KR20130054951A - 헤모글로빈류의 분석 방법 - Google Patents

헤모글로빈류의 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 액체 크로마토그래피에 의해, 헤모글로빈류를 단시간에 고정밀도로 분리할 수 있는 헤모글로빈류의 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 액체 크로마토그래피를 사용한 헤모글로빈류의 분석 방법으로서, 미리 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리하는 헤모글로빈류의 분석 방법이다.

Description

헤모글로빈류의 분석 방법 {METHOD OF ANALYZING HEMOGLOBINS}
본 발명은, 액체 크로마토그래피에 의해, 헤모글로빈류를 분리하는 헤모글로빈류의 분석 방법에 관한 것이다.
고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의한 헤모글로빈류의 분석은 현재 널리 실시되고 있고, 당뇨병 진단에서는 글리코헤모글로빈의 일종인 헤모글로빈 A1c 의 정량이나 이상 헤모글로빈의 분석 등에 사용되고 있다. 예를 들어, 혈액 검체를 용혈 희석하여 조제한 측정 시료 중의 헤모글로빈류를, 양이온 교환법에 의해, 헤모글로빈 성분마다 상이한 플러스 하전 상태의 차이를 이용하여 분리하는 액체 크로마토그래피가 알려져 있다. 최근의 당뇨병 환자의 증가에 수반하여, 헤모글로빈 A1c 의 측정 건수도 증가 경향이 있어, HPLC 에 의한 측정에 있어서도 고정밀도 측정과 측정 시간의 단축이 요구되고 있다.
생체 내에 있어서, 헤모글로빈류에는, 산소가 결합한 옥시헤모글로빈, 이산화탄소가 결합한 디옥시헤모글로빈, 헴에 함유되어 있는 철이 산화되어 3 가의 철 이온이 된 메트헤모글로빈이 존재한다. 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 HPLC 에서는, 분리 칼럼에 있어서의 유지력의 차이로 인해 옥시헤모글로빈, 디옥시헤모글로빈, 메트헤모글로빈의 용출 시간에 차이가 생겨, 검출되는 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성(二峰性)을 나타내거나 하여 분리 정밀도가 불량한 것이 되는 경우가 있다. 또한, 메트헤모글로빈과 아지화물이나 시안화물이 공존하고 있는 경우, 아지화물이나 시안화물이 메트헤모글로빈의 3 가의 철 이온에 결합하여, 아지드메트헤모글로빈이나 시안메트헤모글로빈 (이하, 이들을 안정화 메트헤모글로빈이라고도 한다) 이 되어 안정화되는 것이 알려져 있지만, 이 안정화 메트헤모글로빈도, 분리 칼럼에 있어서의 유지력이 옥시헤모글로빈이나 디옥시헤모글로빈과는 약간 상이하기 때문에, 안정화 메트헤모글로빈의 존재에 의해, 검출되는 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다.
HPLC 를 사용한 헤모글로빈류의 분석은, 당뇨병 진단 외에 주로 빈혈을 일으키는 이상 헤모글로빈증이나 탈라세미아와 같은 진단에도 사용되고 있다. 그 중에서도, 헤모글로빈 S 는 가장 많이 볼 수 있는 이상 헤모글로빈으로, 위독한 빈혈 증상을 일으키는 겸상적혈구증의 원인 물질이기 때문에, 분리, 검지의 수요는 높다. 또한, 당뇨병의 마커인 헤모글로빈 A1c 를 측정할 때에는, 헤모글로빈 S 를 비롯한 이상 헤모글로빈을 샤프한 용출 피크로서 분리하는 것이 바람직하다. 헤모글로빈류의 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성이 되어 있거나 하면 이상 헤모글로빈과 정상 헤모글로빈의 분리가 곤란해짐과 함께, 측정치에 대한 악영향이 염려된다.
또한, 신선혈보다 열화혈(劣化血)쪽이 브로드나 이봉성의 용출 피크를 발생시키기 쉬운 경향이 있다. 이것은 열화에 의해 생성되는 메트헤모글로빈이 증가하는 것이 원인이다. 그 때문에, 재검사 등에서 보존 검체의 분석을 실시하는 경우에 측정치에 대한 영향이 염려되고 있다.
헤모글로빈류의 열화나 변성을 방지하기 위한 방법으로는, 공지된 항균제를 첨가하는 방법이나 당류를 첨가하는 방법이 알려져 있지만, 이 밖에도, 예를 들어, 특허문헌 1 에는 알부민을 헤모글로빈류와 공존시키는 방법, 특허문헌 2 에는 헤모글로빈류와 카세인, 붕산 등을 공존시키는 방법, 특허문헌 3 에는 헤모글로빈류와 이미노카르복실산 및 그 염을 공존시키는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 특허문헌 1 ∼ 3 에 개시되어 있는 방법을 사용해도, 혈액 검체에 옥시헤모글로빈, 디옥시헤모글로빈, 메트헤모글로빈 등의 각종 헤모글로빈류가 혼재하는 상황에 있어서는, HPLC 로 측정한 경우에 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다.
또한, 일반적인 HPLC 장치에는 용리액 중의 기체를 제거하기 위한 디개서가 장착되어 있지만, 디개서는 스타트 후 얼마 동안은 기체 제거 능력이 안정되지 않아, 헤모글로빈의 용출 시간이 변동되거나 분리에 악영향을 미치거나 하는 경우가 있다. 특히, HPLC 장치의 스타트 직후나 용리액 온도가 불안정한 경우에 헤모글로빈류의 용출 시간이 변동되거나 정량성이 악화되기 쉬워지거나 한다. 이것은 신속성이 요구되는 헤모글로빈 A1c 를 마커로 하는 당뇨병 검사에서, 퍼스트 리포트까지의 시간이 오래 걸리는 것으로 이어지기 때문에, HPLC 장치의 스타트 직후부터 안정적인 측정이 가능한 기술이 필요해지고 있다.
또한, 각종 헤모글로빈류의 검출, 정량에는 일반적으로 분광 광도계에 의한 흡광도가 사용되는데, 옥시헤모글로빈, 디옥시헤모글로빈, 메트헤모글로빈, 아지드메트헤모글로빈, 시안메트헤모글로빈은 각각의 흡광 스펙트럼이 상이하기 때문에, 이들이 혼재하고 있으면 정확한 헤모글로빈량을 측정할 수 없는 경우가 있다.
일본 공개특허공보 2003-194825호 일본 공개특허공보 평11-166932호 일본 공개특허공보 2009-97956호
본 발명은, 액체 크로마토그래피에 의해, 헤모글로빈류를 단시간에 고정밀도로 분리할 수 있는 헤모글로빈류의 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 액체 크로마토그래피를 사용한 헤모글로빈류의 분석 방법으로서, 미리 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리하는 헤모글로빈류의 분석 방법이다.
이하에 본 발명을 상세히 서술한다.
본 발명자들은, 미리 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리함으로써, 검체 중의 헤모글로빈류를 모두 안정화 메트헤모글로빈으로 변화시키며, 각 헤모글로빈의 칼럼 고정상에 대한 유지력을 균일하게 하여, 단시간에 고정밀도로 헤모글로빈류를 분리할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명의 헤모글로빈류의 분석 방법에 있어서는, 미리 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리한다.
산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 검체를 처리함으로써, 헤모글로빈류의 분리능을 향상시키면서 헤모글로빈류의 용출 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, HPLC 장치의 디개서의 스타트 직후의 기체 제거 능력이 안정되지 않은 경우에 있어서도, 헤모글로빈류의 용출 시간의 변동이 발생하지 않게 됨과 함께, 검출되는 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 없어, 헤모글로빈류가 고정밀도로 분리된다.
또한, 본 발명에 있어서, 「미리 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리한다」란, 헤모글로빈류가 분리 칼럼에 의해 분리되기 전에, 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리하는 것을 의미하고, 액체 크로마토그래피에 의한 측정 개시 전에 처리하는 것에 한정되지 않는다. 구체적으로는 예를 들어, 검체 전처리액 및/또는 용리액에, 표 1 에 기재한 조합 중 어느 것으로 산화제와 3 가의 헴철에 대한 결합제를 배합함으로써, 헤모글로빈류가 분리되기 전에 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리할 수 있다. 표 1 중, 「○」는 배합하는 것을 의미하고, 「－」는 배합하지 않는 것을 의미한다.
Figure pct00001
본 발명의 헤모글로빈류의 분석 방법에 있어서, 산화제는, 헤모글로빈류의 헴철을 2 가에서 3 가로 변화시켜, 메트헤모글로빈을 형성한다.
산화제로는, 헤모글로빈류의 헴철을 2 가에서 3 가로 변화시키는 효과가 있으면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 아질산염, 페리시안화칼륨, 메틸렌 블루, 과산화수소, 아스코르브산, 황화수소 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 아질산염이 바람직하고, 아질산나트륨, 아질산칼륨이 보다 바람직하다. 이들 산화제를 사용함으로써, 산화력이 지나치게 강해 헤모글로빈류가 분해되거나 하는 경우가 없고, 또한, 메트헤모글로빈과 결합하여 용출 패턴이 크게 변화하거나, 헤모글로빈류를 검출하는 파장과 산화제의 흡광 스펙트럼이 간섭하여 HPLC 측정 중에 베이스라인의 변동이 발생하거나 하는 경우가 없어, 헤모글로빈류의 정량성이 보다 우수한 것이 된다.
본 발명의 헤모글로빈류의 분석 방법에 있어서, 3 가의 헴철에 대한 결합제는, 메트헤모글로빈을 안정화 메트헤모글로빈으로 한다.
3 가의 헴철에 대한 결합제로는, 예를 들어, 아지화물, 시안화물 등을 들 수 있다. 3 가의 헴철에 대한 결합제로서 아지화물 또는 시안화물을 사용함으로써, 메트헤모글로빈의 구조를 크게 바꾸어 버리는 경우가 없고, 헤모글로빈류의 용출 거동을 크게 변화시켜 버리는 경우도 없다. 따라서, 헤모글로빈류의 정량성이 보다 우수한 것이 된다.
아지화물로는, 예를 들어, 아지화나트륨, 디페닐인산아지드, 4-도데실벤젠술포닐아지드, 4-아세틸아미노벤젠술포닐아지드, 아지화칼륨, 아지화리튬, 아지화철, 아지화수소, 아지화납, 아지화수은, 아지화구리, 아지화은 등을 들 수 있다.
시안화물로는, 예를 들어, 시안화칼륨, 시안화수소, 시안화나트륨, 시안화은, 시안화수은, 시안화구리, 시안화납, 시안화철, 시안화리튬, 시안화암모늄 등을 들 수 있다.
이들 3 가의 헴철에 대한 결합제 중에서도 아지화나트륨이 바람직하다.
검체 전처리액으로는, 예를 들어, 유기산 또는 그 염류, 아미노산류, 무기산 또는 그 염류, 굿 완충제 등의 완충제를 함유하는 공지된 완충액을 사용할 수 있다.
유기산으로는, 예를 들어, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 말산 등을 들 수 있다.
아미노산류로는, 예를 들어, 글리신, 타우린, 아르기닌 등을 들 수 있다.
무기산으로는, 예를 들어, 염산, 질산, 황산, 인산, 붕산, 아세트산 등을 들 수 있다.
또한, 완충액에는, 필요에 따라, 계면 활성제, 각종 폴리머, 친수성의 저분자 화합물 등이 적절히 첨가되어 있어도 된다.
검체 전처리액의 완충제 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 5 mmol/ℓ, 바람직한 상한은 500 mmol/ℓ 이다. 완충제 농도가 5 mmol/ℓ 미만이면, 완충 작용이 충분히 얻어지지 않는 경우가 있다. 완충제 농도가 500 mmol/ℓ 를 초과하면, 완충제의 석출이 일어나, HPLC 장치의 유로를 막히게 하는 원인이 되는 경우가 있다. 완충제 농도의 보다 바람직한 하한은 10 mmol/ℓ, 보다 바람직한 상한은 200 mmol/ℓ 이다.
검체 전처리액이 산화제를 함유하는 경우, 검체 전처리액 중에 있어서의 산화제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 0.05 mmol/ℓ, 바람직한 상한은 50 mmol/ℓ 이다. 검체 전처리액 중에 있어서의 산화제의 농도가 0.05 mmol/ℓ 미만이면, 헤모글로빈류의 메트화가 충분히 이루어지지 않아, 옥시헤모글로빈, 디옥시헤모글로빈이 측정 시료 중에 혼재함으로써, 검출되는 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다. 검체 전처리액 중에 있어서의 산화제의 농도가 50 mmol/ℓ 를 초과하면, 메트헤모글로빈이 분해되어 버려, 용출 피크가 검출되지 않거나, 상이한 용출 시간에 용출 피크가 검출되거나 하는 경우가 있다. 검체 전처리액 중에 있어서의 산화제 농도의 보다 바람직한 하한은 0.5 mmol/ℓ, 보다 바람직한 상한은 25 mmol/ℓ 이다.
검체 전처리액이 3 가의 헴철에 대한 결합제를 함유하는 경우, 검체 전처리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 0.05 mmol/ℓ, 바람직한 상한은 50 mmol/ℓ 이다. 검체 전처리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제의 농도가 0.05 mmol/ℓ 미만이면, 메트헤모글로빈의 3 가의 헴철에 대한 결합제의 결합이 충분히 이루어지지 않아, 검출되는 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다. 검체 전처리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제의 농도가 50 mmol/ℓ 를 초과하면, 메트헤모글로빈이 분해되어 버려, 용출 피크가 검출되지 않거나, 상이한 용출 시간에 용출 피크가 검출되거나 하는 경우가 있다. 검체 전처리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제 농도의 보다 바람직한 하한은 0.5 mmol/ℓ, 보다 바람직한 상한은 25 mmol/ℓ 이다.
검체 전처리액의 pH 는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 4.0, 바람직한 상한은 10.0 이다. 검체 전처리액의 pH 가 4.0 미만 혹은 10.0 을 초과하면, 헤모글로빈류의 안정성이 저하되어, 용출 피크가 검출되지 않거나, 상이한 용출 시간에 용출 피크가 검출되거나 하는 경우가 있다. 검체 전처리액의 pH 의 보다 바람직한 하한은 6.0, 보다 바람직한 상한은 8.5 이다.
용리액으로는, 예를 들어, 유기산 또는 그 염류, 아미노산류, 무기산 또는 그 염류, 굿 완충제 등의 완충제를 함유하는 공지된 완충액을 사용할 수 있다.
유기산으로는, 예를 들어, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 말산 등을 들 수 있다.
아미노산류로는, 예를 들어, 글리신, 타우린, 아르기닌 등을 들 수 있다.
무기산으로는, 예를 들어, 염산, 질산, 황산, 인산, 붕산, 아세트산 등을 들 수 있다.
또한, 완충액은, 필요에 따라, 계면 활성제, 각종 폴리머, 친수성의 저분자 화합물 등이 적절히 첨가되어 있어도 된다.
용리액의 완충제 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 5 mmol/ℓ, 바람직한 상한은 500 mmol/ℓ 이다. 완충제 농도가 5 mmol/ℓ 미만이면, 완충 작용이 충분히 얻어지지 않는 경우가 있다. 완충제 농도가 500 mmol/ℓ 를 초과하면, 완충제의 석출이 일어나 HPLC 장치의 유로를 막히게 하는 원인이 되거나, 용리액의 전환 효율이 저하되어 평형화에 시간이 걸리는 원인이 되거나 하는 경우가 있다. 완충제 농도의 보다 바람직한 하한은 10 mmol/ℓ, 보다 바람직한 상한은 200 mmol/ℓ 이다.
용리액이 산화제를 함유하는 경우, 용리액 중에 있어서의 산화제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 0.05 mmol/ℓ, 바람직한 상한은 50 mmol/ℓ 이다. 용리액 중에 있어서의 산화제의 농도가 0.05 mmol/ℓ 미만이면, 헤모글로빈류의 메트화가 충분히 이루어지지 않아, 옥시헤모글로빈, 디옥시헤모글로빈이 측정 시료 중에 혼재함으로써, 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다. 용리액 중에 있어서의 산화제의 농도가 50 mmol/ℓ 를 초과하면, 용출 시간이 지나치게 빨라져 분리능이 악화되는 경우가 있다. 또한, 용출 시간은, 메트헤모글로빈이 분해되지 않는 범위 내에서 용리액 중의 완충제 농도 등을 조정함으로써 조절은 가능하다. 용리액 중에 있어서의 산화제 농도의 보다 바람직한 하한은 0.5 mmol/ℓ, 보다 바람직한 상한은 25 mmol/ℓ 이다.
용리액이 3 가의 헴철에 대한 결합제를 함유하는 경우, 용리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 0.05 mmol/ℓ, 바람직한 상한은 50 mmol/ℓ 이다. 용리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제의 농도가 0.05 mmol/ℓ 미만이면, 헤모글로빈류의 메트화가 충분히 이루어지지 않아, 옥시헤모글로빈, 디옥시헤모글로빈이 혼재함으로써, 용출 피크가 브로드화되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다. 용리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제의 농도가 50 mmol/ℓ 를 초과하면, 용출 시간이 지나치게 빨라져 분리능이 악화되는 경우가 있다. 또한, 용출 시간은, 메트헤모글로빈이 분해되지 않는 범위 내에서 용리액 중의 완충제 농도 등을 조정함으로써 조절은 가능하다. 용리액 중에 있어서의 3 가의 헴철에 대한 결합제 농도의 보다 바람직한 하한은 0.5 mmol/ℓ, 보다 바람직한 상한은 25 mmol/ℓ 이다.
본 발명의 헤모글로빈류의 분석 방법에 있어서, 용리액에만 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제를 배합하는 경우에는, 적어도 HPLC 에 의한 측정시 최초로 송액하는 용리액에 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제를 배합한다. 또한, 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제는, HPLC 에 의한 측정시 최초로 송액하는 용리액 이외의 용리액에도 배합하는 것이 바람직하고, 측정에 사용하는 모든 용리액에 배합하는 것이 보다 바람직하다.
용리액은, pH 조정제로서, 공지된 산, 염기를 함유해도 된다. 산으로는, 예를 들어, 염산, 인산, 질산, 황산 등을 들 수 있고, 염기로는, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 수산화마그네슘, 수산화바륨, 수산화칼슘 등을 들 수 있다.
용리액은, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤 등의 수용성 유기 용매를 함유하고 있어도 된다. 유기 용매의 농도는, 염 등이 석출되지 않는 정도로 사용하는 것이 바람직하고, 바람직한 상한은 80 ％ (v/v) 이다.
용리액의 pH 는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 4.0, 바람직한 상한은 10.0 이다. 용리액의 pH 가 4.0 미만이면, 검출되는 용출 피크의 리딩이 커지거나, 용출 피크가 브로드하게 되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다. 용리액의 pH 가 10.0 을 초과하면, 칼럼 고정상과 헤모글로빈류의 유지가 약해져 헤모글로빈류의 용출 시간이 극단적으로 빨라지는 것에 더해, 검출되는 용출 피크의 테일링이 커지거나, 또한, 용출 피크가 브로드하게 되거나 이봉성을 나타내거나 하는 경우가 있다. 또한, pH 를 4.0 이상 10.0 이하로 함으로써, 측정 시료 중의 헤모글로빈류의 안정성이 저하되는 경우가 없어, 헤모글로빈류의 용출 피크가 검출되지 않거나, 상이한 용출 시간에 용출 피크가 검출되거나 하는 경우가 없다. 용리액의 pH 의 보다 바람직한 하한은 6.0, 보다 바람직한 상한은 8.5 이다.
본 발명의 헤모글로빈류의 분석 방법에 있어서의 액체 크로마토그래피로는, 이온 교환 액체 크로마토그래피를 사용하는 것이 바람직하다.
이온 교환 액체 크로마토그래피로는, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 펌프를 사용하여 용리액을 분리 칼럼에 송액할 때에, 용리액을, 디개서를 통과시킨 후에 측정 시료를 주입하여 분리 칼럼에 보내고, 분리 칼럼에서 헤모글로빈류를 분리시키고, 용출되어 온 용출액 중의 분리 성분을 검출기에 의해 검출하는 방법을 들 수 있다.
분리 칼럼은, 칼럼 본체에 고정상이 충전된 것이다. 고정상으로는, 충전제 입자, 다공질체 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 충전제 입자가 바람직하다.
충전제 입자로는, 무기계 입자, 유기계 입자 등을 들 수 있다.
무기계 입자로는, 실리카, 지르코니아 등으로 구성되는 입자를 들 수 있다.
유기계 입자로는, 셀룰로오스, 폴리아미노산, 키토산 등의 천연 고분자 입자나, 폴리스티렌, 폴리아크릴산에스테르 등의 합성 고분자 입자를 들 수 있다.
고정상으로는, 양이온 교환기를 갖는 고정상을 사용하는 것이 바람직하다.
양이온 교환기로는, 카르복실기, 인산기, 술폰산기 등을 들 수 있다.
본 발명의 헤모글로빈류의 분석 방법에 있어서의 측정 조건은, 사용하는 측정 시료, 칼럼 등의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 용리액 유속의 바람직한 하한은 0.05 ㎖/분, 바람직한 상한은 5 ㎖/분, 보다 바람직한 하한은 0.2 ㎖/분, 보다 바람직한 상한은 3 ㎖/분이다. 헤모글로빈류의 검출 파장은 415 ㎚ 가 바람직하지만, 특히 이것에만 한정되는 것은 아니다.
측정 시료는, 통상적으로, 계면 활성제 등의 용혈 활성을 갖는 물질을 함유하는 용액에 의해 용혈된 혈액 검체를 희석한 것을 사용한다. 측정 시료의 주입량은, 혈액 검체의 희석 배율에 따라 상이하지만, 바람직하게는 0.1 ∼ 100 ㎕ 정도이다.
본 발명의 헤모글로빈류의 분석 방법은, 우수한 분리능을 나타냄과 함께, 분석을 단시간에 실시할 수가 있으며, 또한, 종래 분리가 곤란하였던 헤모글로빈류도 분리하기 쉬워진다.
즉, 본 발명에 의하면, 액체 크로마토그래피에 의해, 헤모글로빈류를 단시간에 고정밀도로 분리하여, 분석할 수 있다.
도 1 은, 실시예 1 및 비교예 1 에 있어서의 측정 횟수와 헤모글로빈 S 의 용출 시간의 관계를 나타낸 도면이다.
도 2 는, 실시예 2 에 있어서의 제 1 용리액과 제 2 용리액의 그레이디언트 조건을 나타낸 도면이다.
도 3 은, 실시예 2 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 4 는, 실시예 3 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 5 는, 실시예 4 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 6 은, 실시예 5 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 7 은, 실시예 6 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 8 은, 실시예 7 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 9 는, 실시예 8 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 10 은, 비교예 2 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 11 은, 비교예 3 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 12 는, 비교예 4 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 13 은, 실시예 9 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 14 는, 실시예 10 에 있어서, (a) 글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 를 함유하는 측정 시료, 및, (b) 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액을 함유하는 측정 시료를 측정하여 얻어진 크로마토그램이다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되지 않는다.
(실시예 1)
헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
분리 칼럼으로서, 입자 표면에 술폰산기를 도입한 양이온 교환 수지 충전제를 칼럼 본체에 충전한 칼럼을 사용하였다.
HPLC 장치에는, 오토샘플러로서 SIL-20AC (시마즈 제작소사 제조), 송액 펌프로서 LC-20AD (시마즈 제작소사 제조), 디개서로서 DGU-20A5 (시마즈 제작소사 제조), 칼럼 오븐으로서 CTO-20AC (시마즈 제작소사 제조), 검출기로서 SPD-M20A (시마즈 제작소사 제조) 를 사용하고, 용리액의 유속을 1.7 ㎖/분, 검출 파장을 415 ㎚, 측정 시료 주입량을 10 ㎕ 로 하였다.
용리액으로는, 0.5 분까지는 용리액 1 (60 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 용출시키고, 0.5 분을 초과 1.0 분까지는 용리액 2 (10 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 로 용출시키고, 1.0 분을 초과 1.1 분까지는 용리액 3 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 으로 용출시키고, 1.1 분을 초과 1.5 분까지는 용리액 1 로 용출시켜 측정 시료의 측정을 실시하였다.
또한, HPLC 장치의 스타트 직후부터 연속해서 15 회 측정을 실시하였다.
(비교예 1)
측정 시료는, 실시예 1 과 동일한 것을 사용하였다.
용리액 1 을 용리액 4 (60 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)), 용리액 2 를 용리액 5 (10 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다.
실시예 1 및 비교예 1 에 있어서의 측정 횟수와 헤모글로빈 S 의 용출 시간의 관계를 도 1 에 나타냈다. 도 1 로부터, 헤모글로빈 S 의 용출 시간은, 비교예 1 에서는 측정 횟수의 증가에 수반하여 느려지고 있는 것을 알 수 있다. 한편, 실시예 1 에서는, 헤모글로빈 S 의 용출 시간은 측정 횟수에 관계없이 거의 일정하였다.
(실시예 2)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
분리 칼럼은 실시예 1 과 동일한 분리 칼럼을 사용하였다.
실시예 1 과 동일한 HPLC 장치를 사용하고, 유속을 1.7 ㎖/분, 검출 파장을 415 ㎚, 측정 시료 주입량을 10 ㎕ 로 하였다.
용리액은, 제 1 용리액으로서 용리액 6 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 과 제 2 용리액으로서 용리액 7 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 을 사용하여 2 액 리니어 그레이디언트로 용출시켜 측정 시료의 측정을 실시하였다. 제 1 용리액과 제 2 용리액의 그레이디언트 조건을 도 2 에 나타냈다. 도 2 는, 제 1 용리액과 제 2 용리액의 합계량에 대한 제 2 용리액의 비율 (중량％) 을 나타내고 있다. 또한, 얻어진 크로마토그램을 도 3 에 나타냈다.
(실시예 3)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 2 용리액을, 실시예 1 에서 사용한 용리액 3 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 으로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 4 에 나타냈다.
(실시예 4)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 8 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 10 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 9 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 10 mmol/ℓ 아질산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 5 에 나타냈다.
(실시예 5)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 10 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 10 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 으로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 11 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨, 10 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 6 에 나타냈다.
(실시예 6)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 12 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 10 mmol/ℓ 아질산나트륨, 10 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 13 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 10 mmol/ℓ 아질산나트륨, 10 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 으로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 7 에 나타냈다.
(실시예 7)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 페리시안화칼륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 페리시안화칼륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 14 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 페리시안화칼륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 15 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 페리시안화칼륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 8 에 나타냈다.
(실시예 8)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 16 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 페리시안화나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 으로 변경하고, 제 2 용리액을, 실시예 1 에서 사용한 용리액 3 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 으로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 9 에 나타냈다.
(비교예 2)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 17 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 변경하고, 제 2 용리액을, 실시예 1 에서 사용한 용리액 3 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 으로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 10 에 나타냈다.
(비교예 3)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 18 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 19 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 아질산나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 11 에 나타냈다.
(비교예 4)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 20 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 1 mmol/ℓ 페리시안화칼륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 으로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 21 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 12 에 나타냈다.
(실시예 9)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 22 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 25 mmol/ℓ 아질산나트륨, 25 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 23 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 25 mmol/ℓ 아질산나트륨, 25 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 으로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 13 에 나타냈다.
(실시예 10)
글리코헤모글로빈 컨트롤 레벨 2 (시스멕스사 제조) 를 200 ㎕ 의 주사용수로 용해시킨 후, 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
또한, 헤모글로빈 S 를 함유하는 혈액 검체를 검체 전처리액 (0.1 중량％ 트리톤 X-100 을 함유하는 10 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0)) 으로 100 배로 희석한 것을 측정 시료로서 사용하였다.
제 1 용리액을, 용리액 24 (30 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 50 mmol/ℓ 아질산나트륨, 50 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 20 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 5.4)) 로 변경하고, 제 2 용리액을, 용리액 25 (0.8 중량％ 트리톤 X-100, 300 mmol/ℓ 과염소산나트륨, 50 mmol/ℓ 아질산나트륨, 50 mmol/ℓ 아지화나트륨을 함유하는 40 mmol/ℓ 인산 완충액 (pH 8.0)) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여 측정 시료의 측정을 실시하였다. 얻어진 크로마토그램을 도 14 에 나타냈다.
실시예 2 ∼ 10, 및, 비교예 2 ∼ 4 의 측정에서 사용한 검체 전처리액과 용리액의 조성을 표 2, 3 에 나타냈다. 또한, 얻어진 크로마토그램의 헤모글로빈류의 분리 상황과 피크 패턴을 표 4 에 나타냈다.
도 3 ∼ 14 에 있어서, 피크 (A) 는 헤모글로빈 A0, 피크 (B) 는 헤모글로빈 A2, 피크 (C) 는 헤모글로빈 S 를 나타내고 있다.
도 3 ∼ 7 (실시예 2 ∼ 6) 에 있어서, 피크 (A), 피크 (C) 는 샤프한 단일 피크로서 분리되어 있는 것이 확인되었다. 도 8 (실시예 7) 은 크로마토그램에 조금 드리프트가 확인되었기 때문에 정량성이 약간 저하되었지만, 피크 동정은 가능한 레벨이었다. 한편, 도 9 (실시예 8) 의 피크 (A), 피크 (C) 는 약간 삼봉성 또는 이봉성을 나타내는 피크로서 검출되었지만, 문제가 없는 정도였다.
또한, 도 3 ∼ 9 (실시예 2 ∼ 8) 에서는 피크 (B) 는 피크 (A) 로부터 분리되어 있는 것이 확인되었지만, 도 10 (비교예 2) 에서는 글리코헤모글로빈 컨트롤 2 를 함유하는 측정 시료에서는 피크 (B) 는 피크 (A) 로부터 전혀 분리되어 있지 못하고, 헤모글로빈 S 를 함유하는 측정 시료에서는 피크 (A) 의 뒤에 피크 (B) 가 약간 숄더로서 확인할 수 있는 정도였다. 동일한 현상은 다른 헤모글로빈종에 대해서도 일어날 수 있는 것으로 생각되고, 본 발명을 사용함으로써 함유량이 많은 헤모글로빈종에 인접한 피크를 고정밀도로 분리시키기 쉬워진다.
도 11, 12 (비교예 3, 4) 에서는 아질산나트륨 또는 페리시안화칼륨에 의해 메트화된 헤모글로빈이 피크로서 검출되고 있지만, 헤모글로빈류의 분해물로 보여지는 피크가 검출되었다.
도 13, 14 (실시예 9, 10) 는 아질산나트륨과 아지화나트륨이 공존하고 있기 때문에, 단일 피크를 형성하고 있기는 하지만, 첨가량이 지나치게 많기 때문에 용출 시간이 지나치게 빨라져 있었다. 그러나, 단일 피크가 형성되어 있기 때문에, 완충제 농도 등의 다른 조건을 조정함으로써, 정량성을 확보할 수 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, 액체 크로마토그래피에 의해, 헤모글로빈류를 단시간에 고정밀도로 분리할 수 있는 헤모글로빈류의 분석 방법이 제공된다.

Claims (8)

  1. 액체 크로마토그래피를 사용한 헤모글로빈류의 분석 방법으로서,
    미리 검체를 산화제 및 3 가의 헴철에 대한 결합제로 처리하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    산화제는 헤모글로빈을 메트화시키는 물질인 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    산화제는 아질산염인 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    산화제는 아질산나트륨인 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    3 가의 헴철에 대한 결합제는, 메트헤모글로빈 중의 3 가의 철에 결합하는 물질인 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    3 가의 헴철에 대한 결합제는, 아지화물인 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    3 가의 헴철에 대한 결합제는, 아지화나트륨인 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
  8. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    액체 크로마토그래피로서 양이온 교환 액체 크로마토그래피를 사용하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 분석 방법.
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