TWI357347B - Method of purifying apolipoprotein a-1 - Google Patents

Description

1357347 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域:j 發明領域 本發明係有關一種蛋白質的製備，特別是ap〇A-l之製 5 備。 t先前技術】 發明背景 高密度脂蛋白（HDL)是一種在血液中重要脂蛋白，其 係參與一被稱作為反轉膽固醇輸送(RCT)之方法，經由該 10 方法在組織細胞中之膽固醇可被輸送到要被代謝成無毒物 質之肝臟中，進而阻制動脈粥狀硬化(AS)的發生與演進。 脂蛋白原 A-l(APOLIPOPROTEIN A-1) (apoA-Ι)是在高密

度脂蛋白（HDL)中脂蛋白原的主要形式，其與血液中HDL 之生理功能相當有關，且其是HDL抗動脈粥狀硬化功能 15主要的負責者。此外，依據近來的研究結果，ap〇A-l缺乏 症可以造成在動脈粥狀硬化上的演進上以及在發炎作用上 的增高。又，apoA-Ι會降低低密度脂蛋白（LDL)並清除斑 塊。此外，依據近來的研究結果，apoA」有希望應用於 具有抗發炎作用或肝-鎖定功能之藥物中。 20 > -** 諸如超高速離心、有機溶劑沉澱與高效能液相層析法 (HPLC)等方法一般是用來純化apoAj。但此等方法有一些 先天的缺失，例如，低產率、高成本、不安全以及太小型 的生產規模。此等方法不適用於apoA」工業生產。 另一方面’作為在血漿分餾後取得該等餾分之一者， 5

灰激餾分IV因沒有可使用之產物予以純化，以供商業應 用’故是被丟棄的。本發明係提供一種適用於大規模製造 的純化方法’且具有高純度之ap〇A-l是自血漿餾分IV獲 得。 t 明内】 發明概要

本發明係發現，尿素會顯著影響apoAd 1〇 析法中之行為。當apoAd沒有與尿素結合時，其十分容g ^附於陰離子交換管柱上，且相當難以自管柱溶析出來 2是，若其與尿素結合時，料分容㈣自離子交換管; 六析^因此，依據本發明，aP〇A-l是可利用二種陰離- '^換b柱並使用二種不同的溶析外廟㈣触㈣㈣加」 純化。 15 20 步本發明提供—種純化脂蛋白原A_1的方法，其包含歹， 所二 '將血漿齡IV (利用科恩(C—)乙醇分館方法 預/者I、1_8 M尿素溶㈣混合，形^種館分IV -^將步驟a)所得到預處理溶液添載於一種第 溶:子^析管柱’其後並以具有MM尿素之溶液加以 H以得到叩从·1蛋白；C)將得自步驟b)之—A] f 尿—種第二陰離子層析管桂，其後並以Ο] IV 高以得到純f apGA_1蛋白。此方法具有諸如 =使"、低成本以及適社業生產等優點 °此外，此方法 :用血㈣分1¥作為原始物f，因而可使得血聚 物可以被完整的利用。 6 本發明所得到之純質apoA-1在動脈粥狀硬化治療 上抗發炎治療、抗毒素治療、肝鎖定(liver-targeting)之 藥物上的應用是十分有希望的。 5圖式簡單說明 第1圖為顯示自血漿餾分製造apoA-Ι之製造方法流程 圖。 第2圖顯示在實施例1中第，離子交換層析法之溶析 方法。 10 第3圖顯示一取自實施例1之第一離子交換層析法樣 品所得到之SDS-PAGE電泳結果。 第4圖顯示一取自實施例1之第二離子交換層析法樣 品所得到之SDS-PAGE電泳結果。 第5圖顯示一取自實施例4樣品所得到之SDS-PAGE 15電泳結果。

第6圖顯示一取自實施例2樣品所得到之SDS-PAGE 電泳結果。 第7圖顯示一取自實施例3樣品所得到之sdS-PAGE 電泳結果。 20 C貧施方式3 較佳實施例之詳細說明 本發明方法之一實施態樣係例示於第1圖，其係顯示 自血漿餾分製造apoA-l之製造方法流裎圖。 7 1357347 Π)血漿餾分τν預處理 在此所稱之餾分IV係為利用科恩(Cohn)乙醇分餾方 法所得到者（Cohn，E. J·; Strong, L.E.; Huges, W.L_; et al·， Preparation and properties of serum and plasma proteins IV. 5 A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids.

Amer ChemSoc” 1946, 68:459-475)。該餾分 是溶解於 一種緩衝液中’ 一定量的尿素則被加入該溶液中並被完全 地混合。在此方法中，apoAd係與尿素相結合，且此結 10合是屬可逆的。所加入之尿素濃度是1-8 Μ，較佳是3-7 Μ ’更佳是5-6 Μ。餾分IV與尿素之質量比例係為 1:30-300 ’ 較佳是 1:90-240，更佳是 1:150-210。 可以選用此技術中一般常用的緩衝液：Tds緩衝液、 磷酸緩衝液或HEPES緩衝液，較佳是Tris緩衝液。該緩 15衝液PH係為7.2-8.5，較佳為7.5-8，更佳為7.8。 在另一實施例中’該餾分IV是在低溫下（〇-4。〇溶解。 在另一實施例中’是將該預處理溶液離心以去除沈降 物並將之過濾。離心的速度是6 〇〇〇1〇 〇〇〇 rpm、較佳是 8,000 rpm ’且該過濾膜的孔洞大小係為0.2 —0.6/zm，較 20 佳是 0.45/zm。 (2)第一 交換層析法 將步驟（1)所得到的溶液添載於DEAE (二乙胺乙醇） 陰離子交換管柱上，在溶液中之蛋白質 ，包含apoA-Ι，則 會結合至該管柱上°詳言之’得自步驟⑴之apoA-Ι溶液 8 1357347 是以水稀釋1-10倍，較佳是3-7倍。在稀釋後，該溶液係 以流速為0.5-1.5 ml/min，較佳是0.8-1.2 ml/min，而被添 載至陰離子交換管柱。 而後，該蛋白是以二個溶析步驟來溶析出。第一步驟 5 是使用一種具有低導電性之緩衝液來溶析該管柱。此時 apoA-Ι與該管柱是相當弱的結合，且主要含有apoA-Ι的 蛋白質會被最先溶析出。第二步驟是使用一種具有高導電 性之緩衝液來溶析該管柱，且主要含有雜質之蛋白會則會 被溶析出。 10 用來溶析apoA-Ι之溶析液含有1-8 Μ尿素，較佳是 3-7 Μ尿素，且更佳是5-6 Μ尿素。該導電性係為1-4 ms/cm，較佳為 2-3.8 ms/cm，更佳為 2.5-3.6 ms/cm.。在 溶析液中之鹽類可包含有，但不限於NaQ、KC1、MgCl2 與CaCl2，而以NaCl為佳。 15 用來溶析雜質之溶析液包含有0-1 Μ尿素，而以0 Μ 為佳。該導電度係為4.5 — 100 ms/cm.。在溶析液中之鹽類 包含有，但不限於NaCl、KC1、MgCh與CaCh ’而以NaCl 為佳。 可以選用此技術中一般常用的緩衝液：Tris緩衝液、 20 磷酸緩衝液或HEPES緩衝液，較佳是Tris緩衝液。該緩 衝液pH係為7.2-8.5，較佳為7.5-8，更佳為7.8。 得自於步驟1之餾分預處理溶液的管柱流速係為 0.5-1.5 ml/min，較佳為 0.8-1.2 ml/min。該餾分 IV 與管柱 之體積比係為1:5-50,較佳為1:15-40,且更佳為1:20-30。 9 1357347 Ω)第一.deae陰離干交換層耕法 得自第一 DEAE陰離子交換層析步 液，包含有apoA-1、尿素以及少量雜質， 導電度’而後被添載至第二DEAE管杈。

驟之apoA-Ι溶 是以水稀釋至低 5該蛋白是結合在ΜΑΕ管柱，而該尿素則保持在溶液 中，並會流過管柱而消除。而後，該蛋白是利用二個溶析 步驟而被溶析出來。第-個步驟中是使用具有相當低導電 度之緩衝液來溶析管柱^ApoA-Ι會強烈地與該管柱結合， 且該雜質亦會自管柱溶析出來。第二個步驟則使用高導電 10度之緩衝液來溶析管柱’且該純質之apGA]會被溶析出 來。 溶析該雜質之溶析液的導電度係為，較佳 為7-15 mS/Cm，更佳為9-12 ms/cm。在該溶析液中可以 存在有0-1 Μ尿素，而以〇 M為佳◦在溶析液中之鹽類 15可包含有’但不限於NaC卜ΚΠ、MgCl2與CaCl2。而以 NaCl為佳。 溶析該apoA-Ι之溶析液的導電度係為50-100 ms/cm ’ 較佳為 70-95 ms/cm，更佳為 80-90 ms/cm。在該 溶析液中可以存在有〇_1 IV[尿素，而以〇 Μ為佳。在溶 20析液中之鹽類可包含有，但不限於NaCl、KC1 ' MgCl2與 CaCl2，而以NaCl為佳。 在另一實施例中，在ap〇A-l與少量雜質係結合於該第 二DEAE管柱上時，則使用一種3 mS/cm/min之導電梯度 來溶析該蛋白。該溶析液的導電度是自1升至100 ms/cm。 10 1357347 純質之叩‘1是在導電度在3〇與6〇ms/cm之間被溶析 出來並被收集。 可以選用此技術中一般常用的緩衝液：Tris緩衝液、 填酸緩衝液或HEPES緩衝液，較佳是加緩衝液。該緩 5衝液PH係為7.2-8.5 ’較佳為7·5_8，更佳為7 8。 本發明亦提供-種後加王方法，以將得自於步驟(3) 之純質apoA]溶液予以加工。該方法包含有超-過滤步 驟、安定劑加入步驟以及冷凍乾燥步驟。在後加工步驟後， 最後可以得到經冷凍乾燥apoA」。 10 此技術領域常使用超-過濾是用來將apoA_i溶液調 節、調整該溶液至適合之pH與蛋白質濃度。超_過濾是使 用一種具有切斷5000之分子量的超_過濾膜a Mimp〇re PES，操作溫度係為4t，且操作壓力是在ο」

Mpa。 所加入的安定劑是源自該等此技術領域常使用者，包 15含但不限於，羥基丙基纖維素、羥基丙基曱基纖維素、纖 維素乙二醇酸鈉纖維素乙二醇酸鈉、蔗糖、山梨醇 (sorbierite)等。 使用是此技術領域常使用之冷凍乾燥：產物是在低於 -36°C冷束達3-4小時’而後在真空度是7_9以下冷凍乾 20燥。該冷阱(cold trap)之溫度係約·55ι，而後在第二期間， 該保存溫度係為4〇°c，且時間為約15小時。 使用於本發明之層析管柱可以是此技術領域中常使 用者，且該層析用介質可以是QAE (四級銨）或DEAE陰離 子交換層析介質’較佳為DEAE。 11 1357347 本發明進-步以下列實施例來加以例示說明。可以了 解到的是，此等實施例是使用來解釋本發明，旅朴用來限 制本心明範驚。在下列實施例中為了實驗的目的，若未就 其條件加以載述，則其意指該條件是一般常用者或為製造 5商所告知者。除非另外載述，否則下列所提比例係為質量 比例。 除非另有界定’技術與科學用語的界定係為此發明技 術人士一般所了解者。 實施例1 ApoA-1純化

10 起始物質包含有：0.2 g血漿餾分iv、二個5 ml DEAE 陰離子交換管柱（得自GE Healthcare)與純化與導電度測 定設備’即 AKTA EXPLORER 100 (得自 GE Healthcare)。 (1) 血漿餾分IV預處理 將〇·2 g餾分IV係溶解於1〇〇 ml Tris緩衝液（pH 15 7.8, 4 C)中，再將尿素加入該溶液中直到該最終濃度係為6 mol/L，且被完全地將之混合。該溶液係在8,000 rpm離 心’以去除沈降物，而後以0.45 μηι過渡膜過據。 (2) 第一 DEAE陰離子交換層析法 第一 DEAE管柱是以含有6 mol/L尿素之Tris緩衝 20 液（pH 7.8)所平衡。源自於步驟⑴之溶液是以1 ml/min 的流速添載於DEAE管柱上。具有6 mol/L尿素濃度的 Tris緩衝液（pH 7.8，導電性3.5 ms/cm)是用來溶析該管 柱。ApoA-1則被溶析出來。該溶析的體積係為2〇 ml。使 用四種不同的Tris緩衝液s (每一個係具有pH 7.8且分別 12 1357347 具有 4.3 ms/cm、5.4 ms/cm、6.7 ms/cm 及 59.2 ms/cm 之 導電度）來溶析該管柱，而將雜質溶析出來。該溶析步驟、 其該溶析方法結果以及其獲致SDS-PAGE電泳結果是分 別顯示於第2與3圖。在第2圖之X-座標為在層析方法中 之溶析體積，而y·座標則是在溶析液中蛋白質濃度。數字 1至9則顯示採取樣品之點。該樣品是以第3圖所示之 SDS-PAGE電泳結果來加測定。箭頭顯示該蛋白 的位置。 (3)第二DE又E陰離子交換層析法 ίο 在步驟(2)所浴析出來的apoA-1 (pH 7 §，導電度3 5 ms/cm)，其包含有apoA-i、尿素與少量雜質係以水稀釋 5倍，而後以10 ml/min流速被添載於第二deae管柱。 AM·!與少4_質係結合於管桂，㈣素聽留在溶液 中並會流經管柱而去除。 15 不具尿素之Tds緩衝液（pH7.8，導電度n 7ms/cm) 疋使用來溶析該管柱，雜質會自料溶析出。而後不具 有尿素之Tris緩衝液（PH 7.8，導雷声。 A a 电度85.2 ms/cm)是用 來溶析該管柱，且ap〇A-l係被溶析出來。 20 SDS·職電泳結果顯示純質咖〜是在此步驟中 ^ (第4 ,該樣品1為在添餘驟_流經管柱溶液 中之蛋白質。樣品2則是標記蛋白質。 在第-次溶析步驟所收集的樣品，I ^ 15則顯不 者。數目6至10則顯示第二次溶析 、冓成 其主| 0出 Δ 1 όϊί· 斤收集的樣品’ 、要疋由aP〇A-1所構成者。樣品6座7 a /、/疋被稀釋5倍， 13 1357347 樣品8則是稀釋10倍。箭頭顯示該apoA-l蛋白的位置。 實施例2 ApoA-l純化 0.2 g血漿餾分IV與設備係與實施例1者相同。 5 (1)血漿餾分IV預處理 將0.2 g餾分IV係溶解於100 ml Tris緩衝液（pH 7.8, 4°C)中，再將尿素加入該溶液中直到該最終濃度係為6 mol/L且將之完全地混合。該溶液係在8，000 rpm離心， 以去除沈降物，而後以0.45 μιη過濾膜過濾。 10 (2)第一 DEAE陰離子交換層析法 第一 DEAE管柱是以含有6 mol/L尿素之Tris緩衝 液（pH 7.8)所平衡。源自於步驟（1)之溶液是以1 ml/min 的流速添載於DEAE管柱上。具有6 mol/L尿素濃度的 Tris緩衝液（pH 7.8,導電性3.5 ms/cm)是用來溶析該管 15 柱。ApoA-l則被溶析出來。該溶析的體積係為20 ml。使 用Tris緩衝液（pH 7.8，導電度59.2 ms/cm)來溶析該管 柱，以溶析出雜質。 (3)第二DEAE陰離子交換層析法 使用相同於實施例1之步驟。純化的結果是顯示於第 20 5圖。樣品1係為預處理步驟後之血漿餾分IV的上清液。 樣品4至8係為純化步驟中所收集之apoA-l。樣品10則 是在純化步驟中所收集之雜質。箭頭顯示該apoA-l蛋白 的位置。 14 1357347 實施例3 ApoA-l純化 〇·2 g血漿餾分IV與設備係與實施例1者相同。 (1) 血漿餾分IV預處理 將0.2 g館分IV係溶解於1〇〇 mi Tris緩衝液（pH 5 7·8, 4 C)中’再將尿素加入該溶液中直到該最終濃度係為6 mol/L，且將之完全地混合。該溶液係在8 〇〇〇 rpm離心， 以去除沈降物’而後以0·45 μηι過濾膜過濾。 (2) 第一 DEAE陰離子交換層析法 第一 DEAE管柱是以含有6 m〇i/L尿素之Tris緩衝 10液（PH 7.8)所平衡。源自於步驟（1)之溶液是以i ml/min 的流速添載於DEAE管柱上。具有6 mol/L尿素濃度的 Tris緩衝液（pH7_8，導電性3.5ms/cm)是用來溶析該管 柱。ApoA-l則被溶析出來《該溶析的體積係為2〇m卜使 用Tris緩衝液（pH 7.8，導電度59.2 ms/cm)來溶析該管 15 柱，以溶析出雜質。 (3) 第二DEAE陰離子交換層析法 其步驟相同於實施例1 且純化的結果顯示於第7圖。 實施例4 ApoA-l中間型試驗規模的純化 20 起始物質包含有：60g血漿餾分IV、二個1500 ml DEAE陰離子交換管柱（得自Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Cooperation)，陰離子交換介 質’即 DEAE Sepharose FF (得自 GE Healthcare)、泵以及 UV 檢測器（得自 Shanghai Jinhua Chromatography 15 1357347

Equipment Corporation)以及純化與導電度測定設備，即 AKTA EXPLORER 100 (得自 GE Healthcare) (1) 血漿餾分IV預處理

60g德分IV係溶解於100 ml Tris緩衝液（pjj 7.8, 4 5 °C)中。將尿素加入該溶液中直到該最終濃度係為6 mol/L 且被完全地混合。該溶液係在8,000 rpm離心，以去除沈 降物，而後以0.45 μιη過濾膜過濾。

(2) 第一 DEAE陰離子交換層析法 第一 DEAE管柱是以含有6 mol/L尿素之Tris緩衝 10 液（PH 7.8)所平衡。源自於步驟（1)之溶液是以1〇 ml/min 的流速添載於DEAE管柱上。具有6 mol/L尿素漢度的 Tris緩衝液（pH 7.8，導電性3.7 ms/cm)是用來溶析該管 柱。ApoA-1則被溶析出來。該溶析的體積係為1〇L。使用 Tris緩衝s (pH 7.8，導電度80.3 ms/cm)來溶析該管柱，以 15 溶析出雜質。 (3) 第二DEAE陰離子交換層析法 在步驟(2)所溶析出來的apoA-1 (pH 7.8，導電度3 7 ms/cm) ’其包含有ap〇A-l、尿素與少量雜質，係以水稀 釋5倍，而後以1〇 mi/min流速被添載於第二DEAE管柱。 20 APOA·1與少量的雜質係結合於管柱，而尿素則保留在溶 液，並會流經管/柱-而~^除\ 不具尿，之’Tris緩（pH 7,8,導電度12,2 ms/cm) 是使用采柱〆雜質會自管柱溶析出。而後不具 有尿素之Tris緩衝液（pH 7.8，導電度50.4. ms/cm)是用 16 1357347 來溶析該管柱，且apoA-l係被溶析出來。 SDS-PAGE電泳結果是顯示於第5圖。此結果顯示， 中間型試驗規模的純化下可得獲得純質之The apoA-1。 5 實施例5 ApoA-l蛋白測定 純化自實施例1之apoA-l蛋白是以源自於shanghai SUN Biotech Co. LTD.之ap〇A-l免疫濁度測定套組來加 以測定。 10//1純化蛋白質係加入1 ml之fapoAd抗血清中， 10而後在37 C下培育15分鐘。在該培育後，測定該溶液在 505 nm下的吸光度。其結果顯示此蛋白質係為叩〇八_ 1。 實施例6 ApoA-1蛋白測定 使用貫施例5的方法，將分別源自於實施例2與3 15之ap〇A_l蛋白以及源自於實施例4之叩〇八_丨蛋白以源自 於 Shanghai SUN Biotech Co· LTD.之 apoA-l 免疫濁度測 定套組來加以決定。 其亦獲得相似的結果。 本發明具有通常知識者皆了解並認為，在此所例示說 20明並揭不之實施態樣的各種變化皆可以在未偏離本發明之 精神與範圍下進行。因此，在此想要的是，前述的說明僅 是用來例示說明，本發明之真正精神與範圍則是由所附之 申請專利範圍來決定者。 17 1357347 ί：圖式簡單說明3 第1圖為顯示自血漿餾分製造apoA-l之製造方法流程 圖。 第2圖顯示在實施例1中第一離子交換層析法之溶析 5 方法。 第3圖顯示一取自實施例1之第一離子交換層析法樣 品所得到之SDS-PAGE電泳結果。 第4圖顯示一取自實施例1之第二離子交換層析法樣 品所得到之SDS-PAGE電泳結果。

10 第5圖顯示一取自實施例4樣品所得到之SDS-PAGE 電泳結果。

第6圖顯示一取自實施例2樣品所得到之SDS-PAGE 電泳結果。 第7圖顯示一取自實施例3樣品所得到之SDS-PAGE 15 電泳結果。 【主要元件符號說明】 (無） 18

Claims (1)

1. 第96145616號專利申請案申請專利範圍修正本修正曰期：100年10月26曰 十、申請專利範圍： ρ年~月正替換頁 1. 一種純化脂蛋白原A-l(apoplipoprotein A-1)之方法，其 包含： a) 將血漿餾分IV與1-8 Μ尿素溶液相混合，形成 一種餾分IV預處理溶液； b) 將該步驟a)所得到之該預處理溶液添載於一種 第一陰離子離子交換層析管柱，其後並以一種包含有 1-8 Μ尿素且具有1-4 ms/cm導電度之緩衝液I加以 溶析，以得到一種主要含有apoA-1蛋白之溶析液I ; c)將該溶析液I添載於一種第二陰離子離子交換 層析管柱，再先以一種具有1-15 ms/cm導電度之緩 衝液II溶析，而後再以一種具有30-100 ms/cm導電 度之緩衝液III溶析，以得到純質之apoA-Ι蛋白。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該血漿餾分IV是 得自於科恩（Cohn)乙醇分餾方法。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液II包含 有0-1 Μ尿素。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液III包 含有0-1 Μ尿素。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟a)與b) 中之該尿素濃度為3·8 Μ。 6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟a)與b) 中之該尿素濃度為5-7M。 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液I之導 1357347 (f：##月β曰修(更)正替換頁 第96145616號專1利申請棄中讀專'利_範固修止奉1^·正日期：100年10月26曰 電度係為2-4 ms/cm、該緩衝液II之導電度係為7-15 ms/cm，以及該鎂衝液III之導電度係為70-95 ms/cm ° 8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液I之導 5 電度係為2.5-3.6 ms/cm、該缓衝液II之導電度係為 9-12 ms/cm，以及該緩衝液III之導電度係為80-90 ms/cm ° 9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該各個陰離子離 子交換層析管柱係下列管柱之一種：1)為強陰離子離 10 子交換層析管柱；以及2)弱陰離子離子交換層析管柱。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其甲該各個陰離子離 子交換層析管柱係下列管柱之一種：1) QAE(四級銨） 離子交換管柱；以及2) DEAE(二乙胺乙醇)離子交換 管柱。 15 11.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟a)之該 餾分IV與該尿素的質量比係為1:30-300。 12.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟a)之該 餾分IV與該尿素的質量比係為1:90-240。 13·如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟a)之該 20 餾分IV與該尿素的質量比係為1:150-210。 14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟b)與c) 中之該緩衝液1、11與III包含有至少一種選自於下列 群組中之鹽類：NaC卜KC卜MgCl2與CaCl2。 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟b)與c) 20 1357347

   ίο 15

   20 卜年(。月修辦替換頁I 第96145616號專利申請案申請專圍#正本曰期:Ί00年10月26曰 中之該溶析緩衝液I、II與III包含有NaCl。 16.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟a)與b) 之間，該餾分IV預處理液係被離心以去除沈降物， 並被過滤。 17·如申請專利範圍第16項之方法，其中該餾分IV預處 理溶液係在6,000-10,000 rpm速率下離心，並以一具 有0.2 —0.6μιη孔洞大小的過濾膜進行過濾。 18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該步驟b)與c) 之間，大部分雜質係被一具有4.5-70 s/cm導電度之緩 衝液IV所溶析出。 19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該緩衝液IV包 含有0-1 Μ尿素。 20. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該缓衝液IV包 含有至少一種選自於下列群組中之鹽類：Naa、 KC1、MgCl2 以及 CaCl2。 21. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該緩衝液IV包 含有NaCl。 22. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液I、II 與 III 之 pH 係為 7.2-8.5。 23. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液I、II 與III包含有Tris緩衝液。 24. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液I、II 與III之pH係為7.5-8。 25. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液I、II 21 1357347 />年P月1^日修(走)正替換頁I 第96145616號專利屮岫土彳，4專利奴凼修正本曰期：1〇〇年10月26曰 與III之pH係為7.8。 26.如申請專利範圍第1項之方法，其進一步在該步驟c) 後，包含有下列步驟之至少一者：超過濾該純質 apoA-1蛋白、加安定劑至該純質apoA-1蛋白，以及 5 冷柬乾燥該純質apoA-1蛋白。 22