WO2011125484A1 - ヘモグロビン類の分析方法 - Google Patents

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博暁 太平
岡　孝之
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Definitions

  • the present invention relates to a hemoglobin analysis method for separating hemoglobins by liquid chromatography.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • hemoglobin A1c is a type of glycohemoglobin, analysis of abnormal hemoglobin, and the like in diabetes diagnosis.
  • liquid chromatography is known in which hemoglobins in a measurement sample prepared by hemolyzing a blood sample are separated by a cation exchange method using a difference in positive charge state that differs for each hemoglobin component.
  • the number of diabetic patients has increased in recent years, the number of hemoglobin A1c measurements has been increasing, and high precision measurement and shortening of the measurement time are also required in HPLC measurement.
  • hemoglobins include oxyhemoglobin to which oxygen is bound, deoxyhemoglobin to which carbon dioxide is bound, and methemoglobin in which iron contained in heme is oxidized to form trivalent iron ions.
  • HPLC using cation exchange chromatography the elution time of oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, and methemoglobin varies depending on the retention capacity of the separation column, and the detected elution peak broadens or shows bimodality. As a result, the separation accuracy may be poor.
  • methemoglobin coexists with azide or cyanide
  • azide or cyanide binds to trivalent iron ions of methemoglobin and azidomethemoglobin or cyanmethemoglobin (hereinafter, these are stabilized).
  • This stabilized methemoglobin is also known to be stabilized, but the retention of the stabilized methemoglobin is slightly different from that of oxyhemoglobin and deoxyhemoglobin.
  • the detected elution peak may be broadened or bimodal.
  • hemoglobin S is the most common abnormal hemoglobin, and is a causative agent of sickle cell disease causing severe anemia, so that the demand for separation and detection is high.
  • hemoglobin A1c which is a marker of diabetes
  • degraded blood tends to generate broader or bimodal elution peaks than fresh blood. This is caused by an increase in methemoglobin caused by deterioration. For this reason, there is a concern about the influence on the measured value when the stored sample is analyzed by retesting or the like.
  • Patent Document 1 discloses albumin.
  • Patent Document 2 discloses a method of coexisting hemoglobins with casein, boric acid and the like
  • Patent Document 3 discloses a method of coexisting hemoglobins with iminocarboxylic acid and a salt thereof.
  • a degasser for removing gas in the eluent is incorporated in a general HPLC apparatus, but the degasser does not stabilize the gas removal capacity for a while after startup, and the elution time of hemoglobin varies. May adversely affect separation.
  • the elution time of hemoglobin varies, and the quantitative property tends to deteriorate. This leads to a long time until the first report in a diabetes test using hemoglobin A1c as a marker, which requires quickness. Therefore, a technique that enables stable measurement immediately after the start-up of the HPLC apparatus is required. ing.
  • the absorbance by a spectrophotometer is generally used for detection and quantification of various hemoglobins, oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, methemoglobin, azidomethemoglobin, and cyanmethemoglobin have different absorption spectra. If these are mixed, an accurate amount of hemoglobin may not be measured.
  • An object of the present invention is to provide a method for analyzing hemoglobin capable of separating hemoglobin with high accuracy in a short time by liquid chromatography.
  • the present invention is a method for analyzing hemoglobin using liquid chromatography, wherein the sample is previously treated with an oxidizing agent and a binder to trivalent heme iron.
  • the present invention is described in detail below.
  • the present inventors previously processed the specimen with an oxidizing agent and a binding agent to trivalent heme iron, thereby changing all the hemoglobins in the specimen to stabilized methemoglobin, and applying each hemoglobin to the column stationary phase.
  • the inventors have found that hemoglobins can be separated with high holding force and high accuracy in a short time, and the present invention has been completed.
  • the specimen is previously treated with an oxidizing agent and a binding agent to trivalent heme iron.
  • the elution time of hemoglobin can be shortened while improving the separation of hemoglobin.
  • the gas removal capability immediately after the startup of the degasser of the HPLC apparatus is not stable, the elution time of hemoglobins does not change, and the detected elution peak becomes broad or bimodal. And hemoglobins are separated with high accuracy.
  • pretreating the specimen with an oxidizing agent and a binding agent to trivalent heme iron means that the specimen is separated from the oxidizing agent and trivalent heme before the hemoglobin is separated on the separation column.
  • the hemoglobins are separated by blending an oxidizing agent and a binder to trivalent heme iron in any one of the combinations shown in Table 1 in the sample pretreatment liquid and / or eluent.
  • the analyte can be treated with an oxidizing agent and a binder to trivalent heme iron before being processed.
  • the oxidizing agent changes the hemoglobin of hemoglobin from divalent to trivalent to form methemoglobin.
  • the oxidizing agent is not particularly limited as long as it has the effect of changing the hemoglobin heme iron from divalent to trivalent, and examples thereof include nitrite, potassium ferricyanide, methylene blue, hydrogen peroxide, ascorbic acid, hydrogen sulfide and the like. It is done. Of these, nitrite is preferable, and sodium nitrite and potassium nitrite are more preferable.
  • hemoglobins will not be decomposed due to too strong oxidizing power, and the elution pattern will change greatly by binding to methemoglobin, and the wavelength and oxidation to detect hemoglobins.
  • the absorption spectrum of the agent does not interfere with the fluctuation of the baseline during the HPLC measurement, and the quantification of the hemoglobin is excellent.
  • the binding agent to trivalent heme iron turns methemoglobin into stabilized methemoglobin.
  • the binder to trivalent heme iron include azide and cyanide.
  • azides include sodium azide, diphenyl phosphate azide, 4-dodecylbenzenesulfonyl azide, 4-acetylaminobenzenesulfonyl azide, potassium azide, lithium azide, iron azide, hydrogen azide, and lead azide.
  • the cyanide include potassium cyanide, hydrogen cyanide, sodium cyanide, silver cyanide, mercury cyanide, copper cyanide, lead cyanide, iron cyanide, lithium cyanide, ammonium cyanide and the like.
  • sodium azide is preferable.
  • a known buffer solution containing a buffering agent such as an organic acid or a salt thereof, an amino acid, an inorganic acid or a salt thereof, or a Good's buffer can be used.
  • the organic acid include citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid and the like.
  • amino acids include glycine, taurine, arginine and the like.
  • inorganic acids include hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid, acetic acid and the like.
  • a surfactant, various polymers, a hydrophilic low molecular compound, and the like may be appropriately added to the buffer solution as necessary.
  • the concentration of the buffer in the sample pretreatment solution is not particularly limited, but a preferable lower limit is 5 mmol / L, and a preferable upper limit is 500 mmol / L. If the buffer concentration is less than 5 mmol / L, the buffering action may not be sufficiently obtained. If the buffer concentration exceeds 500 mmol / L, precipitation of the buffer may occur, which may cause clogging of the flow path of the HPLC apparatus.
  • a more preferable lower limit of the buffering agent concentration is 10 mmol / L, and a more preferable upper limit is 200 mmol / L.
  • the concentration of the oxidizing agent in the specimen pretreatment liquid is not particularly limited, but a preferred lower limit is 0.05 mmol / L and a preferred upper limit is 50 mmol / L. If the concentration of the oxidant in the sample pretreatment liquid is less than 0.05 mmol / L, the hemoglobins are not sufficiently met and detected by mixing oxyhemoglobin and deoxyhemoglobin in the measurement sample.
  • the elution peak may be broad or bimodal.
  • concentration of the oxidizing agent in the sample pretreatment liquid exceeds 50 mmol / L, methemoglobin is decomposed, and the elution peak may not be detected or the elution peak may be detected at a different elution time.
  • a more preferable lower limit of the concentration of the oxidizing agent in the specimen pretreatment liquid is 0.5 mmol / L, and a more preferable upper limit is 25 mmol / L.
  • the concentration of the binder to trivalent heme iron in the sample pretreatment liquid is not particularly limited, but the preferred lower limit is 0.05 mmol / L.
  • the preferred upper limit is 50 mmol / L.
  • concentration of the binding agent to trivalent heme iron in the sample pretreatment solution exceeds 50 mmol / L, methemoglobin is decomposed and no elution peak is detected or an elution peak is detected at a different elution time.
  • concentration of the binder to trivalent heme iron in the sample pretreatment liquid is 0.5 mmol / L, and a more preferable upper limit is 25 mmol / L.
  • the pH of the sample pretreatment liquid is not particularly limited, but a preferable lower limit is 4.0 and a preferable upper limit is 10.0. If the pH of the sample pretreatment solution is less than 4.0 or more than 10.0, the stability of hemoglobin may be reduced, and the elution peak may not be detected, or the elution peak may be detected at a different elution time. .
  • the more preferable lower limit of the pH of the sample pretreatment liquid is 6.0, and the more preferable upper limit is 8.5.
  • a known buffer containing a buffer such as an organic acid or a salt thereof, an amino acid, an inorganic acid or a salt thereof, and Good's buffer can be used.
  • the organic acid include citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid and the like.
  • amino acids include glycine, taurine, arginine and the like.
  • inorganic acids include hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid, acetic acid and the like.
  • surfactant, various polymers, a hydrophilic low molecular weight compound, etc. may be suitably added to the buffer solution as needed.
  • the buffer concentration of the eluent is not particularly limited, but a preferred lower limit is 5 mmol / L and a preferred upper limit is 500 mmol / L. If the buffer concentration is less than 5 mmol / L, the buffering action may not be sufficiently obtained. If the concentration of the buffer exceeds 500 mmol / L, it may cause precipitation of the buffer and cause clogging of the flow path of the HPLC apparatus, or it may cause the switching efficiency of the eluent to decrease and take time for equilibration. Sometimes. A more preferable lower limit of the buffering agent concentration is 10 mmol / L, and a more preferable upper limit is 200 mmol / L.
  • the concentration of the oxidizing agent in the eluent is not particularly limited, but the preferred lower limit is 0.05 mmol / L and the preferred upper limit is 50 mmol / L. If the concentration of the oxidant in the eluent is less than 0.05 mmol / L, hemoglobins are not sufficiently metomorphized, and oxyhemoglobin and deoxyhemoglobin are mixed in the measurement sample, so that the elution peak broadens. Or bimodality. When the concentration of the oxidizing agent in the eluent exceeds 50 mmol / L, the elution time becomes too early and the resolution may deteriorate.
  • the elution time can be adjusted by adjusting the concentration of the buffer in the eluent within a range where methemoglobin is not degraded.
  • a more preferable lower limit of the concentration of the oxidizing agent in the eluent is 0.5 mmol / L, and a more preferable upper limit is 25 mmol / L.
  • the concentration of the binder to trivalent heme iron in the eluent is not particularly limited, but the preferred lower limit is 0.05 mmol / L, and the preferred upper limit is 50 mmol / L.
  • concentration of the binding agent to trivalent heme iron in the eluent is less than 0.05 mmol / L, hemoglobins are not sufficiently met and the elution peak is caused by the mixture of oxyhemoglobin and deoxyhemoglobin. May become broad or bimodal.
  • the concentration of the binder to the trivalent heme iron in the eluent exceeds 50 mmol / L, the elution time may be too fast and the resolution may deteriorate.
  • the elution time can be adjusted by adjusting the concentration of the buffer in the eluent within a range where methemoglobin is not degraded.
  • a more preferable lower limit of the concentration of the binder to trivalent heme iron in the eluent is 0.5 mmol / L, and a more preferable upper limit is 25 mmol / L.
  • the oxidizing agent and trivalent are added to the eluent sent at least at the beginning of the measurement by HPLC.
  • a binder to heme iron is added.
  • the oxidizing agent and the binding agent to trivalent heme iron are preferably added to the eluent other than the eluent sent at the beginning of the measurement by HPLC, and should be added to all eluents used for the measurement. Is more preferable.
  • the eluent may contain a known acid or base as a pH adjuster.
  • the acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid and the like
  • the base include sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, magnesium hydroxide, barium hydroxide, calcium hydroxide and the like. Can be mentioned.
  • the eluent may contain a water-soluble organic solvent such as methanol, ethanol, acetonitrile, and acetone.
  • concentration of the organic solvent is preferably such that no salt or the like is precipitated, and the preferable upper limit is 80% (v / v).
  • the pH of the eluent is not particularly limited, but a preferred lower limit is 4.0 and a preferred upper limit is 10.0. If the pH of the eluent is less than 4.0, the reading of the detected elution peak may become large, or the elution peak may become broad or bimodal. When the pH of the eluent exceeds 10.0, the retention of the column stationary phase and hemoglobin is weakened, and the elution time of hemoglobin becomes extremely fast, and the tailing of the detected elution peak becomes large. The elution peak may be broad or bimodal.
  • the stability of hemoglobins in the measurement sample does not decrease, the hemoglobin elution peaks are not detected, or the elution peaks are at different elution times. Will not be detected.
  • a more preferred lower limit of the pH of the eluent is 6.0, and a more preferred upper limit is 8.5.
  • liquid chromatography in the method for analyzing hemoglobin of the present invention, it is preferable to use ion exchange liquid chromatography.
  • ion exchange liquid chromatography a known method can be used. For example, when an eluent is sent to a separation column using a pump, the eluent is passed through a degasser, and then a measurement sample is injected and sent to the separation column, and hemoglobins are separated and separated by the separation column. And a method of detecting the separated components in the eluate with a detector.
  • the separation column is a column body filled with a stationary phase.
  • the stationary phase include filler particles and porous bodies. Among these, filler particles are preferable.
  • the filler particles include inorganic particles and organic particles. Examples of the inorganic particles include particles composed of silica, zirconia, and the like. Examples of the organic particles include natural polymer particles such as cellulose, polyamino acid, and chitosan, and synthetic polymer particles such as polystyrene and polyacrylate.
  • the stationary phase it is preferable to use a stationary phase having a cation exchange group.
  • the cation exchange group include a carboxyl group, a phosphate group, and a sulfonate group.
  • the measurement conditions in the hemoglobin analysis method of the present invention can be appropriately selected depending on the type of measurement sample, column, etc. used.
  • the preferred lower limit of the eluent flow rate is 0.05 mL / min, and the preferred upper limit is 5 mL / min.
  • a preferable lower limit is 0.2 mL / min, and a more preferable upper limit is 3 mL / min.
  • the detection wavelength of hemoglobins is preferably 415 nm, but is not particularly limited thereto.
  • As the measurement sample a sample obtained by diluting a hemolyzed blood sample with a solution containing a substance having hemolytic activity such as a surfactant is usually used.
  • the injection amount of the measurement sample varies depending on the dilution rate of the blood sample, but is preferably about 0.1 to 100 ⁇ L.
  • the method for analyzing hemoglobin of the present invention exhibits excellent separation ability, enables analysis to be performed in a short time, and facilitates separation of hemoglobin that has been difficult to separate. That is, according to the present invention, hemoglobins can be separated and analyzed with high accuracy in a short time by liquid chromatography.
  • Example 2 it is the chromatogram obtained by measuring the measurement sample containing the blood containing (a) glycohemoglobin control level 2 and (b) hemoglobin S.
  • Example 3 it is the chromatogram obtained by measuring (a) the measurement sample containing the glycohemoglobin control level 2, and (b) the measurement sample containing the blood containing hemoglobin S.
  • Example 4 it is the chromatogram obtained by measuring (a) the measurement sample containing the glycohemoglobin control level 2, and (b) the measurement sample containing the blood containing hemoglobin S.
  • Example 5 it is the chromatogram obtained by measuring (a) the measurement sample containing the glycohemoglobin control level 2 and (b) the measurement sample containing the blood containing hemoglobin S.
  • Example 6 it is the chromatogram obtained by measuring (a) the measurement sample containing the glycohemoglobin control level 2, and (b) the measurement sample containing the blood containing hemoglobin S.
  • Example 7 it is the chromatogram obtained by measuring (a) the measurement sample containing the glycohemoglobin control level 2 and (b) the measurement sample containing the blood containing hemoglobin S.
  • Example 8 it is a chromatogram obtained by measuring (a) a measurement sample containing glycated hemoglobin control level 2 and (b) a measurement sample containing blood containing hemoglobin S.
  • Comparative Example 2 it is a chromatogram obtained by measuring (a) a measurement sample containing glycohemoglobin control level 2 and (b) a measurement sample containing blood containing hemoglobin S.
  • Comparative Example 3 it is a chromatogram obtained by measuring (a) a measurement sample containing glycohemoglobin control level 2 and (b) a measurement sample containing blood containing hemoglobin S.
  • Example 4 (a) a chromatogram obtained by measuring a measurement sample containing glycated hemoglobin control level 2 and (b) a measurement sample containing blood containing hemoglobin S.
  • Example 9 it is the chromatogram obtained by measuring (a) the measurement sample containing the glycohemoglobin control level 2, and (b) the measurement sample containing the blood containing hemoglobin S.
  • Example 10 it is the chromatogram obtained by measuring (a) the measurement sample containing the glycohemoglobin control level 2, and (b) the measurement sample containing the blood containing hemoglobin S.
  • Example 1 A blood sample containing hemoglobin S diluted 100-fold with a sample pretreatment solution (phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) was used as a measurement sample.
  • a sample pretreatment solution phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100
  • a separation column a column in which a cation exchange resin filler having a sulfonic acid group introduced on the particle surface was packed in the column body was used.
  • SIL-20AC manufactured by Shimadzu Corporation
  • LC-20AD manufactured by Shimadzu Corporation
  • DGU-20A5 manufactured by Shimadzu Corporation
  • CTO-20AC column oven SPD-M20A (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • the flow rate of the eluent was 1.7 mL / min
  • the detection wavelength was 415 nm
  • the measurement sample injection volume was 10 ⁇ L.
  • eluent 1 As an eluent, eluent 1 (60 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L sodium nitrite, 1 mmol / L sodium azide-containing 40 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) is used for up to 0.5 minutes.
  • Example 1 The measurement sample was the same as in Example 1. Eluent 1 was used as eluent 4 (60 mmol / L sodium perchlorate, 40 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 1 mmol / L sodium azide), and eluent 2 was used as eluent 5 (10 mmol / L excess). The measurement sample was measured in the same manner as in Example 1 except that it was changed to sodium chlorate and 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mmol / L sodium azide.
  • Example 1 The relationship between the number of measurements in Example 1 and Comparative Example 1 and the elution time of hemoglobin S is shown in FIG. 1 that the elution time of hemoglobin S is delayed in the comparative example 1 as the number of measurements is increased. On the other hand, in Example 1, the hemoglobin S elution time was almost constant regardless of the number of measurements.
  • Example 2 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100)) A 100-fold diluted sample was used as a measurement sample. A blood sample containing hemoglobin S diluted 100-fold with a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) was used as a measurement sample. Using. As the separation column, the same separation column as in Example 1 was used.
  • the same HPLC apparatus as in Example 1 was used, the flow rate was 1.7 mL / min, the detection wavelength was 415 nm, and the measurement sample injection volume was 10 ⁇ L.
  • the eluent is eluent 6 (30 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L sodium nitrite, 1 mmol / L sodium azide-containing 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4)) as the first eluent.
  • eluent 7 As the second eluent, eluent 7 (0.8 mmol% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L sodium nitrite, 1 mmol / L sodium azide 40 mmol / L phosphate buffer ( The sample to be measured was eluted with a two-liquid linear gradient using pH 8.0). The gradient conditions of the first eluent and the second eluent are shown in FIG. FIG. 2 shows the ratio (% by weight) of the second eluent to the total amount of the first eluent and the second eluent. The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 3 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex Corporation) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and sample pretreatment solution (containing 0.1 wt% Triton X-100, 1 mmol / L sodium nitrite, 1 mmol / L sodium azide) 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) diluted 100 times was used as a measurement sample.
  • sample pretreatment solution containing 0.1 wt% Triton X-100, 1 mmol / L sodium nitrite, 1 mmol / L sodium azide-containing 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.
  • the second eluent was used as eluent 3 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L sodium azide 40 mmol / L phosphate buffer ( The measurement sample was measured in the same manner as in Example 2, except that the pH was changed to 8.0). The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 4 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100)) A 100-fold diluted sample was used as a measurement sample. A blood sample containing hemoglobin S diluted 100-fold with a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) was used as a measurement sample. Using.
  • the first eluent was changed to eluent 8 (30 mmol / L sodium perchlorate, 10 mmol / L sodium nitrite, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 1 mmol / L sodium azide),
  • the second eluent was eluent 9 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 10 mmol / L sodium nitrite, 1 mmol / L sodium azide 40 mmol / L phosphate buffer.
  • the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2 except that the pH was changed to (pH 8.0). The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 5 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100)) A 100-fold diluted sample was used as a measurement sample. A blood sample containing hemoglobin S diluted 100-fold with a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) was used as a measurement sample. Using.
  • the first eluent was changed to eluent 10 (30 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L sodium nitrite, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 10 mmol / L sodium azide),
  • the second eluent was used as eluent 11 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L sodium nitrite, 10 mmol / L sodium azide 40 mmol / L phosphate buffer
  • the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2 except that the pH was changed to (pH 8.0). The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 6 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100)) A 100-fold diluted sample was used as a measurement sample. A blood sample containing hemoglobin S diluted 100-fold with a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) was used as a measurement sample. Using.
  • the first eluent was changed to eluent 12 (30 mmol / L sodium perchlorate, 10 mmol / L sodium nitrite, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 10 mmol / L sodium azide),
  • the second eluent was used as eluent 13 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 10 mmol / L sodium nitrite, 10 mmol / L sodium azide 40 mmol / L phosphate buffer
  • the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2 except that the pH was changed to (pH 8.0). The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 7 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex Corporation) is dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (0.1 wt% Triton X-100, 1 mmol / L potassium ferricyanide, 1 mmol / L sodium azide is contained. What was diluted 100 times with 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) was used as a measurement sample.
  • a sample pretreatment solution 0.1 wt% Triton X-100, 1 mmol / L potassium ferricyanide, 1 mmol / L sodium azide is contained. What was diluted 100 times with 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) was used as a measurement sample.
  • a blood sample containing hemoglobin S was prepared as a sample pretreatment solution (0.1 mmol% Triton X-100, 1 mmol / L potassium ferricyanide, 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mmol / L sodium azide). The sample diluted 100 times in step)) was used as a measurement sample.
  • the first eluent was changed to eluent 14 (30 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L potassium ferricyanide, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 1 mmol / L sodium azide)
  • Two eluents were added to eluent 15 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L potassium ferricyanide, 1 mmol / L sodium azide 40 mmol / L phosphate buffer (pH 8 0.0)), the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2. The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 8 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (0.1 wt% Triton X-100, 10 mmol / L phosphate buffer containing 1 mmol / L sodium azide) A solution (pH 7.0) diluted 100 times was used as a measurement sample. In addition, a blood sample containing hemoglobin S is increased 100 times with a sample pretreatment solution (0.1 wt% Triton X-100, 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mmol / L sodium azide). The diluted sample was used as a measurement sample.
  • a sample pretreatment solution 0.1 wt% Triton X-100, 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mmol / L sodium azide.
  • the first eluent is changed to eluent 16 (30 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L sodium ferricyanide, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 1 mmol / L sodium azide).
  • the second eluent was used as eluent 3 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 40 mmol / L phosphate buffer containing 1 mmol / L sodium azide used in Example 1).
  • the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2 except that the pH was changed to (pH 8.0). The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the first eluent was changed to eluent 17 (30 mmol / L sodium perchlorate, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 1 mmol / L sodium azide) and the second eluent was run.
  • Eluent 3 used in Example 1 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 40 mmol / L phosphate buffer (pH 8.0) containing 1 mmol / L sodium azide)
  • the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2 except that. The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the first eluent was changed to eluent 18 (30 mmol / L sodium perchlorate, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 1 mmol / L sodium nitrite), and the second eluent was eluted. Except for changing to liquid 19 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 40 mmol / L phosphate buffer (pH 8.0) containing 1 mmol / L sodium nitrite). The measurement sample was measured in the same manner as in Example 2. The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the first eluent was changed to eluent 20 (30 mmol / L sodium perchlorate, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 1 mmol / L potassium ferricyanide), and the second eluent was changed to eluent.
  • Sample to be measured in the same manner as in Example 2 except that it was changed to 21 (0.8 wt% Triton X-100, 40 mmol / L phosphate buffer (pH 8.0) containing 300 mmol / L sodium perchlorate) was measured.
  • the obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 9 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100)) A 100-fold diluted sample was used as a measurement sample. A blood sample containing hemoglobin S diluted 100-fold with a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) was used as a measurement sample. Using.
  • the first eluent was changed to eluent 22 (30 mmol / L sodium perchlorate, 25 mmol / L sodium nitrite, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 25 mmol / L sodium azide),
  • the second eluent was used as eluent 23 (40 mmol / L phosphate buffer containing 0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 25 mmol / L sodium nitrite, 25 mmol / L sodium azide).
  • the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2 except that the pH was changed to (pH 8.0). The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Example 10 Glycohemoglobin control level 2 (manufactured by Sysmex) was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection, and then a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100)) A 100-fold diluted sample was used as a measurement sample. A blood sample containing hemoglobin S diluted 100-fold with a sample pretreatment solution (10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) was used as a measurement sample. Using.
  • the first eluent was changed to eluent 24 (30 mmol / L sodium perchlorate, 50 mmol / L sodium nitrite, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 5.4) containing 50 mmol / L sodium azide),
  • the second eluent was used as eluent 25 (40 mmol / L phosphate buffer containing 0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 50 mmol / L sodium nitrite, 50 mmol / L sodium azide).
  • the measurement sample was measured in the same manner as in Example 2 except that the pH was changed to (pH 8.0). The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • Tables 2 and 3 show the compositions of the sample pretreatment liquid and the eluent used in the measurements of Examples 2 to 10 and Comparative Examples 2 to 4, respectively.
  • Table 4 shows the separation state and peak pattern of hemoglobins in the obtained chromatogram.
  • peak (A) indicates hemoglobin A0
  • peak (B) indicates hemoglobin A2
  • peak (C) indicates hemoglobin S.
  • 3 to 7 it was confirmed that the peak (A) and the peak (C) were separated as a sharp single peak.
  • FIG. 8 Example 7
  • the peak (A) and the peak (C) in FIG. 9 Example 8) were detected as peaks having a slight trimodality or bimodality, but there was no problem.

Abstract

本発明は、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離できるヘモグロビン類の分析方法を提供することを目的とする。 本発明は、液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の分析方法であって、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理するヘモグロビン類の分析方法である。　

Description

ヘモグロビン類の分析方法
本発明は、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を分離するヘモグロビン類の分析方法に関する。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるヘモグロビン類の分析は現在広く行われており、糖尿病診断ではグリコヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃの定量や異常ヘモグロビンの分析等に用いられている。例えば、血液検体を溶血希釈して調製した測定試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィーが知られている。近年の糖尿病患者の増加に伴い、ヘモグロビンＡ１ｃの測定件数も増加傾向にあり、ＨＰＬＣでの測定においても高精度測定と測定時間の短縮が求められている。
生体内において、ヘモグロビン類には、酸素が結合したオキシヘモグロビン、二酸化炭素が結合したデオキシヘモグロビン、ヘムに含まれている鉄が酸化されて三価の鉄イオンとなったメトヘモグロビンが存在する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣでは、分離カラムにおける保持力の違いにより、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビンの溶出時間に違いが生じ、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりして分離精度の悪いものとなることがある。また、メトヘモグロビンとアジ化物やシアン化物とが共存している場合、アジ化物やシアン化物がメトヘモグロビンの三価の鉄イオンに結合し、アジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビン（以下、これらを安定化メトヘモグロビンともいう）となって安定化することが知られているが、この安定化メトヘモグロビンも、分離カラムにおける保持力が、オキシヘモグロビンやデオキシヘモグロビンとはわずかに異なるため、安定化メトヘモグロビンの存在により、検出される溶出ピークがブロード化したり、二峰性を示したりすることがある。
ＨＰＬＣを用いたヘモグロビン類の分析は、糖尿病診断の他に主に貧血を引き起こす異常ヘモグロビン症やサラセミアといった診断にも使用されている。なかでも、ヘモグロビンＳは最も多くみられる異常ヘモグロビンであり、重篤な貧血症状を引き起こす鎌状赤血球症の原因物質であるため、分離、検知の需要は高い。また、糖尿病のマーカーであるヘモグロビンＡ１ｃを測定する際には、ヘモグロビンＳをはじめとした異常ヘモグロビンをシャープな溶出ピークとして分離することが望ましい。ヘモグロビン類の溶出ピークがブロード化したり二峰性となっていたりすると異常ヘモグロビンと正常ヘモグロビンとの分離が困難となるとともに、測定値への悪影響が懸念される。
また、新鮮血よりも劣化血の方がブロードや二峰性の溶出ピークを生じやすい傾向がある。これは劣化により生じるメトヘモグロビンが増加することが原因である。そのため、再検査等で保存検体の分析を行う場合に測定値への影響が懸念されている。
ヘモグロビン類の劣化や変性を防止するための方法としては、公知の抗菌剤を添加する方法や糖類を添加する方法が知られているが、この他にも、例えば、特許文献１にはアルブミンをヘモグロビン類と共存させる方法、特許文献２にはヘモグロビン類とカゼイン、ホウ酸等を共存させる方法、特許文献３にはヘモグロビン類とイミノカルボン酸及びその塩を共存させる方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１～３に開示されている方法を用いても、血液検体にオキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン等の各種ヘモグロビン類が混在する状況においては、ＨＰＬＣで測定した場合に溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。
また、一般的なＨＰＬＣ装置には溶離液中の気体を除去するためのデガッサーが組み込まれているが、デガッサーは立ち上げ後しばらくは気体除去能力が安定せず、ヘモグロビンの溶出時間が変動したり、分離に悪影響を及ぼしたりすることがある。特に、ＨＰＬＣ装置の立ち上げ直後や溶離液温度が不安定である場合にヘモグロビン類の溶出時間が変動したり、定量性が悪化し易くなったりする。これは迅速性が要求されるヘモグロビンＡ１ｃをマーカーとする糖尿病検査にて、ファーストレポートまでの時間が長くかかることにつながるため、ＨＰＬＣ装置の立ち上げ直後から安定した測定が可能な技術が必要とされている。
なお、各種ヘモグロビン類の検出、定量には一般的に分光光度計による吸光度が用いられるが、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、アジドメトヘモグロビン、シアンメトヘモグロビンはそれぞれの吸光スペクトルが異なっているため、これらが混在していると正確なヘモグロビン量を測定することができないことがある。
特開２００３－１９４８２５号公報 特開平１１－１６６９３２号公報 特開２００９－９７９５６号公報
本発明は、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離できるヘモグロビン類の分析方法を提供することを目的とする。
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の分析方法であって、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理するヘモグロビン類の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。
本発明者らは、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理することで、検体中のヘモグロビン類を全て安定化メトヘモグロビンに変化させ、各ヘモグロビンのカラム固定相への保持力を均一にし、短時間で高精度にヘモグロビン類を分離できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明のヘモグロビン類の分析方法においては、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理する。
酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で検体を処理することにより、ヘモグロビン類の分離能を向上させつつヘモグロビン類の溶出時間を短縮できる。更に、ＨＰＬＣ装置のデガッサーの立ち上げ直後の気体除去能力が安定しない場合においても、ヘモグロビン類の溶出時間の変動が発生しなくなるとともに、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがなく、ヘモグロビン類が高精度に分離される。
なお、本発明において、「予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理する」とは、ヘモグロビン類が分離カラムで分離される前に、検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理することを意味し、液体クロマトグラフィーでの測定開始前に処理することに限定されない。具体的には例えば、検体前処理液及び／又は溶離液に、表１に記載した組み合わせのいずれかで酸化剤と三価のヘム鉄への結合剤とを配合することにより、ヘモグロビン類が分離される前に検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理できる。表１中、「○」は配合することを意味し、「－」は配合しないことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
本発明のヘモグロビン類の分析方法において、酸化剤は、ヘモグロビン類のヘム鉄を二価から三価に変化させ、メトヘモグロビンを形成する。
酸化剤としては、ヘモグロビン類のヘム鉄を二価から三価に変化させる効果があれば特に限定されず、例えば、亜硝酸塩、フェリシアン化カリウム、メチレンブルー、過酸化水素、アスコルビン酸、硫化水素等が挙げられる。なかでも、亜硝酸塩が好適であり、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウムがより好適である。これらの酸化剤を用いることで、酸化力が強すぎてヘモグロビン類が分解したりすることがなく、また、メトヘモグロビンと結合して溶出パターンが大きく変化したり、ヘモグロビン類を検出する波長と酸化剤の吸光スペクトルが干渉してＨＰＬＣ測定中にベースラインの変動が生じたりすることがなく、ヘモグロビン類の定量性により優れたものとなる。
本発明のヘモグロビン類の分析方法において、三価のヘム鉄への結合剤は、メトヘモグロビンを安定化メトヘモグロビンにする。
三価のヘム鉄への結合剤としては、例えば、アジ化物、シアン化物等が挙げられる。三価のヘム鉄への結合剤としてアジ化物又はシアン化物を用いることにより、メトヘモグロビンの構造を大きく変えてしまうことがなく、ヘモグロビン類の溶出挙動を大きく変化させてしまうこともない。従って、ヘモグロビン類の定量性により優れたものとなる。
アジ化物としては、例えば、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４－ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４－アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。
シアン化物としては、例えば、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。
これらの三価のヘム鉄への結合剤のなかでも、アジ化ナトリウムが好適である。
検体前処理液としては、例えば、有機酸又はその塩類、アミノ酸類、無機酸又はその塩類、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有する公知の緩衝液を用いることができる。
有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、緩衝液には、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等が適宜添加されていてもよい。
検体前処理液の緩衝剤濃度は特に限定されないが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。緩衝剤濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、緩衝作用が充分に得られないことがある。緩衝剤濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝剤の析出が起こり、ＨＰＬＣ装置の流路を詰まらせる原因となることがある。緩衝剤濃度のより好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
検体前処理液が酸化剤を含有する場合、検体前処理液中における酸化剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。検体前処理液中における酸化剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビン類のメト化が充分に行われず、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビンが測定試料中に混在することで、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。検体前処理液中における酸化剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、メトヘモグロビンが分解されてしまい、溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがある。検体前処理液中における酸化剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。
検体前処理液が三価のヘム鉄への結合剤を含有する場合、検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、メトヘモグロビンの三価のヘム鉄への結合剤の結合が充分に行われず、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、メトヘモグロビンが分解されてしまい、溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがある。検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。
検体前処理液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は４．０、好ましい上限は１０．０である。検体前処理液のｐＨが４．０未満もしくは１０．０を超えると、ヘモグロビン類の安定性が低下し、溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがある。検体前処理液のｐＨのより好ましい下限は６．０、より好ましい上限は８．５である。
溶離液としては、例えば、有機酸又はその塩類、アミノ酸類、無機酸又はその塩類、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有する公知の緩衝液を用いることができる。
有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、緩衝液は、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等が適宜添加されていてもよい。
溶離液の緩衝剤濃度は特に限定されないが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。緩衝剤濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、緩衝作用が充分に得られないことがある。緩衝剤濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝剤の析出が起こりＨＰＬＣ装置の流路を詰まらせる原因となったり、溶離液の切り替え効率が低下して平衡化に時間がかかる原因となったりすることがある。緩衝剤濃度のより好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
溶離液が酸化剤を含有する場合、溶離液中における酸化剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。溶離液中における酸化剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビン類のメト化が充分に行われず、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビンが測定試料中に混在することで、溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。溶離液中における酸化剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、溶出時間が早くなりすぎて分離能が悪化することがある。なお、溶出時間は、メトヘモグロビンが分解しない範囲内で溶離液中の緩衝剤濃度等を調整することで調節は可能である。溶離液中における酸化剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。
溶離液が三価のヘム鉄への結合剤を含有する場合、溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビン類のメト化が充分に行われず、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビンが混在することで、溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、溶出時間が早くなりすぎて分離能が悪化することがある。なお、溶出時間は、メトヘモグロビンが分解しない範囲内で溶離液中の緩衝剤濃度等を調整することで調節は可能である。溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。
本発明のヘモグロビン類の分析方法において、溶離液にのみ酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤を配合する場合は、少なくともＨＰＬＣによる測定の最初に送液する溶離液に酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤を配合する。また、酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤は、ＨＰＬＣによる測定の最初に送液する溶離液以外の溶離液にも配合することが好ましく、測定に用いる全ての溶離液に配合することがより好ましい。
溶離液は、ｐＨ調整剤として、公知の酸、塩基を含有してもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
溶離液は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を含有していてもよい。有機溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。
溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は４．０、好ましい上限は１０．０である。溶離液のｐＨが４．０未満であると、検出される溶出ピークのリーディングが大きくなったり、溶出ピークがブロードになったり二峰性を示したりすることがある。溶離液のｐＨが１０．０を超えると、カラム固定相とヘモグロビン類との保持が弱まりヘモグロビン類の溶出時間が極端に早くなることに加え、検出される溶出ピークのテーリングが大きくなったり、また、溶出ピークがブロードになったり、二峰性を示したりすることがある。また、ｐＨを４．０以上１０．０以下とすることにより、測定試料中のヘモグロビン類の安定性が低下することがなく、ヘモグロビン類の溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがない。溶離液のｐＨのより好ましい下限は６．０、より好ましい上限は８．５である。
本発明のヘモグロビン類の分析方法における液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換液体クロマトグラフィーを用いることが好適である。
イオン交換液体クロマトグラフィーとしては、公知の方法を用いることができる。例えば、ポンプを用いて溶離液を分離カラムに送液する際に、溶離液を、デガッサーを通した後に測定試料を注入して分離カラムに送り、分離カラムでヘモグロビン類を分離させて、溶出してきた溶出液中の分離成分を検出器により検出する方法が挙げられる。
分離カラムは、カラム本体に固定相が充填されたものである。固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられる。なかでも、充填剤粒子が好ましい。
充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。
固定相としては、陽イオン交換基を有する固定相を用いることが好ましい。
陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
本発明のヘモグロビン類の分析方法における測定条件は、使用する測定試料、カラム等の種類によって適宜選択できるが、溶離液の流速の好ましい下限は０．０５ｍＬ／分、好ましい上限は５ｍＬ／分、より好ましい下限は０．２ｍＬ／分、より好ましい上限は３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出波長は４１５ｎｍが好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。
測定試料は、通常、界面活性剤等の溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された血液検体を希釈したものを用いる。測定試料の注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１～１００μＬ程度である。
本発明のヘモグロビン類の分析方法は、優れた分離能を示すとともに、分析を短時間で行うことができ、かつ、従来分離が困難であったヘモグロビン類も分離し易くなる。
即ち、本発明によれば、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離し、分析できる。
実施例１及び比較例１における測定回数とヘモグロビンＳの溶出時間との関係を示した図である。 実施例２における第１溶離液と第２溶離液のグラジエント条件を示した図である。 実施例２において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例３において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例４において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例５において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例６において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例７において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例８において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 比較例２において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 比較例３において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 比較例４において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例９において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。 実施例１０において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
（実施例１）
ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
分離カラムとして、粒子表面にスルホン酸基を導入した陽イオン交換樹脂充填剤をカラム本体に充填したカラムを用いた。
ＨＰＬＣ装置には、オートサンプラーとしてＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ－２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）、検出器としてＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）を用い、溶離液の流速を１．７ｍＬ／分、検出波長を４１５ｎｍ、測定試料注入量を１０μＬとした。
溶離液としては、０．５分までは溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））にて溶出し、０．５分を超え１．０分までは溶離液２（１０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液３（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定試料の測定を行った。
なお、ＨＰＬＣ装置の立ち上げ直後から連続して１５回測定を行った。
（比較例１）
測定試料は、実施例１と同様のものを用いた。
溶離液１を溶離液４（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））、溶離液２を溶離液５（１０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に変更したこと以外は、実施例１と同様にして測定試料の測定を行った。
実施例１及び比較例１における測定回数とヘモグロビンＳの溶出時間との関係を図１に示した。図１より、ヘモグロビンＳの溶出時間は、比較例１では測定回数の増加にともなって遅くなっていることが分かる。一方、実施例１では、ヘモグロビンＳの溶出時間は測定回数に関係なくほぼ一定であった。
（実施例２）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
分離カラムは実施例１と同様の分離カラムを用いた。
実施例１と同様のＨＰＬＣ装置を用い、流速を１．７ｍＬ／分、検出波長を４１５ｎｍ、測定試料注入量を１０μＬとした。
溶離液は、第１溶離液として溶離液６（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））と第２溶離液として溶離液７（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））とを用い、２液リニアグラジエントにて溶出して測定試料の測定を行った。第１溶離液と第２溶離液のグラジエント条件を図２に示した。図２は、第１溶離液と第２溶離液との合計量に対する第２溶離液の割合（重量％）を示している。また、得られたクロマトグラムを図３に示した。
（実施例３）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第２溶離液を、実施例１で用いた溶離液３（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図４に示した。
（実施例４）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液８（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液９（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図５に示した。
（実施例５）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１０（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１１（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図６に示した。
（実施例６）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１２（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１３（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図７に示した。
（実施例７）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１４（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１５（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図８に示した。
（実施例８）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１６（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、実施例１で用いた溶離液３（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図９に示した。
（比較例２）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１７（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、実施例１で用いた溶離液３（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１０に示した。
（比較例３）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１８（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１９（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１１に示した。
（比較例４）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液２０（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液２１（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１２に示した。
（実施例９）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液２２（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液２３（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１３に示した。
（実施例１０）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ－１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液２４（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液２５（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１４に示した。
実施例２～１０、及び、比較例２～４の測定で用いた検体前処理液と溶離液の組成を表２、３に示した。また、得られたクロマトグラムのヘモグロビン類の分離状況とピークパターンを表４に示した。
図３～１４において、ピーク（Ａ）はヘモグロビンＡ０、ピーク（Ｂ）はヘモグロビンＡ２、ピーク（Ｃ）はヘモグロビンＳを示している。
図３～７（実施例２～６）において、ピーク（Ａ）、ピーク（Ｃ）はシャープな単一ピークとして分離していることが確認された。図８（実施例７）はクロマトグラムに少しドリフトが確認されたために定量性が若干低下したが、ピーク同定は可能なレベルであった。一方、図９（実施例８）のピーク（Ａ）、ピーク（Ｃ）はわずかに３峰性又は２峰性を示すピークとして検出されたが、問題の無い程度であった。
また、図３～９（実施例２～８）ではピーク（Ｂ）はピーク（Ａ）から分離していることが確認されたが、図１０（比較例２）ではグリコヘモグロビンコントロール２を含有する測定試料ではピーク（Ｂ）はピーク（Ａ）から全く分離できておらず、ヘモグロビンＳを含有する測定試料ではピーク（Ａ）の後ろにピーク（Ｂ）がわずかにショルダーとして確認できる程度であった。同様の現象は他のヘモグロビン種に対しても起こりえるものと考えられ、本発明を用いることで含有量の多いヘモグロビン種に隣接したピークを高精度に分離させ易くなる。
図１１、１２（比較例３、４）では亜硝酸ナトリウム又はフェリシアン化カリウムによりメト化されたヘモグロビンがピークとして検出されているが、ヘモグロビン類の分解物とみられるピークが検出された。
図１３、１４（実施例９、１０）は亜硝酸ナトリウムとアジ化ナトリウムが共存していることから、単一ピークを形成しているものの、添加量が多過ぎるために溶出時間が早くなりすぎていた。しかしながら、単一ピークが形成されているので、緩衝剤濃度等の他の条件を調整することで、定量性を確保することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
本発明によれば、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離できるヘモグロビン類の分析方法が提供される。
　
　

Claims (8)

  1. 液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の分析方法であって、
    予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理することを特徴とするヘモグロビン類の分析方法。
  2. 酸化剤は、ヘモグロビンをメト化させる物質であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の分析方法。
  3. 酸化剤は、亜硝酸塩であることを特徴とする請求項２記載のヘモグロビン類の分析方法。
  4. 酸化剤は、亜硝酸ナトリウムであることを特徴とする請求項３記載のヘモグロビン類の分析方法。
  5. 三価のヘム鉄への結合剤は、メトヘモグロビン中の三価の鉄に結合する物質であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の分析方法。
  6. 三価のヘム鉄への結合剤は、アジ化物であることを特徴とする請求項５記載のヘモグロビン類の分析方法。
  7. 三価のヘム鉄への結合剤は、アジ化ナトリウムであることを特徴とする請求項６記載のヘモグロビン類の分析方法。
  8. 液体クロマトグラフィーとして陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６又は７記載のヘモグロビン類の分析方法。
    　
    　
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