KR101363106B1 - 아포리포 단백질 ａ-1 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 아포리포 단백질 A-1을 정제하는 방법에는 혈장 분취물 FV (Cohn Ethanol 분취법으로 수득됨)을 1-8 M 요소 용액과 혼합시켜, 분취물 IV 선처리 용액을 만들고; 이 단계에서 수득된 선처리 용액을 제1 음이온 크로마토그래피 컬럼에 적하시키고, 그 다음 1-8M s요소 용액으로 용출시켜 apoA-1 단백질을 수득하고; apoA-1 단백질 용액을 제 2 음이온 크로마토그래피 컬럼에 적하시키고, 0-1M 요소 용액으로 용출시켜 순수한 apoA-1 단백질을 수득하는 것이 포함된다.

Description

아포리포 단백질 Ａ-1 정제 방법{METHOD OF PURIFYING APOLIPOPROTEIN A-l}

본 발명은 단백질 준비물, 특히 apoA-1의 준비에 관계한다.

고밀도 리포 단백질(HDL)은 혈액에서 중요한 리포 단백질이다. 역 콜레스테롤 운반(RCT)이라고 불리는 과정에 참여하는데, 조직 세포에서 콜레스테롤은 간으로 운반되어 무해한 물질로 대사될 수 있고, 그 이후로 아테롬성 동맥경화증(AS) 출현과 발생이 억제된다. Apo 리포 단백질 A-I (apoA-1)는 고밀도 리포 단백질 (HDL)에서 아포리포 단백질의 주요 형태이다. HDL의 항-아테롬성 동맥경화증의 주요 실행물질이다. 또한, 최근 연구 결과에 따르면, apoA-1 결핍은 아테롬성 동맥경화증 발생의 원인이 되며 염증 증가의 원인이 될 수도 있다. 또한, apoA-1은 저밀도 리포 단백질(LDL)를 낮추고, 플레이크(plaque)를 청소한다. 또한, 최근 연구 결과에 따르면, apoA-1은 항-염증 효과 또는 간-표적 기능을 가진 약물에도 응용할 수 있을 것이다.

고속 원심분리, 유기 용매 침전, HPLC(high performance liquid chromatography)와 같은 방법이 apoA-1을 정제하는데 통상 이용된다. 그러나, 이들 방법은 약간의 고유 결함이 있는데 가령, 낮은 수율, 고비용, 불확실성, 소규모 생산 규모 등이 있다. apoA-1을 산업 규모로의 생산에 이러한 방법은 적합하지 못하 다.

한편, 혈장 분취후에 요구되는 분취물중 하나인 혈장 분취 IV는 상업적으로 이용하기 위해 정제되어야 할 유용한 산물이 없기 때문에 항상 버리게 된다. 본 발명에 따르면, 대규모 생산에 적합한 정제 방법이 제공되며, 고순도의 apoA-1이 혈장 분취물 IV로부터 수득된다.

발명의 요약

본 발명에 따르면, 요소는 이온 교환 크로마토그래피에서 apoA-1의 거동에 상당한 영향을 끼치는 것을 알 수 있다. apoA-1이 요소와 복합되지 않으면, 음이온 교환 컬럼에 매우 용이하게 흡수되어, 컬럼으로부터 용출시키는 것이 상대적으로 어렵다. 그러나, 요소와 apoA-1가 복합되면, 음이온 교환 컬럼으로부터 매우 용이하게 용출시킨다. 따라서, 본 발명에 따라, apoA-1은 두 가지 상이한 용출 프로파일을 이용하여 두 가지 음이온 교환 컬럼으로부터 정제된다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 아포리포 단백질 A-1을 정제하는 방법을 제공한다: a) 혈장 분취물 FV (Cohn Ethanol 분취법으로 수득됨)을 1-8 M 요소 용액과 혼합시켜, 분취물 IV 선처리 용액을 만들고; b) 이 단계에서 수득된 선처리 용액을 제1 음이온 크로마토그래피 컬럼에 적하시키고, 그 다음 1-8M s요소 용액으로 용출시켜 apoA-1 단백질을 수득하고; c) 단계 b)의 apoA-1 단백질 용액을 제 2 음이온 크로마토그래피 컬럼에 적하시키고, 0-1M 요소 용액으로 용출시켜 순수한 apoA-1 단백질을 수득한다. 이 방법은 고수율, 저비용 및 산업규모로의 생산에 적합성과 같은 장점들을 가지고 있다. 또한, 이 방법은 출발 재료 물질로 혈장 분취 물 IV를 이용하여 혈장 공급원을 온전하게 모두 이용할 수 있도록 한다.

이 방법에서 수득된 순수한 apoA-1은 아테롬성 동맥경화증 치료, 항-염증 치료, 항-독소 치료, 간-표적 약물 등에 이용할 수 있다.

도 1은 혈장 분취물 IV로부터 apoA-1의 생산 공정을 보여주는 순서도이다.

도 2는 실시예 1에서 제 1 이온 교환 크로마토그래피의 용출 과정을 보여준다.

도 3은 실시예 1에서 제 1 이온 교환 크로마토그래피에서 취한 샘플의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 보여준다.

도 4는 실시예 1에서 제 2 이온 교환 크로마토그래피에서 취한 샘플의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 보여준다.

도 5는 실시예 4에서 취한 샘플의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 보여준다.

도 6은 실시예 2에서 취한 샘플의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 보여준다.

도 7은 실시예 3에서 취한 샘플의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 보여준다.

본 발명에 따른 공정의 구체예는 혈장 분취물 IV로부터 apoA-1의 생산 공정을 보여주는 순서도이다.

(1) 혈장 분취물 IV 전처리(pretreatment)

설명된 분취물 IV은 Cohn 에탄올 분취법(Cohn, E. J.; Strong, L.E.; Huges, W.L.; et al., Preparation and properties of serum and plasma proteins IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. Amer Chem Soc, 1946, 68:459-475)에 따라 수득한다. 분취물 IV은 완충액에 용해시키고, 특정 양의 요소를 용액에 첨가하고, 완전하게 혼합한다. 이 공정에서 apoA-1가 요소와 복합되고, 이와 같은 복합은 가역적이다. 첨가된 요소의 농도는 1-8 M, 바람직하게는 3-7 M이며, 더욱 바람직하게는 5-6 M이다. 분취물 IV과 요소의 질량비는 1:30-300, 바람직하게는 1:90-240이며, 좀더 바람직하게는 1: 150-210이다.

이 분야에 통상적으로 이용되는 완충액이 선택되었는데; Tris 완충액, 인산염 완충액 또는 HEPES 완충액이며, Tris 완충액이 바람직하다. 완충액 pH는 7.2-8.5이며, 바람직하게는 7.5-8이며, 더욱 바람직하게는 7.8이 된다.

또 다른 실시예에서, 분취물 IV은 저온(0-4℃)에 용해된다.

또 다른 실시예에서, 전처리 용액은 침전물을 제거하기 위해 원심분리시키고, 그 다음 여과시켰다. 원심분리 속도는 6,000-10,000 rpm, 바람직하게는 8,000 rpm이며, 여과 막의 포어 크기는 0.2 0.6 ㎛, 바람직하게는 0.45㎛이다.

(2) 제 1 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

단계 (1)에서 수득된 용액을 DEAE (Diethylamino Ethanol)에 적하시킨다.

음이온 교환 컬럼, apoA-1을 포함하는 용액에 단백질은 컬럼상에서 복합된다. 좀더 구체적으로 단계(1)에서 수득된 apoA-1 용액을 1-10배, 바람직하게는 3-7 배의 물로 희석시킨다. 희석 후에 용액을 음이온 교환 컬럼(유속은 분당 0.5-1.5㎖, 바람직하게는 분당 0.8-1.2㎖)에 적하시킨다.

그 다음 단백질은 두 가지 용출 단계로 용출시켰다. 제1용출 단계에서, 낮은 전도성의 완충액을 이용하여 컬럼을 용출시켰다. apoA-1는 이때 컬럼과 매우 약하게 복합되고, 주로 apoA-1을 포함하는 단백질이 우선적으로 용출될 것이다. 제2 단계에서 높은 전도성을 가진 완충액을 이용하여 컬럼을 용출시키는데, 주로 불순물을 포함하는 단백질이 용출된다.

apoA-1을 용출시키는 용출액에는 1-8 M 요소, 바람직하게는 3-7 M, 좀더 바람직하게는 5-6 M을 포함한다. 전도성은 1-4 ms/cm, 바람직하게는 2-3.8 ms/cm, 좀더 바람직하게는 2.5-3.6 ms/cm이다. 용출액에 있는 염에는 NaCl, KCl, MgCl₂ 그리고 CaCl₂가 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. NaCl이 바람직하다.

불순물을 용출시키는 용출액에는 0-1 M 요소가 포함되는데; 0 M이 바람직하다. 전도성은 4.5 100 ms/cm이다. 용출액에 있는 염에는 NaCl, KCl, MgCl₂ 그리고 CaCl₂가 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. NaCl이 바람직하다.

이 분야에 통상적으로 이용되는 완충액이 선택되었는데; Tris 완충액, 인산염 완충액 또는 HEPES 완충액이며, Tris 완충액이 바람직하다. 완충액 pH는 7.2-8.5이며, 바람직하게는 7.5-8이며, 더욱 바람직하게는 7.8이 된다.

단계 1에서 수득된 분취물 전처리 용액의 컬럼 유속은 분당 0.5-1.5㎖, 바람직하게는 분당 0.8-1.2㎖이다. 분취물 IV과 컬럼의 용적 비율은 1:5-50, 바람직하게는 1:15-40이며, 더욱 바람직하게는 1:20-30이다.

(3) 제2 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

apoA-1, 요소 그리고 약간의 불순물을 포함하는 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피에서 수득된 apoA-1 용액을 더 낮은 전도성을 갖도록 물로 희석시킨 후, 제 2 DEAE 컬럼상에 적하시킨다.

단백질을 제2 DEAE 컬럼상에서 복합시키고, 요소는 용액에 남아있어, 컬럼을 통하여 흘러내려감으로써 제거된다. 그 다음 단백질은 두 가지 용출 단계에 의해 용출된다. 제1 단게에서, 상대적으로 낮은 전도성을 가진 완충액을 이용하여 컬럼을 용출시킨다. apoA-1는 컬럼에 강하게 복합되어, 불순물이 컬럼으로부터 용출되어 나온다. 제2단계에서, 더 높은 전도성을 가진 완충액을 이용하여 컬럼을 용출시키는데, 순수한 apoA-1가 용출된다.

불순물을 용출시키는 용출액의 전도성은 1-20 ms/cm, 바람직하게는 7-15 ms/cm, 좀더 바람직하게는 9-12 ms/cm이다. 0-1 M 요소가 용출액에 존재할 수도 있지만, 0 M이 바람직하다. 용출액에 있는 염에는 NaCl, KCl, MgCl₂ 그리고 CaCl₂가 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. NaCl이 바람직하다.

apoA-1을 용출시키는 용출액의 전도성은 50-100 ms/cm, 바람직하게는 70-95ms/cm, 좀더 바람직하게는 80-90 ms/cm이다. 0-1 M 요소가 용출액에 존재할 수도 있지만, 0 M이 바람직하다. 용출액에 있는 염에는 NaCl, KCl, MgCl₂ 그리고 CaCl₂가 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. NaCl이 바람직하다.

또 다른 실시예에서, 제2 DEAE 컬럼상에서 apoA-1와 소량의 불순물이 복합된 후에, 3 ms/cm/min의 전도성 차등을 이용하여 단백질을 용출시킨다. 용출액의 전도성은 1에서 100 ms/cm으로 상승한다. 순수 apoA-1는 30 내지 60 ms/cm의 전도성 범위에서 용출되어 수집된다.

이 분야에 통상적으로 이용되는 완충액이 선택되었는데; Tris 완충액, 인산염 완충액 또는 HEPES 완충액이며, Tris 완충액이 바람직하다. 완충액 pH는 7.2-8.5이며, 바람직하게는 7.5-8이며, 더욱 바람직하게는 7.8이 된다.

본 발명에서 단계 3)에서 수득된 순수 apoA-1 용액을 프로세스하기 위해 포스트 처리 방법이 제공된다. 이 방법에는 한외-여과 단계, 안정화제 첨가 단계 및 동결건조 단계가 포함된다. 포스트 프로세싱 단계후에 냉동 건조된 apoA-1가 수득된다.

이 분야에서 흔히 이용되는 한외-여과는 apoA-1 용액의 조건을 조절하는데, 즉, 용액의 적정 pH 및 단백질 농도를 조절하는데 이용된다. 한외 여과를 위해, 분자량 컷오프가 5000인 Millipore PES 한외-여과 막이 이용되고, 작업 온도는 4℃이며, 작업 압력은 0.3Mpa이다.

첨가되는 안정화제는 이 분야에 흔히 이용되는 것들, 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈, 셀룰로오즈 글리콜레이트 나트륨, 슈크로즈, 소르비에라이트 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 것들이다.

이 분야에 흔히 응용되는 동결 건조 방법이 이용되는데; 산물을 3-4시간동안 -36℃이하에서 냉동시키고, 7-9Pa의 진공하에서 동결 건조시킨다.

콜드 트랩의 온도는 약 -55℃이며, 제 2 기간에 쉐프(shelf) 온도는 40℃이며, 시간은 약 15시간이다.

본 발명에 이용되는 크로마토그래피 컬럼은 이 분야에 통상 응용되는 것들이 되는데, 크로마토그래피 매질은 QAE (quaternary amine) 또는 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 매질이 될 수 있으며, DEAE가 바람직하다.

본 발명은 다음의 구체예를 통하여 상세하게 설명될 것이다. 이들 구체예는 본 발명을 설명하기 위함이지 그 범위를 이에 한정하기 위함이 아니라는 것을 인지해야 한다. 다음 실시예에서 조건이 명시되지 않은 경우, 조건들은 제조업자가 권고하거나 통상적인 것을 의미한다. 명시되지 않는 한, 하기 언급된 비율은 질량비이다.

다른 언급이 없는 한, 기술적 또는 과학적 용어의 정의는 당업자가 일반적으로 이해하는 것들이다.

실시예 1

apoA -1 정제

출발 물질에는 0.2 g 혈장 분취물 IV, 두 가지 5㎖ DEAE 음이온 교환 컬럼 (GE Healthcare)이 포함되며, 순도 및 전도성 측정 장비, 즉, AKTA EXPLORER 100 (GE Healthcare)이 이용된다.

(1) 혈장 분취물 IV 전처리

0.2 g 분취물 IV을 100㎖ Tris 완충액(pH 7.8, 4℃)에 용해시킨다. 요소를 용액에 첨가하여 최종 농도가 6 mol/L되도록 하고, 완전하게 혼합한다. 용액을 8,000 rpm에서 원심분리시켜 침전물을 제거하고, 0.45㎛ 필터를 통하여 여과시킨 다.

(2) 제1 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

제1 DEAE 컬럼은 6mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액(pH 7.8)으로 균등(equilibrate)시킨다. 단계(1)의 용액을 DEAE 컬럼 (유속은 분당 1㎖)에 적하시킨다. 6mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액 (pH 7.8, 전도성 3.5 ms/cm)으로 컬럼을 용출시킨다. apoA-1이 용출된다. 용출된 용적은 20㎖이다. 4가지 다른 Tris 완충액 (각각은 pH 7.8이며, 전도성은 각각 4.3 ms/cm, 5.4 ms/cm, 6.7 ms/cm, 59.2 ms/cm이다)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, 불순물이 용출된다. 용출 과정 및 SDS-PAGE 전기영동 결과를 도 2와 3에 나타내었다. 도 2의 X-좌표는 크로마토그래피 과정에서 용출 용적이며, Y 좌표는 용출물에서 단백질 농도이다. 숫자 1 내지 9는 샘플을 취한 지점을 나타낸다. 샘플은 도 3에서 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE 전기영동으로 측정된다. 화살표가 apoA-1 단백질의 위치를 나타낸다.

(3) 제2 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

apoA-1, 요소, 소량의 불순물을 포함하는 단계 (2)에서 용출된 apoA-1 (pH 7.8, 전도성 3.5 ms/cm)를 5배의 물로 희석시키고, 제2 DEAE 컬럼(유속은 분당 10㎖)에 적하시킨다. ApoA-1와 소량의 불순물이 컬럼상에서 복합되고, 요소는 용액에 잔류하여 컬럼을 통한 유체로 제거된다.

요소가 없는 Tris 완충액(pH 7.8, 전도성 11.7 ms/cm)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, 불순물은 컬럼으로부터 용출되어 빠져나간다. 그 다음 요소가 없는 완충액(pH 7.8, 전도성 85.2 ms/cm)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, apoA-1가 용출된 다.

SDS-PAGE 전기영동 결과에서 순수한 apoA-1가 이 단계에서 수득되었음을 보여준다(도 4). 샘플 1은 적하 프로세스 동안에 컬럼 흐름 용액에 있는 단백질이다. 샘플 2는 단백질 마커이다. 3 내지 5번은 제1 용출 과정 동안에 수거되는 샘플로써 주로 불순물로 구성된다. 6 내지 10번은 제 2 용출과정에서 수거되는 샘플로써, 주로 apoA-1로 구성된다. 샘플 6과 7을 5배 희석시키고, 샘플 8은 10배 희석시켰다. 화살표는 apoA-1 단백질의 위치를 나타낸다.

실시예 2

ApoA -1 정제

0.2 g의 혈장 분취물 IV과 장비는 실시예 1과 동일하다.

(1) 혈장 분취물 IV 전처리

0.2 g 분취물 IV을 100㎖ Tris 완충액(pH 7.8, 4℃)에 용해시킨다. 요소를 용액에 첨가하여 최종 농도가 6 mol/L되도록 하고, 완전하게 혼합한다. 용액을 8,000 rpm에서 원심분리시켜 침전물을 제거하고, 0.45㎛ 필터를 통하여 여과시킨다.

(2) 제1 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

제1 DEAE 컬럼은 8mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액(pH 7.8)으로 균등(equilibrate)시킨다. 단계(1)의 용액을 DEAE 컬럼 (유속은 분당 1㎖)에 적하시킨다. 8mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액 (pH 7.8, 전도성 3.5 ms/cm)으로 컬럼을 용출시킨다. apoA-1이 용출된다. 용출된 용적은 20㎖이다. Tris 완충액 (pH 7.8이며, 전도성은 59.2 ms/cm이다)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, 불순물이 용출된다.

(3) 제2 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

실시예 1과 동일하다. 정제 결과는 도 5에 나타낸다. 샘플 1은 전치리 공정 후에 혈장 분취물 IV의 상층액이다. 샘플 4 내지 8은 정제 과정에서 수거된 apoA-1이다. 샘플 10은 정제 과정에서 수거된 불순물이다. 화살표는 apoA-1 단백질의 위치를 나타낸다.

실시예 3

ApoA -1 정제

0.2 g의 혈장 분취물 IV과 장비는 실시예 1과 동일하다.

(1) 혈장 분취물 IV 전처리

0.2 g 분취물 IV을 100㎖ Tris 완충액(pH 7.8, 4℃)에 용해시킨다. 요소를 용액에 첨가하여 최종 농도가 6 mol/L되도록 하고, 완전하게 혼합한다. 용액을 8,000 rpm에서 원심분리시켜 침전물을 제거하고, 0.45㎛ 필터를 통하여 여과시킨다.

(2) 제1 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

제1 DEAE 컬럼은 8mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액(pH 7.8)으로 균등(equilibrate)시킨다. 단계(1)의 용액을 DEAE 컬럼 (유속은 분당 1㎖)에 적하시킨다. 8mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액 (pH 7.8, 전도성 3.5 ms/cm)으로 컬럼을 용출시킨다. apoA-1이 용출된다. 용출된 용적은 20㎖이다. Tris 완충액 (pH 7.8이며, 전도성은 59.2 ms/cm이다)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, 불순물이 용출된다.

(3) 제2 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

실시예 1과 동일하다. 정제 결과는 도7에 나타낸다.

실시예 4

apoA -1 파일럿 규모 정제

출발 물질에는 60 g 혈장 분취물 IV, 두 가지 1500㎖ DEAE 음이온 교환 컬럼 (Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Cooperaration), 음이온 교환 매질, 즉, DEAE Sepharose FF(GE Healthcare), 펌프 및 UV 감지기(Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Cooperaration)순도 및 전도성 측정 장비, 즉, AKTA EXPLORER 100 (GE Healthcare)이 이용된다.

(1) 혈장 분취물 IV 전처리

60 g 분취물 IV을 100㎖ Tris 완충액(pH 7.8, 4℃)에 용해시킨다. 요소를 용액에 첨가하여 최종 농도가 6 mol/L되도록 하고, 완전하게 혼합한다. 용액을 8,000 rpm에서 원심분리시켜 침전물을 제거하고, 0.45㎛ 필터를 통하여 여과시킨다.

(2) 제1 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

제1 DEAE 컬럼은 6mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액(pH 7.8)으로 균등(equilibrate)시킨다. 단계(1)의 용액을 DEAE 컬럼 (유속은 분당 1㎖)에 적하시킨다. 6mol/L 요소를 포함하는 Tris 완충액 (pH 7.8, 전도성 3.5 ms/cm)으로 컬럼 을 용출시킨다. apoA-1이 용출된다. 용출된 용적은 10L이다. Tris 완충액 (pH 7.8이며, 전도성은 80.3 ms/cm이다)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, 불순물이 용출된다.

(3) 제2 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피

apoA-1, 요소, 소량의 불순물을 포함하는 단계 (2)에서 용출된 apoA-1 (pH 7.8, 전도성 3.7 ms/cm)를 5배의 물로 희석시키고, 제2 DEAE 컬럼(유속은 분당 10㎖)에 적하시킨다. ApoA-1와 소량의 불순물이 컬럼상에서 복합되고, 요소는 용액에 잔류하여 컬럼을 통한 유체로 제거된다.

요소가 없는 Tris 완충액(pH 7.8, 전도성 12.2 ms/cm)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, 불순물은 컬럼으로부터 용출되어 빠져나간다. 그 다음 요소가 없는 완충액(pH 7.8, 전도성 50.4 ms/cm)을 이용하여 컬럼을 용출시키고, apoA-1가 용출된다.

SDS-PAGE 전기영동 결과는 도 5에 나타낸다. 결과에서 순수한 apoA-1가 파일럿 규모 공정에서 수득되었음을 보여준다.

실시예 5

ApoA -1 단백질 측정

실시예 1에서 정제된 apoA-1 단백질은 apoA-1 면역탁도 결정 키트(apoA-1 immnunoturbity determination kit: Shanghai SUN Biotech Co. LTD.)로 측정한다.

정제된 단백질 10㎕을 1㎖ apoA-1 항혈청에 첨가하고, 15분간 37℃에서 항온처리한다. 항온처리후에, 용액은 505nm 흡수도에서 감지된다. 결과에서 이 단백질 은 apoA-1이라는 것을 알 수 있다.

실시예 6

apoA -1 단백질 측정

실시예 5에서 설명된 방법을 이용하여, 각 실시예 2와 3의 apoA-1 단백질 그리고 실시예 4의 apoA-1 단백질을 면역탁도 결정 키트(apoA-1 immnunoturbity determination kit: Shanghai SUN Biotech Co. LTD.)로 측정한다.

유사한 결과를 수득한다.

본 발명의 범위나 사상을 벗어나지 않고 여기에서 설명된 구체예의 변형들이 만들어질 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 따라서, 상기 기술 내용은 설명을 위한 것이며, 첨부된 청구범위로 본원 발명의 범주 및 기술적 사상이 결정될 것이다.

Claims (27)

1. 아포리포단백질 A-1(apoA-1)을 정제하는 방법에 있어서,

   a) 1-8M 요소 용액과 혈장 분취물 IV를 혼합시켜, 분취물 IV 전처리 용액을 만들고;

   b) 단계 a)에서 수득된 전처리 용액을 제1 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적하시키고, 1-8M 요소를 포함하는 완충액 I(전도성 1-4ms/cm)로 용출시켜, apoA-1 단백질을 주로 포함하는 용출물 I을 수득하고,

   c) 용출물 I를 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적하시켜, 전도성 1-15ms/cm를 가지는 완충액 II로 먼저 용출시키고, 그 다음 전도성 30-100ms/cm를 가지는 완충액 III으로 용출시켜 순수한 apoA-1 단백질을 얻는 단계로 구성된 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 혈장 분취물 IV는 Cohn 에탄올 분취법으로 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 완충액 II에는 0-1 M 요소가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 완충액 III에는 0-1 M 요소가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 단계 a)와 b)에서 요소 농도는 3-8M인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 단계 a)와 b)에서 요소 농도는 5-7M인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 완충액 I의 전도성은 2-4ms/cm이며, 완충액 II의 전도성은 7-15ms/cm이며, 완충액 III의 전도성은 70-95ms/cm인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 완충액 I의 전도성은 2.5-3.6ms/cm이며, 완충액 II의 전도성은 9-12ms/cm이며, 완충액 III의 전도성은 80-90ms/cm인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 각 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 1) 강력한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼과 2) 약한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼중 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 각 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 1) QAE 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼과 2) DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼중 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, b)와 c) 사이 단계에서 대부분의 불순물은 4.5-70ms/cm의 전도성을 가진 완충액 IV로 용출되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, c) 단계 이후에, 순수한 apoA-1 단백질을 한외여과시키고, 순수한 apoA-1 단백질에 안정화제를 첨가하고, 그리고 순수한 apoA-1 단백질을 동결건조시키는 단계중 최소 한 가지가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 전처리 용액을 형성하기 위한 혼합은 7.2 내지 8.5의 pH 범위를 갖는 완충액을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 제1 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼상에 적하시키기에 앞서 물로 전처리 용액을 1 내지 10배 희석시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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