WO2004030689A1 - 好酸球カチオン性タンパク質を含有する組成物 - Google Patents
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- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
Definitions
- the invention of this application relates to a composition containing an eosinophil cationic protein. More specifically, this application relates to a therapeutic composition and a cell culture medium composition utilizing a novel physiological activity of eosinophil cationic protein, and a screening using the physiological activity of eosinophil cationic protein as an index. It is about the method. Background art
- Eosinophil cat ionic protein is a protein whose expression increases with eosinophil activation and is present in basic granules (Proc. Nail Acad. Sci. USA. 1986, 83 (10): 3146-3150).
- This ECP is known to have activities such as parasite killing, neurotoxin, suppression of lymphocyte proliferation, sterilization, histamine release, liponuclease, and shortening of clotting time (Nippon Clinical 1993, 51 (3): 60 (606)), in particular, since its histamine releasing activity induces an allergic reaction, an antiallergic drug having a pharmacological action of suppressing the expression of ECP has been proposed (Japanese Patent Publication No. 2002-500506). It has also been proposed to use this eosinophil cell line containing ECP for screening for asthma drugs and antiallergic drugs (Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-111382).
- ECP physiological activity of ECP has been recognized to be toxicity and inhibition of growth on bacteria and animal cells.
- ECP has novel physiological activities such as maintaining the survival of animal cells and promoting differentiation.
- An object of the invention of this application is to provide a new composition utilizing the novel activity of ECP found by the inventors.
- This application also promotes cell survival and differentiation using the novel activity of ECP as an indicator.
- the task is to provide a new method for developing therapeutic drugs whose pharmacological action is to promote it. Disclosure of the invention
- the present invention is directed to a first invention for solving the above-mentioned problems, which is a therapeutic composition for a disease caused by impairment of cell survival, proliferation and Z or cell differentiation, comprising eosinophil cations.
- a composition characterized by containing a sex protein and a pharmacological component.
- the disease caused by impairment of cell survival, proliferation, or cell differentiation is a heart disease, a bone disease, or a neurodegenerative disease. .
- the present invention also provides, as a second invention, a medium composition for promoting the maintenance, growth and / or cell differentiation of cells, which comprises an eosinophil cationic protein and a cell biological component. Offer things.
- the present invention provides, as a third invention, a method for screening an active ingredient substance of a therapeutic composition for a disease caused by impairment of cell survival, proliferation and / or cell differentiation, wherein the method comprises the steps of: A screening method characterized by contacting a substance and identifying a substance that promotes the maintenance of cell survival and promotes Z or cell differentiation to the same or higher level as eosinophil cationic protein as a target substance .
- a preferred embodiment is that the cells are nerve cells, bone cells, cardiomyocytes or fibroblasts.
- Figure 1 shows the results of testing the effect of ECP on the growth of normal tissue-derived cell lines. Closed circles are BALB / c 3T3 cells, S corners are A10H cells, squares are HC-11 cells, and open circles are HUVEC cells.
- Figure 2 shows the results of testing the dose-dependent effect of ECP on the proliferation of BALB / c 3T3 cells.
- FIG. 3 shows the results of testing the time-dependent effect of ECP on the growth of BALB / c 3T3.
- the closed circle is EPC
- the closed square is RNase
- the open square is control.
- FIG. 4 shows the results (phase-contrast microscopy images) of the effect of ECP on BALB / c 3T3 growth in a low serum medium.
- Figure 5 shows the results (confocal laser-microscope image) of testing the ECP effect on BALB / c 3T3 cytoskeletal molecule formation in a low serum medium.
- Figure 6 shows the results (confocal laser microscope image) of testing the effect of ECP + bFGF on BALB / c 3T3 cytoskeletal molecule formation in low serum medium.
- Figure 7 shows the results (confocal laser microscope image) of testing the effects of ECP and ROCK inhibitor on the cytoskeleton formation of BALB / c 3T3 cells.
- Figure 8 shows the results of a test (confocal laser microscopy) of the ECP effect on cytoskeleton formation in cardiomyocytes from neonatal rats.
- FIG. 9 shows the results of testing the effect of ECP on the beating rate of cardiomyocytes from neonatal rats.
- Figure 10 shows the results of testing the effects of ECP and ROCK inhibitors on cardiomyocyte beat rate.
- FIG. 11 shows the results of testing the effect of ECP on the survival of nerve-like PC12 cells in a serum-free culture medium.
- FIG. 12 shows the results of testing the effect of ECP on alkaline phosphatase activity in MC3T3-E1 cells derived from rat calvarial bone.
- ECP used in each invention of this application can be isolated from cells of various mammals including humans (leukocytes and hematopoietic stem cells) by a known method. It can also be prepared by a known solid phase peptide synthesis method based on the amino acid sequence (human ECP: GenBank / X15161, chimpanzee: GenBank / AF294028, gorilla: GenBank / U24097) and the like. Alternatively, recombinant ECP can be obtained by expressing a polynucleotide encoding each peptide in an in vitro transcription / translation system or an appropriate host vector system.
- Polynucleotides e.g., ECP cDNA
- ECP cDNA can be screened by using an oligonucleotide probe prepared based on the nucleotide sequence information in the GenBank database to screen an existing cDNA library, or by T-PCR using oligonucleotide primers. It can be obtained by a known method.
- the polynucleotide when recombinant ECP is produced by in vitro transcription / translation, the polynucleotide is inserted into a vector having an NA polymerase promoter to produce an expression vector, and this vector is used as a promoter.
- the in vitro translation system such as a heron reticulocyte lysate or wheat germ extract containing the corresponding K polymerase.
- the RNA polymerase promoter include T7, T3, SP6 and the like.
- vectors containing these RNA polymerase promoters include pKAl, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, pBluescript II, and the like.
- the expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, and a yeast-mine, which can replicate in the microorganism, is used as described above.
- An expression vector is prepared by recombining the DNA fragments, and the fusion peptide is isolated from the culture.
- Examples include the pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system, and the like.
- the fusion polynucleotide When recombinant ECP is expressed in eukaryotic cells, the fusion polynucleotide is inserted into an expression vector for eukaryotic cells having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like. If a recombinant vector is prepared and introduced into eukaryotic cells, the fusion peptide can be expressed in transformed eukaryotic cells.
- expression vectors include KAK pCDM8, pSVK3, pMSG, pSYL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like.
- mammalian cultured cells such as monkey kidney cell C0S7 and Chinese hamster ovary cell CH0, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, and African egg cells are generally used, but they express the target protein. Any eukaryotic cell can be used.
- known methods such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, and a DEAE dextran method can be used.
- a known separation procedure can be used in combination to isolate and purify the recombinant ECP from the culture.
- treatment with denaturing agents such as urea or surfactants, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out or solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing Dynamic chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography and the like.
- ECP is a secretory protein.
- the 23 amino acid sequence on the N-terminal side is a secretory signal. Therefore, when expressing recombinant ECP in prokaryotic or eukaryotic cells, the C-terminal side of the secretory signal sequence (for example, Arg after position 28) should be considered in consideration of the recovery efficiency of recombinant ECP from the culture. It is preferable to express the active region of (1).
- the composition of the first invention is a medical composition characterized by containing the ECP and the pharmacological component as described above, and is caused by impairment of cell survival, proliferation and Z or cell differentiation. It is used for the treatment of human diseases.
- diseases are diseases caused by abnormalities in the normal life cycle (proliferation, differentiation, cell death, etc.) of various tissue cells in a living body, and various diseases caused by heredity or various cytotoxic substances. Can be targeted. In particular, it can be used for the complete remission or amelioration of symptoms of heart, bone and degenerative diseases.
- Cardiac diseases include myocardial infarction, myocarditis, and cardiomyopathy (dilated cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, constrained cardiomyopathy, and closed lumen cardiomyopathy caused by the formation or degeneration of the myocardial cytoskeleton, etc. Etc.) and myocardial fibrosis.
- Bone diseases include osteoporosis and periodontal disease caused by osteoblast (osteoblast) differentiation disorders.
- the composition for therapeutic use of bones can also be used for bone tissue regeneration after fracture.
- Neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease caused by degeneration and cell death of nerve cells, senile dementia, Down's syndrome, Parkinson's disease, Kreuz'Felt's Jakob disease, amyotrophic lateral cord sclerosis, neuropathy, etc. It is.
- the “pharmaceutical component”, which is a component of the medical composition of the first invention, firstly means various carriers used in usual drug production.
- the carrier can be appropriately selected from a wide range depending on the type of the target disease and the dosage form of the drug, but the medical composition of the present invention is in a unit dosage form which can be administered orally or by injection. Desirably.
- administration by injection local injection, intraperitoneal injection, selective intravenous injection, intravenous injection, subcutaneous injection, organ perfusate injection, and the like can be employed.
- Oral liquid preparations such as suspensions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, and fructoses; glycols such as polyethylene glycol; oils such as sesame oil and soybean oil; alkylparahydroxybenzoate; It can be manufactured using preservatives, stover flavors and flavors such as peppermint.
- Powders, pills, capsules and tablets are excipients such as lactose, glucose, glucose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, magnesium stearate, talc, etc. And a binder such as polyvinyl alcohol, hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin. Tablets and capsules are the preferred unit dosage form in the compositions of the present invention in that they are easy to administer. When manufacturing tablets and capsules, solid pharmaceutical carriers are used.
- the solution for injection may be a saline solution, a glucose solution, or a saline solution and a glucose solution. It can be formulated by using a carrier comprising a mixture of liquids and various buffers. Alternatively, the preparation may be prepared in powder form, and mixed with the liquid carrier at the time of use to prepare an injection solution.
- the dose of the medical composition of the present invention varies depending on the patient's age, body weight, symptoms, administration route, etc., but the blood concentration of ECP is 10 nmol to 0.1 nm, preferably 5 nmol to 0.5 nm.
- the dose should be about ol.
- the second of the pharmaceutical components is a component for converting ECP into a form that can be introduced into cells.
- the polypeptide can be mixed with a pharmacologically acceptable solution without changing the structure or function of the polypeptide to form a composition.
- a composition may be introduced into cells by, for example, a microinjection method, or a lipid (for example, BioPORTER (Gene Therapy Systems, USA), Chariot "(Active Motif, USA), etc.). It can be introduced into target cells by an intracellular introduction method.
- the third of the pharmaceutical components is a component for converting the polynucleotide encoding ECP into a form that can be introduced into cells. That is, the polynucleotide may be incorporated into an expression vector for eukaryotic cells, and this vector may be incorporated into, for example, a hollow nanoparticle presenting a biorecognition molecule, a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, or the like. Such a composition can be introduced into a target cell in a living body by a gene therapy technique.
- the second invention of this application is a medium composition containing an eosinophil cationic protein and a cell biological component, which is used for promoting survival maintenance, growth and Z or cell differentiation of cultured cells. can do.
- the “cell biological component” is a component essential for the survival, growth, differentiation, etc. of cells, and specifically, a component constituting a normal animal cell culture medium.
- a component constituting a normal animal cell culture medium include buffers (sodium phosphate monocarbonate and carbon dioxide gas), organic substances such as salts, glucose, vitamins and amino acids, serum (fetal fetal serum: FBS) and nutritional factors (Growth Factor in Serum: GFS).
- the medium composition of the present invention can be produced by appropriately mixing these components and ECP.
- the content of each component can be approximately the same as that of a normal animal culture medium.
- ECP can be adjusted according to cell type and purpose. However, it can be about 0.001 to 10 / with respect to the medium 111.
- a cell which is a target of a normal animal cell can be used, and particularly, a nerve cell, a bone cell, a cardiomyocyte, a fibroblast and the like are preferable. These cells may be primary cells, passaged cells, cell lines isolated from animal tissues, or transformed cells into which a foreign gene has been introduced. “Culture” can be performed as suspension culture for suspension cells, or as monolayer culture or three-dimensional culture for adherent cells. Further, holofiber culture may be performed in a hollow polymer tube.
- the cultured cells can survive for a long period of time or can be differentiated for expression of function. For this reason, culture systems using this composition should be used for cell biological events such as cell survival, cytoskeleton formation, proliferation, and differentiation, or for signal transduction cascades (particularly the Rho kinase pathway) that governs these events. Useful for elucidation.
- this composition can differentiate cells into a state of expressing functions or allow cells to survive for a long period of time, they can also be used for producing useful substances (such as bioreactors).
- the medium composition of the present invention can allow nerve cells and the like to survive for a long period of time even with low serum or serum-free by containing ECP. For this reason, cell functions can be analyzed with little or no protein components other than ECP, and thus it is also useful as a system for screening protein factors and the like that act on specific functions of cells.
- the third invention of this application is a screening method for identifying a novel factor other than ECP, which has an activity of maintaining the survival of cells, promoting proliferation, and / or promoting cell differentiation. That is, a candidate substance is brought into contact with a cell, and the survival time or differentiation state of the cell is measured. When the measured value is equal to or higher than the measured value obtained when the ECP is brought into contact with the cells, the tested candidate substance can be determined to be the target factor.
- the survival of the cells can be performed by a known method such as trypan blue staining.
- Cell proliferation can be performed by counting the number of viable cells after a certain period of culture.
- cell differentiation can be performed by immunostaining, Western blot analysis, RT-PCR, or the like for markers specific to differentiated cells.
- the cell is a cell whose survival period is prolonged by contact with ECP, or a cell which promotes proliferation or differentiation.
- nerve cells, bone cells, cardiomyocytes, fibroblasts and the like are preferable.
- These cells may also be primary cells, passage cells, cell lines, or transformed cells into which a foreign gene has been introduced, isolated from animal tissues. These cells can be tested under the same conditions as normal animal cell culture. When testing the survival of cells, it is preferable to culture the cells in the absence of serum or growth factors. Further, these cells may be cells in an animal individual.
- “Candidate substances” are, for example, unknown and known organic or inorganic compounds, proteins, peptides, polynucleotides, oligonucleotides and the like.
- a method of adding the candidate substance to the culture medium of a cultured cell a method of introducing the candidate substance into cultured cells or cells in an animal individual (intracellular introduction by microinjection or lipid) are used. Law) etc. can be adopted.
- the candidate substance is a polynucleotide / oligonucleotide
- the expression vector is transfected into cells by a known method, or an animal individual is infected with a viral vector according to a gene therapy method. Is also good.
- Example 1 Effect of ECP on proliferation of cell line derived from normal tissue
- mice fibroblast cell line BALB / c 3T3
- aortic smooth muscle cell line ⁇ 10
- mouse mammary gland endothelial cell line HC-11
- human umbilical cord vascular endothelial cell line HAVEC
- Example 2 Effect of ECP on BALB / c 3T3 cell proliferation
- BALB / c 3T3 A31-K cells were seeded at a concentration of 1000 cels / well in a DMEM culture solution containing 10 FBS in a 96-well culture plate. Twenty-four hours later, a final concentration of ⁇ of ECP or NaseA was added to each culture. After culturing for 48 hours, the number of viable cells was measured. The results are as shown in FIG. ECP significantly promoted cell proliferation at all concentrations. On the other hand, RNaseA did not show a growth promoting effect.
- Example 3 Effect of ECP on the time course of BALB / c 3T3 cell proliferation
- BALB / c 3T3 cells were seeded at a concentration of 1000 cells / well in a DMEM culture solution containing 10% FBS in a 96-well culture plate. After 24 hours of culture, I M ECP or I M RNaseA was added to the culture solution at a concentration of lng / il. Culture was continued for 4 days, and the number of viable cells was measured every 24 hours. The culture medium was replaced on the second day of the culture.
- Example 4 Effect of ECP on BALB / 3T3 cell growth under low serum conditions
- BALB / c 3T3 cells were inoculated to a DMEM culture solution containing 10% FBS in a 24-well culture plate at 2 ⁇ 10 4 cells Is / well and cultured. After 24 hours, when the cultured cells became stable, the medium was replaced with a DMEM culture solution containing 0.5% FBS, and the culture was continued. Twenty-four hours later, 1 M of ECP and RnaseA, and 60 pM of bFGF were combined and added to the culture solution. After culturing for another 48 hours, the cells cultured under each condition were subjected to phase contrast microscopy (objective lens X20). Was observed.
- phase contrast microscopy objective lens X20
- Example 5 Effect of ECP on BALB / c 3T3 cytoskeletal molecules under low serum conditions Place a previously sterilized round cover glass of 15 ⁇ diameter on a 24-well culture plate, IX phosphate buffer solution (PBS) containing gelatin was placed in each well so that the cover glass was sufficiently immersed, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to coat the cover glass with gelatin. Each well was filled with a DMEM culture solution containing 10% FBS, and BALBc / 3T3 cells were seeded and cultured at 2 ⁇ 10 4 cells / well. Twenty-four hours later, the medium was replaced with a DMEM culture solution containing 0.5 FBS. Further 24 hours later, 1 iM ECP or RNaseA was added to the culture medium, respectively.
- PBS IX phosphate buffer solution
- the cover glass on which the BALB / c 3T3 cells have grown is removed from the well, washed with 1X PBS 2-3 times, and then the cover glass is placed in 4% formaldehyde (Wako Pure Chemical Industries) at room temperature. The cells were fixed by soaking for a minute. Next, wash 2-3 times with 1XPBS, soak the cell membrane by soaking in 1XPBS containing 0.1- Trton-XlOO for 10 minutes, wash again with 1XPBS 2-3 times, soak in 0.53 ⁇ 4BSA / PBS, and wash at room temperature for 30 minutes. Then, the non-specifically adsorbed portion was blocked by BSA during this operation.
- the cells were diluted to 1 g / il with PBS containing the primary antibody, and the cells were immersed in this antibody diluent for 30 minutes to perform the primary antibody reaction.
- Three types of primary antibodies were used: F-actin, vinculin, and a mixture of F-actin and vinculin.
- stress fiber 1 increases (arrow) in the cell group to which ECP was added.
- the BALB / 3T3 cells and clone A3 Bok 11- 1 cells of the same cell in 24-well culture plates were seeded and cultured in l X l0 4 cel ls / wel l, culture in 5% FBS-containing DMEM culture medium 0.5 to 24 hours The soil was changed and the culture was continued. Further 24 hours later, lOiiM ROCK inhibitor (Y27632) was added along with 1 M ECP or RNaseA. Six hours later, the cells were collected, stained with antibodies, and observed for the formation of cytoskeleton with a microscope (objective lens X40). The results are as shown in FIG. The addition of a ROCK inhibitor inhibited the promotion of strain fiber formation by ECP, confirming that Rho kinase is involved in cell spermatogenesis by ECP.
- the cultured cardiomyocytes were dedifferentiated by culturing them in SFM (2 / M BrDU, 100 units / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin) for 48 hours. After that, the culture medium was changed, ECP at a final concentration of 100 ng / ml was added, and after 24 hours, the cells were washed three times with 1 XPBS for 10 minutes, and immersed in ⁇ paraformaldehyde for 30 minutes at room temperature, and the cells were washed. Fixed.
- the plate was immersed in PBS containing 0.25% Tritoii-X100 for 15 minutes at room temperature, and a 1:40 ratio of anti-ENH1 antibody and a 1: 100 ratio of anti- ⁇ -actinin antibody were added to a blocking buffer containing BSA. And soaked overnight at 4 to react. Next, the plate was washed with PBS containing 0.03% Triton-X100 for 20 minutes, and this was repeated three times. Cy3-labeled anti-mouse and Cy2-labeled anti-Egret IgG antibodies were added to the blocking buffer at a ratio of 1: 250, respectively, and reacted at 4 for 4 hours.
- FIG. 8 shows the results of immunofluorescence staining. As shown in FIG. 8, cardiac hypertrophy was confirmed in cardiac myocytes by ECP.
- Example 8 Effect of ECP on the beat rate of cardiomyocytes from neonatal rats
- Cardiomyocytes isolated from neonatal rats were dedifferentiated in the same manner as in Example 7, ECP (10 ng, 100 ng or 1 g per ml) was added to the culture medium, and the pulse rate was measured 24 hours later. Measured. '
- the results are as shown in FIG. It was confirmed that the myocardial cell beat rate increased in an ECP dose-dependent manner. Furthermore, the effect of a ROCK inhibitor (Y27632) on the effect of increasing the cardiomyocyte beat rate of this ECP was examined. The added amount of Y27632 was 0, 5, 10, or 15 ⁇ m, and the ECP concentration was 100 ng / il.
- Example 9 The effect PC12 cells ECP on cell survival under serum-free conditions of neuronal-like PC12 cells in 96-well culture plate, and cultured overnight at IX 10 4 cells / well / 100 .
- the medium used was a DMEM culture solution containing 103 ⁇ 4 FBS, penicillin and streptomycin. Then, wash once with 150 ml of DMEM, replace the medium with a DMEM culture solution containing 100 l of ECP, penicillin and streptomycin, incubate for 72 hours, and determine the number of viable cells using CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability. ity Assay (No.
- Example 10 Effect of ECP on alkaline phosphatase (ALP) activity of osteoblast-like MC3T3-E1 cells
- MC3T3-E1 cells were seeded in ⁇ -MEM medium in a 24-well culture plate, and ECP (final concentration: lng, 10 ng, lOOng or l / g / ml), BMP-4 (lOOng / ml) or WGF (lOOng / l ml) was added. After 72 hours, the cells were washed twice with a ⁇ Tris-HCl (pH 7.2) solution and lysed with a 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) solution containing 0.13 ⁇ 4 Triton-XlOO.
- the cell lysate was sonicated for 15 seconds to disrupt the cells, and 100 l of the cell lysate and a substrate solution (4 mg / ml p-nitorophenyl phosphate) adjusted to ⁇ .5 with 0.1 M aminomethylpropanol And 2IDM MgCl 2 ) 100 1 were mixed and reacted at 37 for 30 minutes.
- the reaction was stopped with 0.5 M NaOH, and the absorbance at 410 nm was measured. The obtained value was divided by the total protein amount of the cell lysate to calculate the specific activity.
- the results are as shown in FIG. The effect of each additive component was shown with the control set as 100%.
- ECP was added at lng / ml, ALP activity equivalent to or higher than that of BMP-4, a type of osteoinductive factor, was obtained.
- the invention of this application provides a therapeutic composition based on the novel physiological activity of ECP, and provides heart disease, bone disease and neurodegeneration caused by abnormal cell survival, proliferation and Z or differentiation. A new way is opened for treatment of diseases and the like. Also provided is a medium composition for extending the survival time of cultured cells, promoting growth and promoting Z or differentiation. In addition, means are provided for identifying novel factors that promote cell survival, proliferation and Z or differentiation, allowing the development of more effective therapeutic compositions.
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Abstract
好酸球カチオン性タンパク質と他の成分とを含有し、細胞の生存維持、増殖および/または細胞分化の障害を原因とする疾患に対する治療用組成物、および細胞の生存維持、増殖および/または細胞分化を促進する培地組成物。
Description
明細書 好酸球力チォン性タンパク質を含有する組成物 技術分野
この出願の発明は、好酸球カチオン性タンパク質を含有する組成物に関するも のである。 さらに詳しくは、 この出願は、 好酸球カチオン性タンパク質の新規生 理活性を利用する治療用組成物と細胞培地組成物、並びに好酸球カチオン性夕ン パク質の生理活性を指標とするスクリーニング方法に関するものである。 背景技術
好酸球カチオン性タンパク質 (eosinophil cat ionic protein： ¾ 「ECP」 と 記載する） は、 好酸球の活性化に伴って発現が上昇するタンパク質であり、 塩基 性顆粒中に存在する (Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 1986, 83 (10) : 3146- 3150)。 この ECPは、 寄生虫殺傷、 神経毒、 リンパ球増殖抑制、 殺菌、 ヒスタミン遊離、 リポヌクレア一ゼ、 凝固時間短縮等の活性を有することが知られており （日本臨 床 1993, 51 (3) : 60 (606) )、 特にそのヒスタミン遊離活性はアレルギー反応を惹 起することから、 ECPの発現抑制を薬理作用とする抗アレルギー薬が提案されて いる （特表 2002- 500506号公報)。 またこの ECPを含む好酸球細胞株を喘息薬や 抗アレルギ一薬のスクリーニングに利用することも提案されている （特開平 05 - 111382号公報)。
前記のとおり、 ECPの生理活性はこれまで、 細菌や動物細胞に対する毒性や増 殖抑制であると認識されてきた。
これに対し、 この出願の発明者らは、 ECPが動物細胞の生存維持や分化促進と いった新規の生理活性を有することを見出した。
この出願の発明は、発明者らが見出した ECPの新規活性を利用した新しい組成 物を提供することを課題としている。
また、 この出願は、 ECPの新規活性を指標として、 細胞の生存維持や分化を促
進させることを薬理作用とする治療薬剤を開発するための新しい方法を提供す ることを課題としている。 発明の開示
この出願は、前記の課題を解決するた ¾の第 1の発明として、細胞の生存維持、 増殖および Zまたは細胞分化の障害を原因とする疾患に対する治療用組成物で あって、好酸球カチオン性タンパク質と薬理学的成分とを含有することを特徴と する組成物を提供する。
この第 1発明の組成物においては、 細胞の生存維持、 増殖おょぴ Zまたは細胞 分化の障害を原因とする疾患が、 心臓疾患、 骨疾患または、 神経変性疾患である ことを好ましい態様としている。
またこの出願は、 第 2の発明として、 細胞の生存維持、 増殖および/または細 胞分化を促進する培地組成物であって、好酸球カチオン性タンパク質と細胞生物 学的成分とを含有する組成物を提供する。
さらにこの出願は、 第 3の発明として、 細胞の生存維持、 増殖および/または 細胞分化の障害を原因とする疾患に対する治療用組成物の有効成分物質をスク リーニングする方法であって、 細胞に候補物質を接触させ、 好酸球カチオン性夕 ンパク質と同程度またはそれ以上に細胞の生存維持および Zまたは細胞分化を 促進させる物質を目的物質として特定することを特徴とするスクリーニング方 法を提供する。
この第 3発明においては、 細胞が、 神経細胞、 骨細胞、 心筋細胞または線維芽 細胞であることを好ましい態様としている。
すなわち、 この出願の発明者らは、 従来は細胞毒性や細胞の増殖抑制を生理活 性とするものと考えられてきた ECPについて、以下のとおりの新たな活性を見出 した。
(1) 線維芽細胞の増殖促進とストレスファイバ一の形成促進。
(2) 心筋細胞の筋繊維の成熟と、 拍動数の上昇。
(3) 低血清または無血清培地での神経細胞の生存率の向上。
(4) 骨芽細胞の分化促進。
そしてまた、 前記の活性は、 細胞のシグナル伝達経路において重要な役割を果 たしている低分子量 Gタンパク質 Ehoキナーゼの基質 (ROCK) に対する阻害剤に よって抑制もしくは消失することから、 ECPが細胞のシグナル伝達経路に作用し、 前記（1)〜 (4)の活性をもたらすことを見出してもいる。 図面の簡単な説明
図 1は、正常組織由来細胞株の増殖に対する ECPの効果を試験した結果である。 黒丸は BALB/c 3T3細胞、 S角は A10 H胞、 四角は HC- 11細胞、 白丸は HUVEC細 胞である。
図 2は、 BALB/c 3T3細胞の増殖に対する ECPの用量依存効果を試験した結果で める
図 3は、 BALB/c 3T3の増殖に対する ECPの経時効果を試験した結果である。 黒 丸は EPC、 黒四角は RNase、 白四角はコントロールである。
図 4は、 低血清培地での BALB/c 3T3増殖に対する ECPの効果を試験した結果 (位相差顕微鏡像） である。
図 5は、 低血清培地での BALB/c 3T3細胞骨格分子形成に対する ECP効果を試 験した結果 （共焦点レーザ一顕微鏡像） である。
図 6は、 低血清培地での BALB/c 3T3細胞骨格分子形成に対する ECP+bFGF効 果を試験した結果 （共焦点レーザー顕微鏡像） である。
図 7は、 BALB/c 3T3細胞の細胞骨格形成に対する ECP効果と ROCK阻害剤の効 果を試験した結果 （共焦点レーザー顕微鏡像） である。
図 8は、新生仔ラット由来の心筋細胞における細胞骨格形成に対する ECP効果 を試験した結果 （共焦点レーザー顕微鏡像） である。
図 9は、新生仔ラット由来の心筋細胞の拍動数に対する ECP効果を試験した結 果である。
図 1 0は、 心筋細胞拍動数に対する ECPと ROCK阻害剤の効果を試験した結果 である。
図 1 1は、 無血清培養液における神経様 PC12細胞の生存に対する ECPの効果 を試験した結果である。 カラムは、 1 ： ECP添加前、 2： ECP O ng/mL 3： ECP 10
ng/mL 4 ： ECP 1000 ng/mlの平均値である。
図 1 2は、 ラット頭蓋冠骨由来の MC3T3-E1細胞におけるアルカリフォスファ ターゼ活性に対する ECP効果を試験した結果である。 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見を基礎とするものである。以下、 この出願の各発明について、 実施形態を詳しく説明する。
この出願の各発明において使用する ECPは、 ヒトをはじめとする各種哺乳動物 の細胞 （白血球や造血幹細胞） から公知の方法によって単離することができる。 また、 そのアミノ酸発列 （ヒト ECP： GenBank/X15161、 チンパンジー ： GenBank/AF294028、 ゴリラ： GenBank/U24097)等に基づいて公知の固相ペプチド 合成法により化学合成して作製することもできる。 あるいは、 それぞれのぺプチ ドをコードするポリヌクレオチドを in vitro転写翻訳系や適当な宿主一べクタ 一系で発現させることによって、 組換え ECPとして取得することができる。 ポリ ヌクレオチド （例えば ECP cDNA) は前記 GenBankデータベースの塩基配列情報に 基づき作製したオリゴヌクレオチドプロ一ブを用いて既存の cDNAライブラリー をスクリーニングする方法や、 オリゴヌクレオチドプライマーを用いた T-PCR 法等の公知の方法により取得することができる。
例えば組換え ECPを in vitro転写翻訳で作製する場合には、 前記ポリヌクレ ォチドを、 NAポリメラーゼプロモー夕一を有するベクターに挿入して発現べク 夕一を作製し、 このべクタ一を、 プロモーターに対応する K ポリメラーゼを含 むゥサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのィンビトロ翻訳系に添加す る。 RNAポリメラーゼプロモーターとしては、 T7、 T3、 SP6などが例示できる。 これらの RNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、 pKAl、 pCDM8、 pT3/T7 18、 pT7/3 19、 pBluescript IIなどが例示できる。
組換え ECPを、 大腸菌などの微生物で発現させる場合には、 微生物中で複製可 能なオリジン、 プロモータ一、 リボソーム結合部位、 DNAクローニング部位、 夕 —ミネ一夕一等を有する発現ベクターに前記の DNA断片を組換えた発現ベクター を作成し、培養物から融合ペプチドを単離する。大腸菌用発現べクタ一としては、
pUC系、 pBluescript II、 pET発現システム、 pGEX発現システムなどが例示でき る。
また組換え ECPを真核細胞で発現させる場合には、前記の融合ポリヌクレオチ ドを、 プロモータ一、 スプライシング領域、 ポリ（A)付加部位等を有する真核細 胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば 融合ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとし ては、 KAK pCDM8、 pSVK3、 pMSG、 pSYL、 pBK-CMV, pBK-RSV, EBVベクタ一、 pRS、 pcDNA3、 pMSG、 pYES2などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞 C0S7、 チャイニーズハムスター卵巣細胞 CH0などの哺乳動物培養細胞、 出芽酵母、 分裂 酵母、 カイコ細胞、 アフリカッメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、 目的 とするタンパク質を発現できるものであれば、 いかなる真核細胞でもよい。 発現ベクターを宿主細胞に導入するには、 電気穿孔法、 リン酸カルシウム法、 リポソ一ム法、 DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。 融合ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、 培養物から組換え ECP を単離精製するためには、 公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例 えば、 尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、 超音波処理、 酵素消化、 塩析 や溶媒沈殿法、 透析、 遠心分離、 限外濾過、 ゲル濾過、 SDS- PAGE、 等電点電気泳 動、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ 一クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
なお、 ECPは分泌性夕ンパク質であり、 例えばヒト ECPの場合にはその N端側 の 23アミノ酸配列が分泌シグナルである。 従って、 原核細胞や真核細胞で組換 え ECPを発現させる場合には、その培養物からの組換え ECPの回収効率を考慮し て、 分泌シグナル配列より C端側 （例えば第 28位 Arg以降） の活性領域を発現 させることが好ましい。
第 1発明の組成物は、前記のとおりの ECPと薬理学的成分とを含有することを 特徴とする医療用組成物であり、 細胞の生存維持、 増殖および Zまたは細胞分化 の障害を原因とするヒト疾患の治療に用いられる。 すなわち、 このような疾患は 生体の各種組織細胞の正常なライフサイクル （増殖、 分化、 細胞死等） の異常に よって発症する疾患であり、遺伝や様々な細胞障害物質を原因とする各種の疾患
を対象とすることができる。 特には、 心臓疾患、 骨疾患および神 変性疾患の完 洽、 寛解または症状の改善に使用することができる。 心臓疾患としては、 心筋の 細胞骨格の形成以上や変性等を原因とする心筋梗塞、 心筋炎、 心筋症 （拡張型心 筋症、 肥大型心筋症、 拘束型心筋症、 内腔閉鎖型心筋症等)、 心筋線維症などで ある。 骨疾患としては、 特に造骨細胞 （骨芽細胞） の分化障害を原因とする骨粗 鬆症ゃ歯周病である。 またこの洽療用組成物は骨折後の骨組織再生のためにも使 用することができる。 神経変性疾患としては、 神経細胞の変性や細胞死を原因と するアルツハイマー病、.老年性痴呆、 ダウン症、 パーキンソン病、 クロイツ'フエ ルト 'ヤコブ病、 筋萎縮性脊髄側索硬化症、 ニューロパチ一等である。
この第 1発明の医療用組成物の成分である 「薬学的成分」 とは、 第 1には、 通 常の薬剤製造に用いられる各種の担体を意味する。 担体は、 対象疾患の種類や薬 剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜に選択することができるが、 この発明の 医療用組成物は、経口的にまたは注射により投与しうる単位服用形態にあること が望ましい。 特に、 注射による投与の場合には、 局所注入、 腹腔内投与、 選択的 静脈内注入、 静脈注射、 皮下注射、 臓器灌流液注入等を採用することができる。 懸濁剤およびシロップ剤のような経口液体調製物は、 水、 シユークロース、 ソ ルビトール、フラクト一ス等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、 ゴマ油、 大豆油等の油類、 アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、 ス トロべリー.フレーバー、 ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造する ことができる。
散剤、 丸剤、 カプセル剤および錠剤は、 ラクト一ス、 グルコース、 シュ一クロ ース、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ソ一ダ等の崩壊剤、 マグ ネシゥムステアレート、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシ プロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の表面活性剤、 グ リセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤およびカプセル剤 は、 投与が容易であるという点において、 この発明の組成物における好ましい単 位投与形態である。 錠 やカプセルを製造する際には、 固体の製薬担体が用いら れる。
また、 注射用の溶液は、 塩溶液、 グルコース溶液、 または塩水とグルコース溶
液の混合物、 各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。 ま た粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するよう にしてもよい。
この発明の医療用組成物の投与量は、 患者の年齢や体重、 症状、 投与経路等に よって異なるが、 ECPの血中濃度が 10nmol〜0. 1顧 ol、好ましくは 5nmol〜0. 5画 ol 程度となる量を投与すればよい。
薬学的成分の第 2は、 ECPを細胞内に導入可能な形態とするための成分である。 例えば、 このポリペプチドの構造や機能を変更することなく、 かつ薬理学的に許 容される溶液にこのポリペプチドを混合して組成物とすることができる。 このよ うな組成物は、例えばマイクロインジェクション法により鉀胞内に導入する方法 や、脂質（例えば、 BioPORTER (Gene Therapy Systems社、米国）、 Chariot "(Act ive Motif 社、 米国） 等） を用いた細胞内導入法によって標的細胞に導入することが できる。
薬学的成分の第 3は、 ECPをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能 な形態とするための成分である。すなわち、 ポリヌクレオチドを真核細胞用の発 現ベクターに組み込み、 このベクターを、 例えば生体認識分子を提示した中空ナ ノ粒子、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス等に組み込むよ うにすればよい。 このような組成物は、 遺伝子治療の手法により生体内の標的細 胞に導入することができる。
この出願の第 2の発明は、好酸球カチオン性タンパク質と細胞生物学的成分と を含有する培地組成物であって、 培養細胞の生存維持、 増殖および Zまたは細胞 分化を促進させるための使用することができる。
「細胞生物学的成分」とは、細胞の生存、増殖、分化等に必須の成分であって、 具体的には通常の動物細胞培地を構成する成分である。 具体的には、 緩衝液（リ ン酸塩一炭酸水素ナトリウムと二酸化炭素ガスなど)、 塩類、 グルコース、 ビタ ミン、アミノ酸等の有機物質、血清（ゥシ胎児血清: FBS)や栄養因子 (Growth Factor in Serum： GFS) 等である。 これらの成分と ECP とを適宜に混合することによつ てこの発明の培地組成物を製造することができる。各成分の含有量は通常の動物 培養培地と同程度とすることができる。 ECPは、 細胞の種類や目的に応じて適宜
とすることができるが、培地 111に対して 0. 001〜10 / 程度とすることができる。 「細胞」 は、 通常の動物細胞の対象となる細胞を用いることができるが、 特に、 神経細胞、 骨細胞、 心筋細胞、 線維芽細胞等が好ましい。 またこれらの細胞は、 動物組織から単離した初代細胞、 継代細胞、 株化細胞、 あるいは外来遺伝子を導 入した形質転換細胞であってもよい。 「培養」は、浮遊細胞の場合には浮遊培養、 接着性細胞の場合には単層培養または 3次元培養として行うことができる。 また 中空性ポリマー管内でのホロファイバー培養としてもよい。
この第 2発明の培地組成物を用いた培養によつて、培養細胞を長期間に渡つて 生存させ、 または機能発現のために分化させることができる。 このため、 この組 成物を用いた培養系は、 細胞の生存、 細胞骨格形成、 増殖、 分化といった細胞生 物学的事象、 あるいはこれらの事象を司るシグナル伝達カスケード （特に Rhoキ ナーゼ経路） の解明に有用である。 また、 この組成物は、 細胞を機能発現状態に 分化させ、 あるいは細胞を長期間に渡って生存させることができるため、 有用物 質の製造 ひ ィォリアクタ一等） にも利用することこができる。
さらに、 この発明の培地組成物は、 ECPを含有することによって、 低血清や無 血清であっても神経細胞等を長期間に渡って生存させることができる。 このため、 ECP以外のタンパク質成分が少ない、 または全くない状態で細胞機能を解析する ことができるため、細胞の特定機能に作用するタンパク質因子等をスクリーニン グするための系としても有用である。
この出願の第 3の発明は、 細胞の生存維持、 増殖および/または細胞分化の促 進作用を有する、 ECP以外の新規因子を特定するためのスクリーニング方法であ る。 すなわち、 細胞に候補物質を接触させ、 その細胞の生存期間あるいは分化状 態を測定する。 そして、 この測定値が、 ECPを細胞に接触させた時の測定値と同 程度またはそれ以上である場合に、試験した候補物質が目的因子であると決定す ることができる。細胞の生存は、 例えばトリパンブルー染色法等の公知の方法で 行うことができる。細胞の増殖は、 一定期間の培養後の生細胞数を計測すること によって行うことができる。 また細胞の分化は、 分化細胞に特有のマーカ一を対 象とする免疫染色やウェスタンプロット分析、 RT- PCR法等によって行うことがで きる。
細胞は、 ECPの接触によってその生存期間を延長させる細胞、 増殖または分化 を促進させる細胞であり、 具体的には、 神経細胞、 骨細胞、 心筋細胞、 線維芽細 胞等が好ましい。 またこれらの細胞は、 動物組織から単離した初代細胞、 継代細 胞、 株化細胞、 あるいは外来遺伝子を導入した形質転換細胞であってもよい。 こ れらの細胞は、 通常の動物細胞培養と同一の条件下で試験することができる。 な お、 細胞の生存を試験する場合には、 血清や成長因子が存在しない条件下で培養 することが好ましい。 さらに、 これらの細胞は、 動物個体内にある細胞であって もよい。
「候補物質」 は、 例えば、 未知および既知の有機または無機化合物、 タンパク 質、 ペプチド、 ポリヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド等である。 これらの候補 物質を細胞に接触させる場合には、 候補物質を培養細胞の培地に添加する方法、 培養細胞または動物個体内の細胞に候補物質を導入する方法（マイクロインジェ クシヨンや脂質による細胞内導入法） 等を採用することができる。 また、 候補物 質がポリヌクレオチドゃオリゴヌクレオチドの場合には、その発現ベクターを公 知の方法で細胞にトランスフエクシヨンしたり、遺伝子治療の方法に準じて動物 個体にウィルスベクタ一を感染させてもよい。
このスクリーニング方法によって特定される新規因子は、 単独で、 または ECP との組み合わせによって、 治療用組成物や培地組成物の有効成分となりうる。 以下、 '実施例として、 ECPの新規生理活性を確認するために行った試験研究の 結果を示して、 この出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、 こ の出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。 実施例
実施例 1 ：正常組織由来細胞株の増殖に対する ECPの効果
マウス線維芽細胞株 （BALB/c 3T3)、 大動脈平滑筋細胞株 （Α10)、 マウス乳腺 内皮細胞株 (HC-11)およびヒト臍帯血管内皮細胞株 (HUVEC)の増殖に対する ECP の効果を、 10% FBSの 在下で解析した。 まず、 96穴培養プレートの 10% FBS含 有 DMEM培養液中に 500 cells/wellになるように各細胞を播種した。 24時間、 5 C02に維持した培養庫で培養し、 0から IO Mの各濃度の ECPおよび ENaseAを添
加し、 8時間、同じ培養庫で培養を続けた。そして、 3- (4， 5-dimetliyl thiazol-2-y l) -diphenyl-tetrazol ium broiide (MTT) を添加し、 各細胞の増殖率を求めた。 その結果を図 1に示した。 この図 1から明らかなように、 BALB/c 3T3細胞は ECPの添加により、 細胞増殖が促進されることが確認された。 一方その他の細胞 株は、 ECPによる増殖促進がないか、 または増殖が抑制された。
実施例 2 ： BALB/c 3T3細胞増殖に対する ECPの効果
96穴培養プレートの 10 FBS含有 DMEM培養液中に BALB/c 3T3 A31-K細胞を 1000 cel ls/wellの濃度で播種した。 24時間後、最終濃度 Ι μΜの ECPまたは NaseA をそれぞれ培養液中に添加した。 48時間培養を続けた後に生細胞数を測定した。 結果は図 2に示したとおりである。 ECPは何れの濃度においても有意に細胞増 殖を促進させた。 一方、 RNaseAには増殖促進効果は見られなかった。
実施例 3 ： BALB/c 3T3細胞増殖の経時変化に対する ECPの効果
96穴培養プレートの 10% FBS含有 DMEM培養液中に BALB/c 3T3細胞を 1000 cells/wel lの濃度で播種した。 培養 24時間後、 I M ECPまたは I M RNaseAを それぞれ lng/ilになるように培養液中に添加した。 4日間培養を続け、 24時間 ごとに生細胞数を測定した。 なお、 培養 2日目に培養液の交換を行った。
結果は図 3に示したとおりである。 培養 2日目の培地交換ののち、 ECP添加条 件では細胞の増殖が著しく促進された。
実施例 4：低血清条件下での BALB/3T3細胞増殖に対する ECPの効果
24穴培養プレートの 10% FBS含有 DMEM培養液に、 2 X 104cel Is/wel lになるよ うに BALB/c 3T3細胞を播種し培養した。 24時間後、培養細胞が安定したら、 0. 5% FBSを含む DMEM培養液に培地を交換して培養を続けた。 24時間後、 1 Mの ECP および RnaseA、 60pMの bFGFをそれぞれ組み合わせて培養液に添加し、さらに 48 時間培養を行った後、各条件下で培養した細胞を位相差顕微鏡（対物レンズ X 20) にて観察した。
結果は図 4に示したとおりである。 細胞は bFGF単独で増殖したが、 FGF+ECP の条件でさらに顕著な細胞増殖効果が観察された。
実施例 5 ：低血清条件下での BALB/c 3T3細胞骨格分子に対する ECPの効果 24穴培養プレートに予め滅菌した直径 15ιπιの丸型カバ一ガラスを置き、 0. 1¾
ゼラチンを含む IXリン酸緩衝液 (PBS)を各ゥエルにカバ一ガラスが十分浸たる 程度に入れて、 30分間室温に放置し、 カバ一ガラスをゼラチンコートした。各ゥ エルに 10% FBS含有 DMEM培養液を充填し、 BALBc/3T3細胞を 2X 104cells/well になるように播種して培養した。 24時間後、 0.5¾ FBS含有 DMEM培養液に培地を 交換した。 さらにその 24時間後、 1 iMの ECPまたは RNaseAをそれぞれ培養液 に添加した。 6時間後に BALB/c 3T3細胞が生育したカバーガラスをゥエルから取 り出して、 1XPBSで 2-3回洗浄した後、 カバーガラスを 4%フオルムアルデヒド (和光純薬工業社）に室温で 10分間浸して細胞を固定した。次に、 1XPBSで 2 - 3 回洗浄し、 0.1¾ Trton-XlOOを含む 1XPBSに 10分間浸して細胞膜を溶解させ、 1XPBSで 2- 3回再度洗浄し、 0.5¾BSA/PBSに浸けて室温で 30分間放置し、 この 操作中の BSAによって非特異的吸着部分をプロックした。 1次抗体を含む PBSで ll g/ilに希釈し、 細胞をこの抗体希釈液に 30分間浸し、 1次抗体反応を行つ た。 1次抗体は、 F-actin、 vinculinおよび F- actinと vinculinの混合の 3種類 を用いた。
次に、 5分毎に新しい 1XPBSに交換 ·洗浄を行い、 2次抗体として RITC結合 型ャギ抗マウス IgG抗体（CHEMICON社）を 10 g/ml、 10 Mの FITC- phalloidin/ メタノール （Molecular Probes社） を ΙΟΟπΜになるように 1XPBS中で混合し、 細胞をこの抗体希釈液に 30分間浸して反応させた。 その後、 5 分毎に新しい 1XPBSに交換 ·洗浄し、 等量の 1XPBS :グリセロール溶液を挟んで前記の丸型 カバーガラスをスライドガラスに落とし、 共焦点レーザー顕微鏡 （MRC— 1024、 Bio- Rad社） で観察した。
結果は図 5に示したとおりである。 ECPを加えた場合の細胞群には、 多くの細 胞骨格分子 (ストレスファイバ一) の形成が増加 （矢印） していることが確認さ れた。
また、 1 Mの ECPまたは RNaseAに加え、 それぞれ 60pMの bFGFを添加して同 様に細胞骨格形成を観察した。
結果は図 6に示した'とおりであり、 ECPと WGFの共存下では細胞骨格分子がよ り顕著に形成されることが確認された。
実施例 6 ： ECPによる細胞骨格形成に対する ROCK阻害剤の効果
24穴培養プレートで BALB/3T3細胞および同細胞のクローン A3卜 11- 1細胞を l X l04cel ls/wel lで播種し培養し、 24時間後に 0. 5% FBS含有 DMEM培養液に培 地を交換し、 培養を続けた。 そのさらに 24時間後、 1 Mの ECPまたは RNaseA とともに、 lO iiMの ROCK阻害剤 (Y27632) を添加した。 6時間後細胞を回収し、 抗体染色を行い、 顕微鏡 （対物レンズ X40) で細胞骨格の形成を観察した。 結果は図 7に示したとおりである。 ROCK阻害剤を添加することによって、 ECP によるストレズファイバ一形成促進が阻害されたことから、 ECPによる細胞脊格 形成には Rhoキナーゼが関与していることが確認された。
実施例 7 ：新生仔ラット由来の心筋細胞に対する ECPの効果
心筋培養細胞を SFM (2/ M BrDU、 lOOunit/mlペニシリン、 100 g/mlストレブ トマイシン） 中で 48時間培養して脱分化させた。 その後、 培養液を交換し、 最 終濃度 100ng/mlの ECPを添加し、 さらに 24時間後、 1 XPBSで 10分間、 3回洗 浄し、 ^パラフオルムアルデヒドに 30分間室温で浸し、 細胞を固定した。 そし て、 0. 25% Tritoii-X100を含む PBSに 15分間室温で浸し、 BSA含有のブロッキン グバッファーに、 抗 ENH1抗体を 1： 40の割合で、 抗 α-ァクチニン抗体は 1： 100 の割合で添加し、 4でで一晩浸し反応させた。 次に、 0. 03¾ Triton-X100含有 PBS で 20分間洗浄し、 これを 3回繰り返した。 ブロッキングバッファーに Cy3標識 抗マウスおよび Cy2標識抗ゥサギ IgG抗体をそれぞれ 1： 250になるよう添加し、 4でで 4時間反応させた。 反応後、 再度 0. 03¾ Tri ton-XlOO含有 PBSで 20分間洗 浄し、 これを 3回繰り返し、 水分を除去して、 90%グリセロールを加えた。 図 8は免疫蛍光染色の結果である。 この図 8に示したように、 ECPによって心 筋細胞に心肥大化作用が確認された。
実施例 8 ：新生仔ラット由来の心筋細胞の拍動数に対する ECPの効果
新生仔ラットから単離した心筋細胞を、 実施例 7と同様にして脱分化し、 ECP (lml当たり 10ng、 100ngまたは 1 g) を培養液に添加して、 その 2 4時間後に 拍動数を計測した。 '
結果は図 9に示したとおりである。心筋細胞拍動数が ECP用量依存的に増加す ることが確認された。
さらに、 この ECPの心筋細胞拍動数の増加効果に対する ROCK阻害剤 (Y27632) の効果を試験した。 Y27632の添加量は 0、 5、 10または 15 Λ Μとし、 ECP濃度は 100ng/ilとした。
結果は図 1 0に示したとおりである。 ROCK阻害剤によって、 ECPによる拍動数 の増加が消失することから、 この ECP活性がシグナル伝達カスケードにおける Rhoキナーゼ経路に依存することが確認された。
実施例 9 ：神経様 PC12細胞の無血清条件下での細胞生存に対する ECPの効果 PC12細胞を 96穴培養プレートで、 I X 104cells/well/100 で一晩培養した。 培地は、 10¾ FBS, ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する DMEM培養液 を使用した。 その後、 150 1の DMEMで 1回洗浄し、 100 lの ECP、 ペニシリン およびストレブトマイシンを含有する DMEM培養液に培地を交換し、 72時間培養 を行い、 生存細胞数を CellTiter-GloTMLuminescent Cel l Viabil ity Assay (No.
G7570 ; Promega社） で計測した。
結果は図 1 1に示したとおりである。 ECP添加によって、 神経細胞の生存が維 持されることが確認された。
実施例 1 0：骨芽細胞様 MC3T3- E1細胞のアルカリフォスファタ一ゼ (ALP)活性に 対する ECPの効果
MC3T3-E1細胞を 24穴培養プレート中の α— MEM培地に播種し、 ECP (最終濃度 として 1ml当たり lng、 10ng, lOOngまたは l / g)、 BMP-4 (lOOng/ml)または WGF (lOOng/ml) を添加した。 72時間後、 細胞を ΙΟπιΜ Tris-HCl (pH7. 2) 溶液で 2 回洗浄し、 0. 1¾ Tri ton-XlOO含有の 10mM Tris-HCl (pH7. 2) 溶液で溶解した。 次に、 前記細胞溶解液を 15秒間、 超音波処理いて細胞を破碎し、 この細胞破砕 液 100 l と 0. 1Mアミノメチルプロパノールで ρΗΙΟ. 5 に調整した基質溶液 (4mg/ml p-nitorophenyl phosphateおよび 2IDM MgCl2) 100 1を混合し、 37で で 30分間反応させた。 この反応を 0. 5Mの NaOHにて停止させ、 410nmの吸光度を 測定した。得られた値を細胞破碎液の総タンパク質量で割り、比活性を算出した。 結果は図 1 2に示したとおりである。コントロール置を 100%として各添加成分 の効果を示した。 ECPを lng/ml添加した場合、 骨誘導因子の一種である BMP- 4 と同等以上の ALP活性が得られた。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 ECPの新規生理活性に 基づく治療用組成物が提供され、 細胞の生存、 増殖および Zまたは分化の異常を 原因とする心臓疾患、骨疾患および神経変性疾患等の治療に新たな途が拓かれる。 また、 培養細胞の生存期間の延長、 増殖促進および Zまたは分化促進のための培 地組成物が提供される。 さらには、 細胞の生存、 増殖および Zまたは分化を促進 する新規因子を特定するための手段が提供され、 さらに有効な治療用組成物の開 発が可能となる。
Claims
1 . 細胞の生存維持、 増殖および/または細胞分化の障害を原因とする疾患に 対する治療用組成物であって、好酸球カチオン性タンパク質と薬理学的成分とを 含有することを特徴とする組成物。
2 . 細胞の生存維持、増殖および Zまたは細胞分化の障害を原因とする疾患が、 心臓疾患、 骨疾患または、 神経変性疾患である請求項 1の組成物。
3 . 細胞の生存維持、 増殖および Zまたは細胞分化を促進する培地組成物 ぁ つて、 好酸球力チォン性タンパク質と細胞生物学的成分とを含有する組成物。
4. 細胞の生存維持、 増殖および/または細胞分化の障害を原因とする疾患に 対する治療用組成物の有効成分物質をスクリーニングする方法であって、細胞に 候補物質を接触させ、好酸球カチオン性タンパク質と同程度またはそれ以上に細 胞の生存維持および/または細胞分化を促進させる物質を目的物質として特定 することを特徴とするスクリーニング方法。
5 . 細胞が、 神経細胞、 骨細胞、 心筋細胞または線維芽細胞である請求項 4の スクリーニング方法。
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