JP5438854B2 - 被検対象物の分析方法および分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、被検対象物の分析方法および分析装置に関し、特に、測定試料に含まれる含硫化合物、特にシステインおよびシスチンなどのようなチオール基、またはジスルフィド結合を持つ物質の分析方法に関する。本発明は、輸液製剤や生体試料のように糖、電解質、アミノ酸等の多成分からなり、粘ちょう性のある測定試料における高感度及び高精度の分析に適する。

輸液製剤等の有効成分の一つであるシステインは、他のアミノ酸などと比較して安定性が悪く、保管中にシスチン等に変化し含量が減少することが知られている。そのため、製剤中のシステイン、シスチン等を正確に定量することは、品質管理上重要な意味を持つ。

Ｌ−システインの従来の規格分析法としては、Ｌ−システインと４,４’−ジチオジピリジン（４−ＰＤＳ）とを反応させ、反応生成物である４−チオピリドンに由来する極大吸収波長３２４ｎｍにおける吸光度を測定する、紫外可視吸光度測定法（４−ＰＤＳ法）が挙げられる。しかし、４−ＰＤＳ法は、長時間の分析操作を要し、操作が煩雑であり、非効率的な試験方法である。

Ｌ−シスチンの従来の規格分析法としては、アミノ酸分析法であり、アミノ基に対して選択的に反応するような誘導体化試薬を用いたポストカラム誘導体化法が挙げられる。ポストカラム誘導体化法は、陽イオン交換クロマトグラフィーによりアミノ酸を分離した後、誘導体化試薬（ニンヒドリン）を送液し、アミノ酸と反応させ、可視吸光度検出器により分析する方法である。ポストカラム誘導体化法では、１試料あたりの分析時間が約１３４分と長時間であり、非効率的な分析法である。

また、上述した従来の分析法では、Ｌ−システインとＬ−シスチンとを同時に分析できない。

一方、含硫アミノ酸、ペプチド、蛋白は生体系の生理活性において重要な役割を果たしていることが知られている。チオール基（−ＳＨ）は、アルコールなどの水酸基（−ＯＨ）よりも活性が高く、ｐＨの変化や酵素により、容易にジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を介して自身が二量体に成ったり、他のチオール基を持つ分子と結合する。
生体系は巧みにチオール基の反応性を利用して、生合成や代謝を行ないながら生命を維持している。
還元型（−ＳＨ）と酸化型（−Ｓ−Ｓ−）のアミノ酸は、システイン−シスチン、ホモシステイン−ホモシスチン、グルタチオン−グルタチオンジスルフィド、またビタミンＢ１で知られるチアミンのチオール型−チアミンジスルフィドなど数多く知られている（非特許文献１および２参照）。

生体試料等、複雑な組成を有するサンプルでは、チオール基に選択的に反応する蛍光誘導体化試薬を用いて前処理を行い、液体クロマトグラフィーで分離した後、蛍光検出する方法か、カーボン電極を使用した電気化学検出器で直接チオール基を検出する方法が一般的である。
誘導体化法（プレカラム誘導体化法）は、誘導体化反応時にサンプルを中性〜弱アルカリ性に調整する必要があるが、この条件では、チオール基同士がジスルフィド結合を形成しやすく、多数のサンプルを正確に処理するのは非常に困難である。
カーボン電極を使用した電気化学検出器は、後述するように安定性が悪く、精度良く測定を行うことは非常に困難である。

−Ｓ−Ｓ−結合の有用性は、例を挙げれば切がない。たとえば、にんにくの有効成分として知られているアリシンはジスルファチドであるが、アリシンとチオール型チアミンの結合により生成されるアリチアミン類は、脂溶性が適度にあがるので腸管吸収が向上する。健康食品や医薬品においても、有効成分の体内吸収をさせる手法として価値がある。体内において、これらの化合物は、酵素により還元される。いわいるプロドラッグ的な利用法である。また、植物においても、有効成分の生合成による産生（有効成分ができるのは、実は、各種回路→代謝経路の途中）において、これらチオール類は重要な役目を担っていることが分かってきた。近年、興味深い報告がされている。低分子のチオール類は、極めて香の閾値が高く、良い香を決定付けるのに重要である。たとえば、珈琲の香として有名なフランチオールやグレープフルーツの香として重要なメルカプトヘキサノールなどは、ｐｐｂ〜ｐｐｔオーダーでよい香を決定する。ワインでは、メルカプトヘキサノールなどが含まれる製品が付加価値が高く、その生産管理をすることが重要に成ってきた。ブドウ中では、メルカプトヘキサノールはシステインと−Ｓ−Ｓ−結合した前駆体の状態で産生される。収獲前にこれらを測定することにより、最も良い時期が決定できるわけである（非特許文献３参照）。

現状でのこれらの測定法は、−Ｓ−Ｓ−結合を切断する酵素を固定化した反応カラムにブドウ果汁を流し、有機溶媒でメルカプトヘキサノールを回収した後、窒素気流等で濃縮してＧＣ／ＭＳに供するという極めて前処理に手のかかる操作と高価な分析装置を必要とする。

電気化学検出器は、紫外可視、示差屈折率、蛍光検出器に次いでよく用いられており、選択性が高く、又高感度であることを特徴とする検出器である。そのため、夾雑物質を多量に含み、更に目的成分が極微量であるような、生化学分野や環境分野などへの適用が進みつつある。この電気化学検出器の主な利点は、（１）液体クロマトグラフィーで汎用的に使われている紫外可視吸光検出器よりも４桁以上の感度が要求される微量成分の分析が可能、（２）反応原理から電気化学的に酸化又は還元物質しか反応しないため選択性が高い、ことに尽きる。
多くの化合物は、作用電極表面上に不活性膜を形成する反応生成物を形成し、このため検出器の応答が時間と共に変化する。その中でもフェノールは非常に悪い膜生成物質として知られ、作用電極に炭素電極（グラファイトやグラッシーカーボンなど）を使用した電気化学検出器では、僅か数時間の操作においても応答は連続的に低下する。その場合、セルを分解し、作用電極表面を研磨し、新しくしなければならない。そして、再度組み立てなおして、微量成分を分析し始めるまで平衡化させるのに数時間を要する。応答が連続的に変わったり、老練なメンテナンスが必要であったりすることは、通常のユーザーにとって煩雑で非常に費用がかかる等の理由から各種の長所があるにも拘わらず、その利用は限られている。
また、グラッシーカーボン電極では、高い印加電圧をかけることができないため、反応電位の高いジスルフィド結合は安定して検出することが困難である。

一方、作用電極に、ボロンをドープすることで導電性を付与した導電性ダイヤモンドを使用するダイヤモンド電極も広く提案されてきている。導電性ダイヤモンド電極は、水溶液中における電位窓が広く、即ち、水の電気分解が起こらない電位領域が広く、高い印加電圧をかけて安定した反応を行うことができる。さらに、電位窓の広さは電極表面における水素発生、酸素発生に対する過電位により決まるわけであるが、これらの反応は、一般に電極表面に弱く吸着した反応中間体を経由する多段階多電子移動反応である。導電性ダイヤモンド表面にはそのような中間体が吸着するサイトが無視できる程度しか存在せず、それゆえバックグラウンド電流値が小さく、ノイズレベルの低い高感度分析が可能となる。

導電性ダイヤモンド電極は、各種の検出に使用されている。
本発明者らの一部は、液体クロマトグラフイーの検出器フローセルに導電性ダイヤモンド電極を使用し、難反応性物質に高電位を印加することで検出可能にしている（特許文献１）。この方法は、さらにクーロメトリックなセルとの組み合わせで、電気化学的に活性な夾雑・痕跡物質の除去や、別物質への変換を行い、分離の向上を図っている。
また、藤島ら（特許文献２）はダイヤモンド電極が過酸化水素に特異的に感応する性質を利用し、酵素反応による物質の濃度検出に応用している。
さらに、長岡ら（特許文献３）は、フロー型のアミノ酸分析装置に、鏡面化処理を施し、酸素終端処理された導電性ダイヤモンド電極を使用した検出部を設けている。酸素終端化処理は、酸素飽和雰囲気下のプラズマにより行っているが、この方法は、電極を設置し、システムを組んだ状態で移動相を流しながら行うことができず、検出の開始以前にオフラインでやっておく必要がある。そのため、多検体、連続繰り返し分析を行う場合にはどうしても電極表面状態に変化が起こり、安定した分析は不可能である。

国際公開第０１／６７０８９号パンフレット 特開２００３−１２１４１０号公報 特開２００５−６９６９２号公報

Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３，１６６−１７２（１９８９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６１，４３６５−４３７０（２００１） 富永隆俊：きいろの香、フレグランスジャーナル社

本発明は、測定試料に含まれる被検対象物のための効率のよい分析方法およびそのための分析装置を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は測定試料に含まれるシステイン、シスチンといった複数の含硫化合物を短時間で同時に分析することができる方法を提供することを課題とする。さらに好ましくは、輸液製剤、生体試料のような糖、電解質、アミノ酸等の多成分からなり、粘ちょう性のあるサンプルにおけるシステイン、シスチンなどの含硫化合物を精度良く短時間で分析することができる方法の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、本発明を完成した。本発明は以下の事項を包含する。
［１］測定試料に含まれる被検対象物の分析方法であって、
測定試料を移動相とともに以下の流路Ｐ１に流す工程（１）、
測定試料を含まない移動相を以下の流路Ｐ２および流路Ｐ３に流す工程（２）、ならびに、
工程（１）および工程（２）によって分析カラムから出た上記被検対象物のクロマトグラムを、ダイヤモンド電極を作用電極として有する電気化学検出器によって取得する工程（３）、を有し
（但し、流路Ｐ１は、前処理カラムを順方向に通り、次いで分析カラムを経て検出器へ至る流路であり、流路Ｐ２は、前処理カラムを通らずに、分析カラムを経て検出器へ至る流路であり、流路Ｐ３は、前処理カラムを逆方向に通り、分析カラムを経ず、検出器も経ずに排出される流路である。）、
工程（１）において上記被検対象物が前処理カラムを通過した後に工程（１）を終了して工程（２）を開始する、前記分析方法。
［２］測定試料に含まれる被検対象物より大幅に長い通過時間を要する夾雑物質は分析カラムを経由しない［１］の分析方法。
［３］被検対象物が含硫化合物である［１］または［２］の分析方法。
［４］含硫化合物がチオール基またはジスルフィド結合をもつ化合物である［３］の分析方法。
［５］含硫化合物が含硫アミノ酸である［３］の分析方法。
［６］含硫化合物がＮ−アセチルシステインである［３］の分析方法。
［７］含硫化合物がホモシステインまたはグルタチオンである［３］の分析方法。
［８］被検対象物が２種以上の含硫化合物である上記［１］または［２］の分析方法。
［９］２種以上の含硫化合物がシステインおよびシスチンである［８］の分析方法。
［１０］被検対象物が２種以上のアミノ酸である上記［１］または［２］の分析方法。
［１１］移動相が、水、電解質を含む［１］〜［１０］のいずれかの分析方法。
［１２］移動相が、水、電解質およびイオンペア化合物を含み、ｐＨが１〜３である［１］〜［１０］のいずれかの分析方法。
［１３］イオンペア化合物がアルキルスルホン酸塩およびアルキル硫酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種である［１２］の分析方法。
［１４］分析カラムが、逆相カラム、順相カラム、またはイオン交換カラムのいずれかである［１］〜［１３］のいずれかの分析方法。
［１５］分析カラムが、逆相カラムである［１４］の分析方法。
［１６］ダイヤモンド電極が導電性ダイヤモンド電極である、上記［１］〜［１５］のいずれかの分析方法。
［１７］導電性ダイヤモンド電極が、酸化電解研磨された電極である、［１６］の分析方法。
［１８］導電性ダイヤモンド電極が、移動相を流した状態で酸化電解研磨された電極である、［１６］の分析方法。
［１９］測定試料が輸液製剤、透析剤、醗酵液、生体試料のいずれかである［１］〜［１８］のいずれかの分析方法。
［２０］工程（３）の終了後、工程（１）、（２）および（３）を開始し、連続繰り返し分析を行う［１］の分析方法。
［２１］［１］〜［２０］のいずれかの分析方法を用いることを特徴とする測定試料に含まれる２種以上の含硫化合物の同時検出方法。
［２２］測定試料に含まれる被検対象物の分析装置であって、
流路の方向を可逆的に切り換えることができる流路切換装置と、
移動相を測定試料とともに流路切換装置へ流す試料導入用流路と、
移動相を単独で流路切換装置へ流す移動相導入用流路と、
流路切換装置から出て前処理カラムを経て再び流路切換装置に戻る流路と、
流路切換装置から出て分析カラムを経て被検対象物のクロマトグラムを取得することができるダイヤモンド電極を作用電極として有する電気化学検出器へ至る流路と、
流路切換装置から出て前処理カラムも分析カラムも経ずに当該装置外へ至る排出路と、を有し、
流路切換装置は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の状態に相互に切り換えることができるように構成されている、被検対象物の分析装置。
（Ａ）試料導入用流路から、前処理カラムを順方向に通り、次いで分析カラムを経て検出器へ至る流路Ｐ１を構成する状態、
（Ｂ）試料導入用流路から、前処理カラムを通らずに、分析カラムを経て検出器へ至る流路Ｐ２、および、移動相導入用流路から、前処理カラムを逆方向に通り、排出路へ至る流路Ｐ３を構成する状態。
［２３］被検対象物が含硫化合物である［２２］の装置。
［２４］含硫化合物がチオール基またはジスルフィド結合をもつ化合物である［２３］の装置。
［２５］含硫化合物が含硫アミノ酸である［２３］の装置。
［２６］含硫化合物がＮ−アセチルシステインである［２３］の装置。
［２７］含硫化合物がホモシステインまたはグルタチオンである［２３］の装置。
［２８］被検対象物が２種以上の含硫化合物である［２２］の装置。
［２９］２種以上の含硫化合物がシステインおよびシスチンである［２８］の装置。
［３０］被検対象物が２種以上のアミノ酸である［２２］の装置。
［３１］分析カラムが、逆相カラム、順相カラム、またはイオン交換カラムのいずれかである［２２］〜［３０］のいずれかの装置。
［３２］分析カラムが、逆相カラムである［３１］の装置。
［３３］ダイヤモンド電極が導電性ダイヤモンド電極である、［２２］〜［３２］のいずれかの装置。
［３４］導電性ダイヤモンド電極が、酸化電解研磨された電極である、［３３］の装置。
［３５］導電性ダイヤモンド電極が、移動相を流した状態で酸化電解研磨された電極である、［３３］の装置。
［３６］測定試料が輸液製剤、透析剤、醗酵液、生体試料のいずれかである［２２］〜［３６］のいずれかの装置。

本発明によれば、選択性が高く、ノイズレベルの低いダイヤモンド電極型電気化学検出器とカラムスイッチング法を用いることで、精度の高い、安定した測定が可能になる。すなわち、試料溶液に含まれる可能性があって測定時間を長くする原因となっていた夾雑物質は工程（１）において前処理カラムの入口付近に留まり、工程（２）において移動相を逆方向に流すことでこの夾雑物質が分析カラムを経由することなく、素早く除去されることができるので、直ちに次回の測定を開始することができ、結果として、測定時間の大幅な短縮が見込まれる。また、それゆえに、多検体の連続分析が可能となる。

本発明の一局面では、イオンペア化合物を使用した逆相クロマトグラフィーを用いて、輸液製剤や透析剤のような多成分を含む粘ちょう性の試料から、好適な被検対象である複数の含硫化合物、特にシステイン、シスチンを短時間にて明瞭に分離し、精度良く分析することができる。なお、本発明では分離方法は、イオンペア化合物を用いた逆相分析に限定されず、通常の逆相、順相、および、イオン交換法での使用も可能であり、分離メカニズムには依存しない。

本発明の一局面では、試料及び標準液の調製液、移動相等すべて酸性条件下で実施し、簡単な操作であることにより、酸化、および、新たなジスルフィド結合の形成による影響も受けにくく、安定的に複数の含硫化合物成分を短時間にて明瞭に分離し、精度良く分析することができる。

本発明の一局面では、オンライン再生化を用いることにより、堅牢性が高く、安定的に複数の含硫化合物成分を短時間にて明瞭に分離し、精度良くかつ同時に分析することができる。

本発明によれば、申請用の医薬品の規格試験法あるいは品質試験法としての分析方法が提供されることが見込まれる。

本発明の一局面によれば、透析剤などに含まれる２種の含硫アミノ酸、特にシステイン、シスチンの両成分を短時間にて明瞭に分離し、精度良くかつ同時に分析することができる。

本発明の一局面では、移動相を流しながら導電性ダイヤモンド電極の酸化電解研磨処理を行うことにより、システムを組替えることなく、安定した測定をすることができる。
表１に、システイン、シスチン分析における本発明と既存分析法の性能をまとめた。

図１は流路Ｐ１を模式的に示す。 図２は流路Ｐ２および流路Ｐ３を模式的に示す。 図３は標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムを示す。（実施例１） 図４は酸化電解研磨なしでのシステインのクロマトグラムを示す。（実施例１） 図５は酸化電解研磨ありでのシステインのクロマトグラムを示す。（実施例１） 図６は輸液製剤の分析によって得られたクロマトグラムを示す。（実施例１） 図７は標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムを示す。（実施例２） 図８は輸液製剤の分析によって得られたクロマトグラムを示す。（実施例２） 図９は標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムを示す。（実施例３） 図１０は標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムを示す（実施例４） 図１１はマウス血漿サンプルのクロマトグラムを示す。（実施例４） 図１２はマウス血漿に標準溶液を添加したサンプルのクロマトグラムを示す。（実施例４） 図１３は図１０の拡大図を示す。（実施例４） 図１４は図１２の拡大図を示す。（実施例４） 図１５はラット血漿サンプルを連続測定したクロマトグラムを示す。（実施例５） 図１６は標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムを示す。（実施例１） 図１７は赤ワインの分析によって得られたクロマトグラムを示す。（実施例７） 図１８は３−メルカプト−１−ヘキサノールのクロマトグラムを示す。（実施例８） 図１９はフランチオールのクロマトグラムを示す。（実施例９） 図２０はＨＩＬＩＣモードでのクロマトグラムを示す。（実施例１０）

以下、本発明による、測定試料に含まれる被検対象物の分析方法を単に本発明の方法と記載することもある。以下、被検対象物が「システインおよびシスチン」である場合を中心に説明するが、本発明では、被検対象物は特に限定されない。

本発明の測定試料は被検対象物を分析すべき試料であれば特に限定はなく、具体的には、輸液製剤、透析剤、醗酵液、生体試料（血漿・組織）などが挙げられる。被検対象物の分析は、被検対象物が存在しない場合にその不存在を確認することも含む。よって、測定試料に被検対象物が含まれることを要さない。好ましくは、被検対象物は２種以上のアミノ酸である。本発明におけるアミノ酸とは、天然型アミノ酸のみならず、非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミノ酸類をも含み、含硫アミノ酸が好ましい。例えば、ホモシステイン、スルホシステイン、Ｎ−アセチルシステイン（例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）などを含む。２種以上の含硫アミノ酸は好ましくはシステインおよびシスチンである。システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）はアミノ酸の一種であり、側鎖にチオール基を持つ。シスチン（ｃｙｓｔｉｎｅ）はアミノ酸の一種であり、２分子のシステインが、チオール基（−ＳＨ）の酸化によって生成するジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合を介してつながった構造をもつ。

本発明では、被検対象物は含硫化合物であってもよい。含硫化合物は化学構造中にイオウ原子を有する化合物であり、例えば、チオール基、ジスルフィド結合、スルフィド結合、スルホキシド結合、スルホン結合、スルフィン酸、スルホン酸、硫酸などの含硫官能基を有する化合物が挙げられ、チオール基またはジスルフィド結合を有する化合物が好ましい。含硫化合物は、好ましくは含硫アミノ酸である。上述したシステインやシスチンは含硫アミノ酸の具体例であり、含硫アミノ酸の具体例としては、他に、メチオニン、Ｎ−アセチルシステイン（例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）、システインスルフィン酸、ホモシステインスルフィン酸、ホモシステイン、ホモシスチン等が挙げられる。含硫アミノ酸ではない含硫化合物としては、含硫ペプチドであるグルタチオン（還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含む）、その他の３−メルカプト−１−ヘキサノール、フランチオール等が想定される。
含硫化合物としては、システイン、シスチン、Ｎ−アセチルシステイン、ホモシステイン、グルタチオンが好ましい。
含硫化合物は、１種のみを被検対象としてもよいし、２種以上を被検対象としてもよい。後述のように、本発明の分析方法は複数物質の同時分析が可能であるので、２種以上の含硫化合物を被検対象とする態様が好ましい。

測定試料に含まれる被検対象物、特に２種以上の含硫化合物（特にシステインおよびシスチン）の分析方法は、測定試料中の被検対象物の状態を見出すことを広く包含する概念であり、分析は定性分析であってもよいし定量分析であってもよい。また、本発明の方法は、医薬品の規格試験法、工場における品質管理試験法として用いてもよい。本発明の方法は、測定試料に被検対象物が含まれるか含まれないかを見出す方法、すなわち検出方法であってもよい。本発明の方法は測定試料中のシステインおよびシスチンの少なくとも一つの濃度の測定方法であってもよい。

本発明の一態様によれば、システインおよびシスチンに適した前処理カラムにおいて、システインおよびシスチンよりも大幅に長い通過時間を要する夾雑物質を含む測定試料において効果が大である。すなわち、該夾雑物質は、工程（１）において前処理カラムの入口付近に留まり、工程（２）において移動相を逆方向に流すことにより分析カラムを経由することなく、素早く除去される。そのような夾雑物質としては、電気化学的に活性なアミノ酸であるチロジン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニンなどが挙げられる。
なお、試料中に含まれる糖（ブドウ糖等）及び電解質（塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛等）の夾雑物質については本発明の方法では検出されない。

本発明の方法では、液体クロマトグラフィーの手法を適宜援用することができる。例えば、水および電解質を含む移動相を使用した逆相カラム液体クロマトグラフィーを採用することができる。以下、逆相カラムを用いた態様について説明するが、本発明がこれに限定されないことはいうまでもない。
移動相は一般的な酸性移動相を用いてもよい。本発明では、移動相のｐＨは好ましくは１〜３である。移動相のｐＨが前記範囲内である場合には、短時間に、精度良く、安定性良く、堅牢に分析できるという利点がある。移動相に含まれる電解質としては、特に限定はなく、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどが例示される。

好適な移動相の例は、以下のＡ成分およびＢ成分の混合物である。
ここで、Ａ成分は１０〜１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウムおよび１〜１０ｍＭのオクタンスルホン酸ナトリウムからなるリン酸緩衝液（ｐＨ１〜３）であり、Ｂ成分はアセトニトリルである。Ａ成分とＢ成分の重量比（Ａ／Ｂ）は、好ましくは９０．０／１０．０〜９９．０／１．０である。

本発明者らの知見によれば、移動相にイオンペア化合物を含有せしめることによってシステインおよびシスチンの分析精度が向上する。ＯＤＳカラムなどを用いる逆相系での分析において、酸性物質や塩基性物質などイオン性の物質は移動相の条件によって、解離状態となり、十分にカラムに保持することができなくなる。このような場合に、目的成分と逆の電荷を有するイオン性物質を移動相に添加することで、化合物を保持させる手法をイオンペアクロマトグラフィーといい、添加するイオン性物質をイオンペア化合物という。目的成分とイオンペア化合物は、移動相中でイオン対を形成することで、電荷の影響が軽減されて固定相に保持されやすくなる。加えて、固定相にイオンペア化合物が保持されることで、疑似的なイオン交換作用を持ち、目的成分が固定相に保持される効果も期待される。酸性移動相を用いた場合、アミノ酸のアミノ基がイオン化しているので、酸性のイオンペア化合物、例えば、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等を用いる。イオンペア化合物は、好適には、アルキルスルホン酸塩およびアルキル硫酸塩からなる群から選ばれる。

アルキルスルホン酸塩のアルキル部分の炭素数は好ましくは５〜１２であり、より好ましくは５〜８である。アルキルスルホン酸塩における「塩」は好ましくはアルカリ金属塩であり、中でも、ナトリウム塩が好ましい。アルキルスルホン酸塩のより具体的な例としては、オクタンスルホン酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム、ヘプタンスルホン酸ナトリウム、ドデカンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。

アルキル硫酸塩のアルキル部分の炭素数は好ましくは５〜１２であり、より好ましくは５〜８である。アルキル硫酸塩における「塩」は好ましくはアルカリ金属塩であり、中でも、ナトリウム塩が好ましい。アルキル硫酸塩のより具体的な例としては、ドデシル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。

図１は流路Ｐ１を模式的に示す。但し、本発明は図示された態様に限定されるわけではない。本発明の工程（１）では、流路Ｐ１に移動相と測定試料とを流す。流路Ｐ１は、前処理カラム１を順方向に通り、次いで分析カラム２を経て検出器３へ至る流路である。前処理カラム１は、複数の含硫化合物（システインおよびシスチンなど）が４〜１５分程度で通過することができるものから選ぶことができる。例えば、逆相カラムの市販品として、イナートシルＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＵＧ（野村化学社製）、ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳシリーズ（ワイエムシイ社製）、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８(資生堂社製)、ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）などが挙げられる。

本発明の分析装置において流路Ｐ１を構成する場合には、流路の方向を可逆的に切り換えることができる流路切換装置６を用いて、試料導入用流路をこの流路切換装置６に結合し、次いで、流路切換装置６から出て前処理カラム１を経て再び流路切換装置６に戻る流路へと導き、さらに、流路切換装置６から出て分析カラム２を経て被検対象物のクロマトグラムを取得することができる検出器３へ至るように配管および流路切換装置６を配置すればよい。ここで、流路切換装置６は典型的には１つ以上のバルブであり、試料導入用流路には、一般には、移動相の供給源（タンク等）５１と移動相の流れを駆動するための送液装置（ポンプ等）４１と測定試料を投入すべきインジェクタ７とが設けられている。

前処理カラム１は液体クロマトグラフィーにおける固定相として作用する。移動相は通常は分析カラム２を一方向に流す。本発明では、工程（１）で使用する流路Ｐ１において移動相を前処理カラム１に流すときの分析カラム内における流通方向を「順方向」と定義して、その反対の方向を「逆方向」と定義する。説明の便宜上、前処理カラム１の入口１１および出口１２を次のように定義する。すなわち、流通方向が「順方向」である場合には、液体は、前処理カラム１の「入口」１１から該カラム１に入り、前処理カラムの「出口」１２から出る。したがって、流通方向が「逆方向」である場合には、移動相は、前処理カラム１の「出口」１２から該カラムに入り、前処理カラムの「入口」１１から出る。

本発明では、測定試料を移動相とともに前処理カラム１を通過させることによって、好ましくは少なくとも一部の夾雑物質を除去した後に、被検対象物を含む溶液は分析カラム２に到達する。分析カラム２もまた液体クロマトグラフィーにおける固定相として作用し、例えば、システインおよびシスチンを分離することができる。被検対象物（システインやシスチンなどの含硫化合物）が分離可能であれば、分析カラム２の材質や形状などは特に限定されず、前処理カラム１と同じ種類のカラムを用いてもよい。

本発明は、逆相クロマトグラフィーに限定されない。例えば、順相クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーでも分析は可能である。
順相クロマトグラフィーの好適な移動相の例は、以下のＡ成分およびＢ成分の混合物である。ここで、Ａ成分は１０〜１００ｍＭの酢酸、および、酢酸ナトリウム
（ｐＨ３〜５）からなり、Ｂ成分はアセトニトリルである。Ａ成分とＢ成分の容量比（Ａ／Ｂ）は、好ましくは４０．０／６０．０〜５．０／９５．０である。使用する順相カラムとしては、水系移動相が使用できるＨＩＬＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）カラムが好ましく使用される。ＨＩＬＩＣカラムの市販品として、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ（野村化学社製）などが挙げられる。
イオン交換クロマトグラフィーの好適な移動相の例は、０．１から０．３Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液である。イオン交換カラムの市販品としては、昭和電工社製のＳｈｏｄｅｘ ＣＸｐａｋなどが挙げられる。

検出器３は被検対象物の存在に基くクロマトグラムの信号を受けて必要に応じて演算を行って、チャート等の表示手段（図示せず）に情報を伝達する装置である。検出器３の種類は、作用電極としてダイヤモンド電極を有する電気化学検出器である。電気化学検出器は作用電極と参照電極とを有し、所定の電圧、好ましくは１２００〜２０００ｍＶの電圧を作用電極に印加したときの、作用電極表面の酸化反応による電流変化を検出する装置である。好ましくは、作用電極は、導電性ダイヤモンド電極である。参照電極は一般的な銀／塩化銀電極などを用いることができる。

導電性ダイヤモンド電極は、３族や５族の不純物が添加されて半導体や金属のような導電性を呈するダイヤモンドからなる電極である。導電性ダイヤモンド電極はＣＶＤ法などによって製造できることが公知であり、特許文献２などの公知文献を適宜参酌して得ることができる。導電性ダイヤモンド電極を用いると、高感度で、短時間に、精度良く、日差変動もなく安定に、堅牢に、同時分析できるという利点がある。電極の処理はオンライン再生化を用いることが好ましく、その場合、システムの堅牢性が高まり、分析精度が向上する。さらに、堅牢性を高めるためには、電極上の酸素終端と水素終端の比率が徐々に変化しないよう電極表面を高度に酸素終端にしておくと良い結果が得られる。酸素終端を作る方法は、当該技術分野の自体公知の方法を特に制限することなく採用することができる。例えば、Akira Fujishima et. al. 編：Diamond Chemistry, 218 (2005) Elsevierに記載の、１．高温化で酸素ガスを流す、２．硫酸-硝酸の混液中でボイルする、３．酸素プラズマの照射、４．酸化剤での処理、５．酸化電解研磨、が好ましく採用される。中でも、分析システムの構成を崩さず、分析状態と同様に移動相を送液しながらオンラインで実行することのできる、酸化電解研磨法が本発明については、再現性が高く有用である。

移動相と測定試料の送液手段は特に限定なく、一般的なポンプ４１などを用いて移動相の供給源５１から移動相を送ることができる。図１の態様では、測定試料はインジェクタ７において流路Ｐ１に投入される。時間あたりの流量は、カラムの能力などに応じて適宜設定すればよく、好ましくは０．２〜１．０ｍＬ／ｍｉｎである。

本発明では、工程（１）において複数の含硫化合物（システインおよびシスチンなど）が前処理カラム１を通過した後に工程（１）を終了して工程（２）を開始する。複数の含硫化合物が前処理カラム１を通過するのに要する時間は移動相、流速、固定相の組合わせで概ね決まるので、予め所要時間を測定しておいてもよいし、前処理カラム１の出口１２の近傍などに検出手段（図示せず）を設けてモニターしてもよい。工程（２）では流路Ｐ２および流路Ｐ３を用いる。

図２は流路Ｐ２および流路Ｐ３を模式的に示す。但し、本発明は図示された態様に限定されるわけではない。本発明の工程（２）では、流路Ｐ２および流路Ｐ３に測定試料を含まない移動相を流す。流路Ｐ２の方向は図２において黒色の矢印で示されている。流路Ｐ２は、前処理カラム１を通らずに、分析カラム２を経て検出器３へ至る流路である。分析カラム２および検出器３は流路Ｐ１において使用するものと同じである。流路Ｐ２に移動相を流すことによって、工程（１）において分析カラム２あるいはそれ以前の管路に留まっていた被検対象の複数の含硫化合物（システインおよびシスチンなど）を分析カラム２においてクロマトグラフィー処理に供して分析作業を続行することができる。工程（２）において流路Ｐ２に測定試料を流さないことで、分析カラム２への夾雑物質の進入がないので分析精度の低下が起こり難い。

流路Ｐ３の方向は図２において白色の矢印で示されている。流路Ｐ３は、前処理カラム１を逆方向に通り、分析カラム２を経ず、検出器３も経ずに排出される流路である。前処理カラム１は流路Ｐ１で用いるものと同じである。工程（１）において前処理カラム１に留まる夾雑物質のうち、保持時間の長いものは前処理カラム１の入口１１の近傍に留まっている。こういった保持時間の長い夾雑物質を除去するために従来は長時間にわたって移動相を前処理カラム１に流しつづける必要があったところ、本発明によれば、流路Ｐ３を流れる移動相は前処理カラム１の出口１２から入口１１へと流れるので、入口１１の近傍に留まっていた夾雑物質を比較的に短時間で除去することができる。したがって、短時間にて次の測定試料に対する測定を開始することができ、測定の迅速化が図られる。さらに本発明の好ましい態様は、第１の分析において工程（３）の終了後、直ちに第２の分析において工程（１）、（２）および（３）を開始し、これを連続して繰り返し分析を行うことである。

本発明の分析装置において流路Ｐ２を構成する場合には、流路切換装置６を切り換えることによって、試料導入用流路からの流れを直ちに分析カラム２を経て検出器３へ至る流路へと導くようにすればよい。このように流路切換装置６により流れの方向を定めたときに、同時に、流路Ｐ３が構成されることが重要である。この場合、流路Ｐ３は、移動相導入用流路から流路切換装置６に入る流れを、前処理カラム１の出口側１２に導き、該前処理カラムを逆方向に通過させ、再び流路切換装置６に入れ、その後、排出路へ向うように流路が定められる。

工程（１）および工程（２）で流す移動相は好ましくは全て同種類とする。その場合、操作が簡便になることに加えて、移動相の種類の変化に起因するカラム１、２内での物質の保持挙動が変化するおそれが低減する。図面では、移動相の供給源５１、５２を便宜上２つ示しているが、同一の供給源から移動相を流路Ｐ１〜Ｐ３に供給してもよい。工程（１）および工程（２）における、流路Ｐ１〜Ｐ３の切り替えは、図示するように、流路切換装置（バルブ等）６および配管を組合わせることによって容易に実現することができる。

流路Ｐ２及びＰ３を構成した場合、被検対象物は、分析カラム２での分離後にダイヤモンド電極型電気化学検出器に導かれ、物質固有の電気化学活性により選択的に検出される。通過時間が被検対象物とほぼ同様の夾雑物質も分析カラム２に導かれるが、ダイヤモンド電極型電気化学検出器に活性を示さないため検出されない。一方、被検対象物より大幅に長い通過時間を要する夾雑物質は前処理カラム１から逆方向に流れて排出される。従って、本構成を採用することによって、夾雑物質の影響を無くした電気化学活性を持つ複数の含硫化合物を同時に検出することが可能となる。
本発明は、選択性が高く、ノイズレベルの低いダイヤモンド電極型電気化学検出器とカラムスイッチング法を用いることで、複数化合物を短時間で、精度の高い、安定した測定法が可能となる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明するが、これらの例は本発明を何ら限定するものではない。

（移動相）
５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム及び５ｍｍｏｌ／Ｌオクタンスルホン酸ナトリウム溶液に、リン酸を所定量加えることにより、酸性（ｐＨ２．２）の緩衝液を調製した。この緩衝液９７．５重量部に対し、アセトニトリルを２．５重量部加えることによって移動相を得た。

（標準溶液）
デシケータ（減圧、五酸化リン）で３時間乾燥した定量用Ｌ−システインを移動相に溶かした。別に、１０５℃で３時間乾燥した定量用Ｌ−シスチンを少量の１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液に溶かして水を加えて所定量にする。次に、このＬ−システイン溶液及びＬ−シスチン溶液をそれぞれ所定量はかり取り、移動相を加え混合および希釈して、標準溶液を得た。

（分析条件）
この実施例では図１および２に模式的に表現される分析システムを構築して分析を実施した。詳細な条件は以下のとおりである。
分析カラム：イナートシル ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）
１５０ｍｍ×３．０ｍｍＩ．Ｄ．ｄｐ＝３μｍ
前処理カラム：イナートシル ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）
３３ｍｍ×３．０ｍｍＩ．Ｄ．ｄｐ＝３μｍ
カラム温度：４０℃
検知器：電気化学検出器、導電性ダイヤモンド電極 １６００ｍＶ
参照電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ
流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ

（ダイヤモンド電極の酸化電解研磨）
移動相条件：アセトニトリル／０．１％リン酸＝５０／５０
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
印加電圧：５０００ｍＶ
処理時間：２４時間放置
ダイヤモンド電極の酸化電解研磨は、実際の測定に使用するシステムを構築した状態で移動相を流し、上記条件で行った。本条件はシステインに有効であった一例であり、各種の化合物においては強酸性条件において移動相を測定条件とほぼ同等な速度で流し、２０００ｍＶ以上の高電圧で６時間以上放置処理し、酸化電解研磨を完了することが好ましい。

（標準溶液の分析）
上述の標準溶液を用い、図１および図２に模式的に示される測定系において検出器３の作用電極の印加電圧を１６００ｍＶに設定し、その電流変化を検出した。このとき、図１および図２において点線で囲われた領域、すなわち、前処理カラム１と分析カラム２とバルブ６とを含む領域を４０℃にて一定に保った。この操作の結果、Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの同時分析が可能であることが確認できた。図３はこの標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムである。

ダイヤモンド電極の酸化電解研磨処理を行わない場合、初期の分析から１０時間経過するとシステインピーク面積値が約６６％に減ってしまっていたが、酸化電解研磨処理を行った場合は、９６％の面積値とほぼはじめの状態の面積値を維持していた。

図４は酸化電解研磨処理を行わずに、５時間後、１０時間後に同じ分析を行って得られたクロマトグラムであり、表２はその面積値である。

図５は、酸化電解研磨処理を行った後に、５時間後、１０時間後に同じ分析を行って得られたクロマトグラムであり、表３はその面積値である。

移動相を流しながらの酸化電解研磨処理が、本システムに十分有効であることが確認された。

（輸液製剤の分析）
輸液製剤（糖・電解質・アミノ酸液「ツインパル（登録商標）」味の素社製）を、上述の移動相で希釈して試料溶液を得た。この試料溶液を、標準溶液と同様にして分析を試みたところ、Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの特異的な分析が可能であることが確認できた。図６はこの輸液製剤の分析によって得られたクロマトグラムである。

この輸液製剤の組成は、表４（Ｉ層（糖・電解質液））および表５（ＩＩ層（アミノ酸液））のとおりである。分析の際には、ＩＩ層またはＩ層とＩＩ層とを混合した試料を用いた。図６には、ＩＩ層を試料としたときのクロマトグラムを示す。

本輸液製剤の場合、５００ｍＬ容量（Ｉ層：３５０ｍＬ、ＩＩ層：１５０ｍＬ）と１０００ｍＬ容量（Ｉ層：７００ｍＬ、ＩＩ層：３００ｍＬ）と２容量あり、試料としては２容量用いた。

本発明分析法では真度及び併行精度も良好であり、Ｌ−システイン；回収率：１０１％、相対標準偏差：０．９％、Ｌ−シスチン；回収率：１００％、相対標準偏差：０．７％（すべて、ｎ＝９で実施）であった。
特に、本実施例にあたっては、図１、２で示した、カラムスイッチング法が重要な役割を果たしている。ダイヤモンド電極を使用した電気化学検出器は選択性の高い装置ではあるが、システイン、シスチン以外にも、メチオニン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニンなどのアミノ酸も検出される。これらのアミノ酸は、輸液製剤や生体試料中にも多く含まれる成分である。カラムスイッチング法を使用しない場合、これらのアミノ酸は４５分から２８０分の間で溶出される（図１６）。このため、1サンプルあたりの分析時間が非常に長くなってしまい、事実上、実サンプルの測定には使用できないことになる。

（標準溶液）
８０℃で３時間乾燥した定量用Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを移動相に溶かした。次に、このＮ−アセチル−Ｌ−システイン溶液を所定量はかり取り、移動相を加えて希釈して、標準溶液を得た。なお、移動相は実施例１と同様のものとした。

（分析条件）
この実施例では図１および２に模式的に表現される分析システムを構築して分析を実施した。詳細な条件は実施例１の場合と同じである。

（標準溶液の分析）
上述の標準溶液を用い、図１および図２に模式的に示される測定系において実施例１の場合と同様の操作を行なった結果、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの同時分析が可能であることが確認できた。図７はこの標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムである。

（輸液製剤の分析）
輸液製剤（アミノ酸・電解質液「市販のビタミンＢ1・糖・電解質・アミノ酸液」）を、上述の移動相で希釈して試料溶液を得た。この試料溶液を、標準溶液と同様にして分析を試みたところ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの特異的な分析が可能であることが確認できた。図８はこの輸液製剤の分析によって得られたクロマトグラムである。

この輸液製剤の組成は、表６（上室液（アミノ酸・電解質液））および表７（下室液（ビタミンＢ1・糖・電解質液））のとおりである。分析の際には、上室液または上室液と下室液とを混合した試料を用いた。図８には、上室液を試料としたときのクロマトグラムを示す。

本輸液製剤の場合、５００ｍＬ容量（上室液：１５０ｍＬ、下室液：３５０ｍＬ）と１０００ｍＬ容量（上室液：３００ｍＬ、下室液：７００ｍＬ）と２容量あり、試料としては２容量用いた。

（標準溶液）
デシケータ（減圧、五酸化リン）で３時間乾燥したＬ−システインスルフィン酸、Ｌ−ホモシステインスルフィン酸、ＤＬ−ホモシステイン及び還元型グルタチオンを移動相に溶かし混合溶液とした。同様に乾燥したＬ−ホモシスチンを少量の１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液に溶かして水を加えて所定量とし、Ｌ−ホモシスチン溶液とする。次に、この混合溶液及びＬ−ホモシスチン溶液をそれぞれ所定量はかり取り、移動相を加え混合および希釈して、含硫アミノ酸・含硫化合物の標準溶液を得た。なお、移動相は実施例１と同様のものとした。

（分析条件）
この実施例では図１および２に模式的に表現される分析システムを構築して分析を実施した。詳細な条件は実施例１の場合と同じである。

（標準溶液の分析）
上述の標準溶液を用い、図１および図２に模式的に示される測定系において実施例１の場合と同様の操作を行なった結果、含硫アミノ酸・含硫化合物の標準溶液の同時分析が可能であることが確認できた。図９はこの標準溶液の分析によって得られたクロマトグラムである。
本法は、Ｌ−システイン等のアミノ酸の分解物の検索に有効な方法と考えられる。なお、図９でリテンションタイム２．１分のピークはＬ−システインスルフィン酸に由来し、２．５分のピークはＬ−ホモシステインスルフィン酸に由来する。

（標準溶液）
システイン、シスチン、還元型グルタチオン、ホモシステインを所定量はかり取り、希塩酸を用いて溶解した。その後、水を加えて順次希釈し、６μｍｏｌ／Ｌのシステイン、１５μｍｏｌ／Ｌのシスチン、３μｍｏｌ／Ｌの還元型グルタチオンおよび６μｍｏｌ／Ｌのホモシステインを含有する標準溶液を得た。

（血漿サンプルの調製）
マウス、ラット、イヌおよびヒト等の血漿に対し、トリクロロ酢酸溶液を添加し、遠心分離により、タンパク成分を除去した。遠心上清を水で希釈し、血漿サンプルを得た。

（分析条件）
この実施例では図１および２に模式的に表現される分析システムを構築して分析を実施した。詳細な条件は以下のとおりである。
分析カラム：イナートシル ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）
１００ｍｍ×３．０ｍｍＩ．Ｄ．ｄｐ＝３μｍ
前処理カラム：イナートシル ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）
１０ｍｍ×３．０ｍｍＩ．Ｄ．ｄｐ＝５μｍ
カラム温度：５０℃
移動相：１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム（２０ｍＭ）およびリン酸（２５ｍＭ）を含有する緩衝液９８．５重量部と、１．５重量部のアセトニトリルとの混合液
検知器：電気化学検出器、導電性ダイヤモンド電極 １６００ｍＶ
参照電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ
流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
カラムスイッチング時間 ２．１ ｍｉｎ
検出 ：ＥＣＤ ２０．０分 １６００ｍＶ
２０．１分 ４０００ｍＶ
２１．０分 １６００ｍＶ
被検対象物が検出され分析が終了した２０．１分後に、電極表面に堆積してしまう汚れを高電圧を印加することで落とし、電気化学的に再生した。

（標準溶液の分析）
上述の標準溶液を用い、図１および図２に模式的に示される測定系において検出器３の作用電極の印加電圧を１６００ｍＶに設定し、その電流変化を検出した。このとき、図１および図２において点線で囲われた領域、すなわち、前処理カラム１と分析カラム２とバルブ６とを含む領域を５０℃にて一定に保った。この操作の結果、システイン、シスチン、還元型グルタチオン、ホモシステインの同時分析が可能であることが確認できた。
図１０は標準溶液で、システイン６μｍｏｌ／Ｌ、還元型グルタチオン ３μｍｏｌ／Ｌ、ホモシステイン ６μｍｏｌ／Ｌ、シスチン １５μｍｏｌ／Ｌを分析したクロマトグラムであり、図１３は図１０のホモシステイン溶出部分を拡大した図である。

（血漿サンプルの分析）
上述の前処理を施した血漿サンプルを、標準溶液と同様にして分析を試みたところ、血漿中のシステイン、シスチン、還元型グルタチオン、ホモシステインの特異的な分析が可能であることが確認できた。図１１はマウス血漿サンプルの分析によって得られたクロマトグラムである。

（血漿添加サンプルの分析）
図１２は血漿（図１１）に標準溶液６μｍｏｌ／Ｌ、還元型グルタチオン ３μｍｏｌ／Ｌ、ホモシステイン ６μｍｏｌ／Ｌ、シスチン １５μｍｏｌ／Ｌを添加し、分析した結果である。図１４は図１２のホモシステイン溶出部分を拡大した図である。

図１０は標準溶液分析より、添加したシステイン、還元型グルタチオン、ホモシステイン、シスチンのみが検出されている。図１１では血漿中に含まれている成分として、システイン、還元型グルタチオン、シスチンが検出されている。
血漿中ではホモシステインが検出されていないため、図１２において、血漿中に添加したホモシステインの濃度は図１０と同濃度の６μｍｏｌ／Ｌとなる。図１２で得られたホモシステインのピークと図１０のホモシステインのピークはほぼ同一であり、かつ、図１３と図１４から、ピークの高さとノイズが同程度であることが確認された。以上の結果から、マトリクスに夾雑物質を含む血漿中の分析においても、標準溶液分析と同様の感度が得られることがわかった。

実際の血漿等の生体試料においては様々な夾雑物質が含まれており、その中には電気化学的な活性を示すものが存在する。しかし、先行文献においては夾雑物質が含まれていない標準品分析のデータしか提示されていないのが現状である。
電気化学的な選択性とカラムスイッチング等の分離手法を組み合わせた選択性の調整が、本システムを複雑なマトリクスを含む材料に適用する際には不可欠である。事実医薬品や食品分析における検出限界はバックグラウンドの３σと定義づけされており、ダイヤモンド電極電気化学検出器が優れた検出能を有していても、夾雑物質と分離できる選択性の調整が達成できない限り、感度は上がらない。
このように、複雑なマトリクスサンプルであり夾雑物質が含まれている血漿ブランクサンプルにおいても、標準溶液分析と同じ感度が得られたことは、電気化学的選択性とカラムスイッチング手法を組み合わせた本システムによって初めて達成されるものである。

本法について、ラット血漿を用いて、定量性を確認した結果、直線性、同時再現性、日間再現性、安定性（オートサンプラー４℃）、正確度等良好な結果が得られた。定量範囲は、システイン、ホモシステイン：６〜１２０μＭ、還元型グルタチオン：３〜６０μＭ、シスチン：１５〜３００μＭであった。

（標準溶液を添加した血漿試料の調製）
ラット血漿１００μＬに水２０μＬ、１０％トリクロロ酢酸８０μＬを添加して、タンパクを変性させる。遠心分離をした上清１００μＬに対し、システイン・シスチン混合試料１０μＬ、精製水８９０μＬを加え攪拌したサンプルを血漿試料とした。
この血漿試料を用いて連続分析を行った。

（分析条件）
図１および図２に模式的に示される測定系において検出器３の作用電極の印加電圧を１６００ｍＶに設定し、その電流変化を検出した。
詳細な条件は実施例１の場合と同じである。なお、分析サイクルは １分析あたり２０分とした。

（血漿添加サンプルの連続測定）
図１５は、１０００回の連続分析の中で、初期、５００回、１０００回目のクロマトグラムである。
初期、５００回、１０００回のクロマトグラムにおいて、システイン、シスチンのピーク強度は変わらず、ベースラインも安定している。
表８は、１０００回の連続分析のうち、２１〜２９回目、４８１〜４８９回目、９６１〜９６９回目それぞれ連続する９回分析における保持時間と面積値の変動率（ＣＶ％）を示すものである。システイン、シスチンとも保持時間の変動率は１％以下、面積値のＣＶ値は最大でも約３．９％と良好な結果が得られた。

表９、１０に１０００回連続分析を行った中の、７時間後（２０回め）、１６０時間後（４８０回め）、３２０時間後（９６０回め）のピーク面積値をピックアップし、その減少率を示した。３２０時間後でもその減少率は５％以下とわずかであり、システムの安定性が確認された。
以上より、非常に多くの夾雑物質を含む複雑なマトリクスである血漿サンプルを試料として、短時間で、精度の高い定量分析が可能であることが示された。
これには、カラムスイッチング法を用いて夾雑物質を効率よく除去し、分析時間の短縮化と電極の劣化を防いだこと、導電性ダイヤモンド電極を使用したため、カーボンでは電極に負荷のかかるアルキルスルホン酸塩を十分な濃度で使用でき、かつ、高い印加電圧をかけて電極表面を酸化電解研磨する洗浄ができること、さらに注入ごとに洗浄ができることなどが大きく寄与していると考えられ、夾雑物質の影響を受けず、安定した分析を可能とするものである。

一方、データ安定性の比較対照として、グラッシーカーボン電極を使用した標準溶液の分析を行った。グラッシーカーボン電極は、高い印加電圧をかけることができないため、反応電位の高いシスチンは検出することができずにシステインのみ行っている。

（分析条件）
分析カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）３μｍ ３．０ｘ１５０ｍｍ
移動相：１００ｍＭ リン酸緩衝液−５ｍＭオクタンスルホン酸ナトリウム (ｐＨ２．２)/メタノール＝９５／５
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：電気化学検出器 グラッシーカーボン電極
印加電圧：５００ｍＶ

（グラッシーカーボン電極を使用する標準溶液の分析）
３種類の濃度に標準溶液を調整し、日が経過した場合の面積値変化を見たものが表１１〜１３である。
グラッシーカーボン電極を用いたシステイン分析では、時間の経過に伴い面積値が変化し、９６時間ですでに２０％以上面積値が減少したことから、安定性に欠けることが確認された。
このことから、先の、ダイヤモンド電極で構築した分析システムが、試料に夾雑物質を多く含む過酷な条件にもかかわらず、いかに安定したものであるかが際立つ結果となった。

(発酵液である赤ワイン分析)
発酵液の分析例として、赤ワイン、および、その強制酸化品の分析を本発明のシステムで行った。
図１および図２に模式的に示される測定系において検出器３の作用電極の印加電圧を１６００ｍＶに設定し、その電流変化を検出した。詳細な条件は実施例４の場合と同じである。

（酸化条件・サンプル前処理条件）
赤ワインをスクリューバイアルに１／３量程度入れ、フタをした後、超音波を３０分間かけた。その後、未処理の赤ワイン、および、酸化処理した赤ワインを１０％トリクロロ酢酸で除タンパクし、その遠心上清を希釈して本発明のシステムで測定を行った。

（分析結果）
図１７に結果を示す。本発明のシステムを用いることで、多くの成分を含む発酵液を短時間で再現性良く測定することが可能となった。２種のクロマトグラムを比較したところ約１０分までのシグナルについては、同等の分離・強度が得られている。一方、１０〜１１分、および、１４〜１５分のシグナルについてはピーク強度が大きく変動している。これらの化合物は、サンプルの酸化状態を示すシグナルであり、本発明のシステムを用いることで、精度良く短時間に分析が可能である。

（標準溶液の分析）
チオール基をその構造に持ち、グレープフルーツの香として知られている３−メルカプト−１−ヘキサノールを、強制的に酸化し、本発明のシステムでその酸化体の分析を行った。

分析カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）３μＭ ２．１ｘ１５０ｍｍ
移動相：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．８）／アセトニトリル＝５０／５０
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：電気化学検出器 導電性ダイヤモンド電極
印加電圧：１６００ｍＶ

（３−メルカプト−１−ヘキサノールの酸化条件）
３−メルカプト−１−ヘキサノール１０μＬに水−ジメチルホルムアミド混合溶液（１:１）を添加し、３０分超音波処理後、室温で１２時間静置した。これを水で６倍希釈し、３−メルカプト−１−ヘキサノールの酸化試料として分析に用いた。

（分析結果）
図１８は、３−メルカプト−１−ヘキサノールの酸化試料の分析によって得られたクロマトグラムである。
３−メルカプト−１−ヘキサノールを酸化させた場合、５分に３−メルカプト−１−ヘキサノール、１０．５分に３−メルカプト−１−ヘキサノール二量体と考えられる２本のピークが検出された。
チオール基を持つ化合物の１量体と２量体の同時分析が可能であることが確認された。

（標準溶液の分析）
チオール基をその構造に持ち、珈琲の香として知られているフランチオールを、システインと合わせて強制的に酸化し、本発明のシステムでその酸化体の分析を行った。

（分析条件）
分析カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）３μＭ ２．１ｘ１５０ｍｍ
移動相：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．８）／アセトニトリル＝５０／５０
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：電気化学検出器 導電性ダイヤモンド電極
印加電圧：１６００ｍＶ

（フランチオールとシステインの酸化条件）
システイン１０ｍｇ／ｍＬ（水：ジメチルホルムアミド＝１:１で溶解)とフランチオール１０μＬを混合し、３０分超音波処理後、室温で１２時間静置したものを、フランチオール-システイン混合酸化試料として分析に用いた。
システイン１０ｍｇ／ｍＬ（水：ジメチルホルムアミド＝１:１で溶解）を上記と同様に酸化させ、ジメチルホルムアミドで１０倍希釈後、システインの酸化試料として分析に用いた。
フランチオール１０μＬは、上記と同様に酸化させて分析に用いた。

（分析結果）
図１９は、前記したフランチオール−システイン混合酸化試料、フランチオール、システインの分析によって得られたクロマトグラムである。
フランチオールのみを酸化した場合、７．５分にフランチオール、２４．５分にフランチオール二量体のピークが検出され、マススペクトルにより同定することができた。
フランチオールとシステインを混合し酸化した場合、システインピークと、フランチオールのみの酸化では見られなかったピークが数本出現し、システインを混合したことでフランチオールとシステインが反応し、酸化体が生成したと考えられた。ダイヤモンド電極を使用した電気化学検出器により、チオールのホモ２量体だけではなく、異なるチオール間で形成される酸化体の測定が可能であることが確認された。

イオンペアクロマトグラフィー以外の分離モードの事例として、ＨＩＬＩＣモードでの分析を実施した。システイン、シスチン、還元型グルタチオン、および、酸化型グルタチオンのクロマトグラムを図２０に示す。

（分析条件）
分析カラム: ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ ４．６×２５０ｍｍ
移動相: アセトニトリル／５０ｍＭ 酢酸＋５ｍＭ 酢酸アンモニウム＝７０／３０
カラムオーブン温度: ４０℃設定
流速：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：１０ μｌ
検出:ＥＣＤ ３０ ｍｉｎ １６００ ｍＶ
３１ ｍｉｎ ４０００ ｍＶ
３１ ｍｉｎ １６００ ｍＶ
ＨＩＬＩＣモードの移動相とイオンペアクロマトグラフィーの移動相（実施例１、４）を比較した場合、緩衝液の種類、塩強度、イオンペア試薬の有無、および、有機溶媒濃度などが大きく異なっていることがわかる。このような異なる移動相条件においても、システイン、シスチン、還元型グルタチオン、および、酸化型グルタチオンは、ダイヤモンド電極付電気化学検出器により、全く支障なく検出されている（図２０）。以上のことから、本分析システムにおいては、分離モードに依存することなく含硫アミノ酸、含硫化合物を分析することが可能と考えられる。

本出願は、日本で出願された特願２００６−１６６５５６を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
本発明がその好ましい態様を参照して提示又は記載される一方、本明細書中において、添付の請求の範囲で包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態や詳細の様々な変更をなし得ることは当業者に理解されるであろう。本明細書中に示され又は参照されたすべての特許、特許公報及びその他の刊行物は、参照によりその全体が取り込まれる。

１ 前処理カラム
１１ 入口
１２ 出口
２ 分析カラム
３ 検出器
４１、４２ ポンプ
５１、５２ 移動相の供給源
６ バルブ
７ インジェクタ

Claims (13)

1. 測定試料に含まれる被検対象物を液体クロマトグラフィーを用いて分析するための分析方法であって、前記測定試料は、シスチン、システインおよびグルタチオンを少なくとも含有するものであり、前記被検対象物は、少なくとも、シスチン、システインおよびグルタチオンであり、
   測定試料を移動相とともに以下の流路Ｐ１に流す試料導入工程（１）、
   測定試料を含まない移動相を以下の流路Ｐ２および流路Ｐ３に流す洗浄工程（２）、ならびに、
   試料導入工程（１）によって分析カラムから出た上記被検対象物のクロマトグラムを、導電性ダイヤモンド電極を作用電極として有する電気化学検出器によって取得する分析工程（３）、
   を有し
   （但し、流路Ｐ１は、前処理カラムを順方向に通り、次いで分析カラムを経て検出器へ至る流路であり、
   流路Ｐ２は、前処理カラムを通らずに、分析カラムを経て検出器へ至る流路であり、
   流路Ｐ３は、前処理カラムを逆方向に通り、分析カラムを経ず、検出器も経ずに排出される流路である。）、
   （ｉ）前記試料導入工程（１）において上記被検対象物が前処理カラムを通過し、前記分析工程（３）におけるクロマトグラムの取得が完了した後に、該試料導入工程（１）および該分析工程（３）を終了して前記洗浄工程（２）を開始し、かつ、
   （ii）分析時に前記導電性ダイヤモンド電極の表面に形成された不活性膜を前記洗浄工程（２）で除去すべく、移動相を検出器に流しながら該導電性ダイヤモンド電極に４０００ｍＶ以上の電圧を印加することによって、該電極を検出器に取り付けた状態のままで、該不活性膜を分析毎に移動相中で除去し、
   前記（ｉ）、（ii）の操作を繰り返すことによって、分析時に前記導電性ダイヤモンド電極表面に形成された前記不活性膜を分析毎に移動相中で除去しながら、連続繰り返し分析を行うことを特徴とする、
   前記分析方法。
2. 測定試料に含まれる被検対象物より大幅に長い通過時間を要する夾雑物質は分析カラムを経由しない請求項１の分析方法。
3. 移動相が、水、電解質を含む請求項１または２記載の分析方法。
4. 移動相が、水、電解質およびイオンペア化合物を含み、ｐＨが１〜３である請求項１〜３のいずれか１項記載の分析方法。
5. イオンペア化合物がアルキルスルホン酸塩およびアルキル硫酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項４記載の分析方法。
6. 分析カラムが、逆相カラム、順相カラム、またはイオン交換カラムのいずれかである請求項１〜５のいずれか１項記載の分析方法。
7. 分析カラムが、逆相カラムである請求項６記載の分析方法。
8. 測定試料が輸液製剤、透析剤、醗酵液、生体試料のいずれかである請求項１〜７のいずれか１項記載の分析方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項の分析方法を用いることを特徴とする、測定試料に含まれるシスチン、システインおよびグルタチオンの同時検出方法。
10. 測定試料に含まれる被検対象物を液体クロマトグラフィーを用いて分析するための分析装置であって、前記測定試料は、シスチン、システインおよびグルタチオンを少なくとも含有するものであり、前記被検対象物は、少なくとも、シスチン、システインおよびグルタチオンであり、
    流路の方向を可逆的に切り換えることができる流路切換装置と、
    移動相を測定試料とともに流路切換装置へ流す試料導入用流路と、
    移動相を単独で流路切換装置へ流す移動相導入用流路と、
    流路切換装置から出て前処理カラムを経て再び流路切換装置に戻る流路と、
    流路切換装置から出て分析カラムを経て被検対象物のクロマトグラムを取得することができる、導電性ダイヤモンド電極を作用電極として有する電気化学検出器へ至る流路と、
    流路切換装置から出て前処理カラムも分析カラムも経ずに当該装置外へ至る排出路と、を有し、
    流路切換装置は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の状態に相互に切り換えることができるように構成されており、かつ、下記（Ａ）の状態において分析時に前記導電性ダイヤモンド電極の表面に形成される不活性膜を、下記（Ｂ）の状態において移動相中で除去すべく、流路切換装置を下記（Ｂ）の状態として移動相を検出器に流しながら、該導電性ダイヤモンド電極に４０００ｍＶ以上の電圧を印加することによって、該電極を検出器に取り付けた状態のままで、該不活性膜を分析毎に移動相中で除去し得る構成となっており、
    該構成によって、該（Ａ）及び該（Ｂ）の状態の切り換えを繰り返し、分析時に前記導電性ダイヤモンド電極表面に形成された前記不活性膜を、分析毎に移動相中で除去しながら、連続繰り返し分析を行うことが可能となっている、
    被検対象物の分析装置。
    （Ａ）試料導入用流路から、前処理カラムを順方向に通り、次いで分析カラムを経て検出器へ至る流路Ｐ１を構成する状態、
    （Ｂ）試料導入用流路から、前処理カラムを通らずに、分析カラムを経て検出器へ至る流路Ｐ２、および、移動相導入用流路から、前処理カラムを逆方向に通り、排出路へ至る流路Ｐ３を構成する状態。
11. 分析カラムが、逆相カラム、順相カラム、またはイオン交換カラムのいずれかである請
    求項１０記載の分析装置。
12. 分析カラムが、逆相カラムである請求項１１記載の分析装置。
13. 測定試料が輸液製剤、透析剤、醗酵液、生体試料のいずれかである、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の分析装置。

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