CN117805272A - 一种糖化血红蛋白检测试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种糖化血红蛋白检测试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，所述糖化血红蛋白检测试剂盒包括第一洗脱液、第二洗脱液和溶血液；所述第一洗脱液包括组分一、组分二和添加剂；所述第二洗脱液包括组分一、组分二和添加剂；所述溶血液包括表面活性剂和添加剂。本发明提供的试剂盒能够有效提高糖化血红蛋白分离度，分离血红蛋白变异体，减少血红蛋白变异体对检测的干扰。
Description
技术领域
本发明属于液相检测技术领域，具体涉及一种糖化血红蛋白检测试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，尤其涉及一种分离度高的糖化血红蛋白检测试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法。
背景技术
糖化血红蛋白(GHb)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物。它是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间，而与抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。GHb由HbA1a、HbA1b、HbA1c组成，其中HbA1c约占70％，且结构稳定，目前HbA1c是评价糖尿病患者长期血糖控制状况的“金标准”，在糖尿病治疗及其并发症监测中具有重要价值。
高效液相糖化血红蛋白检测系统实现的是对HbA1c的定量检测。根据高效液相色谱法(HPLC)的工作原理，在离子交换法对糖化血红蛋白的检测分析中，高效液相分析仪、洗脱试剂、层析柱、校准品等对检测结果都会产生影响，而其中洗脱试剂对于糖化血红蛋白的分离能力以及层析柱寿命保护起着非常重要的作用。目前，大多数HPLC法最易受血红蛋白变异体的干扰，这种干扰可能引起HbA1c的极度异常或HbA1c测定值与血糖浓度不一致。到目前为止发现的最为常见的血红蛋白变异体是HbS、HbE、HbC和HbD，全球范围的分布规律为HbS＞HbE＞HbC＞HbD，这四种变异体由于相对较低的糖化血红蛋白分离能力，可能导致血红蛋白变异体与血红蛋白A0共洗脱，从而导致HbA1c假性偏低产生异常结果。而大部分血红蛋白变异体的杂合子通常无症状，红细胞生存率正常，如果糖尿病患者同时携带血红蛋白变异体基因，那么检测结果不易引起临床医生的注意，从而影响诊断。
CN104897812A公开了一种糖化血红蛋白的检测方法及其试剂盒，检测的方法为：将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱仪或糖化血红蛋白仪检测。该发明提供的方法可以将血样稀释后直接进样检测，避免了冗长的前处理过程，从而实现对血样的快速、准确检测。经试验证实，该发明提供的方法能够实现1min内完成对血样中的糖化血红蛋白的定量检测。
CN110887916A公开了一种糖化血红蛋白高压液相色谱分析仪配套试剂，该发明配套试剂包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂H和层析柱；其中试剂A、试剂B、试剂C为不同梯度浓度的洗脱液，试剂H为溶血剂试剂A、试剂B和试剂C均包括柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠和防腐剂，所述的试剂H包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、表面活性剂和防腐剂。该发明对样本既可以不处理也可以前处理，可以直接原始管上架，通过与仪器配套，便可将HbF、L-HbA1c和HbA1c分离开来，同时将检测结果与进口仪器与配套试剂作对比，相关性较好。
然而上述方法以及其他现有技术均未涉及任何有关HbA1c受到血红蛋白变异体干扰以及消除干扰的内容。因此，如何提供一种能够有效分离HbA1c和血红蛋白变异体、减少血红蛋白变异体干扰的检测试剂和方法，成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种糖化血红蛋白检测试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，尤其提供一种分离度高的糖化血红蛋白检测试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法。本发明提供的试剂盒能够有效提高糖化血红蛋白分离度，分离血红蛋白变异体，减少血红蛋白变异体对检测的干扰。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种糖化血红蛋白检测试剂盒，所述糖化血红蛋白检测试剂盒包括第一洗脱液、第二洗脱液和溶血液。
所述第一洗脱液包括组分一、组分二和添加剂。
所述第二洗脱液包括组分一、组分二和添加剂。
所述溶血液包括表面活性剂和添加剂。
所述第一洗脱液和第二洗脱液中的组分一独立地包括吗啉乙磺酸(MES)、柠檬酸或磷酸二氢钠中任意一种或至少两种的组合、例如吗啉乙磺酸和柠檬酸的组合、柠檬酸和磷酸二氢钠的组合或磷酸二氢钠和吗啉乙磺酸的组合等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。
所述第一洗脱液和第二洗脱液中的组分二独立地包括磷酸氢二钠、柠檬酸三钠、氢氧化钠中任意一种或至少两种的组合，例如磷酸氢二钠和柠檬酸三钠的组合、柠檬酸三钠和氢氧化钠的组合或氢氧化钠和磷酸氢二钠的组合等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。
所述第一洗脱液、第二洗脱液、溶血液中的添加剂独立地包括甘油、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、氯化钠或高氯酸钠中的任意一种或至少两种的组合，例如甘油和精氨酸的组合、精氨酸和甘氨酸的组合或氯化钠和高氯酸钠的组合等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。
所述第一洗脱液的pH为5.0-5.5，所述第二洗脱液的pH为5.7-6.3，其中第一洗脱液的pH可以是5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5等，第二洗脱液的pH可以是5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2或6.3等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
上述方法通过采用复配缓冲盐体系，能够对HbA1C及A0与相邻的血红蛋白变异体进行有效分离，减少血红蛋白变异体对检测的干扰，提高检测的准确度；并通过采用添加剂能够减小血红蛋白之间的相互作用力，阻止血红蛋白的凝聚和聚集，加速血红蛋白的离子交换效率，从而提高血红蛋白的分离度。
优选地，所述表面活性剂包括Triton-X100、吐温-20、吐温-80、STANDAPOLES-1、Tetronic 1307或十二烷基硫酸钠中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述第一洗脱液和第二洗脱液中的组分一均为吗啉乙磺酸、柠檬酸和磷酸二氢钠的组合。
上述特定组合通过采用吗啉乙磺酸、柠檬酸和磷酸二氢钠三者复配，协同作用，能够进一步提高分离的效果，提高检测的准确度。
优选地，所述第一洗脱液中组分一的含量为50-200mM，组分二的含量为50-200mM，添加剂的质量分数为0.01-2％，其中组分一的含量可以是50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM等，组分二的含量可以是50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM等，添加剂的质量分数可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1％、1.5％或2％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述第二洗脱液中组分一的含量为30-100mM，组分二的含量为30-100mM，添加剂的质量分数为0.01-2％，其中组分一的含量可以是30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM等，组分二的含量可以是30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM等，添加剂的质量分数可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1％、1.5％或2％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述溶血液中表面活性剂的质量分数为0.1-1％，添加剂的质量分数为0.01-2％，其中表面活性剂的质量分数可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％等，添加剂的质量分数可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1％、1.5％或2％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述第一洗脱液、第二洗脱液和溶血液中还各自独立地包括防腐剂，所述防腐剂包括叠氮钠、Proclin300、BND-10、BIT-10、PC-950或GML-2中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述防腐剂的质量分数为0.01-2％，例如0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1％、1.5％或2％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
第二方面，本发明还提供了一种糖化血红蛋白检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
将待测样品与如上所述的糖化血红蛋白检测试剂盒中的溶血液混合，之后进样进行液相色谱检测，得到检测结果；
所述液相色谱检测采用的洗脱液为如上所述的糖化血红蛋白检测试剂盒中的第一洗脱液和第二洗脱液。
上述方法通过采用上述试剂盒，能够有效检测待测样品中HbA1C含量情况，并能够有效减少血红蛋白变异体对检测的干扰，提高检测的准确度。
优选地，所述待测样品与溶血液的体积比为1:(100-300)，例如1:100、1:150、1:200、1:250或1:300等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述液相色谱检测的色谱柱填料为强阳离子交换高分子树脂填料，粒径范围为1-5μm，例如1μm、2μm、3μm、4μm或5μm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述液相色谱检测的柱温为30-50℃，洗脱液流速为1-4mL/min，其中柱温可以是30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃等，洗脱液流速可以是1mL/min、1.5mL/min、2mL/min、2.5mL/min、3mL/min、3.5mL/min或4mL/min等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述液相色谱检测的洗脱程序为：
采用流动相A进行第一阶段洗脱，之后采用流动相B进行第二阶段洗脱，最后采用流动相A进行第三阶段洗脱。
优选地，所述第一阶段的持续时间为15-50s，第二阶段的持续时间为20-60s，第三阶段的持续时间为28-100s。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种糖化血红蛋白检测试剂盒及使用其的检测方法，通过采用复配缓冲盐体系，能够对HbA1C及A0与相邻的血红蛋白变异体进行有效分离，减少血红蛋白变异体对检测的干扰，提高检测的准确度；通过采用添加剂能够减小血红蛋白之间的相互作用力，阻止血红蛋白的凝聚和聚集，加速血红蛋白的离子交换效率，从而提高血红蛋白的分离度；并通过采用吗啉乙磺酸、柠檬酸和磷酸二氢钠三者复配，协同作用，能够进一步提高分离的效果，提高检测的准确度。
附图说明
图1是实施例1的液相色谱检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供了一种糖化血红蛋白试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，试剂盒组成如下：
洗脱液A：MES 30mM、柠檬酸30mM、磷酸二氢钠5mM、磷酸氢二钠80mM、甘油0.1％、Proclin300 0.09％，其余水，pH 5.3；
洗脱液B：MES 50mM、柠檬酸10mM、磷酸二氢钠2mM、磷酸氢二钠50mM、甘油0.1％、Proclin300 0.09％，其余水，pH 5.9；
溶血液：甘油0.1％、吐温-20 0.2％、Proclin300 0.09％，其余水。
检测方法如下：
将待测样品与溶血液混合(体积比1:200)，之后进样进行液相色谱检测，其中色谱柱为强阳离子交换层析柱，柱温为40℃，洗脱液流速为2mL/min，洗脱程序如下：
第0-19s，使用流动相A进行洗脱；第19-45s使用流动相B进行洗脱；第45-80s，使用流动相A进行洗脱。
结果如图1所示，从图中可以发现，HbA1C、A0与相邻的血红蛋白变异体进行了有效地分离，且血红蛋白变异体峰距离A0峰更接近，因此以A0峰与相邻的血红蛋白变异体峰的分离情况作为分离度分析的指标。
实施例2
本实施例提供了一种糖化血红蛋白试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，除洗脱液A中不添加MES、减少部分按比例分配给柠檬酸和磷酸二氢钠外，其余与实施例1一致。
实施例3
本实施例提供了一种糖化血红蛋白试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，除洗脱液A中不添加柠檬酸、减少部分按比例分配给MES和磷酸二氢钠外，其余与实施例1一致。
实施例4
本实施例提供了一种糖化血红蛋白试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，除洗脱液A中不添加磷酸二氢钠、减少部分按比例分配给柠檬酸和MES外，其余与实施例1一致。
实施例5
本实施例提供了一种糖化血红蛋白试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，除洗脱液B中不添加MES、减少部分按比例分配给柠檬酸和磷酸二氢钠外，其余与实施例1一致。
实施例6
本实施例提供了一种糖化血红蛋白试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，除洗脱液B中不添加柠檬酸、减少部分按比例分配给MES和磷酸二氢钠外，其余与实施例1一致。
实施例7
本实施例提供了一种糖化血红蛋白试剂盒及一种糖化血红蛋白检测方法，除洗脱液B中不添加磷酸二氢钠、减少部分按比例分配给柠檬酸和MES外，其余与实施例1一致。
效果测试：
计算实施例1-7的液相测试结果中A0峰与血红蛋白变异体峰HbE的保留时间差，结果如下：
之后将各实施例的测试结果与电泳法测试结果(对照组)进行对比，电泳法具体步骤如下：
使用sebia毛细管全自动电泳仪对变异样本进行测试，选取一个包含变异体HbE的样本，使其在碱性缓冲液(pH 9.4)中进行毛细管电泳，利用糖化和非糖化血红蛋白在电场中所带电荷不同，等电点及泳动速度不同进行分离检测。
HbA1C含量检测结果如下：
从以上结果可以发现，本发明提供的试剂盒及检测方法能够有效分离HbA1C及A0与相邻的血红蛋白变异体，减少血红蛋白变异体对检测的干扰；比较实施例1-7和对照组可以发现，本发明提供的试剂盒及检测方法通过采用吗啉乙磺酸、柠檬酸和磷酸二氢钠三者复配，协同作用，进一步提高了分离的效果，提高了检测的准确度。
方法学考察：
(1)重复性：分别检测两个HbA1c范围内(4.0％～6.5％，8.5％～14.0％)的两个全血样品，每个浓度重复测试10次，计算测试变异系数(CV)，能够达到≤1％的精度。
| 靶值 | 5.6 | 10.4 |
| 1 | 5.48 | 10.05 |
| 2 | 5.53 | 10.03 |
| 3 | 5.50 | 10.03 |
| 4 | 5.44 | 10.03 |
| 5 | 5.47 | 10.07 |
| 6 | 5.44 | 10.04 |
| 7 | 5.48 | 10.02 |
| 8 | 5.47 | 10.03 |
| 9 | 5.47 | 10.06 |
| 10 | 5.43 | 10.09 |
| 平均值 | 5.47 | 10.05 |
| CV | 0.55％ | 0.22％ |
(2)准确性：选取14个包含变异体的样本，电泳法测定其靶值，使用本方法得到的测试值能靶值的偏差均在±6％以内。
| 序号 | 靶值 | 测试值 | 偏差 | 偏差百分比 |
| 1 | 4.5 | 4.72 | 0.22 | 4.9％ |
| 2 | 7.3 | 7.00 | -0.30 | -4.1％ |
| 3 | 6.6 | 6.65 | 0.05 | 0.8％ |
| 4 | 6.2 | 6.29 | 0.09 | 1.5％ |
| 5 | 6.6 | 6.91 | 0.31 | 4.7％ |
| 6 | 5.8 | 5.81 | 0.01 | 0.2％ |
| 7 | 10.2 | 10.44 | 0.24 | 2.4％ |
| 8 | 10.1 | 9.99 | -0.11 | -1.1％ |
| 9 | 5.9 | 6.05 | 0.15 | 2.5％ |
| 10 | 5.5 | 5.68 | 0.18 | 3.3％ |
| 11 | 5.2 | 5.27 | 0.07 | 1.3％ |
| 12 | 5.2 | 5.41 | 0.21 | 4.0％ |
| 13 | 5.5 | 5.72 | 0.22 | 4.0％ |
| 14 | 7.3 | 7.10 | -0.20 | -2.7％ |
(3)线性：选低高值6个全血样本，以样本靶值为自变量，以本方法测定结果为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(r)，线性相关系数(r)达到0.9995，具有非常好的线性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的糖化血红蛋白检测试剂盒及糖化血红蛋白检测方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述糖化血红蛋白检测试剂盒包括第一洗脱液、第二洗脱液和溶血液；
所述第一洗脱液包括组分一、组分二和添加剂；
所述第二洗脱液包括组分一、组分二和添加剂；
所述溶血液包括表面活性剂和添加剂；
所述第一洗脱液和第二洗脱液中的组分一独立地包括吗啉乙磺酸、柠檬酸或磷酸二氢钠中任意一种或至少两种的组合；
所述第一洗脱液和第二洗脱液中的组分二独立地包括磷酸氢二钠、柠檬酸三钠、氢氧化钠中任意一种或至少两种的组合；
所述第一洗脱液、第二洗脱液、溶血液中的添加剂独立地包括甘油、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、氯化钠或高氯酸钠中的任意一种或至少两种的组合；
所述第一洗脱液的pH为5.0-5.5，所述第二洗脱液的pH为5.7-6.3。
2.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂包括Triton-X100、吐温-20、吐温-80、STANDAPOLES-1、Tetronic 1307或十二烷基硫酸钠中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述第一洗脱液和第二洗脱液中的组分一均为吗啉乙磺酸、柠檬酸和磷酸二氢钠的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述第一洗脱液中组分一的含量为50-200mM，组分二的含量为50-200mM，添加剂的质量分数为0.01-2％；
优选地，所述第二洗脱液中组分一的含量为30-100mM，组分二的含量为30-100mM，添加剂的质量分数为0.01-2％；
优选地，所述溶血液中表面活性剂的质量分数为0.1-1％，添加剂的质量分数为0.01-2％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述第一洗脱液、第二洗脱液和溶血液中还各自独立地包括防腐剂，所述防腐剂包括叠氮钠、Proclin300、BND-10、BIT-10、PC-950或GML-2中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述防腐剂的质量分数为0.01-2％。
6.一种糖化血红蛋白检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
将待测样品与权利要求1-5中任一项所述的糖化血红蛋白检测试剂盒中的溶血液混合，之后进样进行液相色谱检测，得到检测结果；
所述液相色谱检测采用的洗脱液为权利要求1-5中任一项所述的糖化血红蛋白检测试剂盒中的第一洗脱液和第二洗脱液。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品与溶血液的体积比为1:(100-300)。
8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的色谱柱填料为强阳离子交换高分子树脂填料，粒径范围为1-5μm。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的柱温为30-50℃，洗脱液流速为1-4mL/min。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的洗脱程序为：
采用流动相A进行第一阶段洗脱，之后采用流动相B进行第二阶段洗脱，最后采用流动相A进行第三阶段洗脱；
优选地，所述第一阶段的持续时间为15-50s，第二阶段的持续时间为20-60s，第三阶段的持续时间为28-100s。
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