CN114062565B - 一种检测样品中含dota环或nota环的化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其中，含DOTA环的化合物例如为(S,E)‑2,2',2'‑(10‑(2‑((6‑氨基‑1‑((4'‑((8‑氨基‑1‑羟基‑5,7‑二硫酞菁‑2‑基)重氮基)‑3,3'‑二甲基‑[1,1'‑联苯基]‑4‑基)氨基)‑1‑氧杂烷‑2‑基)氨基)‑2‑氧乙基)‑1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7‑三酰基)三乙酸或氧奥曲肽，所述方法包括以下步骤：使用稀释剂对所述样品进行稀释，将稀释的样品使用高效液相色谱法进行检测，其中所述稀释剂包含喷替酸。本发明的方法解决了含DOTA环或NOTA环的化合物含量测定的准确度问题。除此之外，方法专属性、灵敏度、线性和范围、溶液稳定性经验证均良好。

Description

一种检测样品中含DOTA环或NOTA环的化合物的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地，涉及一种检测样品中含DOTA环或NOTA环的化合物的方法。
背景技术
DOTA环是指1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸，是一种十二元四氮杂大环配体，本质上是环楞胺中四个氮上的氢被乙酸基取代的产物。NOTA环是指1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三羧酸，是一种九元三氮杂大环配体，本质上是三乙基烯三胺中三个氮上的氢被乙酸基取代的产物。
含DOTA环或NOTA环的化合物如有高活性DOTA环或NOTA环的存在，常温下即可与常规稀释剂中、玻璃容器中可能存在的金属离子反应，因此对含DOTA环或NOTA环的化合物的定量检测带来困难。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种检测样品中检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其中，含DOTA环的化合物例如为 (S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸或氧奥曲肽。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1. 一种检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
使用稀释剂对所述样品进行稀释，
将稀释的样品使用高效液相色谱法进行检测，
其中所述稀释剂包含喷替酸。
2. 根据项1所述的方法，其特征在于，含DOTA环的化合物为(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸或氧奥曲肽。
3. 根据项1所述的方法，其特征在于，所述稀释剂包含喷替酸、水和乙腈。
4. 根据项3所述的方法，其特征在于，所述稀释剂中喷替酸的质量百分比为0.01%-0.5%，和/或乙腈的体积百分比为45-55%。5. 根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法使用的色谱柱为辛烷键合硅胶色谱柱或十八烷基键合硅胶色谱柱，其中辛烷键合硅胶色谱柱优选Agilent Zorbax SB C8，十八烷基键合硅胶色谱柱优选WatersAtlantis® T3。
6. 根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，
其中流动相A：四丁基乙酸铵水溶液，优选所述水溶液使用例如磷酸调节pH为3.0±0.1，进一步优选所述水溶液中四丁基乙酸铵的浓度为1.2g/L；
流动相B：乙腈，
优选地，所述梯度洗脱的过程为：
第一阶段，流动相A和流动相B的体积比为80：20；
第二阶段，流动相A和流动相B的体积比为30：70；
第三阶段，流动相A和流动相B的体积比为5：95；
第四阶段，流动相A和流动相B的体积比为80：20。
7. 根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法使用流动相A和流动相B进行等度洗脱，
其中流动相A：三氟乙酸水溶液，优选质量含量为0.1±0.01%的三氟乙酸水溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱程序为A:B=70:30-80:20。
8. 根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.8-1.2ml/min。
9. 根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为25-35℃，检测波长为220nm或218nm。
10. 根据项1所述的方法，其特征在于，在使用稀释剂对所述样品进行稀释的步骤中，将所述样品稀释至样品浓度为1-100μg/ml。
本发明的方法解决了含DOTA环或NOTA环化合物含量检测的准确性问题，特别是在上述化合物含量非常低的情况下。
附图说明
图1为实施例1的分析色谱图。
图2为对比例1的分析色谱图。
图3为实施例4的分析色谱图。
图4为对比例2的分析色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
DOTA环是指1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸，是一种十二元四氮杂大环配体，本质上是环楞胺中四个氮上的氢被乙酸基取代的产物。含DOTA环的化合物如有高活性DOTA环的存在，常温下即可与常规稀释剂中、玻璃容器中可能存在的金属离子反应，因此对含DOTA环的化合物的定量检测带来困难，特别是在上述化合物含量非常低的情况下。
其中，(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸为含有高活性DOTA环的化合物，其结构如下式所示：
Figure 992533DEST_PATH_IMAGE001
氧奥曲肽是指[(4,7,10-三羧甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰基]-D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-酪氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨酸环(2→7)-二硫键三氟乙酸盐，其结构如下式所示：
Figure 15852DEST_PATH_IMAGE002
NOTA环是指1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三羧酸，是一种九元三氮杂大环配体，本质上是三乙基烯三胺中三个氮上的氢被乙酸基取代的产物。性质与DOTA环类似，其检测同样存在上述问题。
为了解决上述含DOTA环或NOTA环的化合物在检测中存在的问题，本发明提供一种检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其中含DOTA环的化合物例如 为(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸或氧奥曲肽，所述方法包括以下步骤：
使用稀释剂对所述样品进行稀释，
将稀释的样品使用高效液相色谱法进行检测，
其中所述稀释剂包含喷替酸。
其中，所述样品可以是包含DOTA环或NOTA环的化合物的任何样品。
所述样品在进行检测时需要进行稀释，其中，在使用稀释剂对所述样品进行稀释的步骤中，可以根据实际样品将所述样品使用稀释剂稀释不同的倍数。在一个具体的实施方式中，将所述样品稀释至样品浓度为1-100μg/ml，例如可以为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml。所述稀释剂包含喷替酸，其中喷替酸又称为戊二酸或二亚乙基三胺五乙酸（DTPA），是由具有五个羧甲基的二亚乙基三胺骨架组成的氨基多羧酸，是一种白色的水溶性固体。喷替酸分子中的N和O配位原子多，络合金属能力强，常温下即可与常规稀释剂如水、一定比例的乙腈水溶液、溶剂接触的玻璃容器等中可能存在的铅、铬、锌、铁(3价)、锰等鳌合。
进一步地，所述稀释剂包含喷替酸、水和/或乙腈，即所述稀释剂可以包含替酸、水和乙腈，也可以包含喷替酸和水，还可以包含喷替酸和乙腈。
更进一步地，所述稀释剂由喷替酸、水、和/或乙腈组成。即所述稀释剂可以由喷替酸、水和乙腈组成，也可以由喷替酸和水组成，还可以由喷替酸和乙腈组成。
其中，喷替酸和乙腈的含量可以根据实际样品进行调整。在一个具体的实施方式中，所述稀释剂中喷替酸的质量百分比为0.01-0.5%，例如可以为0.01%、0.025%、0.045%、0.05%、0.075%、0.1%、0.25%、0.5%。所述稀释剂中当存在乙腈时，其在稀释剂中的体积百分比为45-55%，例如可以为45%、50%、55%。
在一个具体的实施方式中，所述稀释剂由喷替酸、水和乙腈组成，其中喷替酸的质量百分比为0.25-0.1%，乙腈的体积百分比为50%。
在一个具体的实施方式中，所述稀释剂由喷替酸和水组成，其中喷替酸的质量百分比为0.01-0.5%。
色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
在一个具体的实施方式中，将稀释的样品使用高效液相色谱法进行检测时，所述高效液相色谱法使用的色谱柱为辛烷键合硅胶色谱柱，例如Agilent Zorbax SB C8（4.6×150mm，3.5μm）。
在一个具体的实施方式中，将稀释的样品使用高效液相色谱法进行检测时，所述高效液相色谱法使用的色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱，例如Waters Atlantis® T3（4.6×150mm，3μm）。
在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.8-1.2ml/min，例如可以为0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min。
在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱。其中，流动相A：四丁基乙酸铵水溶液，所述水溶液使用磷酸调节pH为3.0±0.1，所述水溶液中四丁基乙酸铵的浓度为1.2g/L。流动相B：乙腈。
在一个具体的实施方式中，所述梯度洗脱的过程为：
第一阶段，流动相A和流动相B的体积比为80：20；
第二阶段，流动相A和流动相B的体积比为30：70；
第三阶段，流动相A和流动相B的体积比为5：95；
第四阶段，流动相A和流动相B的体积比为80：20。
在一个具体的实施方式中，所述梯度洗脱的过程为：
第0-13min，流动相A和流动相B的体积比为80：20；
第13-18min，流动相A和流动相B的体积比为30：70；
第18-18.1min，流动相A和流动相B的体积比为5：95；
第18.1-32min，流动相A和流动相B的体积比为80：20。
在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法使用流动相A和流动相B进行等度洗脱，
其中流动相A：质量含量为0.1±0.01%的三氟乙酸水溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱程序为A:B=70:30-80:20。在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为25-35℃，检测波长为220nm或218nm。
在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法中进样量为10μl-40μl。
实施例
尽管对本发明的实施方案和具体实施例进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸的检测
1.仪器试剂
岛津20AT液相色谱仪、分析天平： METTLER XPR2
超纯水、乙腈 (色谱纯) 、喷替酸、(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸
2.色谱条件
使用高效液相色谱法进行样品检测，其中具体的色谱条件如表1所示。
表1
Figure 523057DEST_PATH_IMAGE003
3.溶液配制
分别配制稀释剂1、稀释剂2、稀释剂3、稀释剂4。其中，稀释剂1为水。稀释剂2由喷替酸、乙腈和水组成，其中喷替酸的质量含量为0.025%，乙腈的体积比为50%。稀释剂3由喷替酸、乙腈和水组成，其中喷替酸的质量含量为0.075%，乙腈的体积比为50%。稀释剂4由喷替酸、乙腈和水组成，其中喷替酸的质量含量为0.1%，乙腈的体积比为50%。
4.测定
实施例1
取(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸样品，使用稀释剂2溶解并稀释制成理论浓度为20μg/ml的溶液进行测试。
实施例2
取(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸样品，使用稀释剂3溶解并稀释制成理论浓度为20μg/ml的溶液进行测试。
实施例3
取(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸样品，使用稀释剂4溶解并稀释制成理论浓度为20μg/ml的溶液进行测试。
对比例1
取(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸样品，使用稀释剂1溶解并稀释制成理论浓度为20μg/ml的溶液进行测试。
5.结果
实施例1的分析色谱图如图1所示，对比例1的分析色谱图如图2所示。实施例1、实施例2、实施例3和对比例1的检测结果如表2所示。其中回收率为实际测得浓度与相应理论配制浓度的比值。
表2
Figure 1443DEST_PATH_IMAGE004
由图1、图2以及表2的结果可以看出，使用本发明的含有喷替酸的稀释剂测定(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸的含量时，回收率为100%-108%，而当使用水作为稀释剂时，回收率仅为84%。所以，本发明的稀释剂发挥了掩蔽金属离子的作用，使方法回收率达到90%-110%，依照药典相关验证规定，回收率在这个范围内，可以准确测定(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸。
氧奥曲肽的检测
1.仪器试剂
岛津20AT液相色谱仪、分析天平：METTLER XPR2
超纯水、乙腈 (色谱纯) 、喷替酸、氧奥曲肽
2.色谱条件
使用高效液相色谱法进行样品检测，其中具体的色谱条件如表3所示。
表3
Figure 97444DEST_PATH_IMAGE005
3.溶液配制
分别配制稀释剂5、稀释剂6、稀释剂7、稀释剂8。其中，稀释剂5为水。稀释剂6由喷替酸和水组成，其中喷替酸的质量含量为0.01%。稀释剂7由喷替酸和水组成，其中喷替酸的质量含量为0.25%。稀释剂8由喷替酸和水组成，其中喷替酸的质量含量为0.5%。
4.测定
实施例4
取氧奥曲肽样品，使用稀释剂6溶解并稀释制成理论浓度为10μg/ml的溶液进行测试。
实施例5
取氧奥曲肽样品，使用稀释剂7溶解并稀释制成理论浓度为10μg/ml的溶液进行测试。
实施例6
取氧奥曲肽样品，使用稀释剂8溶解并稀释制成理论浓度为10μg/ml的溶液进行测试。
对比例2
取氧奥曲肽样品，使用稀释剂5溶解并稀释制成理论浓度为10μg/ml的溶液进行测试。
5.结果
实施例4的分析色谱图如图3所示，对比例2的分析色谱图如图4所示。实施例4、实施例5、实施例6和对比例2的检测结果如表4所示。其中回收率为实际测得浓度与相应理论配制浓度的比值。
表4
Figure 760506DEST_PATH_IMAGE006
由图3、图4以及表4的结果可以看出，使用本发明的含有喷替酸的稀释剂测定氧奥曲肽的含量时，回收率为91%-97%，而当使用水作为稀释剂时，回收率仅为88%。所以，本发明的稀释剂发挥了掩蔽金属离子的作用，可以准确测定氧奥曲肽。

Claims (14)

1.一种检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
使用稀释剂对所述样品进行稀释，
将稀释的样品使用高效液相色谱法进行检测，
其中所述稀释剂包含喷替酸。
2.根据权利要求1所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，含DOTA环的化合物为(S,E)-2,2',2'-(10-(2-((6-氨基-1-((4'-((8-氨基-1-羟基-5,7-二硫酞菁-2-基)重氮基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-1-氧杂烷-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸或氧奥曲肽。
3.根据权利要求1所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述稀释剂包含喷替酸、水和/或乙腈。
4.根据权利要求3所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述稀释剂中喷替酸的质量百分比为0.01%-0.5%，和/或乙腈的体积百分比为45-55%。
5.根据权利要求1所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法使用的色谱柱为辛烷键合硅胶色谱柱或十八烷基键合硅胶色谱柱。
6.根据权利要求1所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，
其中流动相A：四丁基乙酸铵水溶液；
流动相B：乙腈。
7.根据权利要求6所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述水溶液使用磷酸调节pH为3.0±0.1。
8.根据权利要求6所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述水溶液中四丁基乙酸铵的浓度为1.2g/L。
9.根据权利要求6所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程为：
第一阶段，流动相A和流动相B的体积比为80：20；
第二阶段，流动相A和流动相B的体积比为30：70；
第三阶段，流动相A和流动相B的体积比为5：95；
第四阶段，流动相A和流动相B的体积比为80：20。
10.根据权利要求1所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法使用流动相A和流动相B进行等度洗脱，
其中流动相A：三氟乙酸水溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱程序为A:B=70:30-80:20。
11.根据权利要求10所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，三氟乙酸水溶液的质量含量为0.1±0.01%。
12.根据权利要求1所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.8-1.2ml/min。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为25-35℃，检测波长为220nm或218nm。
14.根据权利要求1所述的检测样品中含有的含DOTA环或NOTA环的化合物的方法，其特征在于，在使用稀释剂对所述样品进行稀释的步骤中，将所述样品稀释至样品浓度为1-100μg/ml。
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