JP2000186045A - 骨吸収抑制剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】新規な骨吸収抑制剤を提供する。
【構成】白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化
タンパク質因子由来の物質が骨吸収抑制作用を有するこ
とを見出し、このものの新規な医薬用途を提供した。
タンパク質因子由来の物質が骨吸収抑制作用を有するこ
とを見出し、このものの新規な医薬用途を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、白血球活性化タンパク
質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を有
効成分とすることを特徴とする骨吸収抑制剤に関する。
さらに、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化
タンパク質因子由来の物質を利用した骨吸収抑制剤のス
クリーニング方法に関する。
質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を有
効成分とすることを特徴とする骨吸収抑制剤に関する。
さらに、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化
タンパク質因子由来の物質を利用した骨吸収抑制剤のス
クリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】白血球活性化タンパク質因子［以下ＬＥ
ＣＴ２（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅ
ｍｏｔａｘｉｎ ２）と称することもある。］は鈴木和
男らにより見出された好中球走化性因子である（特開平
８−１４０６８３公報）。ヒトおよびウシＬＥＣＴ２に
ついてはクローニングが行われ、その塩基配列が決定さ
れている（Ｓ．Ｙａｍａｇｏｅ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ５２， ９−１３， １９９
６、 Ｓ．Ｙａｍａｇｏｅ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３９６，
１０５−１１３， １９９８）。ヒトＬＥＣＴ２のｍＲ
ＮＡはシグナルペプチドと考えられる１８個のアミノ酸
配列を含む１５１アミノ酸をコードすることが明らかと
なっている。ウシおよびヒトＬＥＣＴ２のアミノ酸配列
は、ニワトリ由来のｍｉｍ−１遺伝子産物と高いホモロ
ジーをもっており、このｍｉｍ−１遺伝子産物の機能は
不明であるが、骨髄の前骨髄球の顆粒に含まれ、癌遺伝
子のｍｙｂが発現調節に関わっていることが知られてい
る。
ＣＴ２（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅ
ｍｏｔａｘｉｎ ２）と称することもある。］は鈴木和
男らにより見出された好中球走化性因子である（特開平
８−１４０６８３公報）。ヒトおよびウシＬＥＣＴ２に
ついてはクローニングが行われ、その塩基配列が決定さ
れている（Ｓ．Ｙａｍａｇｏｅ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ５２， ９−１３， １９９
６、 Ｓ．Ｙａｍａｇｏｅ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３９６，
１０５−１１３， １９９８）。ヒトＬＥＣＴ２のｍＲ
ＮＡはシグナルペプチドと考えられる１８個のアミノ酸
配列を含む１５１アミノ酸をコードすることが明らかと
なっている。ウシおよびヒトＬＥＣＴ２のアミノ酸配列
は、ニワトリ由来のｍｉｍ−１遺伝子産物と高いホモロ
ジーをもっており、このｍｉｍ−１遺伝子産物の機能は
不明であるが、骨髄の前骨髄球の顆粒に含まれ、癌遺伝
子のｍｙｂが発現調節に関わっていることが知られてい
る。
【０００３】走化性因子として発見されたＬＥＣＴ２の
作用については、好中球を活性化することによって、が
ん細胞破壊反応の亢進や、インターロイキン類の分泌の
促進等が誘導され、自然免疫能が高められるので、腫瘍
免疫としての治療、診断、予後の判定に利用できること
が示唆されている。ＬＥＣＴ２は好中球の活性化に関連
する作用が知られているのみであり、骨に対する作用に
ついては全く知られていなかった（蛋白質 核酸 酵素
４２， （７）， １０８６， １９９７）。
作用については、好中球を活性化することによって、が
ん細胞破壊反応の亢進や、インターロイキン類の分泌の
促進等が誘導され、自然免疫能が高められるので、腫瘍
免疫としての治療、診断、予後の判定に利用できること
が示唆されている。ＬＥＣＴ２は好中球の活性化に関連
する作用が知られているのみであり、骨に対する作用に
ついては全く知られていなかった（蛋白質 核酸 酵素
４２， （７）， １０８６， １９９７）。
【０００４】一方、鈴木不二男らは、ウシ胎児軟骨より
精製された分子量約１６ＫＤａのタンパク質であるコン
ドロモジュリン２を精製した（Ｙ．Ｈｉｒａｋｉ ｅｔ
ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１，
２２６５７−２２６６２，１９９６）。コンドロモジュ
リン２は軟骨細胞を増殖、分化を促進することが示され
ており（特開平５−２５５３９８公報）、また、破骨細
胞の形成促進、破骨細胞活性化作用も有することが明ら
かになっている（特開平８−２７０２０公報）。最近に
なり、ホモロジー検索の結果、ＬＥＣＴ２とコンドロモ
ジュリン２は同一であることが明らかとなった。
精製された分子量約１６ＫＤａのタンパク質であるコン
ドロモジュリン２を精製した（Ｙ．Ｈｉｒａｋｉ ｅｔ
ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１，
２２６５７−２２６６２，１９９６）。コンドロモジュ
リン２は軟骨細胞を増殖、分化を促進することが示され
ており（特開平５−２５５３９８公報）、また、破骨細
胞の形成促進、破骨細胞活性化作用も有することが明ら
かになっている（特開平８−２７０２０公報）。最近に
なり、ホモロジー検索の結果、ＬＥＣＴ２とコンドロモ
ジュリン２は同一であることが明らかとなった。
【０００５】破骨細胞は骨組織で吸収を目的として存在
し、骨のリモデリングに重要な働きをしている多核巨細
胞である。破骨細胞の前駆細胞は、造血幹細胞に由来す
る細胞で、血流を介して骨表面に運ばれ、破骨細胞へと
分化する。一方、骨芽細胞は、未分化間葉系細胞や線維
芽細胞、間質細胞などの基質形成細胞系に属する前駆細
胞から分化し、破骨細胞とはまったく細胞系列の異なる
前駆細胞から由来している。骨は、常に骨の形成と骨の
吸収を繰り返し、骨リモデリングを行っている。組織学
的には骨リモデリングは、破骨細胞による骨吸収が行わ
れ、その後、吸収された部位に骨芽細胞によって骨が作
られ、バランスが保たれている。加齢に伴い種々の原因
でそのバランスに異常が生じると、骨量が滅少し、この
状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨
折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。
し、骨のリモデリングに重要な働きをしている多核巨細
胞である。破骨細胞の前駆細胞は、造血幹細胞に由来す
る細胞で、血流を介して骨表面に運ばれ、破骨細胞へと
分化する。一方、骨芽細胞は、未分化間葉系細胞や線維
芽細胞、間質細胞などの基質形成細胞系に属する前駆細
胞から分化し、破骨細胞とはまったく細胞系列の異なる
前駆細胞から由来している。骨は、常に骨の形成と骨の
吸収を繰り返し、骨リモデリングを行っている。組織学
的には骨リモデリングは、破骨細胞による骨吸収が行わ
れ、その後、吸収された部位に骨芽細胞によって骨が作
られ、バランスが保たれている。加齢に伴い種々の原因
でそのバランスに異常が生じると、骨量が滅少し、この
状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨
折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。
【０００６】骨吸収抑制作用を有する薬剤としては、エ
ストロジェン、カルシトニン、ビスフォスフォネート等
が知られているが、いずれも副作用が報告されており、
効果的に破骨細胞による骨吸収を抑制することができ、
しかも安全性の高い薬剤が望まれていた。
ストロジェン、カルシトニン、ビスフォスフォネート等
が知られているが、いずれも副作用が報告されており、
効果的に破骨細胞による骨吸収を抑制することができ、
しかも安全性の高い薬剤が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】解決しようとする問題
点は、新規な骨吸収抑制剤を提供することである。
点は、新規な骨吸収抑制剤を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明はＬＥＣＴ２又は
ＬＥＣＴ２由来の物質が骨吸収抑制作用を有することを
見出したことを最も主要な特徴とする。そして、この情
報を利用して新規な骨吸収抑制剤を提供することを実現
した。
ＬＥＣＴ２由来の物質が骨吸収抑制作用を有することを
見出したことを最も主要な特徴とする。そして、この情
報を利用して新規な骨吸収抑制剤を提供することを実現
した。
【０００９】本発明者らはＬＥＣＴ２の新規な作用を見
出すため、鋭意検討を行った結果、骨に対する作用とし
て、骨吸収を抑制する作用、特に破骨細胞に対する骨吸
収抑制作用を見出し、本発明を完成した。すなわち、本
発明はＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２由来の物質を有効成分
とする骨吸収抑制剤に関する。さらに詳しくは、配列表
の配列番号１のアミノ酸番号１〜１５１番又は１９番〜
１５１番で表されるアミノ酸配列を有するＬＥＣＴ２又
はＬＥＣＴ２由来の物質を有効成分とする骨吸収抑制剤
に関する。
出すため、鋭意検討を行った結果、骨に対する作用とし
て、骨吸収を抑制する作用、特に破骨細胞に対する骨吸
収抑制作用を見出し、本発明を完成した。すなわち、本
発明はＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２由来の物質を有効成分
とする骨吸収抑制剤に関する。さらに詳しくは、配列表
の配列番号１のアミノ酸番号１〜１５１番又は１９番〜
１５１番で表されるアミノ酸配列を有するＬＥＣＴ２又
はＬＥＣＴ２由来の物質を有効成分とする骨吸収抑制剤
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のＬＥＣＴ２は、白血病細
胞のような細胞の培養上清からタンパク質をＣＭ−セフ
ァロースで濃縮し、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セ
ファロース、ＨＰＬＣによるハイドロキシアパタイト、
逆相クロマトグラフィーにかけることによって精製する
ことができる。例えば、培養したＳＫＷ−３などの白血
病細胞をＰＨＡ−Ｐにより刺激して培養上清中に本発明
の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カラム
クロマトグラフィーなどの手法を用いて、精製すること
ができる。
胞のような細胞の培養上清からタンパク質をＣＭ−セフ
ァロースで濃縮し、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セ
ファロース、ＨＰＬＣによるハイドロキシアパタイト、
逆相クロマトグラフィーにかけることによって精製する
ことができる。例えば、培養したＳＫＷ−３などの白血
病細胞をＰＨＡ−Ｐにより刺激して培養上清中に本発明
の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カラム
クロマトグラフィーなどの手法を用いて、精製すること
ができる。
【００１１】また、本発明のＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２
由来の物質は、遺伝子工学的手法（特開平８−１４０６
８３，特開平１０−１４６１８９）を用いて作製しても
よい。例えば、ｐＭＡＬＴＭ−Ｃ又はｐＧＥＸ−３Ｘを
ベクターとして作製した形質転換体で産生しても良い。
宿主細胞としては従来公知の細菌（大腸菌など）、酵母
および動物細胞を用いることができる。動物細胞として
は例えば、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣ
ＶＩ細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス線維芽細胞、マウス
Ｃ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ９２９細胞
およびヒトＨｅＬａ細胞などがあげられる。酵母として
は、パン酵母、ピキア酵母等生産系の確立したものが利
用に便利である。なお、工業生産の目的からは酵母分泌
系を利用することがもっとも簡便である。
由来の物質は、遺伝子工学的手法（特開平８−１４０６
８３，特開平１０−１４６１８９）を用いて作製しても
よい。例えば、ｐＭＡＬＴＭ−Ｃ又はｐＧＥＸ−３Ｘを
ベクターとして作製した形質転換体で産生しても良い。
宿主細胞としては従来公知の細菌（大腸菌など）、酵母
および動物細胞を用いることができる。動物細胞として
は例えば、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣ
ＶＩ細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス線維芽細胞、マウス
Ｃ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ９２９細胞
およびヒトＨｅＬａ細胞などがあげられる。酵母として
は、パン酵母、ピキア酵母等生産系の確立したものが利
用に便利である。なお、工業生産の目的からは酵母分泌
系を利用することがもっとも簡便である。
【００１２】本細胞の培養、培養上清からの本発明のタ
ンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転換の
方法、さらに形質転換からの精製は公知の方法によって
実施することができる。
ンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転換の
方法、さらに形質転換からの精製は公知の方法によって
実施することができる。
【００１３】本発明で用いるＬＥＣＴ２由来の物質は、
骨吸収を抑制するものであれば、特に限定されない。公
知のＬＥＣＴ２アミノ酸配列中に１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、付加若しくは誘導といった任意の
変異を有し、骨吸収を抑制するものも含まれる（Ｕｌｍ
ｅｒ， Ｋ． Ｍ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１９，６
６６， １９８３）。さらに、ＬＥＣＴ２由来の物質に
は、キメラタンパク質、融合タンパク質、部分欠失、部
分配列および化学的に修飾されたものも含まれる。さら
に、ＬＥＣＴ２の各種たんぱく質情報（一次、二次、三
次構造及び立体表面構造）をもとにして創薬されるペプ
チドあるいは低分子化合物も候補化合物になりうる（特
開平５−２５５３９８、特開平８−１４０６８３、ＷＯ
／１６１７７）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｏｒｇａ
ｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
４， １４２１−１４２７， １９９６）（Ｓ．Ｙａｍ
ａｇｏｅ ｅｔ ａｌ， Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．， ２３
７， １１６−１２０，１９９７：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＬＥＣＴ２）。なお、その由来となるＬＥＣＴ２
は骨吸収抑制活性を有する限り、その動物種を問わない
が、抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが
好ましい。
骨吸収を抑制するものであれば、特に限定されない。公
知のＬＥＣＴ２アミノ酸配列中に１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、付加若しくは誘導といった任意の
変異を有し、骨吸収を抑制するものも含まれる（Ｕｌｍ
ｅｒ， Ｋ． Ｍ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１９，６
６６， １９８３）。さらに、ＬＥＣＴ２由来の物質に
は、キメラタンパク質、融合タンパク質、部分欠失、部
分配列および化学的に修飾されたものも含まれる。さら
に、ＬＥＣＴ２の各種たんぱく質情報（一次、二次、三
次構造及び立体表面構造）をもとにして創薬されるペプ
チドあるいは低分子化合物も候補化合物になりうる（特
開平５−２５５３９８、特開平８−１４０６８３、ＷＯ
／１６１７７）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｏｒｇａ
ｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
４， １４２１−１４２７， １９９６）（Ｓ．Ｙａｍ
ａｇｏｅ ｅｔ ａｌ， Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．， ２３
７， １１６−１２０，１９９７：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＬＥＣＴ２）。なお、その由来となるＬＥＣＴ２
は骨吸収抑制活性を有する限り、その動物種を問わない
が、抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが
好ましい。
【００１４】本発明において、ＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ
２由来の物質の骨吸収抑制活性は、例えば次のようにし
て測定される。ウサギより単離した破骨細胞を象牙片上
に播種し、翌日に形成されたピットの数を計測する骨吸
収活性を見るアッセイ系に、ＬＥＣＴ２若しくはＬＥＣ
Ｔ２由来の物質又はこれら物質の情報をもとにして創製
された修飾化合物を添加し、形成されるピット数の減少
により、候補化合物の骨吸収の抑制活性を測定すること
ができる（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ， Ｂｏｎｅ ａ
ｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ １７， ３４７−３５９， １
９９２）（亀田ら，日薬理誌 １０９， ７５−８４，
１９９７）。
２由来の物質の骨吸収抑制活性は、例えば次のようにし
て測定される。ウサギより単離した破骨細胞を象牙片上
に播種し、翌日に形成されたピットの数を計測する骨吸
収活性を見るアッセイ系に、ＬＥＣＴ２若しくはＬＥＣ
Ｔ２由来の物質又はこれら物質の情報をもとにして創製
された修飾化合物を添加し、形成されるピット数の減少
により、候補化合物の骨吸収の抑制活性を測定すること
ができる（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ， Ｂｏｎｅ ａ
ｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ １７， ３４７−３５９， １
９９２）（亀田ら，日薬理誌 １０９， ７５−８４，
１９９７）。
【００１５】この測定による抑制率を指標にして、骨吸
収抑制剤の候補化合物をスクリーニングし、例えば、抑
制率８０％を１０μｇ／ｍｌの濃度で発揮する化合物が
選択される。
収抑制剤の候補化合物をスクリーニングし、例えば、抑
制率８０％を１０μｇ／ｍｌの濃度で発揮する化合物が
選択される。
【００１６】本発明の骨吸収抑制剤を使用することので
きる骨疾患の例としては、骨粗鬆症、高カルシウム血
症、副甲状腺機能亢進症、ぺージェット病等が上げられ
る。
きる骨疾患の例としては、骨粗鬆症、高カルシウム血
症、副甲状腺機能亢進症、ぺージェット病等が上げられ
る。
【００１７】本発明の骨吸収抑制剤を治療薬剤として投
与する場合には、通常成人１日当たり０．００５〜１０
ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１〜３ｍｇ／ｋｇを１
日１〜３回に分けて投与すればよく、これらの投与量
は、用いる化合物、年齢、症状等により適宜増減するこ
とが可能である。
与する場合には、通常成人１日当たり０．００５〜１０
ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１〜３ｍｇ／ｋｇを１
日１〜３回に分けて投与すればよく、これらの投与量
は、用いる化合物、年齢、症状等により適宜増減するこ
とが可能である。
【００１８】本発明の骨吸収抑制剤はその投与ルートに
ついては所望により経口的、非経口的、あるいは局所的
に投与することができる。経口投与剤としてはタンパク
質又はペプチドの場合における消化分解、腸内吸収の問
題を考慮して、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの
固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状
製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注
射剤、点滴用剤、又は粘膜若しくは皮膚吸収の問題を考
慮して粘膜投与剤若しくは外用剤とすることができる。
ついては所望により経口的、非経口的、あるいは局所的
に投与することができる。経口投与剤としてはタンパク
質又はペプチドの場合における消化分解、腸内吸収の問
題を考慮して、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの
固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状
製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注
射剤、点滴用剤、又は粘膜若しくは皮膚吸収の問題を考
慮して粘膜投与剤若しくは外用剤とすることができる。
【００１９】剤形についても所望により、必要に応じ
て、公知の担体等を併用して、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、シロップ剤、腸溶解性製剤等の経口投与剤、
又は、注射剤（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔等）、点滴
剤、坐剤等による非経口剤等に製剤化されるものであ
る。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、
着色剤、安定化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、
溶解補助剤、 粘着剤、乳化剤、リポソーム製剤、ｐＨ
調整剤、懸濁剤、コーティング剤、腸吸収促進剤、除放
性製剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しう
る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
て、公知の担体等を併用して、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、シロップ剤、腸溶解性製剤等の経口投与剤、
又は、注射剤（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔等）、点滴
剤、坐剤等による非経口剤等に製剤化されるものであ
る。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、
着色剤、安定化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、
溶解補助剤、 粘着剤、乳化剤、リポソーム製剤、ｐＨ
調整剤、懸濁剤、コーティング剤、腸吸収促進剤、除放
性製剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しう
る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００２０】
【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。以下に実施例をもって、本発明をいっそう具
体的に説明するが、これらは実施の一例として示すもの
であり、本発明はこれらにより何ら限定されるものでは
ない。
説明する。以下に実施例をもって、本発明をいっそう具
体的に説明するが、これらは実施の一例として示すもの
であり、本発明はこれらにより何ら限定されるものでは
ない。
【００２１】
【実施例１】（１）未分画骨細胞の調製 ジエチルエーテルを用いた深麻酔により１０日齢、１１
０ｇ前後の仔ウサギを屠殺し、四肢長管骨を採取した。
軟組織を取り除いた後、５％仔ウシ胎児血清（ＦＢＳ）
を含むアルファ最小必須培地（α−ＭＥＭ）の中でハサ
ミを用いて細切した。充分に細切した骨片と培養液を回
収し、ｖｏｒｔｅｘミキサーを用いて骨片に付着してい
る細胞を剥離させ、２分間静置した後上清を回収するこ
とにより未分画骨細胞を調製した。
０ｇ前後の仔ウサギを屠殺し、四肢長管骨を採取した。
軟組織を取り除いた後、５％仔ウシ胎児血清（ＦＢＳ）
を含むアルファ最小必須培地（α−ＭＥＭ）の中でハサ
ミを用いて細切した。充分に細切した骨片と培養液を回
収し、ｖｏｒｔｅｘミキサーを用いて骨片に付着してい
る細胞を剥離させ、２分間静置した後上清を回収するこ
とにより未分画骨細胞を調製した。
【００２２】（２）ピットアッセイ ２０〜４０μｍ厚の象牙スライスを直径６ｍｍの円盤状
に切断し、７０％エタノール中で超音波処理することに
より滅菌を行った。各象牙スライスをＰＢＳ、α−ＭＥ
Ｍにて洗浄後、２００μｌの培養液（５％ＦＢＳ含有α
−ＭＥＭ）と共に９６穴プレートのウェルに移し、ＣＯ
２インキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ）に
て、３７℃、２時間保温した。２時間後にウェル内の培
養液を完全に取除き、各濃度のヒトＬＥＣＴ２を含む培
養液および５×１０５個の未分画骨細胞を添加した後、
さらにＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％
Ａｉｒ）にて、３７℃、１８時間保温した。１８時間
後、ラバーポリスマンを用いて象牙スライスに付着して
いる骨細胞を完全に取除き、酸性ヘマトキシリン溶液に
て数分間染色し、顕微鏡下で象牙スライス一枚あたりの
ピット数を計測することにより破骨細胞の骨吸収活性を
求めた。
に切断し、７０％エタノール中で超音波処理することに
より滅菌を行った。各象牙スライスをＰＢＳ、α−ＭＥ
Ｍにて洗浄後、２００μｌの培養液（５％ＦＢＳ含有α
−ＭＥＭ）と共に９６穴プレートのウェルに移し、ＣＯ
２インキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ）に
て、３７℃、２時間保温した。２時間後にウェル内の培
養液を完全に取除き、各濃度のヒトＬＥＣＴ２を含む培
養液および５×１０５個の未分画骨細胞を添加した後、
さらにＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％
Ａｉｒ）にて、３７℃、１８時間保温した。１８時間
後、ラバーポリスマンを用いて象牙スライスに付着して
いる骨細胞を完全に取除き、酸性ヘマトキシリン溶液に
て数分間染色し、顕微鏡下で象牙スライス一枚あたりの
ピット数を計測することにより破骨細胞の骨吸収活性を
求めた。
【００２３】図１の横軸は本アッセイ系に用いたヒトＬ
ＥＣＴ２濃度を、縦軸は象牙スライス一枚あたりのピッ
ト数を示している。 ヒトＬＥＣＴ２は１μｇ／ｍｌの
濃度で約５０％の骨吸収阻害活性を示し、１０μｇ／ｍ
ｌの濃度でほぼ１００％の骨吸収阻害活性を示した。
ＥＣＴ２濃度を、縦軸は象牙スライス一枚あたりのピッ
ト数を示している。 ヒトＬＥＣＴ２は１μｇ／ｍｌの
濃度で約５０％の骨吸収阻害活性を示し、１０μｇ／ｍ
ｌの濃度でほぼ１００％の骨吸収阻害活性を示した。
【００２４】
【実施例２】（１）破骨細胞の分離精製 実施例１の方法に従って調製した未分画骨細胞をコラー
ゲンゲル（新田ゼラチン、ｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ ｔ
ｙｐｅ Ｉ）でコートしたシャーレに播種し、ＣＯ２イ
ンキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ）にて、
３７℃、２時間保温した。２時間後、シャーレ内の培地
を完全に取除いた後、広口ピペットを用い、１０ｍｌの
ＰＢＳにて３回洗浄することによりゲル上から細胞を洗
い流した。さらに０．００１％ プロナーゼ Ｅ／０．０
２％ ＥＤＴＡ溶液を添加し、室温１５分静置した後、
再び１０ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄を行った。最後に、
０．０１％ コラゲナーゼ溶液を添加し、室温５分静
置、１０ｍｌのＰＢＳによる３回の洗浄を行うことによ
って破骨細胞以外の細胞をゲル上から完全に取除いた。
ゲル上に残った破骨細胞は、０．１％ コラゲナーゼ溶
液を添加し、室温１０分静置することにより細胞の足場
ごと溶解し、破骨細胞のみを含む細胞浮遊液を回収し
た。
ゲンゲル（新田ゼラチン、ｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ ｔ
ｙｐｅ Ｉ）でコートしたシャーレに播種し、ＣＯ２イ
ンキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ）にて、
３７℃、２時間保温した。２時間後、シャーレ内の培地
を完全に取除いた後、広口ピペットを用い、１０ｍｌの
ＰＢＳにて３回洗浄することによりゲル上から細胞を洗
い流した。さらに０．００１％ プロナーゼ Ｅ／０．０
２％ ＥＤＴＡ溶液を添加し、室温１５分静置した後、
再び１０ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄を行った。最後に、
０．０１％ コラゲナーゼ溶液を添加し、室温５分静
置、１０ｍｌのＰＢＳによる３回の洗浄を行うことによ
って破骨細胞以外の細胞をゲル上から完全に取除いた。
ゲル上に残った破骨細胞は、０．１％ コラゲナーゼ溶
液を添加し、室温１０分静置することにより細胞の足場
ごと溶解し、破骨細胞のみを含む細胞浮遊液を回収し
た。
【００２５】（２）ピットアッセイ 実施例１で用いた象牙スライス、培養液を用意し、実施
例１と同様の方法でピットアッセイを行った。ただし、
ここでは未分画骨細胞の代わりに、１ウェルあたり３０
００個の精製破骨細胞を用いた。図２には本アッセイ系
を用いてヒトＬＥＣＴ２の骨吸収阻害活性について調べ
た結果を示したが、未分画骨細胞を用いたピットアッセ
イと同様に、ヒトＬＥＣＴ２は１０μｇ／ｍｌの濃度で
ほぼ１００％の骨吸収阻害活性を示した。
例１と同様の方法でピットアッセイを行った。ただし、
ここでは未分画骨細胞の代わりに、１ウェルあたり３０
００個の精製破骨細胞を用いた。図２には本アッセイ系
を用いてヒトＬＥＣＴ２の骨吸収阻害活性について調べ
た結果を示したが、未分画骨細胞を用いたピットアッセ
イと同様に、ヒトＬＥＣＴ２は１０μｇ／ｍｌの濃度で
ほぼ１００％の骨吸収阻害活性を示した。
【００２６】
【実施例３】（急性毒性試験）配列番号１９番から１５
１番のアミノ酸配列からなる化合物を公知の手法によっ
て調製し、このものを体重２０±１ｇのｄｄ系マウスの
一群５匹に０．１ｍｇ／ｇを尾静脈より投与した。投与
７日後まで観察し死亡例は確認できなかった。
１番のアミノ酸配列からなる化合物を公知の手法によっ
て調製し、このものを体重２０±１ｇのｄｄ系マウスの
一群５匹に０．１ｍｇ／ｇを尾静脈より投与した。投与
７日後まで観察し死亡例は確認できなかった。
【発明の効果】本発明により、ＬＥＣＴ２が骨吸収活性
を抑制することが判明した。本発明により、高カルシウ
ム血症、骨粗鬆症等に対して有効な治療法を提供するこ
とができる。さらに、ＬＥＣＴ２由来の物質について、
骨吸収抑制剤のスクリーニング法が提供できた。
を抑制することが判明した。本発明により、高カルシウ
ム血症、骨粗鬆症等に対して有効な治療法を提供するこ
とができる。さらに、ＬＥＣＴ２由来の物質について、
骨吸収抑制剤のスクリーニング法が提供できた。
【配列表】 Sequence Listing <110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Agent for inhibiting bone absorption <130> DP981007 <160> 1 <210> 1 <211> 151 <212> PRT <213> human <220> <222> 58 <223> Xaa=Val or Ile <400> 1 Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ile Ser Thr 1 5 10 15 Ala Leu Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ile Cys Ala Gly Lys Ser Ser 20 25 30 Asn Glu Ile Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gln Tyr Ser 35 40 45 Ala Gln Arg Ser Gln Arg Pro His Gln Gly Val Asp Xaa Leu Cys 50 55 60 Ser Ala Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met Ile Val 65 70 75 Gly Gln Glu Lys Pro Tyr Gln Asn Lys Asn Ala Ile Asn Asn Gly 80 85 90 Val Arg Ile Ser Gly Arg Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr Ile 95 100 105 Lys Pro Ile Lys Tyr Lys Gly Pro Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu 110 115 120 Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser 125 130 135 His Val His Ile Glu Asn Cys Asp Ser Ser Asp Pro Thr Ala Tyr 140 145 150 Leu 151
【図１】未分画骨細胞に対するヒトＬＥＣＴ２の骨吸収
抑制活性のアッセイの結果を示す図面である。
抑制活性のアッセイの結果を示す図面である。
【図２】精製破骨細胞に対するのヒトＬＥＣＴ２の骨吸
収抑制活性のアッセイの結果を示す図面である。
収抑制活性のアッセイの結果を示す図面である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 山川 徹 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 BA80 DA02 DA05 DA11 GA11 4B064 AG01 AG02 CA01 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4C084 AA02 BA01 BA21 BA22 BA44 DA02 MA23 MA31 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA66 NA14 ZA962 ZA972 4H045 AA10 AA30 CA40 DA01 EA20 EA50 FA74 GA21
Claims (5)
- 【請求項１】白血球活性化タンパク質因子又は白血球活
性化タンパク質因子由来の物質を有効成分とする骨吸収
抑制剤。 - 【請求項２】白血球活性化タンパク質因子が配列表の配
列番号１のアミノ酸番号１番〜１５１番又は１９番〜１
５１番で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とす
る請求項１記載の骨吸収抑制剤。 - 【請求項３】白血球活性化タンパク質因子又は白血球活
性化タンパク質因子由来の物質が破骨細胞による骨吸収
を抑制する請求項１及び２に記載の骨吸収抑制剤。 - 【請求項４】白血球活性化タンパク質因子若しくは白血
球活性化タンパク質因子由来の物質を出発原料とし、又
はこれらを情報源として調製した骨吸収抑制剤候補化合
物について、骨吸収作用についてのインビトロ試験を指
標にしてスクリーニング試験を実施し選別することから
なる骨吸収抑制剤のスクリーニング方法。 - 【請求項５】請求項４に記載の方法によって選別された
候補化合物のうち、ピットアッセイによって、１０μｇ
／ｍｌの濃度において８０％以上の骨吸収抑制作用を発
揮する化合物を選別し、この化合物を有効成分とする骨
吸収抑制剤。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36372798A JP4378439B2 (ja) | 1998-12-22 | 1998-12-22 | 骨吸収抑制剤 |
| CA002356765A CA2356765A1 (en) | 1998-12-22 | 1999-12-20 | Bone resorption inhibitors |
| EP99959921A EP1142579A4 (en) | 1998-12-22 | 1999-12-20 | BONE RESORPTION INHIBITOR |
| PCT/JP1999/007152 WO2000037093A1 (fr) | 1998-12-22 | 1999-12-20 | Inhibiteur de resorption osseuse |
| US09/868,953 US6723696B1 (en) | 1998-12-22 | 1999-12-20 | Bone resorption inhibitors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36372798A JP4378439B2 (ja) | 1998-12-22 | 1998-12-22 | 骨吸収抑制剤 |
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|---|---|
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Family
ID=18480042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36372798A Expired - Lifetime JP4378439B2 (ja) | 1998-12-22 | 1998-12-22 | 骨吸収抑制剤 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP4378439B2 (ja) |
| CA (1) | CA2356765A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000037093A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP3637087B2 (ja) | 1994-11-28 | 2005-04-06 | 和男 鈴木 | 新規な白血球活性化因子 |
| KR0176418B1 (ko) * | 1996-03-29 | 1999-04-01 | 김은영 | 인체 조직 유래의 엠아이엠-1 상동 유전자 |
| JP3888695B2 (ja) * | 1996-05-27 | 2007-03-07 | 株式会社医学生物学研究所 | ヒトｌｅｃｔ２に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット |
| JP3613909B2 (ja) | 1996-11-12 | 2005-01-26 | ダイキン工業株式会社 | 空調用通路付き建材 |
| JPH10146189A (ja) | 1996-11-15 | 1998-06-02 | Mitsubishi Chem Corp | 新規な遺伝子およびそれを用いた組換えタンパク質の製造方法 |
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1998
- 1998-12-22 JP JP36372798A patent/JP4378439B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-12-20 US US09/868,953 patent/US6723696B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-20 EP EP99959921A patent/EP1142579A4/en not_active Withdrawn
- 1999-12-20 CA CA002356765A patent/CA2356765A1/en not_active Abandoned
- 1999-12-20 WO PCT/JP1999/007152 patent/WO2000037093A1/ja not_active Application Discontinuation
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| EP1142579A2 (en) | 2001-10-10 |
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