JP5013560B2 - ヘモグロビンｓの分析方法、及び、ヘモグロビンａ２の分析方法 - Google Patents
ヘモグロビンｓの分析方法、及び、ヘモグロビンａ２の分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5013560B2 JP5013560B2 JP2011524076A JP2011524076A JP5013560B2 JP 5013560 B2 JP5013560 B2 JP 5013560B2 JP 2011524076 A JP2011524076 A JP 2011524076A JP 2011524076 A JP2011524076 A JP 2011524076A JP 5013560 B2 JP5013560 B2 JP 5013560B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hemoglobin
- peak
- eluent
- minutes
- measurement sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 108010016797 Sickle Hemoglobin Proteins 0.000 title claims description 41
- 108010027616 Hemoglobin A2 Proteins 0.000 title claims description 37
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 106
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 28
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 22
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 17
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 107
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 61
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 61
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 59
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 10
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 108700021935 methemoglobin azide Proteins 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010044267 Abnormal Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 2
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 108010005922 oxyhemoglobin S Proteins 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZRXHLJNBNWVNIM-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-1-benzofuran Chemical compound C1=CC=C2C(C)=COC2=C1 ZRXHLJNBNWVNIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 108091005880 Hemoglobin F Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ICAIHGOJRDCMHE-UHFFFAOYSA-O ammonium cyanide Chemical compound [NH4+].N#[C-] ICAIHGOJRDCMHE-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZJRLCPXRZLFGU-UHFFFAOYSA-N azidomercury Chemical compound [Hg]N=[N+]=[N-] NZJRLCPXRZLFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQPZNWPYLFFXCP-UHFFFAOYSA-L barium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ba+2] RQPZNWPYLFFXCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001863 barium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- DOBRDRYODQBAMW-UHFFFAOYSA-N copper(i) cyanide Chemical compound [Cu+].N#[C-] DOBRDRYODQBAMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 108010002255 deoxyhemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- UMTFPTCPRUEQHM-UHFFFAOYSA-N dicyanolead Chemical compound N#C[Pb]C#N UMTFPTCPRUEQHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- JMQGGPRJQOQKRT-UHFFFAOYSA-N diphenyl hydrogen phosphate;azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-].C=1C=CC=CC=1OP(=O)(O)OC1=CC=CC=C1 JMQGGPRJQOQKRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- JUINSXZKUKVTMD-UHFFFAOYSA-N hydrogen azide Chemical compound N=[N+]=[N-] JUINSXZKUKVTMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- PANJMBIFGCKWBY-UHFFFAOYSA-N iron tricyanide Chemical compound N#C[Fe](C#N)C#N PANJMBIFGCKWBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNJFAQMJRFJRF-UHFFFAOYSA-N iron(2+) diazide Chemical compound [Fe+2].[N-]=[N+]=[N-].[N-]=[N+]=[N-] HMNJFAQMJRFJRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- GUWHRJQTTVADPB-UHFFFAOYSA-N lithium azide Chemical compound [Li+].[N-]=[N+]=[N-] GUWHRJQTTVADPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- FQGYCXFLEQVDJQ-UHFFFAOYSA-N mercury dicyanide Chemical compound N#C[Hg]C#N FQGYCXFLEQVDJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTMHWRHEGDRTPD-UHFFFAOYSA-N n-(4-azidosulfonylphenyl)acetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(S(=O)(=O)N=[N+]=[N-])C=C1 NTMHWRHEGDRTPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DYEGEQTYEIHCSO-UHFFFAOYSA-N n-diazo-4-dodecylbenzenesulfonamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCC1=CC=C(S(=O)(=O)N=[N+]=[N-])C=C1 DYEGEQTYEIHCSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005553 polystyrene-acrylate Polymers 0.000 description 1
- TZLVRPLSVNESQC-UHFFFAOYSA-N potassium azide Chemical compound [K+].[N-]=[N+]=[N-] TZLVRPLSVNESQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- QBFXQJXHEPIJKW-UHFFFAOYSA-N silver azide Chemical compound [Ag+].[N-]=[N+]=[N-] QBFXQJXHEPIJKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFAGQMCIGQNPJG-UHFFFAOYSA-N silver cyanide Chemical compound [Ag+].N#[C-] LFAGQMCIGQNPJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098221 silver cyanide Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法に関する。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるヘモグロビン類の分析は現在広く行われており、糖尿病診断ではグリコヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃの定量や異常ヘモグロビンの分析等に用いられている。例えば、特許文献１には、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィーを用いた方法が開示されている。近年の糖尿病患者の増加に伴い、ヘモグロビンＡ１ｃの測定件数も増加傾向にあり、ＨＰＬＣでの測定においても高精度測定と測定時間の短縮が求められている。
生体内において、ヘモグロビン類には、酸素が結合したオキシヘモグロビン、二酸化炭素が結合したデオキシヘモグロビン、ヘムに含まれている鉄が酸化されて三価の鉄イオンとなったメトヘモグロビンが存在する。また、アジ化物やシアン化物が共存している場合、アジ化物やシアン化物がメトヘモグロビンの三価の鉄イオンに結合し、アジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビンとなって安定化することが知られている。しかしながら、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣでは、オキシヘモグロビンの溶出時間と、これらのアジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビンの溶出時間とに違いが生じることがある。これらのヘモグロビン類の電荷の違いはわずかであるため、ピークが完全分離できずにブロード化したり二峰性を示したりする。
ＨＰＬＣを用いたヘモグロビン類の分析は、糖尿病診断の他に主に貧血を引き起こす異常ヘモグロビン症やサラセミアといった診断にも使用されている。なかでも、ヘモグロビンＳは最も多くみられる異常ヘモグロビンであり、重篤な貧血症状を引き起こす鎌状赤血球症の原因物質であるため、分離、検知の需要は大きい。また、糖尿病のマーカーであるヘモグロビンＡ１ｃを測定する際には、ヘモグロビンＳをはじめとした異常ヘモグロビンを分離することが望ましく、ピークがブロード化したり二峰性となっていたりしては正常ヘモグロビンとの分離が困難となるとともに、測定値への悪影響が懸念されるため、シャープなピークとして分離させることが好ましい。一方、サラセミアの診断ではヘモグロビンＡ２を測定する必要があるが、微量成分であるとともに、多量に存在しているヘモグロビンＡ０と隣接して溶出されることが多いため、ヘモグロビンＡ０、Ａ２ともにシャープなピークとして分離させることが好ましい。しかしながら、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、陽イオン交換カラムとの保持力が比較的強い成分は、ピークがブロード化したり二峰性となったりしやすいという問題がある。
また、新鮮血よりも劣化血の方がブロードや二峰性のピークを生じやすい傾向がある。これは劣化により生じるメトヘモグロビンが増加することが原因である。そのため、再検査等で保存検体の分析を行う場合に測定値への影響が懸念されている。
また、新鮮血よりも劣化血の方がブロードや二峰性のピークを生じやすい傾向がある。これは劣化により生じるメトヘモグロビンが増加することが原因である。そのため、再検査等で保存検体の分析を行う場合に測定値への影響が懸念されている。
本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することを目的とする。
本発明１は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．８８〜７．５０である溶離液を用いるヘモグロビンＳの分析方法である。
本発明２は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．６０〜６．８０である溶離液を用いるヘモグロビンＡ２の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。
本発明２は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．６０〜６．８０である溶離液を用いるヘモグロビンＡ２の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。
従来、保持力の強いヘモグロビン類を分離する場合、通常、ｐＨ６未満の溶離液が使用されており、本発明者らは、このｐＨ範囲がピークの形状に大きく影響を及ぼしていることを見出した。
そこで本発明者らは、特定の濃度でアジ化物又はシアン化物を配合することによってメトヘモグロビンを安定化させた溶離液のｐＨをヘモグロビンの等電点付近の特定の範囲に調整することにより、保持力の強いヘモグロビン類であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
なお、本明細書において「保持力の強いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の強いヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳを意味する。ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳの等電点は６．９５〜７．４５の範囲内であることが知られている。また、本明細書において「保持力の弱いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の弱いヘモグロビン類を意味し、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられる。なお、保持力はヘモグロビンの立体構造によっても変化するため、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、等電点と溶出順は必ずしも一致するとは限らない。
そこで本発明者らは、特定の濃度でアジ化物又はシアン化物を配合することによってメトヘモグロビンを安定化させた溶離液のｐＨをヘモグロビンの等電点付近の特定の範囲に調整することにより、保持力の強いヘモグロビン類であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
なお、本明細書において「保持力の強いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の強いヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳを意味する。ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳの等電点は６．９５〜７．４５の範囲内であることが知られている。また、本明細書において「保持力の弱いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の弱いヘモグロビン類を意味し、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられる。なお、保持力はヘモグロビンの立体構造によっても変化するため、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、等電点と溶出順は必ずしも一致するとは限らない。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法では、アジ化物又はシアン化物を含有する溶離液を用いる。
上記溶離液が上記アジ化物又は上記シアン化物を含有することにより、メトヘモグロビンを安定化させることができる。なお、一般的にヘモグロビン類の定量は４１５ｎｍ付近の吸光度により測定しているが、オキシヘモグロビンと、アジドメトヘモグロビン及びシアンメトヘモグロビンとの４１５ｎｍ付近の吸光度スペクトルにはほとんど差はなく、定量性に支障はないと考えられる。一方、溶離液中にアジ化物又はシアン化物が含まれていない場合、メトヘモグロビンとして存在し、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーでは溶出時間が大幅に遅くなることが知られている。また、外部環境による異なるが、吸光度の極大値が４０５ｎｍ付近となるため、４１５ｎｍの波長では定量性に悪影響を及ぼすことがある。
上記溶離液が上記アジ化物又は上記シアン化物を含有することにより、メトヘモグロビンを安定化させることができる。なお、一般的にヘモグロビン類の定量は４１５ｎｍ付近の吸光度により測定しているが、オキシヘモグロビンと、アジドメトヘモグロビン及びシアンメトヘモグロビンとの４１５ｎｍ付近の吸光度スペクトルにはほとんど差はなく、定量性に支障はないと考えられる。一方、溶離液中にアジ化物又はシアン化物が含まれていない場合、メトヘモグロビンとして存在し、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーでは溶出時間が大幅に遅くなることが知られている。また、外部環境による異なるが、吸光度の極大値が４０５ｎｍ付近となるため、４１５ｎｍの波長では定量性に悪影響を及ぼすことがある。
上記アジ化物としては、例えば、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４−ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４−アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。
上記シアン化物としては、例えば、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液中の上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度の下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌであると、メトヘモグロビンを安定化する効果が充分に得られない。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、過度なメト化の進行やヘモグロビン類の分解が発生する。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度の好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は３０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＳであっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．８０、上限は７．５０である。上記溶離液のｐＨが６．８０未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＳを測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが７．５０を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明１のヘモグロビンＳの分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．９５、好ましい上限は７．４５、より好ましい下限は７．００、より好ましい上限は７．４０である。
また、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＡ２であっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。
本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．４５、上限は６．８５である。上記溶離液のｐＨが６．４５未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＡ２を測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが６．８５を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．５０、好ましい上限は６．８０である。
更に、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＡ０であっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。
本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．００、上限は６．７５である。上記溶離液のｐＨが６．００未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＡ０を測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが６．７５を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．２０、好ましい上限は６．７０、より好ましい下限は６．４０、より好ましい上限は６．６５である。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液としては、上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度、及び、ｐＨが上述した範囲内であれば特に限定されず、例えば、有機酸及びその塩類、アミノ酸類、無機酸及びその塩類、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有する公知の緩衝液を用いることができる。
上記有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
上記有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液の緩衝剤濃度は特に限定されないが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝剤濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、緩衝作用が充分に得られないことがある。上記緩衝剤濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝剤の析出が起こりＨＰＬＣの流路を詰まらせる原因となったり、溶離液の切り替え効率が低下して平衡化に時間がかかる原因となったりする。上記緩衝剤濃度のより好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
上記溶離液は、ヘモグロビン類のピーク溶出を最適化することを目的として、過塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム等の無機塩類を含有してもよい。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液中における塩の濃度は特に限定されないが、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記塩の濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出してシステムに悪影響を及ぼすことがある。上記塩の濃度のより好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
上記溶離液は、ｐＨ調整剤として、公知の酸、塩基を含有してもよい。上記酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、上記塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
上記溶離液は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を含有していてもよい。上記水溶性有機溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０は上述した溶離液で分離するが、保持力の弱いヘモグロビン類は、上述した溶離液に先立って、上述した溶離液よりもｐＨの低い他の溶離液を用いて溶出してもよい。その場合、各溶離液は同一の成分を含む緩衝液を用いるものであることが好ましいが、溶離液を切り替える際の検出器出力のベースライン変動が測定値に悪影響を与えなければ、必ずしも同一の成分を含む緩衝液を用いるものに限定されない。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、緩衝剤濃度も同一であるものを用いることがより好ましい。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、緩衝剤濃度も同一であるものを用いることがより好ましい。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法では、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーを用いる。上記陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーとしては、公知の方法を用いることができる。例えば、ポンプを用いて溶離液を送液し、デガッサーを通した後に陽イオン交換カラムに送り、陽イオン交換カラムに保持されたヘモグロビン類を分離させて、陽イオン交換カラムから溶出してきた移動相を検出する方法を用いることができる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法で用いる陽イオン交換カラムは、カラム本体に固定相が充填されたものである。固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。
上記充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
上記無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
上記有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。
上記充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
上記無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
上記有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。
上記固定相としては、陽イオン交換基を有する固定相を用いることが好ましい。
上記陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
上記陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法における測定条件は、使用する測定試料、陽イオン交換カラム等の種類によって適宜選択できるが、上記溶離液の流速の好ましい下限は０．０５ｍＬ／分、好ましい上限は５ｍＬ／分、より好ましい下限は０．２ｍＬ／分、より好ましい上限は３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出波長は４１５ｎｍが好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等の溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
本発明によれば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することができる。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
（実施例１）
測定検体には以下の３種を用いた。
ヘモグロビンＳを含む血液を希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で１００倍に希釈したものを測定検体Ａとした。
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）を（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で５０倍に希釈したものを測定検体Ｂとした。
測定検体Ａと測定検体Ｂとを１：１で混合したものを測定検体Ｃとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．５分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．５分を超え１．０分までは表１に示した溶離液２にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。溶離液２では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。
検出波長は４１５ｎｍで行った。
測定検体には以下の３種を用いた。
ヘモグロビンＳを含む血液を希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で１００倍に希釈したものを測定検体Ａとした。
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）を（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で５０倍に希釈したものを測定検体Ｂとした。
測定検体Ａと測定検体Ｂとを１：１で混合したものを測定検体Ｃとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．５分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．５分を超え１．０分までは表１に示した溶離液２にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。溶離液２では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。
検出波長は４１５ｎｍで行った。
（実施例２〜５、及び、比較例１〜７）
０．５分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表１に示した溶離液３〜１３を用いたこと以外は実施例１と同様にして測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃを測定した。溶離液３では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。また、溶離液４〜１３は、測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が５０秒となるようにｐＨと塩濃度を調整した（図１）。
０．５分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表１に示した溶離液３〜１３を用いたこと以外は実施例１と同様にして測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃを測定した。溶離液３では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。また、溶離液４〜１３は、測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が５０秒となるようにｐＨと塩濃度を調整した（図１）。
＜評価＞
実施例１〜５、及び、比較例１〜７において、溶離液２〜１３を送液している０．５分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃのクロマトグラムを図２〜１３に示す。図２〜１３において、ピーク１はヘモグロビンＡ０、ピーク２はオキシ状態のヘモグロビンＳ、ピーク３はアジドメトヘモグロビンＳを示す。なお、一般的にヘモグロビンＳを含む検体は測定検体Ａと同様のクロマトグラムを示し、オキシ状態のヘモグロビンがリッチな状態である。測定検体Ｂはほとんどのヘモグロビンがメト化しているものであり、メトヘモグロビンがリッチな状態である。これは通常検体を極端に劣化させた場合と同様の状態である。測定検体Ｃはオキシ状態のヘモグロビンとメトヘモグロビンをそれぞれ同程度の比率で存在した状態であり、ピークの二峰性が生じやすい条件を設定するために用いた。
図２〜１３より、溶離液２〜６を用いた場合、測定検体Ａのピーク２がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、測定検体Ｃにおいては溶離液７〜１１を用いた場合にピーク２、３からなる二峰性ピークが確認された。
実施例１〜５、及び、比較例１〜７において、溶離液２〜１３を送液している０．５分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃのクロマトグラムを図２〜１３に示す。図２〜１３において、ピーク１はヘモグロビンＡ０、ピーク２はオキシ状態のヘモグロビンＳ、ピーク３はアジドメトヘモグロビンＳを示す。なお、一般的にヘモグロビンＳを含む検体は測定検体Ａと同様のクロマトグラムを示し、オキシ状態のヘモグロビンがリッチな状態である。測定検体Ｂはほとんどのヘモグロビンがメト化しているものであり、メトヘモグロビンがリッチな状態である。これは通常検体を極端に劣化させた場合と同様の状態である。測定検体Ｃはオキシ状態のヘモグロビンとメトヘモグロビンをそれぞれ同程度の比率で存在した状態であり、ピークの二峰性が生じやすい条件を設定するために用いた。
図２〜１３より、溶離液２〜６を用いた場合、測定検体Ａのピーク２がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、測定検体Ｃにおいては溶離液７〜１１を用いた場合にピーク２、３からなる二峰性ピークが確認された。
（ピーク形状）
測定検体Ａにおけるピーク２のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。通常、シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いるが、本例ではピーク２の前にピーク１が隣接しているため、５％位置のピーク幅が算出できなかったことから、半値幅を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２のシンメトリー係数との関係を図１４に示した。図１４より、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の７に近づくほどシンメトリー係数が１に近づき、ピークの対称性が高まることが分かる。
更に、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差を算出した。測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３の溶出時間差はオキシ状態のヘモグロビンＳとアジドメトヘモグロビンの溶出時間差を示しており、この差が小さいほど溶出時間が近づき単一ピークとなるため、シンメトリー係数と合わせてピーク形状の判断指標として用いた。結果を表２に示した。また、測定検体Ａと測定検体Ｂの測定結果から算出した、溶離液２〜１３のｐＨと、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差との関係を図１５に示した。図１５より、ｐＨ７付近でピーク２とピーク３の溶出時間が最も近づくことが分かる。
測定検体Ａにおけるピーク２のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。通常、シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いるが、本例ではピーク２の前にピーク１が隣接しているため、５％位置のピーク幅が算出できなかったことから、半値幅を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２のシンメトリー係数との関係を図１４に示した。図１４より、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の７に近づくほどシンメトリー係数が１に近づき、ピークの対称性が高まることが分かる。
更に、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差を算出した。測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３の溶出時間差はオキシ状態のヘモグロビンＳとアジドメトヘモグロビンの溶出時間差を示しており、この差が小さいほど溶出時間が近づき単一ピークとなるため、シンメトリー係数と合わせてピーク形状の判断指標として用いた。結果を表２に示した。また、測定検体Ａと測定検体Ｂの測定結果から算出した、溶離液２〜１３のｐＨと、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差との関係を図１５に示した。図１５より、ｐＨ７付近でピーク２とピーク３の溶出時間が最も近づくことが分かる。
（隣接ピーク間の分離程度）
測定検体Ａにおけるピーク２の分離度を、ＪＰ（日本薬局方）法を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２の分離度との関係を図１６に示した。図１６より、ヘモグロビンの等電点付近のｐＨが７に近づくほど分離度が向上しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
更に、測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さを算出した。測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さは隣接ピーク間の分離程度を示す指標として分離度と合わせて用いた。なお、ピーク１とピーク２との谷落ち高さとはピーク１とピーク２の間で最も高さが低い位置を示す。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク１とピーク２との谷落ち高さとの関係を図１７に示した。図１７でもｐＨが７に近づくことで谷落ち高さが低下しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
測定検体Ａにおけるピーク２の分離度を、ＪＰ（日本薬局方）法を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２の分離度との関係を図１６に示した。図１６より、ヘモグロビンの等電点付近のｐＨが７に近づくほど分離度が向上しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
更に、測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さを算出した。測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さは隣接ピーク間の分離程度を示す指標として分離度と合わせて用いた。なお、ピーク１とピーク２との谷落ち高さとはピーク１とピーク２の間で最も高さが低い位置を示す。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク１とピーク２との谷落ち高さとの関係を図１７に示した。図１７でもｐＨが７に近づくことで谷落ち高さが低下しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
（比較例８）
ヘモグロビンＡ２凍結乾燥品（シグマ社製、「Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ２， Ｆｅｒｒｏｕｓ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ」）５ｍｇに精製水１００μＬを加えて溶解させた後、５ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｄとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．７分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．７分を超え１．１分までは表３に示した溶離液１６にて溶出し、１．１分を超え１．２分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．２分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
ヘモグロビンＡ２凍結乾燥品（シグマ社製、「Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ２， Ｆｅｒｒｏｕｓ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ」）５ｍｇに精製水１００μＬを加えて溶解させた後、５ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｄとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．７分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．７分を超え１．１分までは表３に示した溶離液１６にて溶出し、１．１分を超え１．２分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．２分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
（実施例６、７、及び、比較例９〜１２）
０．７分を超え１．１分までの溶出に用いる溶離液として表３に示した溶離液１７〜２２を用いたこと以外は比較例８と同様にして測定検体Ｄを測定した。
０．７分を超え１．１分までの溶出に用いる溶離液として表３に示した溶離液１７〜２２を用いたこと以外は比較例８と同様にして測定検体Ｄを測定した。
＜評価＞
実施例６、７、及び、比較例８〜１２において、溶離液１６〜２２を送液している０．７分を超え１．１分までの領域を抜粋した測定検体Ｄのクロマトグラムを図１８〜２４に示す。図１８〜２４において、ピーク４はヘモグロビンＡ２を示す。
図１８〜２４より、溶離液１８及び溶離液１９を用いた場合、測定検体Ｄのピーク４がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液１６、１７、２０〜２２を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
実施例６、７、及び、比較例８〜１２において、溶離液１６〜２２を送液している０．７分を超え１．１分までの領域を抜粋した測定検体Ｄのクロマトグラムを図１８〜２４に示す。図１８〜２４において、ピーク４はヘモグロビンＡ２を示す。
図１８〜２４より、溶離液１８及び溶離液１９を用いた場合、測定検体Ｄのピーク４がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液１６、１７、２０〜２２を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
（ピーク形状）
測定検体Ｄにおけるピーク４のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｄにおける溶離液１６〜２２のｐＨとピーク４のシンメトリー係数との関係を図２５に示した。図２５より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．２５〜６．７０で１に近づくことが分かる。
測定検体Ｄにおけるピーク４のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｄにおける溶離液１６〜２２のｐＨとピーク４のシンメトリー係数との関係を図２５に示した。図２５より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．２５〜６．７０で１に近づくことが分かる。
（比較例１３）
グリコヘモグロビンコントロール レベルＩ（シスメックス社製）に精製水２００μＬを加えて溶解させた後、１０ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｅとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．６分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．６分を超え１．０分までは表４に示した溶離液２５にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
グリコヘモグロビンコントロール レベルＩ（シスメックス社製）に精製水２００μＬを加えて溶解させた後、１０ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｅとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．６分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．６分を超え１．０分までは表４に示した溶離液２５にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
（実施例８〜１０、及び、比較例１４〜１６）
０．６分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表４に示した溶離液２６〜３１を用いたこと以外は比較例１３と同様にして測定検体Ｅを測定した。
０．６分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表４に示した溶離液２６〜３１を用いたこと以外は比較例１３と同様にして測定検体Ｅを測定した。
＜評価＞
実施例８〜１０、及び、比較例１３〜１６において、溶離液２５〜３１を送液している０．６分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ｅのクロマトグラムを図２６〜３２に示す。図２６〜３２において、ピーク１はヘモグロビンＡ０を示す。
図２６〜３２より、溶離液２８〜３０を用いた場合、測定検体Ｅのピーク１がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液２５〜２７、３１を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
実施例８〜１０、及び、比較例１３〜１６において、溶離液２５〜３１を送液している０．６分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ｅのクロマトグラムを図２６〜３２に示す。図２６〜３２において、ピーク１はヘモグロビンＡ０を示す。
図２６〜３２より、溶離液２８〜３０を用いた場合、測定検体Ｅのピーク１がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液２５〜２７、３１を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
（ピーク形状）
測定検体Ｅにおけるピーク１のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｅにおける溶離液２５〜３１のｐＨとピーク１のシンメトリー係数との関係を図３３に示した。図３３より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．６０〜７．００で１に近づくことが分かる。
測定検体Ｅにおけるピーク１のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｅにおける溶離液２５〜３１のｐＨとピーク１のシンメトリー係数との関係を図３３に示した。図３３より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．６０〜７．００で１に近づくことが分かる。
本発明によれば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することができる。
１ ヘモグロビンＡ０
２ オキシ状態のヘモグロビンＳ
３ アジドメトヘモグロビンＳ
４ ヘモグロビンＡ２
２ オキシ状態のヘモグロビンＳ
３ アジドメトヘモグロビンＳ
４ ヘモグロビンＡ２
Claims (6)
- 陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．８８〜７．５０である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＳの分析方法。 - 溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＳの分析方法。
- 溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＳの分析方法。
- 陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．６０〜６．８０である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分析方法。 - 溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項４記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
- 溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４又は５記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011524076A JP5013560B2 (ja) | 2010-02-02 | 2011-02-02 | ヘモグロビンｓの分析方法、及び、ヘモグロビンａ２の分析方法 |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010021466 | 2010-02-02 | ||
| JP2010021466 | 2010-02-02 | ||
| JP2010269551 | 2010-12-02 | ||
| JP2010269551 | 2010-12-02 | ||
| PCT/JP2011/052113 WO2011096420A1 (ja) | 2010-02-02 | 2011-02-02 | ヘモグロビンｓの分析方法、ヘモグロビンａ２の分析方法、及び、ヘモグロビンａ０の分析方法 |
| JP2011524076A JP5013560B2 (ja) | 2010-02-02 | 2011-02-02 | ヘモグロビンｓの分析方法、及び、ヘモグロビンａ２の分析方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012073221A Division JP2012132934A (ja) | 2010-02-02 | 2012-03-28 | ヘモグロビンａ０の分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP5013560B2 true JP5013560B2 (ja) | 2012-08-29 |
| JPWO2011096420A1 JPWO2011096420A1 (ja) | 2013-06-10 |
Family
ID=44355416
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011524076A Active JP5013560B2 (ja) | 2010-02-02 | 2011-02-02 | ヘモグロビンｓの分析方法、及び、ヘモグロビンａ２の分析方法 |
| JP2012073221A Pending JP2012132934A (ja) | 2010-02-02 | 2012-03-28 | ヘモグロビンａ０の分析方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012073221A Pending JP2012132934A (ja) | 2010-02-02 | 2012-03-28 | ヘモグロビンａ０の分析方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20130199277A1 (ja) |
| EP (1) | EP2533043B1 (ja) |
| JP (2) | JP5013560B2 (ja) |
| WO (1) | WO2011096420A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11555807B2 (en) | 2016-05-11 | 2023-01-17 | Tosoh Corporation | Method for measuring glycated hemoglobin and device for measuring glycated hemoglobin |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10527594B2 (en) * | 2016-04-20 | 2020-01-07 | Arkray, Inc. | Liquid chromatography measurement method, liquid chromatography measurement instrument, and liquid chromatography measurement program storage medium |
| JP6600123B1 (ja) * | 2018-04-18 | 2019-10-30 | 積水メディカル株式会社 | ヘモグロビン分析方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02236164A (ja) * | 1988-06-10 | 1990-09-19 | Inst Of Child Health:The | 低圧液体クロマトグラフィー装置，クロマトグラフィーカラムおよび該カラム製造方法，並びに低圧液体クロマトグラフィー用補充パック |
| JP2007078361A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-29 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2007315816A (ja) * | 2006-05-23 | 2007-12-06 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2009243956A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4108603A (en) * | 1977-05-18 | 1978-08-22 | Purdue Research Foundation | Method for rapid analysis of hemoglobin variants by high speed liquid chromatography |
| US4980058A (en) * | 1987-11-06 | 1990-12-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Separation of hemoglobin A2 from hemoglobin mixture |
| US5719053A (en) * | 1996-05-06 | 1998-02-17 | Primus Corporation | Chromatographic method for the identification and characterization of hemoglobin variants in blood |
| JP3429709B2 (ja) | 1998-08-07 | 2003-07-22 | 積水化学工業株式会社 | 安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
| EP1103812B1 (en) * | 1998-08-07 | 2015-11-18 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Method for determining hemoglobins |
| JP4420539B2 (ja) * | 1999-09-24 | 2010-02-24 | 積水化学工業株式会社 | ヘモグロビンａ２の分離方法 |
| JP2003014714A (ja) * | 2001-06-29 | 2003-01-15 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2003107069A (ja) * | 2001-09-28 | 2003-04-09 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
-
2011
- 2011-02-02 EP EP11739768.7A patent/EP2533043B1/en active Active
- 2011-02-02 US US13/576,052 patent/US20130199277A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-02 JP JP2011524076A patent/JP5013560B2/ja active Active
- 2011-02-02 WO PCT/JP2011/052113 patent/WO2011096420A1/ja active Application Filing
-
2012
- 2012-03-28 JP JP2012073221A patent/JP2012132934A/ja active Pending
-
2015
- 2015-03-12 US US14/645,803 patent/US20150204889A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02236164A (ja) * | 1988-06-10 | 1990-09-19 | Inst Of Child Health:The | 低圧液体クロマトグラフィー装置，クロマトグラフィーカラムおよび該カラム製造方法，並びに低圧液体クロマトグラフィー用補充パック |
| JP2007078361A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-29 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2007315816A (ja) * | 2006-05-23 | 2007-12-06 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2009243956A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11555807B2 (en) | 2016-05-11 | 2023-01-17 | Tosoh Corporation | Method for measuring glycated hemoglobin and device for measuring glycated hemoglobin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2011096420A1 (ja) | 2013-06-10 |
| EP2533043A1 (en) | 2012-12-12 |
| EP2533043B1 (en) | 2022-11-02 |
| JP2012132934A (ja) | 2012-07-12 |
| US20150204889A1 (en) | 2015-07-23 |
| EP2533043A4 (en) | 2015-01-07 |
| US20130199277A1 (en) | 2013-08-08 |
| WO2011096420A1 (ja) | 2011-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5875160B2 (ja) | ヘモグロビン類の分析方法 | |
| Heresztyn et al. | Determination of l-arginine and NG, NG-and NG, NG′-dimethyl-l-arginine in plasma by liquid chromatography as AccQ-Fluor™ fluorescent derivatives | |
| Preik-Steinhoff et al. | Determination of nitrie in human blood by combination of a specific sample preparation with high-performance anion-exchange chromatography and electrochemical detection | |
| Andersson et al. | Determination of homocysteine in plasma by ion-exchange chromatography | |
| Schifreen et al. | Accuracy, precision, and stability in measurement of hemoglobin A1C by" high-performance" cation-exchange chromatography. | |
| JP5013560B2 (ja) | ヘモグロビンｓの分析方法、及び、ヘモグロビンａ２の分析方法 | |
| JP5462841B2 (ja) | ヘモグロビンの分析方法 | |
| JP6600123B1 (ja) | ヘモグロビン分析方法 | |
| JPH0477500A (ja) | グリコヘモグロビンの分離方法および分離装置並びに分離カラム | |
| JP2016027326A (ja) | 測定方法、測定装置および溶離液 | |
| Kubota et al. | A simple stabilization method of reduced albumin in blood and plasma for the reduced/oxidized albumin ratio measurement | |
| Hegde et al. | A case of undetectable glycated hemoglobin (HbA1C) | |
| JP2506870B2 (ja) | 糖化ヘモグロビン測定用溶離液 | |
| JP7355471B2 (ja) | ヘモグロビン分析方法 | |
| Chandalia | Standardization of hemoglobinA1c | |
| Abraham et al. | Kinetics of 15 per-and polyfluoroalkyl substances (PFAS) after single oral application as a mixture–A pilot investigation in a male volunteer | |
| Higashidate et al. | New high-speed fully automated guanidino compound analyzer | |
| JPH02259467A (ja) | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 | |
| Biswas et al. | No Effect of Anticoagulant on Hb A1c Analysis by the IFCC Reference Procedure | |
| CN117805272A (zh) | 一种糖化血红蛋白检测试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法 | |
| HARANO et al. | An Automated Hb A_2 Analyzer, HLC-723G7, for Diagnosis of β-Thalassemia | |
| SUTCHARITCHAN et al. | for Diagnosis of f-Thalassemia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120508 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120601 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150615 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5013560 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |