于洗涤，例如50℃的15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠；(2)杂交期间使用诸如甲酰胺等变性剂，例如42℃的具有0.1%胎牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液(带750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠)的50%(v/v)甲酰胺；或(3)使用42℃的50%甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl,75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5×邓哈特溶液(Denhardt's solution)、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS和10%右旋糖酐硫酸酯，在42℃的0.2×SSC中洗涤，在55℃的50%甲酰胺中洗涤，然后在55℃的由含有EDTA的0.1×SSC组成的高严谨洗涤液中洗涤。
在两个以上核酸或多肽的背景下的术语“同一性”或百分比“同一性”，是指不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守性氨基酸取代，当就最大相应性进行比较和比对(必要时引入空位)时，两个或更多个相同或的序列或亚序列、或所述序列或亚序列的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查测定百分比同一性。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件是本领域已知的。这些包括但不限于LAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG WisconsinPackage及其各种变体。如使用序列比较算法或通过目视检查所测定的，当就最大相应性进行比较和比对时，本发明的两种核酸或多肽基本上具有同一性，这意味着他们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、且在一些实施方式中至少95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方式中，在长度为至少约10个、至少约20个、至少约40-60个、至少约60-80个残基或其间的任意整数值的序列区域上存在同一性。在一些实施方式中，在大于60-80个残基的更长区域(例如至少约80-100个残基)上存在同一性，并且在一些实施方式中，序列在所比较的序列(例如核苷酸序列的编码序列)的全长上基本上是相同的。
“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸被具有相似侧链的另一氨基酸替换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。优选的是，本发明的多肽序列和抗体中的保守性取代不会消除含有上述氨基酸序列的多肽或抗体与抗原的结合，所述抗原即所述多肽或抗体所结合的一种或多种RSPO蛋白。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本领域公知的。
本文使用的术语“载体”是指构建体，其能够递送并且通常在宿主细胞中表达一种或多种目的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂连接的DNA或RNA表达载体和包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处于未见于自然界中的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至他们不再处于其见于自然界中的形式的程度的那些。在一些实施方式中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
本文使用的术语“基本上纯”是指至少为50%纯(纯即无污染物)、至少为90%纯、至少为95%纯、至少为98%纯或至少为99%纯的材料。
本文使用的术语“癌”和“癌性的”是指或描述其中细胞群的特征在于不受控的细胞生长的哺乳动物中的生理条件。癌的实例包括但不限于上皮癌、母细胞瘤、肉瘤和血液癌(例如淋巴瘤和白血病)。
本文使用的术语“肿瘤”和“赘生物”是指由过度细胞生长或增殖(良性(非癌性)或恶性(癌性)，包括前癌损伤)引起的任何组织团块。
本文使用的术语“转移”是指癌从起始位点扩散或转移至身体的其他区域并在新位置发育有类似的癌损伤的过程。“转移”或“转移性”细胞是丧失与邻近细胞的粘附接触、通过血流或淋巴从疾病的原发位点移动从而入侵邻近的身体结构的细胞。
术语“癌干细胞”和“CSC”和“肿瘤干细胞”和“肿瘤起始细胞”在本文可以相互替换地使用，并且是指来自癌或肿瘤的如下细胞：(1)具有全面的增殖能力；2)能够进行不对称细胞分裂以产生一种或多种分化细胞后裔，其中分化细胞具有减少的增殖或发育潜能；和(3)能够进行对称细胞分裂以自我更新或自我维持。与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比，这些性质赋予癌干细胞在连续移植到免疫妥协的宿主(例如小鼠)时形成或建立肿瘤或癌的能力。癌干细胞以无序方式进行自我更新和分化，从而形成具有异常细胞类型的肿瘤，由于发生突变，所述异常细胞类型能够随时间发生改变。
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指源自癌或肿瘤或前癌损伤的总细胞群体，其包括非致瘤性细胞(其包含大量癌细胞群)和致瘤性干细胞(癌干细胞)。如本文所用，术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”当仅指缺乏更新分化能力的那些细胞时会被术语“非致瘤性的”修饰，从而将这些肿瘤细胞与癌干细胞区分开。
本文使用的术语“致瘤性的”是指癌干细胞的功能特征，包括自我更新性质(产生另外的致瘤性癌干细胞)和增殖以产生所有其他肿瘤细胞的性质(产生分化的非致瘤性肿瘤细胞)。
本文使用的术语“致瘤性”是指来自肿瘤的随机细胞样品在连续移植至免疫妥协的宿主(例如，小鼠)时形成可察觉的肿瘤的能力。
术语“受试对象”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、犬科动物、猫科动物和啮齿动物等，其是特定治疗的接受者。通常而言，本文术语“受试对象”或“患者”在指人类受试对象时可相互替换地使用。
术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或能够批准或在美国药典或用于包括人类在内的动物的其它公认的药典中列出。
术语“药学上可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的药物载剂”是指可以与至少一种本发明的结合剂(例如抗体)施用至受试对象的赋形剂、载剂或佐剂，当以足以递送治疗效果的剂量施用时其不破坏至少一种本发明的结合剂的药物活性，并且是非毒性的。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受试对象或哺乳动物中的疾病或病症有效的结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其他药物的量。在癌的情况下，药物的治疗有效量具有治疗效果，因此能够减少癌细胞的数量；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；减小癌干细胞的数量和频率；减小肿瘤尺寸；减少癌细胞群；抑制或停止癌细胞浸润到周围器官，包括例如癌扩散至软组织和骨中；抑制和停止肿瘤或癌细胞转移；抑制和停止肿瘤或癌细胞生长；某种程度上减缓与癌有关的一种或多种症状；减少发病率和致死率；改善生活品质；或所述效果的组合。如果试剂，例如抗体防止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞，则可以将其称为细胞抑制剂和/或细胞毒素。
术语“治疗中”或“治疗”或“待治疗”或“缓解”或“待缓解”等术语是指1)治愈、减慢、减轻所诊断病理疾病或病症的症状和/或暂停其发展的治疗性措施，以及2)预防和/或减慢目的病理疾病或病症的发展的预防性或防止性措施。因此需要治疗的对象包括已经罹患疾病的对象、倾向于罹患疾病的对象和其中待要预防疾病的对象。在一些实施方式中，如果患者显示以下情况中的一种或多种，则根据本发明的方法成功地“治疗”了受试对象：癌细胞的数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸的减小；浸润到周围器官的癌细胞(包括例如癌至软组织和骨的扩散)受抑制或不存在；肿瘤或癌细胞转移受抑制或不存在；癌生长受抑制或不存在；与特定癌相关的一种或多种症状的缓解；发病率和致死率减少；生活品质提高；或上述效果的某些组合。
如本说明书和权利要求所用，单数形式的“一种”、“一个”和“所述”包括复数形式，除非上下文明确地指出例外。
应该理解的是，在本文无论何处以语言“包含”描述了实施方式，也就提供了以术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外的类似实施方式。
本文诸如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B、A或B、(单独的)A和(单独的)B。类似地，诸如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖了以下实施方式中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；(单独的)A(单独)；(单独的)B(单独)；和(单独的)C。
II.RSPO-结合剂
本发明提供结合人RSPO蛋白的试剂。本文将这些试剂称为“RSPO-结合剂”。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是多肽。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO1。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO3。在一些实施方式中，所述RSPO试剂特异性结合至少一种其他人RSPO。在一些实施方式中，由RSPO1-结合剂结合的所述至少一种其他人RSPO选自由RSPO2、RSPO3和RSPO4组成的组。在一些实施方式中，由RSPO2-结合剂结合的所述至少一种其他人RSPO选自由RSPO1、RSPO3和RSPO4组成的组。在一些实施方式中，由RSPO3-结合剂结合的所述至少一种其他人RSPO选自由RSPO1、RSPO2和RSPO4组成的组。人RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4的全长氨基酸(aa)序列是本领域已知的，并且在本文作为SEQ ID NO:1(RSPO1)、SEQ ID NO:2(RSPO2)、SEQ ID NO:3(RSPO3)和SEQ ID NO:4(RSPO4)提供。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO-结合剂(例如抗体)的抗原结合位点能够结合(或结合)一种、两种、三种或四种RSPO。在一些实施方式中，本文描述的RSPO1-结合剂(例如抗体)的抗原结合位点能够结合(或结合)RSPO1以及一种、两种或三种其他RSPO。例如，在一些实施方式中，RSPO1-结合剂的抗原结合位点能够特异性结合RSPO1以及至少一种选自由RSPO2、RSPO3和RSPO4组成的组中的其他RSPO。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂特异性结合RSPO1和RSPO2。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂特异性结合RSPO1和RSPO3。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂特异性结合RSPO1和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂特异性结合RSPO1、RSPO2和RSPO3。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂特异性结合RSPO1、RSPO2和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂特异性结合RSPO1、RSPO3和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂特异性结合人RSPO1。在一些实施方式中，本文描述的RSPO1-结合剂(例如抗体)特异性结合人RSPO1和小鼠RSPO1。
在一些实施方式中，所述试剂(结合剂)是在人RSPO1的21～263位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述试剂(结合剂)是在人RSPO1的31～263位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合剂是在人RSPO1的34～135位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合剂是在人RSPO1的91～135位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂在SEQ ID NO:5内结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂在SEQ IDNO:9内结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂或抗体结合RSPO1的弗林蛋白酶样富半胱氨酸结构域。在一些实施方式中，所述试剂或抗体结合在RSPO1的弗林蛋白酶样富半胱氨酸结构域内的至少一个氨基酸。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7内结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7内结合。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂结合RSPO1的血小板反应蛋白结构域。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂或抗体结合RSPO1的血小板反应蛋白结构域内的至少一个氨基酸。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂或抗体在SEQ ID NO:8内结合。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO2-结合剂(例如抗体)的抗原结合位点能够结合(或结合)RSPO2以及一种、两种或三种其他RSPO。例如，在一些实施方式中，RSPO2-结合剂的抗原结合位点能够特异性结合RSPO2以及至少一种选自由RSPO1、RSPO3和RSPO4组成的组中的其他RSPO。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂特异性结合RSPO2和RSPO1。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂特异性结合RSPO2和RSPO3。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂特异性结合RSPO2和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂特异性结合RSPO2、RSPO3和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂特异性结合RSPO2、RSPO1和RSPO3。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂特异性结合RSPO2、RSPO1和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂特异性结合人RSPO2。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂(例如抗体)特异性结合人RSPO2和小鼠RSPO2。
在一些实施方式中，所述试剂(结合剂)是在人RSPO2的22～243位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述试剂(结合剂)是在人RSPO2的22～205位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原-结合剂是在人RSPO2的31～146位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合剂是在人RSPO2的31～89位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合剂是在人RSPO2的90～134位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合剂是在人RSPO2的90～146位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂在SEQ ID NO:43内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂在SEQ ID NO:44内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂或抗体结合RSPO2的弗林蛋白酶样富半胱氨酸结构域。在一些实施方式中，所述试剂或抗体结合在RSPO2的弗林蛋白酶样富半胱氨酸结构域内的至少一个氨基酸。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:46内结合。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂结合RSPO2的血小板反应蛋白结构域。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂或抗体结合RSPO2的血小板反应蛋白结构域内的至少一个氨基酸。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂或抗体在SEQ ID NO:47内结合。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO3-结合剂(例如抗体)的抗原结合位点能够结合(或结合)RSPO3以及一种、两种或三种其他RSPO。例如，在一些实施方式中，RSPO3-结合剂的抗原结合位点能够特异性结合RSPO3以及至少一种选自由RSPO1、RSPO2和RSPO4组成的组中的其他RSPO。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂特异性结合RSPO3和RSPO1。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂特异性结合RSPO3和RSPO2。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂特异性结合RSPO3和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂特异性结合RSPO3、RSPO1和RSPO2。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂特异性结合RSPO3、RSPO1和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂特异性结合RSPO3、RSPO2和RSPO4。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂特异性结合人RSPO3。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂(例如抗体)特异性结合人RSPO3和小鼠RSPO3。
在一些实施方式中，所述试剂(结合剂)是在人RSPO3的22～272位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述试剂(结合剂)是在人RSPO3的22～207位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合剂是在人RSPO3的35～135位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合剂是在人RSPO3的35～86位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗原-结合剂是在人RSPO3的92～135位氨基酸内特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂在SEQ ID NO:48内结合。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂或抗体结合RSPO3的弗林蛋白酶样富半胱氨酸结构域。在一些实施方式中，所述试剂或抗体结合在RSPO3的弗林蛋白酶样富半胱氨酸结构域内的至少一个氨基酸。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:49或SEQ IDNO:50内结合。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50内结合。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂结合RSPO3的血小板反应蛋白结构域。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂或抗体结合RSPO3的血小板反应蛋白结构域内的至少一个氨基酸。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂或抗体在SEQ ID NO:51内结合。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂或抗体以约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的解离常数(KD)结合至少一种RSPO蛋白。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂或抗体以约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的解离常数(KD)结合RSPO1。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂或抗体以约1nM以下的解离常数(KD)结合RSPO1。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂或抗体以约0.1nM以下的解离常数(KD)结合RSPO1。在一些实施方式中，本文描述的RSPO1-结合剂或抗体结合至少一种其他RSPO。在一些实施方式中，本文描述的结合至少一种其他RSPO的RSPO1-结合剂或抗体与至少一种其他RSPO结合的KD为约100nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下。例如，在一些实施方式中，RSPO1-结合剂或抗体还以约10nM以下的KD结合RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如抗体)以约0.1nM以下的KD结合人RSPO1。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂以约10nM以下的KD结合人RSPO和小鼠RSPO。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂以约1nM以下的KD结合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂以约0.1nM以下的KD结合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂或抗体以约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的解离常数(KD)结合RSPO2。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂或抗体以约10nM以下的解离常数(KD)结合RSPO2。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂或抗体以约1nM以下的解离常数(KD)结合RSPO2。在一些实施方式中，本文描述的RSPO2-结合剂或抗体结合至少一种其他RSPO。在一些实施方式中，本文描述的结合至少一种其他RSPO的RSPO2-结合剂或抗体与至少一种其他RSPO结合的KD为约100nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下。例如，在一些实施方式中，RSPO2-结合剂或抗体还以约10nM以下的KD结合RSPO1、RSPO3和/或RSPO4。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如抗体)以约1nM以下的KD结合人RSPO2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂以约10nM以下的KD结合人RSPO和小鼠RSPO。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂以约1nM以下的KD结合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂以约0.1nM以下的KD结合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些实施方式中，所述结合剂(例如抗体)与RSPO蛋白的解离常数是使用固定在Biacore芯片上的包含至少一部分所述RSPO蛋白的RSPO融合蛋白确定的解离常数。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如抗体)以约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的半最大效应浓度(EC50)结合至少一种人RSPO蛋白。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如抗体)以约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的半最大效应浓度(EC50)结合人RSPO1。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如抗体)还以约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的EC50结合人RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如抗体)以约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的半最大效应浓度(EC50)结合人RSPO2。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如抗体)还以约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的EC50结合人RSPO1、RSPO3和/或RSPO4。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述抗体是重组抗体。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人抗体。在一些实施方式中，所述抗体是IgG1抗体。在一些实施方式中，所述抗体是IgG2抗体。在一些实施方式中，所述抗体是包含抗原结合位点的抗体片段。在一些实施方式中，所述抗体是单价抗体、单特异性抗体、双价抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，所述抗体缀合至细胞毒素部分。在一些实施方式中，所述抗体是分离的。在一些实施方式中，所述抗体是基本上纯的。
本发明的RSPO-结合剂(例如抗体)可以通过本领域已知的任何方法进行特异性结合检验。可以使用的免疫检验包括但不限于使用诸如以下技术的竞争性和非竞争性检验系统：Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射性免疫检验、ELISA、“夹心”免疫检验、免疫沉淀检验、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散检验、凝集检验、补体固定检验、免疫放射检验、荧光免疫检验和蛋白A免疫检验。此类检验是常规的，并且是本领域公知的(例如参见,Ausubel等编,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。
例如，抗体与人RSPO1的特异性结合可以使用ELISA确定。ELISA检验包括：制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔添加缀合至诸如酶促底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物的所述RSPO1-结合抗体或其他RSPO1-结合剂，温育一段时间，和检测与所述抗原结合的抗体的存在。在一些实施方式中，所述述RSPO1-结合抗体或试剂不缀合至可检测化合物，而是向所述孔添加识别所述RSPO1-结合抗体或试剂的第二缀合抗体。在一些实施方式中，作为用所述抗原包被所述孔的替代方案，将所述RSPO-结合抗体或试剂包被孔，将所述抗原添加至经包被孔，之后可以添加缀合至可检测化合物的第二抗体。本领域技术人员能够知晓对于参数可以对其进行修改以增加所检测信号以及本领域已知的ELISA的其他变化。
在一个实例中，抗体与人RSPO1的特异性结合可以使用FACS确定。FACS筛选检验可以包括：产生表达作为融合蛋白(例如，RSPO1-Fc或RSPO1-CD4TM)的抗原的cDNA构建体，将所述构建体转染至细胞中，在所述细胞的表面上表达所述抗原，将所述RSPO1-结合抗体或其他RSPO1-结合剂与所转染的细胞混合，和温育一段时间。被RSPO1-结合抗体或其他RSPO1-结合剂结合的细胞可以通过使用缀合有可检测化合物的第二抗体(例如，缀合有PE-的抗-Fc抗体)和流式细胞仪来鉴定。本领域技术人员能够知晓对于参数可以对其进行修改以增加所检测信号以及可以增强筛选的FACS的其他变化(例如，就阻断抗体进行筛选)。
抗体或其他结合剂与抗原(例如RSPO蛋白)的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的解离速率(off-rate)可以通过竞争性结合检验来确定。竞争性结合检验的一个实例是放射性免疫检验，其包括使经标记抗原(例如3H或125I)或其片段或变体与目的抗体在递增量的未标记抗原的存在下进行温育，然后检测与所述经标记抗原结合的抗体。抗体对抗原(例如RSPO蛋白)的亲和性和结合解离速率可以通过Scatchard作图分析确定。在一些实施方式中，使用Biacore动力学分析来确定结合抗原(例如RSPO蛋白)的抗体或试剂的结合和解离速率。Biacore动力学分析包括从表面上具有经固定抗原(例如RSPO蛋白)的芯片上分析抗体的结合和解离。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO1的RSPO1-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO1-结合剂(例如，抗体)包含抗体89M5的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个和/或六个(见表1)。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含89M5的CDR中的一个以上、89M5的CDR中的两个以上、89M5的CDR中的三个以上、89M5的CDR中的四个以上、89M5的CDR中的五个以上或89M5的CDR中的所有六个。
表1
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO1的RSPO1-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO1-结合剂含有包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂还含有包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ IDNO:17)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有：(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3；和(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO1的RSPO1-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO1-结合剂含有：(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(b)包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQID NO:13)的重链CDR2，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(c)包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(d)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(e)包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；和(f)包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体。在一些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO1的RSPO1-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:10具有至少约80%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:11具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:10具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的重链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:11具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:10具有至少约95%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:11具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有包含SEQ ID NO:10的重链可变区和/或包含SEQ IDNO:11的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有基本上由SEQ IDNO:10组成的重链可变区和基本上由SEQ ID NO:11组成的轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO1的RSPO1-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:55具有至少约80%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:59具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:55具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的重链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:59具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含与SEQ ID NO:55具有至少约95%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:59具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有包含SEQ ID NO:55的重链可变区和/或包含SEQ IDNO:59的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有基本上由SEQ IDNO:55组成的重链可变区和基本上由SEQ ID NO:59组成的轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO1的RSPO1-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO1-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:25具有至少90%序列同一性的重链，和/或(b)与SEQ ID NO:26具有至少90%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:25具有至少95%序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:26具有至少95%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有包含SEQ ID NO:25的重链和/或包含SEQ ID NO:26的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有基本上由SEQ ID NO:25组成的重链和基本上由SEQ ID NO:26组成的轻链。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO1的RSPO1-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO1-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:68具有至少90%序列同一性的重链，和/或(b)与SEQ ID NO:69具有至少90%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:68具有至少95%序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:69具有至少95%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有包含SEQ ID NO:68的重链和/或包含SEQ ID NO:69的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有基本上由SEQ ID NO:68组成的重链和基本上由SEQ ID NO:69组成的轻链。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO2的RSPO2-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO2-结合剂(例如，抗体)包括抗体130M23的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个和/或六个(见表1)。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含130M23的CDR中的一个以上、130M23的CDR中的两个以上、130M23的CDR中的三个以上、130M23的CDR中的四个以上、130M23的CDR中的五个以上或130M23的CDR中的所有六个。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO2的RSPO2-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO2-结合剂含有包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重链CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂还含有包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有包含KASQDVSSAVA(SEQ IDNO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有：(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQID NO:30)的重链CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3；和(b)包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO2的RSPO2-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO2-结合剂含有：(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(b)包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQID NO:30)的重链CDR2，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(c)包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(d)包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；(e)包含WASTRHT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR2，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体；和(f)包含QQHYSTP(SEQID NO:34)的轻链CDR3，或者包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体。在一些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO2的RSPO2-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:27具有至少约80%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:28具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:27具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的重链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:28具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:27具有至少约95%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:28具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有包含SEQ ID NO:27的重链可变区和/或包含SEQ IDNO:28的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有基本上由SEQ IDNO:27组成的重链可变区和基本上由SEQ ID NO:28组成的轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO2的RSPO2-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:63具有至少约80%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少80%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:63具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的重链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含与SEQ ID NO:63具有至少约95%序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有包含SEQID NO:63的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:67的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有包含SEQ ID NO:63的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:76的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有基本上由SEQ ID NO:63组成的重链可变区和基本上由SEQ ID NO:67组成的轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有基本上由SEQ ID NO:63组成的重链可变区和基本上由SEQID NO:76组成的轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO2的RSPO2-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO2-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:41具有至少90%序列同一性的重链，和/或(b)与SEQ ID NO:42具有至少90%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:41具有至少95%序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:42具有至少95%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有包含SEQ ID NO:41的重链和/或包含SEQ ID NO:42的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂含有基本上由SEQ ID NO:41组成的重链和基本上由SEQ ID NO:42组成的轻链。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合RSPO2的RSPO2-结合剂(例如，抗体)，其中所述RSPO2-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:70具有至少90%序列同一性的重链，和/或(b)与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:74具有至少90%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:70具有至少95%序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:74具有至少95%序列同一性的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有包含SEQ ID NO:70的重链和/或包含SEQ ID NO:71的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有包含SEQ ID NO:70的重链和/或包含SEQ ID NO:74的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有基本上由SEQ ID NO:70组成的重链和基本上由SEQ ID NO:71组成的轻链。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂含有基本上由SEQ ID NO:70组成的重链和基本上由SEQ ID NO:74组成的轻链。
本发明提供多肽，包括但不限于特异性结合人RSPO蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述多肽结合人RSPO1。在一些实施方式中，所述多肽结合人RSPO2。在一些实施方式中，所述多肽结合人RSPO3。
在一些实施方式中，所述多肽包含抗体89M5的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个和/或六个(参见本文表1)。在一些实施方式中，所述多肽包含抗体130M23的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个和/或六个(参见本文表1)。在一些实施方式中，所述多肽包含的CDR在每个CDR中具有至多四个(即，0、1、2、3或4)个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述重链CDR包含在重链可变区内。在一些实施方式中，所述轻链CDR包含在轻链可变区内。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:55具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:59具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:55具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:59具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:55具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:59具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO2的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:63具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:63具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:27或SEQID NO:63具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:67或SEQ ID NO:76具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:26具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQID NO:25具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:26具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:26具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽基本上由SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:26组成。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:68具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:69具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQID NO:68具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:69具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:68具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:69具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽基本上由SEQ ID NO:68和/或SEQ ID NO:69组成。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO2的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:42具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQID NO:41具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:42具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽基本上由SEQ ID NO:41和/或SEQ ID NO:42组成。
在一些实施方式中，本发明提供特异性结合人RSPO2的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:70具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:74具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:70具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:74具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO:70具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:74具有至少约95%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽基本上由SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:71组成。在一些实施方式中，所述多肽基本上由SEQ ID NO:70和/或SEQID NO:74组成。
在一些实施方式中，RSPO1-结合剂含有包含选自由以下序列组成的组中的序列的多肽：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂含有包含选自由以下序列组成的组中的序列的多肽：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74和SEQ ID NO:76。
在一些实施方式中，RSPO1-结合剂包含89M5抗体的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂包含89M5抗体(带有或不带有前导序列)的重链和轻链。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂是89M5抗体。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂包含处于89M5抗体的人源化形式的89M5抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂包含h89M5-H2L2抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂包含处于89M5抗体的人源化形式的89M5抗体(带有或不带有前导序列)的重链和轻链。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂包含h89M5-H2L2抗体(带有或不带有前导序列)的重链和轻链。在一些实施方式中，89M5的人源化版本是IgG1抗体。在一些实施方式中，89M5的人源化版本是IgG2抗体。将产生89M5抗体的杂交瘤细胞系于2011年6月30日在布达佩斯条约的条件下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)并给予ATCC指定保藏号PTA-11970。
在一些实施方式中，RSPO1-结合剂包含抗体89M5、基本上由抗体89M5组成或由抗体89M5组成。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂包含抗体h89M5-H2L2、基本上由抗体h89M5-H2L2组成或由抗体h89M5-H2L2组成。
在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含130M23抗体的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含130M23抗体(带有或不带有前导序列)的重链和轻链。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂是130M23抗体。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含处于130M23抗体的人源化形式的130M23抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含h130M23-H1L2抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂包含h130M23-H1L6抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含处于130M23抗体的人源化形式的130M23抗体(带有或不带有前导序列)的重链和轻链。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含h130M23-H1L2抗体(带有或不带有前导序列)的重链和轻链。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含h130M23-H1L6抗体(带有或不带有前导序列)的重链和轻链。在一些实施方式中，130M23的人源化版本是IgG1抗体。在一些实施方式中，130M23的人源化版本是IgG2抗体。将产生130M23抗体的杂交瘤细胞系于2011年8月10日在布达佩斯条约的条件下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)并给予ATCC指定保藏号PTA-12021。
在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含抗体130M23、基本上由抗体130M23组成或由抗体130M23组成。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含抗体h130M23-H1L2、基本上由抗体h130M23-H1L2组成或由抗体h130M23-H1L2组成。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂包含抗体h130M23-H1L6、基本上由抗体h130M23-H1L6组成或由抗体h130M23-H1L6组成。
包括抗体在内的许多蛋白质含有指导蛋白质运输至各种位置的信号序列。信号序列(也称为信号肽或前导序列)位于初生多肽的N末端。他们将多肽靶向内质网，并且通过分泌将蛋白质分发至其目的地，例如到细胞器的内部空间、到内部膜、到细胞外膜或到细胞内部。在蛋白质运输到内质网后，信号肽酶将大多数信号序列从所述蛋白质切割下。从所述多肽切割下信号序列通常在氨基酸序列中的特定位置发生，并且依赖于信号序列内的氨基酸残基。虽然通常存在一个特异性切割位点，信号肽酶可以识别和/或可以使用超过一个切割位点，产生所述多肽的非同源N末端。例如，信号序列内的不同切割位点的使用可以产生表达有不同N末端氨基酸的多肽。因此，在一些实施方式中，本文描述的多肽可以包含具有不同N末端的多肽的混合物。在一些实施方式中，N末端的差异在于1、2、3、4或5个长度的氨基酸。在一些实施方式中，所述多肽基本上是同源的，即多肽具有相同的N末端。在一些实施方式中，与“天然”或“亲本”信号序列相比，所述多肽的信号序列包含一个以上(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)氨基酸取代和/或缺失。在一些实施方式中，所述多肽的信号序列包含使一个切割位点占优势的氨基酸取代和/或缺失，由此产生具有一种N末端的基本上同源的多肽。在一些实施方式中，所述多肽的信号序列被不同的信号序列替换。在一些实施方式中，所述多肽的信号序列影响所述多肽的表达水平。在一些实施方式中，所述多肽的信号序列增加所述多肽的表达水平。在一些实施方式中，所述多肽的信号序列降低所述多肽的表达水平。
在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:10的重链可变区和包含SEQ ID NO:11的轻链可变区的抗体竞争与RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:55的重链可变区和包含SEQ ID NO:59的轻链可变区的抗体竞争与RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:25的重链和包含SEQ ID NO:26的轻链的抗体竞争与RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:68的重链和包含SEQ ID NO:69的轻链的抗体竞争与RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂与抗体89M5或h89M5-H2L2竞争与人RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，在体外竞争性结合检验中，RSPO1-结合剂或抗体竞争与RSPO1的特异性结合。在一些实施方式中，所述RSPO1是人RSPO1。在一些实施方式中，所述RSPO1是小鼠RSPO1。
在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如，抗体)与本发明的抗体结合的RSPO1上的表位相同，或结合的RSPO1上的表位基本上相同。在另一实施方式中，RSPO1-结合剂是这样的抗体：其结合的RSPO1上的表位与本发明的抗体结合的RSPO1上的表位重叠。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂(例如，抗体)与抗体89M5或h89M5-H2L2结合RSPO1上的表位相同，或结合RSPO1上的表位基本上相同。在另一实施方式中，RSPO1-结合剂是这样的抗体：其所结合的RSPO1上的表位与本发明的89M5或h89M5-H2L2结合的RSPO1上的表位重叠。
在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是与ATCC指定保藏号为PTA-11970的杂交瘤产生的抗体(例如，在竞争性结合检验中)竞争与RSPO1的特异性结合的试剂。
在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:27的重链可变区和包含SEQ ID NO:28的轻链可变区的抗体竞争与RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:63的重链可变区和包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76的轻链可变区的抗体竞争与RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:41的重链和包含SEQ ID NO:42的轻链的抗体竞争与RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如，抗体)与含有包含SEQ ID NO:70的重链和包含SEQID NO:71或SEQ ID NO:74的轻链的抗体竞争与RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂与抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6竞争与人RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，在体外竞争性结合检验中，RSPO2-结合剂或抗体竞争与RSPO2的特异性结合。在一些实施方式中，所述RSPO2是人RSPO2。在一些实施方式中，所述RSPO2是小鼠RSPO2。
在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如，抗体)与本发明的抗体结合的RSPO2上的表位相同，或结合的RSPO2上的表位基本上相同。在另一实施方式中，RSPO2-结合剂是这样的抗体：其所结合的RSPO2上的表位与本发明的抗体结合的RSPO2上的表位重叠。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂(例如，抗体)与抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6结合的RSPO2上的表位相同，或结合RSPO2上的表位基本上相同。在另一实施方式中，RSPO1-结合剂是这样的抗体：其所结合的RSPO2上的表位与本发明的130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6结合的RSPO2上的表位重叠。
在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是与ATCC指定保藏号为PTA-12021的杂交瘤产生的抗体(例如，在竞争性结合检验中)竞争与RSPO2的特异性结合的试剂。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO-结合剂(例如，抗体)结合至少一种人RSPO蛋白和调节RSPO活性。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO拮抗剂，并降低RSPO活性。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO拮抗剂，并降低β-连环素活性。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO1-结合剂(例如，抗体)结合人RSPO1，并调节RSPO1活性。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂是RSPO1拮抗剂，并降低RSPO1活性。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂是RSPO1拮抗剂，并降低β-连环素活性。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO2-结合剂(例如，抗体)结合人RSPO2，并调节RSPO2活性。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂是RSPO2拮抗剂，并降低RSPO2活性。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂是RSPO2拮抗剂，并降低β-连环素活性。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO3-结合剂(例如，抗体)结合人RSPO3，并调节RSPO3活性。在一些实施方式中，RSPO3-结合剂是RSPO3拮抗剂，并降低RSPO3活性。在一些实施方式中，RSPO3-结合剂是RSPO3拮抗剂，并降低β-连环素活性。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如，抗体)是至少一种人RSPO蛋白的拮抗剂。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是至少一种RSPO的拮抗剂，并且抑制RSPO活性。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制RSPO活性的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或约100%。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制一种、两种、三种或四种RSPO蛋白的活性。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的活性。在一些实施方式中，抑制人RSPO1活性的RSPO1-结合剂是抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，抑制人RSPO2活性的RSPO2-结合剂是抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如，抗体)是至少一种人RSPO蛋白的拮抗剂。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制RSPO信号传导的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或约100%。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制一种、两种、三种或四种RSPO蛋白的信号传导。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的信号传导。在一些实施方式中，抑制RSPO1信号传导的RSPO1-结合剂是抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，抑制RSPO2信号传导的RSPO2-结合剂是抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如，抗体)是β-连环素信号传导的拮抗剂。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制β-连环素信号传导的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或约100%。在一些实施方式中，抑制β-连环素信号传导的RSPO1-结合剂是抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，抑制β-连环素信号传导的RSPO2-结合剂是抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如，抗体)抑制至少一种RSPO蛋白与受体的结合。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制人RSPO蛋白与一种或多种其受体的结合。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制RSPO蛋白与至少一种LGR蛋白的结合。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制RSPO蛋白与LGR4、LGR5和/或LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂抑制RSPO1与LGR4的结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂抑制RSPO1与LGR5的结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂抑制RSPO1与LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂抑制RSPO2与LGR4的结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂抑制RSPO2与LGR5的结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂抑制RSPO2与LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO-结合剂与至少一种LGR蛋白的结合被抑制至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或至少约95%。在一些实施方式中，抑制至少一种RSPO与至少一种LGR蛋白的结合的RSPO-结合剂还抑制β-连环素信号传导。在一些实施方式中，抑制人RSPO1与至少一种LGR蛋白的结合的RSPO1-结合剂是抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，抑制人RSPO2与至少一种LGR蛋白的结合的RSPO2-结合剂是抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如，抗体)阻断至少一种RSPO与受体的结合。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂阻断人RSPO蛋白与一种或多种其受体的结合。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂阻断RSPO与至少一种LGR蛋白的结合。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂阻断至少一种RSPO蛋白与LGR4、LGR5和/或LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂阻断RSPO1与LGR4的结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂阻断RSPO1与LGR5的结合。在一些实施方式中，RSPO1-结合剂阻断RSPO1与LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂阻断RSPO2与LGR4的结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂阻断RSPO2与LGR5的结合。在一些实施方式中，RSPO2-结合剂阻断RSPO2与LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO-结合剂与至少一种LGR蛋白的结合被阻断至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或至少约95%。在一些实施方式中，阻断至少一种RSPO蛋白与至少一种LGR蛋白的结合的RSPO-结合剂还抑制β-连环素信号传导。在一些实施方式中，阻断人RSPO1与至少一种LGR蛋白的结合的RSPO1-结合剂是抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，阻断人RSPO2与至少一种LGR蛋白的结合的RSPO2-结合剂是抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如，抗体)抑制β-连环素信号传导。应该理解的是，抑制β-连环素信号传导的RSPO-结合剂可以在一些实施方式中抑制β-连环素信号传导途径中的一种或多种受体导致的信号传导，但并非必须抑制所有受体导致的信号传导。在一些替代实施方式中，可以抑制所有人受体导致的β-连环素信号传导。在一些实施方式中，抑制了选自由LGR4、LGR5和LGR6组成的组中的一种或多种受体导致的β-连环素信号传导。在一些实施方式中，RSPO-结合剂对β-连环素信号传导的抑制使β-连环素信号传导的水平减少至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或至少约95%。在一些实施方式中，抑制β-连环素信号传导的RSPO1-结合剂是抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，抑制β-连环素信号传导的RSPO2-结合剂是抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如，抗体)抑制β-连环素的激活。应该理解的是，抑制β-连环素的激活的RSPO-结合剂可以在一些实施方式中抑制一种或多种受体导致的β-连环素的激活，但并非必须抑制所有受体导致的β-连环素的激活。在一些替代实施方式中，可以抑制所有人受体导致的β-连环素的激活。在一些实施方式中，抑制了选自由LGR4、LGR5和LGR6组成的组中的一种或多种受体导致的β-连环素的激活。在一些实施方式中，RSPO-结合剂对β-连环素的激活的抑制使β-连环素的激活的水平减少至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或至少约95%。在一些实施方式中，抑制β-连环素的激活的RSPO1-结合剂是抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，抑制β-连环素的激活的RSPO2-结合剂是抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
用于确定RSPO-结合剂(或候选RSPO-结合剂)是否抑制β-连环素信号传导的体内和体外检验是本领域已知的。例如，可以使用基于细胞的荧光素酶报告基因检验来在体外测定β-连环素信号传导水平，所述荧光素酶报告基因检验利用含有多个拷贝的位于果蝇荧光素酶报告基因的TCF结合结构域(Gazit等,1999,Oncogene,18;5959-66;TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在具有或不具有RSPO蛋白或RSPO条件培养基的一种或多种Wnt(例如，由转染细胞表达的Wnt或由Wnt条件培养基提供的Wnt)的存在下，将在RSPO-结合剂的存在下的β-连环素信号传导的水平与不存在RSPO-结合剂下的信号传导水平进行比较。除了TCF/Lu报告基因检验之外，RSPO-结合剂(或候选剂)对β-连环素信号传导的作用可以通过测定所述试剂对β-连环素-调节基因(例如c-myc(He等,1998,Science,281:1509-12)、周期蛋白D1(Tetsu等,1999,Nature,398:422-6)和/或纤连蛋白(Gradl等，1999,Mol.Cell Biol.,19:5576-87))的作用而在体外或在体内测定。在一些实施方式中，RSPO-结合剂对β-连环素信号传导的作用还可以通过测定所述试剂对Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6和/或β-连环素的磷酸化状态的影响而测定。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂具有以下效应中的一种或多种：抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性、通过减少癌干细胞在肿瘤中的频率而减少肿瘤的致瘤性、抑制肿瘤生长、触发肿瘤细胞的细胞死亡、诱导肿瘤中的细胞进行分化、使致瘤性细胞分化成非致瘤性状态、诱导肿瘤细胞中的分化标记物的表达、防止肿瘤细胞的转移或降低肿瘤细胞的存活。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂能够抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂能够抑制体内肿瘤生长(例如，在异种移植物小鼠模型中和/或在具有癌的人中)。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂能够减少肿瘤的致瘤性。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂或抗体能够在诸如小鼠异种移植物模型等动物模型中减少包含癌干细胞的肿瘤的致瘤性。在一些实施方式中，肿瘤中癌干细胞的数量或频率降低了至少约两倍、约三倍、约五倍、约十倍、约50倍、约100倍或约1000倍。在一些实施方式中，癌干细胞的数量或频率的减少通过使用动物模型的有限稀释检验来确定。关于使用有限稀释检验来确定肿瘤中的癌干细胞数量或频率的减少的另外实验和指南可见例如在国际公开号WO2008/042236、美国专利公开号2008/0064049和美国专利公开号2008/0178305。
在一些实施方式中，本文描述的RSPO-结合剂在小鼠、食蟹猴或人中所具有的循环半衰期为至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。在一些实施方式中，RSPO-结合剂是IgG(例如，IgG1或IgG2)抗体，其在小鼠、食蟹猴或人中所具有的循环半衰期为至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。增加(或减少)诸如多肽和抗体等试剂的半衰期的方法是本领域已知的。例如，增加IgG抗体的循环半衰期的已知方法包括在Fc区引入突变，所述突变增加在pH6.0的所述抗体与初生Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合(参见例如，美国专利公开号2005/0276799、2007/0148164和2007/0122403)。增加缺乏所述Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括诸如PEG化等技术。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是多克隆抗体。可以通过任何已知方法制备多克隆抗体。在一些实施方式中，通过对动物(例如，兔、大鼠、小鼠、山羊、驴)多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如纯化的肽片段、全长重组蛋白或融合蛋白)而使其免疫来产生多克隆抗体。所述抗原可以可选地缀合至载剂，例如钥孔虫戚血兰素(KLH)或血清白蛋白。将所述抗原(使用或不使用载剂蛋白)稀释在无菌盐水中并通常与佐剂(例如，完全或不完全弗氏佐剂)组合以形成稳定的乳液。一段足够时间后，从经免疫动物的血液和腹水回收多克隆抗体。多克隆抗体可以根据本领域的标准方法(包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析)从血清或腹水纯化。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是单克隆抗体。可以使用本领域技术人员已知的杂交瘤方法制备单克隆抗体(参见例如，Kohler和Milstein,1975,Nature,256:495-497)。在一些实施方式中，使用杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生会特异性结合免疫抗原的抗体。在一些实施方式中，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。在一些实施方式中，免疫抗原可以是人蛋白或其一部分。在一些实施方式中，免疫抗原可以是小鼠蛋白或其一部分。
免疫后，将淋巴细胞分离并使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞然后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出。产生特异性针对所选择抗原的单克隆抗体的杂交瘤可以通过各种方法鉴定，所述方法包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹和体外结合检验(例如，流式细胞仪、FACS、ELISA和放射性免疫检验)。杂交瘤可以使用标准方法在体外培养物中繁殖(J.W.Goding,1996,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第3版,Academic Press,San Diego,CA)或作为作为动物中的腹水肿瘤在体内繁殖。单克隆抗体可以根据本领域的标准方法从培养基或腹水纯化，所述标准方法包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析。
在一些实施方式中，单克隆抗体可以使用对本领域技术人员而言已知的重组DNA技术制备(参见例如，美国专利号4,816,567)。例如通过使用特异性扩增编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物，从成熟的B细胞或杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的多核苷酸。然后将编码重链和轻链的分离多核苷酸克隆至合适的表达载体中，所述表达载体在转染至诸如不另外产生免疫球蛋白的大肠杆菌、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞等宿主细胞时产生单克隆抗体。在其他实施方式中，重组单克隆抗体或其片段可以从表达所需要物种的CDR的噬菌体展示文库中分离(参见例如,McCafferty等,1990,Nature,348:552-554;Clackson等,1991,Nature,352:624-628；和Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
编码单克隆抗体的多核苷酸可以进而使用重组DNA技术以许多不同方式进行修饰，从而产生替代性抗体。在一些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被例如人抗体的相应区域取代从而产生嵌合抗体，或被非免疫球蛋白多肽取代从而产生融合抗体。在一些实施方式中，将恒定区截短或除去从而产生单克隆抗体的所需抗体片段。可以使用可变区的定点或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和性等。
在一些实施方式中，针对人RSPO蛋白的单克隆抗体是人源化抗体。通常而言，人源化抗体是其中使用对本领域技术人员而言已知的方法使来自CDR的残基被具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、兔、大鼠、仓鼠等)的CDR的残基替换的人免疫球蛋白。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。在一些实施方式中，人源化抗体可以通过Fv框架区中和/或所替换的非人残基中的另外残基的取代而被进一步修饰，从而改善和优化抗体特异性、亲和性和/或能力。通常，人源化抗体会包含至少一个、通常2个或3个含有所有或基本上所有对应于非人免疫球蛋白的CDR的可变结构域区域，而所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。在一些实施方式中，人源化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。在一些实施方式中，治疗上使用此类人源化抗体，因为他们在施用至人受试对象时可以减少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)响应。本领域技术人员能够按照已知技术获得具有减少的免疫原性的功能性人源化抗体(参见例如，美国专利号5,225,539、5,585,089、5,693,761和5,693,762)
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术直接制备。在一些实施方式中，可以产生体外固定或分离自产生针对靶抗原的抗体的免疫个体的永生化人B淋巴细胞(参见例如,Cole等,1985,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页;Boemer等,1991,J.Immunol.,147:86-95；和美国专利第5,750,373、5,567,610和5,229,275号)。在一些实施方式中，所述人抗体可以从噬菌体文库中选择，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等,1996,Nature Biotechnology,14:309-314;Sheets等,1998,PNAS,95:6157-6162;Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381;Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。作为选择，可以使用噬菌体展示技术来从来自未经免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域库中在体外生产人抗体和抗体片段。用于产生和利用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963号以及Rothe等,2008,J.Mol.Bio.,376:1182-1200中。包括但不限于链重排(Marks等,1992,Bio/Technology,10:779-783)和定点诱变在内的亲和性成熟策略是本领域已知的，并且可以用于产生高亲和性人抗体。
在一些实施方式中，可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人抗体。这些小鼠在免疫后能够在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下生产全部库(repertoire)的人抗体。该方法还见述于美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016号。
本发明还涉及特异性识别至少一种人RSPO蛋白的双特异性抗体。双特异性抗体能够特异性识别和结合至少两种不同的表位。不同的表位可以位于同一分子内(例如人RSPO1上的两个表位)或在不同分子上(例如RSPO1上的一个表位和RSPO2上的一个表位)。在一些实施方式中，所述双特异性抗体是单克隆人抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体能够特异性识别和结合第一抗原靶标(例如RSPO1)以及第二抗原靶标(例如白细胞上的效应分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受体(例如，CD64、CD32或CD16))，从而将细胞防御机制聚焦于表达所述第一抗原靶标的细胞。在一些实施方式中，所述抗体可用于将细胞毒性剂导向表达特定靶抗原的细胞。这些抗体拥有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性同位素螯合剂(例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。在一些实施方式中，所述双特异性抗体特异性结合RSPO1以及选自由RSPO2、RSPO3和RSPO4组成的组中的另外RSPO蛋白。在一些实施方式中，所述双特异性抗体特异性结合RSPO2以及选自由RSPO1、RSPO3和RSPO4组成的组中的另外RSPO蛋白。
用于制造双特异性抗体的技术是本领域技术人员已知的，参见例如Millstein等,1983,Nature,305:537-539;Brennan等,1985,Science,229:81;Suresh等,1986,Methodsin Enzymol.,121:120;Traunecker等,1991,EMBO J.,10:3655-3659;Shalaby等,1992,J.Exp.Med.,175:217-225;Kostelny等,1992,J.Immunol.,148:1547-1553;Gruber等,1994,J.Immunol.,152:5368；美国专利第5,731,168号；和美国专利公开第2011/0123532号。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。还设计了具有超过两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等,1991,J.Immunol.,147:60)。因此，在一些实施方式中针对RSPO1的抗体是多特异性的。
在一些实施方式中，本文描述的抗体(或其他多肽)可以是单特异性的。例如，在一些实施方式中，抗体含有的一个或多个抗原结合位点中的每个都能够结合(或结合)RSPO蛋白上的同源性表位。在一些实施方式中，本文描述的单特异性抗体的抗原结合位点能够结合(或结合)例如RSPO1和RSPO2(即，在RSPO1和RSPO2蛋白上都发现相同的表位)。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗体片段。抗体片段与完整抗体相比可以具有不同的功能或能力，例如抗体片段可以具有增加的肿瘤渗透。已知各种技术可用于生产抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化。在一些实施方式中，抗体片段包括通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化而产生的F(ab')2片段。在一些实施方式中，抗体片段包括通过还原F(ab')2片段的二硫键而生成的Fab片段。在其他实施方式中，抗体片段包括通过用木瓜蛋白酶和还原剂对抗体分子处理而生成的Fab片段。在一些实施方式中，抗体片段以重组方式产生。在一些实施方式中，抗体片段包括Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv和scFv抗体片段可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并从其分泌，从而允许大量地产生这些片段。在一些实施方式中，抗体片段分离自本文讨论的抗体噬菌体文库。例如，可以使用构建Fab表达文库的方法(Huse等,1989,Science,246:1275-1281)来允许快速有效地鉴定具有针对RSPO蛋白或其衍生物、片段、类似物或同源物的所需特异性的单克隆Fab片段。在一些实施方式中，抗体片段是线性抗体片段。在一些实施方式中，抗体片段为单特异性或双特异性的。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是scFv。可以使用各种技术来产生对一种或多种人RSPO具有特异性的单链抗体(参见例如，美国专利号4,946,778)。
此外，特别是在抗体片段的情况下，理想的是抗体进行修饰从而增加其血清半衰期。这可以例如通过利用在抗体片段的合适区域进行突变将挽救受体结合表位引入至抗体片段中或者通过将所述表位引入肽标记内(所述肽标记然后融合至抗体片段的末端或中部)(例如通过DNA或肽合成)而实现。
异源缀合抗体也在本发明的范围内。异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。提出此类抗体以例如将免疫细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)。还设想可以使用在合成蛋白化学中已知的方法(包括涉及交联剂的那些方法)在体外制备异源缀合抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键而构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁亚氨酸甲酯。
为了本发明的目的，应该意识到的是，经修饰抗体可以包含提供所述抗体与靶标(即，人RSPO1或人RSPO2)的连接的任何类型的可变区。在这点上，所述可变区可以包含或衍生自可以诱导增强体液响应和产生针对所需肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的任何种类的哺乳动物。因此，经修饰抗体的可变区可以例如来自人、鼠类、非人灵长类(例如食蟹猴、猕猴等)或大鼠来源。在一些实施方式中，经修饰抗体的可变区和恒定区都是人的。在其他实施方式中，可以对相容性抗体(通常源自非人来源)的可变区进行工程化设计或特意定制，从而改善所述分子的结合性质或减少所述分子的免疫原性。就此而言，用于本发明的可变区可以是人源化的，或者通过包含进引入的氨基酸序列而得到改变。
在一些实施方式中，通过至少部分地替换一个或多个CDR以及必要时部分地替换框架区和序列修饰和/或改变而对重链和轻链的可变结构域进行改变。虽然所述CDR可以源自与框架区所源自的抗体相同类别或亚类别的抗体，设想的是CDR源自不同类别的抗体，优选源自不同物种的抗体。为了将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个，不必将所有CDR用来自供体可变区的所有CDR替换。相反，可以仅需要转移对于维持抗原结合位点的活性而言必须的那些残基。考虑到美国专利号5,585,089、5,693,761和5,693,762中提出的解释，通过实施常规实验或通过试错法测试而获得具有减少的免疫原性的功能抗体完全在本领域技术人员能力之内。
尽管可以对可变区进行改变，本领域技术人员会意识到本发明的经修饰抗体会包括其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已经缺失或改变，以便提供诸如增加的肿瘤定位或增加的血清半衰期(当与包含天然或未改变的恒定区的大致相同的免疫原性的抗体相比时)等所需生化特性的抗体。在一些实施方式中，经修饰抗体的恒定区会包含人恒定区。与本发明相容的对恒定区进行的修饰包括添加、缺失或取代一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸。本文公开的经修饰抗体可以包含对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定区(CL)进行改变或修饰。在一些实施方式中，使一个或多个结构域从经修饰抗体的恒定区部分或完全缺失。在一些实施方式中，经修饰抗体会包含其中整个CH2结构域已经被除去的结构域缺失的构建体或变体(ΔCH2构建体)。在一些实施方式中，省去的恒定区结构域被短氨基酸间隔子(例如10个氨基酸残基)替换，该氨基酸间隔子提供部分的通常由缺失恒定区所赋予的分子柔性。
在一些实施方式中，对经修饰抗体进行工程化设计以将CH3结构域直接融合至抗体的铰链区。在其他实施方式中，在铰链区和经修饰CH2和/或CH3结构域之间插入肽间隔子。例如，可以表达这样的构建体：其中CH2结构域已经缺失，并且残留的CH3结构域(经修饰或未经修饰)利用5～20个氨基酸的间隔子连接至铰链区。可以添加此类间隔子以确保构建体结构域的调节元件保持游离和可及，或确保铰链区保持柔性。但是，应该注意的是在某些情况下，氨基酸间隔子可能会被证实具有免疫原性，并且引发不想要的针对构建体的免疫响应。因此，在一些实施方式中，添加至构建体的任何间隔子相对地是不具有免疫原性的，以维持经修饰抗体的所需生物品质。
在一些实施方式中，经修饰抗体可以仅具有恒定结构域的部分缺失，或仅取代少量或一个氨基酸。例如，CH2结构域的选定区域中单个氨基酸的取代可能足以实质上减少Fc结合，并由此增加癌细胞定位和/或肿瘤渗透。类似地，可能理想的是仅使一个或多个恒定区结构域的一部分缺失，所述部分控制特定效应子功能(例如补体C1q结合)受到调节。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的选定特性(血清半衰期)同时使与受试对象恒定区相关的其他所需功能保持完整。另外，如上所述，通过使一个或多个氨基酸进行可增强所产生构建体的特征的突变或取代，可以对本发明公开的抗体的恒定区进行修饰。就此而言，有可能的是，干扰保守性结合位点(例如，Fc结合)的活性而同时基本上保持经修饰抗体的构象和免疫原性特征。在一些实施方式中，经修饰抗体包含添加至恒定区的一个或多个氨基酸，以便增强所需特性，例如减少或增加效应子功能或提供更多的细胞毒素或碳水化合物连接位点。
本领域已知恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的C1组分与IgG或IgM抗体的Fc区的结合(结合至抗原)激活补体系统。补体激活在细胞病原体的调理素化和裂解中是重要的。补体激活还刺激炎性响应，并且还可与自体免疫超敏性有关。此外，抗体的Fc区可以结合表达Fc受体(FcR)的细胞。存在许多对不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的各种各样的生物响应，包括包被有抗体的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、包被有抗体的靶细胞被杀死细胞(称为抗体依赖性细胞的细胞毒性或ADCC)裂解、释放炎性介体、胎盘转移和控制免疫球蛋白产生。
在一些实施方式中，RSPO-结合抗体提供改变的效应子功能，后者转而影响所施用抗体的生物特性。例如，在一些实施方式中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可以减少循环的经修饰抗体(例如抗-RSPO1抗体)的Fc受体结合，由此增加癌细胞定位和/或肿瘤渗透。在其他实施方式中，恒定区修饰增加或减少所述抗体的血清半衰期。在一些实施方式中，对恒定区进行修饰以消除二硫键或寡糖部分。根据本发明的对恒定区进行的修饰可以容易地使用本领域技术人员知识内公知的生物化学或分子工程化设计技术来进行。
在一些实施方式中，作为抗体的RSPO-结合剂不具有一种或多种效应子功能。例如，在一些实施方式中，所述抗体不具有ADCC活性，和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方式中，所述抗体不结合Fc受体和/或补体因子。在一些实施方式中，所述抗体不具有效应子功能。
本发明还包括与本文提出的嵌合、人源化和人抗体或其抗体片段基本上同源的变体和等效物。这些可以含有例如保守性取代突变，即一个或多个氨基酸被类似的氨基酸取代。例如，保守性取代是指氨基酸被相同通用类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸被另一中性氨基酸取代。保守性氨基酸取代的含义是本领域公知的，并且如本文中所述。
因此，本发明提供用于生产结合至少一种RSPO蛋白的抗体的方法。在一些实施方式中，用于生产结合至少一种RSPO蛋白的抗体的方法包括使用杂交瘤技术。在一些实施方式中，提供用于生产结合人RSPO1的抗体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使用人RSPO1的31～263位氨基酸。在一些实施方式中，所述方法包括使用SEQ ID NO:1的31～263位氨基酸。在一些实施方式中，提供用于生产结合人RSPO2的抗体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使用人RSPO2的22～205位氨基酸。在一些实施方式中，所述方法包括使用SEQ ID NO:2的22～205位氨基酸。在一些实施方式中，提供用于生产结合人RSPO3的抗体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使用人RSPO3的22～272位氨基酸。在一些实施方式中，所述方法包括使用SEQ ID NO:3的22～272位氨基酸。在一些实施方式中，生产结合至少一种人RSPO蛋白的抗体的方法包括筛选人噬菌体文库。本发明还提供鉴定结合至少一种RSPO蛋白的抗体的方法。在一些实施方式中，通过对与RSPO蛋白或其部分的结合进行FACS筛选而鉴定所述抗体。在一些实施方式中，通过对与RSPO蛋白的结合进行使用ELISA的筛选而鉴定所述抗体。在一些实施方式中，通过就对RSPO蛋白与人LGR蛋白的结合的阻断来进行FACS筛选而鉴定所述抗体。在一些实施方式中，对β-连环素信号传导的抑制或阻断进行筛选而鉴定所述抗体。
在一些实施方式中，生产针对人RSPO1蛋白的抗体的方法包括用包含人RSPO1的31～263位氨基酸的多肽对哺乳动物进行免疫。在一些实施方式中，生产针对人RSPO1蛋白的抗体的方法包括用包含人RSPO1的21～263位氨基酸中的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫。在一些实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物分离抗体或产生抗体的细胞。在一些实施方式中，生产结合RSPO1蛋白的单克隆抗体的方法包括：(a)用包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫；(b)从经免疫哺乳动物分离产生抗体的细胞；(c)将所述产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合以产生杂交瘤细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括(d)选择表达结合RSPO1蛋白的抗体的杂交瘤细胞。在一些实施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分选自由SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:9组成的组。在一些实施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分是SEQ IDNO:9。在一些实施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分是SEQID NO:6或SEQ ID NO:7。在一些实施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。在一些实施方式中，所述哺乳动物是小鼠。在一些实施方式中，使用包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分的多肽选择所述抗体。在一些实施方式中，包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分的用于选择的多肽选自由SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:9组成的组。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO1和至少一种其他RSPO蛋白。在一些实施方式中，所述至少一种其他RSPO蛋白选自由RSPO2、RSPO3和RSPO4组成的组。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO1和RSPO2。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO1和RSPO3。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO1和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO1、RSPO2和RSPO3。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO1、RSPO2和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO1、RSPO3和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合人RSPO1和小鼠RSPO1。
在一些实施方式中，生产针对人RSPO2蛋白的抗体的方法包括用包含人RSPO2的22～205位氨基酸的多肽对哺乳动物进行免疫。在一些实施方式中，生产针对人RSPO2蛋白的抗体的方法包括用包含人RSPO2的22～243位氨基酸中的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫。在一些实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物分离抗体或产生抗体的细胞。在一些实施方式中，生产结合RSPO2蛋白的单克隆抗体的方法包括：(a)用包含人RSPO2的22～243位氨基酸的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫；(b)从经免疫哺乳动物分离产生抗体的细胞；(c)将所述产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合以产生杂交瘤细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括(d)选择表达结合RSPO2蛋白的抗体的杂交瘤细胞。在一些实施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分选自由SEQ ID NO:44～SEQ ID NO:47组成的组。在一些实施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分是SEQ IDNO:44。在一些实施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分是SEQID NO:45或SEQ ID NO:46。在一些实施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分是SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。在一些实施方式中，所述哺乳动物是小鼠。在一些实施方式中，使用包含人RSPO2的22～243位氨基酸的至少一部分的多肽选择所述抗体。在一些实施方式中，包含人RSPO2的22～243位氨基酸的至少一部分的用于选择的多肽选自由SEQ ID NO:44～SEQ ID NO:47组成的组。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO2和至少一种其他RSPO蛋白。在一些实施方式中，所述至少一种其他RSPO蛋白选自由RSPO1、RSPO3和RSPO4组成的组。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO2和RSPO1。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO2和RSPO3。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO2和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO2、RSPO1和RSPO3。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO2、RSPO3和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO2、RSPO1和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合人RSPO2和小鼠RSPO2。
在一些实施方式中，生产针对人RSPO3蛋白的抗体的方法包括用包含人RSPO3的22～272位氨基酸的多肽对哺乳动物进行免疫。在一些实施方式中，生产针对人RSPO3蛋白的抗体的方法包括用包含人RSPO3的22～272位氨基酸中的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫。在一些实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物分离抗体或产生抗体的细胞。在一些实施方式中，生产结合RSPO3蛋白的单克隆抗体的方法包括：(a)用包含人RSPO3的22-272位氨基酸的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫；(b)从经免疫哺乳动物分离产生抗体的细胞；(c)将所述产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合以产生杂交瘤细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括(d)选择表达结合RSPO3蛋白的抗体的杂交瘤细胞。在一些实施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分选自由SEQ ID NO:48～SEQ ID NO:51组成的组。在一些实施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分是SEQ IDNO:48。在一些实施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分是SEQID NO:49或SEQ ID NO:50。在一些实施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分是SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。在一些实施方式中，所述哺乳动物是小鼠。在一些实施方式中，使用包含人RSPO3的22～272位氨基酸的至少一部分的多肽选择所述抗体。在一些实施方式中，包含人RSPO3的22～272位氨基酸的至少一部分的用于选择的多肽选自由SEQ ID NO:48～SEQ ID NO:51组成的组。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO3和至少一种其他RSPO蛋白。在一些实施方式中，所述至少一种其他RSPO蛋白选自由RSPO2、RSPO4和RSPO1组成的组。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO3和RSPO1。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO3和RSPO2。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO3和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO3、RSPO1和RSPO2。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO3、RSPO1和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合RSPO3、RSPO2和RSPO4。在一些实施方式中，所述抗体结合人RSPO3和小鼠RSPO3。
在一些实施方式中，由本文描述方法产生的抗体是RSPO拮抗剂。在一些实施方式中，由本文描述方法产生的抗体抑制β-连环素信号传导。
在一些实施方式中，生产针对至少一种人RSPO蛋白的抗体的方法包括使用包含单抗原结合位点的膜结合异二聚体分子鉴定抗体。在一些非限制性实施方式中，使用国际申请WO2011/100566中公开的方法和多肽鉴定所述抗体，本文通过参考并入其全部内容。
在一些实施方式中，生产针对至少一种人RSPO蛋白的抗体的方法包括就结合人RSPO蛋白的抗体筛选抗体表达文库。在一些实施方式中，所述抗体表达文库是噬菌体文库。在一些实施方式中，所述筛选包括淘选。在一些实施方式中，所述抗体表达文库(例如噬菌体文库)使用人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分进行筛选。在一些实施方式中，使用不同的RSPO蛋白再次对在第一筛选中鉴定出的抗体进行筛选，由此鉴定结合RSPO1和第二RSPO蛋白的抗体。在一些实施方式中，用于筛选的多肽包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分，所述至少一部分选自由SEQID NO:5～SEQ ID NO:9组成的组。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO1和至少一种其他RSPO蛋白。在一些实施方式中，所述至少一种其他RSPO蛋白选自由RSPO2、RSPO3和RSPO4组成的组。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO1和RSPO2。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO1和RSPO3。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO1和RSPO4。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体是RSPO1拮抗剂。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体抑制由RSPO1诱导的β-连环素信号传导。在一些实施方式中，所述抗体表达文库(例如噬菌体文库)使用人RSPO2的22～205位氨基酸的至少一部分进行筛选。在一些实施方式中，使用不同的RSPO蛋白再次对在第一筛选中鉴定出的抗体进行筛选，由此鉴定结合RSPO2和第二RSPO蛋白的抗体。在一些实施方式中，用于筛选的多肽包含人RSPO2的22～205位氨基酸的至少一部分，所述至少一部分选自由SEQ ID NO:44～SEQ ID NO:47组成的组。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO2和至少一种其他RSPO蛋白。在一些实施方式中，所述至少一种其他RSPO蛋白选自由RSPO1、RSPO3和RSPO4组成的组。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO2和RSPO3。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO2和RSPO4。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合RSPO2和RSPO1。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体结合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体是RSPO2拮抗剂。在一些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体抑制由RSPO2诱导的β-连环素信号传导。
在一些实施方式中，本文描述的抗体是分离的。在一些实施方式中，本文描述的抗体是基本纯的。
在本发明的一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是多肽。所述多肽可以是包含结合至少一种人RSPO蛋白的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。在本领域中会意识到的是，可以对本发明的一些氨基酸序列进行改变而不会显著影响所述蛋白的结构或功能。因此，本发明还包括所述多肽的各种变化，其显示了针对人RSPO蛋白的抗体或其片段的实质活性，或者其包括针对人RSPO蛋白的抗体或其片段的区域。在一些实施方式中，RSPO-结合多肽的氨基酸序列改变包括缺失、插入、倒置、重复和/或其他类型的取代。
可以对所述多肽、其类似物和变体进行进一步修饰以含有另外的化学部分，该部分通常不是所述多肽的一部分。衍生部分可以改善所述多肽的溶解度、生物半衰期和/或吸收。所述部分还可以减少或消除所述多肽和变体的任何不期望的副作用。对化学部分的综述可见于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005,University of the Sciences,Philadelphia,PA。
本文描述的多肽可以通过本领域已知的任何合适的方法产生。此类方法包括从直接蛋白合成至构建编码多肽序列的DNA序列和在合适的宿主中表达这些序列。在一些实施方式中，使用重组技术通过分离或合成编码野生型目的蛋白的DNA序列来构建DNA序列。可选的是，可以通过位点特异性诱变对所述序列进行诱变，以提供其功能类似物。参见例如Zoeller等,1984,PNAS,81:5662-5066和美国专利号4,588,585。
在一些实施方式中，编码目的多肽的DNA序列可以使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建。寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列，选择在其中产生目的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子来设计。可以应用标准方法来合成对分离的目的多肽进行编码的多核苷酸序列。例如，可以使用完整氨基酸序列来构建回译基因。此外，可以合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成编码所需多肽的一部分的数个小寡核苷酸，然后将其连接。各寡核苷酸通常含有用于互补组装的5'或3'突出(overhang)。
一旦组装后(通过合成、定点诱变或另一方法)，可以将编码特定目的多肽的多核苷酸序列插入至表达载体中，并可操作地连接至适于在所述宿主中表达所述蛋白的表达控制序列。通过核苷酸测序、限制酶定位和/或在合适的宿主中表达生物活性多肽而确认正确的组装。如本领域所公知的，为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，所述基因必须可操作地连接至转录和翻译表达控制序列，所述序列在所选的表达宿主中具有功能。
在一些实施方式中，使用重组表达载体来扩增和表达编码针对人RSPO蛋白的抗体或其片段的DNA。例如，重组表达载体可以是可复制DNA构建体，所述构建体具有编码RSPO-结合剂、抗-RSPO抗体或其片段的多肽链的合成或源自cDNA的DNA片段，所述DNA片段可操作地连接至源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录和/或翻译调控元件。转录单元通常包括以下组件：(1)在基因表达中具有调控作用的一种或多种遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录至mRNA中并翻译成蛋白质的结构或编码序列，和(3)合适的转录和翻译起始和终止序列。调控元件可以包括操作子序列以控制转录。可以另外引入通常由复制原点赋予的在宿主中复制的能力和便于识别转化体的选择基因。当DNA区彼此功能相关时DNA区是“可操作地连接”。例如，如果信号肽的DNA(分泌前导)表达为参与多肽的分泌的前体，该信号肽的DNA(分泌前导)与多肽的DNA可操作地连接，如果启动子控制编码序列的转录则启动子与编码序列可操作地连接，或者如果核糖体结合位点的定位使得允许翻译则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。在一些实施方式中，旨在用于酵母表达系统中的结构元件包括能够使宿主细胞细胞外分泌经翻译蛋白的前导序列。其他实施方式中，当不用前导或转运序列表达重组蛋白时，该重组蛋白可以包括N末端甲硫氨酸残基。该残基可选地能够被从所表达的重组蛋白切割下，从而提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择依赖于宿主的选择。可以使用各种表达宿主/载体的组合。用于真核宿主的有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物，以及更宽宿主范围的质粒，例如M13以及其他丝状单链DNA噬菌体。
用于表达RSPO-结合多肽或抗体(或RSPO蛋白以用作抗原)的合适宿主细胞包括在合适启动子控制下的原核生物、酵母细胞、昆虫细胞或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高级真核细胞包括如下文所述的哺乳动物来源的已建立细胞系。还可以使用无细胞移植系统。Pouwels等(1985,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,NY)描述了与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆表达载体。关于蛋白生产(包括抗体生产)的方法的另外信息可以例如见于美国专利公开号2008/0187954、美国专利第6,413,746和6,660,501号和国际专利公开号WO04009823。
使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组多肽。在哺乳动物细胞中表达重组多肽是优选的，因为此类蛋白通常正确折叠、经过合适的修饰和具有完全功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7(来自猴肾)、L-929(来自鼠类成纤维细胞)、C127(来自鼠类哺乳动物肿瘤)、3T3(来自鼠类成纤维细胞)、CHO(来自中国仓鼠卵巢)、HeLa(来自人子宫颈癌)、BHK(来自仓鼠肾成纤维细胞)和HEK-293(来自人胚胎肾)细胞系和其变体。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件(例如复制原点、与待表达基因连接的合适的启动子和增强子、以及其他5'或3'侧接非转录序列)和5'或3'非翻译序列，例如必要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统是本领域公知的(参见例如,Luckow和Summers,1988,Bio/Technology,6:47)。
因此，本发明提供包含本文描述的RSPO-结合剂的细胞。在一些实施方式中，所述细胞产生本文描述的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述细胞产生抗体。在一些实施方式中，所述细胞产生抗体89M5。在一些实施方式中，所述细胞产生抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述细胞产生抗体130M23。在一些实施方式中，所述细胞产生抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述细胞产生抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述细胞是ATCC保藏号为PTA-11970的杂交瘤细胞系。在一些实施方式中，所述细胞是ATCC保藏号为PTA-12021的杂交瘤细胞系。
由转化的宿主产生的蛋白可以根据任何合适的方法进行纯化。标准方法包括色谱(例如离子交换、亲和和尺寸柱色谱)、离心、差别溶解或用于蛋白纯化的任何其他标准技术。可以将诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒包衣序列和谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标记连接至所述蛋白，以允许通过合适的亲和柱而容易地纯化。还可以利用诸如蛋白水解、质谱(MS)、核磁共振(NMR)、高性能液相色谱(HPLC)和X射线晶体学等技术来物理表征分离的蛋白质。
在一些实施方式中，可以使用可商购获得的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)对来自将重组蛋白分泌至培养基中的表达系统的上清液进行第一浓缩。浓缩步骤后，将浓缩物施涂至合适的纯化基质。在一些实施方式中，可以使用阴离子交换树脂，例如具有悬垂的二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖苷、纤维素或在蛋白纯化中其他类型的常用基质。在一些实施方式中，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种包含磺丙基或羧甲基的不溶性基质。在一些实施方式中，可以使用羟基磷灰石培养基，包括但不限于陶瓷羟基磷灰石(CHT)。在一些实施方式中，可以使用利用疏水性RP-HPLC培养基(例如具有悬垂甲基或其他脂肪族基团的二氧化硅凝胶)的一步或多步反相HPLC步骤来进一步纯化RSPO-结合剂。还可以采用前述纯化步骤的一些或所有的各种组合来提供均匀的重组蛋白。
在一些实施方式中，在细菌培养基中产生的重组蛋白可以通过例如以下步骤进行分离：首先从细胞球团中提取，然后进行一步或多步浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。可以使用HPLC来进行最终纯化步骤。用于表达重组蛋白的微生物细胞可以被任何常规方法破坏，包括冷冻-解冻循环、超声波、机械破坏或使用细胞裂解剂。
用于纯化抗体和其他蛋白的本领域已知的方法还包括例如美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中描述的那些。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂为不作为抗体的多肽。用于鉴定和生产以高亲和性与蛋白靶标的非抗体多肽的各种方法是本领域已知的。参见例如,Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304;Hosse等,2006,Protein Science,15:14-27;Gill等,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658;Nygren,2008,FEBS J.,275:2668-76;和Skerra,2008,FEBS J.,275:2677-83。在一些实施方式中，可以使用噬菌体展示技术来生产和/或鉴定RSPO-结合多肽。在一些实施方式中，所述多肽包含选自由蛋白A、蛋白G、脂钙蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白组成的组中的类别的蛋白支架。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂或抗体可以以许多缀合(即免疫缀合物或放射性缀合物)或非缀合形式中的任一种使用。在一些实施方式中，所述抗体能够以非缀合形式用于利用受试对象的天然防御机制(包括补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性)，从而消除恶性或瘤细胞。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂(例如抗体或多肽)缀合至细胞毒性剂。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂是化学治疗剂，包括但不限于甲氨蝶呤、阿霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺霉素或其他嵌入剂(intercalatingagent)。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂是细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥阜草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecene)。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂是放射性同位素，以产生放射性缀合物或放射性缀合抗体。可利用各种放射性同位素来产生放射性缀合抗体，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re和212Bi。还可以利用抗体与一种或多种小分子毒素的缀合物，所述小分子毒素例如奇霉素、美登醇、单端孢菌毒素(trichothene)和CC1065，以及这些毒素的衍生物。抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用各种双官能蛋白偶联剂来制备，例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如盐酸二甲基己二亚酰胺)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮盐衍生物(例如双(对重氮基苯酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
III.多核苷酸
在一些实施方式中，本发明涵盖了包含编码特异性结合至少一种人RSPO的多肽或此类多肽的片段的多核苷酸的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了仅包括所述多肽的编码序列的多核苷酸以及包括另外的编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。例如，本发明提供包含编码针对人RSPO蛋白的抗体或编码此类抗体的片段的多核苷酸的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以为RNA形式或为DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，并且能够是双链或单链的，并且单链可以是编码链或非编码(反义)链。
在一些实施方式中，所述多核苷酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含选自由以下序列组成的组中的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含选自由以下序列组成的组中的序列：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:76。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含选自由以下序列组成的组中的多核苷酸序列：SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含选自由以下序列组成的组中的多核苷酸序列：SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:75。
在一些实施方式中，质粒包含含有SEQ ID NO:52的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒包含含有多核苷酸序列SEQ ID NO:56的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒包含含有多核苷酸序列SEQ ID NO:60的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒包含含有多核苷酸序列SEQ ID NO:64的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒包含含有多核苷酸序列SEQ ID NO:72的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒包含编码含有SEQID NO:68和/或SEQ ID NO:69的氨基酸序列的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒包含编码含有SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:71的氨基酸序列的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒包含编码含有SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与包含选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58组成的组中序列的多核苷酸具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性，并且在一些实施方式中，两者具有至少96%、97%、98%或99%同一性。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含具有下述核苷酸序列的多核苷酸：所述核苷酸序列与包含选自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72和SEQ IDNO:75组成的组中序列的多核苷酸具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性，并且在一些实施方式中，两者具有至少96%、97%、98%或99%同一性。还提供了包含与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:75杂交的多核苷酸的多核苷酸。在一些实施方式中，所述杂交在高严谨条件下进行。
在一些实施方式中，抗体由包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的多核苷酸编码。在一些实施方式中，抗体由包含SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56的多核苷酸编码。在一些实施方式中，抗体由包含SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的多核苷酸编码。在一些实施方式中，抗体由包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:64的多核苷酸编码。在一些实施方式中，抗体由包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:72的多核苷酸编码。
在一些实施方式中，所述多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，所述编码序列与例如有助于多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸(例如前导序列或信号序列，其用作控制多肽从细胞进行转运的分泌序列)融合在同一阅读框中。具有前导序列的多肽是前蛋白，并且能够被宿主细胞将前导序列其阁下，从而形成所述多肽的成熟形式。所述多核苷酸还可以编码作为附加有另外的5'氨基酸残基的成熟蛋白的原蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是原蛋白，并且是所述蛋白的失活形式。一旦原序列被切割，则留下活性成熟蛋白。
在一些实施方式中，所述多核苷酸包含与例如允许对所编码多肽进行纯化的标记序列融合在同一阅读框中的成熟多肽的编码序列。例如，所述标记序列可以是由pQE-9载体提供的六聚组氨酸标记，以用于在细菌宿主的情况下对与所述标记融合的成熟多肽进行纯化，或者在使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，所述标记序列可以是源自流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标记。在一些实施方式中，所述标记序列是FLAG标记，其是序列为DYKDDDDK(SEQ ID NO:18)的肽，可以与其他亲和标记组合使用。
本发明还涉及例如编码片段、类似物和/或衍生物的上文所述多核苷酸的变体。
在一些实施方式中，所述多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与编码包含本文描述的RSPO-结合剂(例如，抗体)或其片段的多核苷酸具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性，并且在一些实施方式中，两者具有至少约96%、97%、98%或99%同一性。
如本文所用，短语具有与参照核苷酸序列具有至少例如95%“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸是指：所述多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，不同之处在于，相对于参照核苷酸序列中的每100个核苷酸，所述多核苷酸序列包括至多5个点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少例如95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参照序列中的至多5%的核苷酸缺失、或用另一核苷酸取代、或可以将数量为参照序列中全部核苷酸的至多5%的核苷酸插入至参照序列中。参照序列的这些突变可以出现在参照核苷酸序列的5'或3'末端位置或这些末端位置之间的任何地方，其在参照序列的核苷酸中分别地穿插或在参照序列内以一个或多个相邻基团穿插。
多核苷酸变体可以含有编码区和/或非编码区中的改变。在一些实施方式中，所述多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的改变。在一些实施方式中，核苷酸变体通过因遗传编码的简并性导致的沉默取代而产生。在一些实施方式中，核苷酸变体包含导致表达差异(例如表达增加或降低)的核苷酸序列，但氨基酸序列未改变。多核苷酸变体可以出于各种理由而产生，例如，对特定宿主优化密码子表达(即，将人mRNA中的密码子改变为诸如大肠杆菌等细菌宿主优选的密码子)。
在一些实施方式中，所述多核苷酸是分离的。在一些实施方式中，所述多核苷酸是基本上纯的。
还提供包含本文描述的多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方式中，表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含含有所述多核苷酸分子的表达载体。在一些实施方式中，宿主细胞包含多核苷酸分子。
IV.使用方法和药物组合物
本发明的RSPO-结合剂(包括多肽和抗体)用于各种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，例如治疗癌。在一些实施方式中，所述试剂用于抑制β-连环素信号传导、抑制肿瘤生长、诱导分化、减少肿瘤体积、减少肿瘤中癌干细胞的频率和/或减少肿瘤的致瘤性。所述使用方法可以是体外、离体或体内方法。在一些实施方式中，RSPO-结合剂或多肽或抗体是人RSPO1的拮抗剂。在一些实施方式中，RSPO-结合剂或多肽或抗体是人RSPO2的拮抗剂。在一些实施方式中，RSPO-结合剂或多肽或抗体是人RSPO3的拮抗剂。
在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂用于治疗与β-连环素的激活、β-连环素信号传导增加和/或β-连环素信号传导异常有关的疾病。在一些实施方式中，所述疾病是依赖于β-连环素信号传导的疾病。在一些实施方式中，所述疾病是依赖于β-连环素激活的疾病。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂用于治疗特征在于干细胞和/或祖细胞的水平增加的疾病。在一些实施方式中，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO1-结合剂(例如，抗体)。在一些实施方式中，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO2-结合剂(例如，抗体)。在一些实施方式中，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO3-结合剂(例如，抗体)。在一些实施方式中，所述受试对象是人。
本发明提供使用本文描述的RSPO-结合剂或抗体抑制肿瘤生长的方法。在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括使细胞与RSPO-结合剂(例如，抗体)在体外接触。例如，在添加有抗-RSPO抗体或其他试剂的培养基中培养永生化细胞系或癌细胞系以抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，肿瘤细胞分离自患者样品(例如组织活检、胸腔积液或血液样品)，并且在添加有RSPO-结合剂的培养基中培养以抑制肿瘤生长。
在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与RSPO-结合剂(例如，抗体)在体内接触。在一些实施方式中，使肿瘤或肿瘤细胞与RSPO-结合剂接触在动物模型中进行。例如，可以对具有异种移植物的免疫妥协的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)施用RSPO-结合剂。在一些实施方式中，从患者样品(例如组织活检、胸腔积液或血液样品)分离出癌细胞或癌干细胞，并且将其注入免疫妥协的小鼠中，然后对所述免疫妥协的小鼠施用RSPO-结合剂以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方式中，对所述动物施用RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，对所述动物施用RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，对所述动物施用RSPO3-结合剂。在一些实施方式中，在将致瘤性细胞引入动物的同时或稍后施用所述RSPO-结合剂，以预防肿瘤生长(“预防性模型”)。在一些实施方式中，在肿瘤已经生长至特定尺寸后施用所述RSPO-结合剂作为治疗剂(“治疗性模型”)。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO1抗体。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是抗体89M5。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO2抗体。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体130M23。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO3抗体。
在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂，所述RSPO-结合剂含有：包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3；和/或包含KASQDVIFAVA(SEQ IDNO:15)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂，所述RSPO-结合剂含有：包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重链CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3；和/或包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ IDNO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3。
在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述受试对象是人。在一些实施方式中，所述受试对象具有肿瘤或具有的肿瘤已经被除去。在一些实施方式中，所述受试对象具有至少一种RSPO蛋白(例如,RSPO1、RSPO2或RSPO3)的表达水平升高的肿瘤。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO3-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂是抗体。
在一些实施方式中，所述肿瘤是其中激活β-连环素信号传导的肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是其中β-连环素信号传导异常的肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤包含APC肿瘤抑制基因中的失活突变(例如，截短突变)。在一些实施方式中，所述肿瘤不包含所述APC肿瘤抑制基因中的失活突变。在一些实施方式中，所述肿瘤包含野生型APC基因。在一些实施方式中，所述肿瘤不包含β-连环素基因中的激活突变。在一些实施方式中，正在被治疗的受试对象的癌与此类肿瘤有关。
在一些实施方式中，所述肿瘤表达与RSPO1-结合剂或抗体结合的RSPO1。在一些实施方式中，所述肿瘤具有升高表达水平的RSPO1或过表达的RSPO1。在一些实施方式中，所述肿瘤具有高表达水平的RSPO1。通常，短语“肿瘤具有升高表达水平的”蛋白(或类似短语)是指肿瘤中的蛋白的表达水平与同一组织类型的正常组织中同一蛋白质的表达水平进行比较。但是，在一些实施方式中，肿瘤中蛋白质的表达水平与组织类型的组内所述蛋白质的平均表达水平相比“升高”或“高”。在一些实施方式中，肿瘤中蛋白质的表达水平与同一组织类型或不同组织类型的其他肿瘤中所述蛋白质的表达水平相比“升高”或“高”。在一些实施方式中，所述肿瘤表达与RSPO2-结合剂或抗体结合的RSPO2。在一些实施方式中，所述肿瘤具有升高表达水平的RSPO2或过表达的RSPO2。在一些实施方式中，所述肿瘤具有高表达水平的RSPO2。在一些实施方式中，所述肿瘤表达与RSPO3-结合剂或抗体结合的RSPO3。在一些实施方式中，所述肿瘤具有升高表达水平的RSPO3或过表达的RSPO3。在一些实施方式中，所述肿瘤具有高表达水平的RSPO3。在一些实施方式中，所述肿瘤表达与RSPO4-结合剂或抗体结合的RSPO4。在一些实施方式中，所述肿瘤具有升高表达水平的RSPO4或过表达的RSPO4。在一些实施方式中，所述肿瘤具有高表达水平的RSPO4。在一些实施方式中，与正常组织中表达的RSPO水平相比，所述肿瘤表达升高水平的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些实施方式中，所述正常组织是与所述肿瘤相同的组织类型的组织。
此外，本发明提供抑制受试对象中肿瘤生长的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述肿瘤包含癌干细胞。在一些实施方式中，所述肿瘤中癌干细胞的频率通过施用所述RSPO-结合剂而减少。本发明还提供减少肿瘤中癌干细胞的频率的方法，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的RSPO-结合剂(例如，抗-RSPO抗体)接触。在一些实施方式中，提供一种减少受试对象的肿瘤中癌干细胞的频率的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂(例如，抗-RSPO抗体)。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO1抗体。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是89M5。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO2抗体。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是130M23。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO3抗体。
在一些实施方式中，所述肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是选自由以下肿瘤组成的组中的肿瘤：结直肠瘤、胰腺瘤、肺瘤、卵巢瘤、肝瘤、乳腺瘤、肾瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、成胶质细胞瘤以及头颈瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是结直肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是卵巢瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是胰腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是包含APC基因中的失活突变的结直肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是不包含APC基因中的失活突变的结直肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO1的表达水平升高的卵巢瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平升高的胰腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平升高的结肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平升高的肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平升高的黑素瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平升高的乳腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平升高的肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平升高的卵巢瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平升高的乳腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平升高的结肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO4的表达水平升高的乳腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO4的表达水平升高的肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO4的表达水平升高的卵巢瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO1的表达水平高的卵巢瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平高的胰腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平高的结肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平高的肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平高的黑素瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO2的表达水平高的乳腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平高的肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平高的卵巢瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平高的乳腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO3的表达水平高的结肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO4的表达水平高的乳腺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO4的表达水平高的肺瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是RSPO4的表达水平高的卵巢瘤。
本发明还提供用于治疗癌的方法，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述癌的特征在于表达的至少一种RSPO蛋白的水平与正常组织中的同一RSPO蛋白的表达水平相比升高的细胞。在一些实施方式中，所述癌的特征在于过表达RSPO1的细胞。在一些实施方式中，所述癌的特征在于过表达RSPO2的细胞。在一些实施方式中，所述癌的特征在于过表达RSPO3的细胞。在一些实施方式中，所述癌过表达选自由RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4组成的组中的至少一种RSPO蛋白。在一些实施方式中，所述癌的特征在于表达β-连环素的细胞，其中所述RSPO-结合剂(例如，抗体)干扰RSPO-诱导的β-连环素信号传导和/或激活。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO1，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO2，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO3，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO1，干扰RSPO1/LGR相互作用，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO2，干扰RSPO2/LGR相互作用，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO3，干扰RSPO3/LGR相互作用，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO1，抑制β-连环素激活，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO2，抑制β-连环素激活，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO3，抑制β-连环素激活，并且抑制或减少所述癌的生长。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO1，并且减少所述癌中癌干细胞的频率。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO2，并且减少所述癌中癌干细胞的频率。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂结合RSPO3，并且减少所述癌中癌干细胞的频率。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO1抗体。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是抗体89M5。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO2抗体。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体130M23。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是抗-RSPO3抗体。
本发明提供治疗癌的方法，所述方法包括对受试对象(例如需要治疗的受试对象)施用治疗有效量的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述受试对象是人。在一些实施方式中，所述受试对象具有癌性肿瘤。在一些实施方式中，所述受试对象具有的肿瘤已经除去。在一些实施方式中，治疗癌的方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂，其中所述受试对象具有至少一种RSPO蛋白的表达升高的肿瘤。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO1的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO1的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用抗-RSPO1抗体。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO1的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用抗体89M5。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO1的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用抗-RSPO2抗体。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用抗体130M23。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的卵巢瘤，并且对其施用抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的胰腺瘤，并且对其施用抗体130M23。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的胰腺瘤，并且对其施用抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的胰腺瘤，并且对其施用抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的结肠瘤，并且对其施用抗体130M23。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的结肠瘤，并且对其施用抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO2的表达升高的结肠瘤，并且对其施用抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述受试对象具有RSPO3的表达升高的肺瘤，并且对其施用抗-RSPO3抗体。
在一些实施方式中，所述癌是选自由以下癌组成的组中的癌：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤以及头颈癌。在一些实施方式中，所述癌是胰腺癌。在一些实施方式中，所述癌是卵巢癌。在一些实施方式中，所述癌是结直肠癌。在一些实施方式中，所述癌是乳腺癌。在一些实施方式中，所述癌是前列腺癌。在一些实施方式中，所述癌是肺癌。
此外，本发明提供减少受试对象中肿瘤的致瘤性的方法，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述肿瘤包含癌干细胞。在一些实施方式中，通过减少所述肿瘤中癌干细胞的频率而减少肿瘤的致瘤性。在一些实施方式中，所述方法包括使用本文描述的RSPO1-结合剂、RSPO2-结合剂或RSPO3-结合剂。在一些实施方式中，通过施用RSPO-结合剂而减少所述肿瘤中癌干细胞的频率。
在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌中至少一种RSPO蛋白的表达水平的步骤。在一些实施方式中，确定所述肿瘤或癌中RSPO的表达水平的步骤包括确定RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平。在一些实施方式中，将肿瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平与正常组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平进行比较。在一些实施方式中，将肿瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平与正常组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的预定表达水平进行比较。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有APC基因中的失活突变的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有β-连环素基因中的激活突变的步骤。在一些实施方式中，确定RSPO的表达水平的步骤在治疗之前完成。在一些实施方式中，如果所述肿瘤或癌具有的RSPO表达水平与正常组织中相同RSPO蛋白的表达相比升高，则对所述受试对象施用本文描述的RSPO-结合剂或抗体。例如，在一些实施方式中，如果所述肿瘤或癌具有的RSPO1表达水平与正常组织中RSPO1蛋白的表达水平相比升高，则对所述受试对象施用RSPO1-结合剂(例如，抗-RSPO1抗体)。在一些实施方式中，如果所述肿瘤或癌具有的RSPO2表达水平与正常组织中RSPO2蛋白的表达水平相比升高，则对所述受试对象施用RSPO2-结合剂(例如，抗-RSPO2抗体)。在一些实施方式中，如果所述肿瘤或癌具有的RSPO3表达水平与正常组织中RSPO3蛋白的表达水平相比升高，则对所述受试对象施用RSPO3-结合剂(例如，抗-RSPO3抗体)。如果所述肿瘤的超过一种RSPO蛋白的表达水平升高，则对所述受试对象首先施用针对与正常组织相比过表达最多的RSPO蛋白的RSPO-结合剂或抗体。在一些实施方式中，如果所述肿瘤或癌具有APC基因中的突变，则对所述受试对象本文描述的施用RSPO-结合剂或抗体。
此外，本发明提供鉴定用RSPO-结合剂治疗的人受试对象的方法，所述方法包括确定所述受试对象是否具有RSPO表达水平与正常组织中相同RSPO蛋白的表达相比升高的肿瘤。在一些实施方式中，如果所述肿瘤具有的RSPO表达水平升高，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO蛋白的抗体治疗。在一些实施方式中，如果选定用于治疗，则对所述受试对象施用本文描述的RSPO-结合剂或抗体。在一些实施方式中，如果所述肿瘤具有的超过一种RSPO的表达水平升高，则对所述受试对象施用结合表达水平最高的RSPO蛋白的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述受试对象具有的肿瘤已经除去。例如，在一些实施方式中，确定肿瘤中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平，如果所述肿瘤具有的RSPO1表达水平与正常组织中RSPO1的水平相比升高，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO1的抗体进行治疗。如果选定用于治疗，则对所述受试对象施用本文描述的抗-RSPO1抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述受试对象具有的肿瘤已经除去。例如，在一些实施方式中，确定肿瘤中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平，如果所述肿瘤具有的RSPO2表达水平与正常组织中RSPO2的水平相比升高，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO2的抗体进行治疗。如果选定用于治疗，则对所述受试对象施用本文描述的抗-RSPO2抗体。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体130M23。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述受试对象具有的肿瘤已经除去。
本发明提供选择用RSPO-结合剂治疗的人受试对象的方法，所述方法包括确定所述受试对象是否具有至少一种RSPO蛋白的表达水平升高的肿瘤，其中如果所述肿瘤具有的至少一种RSPO蛋白的表达水平升高，则选择所述受试对象以用特异性结合表达水平升高的RSPO蛋白的抗体进行治疗。本发明提供选择用RSPO-结合剂治疗的人受试对象的方法，所述方法包括确定所述受试对象是否具有至少一种RSPO蛋白的表达水平高的肿瘤，其中如果所述肿瘤具有的至少一种RSPO蛋白的表达水平高，则选择所述受试对象以用特异性结合表达水平高的RSPO蛋白的抗体进行治疗。在一些实施方式中，表达水平“升高”或“高”是与相同组织类型的正常组织中的相同RSPO蛋白的表达水平相比。在一些实施方式中，表达水平“升高”或“高”是与相同肿瘤类型的其他肿瘤中的相同RSPO蛋白的表达水平相比。在一些实施方式中，如果选定用于治疗，则对所述受试对象施用本文描述的RSPO-结合剂或抗体。在一些实施方式中，所述受试对象具有的肿瘤已经除去。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述抗-RSPO1抗体是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述抗-RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO3-结合剂。
本发明还提供治疗人受试对象中的癌的方法，所述方法包括：(a)基于或至少部分基于具有RSPO1的表达水平升高或高的癌的受试对象选择受试对象，和(b)对所述受试对象施用治疗有效量的本文描述的RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体h89M5-H2L2。
本发明还提供治疗人受试对象中的癌的方法，所述方法包括：(a)基于或至少部分基于具有RSPO2的表达水平升高或高的癌的受试对象选择受试对象，和(b)对所述受试对象施用治疗有效量的本文描述的RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体h130M23-H1L6。
本发明还提供治疗人受试对象中的癌的方法，所述方法包括：(a)基于或至少部分基于具有RSPO3的表达水平升高或高的癌的受试对象选择受试对象，和(b)对所述受试对象施用治疗有效量的本文描述的RSPO3-结合剂。
用于确定细胞、肿瘤或癌中RSPO的表达水平的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括但不限于，用于核酸表达的基于PCR的检验、微阵列分析和核苷酸测序(例如NextGen测序)。其他方法包括但不限于，用于蛋白质表达的蛋白质印迹分析、蛋白质阵列、ELISA和FACS。
用于确定肿瘤或癌是否具有升高水平或高水平的RSPO表达的方法可以使用各种样品。在一些实施方式中，所述样品取自具有肿瘤或癌的受试对象。在一些实施方式中，所述样品是新鲜肿瘤/癌样品。在一些实施方式中，所述样品是冷冻肿瘤/癌样品。在一些实施方式中，所述样品是福尔马林-固定的石蜡包埋样品。在一些实施方式中，将所述样品处理成细胞裂解物。在一些实施方式中，将所述样品处理成DNA或RNA。
还提供治疗受试对象中疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症与异常(例如，水平增加)的β-连环素信号传导相关。还提供治疗受试对象中疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于干细胞和/或祖细胞的水平增加。在一些实施方式中，所述治疗方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂、多肽或抗体。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO3-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂是抗体。
本发明还提供抑制细胞中β-连环素信号传导的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的RSPO-结合剂接触。在一些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述方法是体内方法，其中使细胞与RSPO-结合剂接触的步骤包括对受试对象施用治疗有效量的所述RSPO-结合剂的步骤。在一些实施方式中，所述方法是体外或离体方法。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制β-连环素信号传导。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂抑制β-连环素的激活。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂干扰RSPO/LGR相互作用。在一些实施方式中，所述LGR是LGR4、LGR5和/或LGR6。在一些实施方式中，所述LGR是LGR4。在一些实施方式中，所述LGR是LGR5。在一些实施方式中，所述LGR是LGR6。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO3-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂是抗体。
还提供本文描述的RSPO-结合剂、多肽或抗体在诱导细胞(包括但不限于肿瘤细胞)分化中的应用。在一些实施方式中，诱导细胞分化的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的RSPO-结合剂(例如，抗-RSPO抗体)接触。在一些实施方式中，诱导受试对象的肿瘤中细胞分化的方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂、多肽或抗体。在一些实施方式中，诱导肿瘤细胞上的分化标记的方法包括施用治疗有效量的RSPO-结合剂、多肽或抗体。在一些实施方式中，所述肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤选自由以下肿瘤组成的组：结直肠瘤、胰腺瘤、肺瘤、卵巢瘤、肝瘤、乳腺瘤、肾瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、成胶质细胞瘤以及头颈瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是卵巢瘤。在一些其他实施方式中，所述肿瘤是结肠瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是肺瘤。在一些实施方式中，所述方法是体内方法。在一些实施方式中，所述方法是体外方法。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO3-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂是抗体。
本发明还提供将致瘤性细胞分化成非致瘤性细胞的方法，所述方法包括使所述致瘤性细胞与RSPO-结合剂接触的方法。在一些实施方式中，所述方法包括对具有包含致瘤性细胞或已经除去此类肿瘤的受试对象施用所述RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述致瘤性细胞是卵巢瘤细胞。在一些实施方式中，所述致瘤性细胞是结肠瘤细胞。在一些实施方式中，所述致瘤性细胞是肺瘤细胞。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1-结合剂是抗体89M5。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体。在一些实施方式中，所述RSPO2-结合剂是抗体130M23。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂是RSPO3-结合剂。在一些实施方式中，所述RSPO3-结合剂是抗体。
在一些实施方式中，用本文描述的RSPO-结合剂治疗的疾病不是癌。例如，所述疾病可以是代谢性疾病，例如肥胖症或糖尿病(例如，II型糖尿病)(Jin T.,2008,Diabetologia,51:1771-80)。作为选择，所述疾病可以是骨病，例如骨质疏松、骨关节炎或类风湿性关节炎(Corr M.,2008,Nat.Clin.Pract.Rheumatol.,4:550-6;Day等,2008,Bone Joint Surg.Am.,90Suppl1:19-24)。所述疾病还可以是肾病，例如多囊性肾病(Harris等,2009,Ann.Rev.Med.,60:321-337;Schmidt-Ott等,2008,Kidney Int.,74:1004-8;Benzing等,2007,J.Am.Soc.Nephrol.,18:1389-98)。作为选择，可以治疗眼病，包括但不限于黄斑退化和家族性渗出性玻璃体视网膜病变(Lad等,2009,StemCells Dev.,18:7-16)。还可以治疗心血管疾病，包括心肌梗死、动脉粥样硬化和瓣膜障碍(Al-Aly Z.,2008,Transl.Res.,151:233-9;Kobayashi等,2009,Nat.Cell Biol.,11:46-55;van Gijn等,2002,Cardiovasc.Res.,55:16-24;Christman等,2008,Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.,294:H2864-70)。在一些实施方式中，所述疾病是肺病，例如特发性肺动脉高压或肺纤维症(Laumanns等,2008,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,2009,40:683-691;等,2008,PLoS ONE,3:e2142)。在一些实施方式中，用所述RSPO-结合剂治疗的疾病是肝病，例如肝硬化或肝纤维症(Cheng等,2008,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,294:G39-49)。
本发明还提供包含本文描述的RSPO-结合剂的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载剂。这些药物组合物可应用在抑制受试对象(例如，人患者)中的肿瘤生长和治疗受试对象(例如，人患者)中的癌方面。
在一些实施方式中，通过将本发明的经纯化抗体或试剂与药学上可接受的载剂(例如载体或赋性剂)组合而制备制剂以用于贮存和使用。合适的药学上可接受的载剂包括但不限于：非毒性缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵(hexamethonium)、苯扎氯铵、苄索氯铵、酚、丁基醇或苄基醇、烷基对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，小于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、凝胶蛋白或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物，例如Zn-蛋白络合物；和非离子表面活性剂，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)(Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版，2005,University of the Sciences in Philadelphia,PA)。
本发明的药物组合物可以以任何方式施用，以用于局部或全身治疗。施用可以通过下述方式进行：通过表皮或透皮贴剂、油膏剂、乳液剂、膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的局部施用；通过吸入或吹入粉末或气溶胶而肺部给药，包括通过喷雾器、气管内和鼻内；口服施用；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或心室内)。
治疗制剂可以是单位剂量形式。此类制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、水或非水性介质中的溶液剂或悬浮剂、或者栓剂。在诸如片剂等固体组合物中，将主要活性成分与药物载剂混合。常规制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶以及稀释剂(例如水)。可以使用他们来形成固体预制剂组合物，所述组合物含有本发明的化合物或其非毒性药学上可接受盐的均匀混合物。然后将固体预制剂组合物细分成上述类型的单位剂型。可以将所述制剂或组合物的片剂、丸剂等包被或配合，来提供赋予延长作用的优点。例如，片剂或丸剂可以包含被外部组分覆盖的内部组合物。此外，所述两种组分可以通过肠衣分开，所述肠衣用于抵抗崩解和允许内部组分完整地通过胃或允许延迟释放。可以将各种材料用于此类肠衣或包衣，此类材料包括许多聚合性酸，以及聚合性酸与诸如虫胶、十六烷醇和乙酸纤维素的混合物。
本文描述的RSPO-结合剂或抗体还可以包封入微胶囊中。此类微胶囊可以分别例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备，例如，羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在巨乳液(macroemulsion)，如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版，2005,University of the Sciences in Philadelphia,PA中所述。
在一些实施方式中，药物组合物包括与脂质体复合的本发明的RSPO-结合剂(例如，抗体)。生产脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可以通过具有包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物进行反相蒸发而生产。脂质体通过规定孔径的过滤器进行挤出，以产生具有所需直径的脂质体。
在一些实施方式中，可以生产缓释制品。缓释制品的合适实例包括含有RSPO-结合剂(例如抗体)的固体疏水性聚合物的半渗透基质，其中所述基质是成型品的形式(例如膜或微胶囊)。缓释基质的实例包括聚酯、诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇)等水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮氨酰脯氨酸醋酸盐组成的可注射微球))、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
在一些实施方式中，除了施用RSPO-结合剂(例如，抗体)之外，所述方法或治疗还包括施用至少一种另外的治疗剂。可以在施用所述RSPO-结合剂之前、与其同时和/或之后施用另外的治疗剂。还提供包含RSPO-结合剂和所述另外的治疗剂的药物组合物。在一些实施方式中，至少一种另外的治疗剂包括1种、2种、3种或更多种另外的治疗剂。
施用两种以上治疗剂的组合治疗通常使用通过不同作用机制起作用的试剂，但不是必须如此。施用具有不同作用机制的试剂的组合治疗可以产生加合或协同效应。组合治疗可以允许每种试剂的剂量比单药治疗使用的剂量更低，由此减少毒性副作用和/或增加所述试剂的治疗指数。组合治疗可以减少发展抗性癌细胞的可能性。在一些实施方式中，组合治疗包含影响(例如抑制或杀死)非致瘤性细胞的治疗剂和影响(例如抑制或杀死)致瘤性CSC的治疗剂。
在一些实施方式中，RSPO-结合剂与至少一种另外的治疗剂的组合产生加合或协同结果。在一些实施方式中，所述组合治疗导致所述RSPO-结合剂的治疗指数的增加。在一些实施方式中，所述组合治疗导致所述另外试剂的治疗指数的增加。在一些实施方式中，所述组合治疗导致所述RSPO-结合剂的毒性和/或副作用的降低。在一些实施方式中，所述组合治疗导致所述另外试剂的毒性和/或副作用的降低。
治疗剂的有用类别包括例如：抗微管蛋白剂、奥利斯达汀(auristatin)、DNA小槽结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物以及卡铂)、蒽环类化合物、抗生素、抗叶酸药、抗代谢药、化学治疗敏化剂、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、氟嘧啶、离子载体(ionophore)、雷昔托普辛(lexitropsin)、亚硝基脲、顺氯氨铂(platinol)、嘌呤抗代谢药、嘌呤霉素、放射敏化剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱等。在一些实施方式中，第二治疗剂是烷基化剂、抗代谢药、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。在一些实施方式中，所述第二治疗剂是铂络合物，例如卡铂或顺铂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是与紫杉烷组合的铂络合物。
可以与所述RSPO-结合剂组合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方式中，所述方法或治疗包括与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的鸡尾酒剂组合施用本发明的RSPO1-结合剂或抗体。在一些实施方式中，所述方法或治疗包括与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的鸡尾酒剂组合施用本发明的RSPO2-结合剂或抗体。在一些实施方式中，所述方法或治疗包括与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的鸡尾酒剂组合施用本发明的RSPO3-结合剂或抗体。用RSPO-结合剂(例如抗体)进行治疗可以在施用化疗剂之前、与其同时或之后发生。组合施用可以包括在单独的药物制剂中或使用单独的制剂共施用，或者以任意顺序连续施用(但通常在一定时间段内)，从而使所有活性剂能够同时发挥其生物活性。此类化学治疗剂的制备和给药可以根据制造商说明使用，或者由熟练的从业者根据经验确定。此类化疗剂的制备和给药方案还描述于The Chemotherapy Source Book,第4版，2008,M.C.Perry编,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.中。
用于本发明的化学治疗剂包括但不限于：烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磺丙脲(cholophosphamide)、磷雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如双氯乙基亚硝脲、氯脲菌素、福莫司汀、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素、放射菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、刺孢霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢药，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑鸟嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿嘧啶脱氧核苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药(anti-adrenal)，例如氨苯哌酮、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶；比达布昔(bestrabucil)；比山群；依达曲沙；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春酰胺；氮烯咪胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞嘧啶(Ara-C)；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(XELODA)；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；以及抗雄激素剂例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是顺铂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是卡铂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是紫杉醇(紫杉酚)。在一些实施方式中，方法包括与顺铂组合施用抗-RSPO1抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，方法包括与顺铂组合施用抗-RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的作用的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸道诺霉素、盐酸米托蒽醌、放射菌素D、依托泊苷、盐酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和依立替康，以及他们中任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是依立替康。因此，在一些实施方式中，所述治疗方法包括与拓扑异构酶抑制剂组合施用RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与依立替康组合施用抗-RSPO1抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，方法包括与拓扑异构酶抑制剂组合施用RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与依立替康组合施用抗-RSPO2抗体130M23或h130M23-H1L2。
在一些实施方式中，所述化学治疗剂是抗代谢药。抗代谢药是这样的化学品：其与正常生化反应所需的代谢物具有类似结构，但是不同之处足以干扰细胞的一种或多种正常功能，例如细胞分裂。抗代谢药包括但不限于，吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-阿扎胞苷、6-巯基嘌呤、咪唑硫嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨，以及他们中任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是吉西他滨。因此，在一些实施方式中，方法包括与抗代谢药组合施用RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与吉西他滨组合施用抗-RSPO1抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，方法包括与抗代谢药组合施用RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与吉西他滨组合施用抗-RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，所述化学治疗剂是抗有丝分裂剂，其包括但不限于结合微管蛋白的试剂。在一些实施方式中，所述试剂是紫杉烷。在一些实施方式中，所述试剂是紫杉醇或多西他赛，或紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，所述试剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、结合有白蛋白的紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在一些替代实施方式中，所述抗有丝分裂剂包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，所述抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或诸如Aurora A或Plk1等有丝分裂激酶的抑制剂。在一些实施方式中，当与RSPO-结合剂组合施用的化学治疗剂是抗有丝分裂剂时，正在治疗的癌或肿瘤是乳腺癌或乳腺瘤。
在一些实施方式中，另外的治疗剂包括诸如小分子等试剂。例如，治疗可以包括组合施用本发明的RSPO-结合剂(例如抗体)与小分子，所述小分子充当针对另外的肿瘤相关抗原的抑制剂，所述抗原包括但不限于EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是抑制癌干细胞途径的小分子。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是Notch途径的抑制剂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是Wnt途径的抑制剂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是BMP途径的抑制剂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是抑制β-连环素信号传导的分子。
在一些实施方式中，另外的治疗剂包含生物分子，例如抗体。例如，治疗可以包括组合施用本发明的RSPO-结合剂(例如抗体)与其他抗体，所述其他抗体针对另外的肿瘤相关抗原，其包括包括但不限于结合EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF的抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是第二抗-RSPO抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是与抗-RSPO1抗体组合使用的抗-RSPO2抗体、抗-RSPO3抗体和/或抗-RSPO4抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是与抗-RSPO2抗体组合使用的抗-RSPO1抗体、抗-RSPO3抗体和/或抗-RSPO4抗体。在一些实施方式中，抗-RSPO1抗体与抗-RSPO2抗体组合使用。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是对抗癌干细胞标记物具有特异性的抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是结合Notch途径的组分的抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是结合Wnt途径的组分的抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是抑制癌干细胞途径的抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是Notch途径的抑制剂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是Wnt途径的抑制剂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是BMP途径的抑制剂。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是抑制β-连环素信号传导的抗体。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是作为血管生成抑制剂的抗体(例如，抗-VEGF或VEGF受体抗体)。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是贝伐单抗(AVASTIN)、曲妥单抗(HERCEPTIN)、帕尼单抗(VECTIBIX)或西妥昔单抗(ERBITUX)。
在一些实施方式中，本文描述的方法包括与Wnt途径抑制剂组合施用治疗有效量的RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述Wnt途径抑制剂是卷曲蛋白(FZD)结合剂（“FZD-结合剂”）。FZD-结合剂的非限制性实例可见于美国专利号7,982,013，本文通过参考并入其全部内容。FZD-结合剂可以包括但不限于抗-FZD抗体。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体组合施用RSPO-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体18R5组合施用RSPO-结合剂。在一些实施方式中，所述Wnt途径抑制剂是Wnt蛋白结合剂(“Wnt-结合剂”)。Wnt-结合剂的非限制性实例可见于美国专利号7,723,477和7,947,277以及国际公开号WO2011/088127和WO2011/088123中，本文通过参考并入其全部内容。Wnt-结合剂可以包括但不限于抗-Wnt抗体和FZD-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，方法包括与FZD-Fc可溶性受体组合施用RSPO-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与FZD8-Fc可溶性受体组合施用RSPO-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体组合施用RSPO1-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体组合施用抗-RSPO1抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体18R5组合施用抗-RSPO1抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，方法包括与FZD-Fc可溶性受体组合施用抗-RSPO1抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，方法包括与FZD8-Fc可溶性受体组合施用抗-RSPO1抗体89M5或h89M5-H2L2。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体组合施用RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体组合施用抗-RSPO2抗体130M23或h130M23-H1L2。在一些实施方式中，方法包括与抗-FZD抗体18R5组合施用抗-RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些实施方式中，方法包括与FZD-Fc可溶性受体组合施用抗-RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些实施方式中，方法包括与FZD8-Fc可溶性受体组合施用抗-RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
在一些实施方式中，本文描述的方法包括与超过一种另外的治疗剂组合施用治疗有效量的RSPO-结合剂。因此，在一些实施方式中，所述治疗方法包括与化学治疗剂和Wnt途径抑制剂组合施用RSPO-结合剂。因此，在一些实施方式中，所述治疗方法包括与化学治疗剂和Wnt途径抑制剂组合施用RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与化学治疗剂和抗-FZD抗体18R5组合施用RSPO2-结合剂。因此，在一些实施方式中，所述治疗方法包括与化学治疗剂和FZD8-Fc可溶性受体组合施用RSPO2-结合剂。因此，在一些实施方式中，所述治疗方法包括与吉西他滨和Wnt途径抑制剂组合施用RSPO2-结合剂。在一些实施方式中，方法包括与吉西他滨和抗-FZD抗体18R5组合施用抗-RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些实施方式中，方法包括与吉西他滨和FZD8-Fc可溶性受体组合施用抗-RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。
此外，用本文描述的RSPO-结合剂进行治疗可以包括与诸如一种或多种细胞因子(例如，淋巴因子、白介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)等另外的生物分子组合治疗，或可以伴随通过手术除去肿瘤、癌细胞或任何其他治疗医师认为必须的疗法。
在一些实施方式中，所述治疗包括与放射性治疗组合施用本发明的RSPO-结合剂(例如抗体)。用RSPO-结合剂进行治疗可以在施加放射性疗法之前、与其同时或之后发生。此类放射性疗法的给药方案可由熟练的医学从业者确定。
组合施用可以包括在单独的药物制剂中或使用单独的制剂共施用，或者以任意顺序连续施用(但通常在一定时间段内)，从而使所有活性剂能够同时发挥其生物活性。
应该意识到，RSPO-结合剂与至少一种另外的治疗剂的组合可以以任意顺序或同时施用。在一些实施方式中，所述RSPO-结合剂可以对之前已经施用第二治疗剂进行治疗的患者施用。在一些其他实施方式中，所述RSPO-结合剂和第二治疗剂可以基本上同时或同时施用。例如，可以对受试对象给药RSPO-结合剂(例如，抗体)，并同时用第二治疗剂(例如化疗剂)进行治疗过程。在一些实施方式中，RSPO-结合剂在用第二治疗剂治疗1年内施用。在一些替代实施方式中，RSPO-结合剂在用第二治疗剂进行任何治疗10、8、6、4或2个月内施用。在一些其他实施方式中，RSPO-结合剂在用第二治疗剂进行任何治疗4、3、2或1周内施用。在一些其他实施方式中，RSPO-结合剂在用第二治疗剂进行任何治疗5、4、3、2或1天内施用。应该进一步意识到，两种(或更多种)试剂或治疗可以在大约数小时或数分钟内(即基本上同时)施用。
为了治疗疾病，本发明的RSPO-结合剂(例如，抗体)的合适剂量取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重性和历程、疾病的响应性，所述RSPO-结合剂抗体是用于治疗性目的施用还是预防性目的施用、之前的治疗和患者的临床史等等，所有这些都由治疗医师裁量。所述RSPO-结合剂或抗体可以一次施用或在持续从数天至数月的一系列治疗中施用，或直到达到治愈或实现疾病状态的缩减(例如肿瘤尺寸的减小)。最佳给药方案可以从患者体内的药物累积的测量结果计算，并且会根据个体抗体或试剂的相对效力而不同。给药医师可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复速率。在一些实施方式中，剂量为0.01μg/kg体重～100mg/kg体重、0.1μg/kg体重～100mg/kg体重、1μg/kg体重～100mg/kg体重、1mg/kg体重～100mg/kg体重、1mg/kg体重～80mg/kg体重、10mg/kg体重～100mg/kg体重、10mg/kg体重～75mg/kg体重或10mg/kg体重～50mg/kg体重。在一些实施方式中，抗体或其他RSPO-结合剂的剂量为约0.1mg/kg体重～约20mg/kg体重。在一些实施方式中，可以每天、每周、每月或每年一次或多次给予剂量。在一些实施方式中，每周一次、每两周一次或每三周一次给予所述抗体或其他RSPO-结合剂。
在一些实施方式中，RSPO-结合剂(例如，抗体)可以以起始较高的“加载”剂量施用，然后施用一次或多次较低的剂量。在一些实施方式中，也可以改变施用频率。在一些实施方式中，给药方案可以包括施用起始剂量，然后每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用另外的剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可以包括施用起始加载剂量，然后每周施用为起始剂量一半的维持剂量。或者给药方案可以包括施用起始加载剂量，然后每隔一周施用为起始剂量一半的维持剂量。或者给药方案可以包括3周施用3次起始剂量，然后每隔一周施用例如为相同量的维持剂量。
本领域技术人员还已知，施用任何治疗剂都可以产生副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性如此严重以致于妨碍以治疗有效量施用特定的试剂。在一些情况下，药物治疗必须中断，并且可以尝试其他试剂。但是，相同治疗类别中的许多试剂通常展示相似的副作用和/或毒性，这意味着患者要么必须停止疗法，要么如果可能的话，就要遭受与所述治疗剂相关的令人不愉快的副作用。
因此，本发明提供治疗受试对象中的癌的方法，所述方法使用间歇性给药策略来施用一种或多种试剂，这可以减少与施用RSPO-结合剂、化学治疗剂等相关的副作用和/或毒性。在一些实施方式中，治疗人受试对象中的癌的方法包括与治疗有效量的化学治疗剂组合对所述受试对象施用治疗有效量的RSPO-结合剂，其中所述试剂中的一种或两种根据间歇性给药策略施用。在一些实施方式中，所述间歇性给药策略包括对受试对象施用起始剂量的RSPO-结合剂，并约每2周1次施用RSPO-结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，所述间歇性给药策略包括对受试对象施用起始剂量的RSPO-结合剂，并约每3周1次施用RSPO-结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，所述间歇性给药策略包括对受试对象施用起始剂量的RSPO-结合剂，并约每4周1次施用RSPO-结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，使用间歇性给药策略施用所述RSPO-结合剂，并且每周施用所述化学治疗剂。
V.包含RSPO-结合剂的试剂盒
本发明提供包含本文描述的包含RSPO-结合剂(例如，抗体)的试剂盒，所述试剂盒可用于执行本文描述的方法。在一些实施方式中，试剂盒包含在一个或多个容器中的针对至少一种人RSPO蛋白的至少一种经纯化抗体。在一些实施方式中，所述试剂盒含有对于执行检查检验所必需和/或充分的所有组件，包括实施检验用的所有控制部件、导引部件，以及用于分析和显示结果的任何必需软件。本领域技术人员会容易地意识到，能够容易地将本发明所公开的RSPO-结合剂引入本领域公知的已建立试剂盒格式之一。
还提供的是包含RSPO-结合剂(例如，抗-RSPO抗体)以及至少一种另外的治疗剂的试剂盒。在一些实施方式中，所述第二(或更多的)治疗剂是化学治疗剂。一些实施方式中，所述第二(或更多的)治疗剂是Wnt途径抑制剂。在一些实施方式中，所述第二(或更多的)治疗剂是血管生成抑制剂。
本发明的实施方式能够通过参考以下非限制性实例进一步定义，所述非限制性实例详细地描述了本发明的一些抗体的制备以及使用本发明的抗体的方法。对本领域技术人员显而易见的是，无需背离本发明的范围即可对材料和方法进行许多改进。
实施例
实施例1
人肿瘤中RSPO和LGR的表达
通过微阵列分析(GenelogicBioExpressDatasuite)分析来自肿瘤组织、大量人患者的良性肿瘤和恶性肿瘤样品。该数据公开了在数种肿瘤类型(包括肾、子宫内膜和卵巢)中相对于正常组织在恶性组织中RSPO1的表达水平升高。注意到RSPO1在卵巢癌中频繁过表达(图1A)。此外，该数据表明，在数种肿瘤类型(包括卵巢、胰腺和肺)中相对于正常组织在恶性组织中RSPO3的表达水平升高。此外，据发现相对于正常组织在恶性胸腺瘤、结肠瘤、肺瘤和卵巢瘤织中LGR5和LGR6过表达，而LGR4在肺瘤中过表达。相对于其他乳腺瘤亚型，LGR5和LGR6过表达似乎局限于三重阴性(ERnegPRnegHER2neg)乳腺瘤。
从在小鼠异种移植物中生长的一系列人肿瘤中分离RNA。使用已建立的Affymetrix策略制备RNA样品并对其进行处理，以产生经标记cRNA。按照制造商的技术手册将经处理的RNA杂交至Affymetrix HG-U133plus2.0微阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)。杂交后，对微阵列进行洗涤、扫描和分析。使用GCRMA算法(Bioconductor,www.bioconductor.org)进行经扫描阵列的背景调整和信号强度标准化。
对特定的人RSPO和人LGRs进行评价：RSPO1(241450_at)、RSPO2(1554012_at)、RSPO3(228186_s_at)、RSPO4(237423_at)、LGR4(218326_s_at)、LGR5(210393_at)和LGR6(227819_at)。微阵列分析显示，LGR4和LGR6在几乎所有肿瘤中广泛表达，发现许多肿瘤仅极大地过表达特定的RSPO家族成员和LGR5(表2)，但没有将这些表达水平与正常组织中的表达水平比较。通常而言，只有一个RSPO家族成员在给定肿瘤中高度表达，表明在RSPO家族内可能存在功能冗余。
表2
实施例2
RSPO蛋白与LGR5的结合
使用标准重组DNA技术通过将人LGR5的22～564位氨基酸连接至N末端FLAG标记和连接至CD4的跨膜结构域和C末端GFP蛋白生成细胞表面LGR5蛋白(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)。使用标准重组DNA技术生成RSPO-Fc构建体。具体而言，将全长人RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4框内连接至人Fc区，使用杆状病毒在昆虫细胞中表达重组RSPO-Fc蛋白。使用蛋白A色谱从昆虫培养基中纯化融合蛋白。
用FLAG-LGR5-CD4TM-GFP构建体瞬时转染HEK-293细胞。48小时后，将转染细胞悬浮在含有2%FBS和肝素的冰冷PBS中，在10μg/ml RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc、RSPO4-Fc或FZD8-Fc融合蛋白的存在下在冰上温育15分钟。进行使用100μl缀合有PE的抗-人Fc第二抗体的第二温育，以检测由Fc融合蛋白结合的细胞。将细胞与作为阳性对照的抗-FLAG抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和与作为阴性对照的抗-PE抗体一起温育。在FACSCalibur仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
如图2所示，RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4都与在HEK-293细胞表面上表达的LGR5结合，而阴性对照FZD8不结合LGR5。
通过表面等离子共振对RSPO蛋白和LGR5之间的结合亲和性进行分析。使用标准重组DNA技术生成可溶性LGR5-Fc构建体。具体而言，将人LGR5的1～564位氨基酸框内连接至人Fc，并且使用杆状病毒在昆虫细胞中表达重组LGR5-Fc融合蛋白。使用蛋白A色谱从昆虫培养基中纯化LGR5-Fc融合蛋白。LGR5信号序列的切割产生含有LGR5的22～564位氨基酸的成熟LGR5-Fc融合蛋白。使用标准胺类化学(NHS/EDC)在CM5芯片上固定重组RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc和RSPO4-Fc融合蛋白。将可溶性LGR5-Fc的双倍稀释液注射在芯片表面上(100nM～0.78nM)。使用来自Biacore Life Sciences(GE Healthcare)的Biacore2000系统收集随时间推移的动力学数据，使用同时全拟合方程(simultaneous global fit equation)对数据进行拟合，以产生各RSPO蛋白的亲合常数(KD值)(表3)。
表3
LGR5(nM)
RSPO1 110
RSPO2 14
RSPO3 <1.0
RSPO4 73
人RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4都与LGR5结合，证明RSPO蛋白可以是LGR蛋白的配体。
实施例3
抑制β-连环素信号传导的体外测试
为了制备细胞悬浮液，将在NOD/SCID小鼠中增殖的新鲜人肺腺癌异种移植物肿瘤(表2中的肺瘤#1)切碎，并且在含有300U/ml的3型胶原酶(Worthington,Lakewood,NJ)和200U/ml DNA酶I(Worthington,Lakewood,NJ)的培养基199(Invitrogen,Carlsbad,CA)中于37℃消化1～2小时。通过40μm尼龙滤器(BD Falcon,Franklin Lakes,NJ)对肺瘤细胞进行过滤，并在82×g旋转5分钟。将红细胞在ACK缓冲液(0.8%氯化铵、0.1mM EDTA、10mM碳酸氢钠、0.1N HCl)中裂解、洗涤，并在由HBSS(Mediatech,Manassas,VA)、25mM HEPES缓冲液(Mediatech,Manassas,VA)和2%热失活胎牛血清(HI-FBS;Invitrogen,Carlsbad,CA)组成的培养基中以150×g离心5分钟。通过在HI-FBS的垫子上以82×g离心8分钟而除去死细胞和碎片。在用SM中的5μg/ml生物素缀合的抗-H-2Kd和2.5μg/ml抗小鼠CD45单克隆抗体(BioLegend,San Diego,CA)染色后，每106细胞/ml使用50μl MagnaBind链亲和素珠(Thermo Scientific,Waltham,MA)使小鼠间质细胞耗尽。
为了制造条件培养基，在补充有B27补充剂(Invitrogen,Carlsbad,CA),胰岛素-转铁因子-硒(Invitrogen,Carlsbad,CA)、青霉素-链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、0.5μg/ml氢化可的松(Stemcell Technologies,Vancouver,加拿大)、20ng/ml EGF(MBLInternational,Woburn,MA)、20ng/ml碱性FGF(MBL International,Woburn,MA)和5U/ml肝素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的DMEM:F12(3:1)培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养肺瘤细胞。24小时后，收获所述条件培养基(本文称为“LT”)。
用6xTCF-荧光素酶报告基因载体稳定转染STF-293细胞。在经纯化可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、Jag-Fc融合蛋白(10μg/ml)、抗-FZD单克隆抗体(40μg/ml)或抗体LZ1(40μg/ml)的存在下，将1体积的肺瘤细胞条件培养基(LT)或对照培养基添加至STF-293细胞。此外，使用Wnt3a L细胞条件培养基作为阳性对照，并且与肺瘤细胞条件培养基(LT)以1:4的最终稀释度组合测试。使细胞温育16小时，使用Luciferase Assay System根据制造商说明(Promega,Madison,WI)测定荧光素酶活性。
将经纯化可溶性LGR5-Fc和FZD8-Fc融合蛋白的效应与对照Jag1-Fc蛋白比较，将抗-FZD单克隆抗体的效应与对照抗细菌溶菌酶抗体LZ1比较。如图3所示(左侧)，肺瘤细胞条件培养基(LT)含有增强Wnt3a-诱导的β-连环素活性的活性。在LT培养基中增强β-连环素活性的蛋白受到与RSPO蛋白结合的可溶性LGR5-Fc的抑制。该活性还被FZD8-Fc和抗-FZD抗体(为阻断Wnt信号传导的试剂)抑制。可溶性Jag-Fc和LZ1不抑制所述活性。甚至在不存在Wnt3a时(图3右侧)，所述LT培养基诱导β-连环素信号传导。可溶性Jag-Fc和LZ1不抑制该活性。与之相反，可溶性LGR5-Fc抑制由LT培养基诱导的β-连环素信号传导，将响应减少至几乎对照水平。该数据表明肺瘤细胞产生具有RSPO-样活性的蛋白(或多种蛋白)，该活性被LGR5抑制，并且该活性区别于Wnt3a活性。
使用利用肺瘤细胞条件培养基和卵巢瘤细胞条件培养基的共培养检验进行类似的实验。如上所述，将不含间质细胞的新处理肿瘤细胞培养过夜。将培养基和细胞转移至使用或不使用Wnt3a L细胞条件培养基的STF-293细胞。添加LGR5-Fc融合蛋白、FZD8-Fc融合蛋白或对照Fc融合蛋白(10μg/ml)。使所述细胞温育20小时，并如上所述测定荧光素酶活性。
如图13所示，β-连环素信号传导活性通过肿瘤细胞和上清液诱导，并与Wnt3a L细胞条件培养基组合而得到进一步增强(图13A，肺瘤LU2；图13B，肺瘤LU25；图13C，卵巢瘤OV38)。FZD8-Fc(Wnt途径抑制剂)将Wnt3a-诱导的β-连环素活性几乎减少至背景水平，而LGR5-Fc强烈地减少了肿瘤衍生的β-连环素活性。如上所述，该数据表明肺瘤和卵巢瘤细胞产生具有RSPO-样活性的蛋白(或多种蛋白)，该活性被LGR5抑制，并且该活性区别于Wnt3a活性。
实施例4
通过可溶性LGR5抑制RSPO活性的体外测试
如实施例3中所述制备来自人肺瘤#1细胞的条件培养基，如实施例2中所述制可溶性LGR5-Fc和RSPO2-Fc。
用6xTCF-荧光素酶报告基因载体(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)转染HEK-293细胞。24至48小时后，将所转染的细胞与含有肺瘤细胞条件培养基与25%Wnt3a-L-细胞条件培养基的培养基或含有RSPO2(10ng/ml)与25%Wnt3a-L细胞条件培养基的培养基一起温育。将可溶性LGR5以20μg/ml～0.02μg/ml的4倍连续稀释液添加至所述细胞。使用20μg/ml的可溶性Jag-Fc蛋白作为阴性对照，使用20μg/ml的FZD8-Fc蛋白作为阳性对照。使细胞温育16小时，使用LuciferaseAssay System根据制造商说明(Promega,Madison,WI)测定荧光素酶活性。
如图4所示，渐增浓度的可溶性LGR5-Fc减少了RSPO2-Fc与Wnt3a-条件培养基的组合(-□-)对荧光素酶活性的诱导，以及肺瘤细胞条件培养基和Wnt3a-条件培养基的组合(-■-)对荧光素酶活性的诱导。阴性对照Jag-Fc蛋白不封闭所述荧光素酶活性，而会封闭Wnt3a的FZD8-Fc封闭了所述荧光素酶活性。重要的是，LGR5展示了与RSPO2蛋白和肺瘤细胞条件培养基相同的抑制EC50。该数据证明了由肺瘤细胞产生的具有RSPO-样活性的蛋白被LGR5抑制，该行为与经纯化RSPO蛋白非常相似，并且表明肺瘤细胞条件培养基中的该活性可归因于RSPO蛋白。
实施例5
抗-RSPO1单克隆抗体的生成
针对重组人RSPO1蛋白31～263位氨基酸生成抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)。使用标准技术用RSPO1蛋白对小鼠(n=3)进行免疫。在开始免疫后70天使用FACS分析就RSPO1筛选来自个体小鼠的血清。在分离脾细胞以用于产生杂交瘤后选择具有最高抗体滴度的动物用于最后的抗原加强(antigen boost)。使用SP2/0细胞作为小鼠脾细胞的融合伴侣。以1细胞/孔将杂交瘤细胞在96孔板上铺平板，并且针对人RSPO1通过FACS分析筛选上清液。
为了FACS筛选抗-RSPO1抗体，构建能够使人RSPO1的N末端弗林蛋白酶样结构域在细胞表面表达的嵌合融合蛋白。如图5A所示，该融合蛋白含有N末端FLAG标记和C末端绿色荧光蛋白标记，所述N末端FLAG标记在RSPO1的两个弗林蛋白酶(furin)样结构域(氨基酸34～135)之后，并且融合至人CD4的跨膜细胞内结构域(FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP)。
将HEK-293细胞用FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP转染。48小时后，将所转染细胞悬浮在含有2%FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在50μl杂交瘤上清液的存在下在冰上温育30分钟。进行使用100μl缀合有PE的抗-人Fc第二抗体的第二温育，以检测由抗体结合的细胞。将细胞与作为阳性对照的抗-FLAG抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作为阴性对照的抗-PE抗体一起温育。在FACSCalibur仪器(BDBiosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
鉴定结合RSPO1的数个杂交瘤，包括89M2、89M4、89M5、89M7、89M19和89M25(图5B)。对来自数个这些抗体的重链可变区和轻链可变区进行测序。分析后，发现抗体89M2、89M4、89M5和89M25包含相同的重链可变区和轻链可变区。将表达抗体89M5的杂交瘤细胞系于2011年8月30日在布达佩斯条约的条件下保藏在ATCC(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)，并给予ATCC指定保藏号PTA-11970。89M5的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:10和SEQID NO:11。89M5的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:19和SEQID NO:20。89M5的重链CDR和轻链CDR列于本文表1中。89M5的重链和轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；89M5的重链和轻链的核苷酸序列是SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
实施例6
抑制RSPO1诱导β-连环素信号传导的抗-RSPO1单克隆抗体的鉴定
用6xTCF-荧光素酶报告基因载体(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)转染HEK-293细胞。24至48小时后，将所转染的HEK-293细胞与Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO1(10ng/ml,R&D BioSystems)的组合在抗-RSPO1抗体89M2、89M4、89M5、89M7、89M19和89M25的存在下一起温育，或者与无关对照抗体254M14和254M26(10μg/ml～0.625μg/ml的2倍稀释液)一起温育。使细胞温育16小时，使用Luciferase Assay System根据制造商说明(Promega,Madison,WI)测定荧光素酶活性。
如图6所示，抗-RSPO1抗体89M2、89M4、89M5和89M25每个都阻断信号传导，而抗-RSPO1抗体89M7和89M19不阻断信号传导。如通过对重链可变区和轻链可变区进行测序所确定的，抗体89M2、89M4、89M5和89M25都包含相同的重链可变区和轻链可变区，因此推断包含相同的抗原结合位点。这些结果证明抗-RSPO1抗体能够阻断RSPO1-诱导的β-连环素信号传导。
实施例7
抗-RSPO1抗体阻断可溶性RSPO1与LGR5的结合
用FLAG-LGR5-CD4TM-GFP构建体瞬时转染HEK-293细胞(之前在实施例2中描述)。48小时后，将所转染细胞悬浮在含有2%FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在RSPO1-Fc蛋白(10μg/ml)和抗体89M2、89M4、89M5、89M7、89M19或89M25(10μg/ml)的存在下在冰上温育。进行使用100μl缀合有PE的抗人Fc第二抗体的第二温育，以检测由RSPO1-Fc融合蛋白结合的细胞。在FACSCalibur仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
如图7所示，抗-RSPO1抗体89M2、89M4、89M5和89M25每个都阻断RSPO1与LGR5的结合，而抗-RSPO1抗体89M7和89M19不阻断RSPO1与LGR5的结合。这些结果与实施例6中所示的结果相关，其证明了在测定β-连环素活性的诱导的检验中在6xTCF荧光素酶报告基因检验中抗体89M2、89M4、89M5和89M25阻断RSPO1信号传导的能力，而抗体89M7和89M19不能阻断RSPO1信号传导。如上所述，抗体89M2、89M4、89M5和89M25都包含相同的重链可变区和轻链可变区，并且据推测包含相同的抗原结合位点，因此预期这些抗体都以类似(或相同)的方式起作用。
实施例8
抗-RSPO1抗体的结合亲和性
使用来自BiacoreLifeSciences(GE Healthcare)的Biacore2000系统确定抗体89M2、89M4、89M5和89M25的KD。使用标准胺类化学(NHS/EDC)将重组人RSPO1-Fc或小鼠RSPO1-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005%v/v表面活性剂P20)中将所述抗体在100nM～0.78nM范围内进行连续2倍稀释，并注射在芯片表面上。随时间收集动力学数据，并使用全拟合方程进行拟合，以产生各抗体的亲合常数(KD值)。
表4
人RSPO1(nM) 小鼠RSPO1(nM)
89M4 <0.1 <0.1
89M5 <0.1 <0.1
89M7 <0.1 <0.1
89M25 <0.1 <0.1
如表4所示，抗体89M4、89M5、89M7和89M25对人RSPO1的亲合常数(KD)都小于0.1nM。这些抗体对小鼠RSPO1的KD也小于0.1nM。
实施例9
抗-RSPO1抗体抑制卵巢瘤的体内生长
在6至8周龄的NOD/SCID小鼠的乳房脂肪垫中注射解离的OV19卵巢瘤细胞(1×105细胞)。使肿瘤生长45天，直到他们达到134mm3的平均尺寸。将小鼠随机化(n=10每组)，并用以下进行治疗：抗-RSPO1抗体89M5；89M25；紫杉醇；89M5和紫杉醇的组合；89M25和紫杉醇的组合；或对照抗体1B7.11。每周一次以15mg/kg给药抗体，并且每周一次以7.5mg/ml给药紫杉醇。通过注入腹腔进行所述抗体和紫杉醇的施用。监视肿瘤生长，并且用电子卡尺在指定时间点测定肿瘤体积。数据表达为平均值±S.E.M。
在第35天，与用对照抗体进行的治疗相比，用抗体89M5进行的治疗导致使肿瘤生长减少40%，89M25使肿瘤生长减少25%(图8，分别为p=0.37和p=0.19)。89M5或89M25与紫杉醇组合治疗导致的肿瘤生长减少大于用任一单独试剂进行的治疗。用89M5和紫杉醇进行治疗导致生长减少48%(p=0.12，相对于对照组)，用89M25和紫杉醇进行治疗导致生长减少43%(p=0.16，相对于对照组)。因此，抗体89M5和89M25证明了作为单独试剂具有在OV19卵巢瘤模型中的抗肿瘤生长活性，还展示了与紫杉醇组合的抗肿瘤生长活性。
对来自在该实验中使用的小鼠(对照小鼠和经治疗小鼠)的肿瘤进行的随后分析揭示，所述肿瘤是人卵巢瘤细胞(OV19)和鼠类T细胞淋巴瘤细胞的混合物。
实施例10
抗-RSPO1单克隆抗体89M5的表位作图
为了进一步表征抗体89M5结合的RSPO1的特定区，进行表位作图实验。使用标准重组DNA技术产生包含人RSPO1的不同区的一系列构建体(参见图9A)。构建体是各自含有N末端FLAG标记的融合蛋白，所述N末端FLAG标记在RSPO1蛋白的一部分之后，并且融合至人CD4的跨膜细胞内结构域。在一些版本中，所述融合蛋白还包含C末端绿色荧光蛋白标记。
用各构建体转染HEK-293细胞。48小时后，将所转染细胞悬浮在含有2%FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在抗-RSPO1抗体89M5的存在下在冰上温育30分钟。进行使用100μl缀合有PE的抗-人Fc第二抗体的第二温育，以检测由抗体结合的细胞。将细胞与作为阳性对照的抗-FLAG抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作为阴性对照的抗-PE抗体一起温育。在FACSCalibur仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
如图9B中所示，FACS分析表明，RSPO1的弗林蛋白酶2结构域内的氨基酸参与抗-RSPO1抗体89M5的结合位点(实施例10、图9)。这些初步结果不排除以下事实：即其他RSPO1结构域中的氨基酸可能不参与所述结合位点。
实施例11
抗-RSPO2单克隆抗体的生成
针对重组人RSPO2蛋白22-205位氨基酸生成抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)。使用标准技术用RSPO2蛋白对小鼠(n=3)进行免疫。在开始免疫后70天使用FACS分析就RSPO2筛选来自个体小鼠的血清。在分离脾细胞以用于产生杂交瘤后选择具有最高抗体滴度的动物用于最后的抗原加强。使用SP2/0细胞作为小鼠脾细胞的融合伴侣。以1细胞/孔将杂交瘤细胞在96孔板上铺平板，并且就人RSPO2通过FACS分析筛选上清液。
如实施例5中所示，为了FACS筛选抗-RSPO2抗体，构建能够细胞表面表达人RSPO2的N末端弗林蛋白酶样结构域的嵌合融合蛋白。与图5A中关于RSPO1所描述的相类似，RSPO2融合蛋白含有N末端FLAG标记和C末端绿色荧光蛋白标记，所述N末端FLAG标记在RSPO2的两个弗林蛋白酶(furin)样结构域(氨基酸31～146)之后，并且融合至人CD4的跨膜细胞内结构域(FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP)。
将HEK-293细胞用FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP转染。48小时后，将所转染细胞悬浮在含有2%FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在50μl杂交瘤上清液的存在下在冰上温育30分钟。进行使用100μl缀合有PE的抗-人Fc第二抗体的第二温育，以检测由抗体结合的细胞。将细胞与作为阳性对照的抗-FLAG抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作为阴性对照的抗-PE抗体一起温育。在FACSCalibur仪器(BDBiosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
鉴定出结合RSPO2的数个杂交瘤，包括130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28(图10)。对来自数个这些抗体的重链可变区和轻链可变区进行测序。将表达抗体130M23的杂交瘤细胞系于2011年8月10日在布达佩斯条约的条件下保藏在ATCC(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)，并赋予ATCC指定保藏号PTA-12021。130M23的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列是SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28。130M23的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列是SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36。130M23的重链CDR和轻链CDR列于本文表1中。130M23的重链和轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；130M23的重链和轻链的核苷酸序列是SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
实施例12
抑制RSPO2诱导β-连环素信号传导的抗-RSPO2单克隆抗体的鉴定
用6xTCF-荧光素酶报告基因载体(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)转染HEK-293细胞。24至48小时后，在抗-RSPO2抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28的存在下将所转染HEK-293细胞与Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO2(10ng/ml,R&D BioSystems)或人RSPO3(10ng/ml,R&D BioSystems)的组合一起温育。将细胞与Wnt3a和RSPO的组合、仅Wnt3a或不添加作为对照一起温育。使细胞温育16小时，使用Luciferase Assay System根据制造商说明(Promega,Madison,WI)测定荧光素酶活性。
如图11所示，抗-RSPO2抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28各自都减少RSPO2-诱导的β-连环素信号传导，抗-RSPO2抗体130M23、130M24完全阻断RSPO2-诱导的β-连环素信号传导。与之相反，这些抗体不阻断RSPO3诱导的β-连环素信号传导。这些结果证明了抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28是RSPO2的特异性抑制剂，能够减少和/或完全阻断RSPO2-诱导的β-连环素信号传导。
实施例13
抗-RSPO2抗体阻断可溶性RSPO2与LGR5的结合
用FLAG-LGR5-CD4TM-GFP构建体瞬时转染HEK-293细胞(之前在实施例2中描述)。48小时后，将所转染细胞悬浮在含有2%FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在RSPO2-Fc蛋白(10μg/ml)和抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28的存在下在冰上温育。进行使用100μl缀合有PE的抗-人Fc第二抗体的第二温育，以检测由RSPO2-Fc融合蛋白结合的细胞。在FACSCalibur仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
如图12所示，抗-RSPO2抗体130M23和130M24各自阻断RSPO2与LGR5的结合，而抗-RSPO2抗体130M25、130M26、130M27和130M28仅微弱阻断或不阻断RSPO2与LGR5的结合。这些结果与实施例11所示的结果相关，其证明了抗体130M23和130M24完全阻断RSPO2-诱导的β-连环素信号传导的能力，而抗体130M25、130M26、130M27和130M28是较弱的RSPO2-诱导的β-连环素信号传导的抑制剂。
实施例14
抗-RSPO3单克隆抗体的生成
针对重组人RSPO3蛋白22～272位氨基酸生成抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)。使用标准技术用RSPO3蛋白对小鼠(n=3)进行免疫。在开始免疫后70天使用FACS分析就RSPO3筛选来自个体小鼠的血清。在分离脾细胞以用于产生杂交瘤后选择具有最高抗体滴度的动物用于最后的抗原加强。使用SP2/0细胞作为小鼠脾细胞的融合伴侣。以1细胞/孔将杂交瘤细胞在96孔板上铺平板，并且就人RSPO3通过FACS分析筛选上清液。
如实施例5中所示，为了FACS筛选抗-RSPO3抗体，构建能够细胞表面表达人RSPO的N末端弗林蛋白酶样结构域的嵌合融合蛋白。与图5A中关于RSPO1所描述的相类似，RSPO3融合蛋白含有N末端FLAG标记和C末端绿色荧光蛋白标记，所述N末端FLAG标记在RSPO3的弗林蛋白酶(furin)样结构域(aa32-141)之后，并且融合至人CD4的跨膜细胞内结构域(FLAG-RSPO3furin-CD4TM-GFP)。
将HEK-293细胞用FLAG-RSPO3furin-CD4TM-GFP转染。48小时后，将所转染细胞悬浮在含有2%FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在50μl杂交瘤上清液的存在下在冰上温育30分钟。进行使用100μl缀合有PE的抗-人Fc第二抗体的第二温育，以检测由抗体结合的细胞。将细胞与作为阳性对照的抗-FLAG抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作为阴性对照的抗-PE抗体一起温育。在FACSCalibur仪器(BDBiosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
实施例15
抗-RSPO2抗体130M23的结合亲和性
使用来自BiacoreLifeSciences(GE Healthcare)的Biacore2000系统确定130M23的KD。使用标准胺类化学(NHS/EDC)将重组人RSPO2-Fc或小鼠RSPO2-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005%v/v表面活性剂P20)中将所述抗体在100nM～0.78nM范围内进行连续2倍稀释，并注射在芯片表面上。随时间收集动力学数据，并使用全拟合方程进行拟合，以产生各抗体的亲合常数(KD值)。
抗体130M23对人RSPO2的亲和常数(KD)为0.14nM，对小鼠RSPO2的KD为0.35nM。
实施例16
抗-RSPO2抗体抑制RSPO活性的体外测试
如实施例3中所述制备来自人肺瘤LU2细胞的条件培养基，如实施例2中所述制备可溶性LGR5-Fc。
使STF-293与LU2细胞和25%的肺瘤细胞条件培养基以及25%Wnt3a-L细胞条件培养基一起温育。将抗体130M23和可溶性LGR5-Fc以在50μg/ml～0.0006μg/ml范围内的5倍连续稀释液添加至所述细胞。使用经过类似稀释的无关单克隆抗体和对照Fc融合蛋白(50μg/ml)作为阴性对照。使细胞温育20小时，使用Luciferase Assay System根据制造商说明(Promega,Madison,WI)测定荧光素酶活性。
如图14所示，递增浓度的可溶性LGR5-Fc(-●-)减少了由肺瘤细胞条件培养基和Wnt3a条件培养基的组合对荧光素酶活性的诱导。递增浓度的抗-RSPO2抗体130M23(-■-)也减少了由肺瘤细胞条件培养基和Wnt3a条件培养基的组合对荧光素酶活性的诱导。130M23阻断了条件培养基诱导的活性，IC50为129nM，比LGR5-Fc的效力高100倍。对照Fc融合蛋白(-△-)，以及无关抗体(-□-)不阻断荧光素酶活性。
实施例17
抗-RSPO抗体抑制胰腺瘤的体内生长
将解离的PN31胰腺瘤细胞(1×105细胞)皮下注入6至8周龄的NOD/SCID小鼠的侧腹中。使肿瘤生长61天，直到他们达到120mm3的平均尺寸。将小鼠随机化(n=10每组)，并用以下进行治疗：抗-RSPO1抗体89M5；抗-RSPO2抗体130M23；吉西他滨；89M5和吉西他滨的组合；130M23和吉西他滨的组合；或对照抗体1B7.11。每周一次以15mg/kg给药抗体，并且每周一次以30mg/ml给药吉西他滨。通过注入腹腔进行所述抗体和吉西他滨的施用。监视肿瘤生长，并且用电子卡尺在特定时间点测定肿瘤体积。数据表达为平均值±S.E.M。
如图15所示，用抗-RSPO1抗体89M5或抗-RSPO2抗体130M23作为单独试剂进行治疗对肿瘤生长仅具有最小效果。与对照相比，用单独吉西他滨进行治疗将肿瘤生长减少49%(p=0.09)。但是，89M5或130M23与吉西他滨组合治疗导致的肿瘤生长减少大于用任一单独试剂进行的治疗。用89M5和吉西他滨进行的治疗导致生长减少59%(p=0.015，与对照组相比)，用130M23和吉西他滨进行的治疗导致生长减少58%(p=0.016，与对照组相比)。因此，抗-RSPO1抗体89M5和抗-RSPO2抗体130M23与的吉西他滨组合显示出在胰腺异种移植物模型中的强效抗肿瘤生长活性。
实施例18
抗-RSPO抗体与Wnt途径抑制剂组合抑制胰腺瘤的体内生长
将解离的PN7胰腺瘤细胞(1×105细胞)皮下注入6至8周龄的NOD/SCID小鼠的侧腹中。使肿瘤生长25天，直到他们达到130mm3的平均尺寸。将小鼠随机化(n=10每组)，并且用以下治疗小鼠：抗-RSPO2抗体130M23；抗-FZD抗体18R5；吉西他滨；130M23和吉西他滨的组合；18R5和吉西他滨的组合；130M23和18R5的组合；130M23、18R5和吉西他滨的组合；或对照抗体1B7.11。每周一次以10mg/kg给药抗-RSPO2抗体130M23，每周一次以20mg/ml给药抗-FZD抗体18R5，并且每周一次以30mg/ml给药吉西他滨。通过注入腹腔进行所述抗体和吉西他滨的施用。监视肿瘤生长，并且用电子卡尺在特定时间点测定肿瘤体积。数据表达为平均值±S.E.M。平行实验组包括用FZD8-Fc可溶性受体(10mg/kg)与吉西他滨组合治疗和用FZD8-Fc与130M23和吉西他滨组合治疗。
用抗体130M23或抗体18R5作为单独试剂进行治疗导致与用对照抗体进行治疗相比，肿瘤生长减少约55%(图16A,p<0.001)。130M23或18R5与吉西他滨组合治疗导致的肿瘤生长减少大于用任一单独试剂进行的治疗。用130M23和吉西他滨进行治疗导致生长减少68%(p<0.001，相对于对照组)，用18R5和吉西他滨进行治疗导致生长减少75%(p<0.001，相对于对照组)。此外，130M23、吉西他滨和18R5的组合导致几乎完全抑制PN7肿瘤的生长(图16A)。用130M23、吉西他滨和FZD8-Fc可溶性受体也看到类似的结果。因此，诸如130M23等抗-RSPO2抗体在抑制胰腺瘤生长方面具有单试剂活性。此外，抗-RSPO2抗体与吉西他滨的组合、或者抗-RSPO2抗体与吉西他滨以及Wnt途径抑制剂（诸如抗-FZD抗体18R5或FZD8-Fc可溶性受体）的组合，据显示对于抑制胰腺瘤模型中的肿瘤生长而言是非常有效的治疗剂。
IHC研究显示，与未治疗小鼠相比，抗-RSPO2抗体130M23在受治疗小鼠的PN7肿瘤中诱导了形态学改变。使用抗-Ki67抗体，这些细胞还展示了增殖方面的显著下降。这些结果可能反映了肿瘤细胞的损失和间质的增加。
对上述PN7肿瘤进行处理以产生单细胞悬浮液。使用生物素化抗-H2Kd和抗-CD45抗体和缀合有链亲和素的磁珠从细胞混合物除去小鼠细胞。将残留的人肿瘤细胞连续移植至新小鼠组中。将来自各治疗组的90个肿瘤细胞注入NOD-SCID小鼠(n=10只小鼠/组)的侧腹中。使肿瘤生长40天，不进行治疗，并且使用电子卡尺测定肿瘤体积。
图16C显示来自各组中个体小鼠的肿瘤体积。与分离自用对照抗体治疗的小鼠的细胞相比，分离自用作为单试剂的抗-RSPO2抗体130M23或抗-FZD抗体18R5或二者组合治疗的小鼠的细胞的致瘤性极大降低。该致瘤性的减少大于用单独吉西他滨观察到的致瘤性的减少。与分离自用对照抗体治疗的小鼠的细胞相比，分离自用吉西他滨和130M23的组合、吉西他滨和18R5的组合或者吉西他滨和FZD8-Fc的组合治疗的小鼠的细胞显示了仅轻微减少的致瘤性。令人感兴趣的是，分离自用130M23、18R5和吉西他滨的组合或者130M23、FZD8-Fc和吉西他滨的组合证明了肿瘤生长的惊人显著的缺乏，其高于任意单独的试剂或两种试剂的组合。这些结果显示，除了标准化学疗法之外抑制多种途径在减少致瘤性和癌干细胞方面具有加合效应并且可能具有协调效应。
实施例19
RSPO抗体的人源化
生成针对人RSPO1和RSPO2的人源化抗体。基本上如Larrick,J.M.,等,1989,Biochem.Biophys.Res.Comm.160:1250and Jones,S.T.&Bendig,M.M.,1991,Bio/Technology9:88所述使用简并PCR从杂交瘤系分离鼠类单克隆抗体89M5和130M23的重链可变区和轻链可变区，并对其测序。然后将可能与亲本89M5或130M23抗体氨基酸序列结构相似的人重链和轻链可变框架区看作参照人框架区，以帮助指导新型合成框架的设计。为了鉴定与鼠类框架具有相似性的人框架区，针对Genbank中保藏的人序列，利用BLAST搜索对由89M5和130M23的鼠类重链和轻链可变结构域编码的预测蛋白序列与由所表达的人cDNA编码的人抗体序列进行比较。对候选人源化框架重链和亲本鼠类多克隆抗体重链可变区和轻链可变区之间的氨基酸差异就可能的重要性进行评价，对关于位置方面的每个差异是否促成正确折叠和可变区的功能进行判断。通过检查其他抗体片段的已解析晶体结构而指导该分析(例如，如Trakhanov等，ActaCrystallogr D BiolCrystallogr,1999,55:122-28中描述的Fab2E8的结构以及其他蛋白晶体结构(例如，蛋白数据库结构1ADQ和1GIG))。使用计算机软件(包括Jmol、快速PDB和Pymol)对结构建模。考虑特定位置处的氨基酸对β折叠框架、重链可变区和轻链可变区之间的相互作用、氨基酸侧链的溶剂暴露程度以及氨基酸影响CDR环的定位的可能性的潜在影响。由该分析，设计出框内融合至人IgG2恒定区的候选重链可变区和框内融合至人IgKC1恒定区的候选轻链可变区并进行化学合成。候选重链和轻链包含：i)设计成与天然人框架相似的合成框架，和ii)亲本89M5或130M23鼠类抗体CDR。
通过共转染至哺乳动物细胞中来测试各候选变体人源化重链和轻链的功能性。将上述各候选变体人源化重链与鼠类轻链cDNA一起共转染至HEK-293细胞中，并通过FACS就RSPO结合活性检验条件培养基。人源化89M5重链变体“89M5-H2”(SEQID NO:68)展现了最强烈的结合，因而选用。将89M5-H2人源化重链与每种候选人源化轻链共转染至HEK-293细胞中，并再次通过FACS就抗原结合检验条件培养基。轻链变体“89M5-L2”(SEQ ID NO:69)展现了最强烈的结合，因而选用。类似地，130M23重链变体“130M23-H1”(SEQ ID NO:70)展现了最强烈的结合，因而选用。将130M23-H1人源化重链与每种候选人源化轻链共转染至HEK-293细胞中，并再次通过FACS就抗原结合检验条件培养基。轻链变体“130M23-L2”(SEQ ID NO:71)展现了最强烈的结合，因而选用。
为了增加抗体的产生，生成130M23-H1L2变体。该变体包含与130M23-H1L2相同的重链，但是具有修饰的轻链，将其称为h130M23-H1L6。
实施例20
人源化89M5和人源化130M23的结合亲和性
使用来自BiacoreLifeSciences(GE Healthcare)的Biacore2000系统确定h89M5-H2L2的KD。使用标准胺类化学(NHS/EDC)将重组人RSPO1-Fc或小鼠RSPO1-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005%v/v表面活性剂P20)中将所述抗体在100nM～0.78nM范围内进行连续2倍稀释，并注射在芯片表面上。随时间收集动力学数据，并使用全拟合方程进行拟合，以产生各抗体的亲合常数(KD值)
h89M5-H2L2对人RSPO1和小鼠RSPO1的亲和常数(KD)小于0.1nM。
使用来自BiacoreLifeSciences(GE Healthcare)的Biacore2000系统确定h130M23-H1L2和h130M23-H1L6的KD。使用标准胺类化学(NHS/EDC)将重组人RSPO2-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005%v/v表面活性剂P20)中将所述抗体在100nM～0.78nM范围内进行连续2倍稀释，并注射在芯片表面上。随时间收集动力学数据，并使用全拟合方程进行拟合，以产生各抗体的亲合常数(KD值)
h130M23-H1L2对人RSPO2的亲和常数(KD)为0.13nM，h130M23-H1L6对人RSPO2的亲和常数(KD)为0.15nM。
实施例21
抗-RSPO抗体的FACS结合
用编码FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP的表达载体瞬时转染HEK293细胞。如实施例5中所示，FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP是能够使人RSPO1的N末端弗林蛋白酶样结构域在细胞表面表达的嵌合融合蛋白。在抗-RSPO1抗体89M5或人源化抗-RSPO1抗体h89M5-H2L2的存在下，对经FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP转染的细胞进行温育。对每种抗体的5倍连续稀释液就其与表达RSPO1的细胞结合的能力进行检查。用缀合有藻红蛋白的抗-IgG对细胞染色，以显示结合抗体。在FACSCalibur仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
如图17A所示，这些研究表明，抗-RSPO1抗体89M5和人源化抗-RSPO1抗体h89M5-H2L2都与人RSPO1结合。
用编码FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP的表达载体瞬时转染HEK293细胞。如实施例11中所示，FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP是能够使人RSPO2的N末端弗林蛋白酶样结构域在细胞表面表达的嵌合融合蛋白。在抗-RSPO2抗体130M23或人源化抗-RSPO2抗体h130M5-H1L2的存在下，对FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP转染的细胞进行温育。对每种抗体的5倍连续稀释液就其与表达RSPO2的细胞结合的能力进行检查。用缀合有藻红蛋白的抗-IgG对细胞染色，以显示结合抗体。在FACSCalibur仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析所述细胞，使用FlowJo软件处理数据。
如图17B所示，这些研究表明，抗-RSPO2抗体130M23和人源化抗-RSPO2抗体h130M23-H1L2都与人RSPO2结合。
实施例22
抗-RSPO抗体与化学治疗剂组合抑制乳腺瘤的体内生长
将解离的OMP-B39乳腺瘤细胞(4×105细胞)皮下注入6至8周龄的NOD/SCID小鼠的侧腹中。OMP-039是三阴性乳腺癌肿瘤，具有高水平的RSPO2表达。此外，RSPO1的表达高于实施例1中表征的其他乳腺瘤(参见表2)。使肿瘤生长39天，直到他们达到120mm3的平均尺寸。将小鼠随机化(n=10每组)，并用以下进行治疗：抗-RSPO1抗体89M5和抗-RSPO2抗体130M23的组合；顺铂；抗-RSPO1和抗RSPO2抗体与顺铂的组合；或者对照抗体。每周一次以15mg/kg给药抗体，并且每周一次以1.5mg/ml给药顺铂。通过注入腹腔进行所述抗体和顺铂的施用。监视肿瘤生长，并且用电子卡尺在指定天数测定肿瘤体积。数据表达为平均值±S.E.M。
如图18所示，抗-RSPO1抗体89M5和抗-RSPO2抗体130M23与顺铂的组合比仅顺铂更好地抑制肿瘤生长(p=0.04，组合组与仅顺铂相比)。三者组合具有更显著的效应，但事实上抗体89M5和130M25的组合(不具有顺铂)对该肿瘤仅具有最小效应。
应该理解的是本文描述的实施例和实施方式仅出于说明性目的，会启示本领域技术人员考虑其各种改进或变化，并且其应包含在本申请的主旨和意图之内。
本文引用的任何出版物、专利、专利申请、网址和登录号/数据库序列(包括多核苷酸序列和多肽序列)都是以全文引用的方式并入，其引用程度等同于将每个单独的出版物、专利、专利申请、网址和登录号/数据库序列特定且个别地以全文引用的方式并入。
序列
具有信号序列的人RSPO1蛋白序列(SEQ ID NO:1)
MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA
具有信号序列的人RSPO2蛋白序列(SEQ ID NO:2)
MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ
具有信号序列的人RSPO3蛋白序列(SEQ ID NO:3)
MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH
具有信号序列的人RSPO4蛋白序列(SEQ ID NO:4)
MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP
不具有预测的信号序列的人RSPO1蛋白序列(SEQ ID NO:5)
SRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA
人RSPO1弗林蛋白酶样结构域1(SEQ ID NO:6)
AEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFD
人RSPO1弗林蛋白酶样结构域2(SEQ ID NO:7)
MNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSA
人RSPO1血小板反应蛋白结构域(SEQ ID NO:8)
QCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCP
人RSPO1的31～263位氨基酸(SEQ ID NO:9)
RISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA
89M5重链可变区(SEQ ID NO:10)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSA
89M5轻链可变区(SEQ ID NO:11)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK
89M5重链CDR1(SEQ ID NO:12)
TGYTMH
89M5重链CDR2(SEQ ID NO:13)
GINPNNGGTTYNQNFKG
89M5重链CDR3(SEQ ID NO:14)
KEFSDGYYFFAY
89M5轻链CDR1(SEQ ID NO:15)
KASQDVIFAVA
89M5轻链CDR2(SEQ ID NO:16)
WASTRHT
89M5轻链CDR3(SEQ ID NO:17)
QQHYSTPW
FLAG标记(SEQ ID NO:18)
DYKDDDDK
89M5重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:19)
GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGGATACACCATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGACCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGAGAAGTCCTCCACCACAGCCTACTTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCACTCTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGTTACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
89M5轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:20)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTTTTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGTATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
具有预测的下划线信号序列的89M5重链氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
具有预测的下划线信号序列的89M5轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
MGFKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
89M5重链核苷酸序列(SEQ ID NO:23)
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGGATACACCATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGACCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGAGAAGTCCTCCACCACAGCCTACTTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCACTCTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGTTACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGATAA
89M5轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:24)
ATGGGCTTCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTTTTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGTATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAGTGA
不具有预测的信号序列的89M5重链氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
不具有预测的信号序列的89M5轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
130M23重链可变区(SEQ ID NO:27)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKFSCAASGFSFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYFCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTSVTVSS
130M23轻链可变区(SEQ ID NO:28)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTNSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK
130M23重链CDR1(SEQ ID NO:29)
SSYAMS
130M23重链CDR2(SEQ ID NO:30)
SISSGGSTYYPDSVKG
130M23重链CDR3(SEQ ID NO:31)
RGGDPGVYNGDYEDAMDY
130M23轻链CDR1(SEQ ID NO:32)
KASQDVSSAVA
130M23轻链CDR2(SEQ ID NO:33)
WASTRHT
130M23轻链CDR3(SEQ ID NO:34)
QQHYSTP
130M23重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:35)
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGTACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTTCTGTGCACGAGGCGGGGATCCGGGGGTCTACAATGGTGACTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
130M23轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:36)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTCGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTTCTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAAACAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGTAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
具有预测的下划线信号序列的130M23重链氨基酸序列(SEQ ID NO:37)
MNFGLRLVFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVKPGGSLKFSCAASGFSFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYFCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
具有预测的下划线信号序列的130M23轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:38)
MGIKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTNSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
130M23重链核苷酸序列(SEQ ID NO:39)
ATGAACTTCGGGCTGAGATTGGTTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGTACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTTCTGTGCACGAGGCGGGGATCCGGGGGTCTACAATGGTGACTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA
130M23轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:40)
ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTCGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTTCTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAAACAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGTAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG
不具有预测的信号序列的130M23重链氨基酸序列(SEQ ID NO:41)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKFSCAASGFSFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYFCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
不具有预测的信号序列的130M23轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:42)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTNSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
不具有预测的信号序列的人RSPO2蛋白序列(SEQ ID NO:43)
QGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ
人RSPO2的22～205位氨基酸(SEQ ID NO:44)
QGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPG
人RSPO2弗林蛋白酶样结构域1(SEQ ID NO:45)
YVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYG
人RSPO2弗林蛋白酶样结构域2(SEQ ID NO:46)
MNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAP
人RSPO2血小板反应蛋白结构域(SEQ ID NO:47)
GCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCP
不具有预测的信号序列的人RSPO3蛋白序列(SEQ ID NO:48)
QNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH
人RSPO3弗林蛋白酶样结构域1(SEQ ID NO:49)
PNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYG
人RSPO3弗林蛋白酶样结构域2(SEQ ID NO:50)
INKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEA
人RSPO3血小板反应蛋白结构域(SEQ ID NO:51)
HCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQ
h89M5-H2L2重链核苷酸序列(SEQ ID NO:52)
ATGGACTGGACCTGGAGGATACTCTTTCTCGTGGCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGGTTTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACTGGATACACCATGCACTGGGTTAGACAGGCCCCCGGACAAAGGCTGGAGTGGATGGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCTGAAGACACAGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
具有预测的下划线信号序列的h89M5-H2L2重链氨基酸序列(SEQ ID NO:53)
MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
h89M5-H2L2重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:54)
CAGGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGGTTTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACTGGATACACCATGCACTGGGTTAGACAGGCCCCCGGACAAAGGCTGGAGTGGATGGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCTGAAGACACAGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCAGCTCA
h89M5-H2L2重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:55)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSS
h89M5-H2L2轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:56)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCACAGCTCCTGGGGCTCCTGCTCCTCTGGCTCCGGGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAACACCCTGACACTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA
具有预测的下划线信号序列的h89M5-H2L2轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:57)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h89M5-H2L2轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:58)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
h89M5-H2L2轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:59)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK
h130M23-H1L2重链核苷酸序列(SEQ ID NO:60)
ATGGAACTGGGACTCAGATGGGTTTTCCTCGTTGCTATTCTGGAAGGAGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGATCTCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCTCCTCTTATGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCATCCATTTCTAGTGGAGGTAGCACATATTATCCTGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTGGAGATCCTGGGGTCTACAATGGAGATTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGAACAACAGTCACAGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
具有预测的下划线信号序列的h130M23-H1L2重链氨基酸序列(SEQ ID NO:61)
MELGLRWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
h130M23-H1L2重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:62)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGATCTCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCTCCTCTTATGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCATCCATTTCTAGTGGAGGTAGCACATATTATCCTGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTGGAGATCCTGGGGTCTACAATGGAGATTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGAACAACAGTCACAGTCAGCTCA
h130M23-H1L2重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:63)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSS
h130M23-H1L2轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:64)
ATGAAATACCTCCTCCCTACAGCTGCCGCTGGACTCCTCCTCCTCGCTGCCCAGCCTGCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCGTGCAAGCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAAGAACTGTGGCTGCACCTTCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTCAAATCTGGAACTGCCTCCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCTAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTCAGCAACACCCTGACACTGTCTAAAGCTGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGAGCTCCCCCGTCACAAAATCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA
具有预测的下划线信号序列的h130M23-H1L2轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:65)
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h130M23-H1L2轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:66)
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCGTGCAAGCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
h130M23-H1L2轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:67)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIK
不具有预测的信号序列的h89M5-H2L2重链氨基酸序列(SEQ ID NO:68)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不具有预测的下划线信号序列的h89M5-H2L2轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:69)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
不具有预测的下划线信号序列的h130M23-H1L2重链氨基酸序列(SEQ ID NO:70)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不具有预测的下划线信号序列的h130M23-H1L2轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:71)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h130M23-H1L6轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:72)
ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCT GGTGTTGACGGAGACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAAGAACTGTGGCTGCACCTTCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTCAAATCTGGAACTGCCTCCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCTAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTCAGCAACACCCTGACACTGTCTAAAGCTGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGAGCTCCCCCGTCACAAAATCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA
具有预测的下划线信号序列的h130M23-H1L6轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:73)
MGIKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
不具有预测的下划线信号序列的h130M23-H1L6轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:74)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h130M23-H1L6轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:75)
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
h130M23-H1L6轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:76)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIK

Claims (173)

1.一种特异性结合人R-反应蛋白1(RSPO1)的分离的抗体，所述分离的抗体包含：
(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3；和/或
(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1，包含WASTRHT(SEQ IDNO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。
2.一种特异性结合人RSPO1的分离的抗体，所述分离的抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:11具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
3.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:10具有至少95%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:11具有至少95%序列同一性的轻链可变区。
4.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:10的重链可变区；和/或
(b)包含SEQ ID NO:11的轻链可变区。
5.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：
(a)基本上由SEQ ID NO:10组成的重链可变区；和
(b)基本上由SEQ ID NO:11组成的轻链可变区。
6.一种特异性结合人RSPO1的分离的抗体，所述分离的抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:55具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:59具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
7.如权利要求6所述的抗体，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:55具有至少95%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:59具有至少95%序列同一性的轻链可变区。
8.如权利要求6所述的抗体，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:55的重链可变区；和/或
(b)包含SEQ ID NO:59的轻链可变区。
9.如权利要求6所述的抗体，所述抗体包含：
(a)基本上由SEQ ID NO:55组成的重链可变区；和
(b)基本上由SEQ ID NO:59组成的轻链可变区。
10.一种分离的抗体，所述分离的抗体与权利要求1～9中任一项所述的抗体竞争与RSPO1的特异性结合。
11.一种分离的抗体，所述分离的抗体与权利要求1～10中任一项所述的抗体所结合的RSPO1上的表位相同。
12.一种分离的抗体，所述分离的抗体所结合的RSPO1上的表位与权利要求1～10中任一项所述的抗体所结合的RSPO1上的表位重叠。
13.如权利要求1～12中任一项所述的抗体，所述抗体是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
14.如权利要求1～13中任一项所述的抗体，所述抗体是人源化抗体。
15.如权利要求1～13中任一项所述的抗体，所述抗体是人抗体。
16.如权利要求1～14中任一项所述的抗体，所述抗体是IgG1抗体或IgG2抗体。
17.如权利要求1～14中任一项所述的抗体，所述抗体是包含抗原结合位点的抗体片段。
18.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由ATCC保藏号为PTA-11970的杂交瘤细胞系生产。
19.权利要求18所述的抗体的人源化形式。
20.如权利要求1～19中任一项所述的抗体，所述抗体抑制RSPO1与至少一种富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体(LGR)的结合。
21.如权利要求20所述的抗体，其中，所述LGR选自由LGR4、LGR5和LGR6组成的组。
22.如权利要求21所述的抗体，其中，所述LGR是LGR5。
23.如权利要求1～22中任一项所述的抗体，所述抗体抑制RSPO1信号传导。
24.如权利要求1～23中任一项所述的抗体，所述抗体抑制β-连环素的激活。
25.如权利要求1～24中任一项所述的抗体，所述抗体抑制β-连环素信号传导。
26.如权利要求1～25中任一项所述的抗体，所述抗体抑制肿瘤生长。
27.如权利要求1～26中任一项所述的抗体，所述抗体诱导肿瘤中分化标记物的表达。
28.如权利要求1～27中任一项所述的抗体，所述抗体诱导肿瘤中的细胞进行分化。
29.如权利要求1～28中任一项所述的抗体，所述抗体减小肿瘤中的癌干细胞的频率。
30.一种多肽，所述多肽包含选自由以下序列组成的组中的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:68和SEQ IDNO:69。
31.如权利要求30所述的多肽，所述多肽是抗体。
32.一种细胞，所述细胞包含或产生权利要求1～31中任一项所述的抗体或多肽。
33.一种杂交瘤细胞系，所述细胞系具有ATCC保藏号PTA-11970。
34.一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码权利要求1～31中任一项所述的抗体或多肽的多核苷酸。
35.一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含选自由以下序列组成的组中的多核苷酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58。
36.一种载体，所述载体包含权利要求34或权利要求35所述的多核苷酸。
37.一种细胞，所述细胞包含权利要求34或权利要求35所述的多核苷酸或者权利要求36所述的载体。
38.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1～31中任一项所述的抗体或多肽和药学上可接受的载剂。
39.一种抑制肿瘤生长的方法，其中，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体接触。
40.一种抑制受试对象中肿瘤生长的方法，其中，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。
41.一种诱导受试对象中肿瘤细胞的分化的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。
42.一种减小受试对象的肿瘤中的癌干细胞的频率的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。
43.一种抑制细胞中β连环素信号传导的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体接触。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞。
45.如权利要求39～42或44中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤选自由以下肿瘤组成的组：结直肠瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、肺瘤、肝瘤、乳腺瘤、肾瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、成胶质细胞瘤以及头颈瘤。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述肿瘤是胰腺瘤。
47.如权利要求45所述的方法，其中，所述肿瘤是卵巢瘤。
48.一种治疗受试对象中的癌的方法，其中，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述癌选自由以下癌组成的组：结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤以及头颈癌。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述癌是结直肠癌或胰腺癌。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌包含腺瘤性结肠息肉病(APC)基因中的失活突变。
52.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌不包含APC基因中的失活突变。
53.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌包含野生型APC基因。
54.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌不包含β连环素基因中的失活突变。
55.如权利要求49所述的方法，其中，所述癌是卵巢癌。
56.如权利要求39～42或44～55中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤或所述癌表达的RSPO1水平比正常组织中的RSPO1水平高。
57.如权利要求40～42或45～56中任一项所述的方法，其中，所述受试对象的肿瘤或癌已被去除。
58.如权利要求39～42或44～57中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌中RSPO1的表达水平的步骤。
59.如权利要求39～42或44～58中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有所述APC基因中的失活突变的步骤。
60.如权利要求39～42或44～59中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有β连环素基因的激活突变的步骤。
61.如权利要求58所述的方法，其中，所述确定RSPO1的表达水平的步骤在用所述抗体进行治疗或与所述抗体接触之前完成。
62.如权利要求61所述的方法，其中，如果所述肿瘤或癌具有升高的RSPO1表达水平，则将所述抗体：
(a)施用至所述受试对象；或
(b)与所述肿瘤或肿瘤细胞接触。
63.一种治疗受试对象中的疾病的方法，其中，所述疾病与β连环素的激活相关，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。
64.如权利要求39～63中任一项所述的方法，所述方法还包括施用至少一种另外的治疗剂。
65.如权利要求64所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是化学治疗剂。
66.如权利要求64所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是血管生成抑制剂。
67.如权利要求39～42或45～66中任一项所述的方法，其中，所述受试对象是人。
68.一种选择人受试对象以用结合RSPO1的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有RSPO1表达水平升高的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有升高的RSPO1表达水平，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO1的抗体进行治疗。
69.如权利要求68所述的方法，其中，所述肿瘤是卵巢瘤。
70.如权利要求58、68或69中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中RSPO1的表达水平。
71.一种选择人受试对象以用结合RSPO1的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有包含APC基因中的失活突变的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有所述APC基因中的失活突变，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO1的抗体进行治疗。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述肿瘤是结直肠瘤。
73.如权利要求59、71或72中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、杂交检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中APC基因的失活突变。
74.如权利要求70或73中任一项所述的方法，其中，所述样品是新鲜的肿瘤样品、冷冻的肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋样品。
75.如权利要求68～74中任一项所述的方法，其中，所述抗体是权利要求1～29中任一项所述的抗体。
76.一种分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合人R-反应蛋白2(RSPO2)，并且包含：
(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重链CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3；和/或
(b)包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQID NO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3。
77.一种分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合人RSPO2，并且包含：
(a)与SEQ ID NO:27具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:28具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
78.如权利要求77所述的抗体，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:27具有至少95%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:28具有至少95%序列同一性的轻链可变区。
79.如权利要求77所述的抗体，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:27的重链可变区；和/或
(b)包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。
80.如权利要求77所述的抗体，所述抗体包含：
(a)基本上由SEQ ID NO:27组成的重链可变区；和
(b)基本上由SEQ ID NO:28组成的轻链可变区。
81.一种分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合人RSPO2，并且包含：
(a)与SEQ ID NO:63具有至少90%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少90%序列同一性的轻链可变区。
82.如权利要求81所述的抗体，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:63具有至少95%序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少95%序列同一性的轻链可变区。
83.如权利要求81所述的抗体，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:63的重链可变区；和/或
(b)包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:76的轻链可变区。
84.如权利要求81所述的抗体，所述抗体包含：
(a)基本上由SEQ ID NO:63组成的重链可变区；和
(b)基本上由SEQ ID NO:67组成的轻链可变区。
85.如权利要求81所述的抗体，所述抗体包含：
(a)基本上由SEQ ID NO:63组成的重链可变区；和
(b)基本上由SEQ ID NO:76组成的轻链可变区。
86.一种分离的抗体，所述分离的抗体与权利要求76～85中任一项所述的抗体竞争与RSPO2的特异性结合。
87.一种分离的抗体，所述分离的抗体与权利要求76～86中任一项所述的抗体所结合的RSPO2上的表位相同。
88.一种分离的抗体，所述分离的抗体所结合的RSPO2上的表位与权利要求76～86中任一项所述的抗体所结合的RSPO2上的表位重叠。
89.如权利要求76～88中任一项所述的抗体，所述抗体是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
90.如权利要求76～89中任一项所述的抗体，所述抗体是人源化抗体。
91.如权利要求76～89中任一项所述的抗体，所述抗体是人抗体。
92.如权利要求76～91中任一项所述的抗体，所述抗体是IgG1抗体或IgG2抗体。
93.如权利要求76～92中任一项所述的抗体，所述抗体是包含抗原结合位点的抗体片段。
94.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由ATCC保藏号为PTA-12021的杂交瘤细胞系生产。
95.权利要求94所述的抗体的人源化形式。
96.如权利要求76-95中任一项所述的抗体，所述抗体抑制RSPO2与至少一种富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体(LGR)的结合。
97.如权利要求96所述的抗体，其中，所述LGR选自由LGR4、LGR5和LGR6组成的组。
98.如权利要求97所述的抗体，其中，所述LGR是LGR5。
99.如权利要求76～98中任一项所述的抗体，所述抗体抑制RSPO2信号传导。
100.如权利要求76～99中任一项所述的抗体，所述抗体抑制β-连环素的激活。
101.如权利要求76～100中任一项所述的抗体，所述抗体抑制β-连环素信号传导。
102.如权利要求76～101中任一项所述的抗体，所述抗体抑制肿瘤生长。
103.如权利要求76～102中任一项所述的抗体，所述抗体诱导肿瘤中分化标记物的表达。
104.如权利要求76～103中任一项所述的抗体，所述抗体诱导肿瘤中的细胞进行分化。
105.如权利要求76～104中任一项所述的抗体，所述抗体减小肿瘤中的癌干细胞的频率。
106.一种多肽，所述多肽包含选自由以下序列组成的组中的序列：SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:76。
107.如权利要求106所述的多肽，所述多肽是抗体。
108.一种细胞，所述细胞包含或产生权利要求76～107中任一项所述的抗体或多肽。
109.一种杂交瘤细胞系，所述细胞系具有ATCC保藏号PTA-12021。
110.一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码权利要求76～107中任一项所述的抗体或多肽的多核苷酸。
111.一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含选自由以下序列组成的组中的多核苷酸序列：SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:75。
112.一种载体，所述载体包含权利要求110或权利要求111所述的多核苷酸。
113.一种细胞，所述细胞包含权利要求110或权利要求111所述的多核苷酸或者权利要求112所述的载体。
114.一种药物组合物，所述药物组合物包含：权利要求76～107中任一项所述的抗体或多肽；和药学上可接受的载剂。
115.一种抑制肿瘤生长的方法，其中，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的权利要求76～105中任一项所述的抗体接触。
116.一种抑制受试对象中肿瘤生长的方法，其中，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求76～105中任一项所述的抗体。
117.一种诱导受试对象中肿瘤细胞的分化的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求76～105中任一项所述的抗体。
118.一种减小受试对象的肿瘤中的癌干细胞的频率的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求76～105中任一项所述的抗体。
119.一种抑制细胞中β连环素信号传导的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的权利要求76～105中任一项所述的抗体接触。
120.如权利要求119所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞。
121.如权利要求115～118或120中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤选自由以下肿瘤组成的组：结直肠瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、肺瘤、肝瘤、乳腺瘤、肾瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、成胶质细胞瘤以及头颈瘤。
122.如权利要求121所述的方法，其中，所述肿瘤是胰腺瘤。
123.如权利要求121所述的方法，其中，所述肿瘤是卵巢瘤。
124.一种治疗受试对象中的癌的方法，其中，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求76～105中任一项所述的抗体。
125.如权利要求124所述的方法，其中，所述癌选自由以下癌组成的组：结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤以及头颈癌。
126.如权利要求125所述的方法，其中，所述癌是结直肠癌。
127.如权利要求126所述的方法，其中，所述结直肠癌包含腺瘤性结肠息肉病(APC)基因的失活突变。
128.如权利要求126所述的方法，其中，所述结直肠癌不包含APC基因中的失活突变。
129.如权利要求126所述的方法，其中，所述结直肠癌包含野生型APC基因。
130.如权利要求126所述的方法，其中，所述结直肠癌不包含β连环素基因中的激活突变。
131.如权利要求125所述的方法，其中，所述癌是胰腺癌。
132.如权利要求115～118或120～131中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤或所述癌表达的RSPO2水平比正常组织中的RSPO2水平高。
133.如权利要求116～118或121～132中任一项所述的方法，其中，所述受试对象的肿瘤或癌已经被去除。
134.如权利要求115～118或120～133中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌中RSPO2的表达水平的步骤。
135.如权利要求115～118或120～134中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有所述APC基因中的失活突变的步骤。
136.如权利要求115～118或120～135中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有β连环素基因的激活突变的步骤。
137.如权利要求134所述的方法，其中，所述确定RSPO2的表达水平的步骤在用所述抗体进行治疗或与所述抗体接触之前完成。
138.如权利要求137所述的方法，其中，如果所述肿瘤或癌具有升高的RSPO2表达水平，则将所述抗体：
(a)施用至所述受试对象；或
(b)与所述肿瘤或肿瘤细胞接触。
139.一种治疗受试对象中的疾病的方法，其中，所述疾病与β连环素的激活相关，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求76～105中任一项所述的抗体。
140.如权利要求115～139中任一项所述的方法，所述方法还包括施用至少一种另外的治疗剂。
141.如权利要求140所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是化学治疗剂。
142.如权利要求140所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是Wnt途径抑制剂。
143.如权利要求116～118或121～142中任一项所述的方法，其中，所述受试对象是人。
144.一种选择人受试对象以用结合RSPO2的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有RSPO2表达水平升高的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有升高的RSPO2表达水平，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO2的抗体进行治疗。
145.如权利要求144所述的方法，其中，所述肿瘤是胰腺瘤。
146.如权利要求144所述的方法，其中，所述肿瘤是乳腺瘤。
147.如权利要求144所述的方法，其中，所述肿瘤是肺瘤。
148.如权利要求144所述的方法，其中，所述肿瘤是黑素瘤。
149.如权利要求144所述的方法，其中，所述肿瘤是结直肠瘤。
150.如权利要求134或144～149中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中RSPO2的表达水平。
151.一种选择人受试对象以用结合RSPO2的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有包含APC基因中的失活突变的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有所述APC基因中的失活突变，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO2的抗体进行治疗。
152.如权利要求151所述的方法，其中，所述肿瘤是结直肠瘤。
153.如权利要求135、151或152中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、杂交检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中APC基因的失活突变。
154.如权利要求150或权利要求153所述的方法，其中，所述样品是新鲜的肿瘤样品、冷冻的肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋样品。
155.如权利要求144～154中任一项所述的方法，其中，所述抗体是权利要求76～105中任一项所述的抗体。
156.一种抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:25的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:26的轻链氨基酸序列。
157.一种抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:41的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:42的轻链氨基酸序列。
158.一种抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:68的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:69的轻链氨基酸序列。
159.一种抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:70的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:71的轻链氨基酸序列。
160.一种抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:70的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:74的轻链氨基酸序列。
161.一种选择人受试对象以用结合RSPO3的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有RSPO3表达水平升高的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有升高的RSPO3表达水平，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO3的抗体进行治疗。
162.如权利要求161所述的方法，其中，所述肿瘤是肺瘤。
163.如权利要求161所述的方法，其中，所述肿瘤是乳腺瘤。
164.如权利要求161所述的方法，其中，所述肿瘤是卵巢瘤。
165.如权利要求161所述的方法，其中，所述肿瘤是结直肠瘤。
166.如权利要求161～165中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中RSPO3的表达水平。
167.如权利要求166所述的方法，其中，所述样品是新鲜的肿瘤样品、冷冻的肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋样品。
168.一种选择人受试对象以用结合RSPO4的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有RSPO4表达水平升高的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有升高的RSPO4表达水平，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO4的抗体进行治疗。
169.如权利要求168所述的方法，其中，所述肿瘤是肺瘤。
170.如权利要求168所述的方法，其中，所述肿瘤是乳腺瘤。
171.如权利要求168所述的方法，其中，所述肿瘤是卵巢瘤。
172.如权利要求168～171中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中RSPO3的表达水平。
173.如权利要求172所述的方法，其中，所述样品是新鲜的肿瘤样品、冷冻的肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋样品。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105925576A (zh) * 2016-03-24 2016-09-07 嘉兴市第医院 针对哺乳动物R-Spondin3基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用
CN106687137A (zh) * 2014-09-16 2017-05-17 昂考梅德药品有限公司 纤维化疾病的治疗
CN106913880A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 上海交通大学 一种含有rspo1的靶向给药系统及其制备与应用
CN107708731A (zh) * 2014-12-02 2018-02-16 昂考梅德药品有限公司 治疗癌症的组合疗法
CN110339364A (zh) * 2018-04-02 2019-10-18 上海邦耀生物科技有限公司 Lgr4/rspo阻断剂与抗免疫检查点抑制剂联合用于肿瘤的免疫治疗
CN110467663A (zh) * 2019-06-18 2019-11-19 华南农业大学 Rspo3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2093298A3 (en) 2003-10-10 2009-09-23 Deutsches Krebsforschungszentrum Compositions for diagnosis and therapy of diseases associated with aberrant expression of Futrins (R-Spondins)
SI2066694T1 (sl) 2006-09-29 2016-02-29 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in postopki za diagnosticiranje in zdravljenje raka
HUE027179T2 (en) 2006-10-20 2016-10-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Angiogenesis and vasculogenesis modulator for Rspond
HUE027154T2 (en) 2007-07-02 2016-08-29 Oncomed Pharm Inc Preparations and procedures for the treatment and diagnosis of cancer
US8993000B2 (en) * 2009-11-17 2015-03-31 National University Corporation Okayama University Method for inducing differentiation of dental pulp cells into odontoblasts
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
KR20140048276A (ko) 2011-07-15 2014-04-23 온코메드 파마슈티칼스, 인크. Rspo 결합제 및 이의 용도
KR20150036603A (ko) 2012-07-13 2015-04-07 온코메드 파마슈티칼스, 인크. Rspo3 결합제 및 그의 용도
AU2014244444A1 (en) * 2013-03-14 2015-09-24 Amgen Inc. CHRDL-1 antigen binding proteins and methods of treatment
RU2016114074A (ru) * 2013-10-18 2017-11-23 Дженентек, Инк. Анти-rspo антитела и способы применения
CN103724415B (zh) * 2013-12-31 2015-05-27 中山大学 斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其制备方法和应用
CA2952315A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Genentech, Inc. Notch pathway inhibition
EP3180027A4 (en) * 2014-08-15 2018-01-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Rspo1 binding agents and uses thereof
WO2017040660A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
WO2017070567A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 The Research Foundation For The State University Of New York Klebsiella pneumoniae antibodies and methods to treat klebsiella pneumoniae infections
MX2018004988A (es) * 2015-10-23 2018-11-09 Merus Nv Moleculas de union que inhibe el crecimiento de cancer.
BR112018067522A2 (pt) 2016-03-01 2019-02-05 Univ Of Rijeka Faculty Of Medicine anticorpos específicos para receptor de poliovírus humano (pvr)
EP3443004A1 (en) 2016-04-14 2019-02-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-rspo3 antibodies and methods of use
US20190224339A1 (en) * 2016-04-29 2019-07-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
JP2020530028A (ja) 2017-08-09 2020-10-15 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴに結合する抗体
CN111133005A (zh) 2017-09-07 2020-05-08 奥古斯塔大学研究所公司 程序性细胞死亡蛋白1抗体
CN109529040B (zh) * 2017-09-21 2020-11-13 华东师范大学 LGR4和R-spondin结合抑制剂及其在肿瘤治疗中的用途
JP7370997B2 (ja) 2017-12-07 2023-10-30 ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ 抗ｒｓｐｏ３抗体
US20220227848A1 (en) * 2018-02-07 2022-07-21 Nordic Bioscience A/S Type XXIII Collagen Assay
AU2019460208A1 (en) * 2019-08-05 2022-03-17 Genex Health Co., Ltd Method for culturing primary cells of lung cancer solid tumor and primary tumor cells of lung cancer pleural effusion, and supporting reagent
WO2021247497A1 (en) * 2020-06-03 2021-12-09 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods comprising r-spondins for treatment of tumors
CN112457400B (zh) * 2020-12-09 2022-03-08 福州迈新生物技术开发有限公司 抗β-catenin蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
KR102551095B1 (ko) * 2023-03-21 2023-07-04 순천향대학교 산학협력단 신규한 항-인간 알스폰딘2 항체 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090074782A1 (en) * 2007-07-02 2009-03-19 Austin Gurney Compositions and Methods for Treating and Diagnosing Cancer

Family Cites Families (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US20070124581A1 (en) 1992-05-17 2007-05-31 Reena Khare Cell adhesion and extracellular matrix proteins
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
US6706484B1 (en) 1995-08-18 2004-03-16 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
CA2288343A1 (en) 1997-04-25 1998-11-05 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6004528A (en) 1997-09-18 1999-12-21 Bergstein; Ivan Methods of cancer diagnosis and therapy targeted against the cancer stemline
JP2001517441A (ja) 1997-09-24 2001-10-09 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ｈｇ３８
US20020065394A1 (en) 1998-03-18 2002-05-30 Kenneth Jacobs Secreted proteins and polynucleotides encoding them
DE69941330D1 (de) 1998-03-26 2009-10-08 Univ R Neue g-protein-gekoppelte rezeptoren aus säugetieren mit extrazellulären leucin-reicher region
US6485972B1 (en) 1998-10-15 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College WNT signalling in reproductive organs
US20030166047A1 (en) 1999-05-06 2003-09-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Lgr6 nucleic acids and uses thereof
ES2353268T3 (es) 1999-07-02 2011-02-28 Morphosys Ag Generacion de elementos de union especifica que se unen a (poli)peptidos codificados por fragmentos de adn genomico o est.
WO2001007611A2 (en) 1999-07-26 2001-02-01 Genentech, Inc. Novel polynucleotides and method for the use thereof
WO2001057190A2 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US6824973B2 (en) 2000-02-03 2004-11-30 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method of promoting stem cell proliferation or survival by contacting a cell with a stem cell factor-like polypeptide
AU5301201A (en) 2000-03-31 2001-10-15 Gen Hospital Corp Methods of modulating hair growth
CA2405104A1 (en) 2000-04-05 2001-10-18 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
EP1156062A1 (en) 2000-05-12 2001-11-21 GPC Biotech AG Immunomodulatory human MHC class II antigen-binding peptides/proteins
AU2001263006A1 (en) 2000-05-18 2001-11-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030139341A1 (en) 2000-05-30 2003-07-24 Shyam Ramakrishnan Regulation of human lgr4-like g protein -coupled receptor
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
ES2649037T3 (es) 2000-12-12 2018-01-09 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
US6768004B2 (en) 2001-01-11 2004-07-27 Mueller Sybille Nucleotide sequences encoding variable regions of heavy and light chains of monoclonal antibody 1F7, an anti-idiotypic antibody reactive with anti-HIV antibodies
US20040077048A1 (en) 2002-01-30 2004-04-22 Warren Bridget A. Protein modification and maintenance molecules
US20100292155A1 (en) 2001-03-05 2010-11-18 Arca Biopharma, Inc. Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
US20030032034A1 (en) 2001-03-05 2003-02-13 Tang Y. Tom Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
US7411052B2 (en) 2001-03-05 2008-08-12 Nuvelo, Inc. Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
JP4251983B2 (ja) 2001-06-11 2009-04-08 協和発酵キリン株式会社 造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るポリペプチドおよびそれをコードするｄｎａ
WO2002102854A2 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
US20030022217A1 (en) 2001-07-02 2003-01-30 Pe Corporation (Ny) Isolated human secreted proteins, nucleic acid molecules encoding human secreted proteins, and uses thereof
CA2458818A1 (en) 2001-08-30 2003-04-10 Nuvelo, Inc. Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
WO2003029437A2 (en) 2001-10-03 2003-04-10 Incyte Genomics Inc. Secreted proteins
US20070237770A1 (en) 2001-11-30 2007-10-11 Albert Lai Novel compositions and methods in cancer
US20040197778A1 (en) 2002-12-26 2004-10-07 Sagres Discovery, Inc. Novel compositions and methods in cancer
JP2005511754A (ja) 2001-12-07 2005-04-28 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 乳癌幹細胞の予測的同定および特徴づけ
EP1504099A4 (en) 2001-12-10 2006-05-10 Nuvelo Inc NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
US7439332B2 (en) 2002-04-26 2008-10-21 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Polypeptide having an activity to support proliferation or survival of hematopoietic stem or progenitor cells
EP1380644A1 (en) 2002-07-08 2004-01-14 Kylix B.V. The use of specified TCF target genes to identify drugs for the treatment of cancer, in particular colorectal cancer, in which TCF/beta-catenin/WNT signalling plays a central role
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
US7365168B2 (en) 2002-10-15 2008-04-29 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004074436A2 (en) 2003-02-19 2004-09-02 Incyte Corporation Methods of use of a gpcr in the diagnosis and treatment of colon and lung cancer
US20050003405A1 (en) 2003-04-30 2005-01-06 Hua-Chien Chen Treatment and diagnostics of cancer
JP2007516693A (ja) 2003-06-09 2007-06-28 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン 癌の治療および診断のための組成物および方法
WO2005110009A2 (en) 2003-07-22 2005-11-24 Immunex Corporation COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO TSP-30a, b, c AND d
DE10339820A1 (de) 2003-08-22 2005-03-17 Hinzmann, Bernd, Dr. Verwendung von an GPR49 bindenden Substanzen zur Diagnose und Behandlung von Krebs
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
EP2093298A3 (en) 2003-10-10 2009-09-23 Deutsches Krebsforschungszentrum Compositions for diagnosis and therapy of diseases associated with aberrant expression of Futrins (R-Spondins)
WO2005040828A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor 49 (gpr49)
EP1697415A1 (en) 2003-11-12 2006-09-06 Biogen Idec MA Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
RU2343158C2 (ru) 2004-01-27 2009-01-10 Ньювело, Инк. Желудочно-кишечный пролиферативный фактор и его применения
AU2005209909B8 (en) 2004-02-03 2009-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing, and treating cancer
EP1725585A2 (en) 2004-03-10 2006-11-29 Lonza Ltd Method for producing antibodies
US20080312425A1 (en) 2004-08-30 2008-12-18 Lonza Biologics Plc. Ion Exchange Chromatography and Purification of Antibodies
US7572456B2 (en) 2004-09-13 2009-08-11 Macrogenics, Inc. Humanized antibodies against West Nile Virus and therapeutic and prophylactic uses thereof
CA2591665C (en) 2004-12-20 2015-05-05 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof
US7439327B2 (en) 2005-01-18 2008-10-21 Nuvelo, Inc. Stem cell factor-like proteins and uses thereof
WO2006110585A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Cancer-related genes (prlr)
EP1917022A2 (en) 2005-07-26 2008-05-07 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Anti-tumor agents comprising r-spondins
WO2007030290A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Maine Medical Center Research Cristin/r-spondin ligands active in the wnt signaling pathway and methods, compositions and kits relating thereto
CA2623413A1 (en) 2005-10-07 2007-09-07 Nuvelo, Inc. Stem cell factor-like protein scfa1 and uses thereof
US7723112B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
GB0603683D0 (en) 2006-02-23 2006-04-05 Novartis Ag Organic compounds
EP2380908A1 (en) 2006-06-02 2011-10-26 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Hepatocyte growth factor (hgf) binding proteins
WO2007143090A2 (en) 2006-06-02 2007-12-13 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Hepatocyte growth factor (hgf) binding proteins
PL2032166T3 (pl) 2006-06-13 2013-09-30 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworów
KR101528939B1 (ko) 2006-07-18 2015-06-15 사노피 암 치료를 위한 ｅｐｈａ2에 대한 길항제 항체
JP2008044926A (ja) 2006-08-14 2008-02-28 Trustees Of Columbia Univ In The City Of New York Ｗｎｔ信号伝達に関係した分泌タンパク質
CA2662041A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Genentech, Inc. Wnt antagonists and their use in the diagnosis and treatment of wnt-mediated disorders
SI2066694T1 (sl) 2006-09-29 2016-02-29 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in postopki za diagnosticiranje in zdravljenje raka
HUE027179T2 (en) 2006-10-20 2016-10-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Angiogenesis and vasculogenesis modulator for Rspond
WO2008075796A1 (ja) 2006-12-21 2008-06-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 血球回復促進剤
WO2008088524A2 (en) 2006-12-28 2008-07-24 Nuvelo, Inc. Thrombospondin-domain-deficient r-spondin 1 protein as gastrointestinal tract epithelial proliferation factor
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
US20100330089A1 (en) 2007-06-12 2010-12-30 Wyeth Anti-cd20 therapeutic compositions and methods
US20120082659A1 (en) 2007-10-02 2012-04-05 Hartmut Land Methods And Compositions Related To Synergistic Responses To Oncogenic Mutations
EP2188630A4 (en) 2007-10-02 2010-11-03 Univ Rochester METHODS AND COMPOSITIONS ASSOCIATED WITH SYNERGIC RESPONSES TO ONCOGENIC MUTATIONS
CA2705509A1 (en) 2007-11-14 2009-05-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-gpr49 antibody
EP2242762B1 (en) 2008-01-18 2015-12-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
US8187601B2 (en) 2008-07-01 2012-05-29 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) binding proteins
WO2010016766A2 (en) 2008-08-08 2010-02-11 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Antibodies recognizing endogenous human lgr5 and/or lgr6
SG190568A1 (en) 2008-09-26 2013-06-28 Oncomed Pharm Inc Frizzled-binding agents and uses thereof
CN103408664B (zh) 2008-10-31 2015-11-25 东丽株式会社 抗人cxcl1单克隆抗体或其片段
WO2010121923A1 (en) 2009-04-15 2010-10-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Rspondin-3 inhibition in bone disorders
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
WO2010129284A1 (en) 2009-04-27 2010-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of hair follicle growth by the wnt inhibitor dkk1
US20120114646A1 (en) 2009-06-18 2012-05-10 Wyeth Llc Lyophilized formulations for small modular immunopharmaceuticals
WO2011009090A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Xoma Technology Ltd. Antibodies to high molecular weight melanoma associated antigen
US8709424B2 (en) 2009-09-03 2014-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-GITR antibodies
EP2515933B1 (en) 2009-12-23 2016-03-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Receptors of rspo2 and rspo3
WO2011085289A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Production of a monoclonal antibody therapeutic against west nile virus in plants
CA2786745A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Wnt-binding agents and uses thereof
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
KR20120117931A (ko) 2010-02-12 2012-10-24 온코메드 파마슈티칼스, 인크. 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 확인 및 분리하는 방법
US20150024952A1 (en) 2010-12-28 2015-01-22 Arlet Alarcon Molecular profiling for cancer
GB201106395D0 (en) 2011-04-14 2011-06-01 Hubrecht Inst Compounds
AU2012248158C1 (en) 2011-04-28 2017-02-02 Sbi Biotech Co., Ltd. Anti-human receptor-type protein tyrosine phosphatase sigma antibody
KR20140048276A (ko) 2011-07-15 2014-04-23 온코메드 파마슈티칼스, 인크. Rspo 결합제 및 이의 용도
CN109111523B (zh) 2011-10-14 2022-06-07 诺华股份有限公司 用于Wnt途径相关疾病的抗体和方法
US10598653B2 (en) 2011-11-01 2020-03-24 Bionomics Inc. Methods of blocking cancer stem cell growth
AU2012332590B2 (en) 2011-11-01 2016-10-20 Bionomics, Inc. Anti-GPR49 antibodies
AU2013216753B2 (en) 2012-02-11 2017-09-21 Genentech, Inc. R-spondin translocations and methods using the same
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
KR20150036603A (ko) 2012-07-13 2015-04-07 온코메드 파마슈티칼스, 인크. Rspo3 결합제 및 그의 용도
CA2905830C (en) 2013-03-12 2022-01-18 Curegenix Inc. Quinazoline and naphthyridine derivatives useful in the treatment of cancer
EP3006942A4 (en) 2013-05-30 2016-11-30 Order Made Medical Res Inc REAGENT WITH ANTI-LGR6 ANTIBODIES FOR THE DETECTION AND DIAGNOSIS OF CANCER
RU2016114074A (ru) 2013-10-18 2017-11-23 Дженентек, Инк. Анти-rspo антитела и способы применения
MA41123A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Oncomed Pharm Inc Polythérapie pour le traitement du cancer
US9777052B2 (en) 2014-12-02 2017-10-03 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma R-spondin variants, compositions, and methods of use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090074782A1 (en) * 2007-07-02 2009-03-19 Austin Gurney Compositions and Methods for Treating and Diagnosing Cancer

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106687137A (zh) * 2014-09-16 2017-05-17 昂考梅德药品有限公司 纤维化疾病的治疗
CN107708731A (zh) * 2014-12-02 2018-02-16 昂考梅德药品有限公司 治疗癌症的组合疗法
CN106913880A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 上海交通大学 一种含有rspo1的靶向给药系统及其制备与应用
CN105925576A (zh) * 2016-03-24 2016-09-07 嘉兴市第医院 针对哺乳动物R-Spondin3基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用
CN105925576B (zh) * 2016-03-24 2018-04-20 嘉兴市第一医院 针对哺乳动物R‑Spondin3基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用
CN110339364A (zh) * 2018-04-02 2019-10-18 上海邦耀生物科技有限公司 Lgr4/rspo阻断剂与抗免疫检查点抑制剂联合用于肿瘤的免疫治疗
CN110339364B (zh) * 2018-04-02 2021-02-12 上海邦耀生物科技有限公司 Lgr4/rspo阻断剂与抗免疫检查点抑制剂联合用于肿瘤的免疫治疗
CN110467663A (zh) * 2019-06-18 2019-11-19 华南农业大学 Rspo3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用
CN110467663B (zh) * 2019-06-18 2022-05-10 华南农业大学 Rspo3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用

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