KR100477307B1 - 부분적인컬럼후반응을이용한비타민b1,b2,b6의동시분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부분적인 컬럼후 반응을 이용하여 비타민 B1, B2, B6를 동시에 분석하는 방법에 관한 것으로써, 좀 더 상세하게는 상기의 비타민을 HPLC 분석용 역상 컬럼에 주입하고 물 1ℓ 당 아세토니트릴 132.5㎖, 암모니아수 0.465㎖ 및 1-헥산설포네이트나트륨 883,5mg을 포함하는 용출용매로 l㎖/분의 유속으로 흘려주는 단계와, 컬럼에서 분리되어 나온 비타민 B1을 형광성이 있는 사이오크롬(Thiochrome)으로 변환시키기 위해 컬럼후 단계에서 페리시안화칼륨을 포함하는 반응용액을 특정 시간에만 0.3㎖/분의 유속으로 유입시키는 단계와, 상기의 과정을 통해 분리된 비타민 B1, B2, B6를 형광 검출기로 측정하는 단계로 구성되어 있으며, 이를 통하여 분석 시간을 단축시키고, 비타민 B1, B2, B6를 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.

Description

부분적인 컬럼후 반응을 이용한 비타민 B1, B2, B6의 동시 분석방법

본 발명은 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography; 이하 "HPLC"라 한다)로 분석된 비타민 B1, B2, B6를 부분적인 컬럼후 반응을 거쳐 형광 검출기를 이용하여 동시에 분석하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비타민 B1이 HPLC 컬럼에서 분리되어 나오는 시간의 전부터 후까지 계속 컬럼후 반응에 사용되는 반응용액을 컬럼과 검출기 사이에 유입시켜 비타민 B1을 사이오크롬으로 전환시키고 이를 비타민 B2, B6와 함께 동시에 형광검출기로 측정하는 분석방법에 관한 것이다.

일반적으로 비타민 B1, B2, B6 등을 분석하는 방법으로는, 시료를 추출하여 복잡한 전처리를 거친 후 형광 광도법으로 분석하는 방법이 사용되었으나, 근래에는 HPLC와 자외선 검출기 혹은 형광 검출기를 이용하는 것이 보다 편리하므로 많이 이용되고 있는 추세이다. 특히 이 중에서 HPLC와 형광 검출기를 사용하면, 검출의 선택성이 높아지고, 보다 낮은 농도의 시료를 분석할 수 있어 최근에 많이 이용되고 있다.

그러나 상술한 HPLC와 형광 검출기를 이용하는 기존의 방법들은 비타민 B1, B2, B6를 동시에 분석하지 못하는 단점이 있다. 비타민 B1을 형광 검출기로 분석하기 위해서는, 염기 조건 하에서 페리시안화칼륨과 반응시켜 사이오크롬을 생성시키는데, 이를 위해서는 HPLC 분리 전에 시료와 페리시안화칼륨을 컬럼전 반응(Precolumn reaction) 시키거나, 혹은 HPLC로 분리된 후에 반응을 시키는 컬럼후 반응이 있다. 그러나, 이때 사용되는 페리시안화칼륨 반응 용액은 비타민 B2와 비타민 B6의 대부분을 파괴시키는 단점이 있어, 기존의 HPLC와 형광 검출기를 이용하는 방법으로는 이 두 종의 비타민(B2, B6)과 비타민 B1을 동시에 분석할 수 없었다. 따라서, 기존의 방법으로는 같은 시료를 2회에 걸쳐 각각 HPLC를 수행하여야만 하며, 그에 따라 분석 시간이 길어지고, 분석 조건이 다름으로 인하여 그 조건을 바꿔 주어야만 하는 번거로움이 있었다.

본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 비타민 B1이 HPLC로 분석되어 나오는 머무름 시간 전후 동안에 위에서 언급한 컬럼후 반응을 부분적으로 수행하도록 조절함으로써 비타민 B2와 B6의 파괴를 막고, 효과적으로 이 3종의 비타민들을 HPLC와 형광 검출기로 동시에 분석하도록 한 부분적인 컬럼후 반응을 이용한 비타민 B1, B2, B6의 동시 분석방법을 제공함에 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은 비타민 B1, B2, B6을 HPLC의 분리 컬럼인 역상 컬럼에 주입시키는 단계와, 물, 아세토니트릴, 암모니아 및 1-헥산술폰산나트륨(1-hexanesulfonate, sodium salt)으로 조성된 용출 용매를 흘려 비타민을 분리·용출시키는 단계와, 컬럼후 단계에서 비타민 B1을 사이오크롬으로 전환시키기 위한 페리시안화칼륨 반응용액을 부분적으로 흘려주는 단계와, 상기의 과정을 거치는 동안 분리된 비타민 B1, B2, B6를 형광 검출기로 분석하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 방법을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

본 발명에 사용된 HPLC 분석용 컬럼은 역상 C18 컬럼(길이 250mm, 내경 4.6mm)으로, 이 컬럼에 1ℓ 당 아세토니트릴 132.5㎖, 암모니아수 0.46㎖, 1-헥산술폰산나트륨 883.5mg의 조성을 갖는 수용액 용출용매를 분당 1㎖의 유속으로 흘려주면, 비타민 B6, 비타민 B1, 비타민 B2는 각각 7.1분, 11.4분, 18.2분의 머무름 시간을 갖고 용출된다. 상술한 바와 같이, 비타민 B6와 B2는 페리시안화칼륨 반응용액에 의하여 파괴되므로 1% 페리시안화칼륨을 포함하는 15% 수산화나트륨 수용액은 비타민 B1이 HPLC 컬럼으로부터 용출되어 나오는 머무름 시간(11.4분) 전부터 후까지인 8.5분에서 14,5분 사이에만 컬럼 후반부에서 분당 0.3㎖로 주입시켜 비타민 B1만 선택적으로 반응되도록 한다. 이때 상술한 바와 같이 비타민 B6는 7.1분, 비타민 B2는 18.2분의 머무름 시간으로 컬럼에서 용출되므로 반응용액이 컬럼 후반부에 주입되는 8.5분에서 14,5분 사이에는 이 반응용액과 전혀 접촉하지 않으므로 파괴되지 않는다.

본 발명에서 사용한 형광 검출기는 형광성을 갖는 물질에 해당하는 여기(excitation)파장의 빛을 조사하고, 이때, 그에 대응하여 발산되는 특정한 방출(emission)파장의 빛을 측정함으로써 분석 대상 물질의 양을 측정하는 기기이다. 이때 조사되는 여기파장과 방출파장은 각각의 물질마다 특이성을 갖는다. 본 발명의 실험 대상인 비타민 B1(컬럼후 반응 이후에는 사이오크롬), 비타민 B2 및 비타민 B6도 역시 서로 상이한 여기파장과 방출파장을 가지며, 본 발명에서 이용된 파장들은 실시예 1에 나타나 있다. 따라서, 형광 검출기로 위 3종의 비타민을 검출하기 위해서는 각 분석 대상 비타민들이 컬럼에서 분리, 용출되어 형광 검출기를 통과하기 이전에 형광 검출기를 미리 각각 비타민에 맞는 여기파장 및 방출파장으로 조절하여야 한다. 이를 위하여 시간에 따른 형광 검출기의 여기 및 방출파장을 프로그램하여야 하며, 시료의 주입과 동시에 이 프로그램도 함께 작동시켜야 한다. 상술한 시간 경과에 따른 여기 및 방출파장 프로그램과 기기 작동 조건은 하기 실시예 1에 나타나 있다.

실시예1

비타민 B1과 비타민 B6 100mg을 각각 증류수 100㎖에 녹여 1,000ppm 표준원액을 제조하였고, 비타민 B2는 100mg을 증류수 1ℓ 에 녹여 100ppm 표준원액을 제조하였다. 상기의 표준원액들을 희석하여 섞어 비타민 B1, B2, B6를 각각 0.2ppm, 1.0ppm, 1.0ppm씩 포함하는 표준용액을 제조하였다. 용출용매는 아세토니트릴 132.5㎖, 암모니아수 0.465㎖ 및 1-헥산술폰산나트륨 883.5mg을 증류수에 첨가하여 1ℓ 로 부피를 맞추고, 0.45㎛n 멤브레인 필터(membrane filter)를 통하여 거른 후, 펌프1(도 3참고)을 이용하여 펌핑하여 사용하였다. 컬럼후 반응의 반응용액은 페리시안화칼륨 5g, 수산화나트륨 75g을 증류수로 녹여 500㎖ 부피를 맞추고, 이를 펌프2(도 3참고)로 펌핑하여 사용하였다. 비타민 B1과 반응용액이 반응하여 사이오크롬을 생성하기 위한 적당한 시간과 온도 조건을 맞추기 위하여, 60℃로 항온 유지되는 반응 챔버(reaction chamber)에 길이 80cm의 반응 코일(reaction coil)을 넣고, 이 코일에 분석 컬럼의 후반부와 반응용액 유입부를 연결하였다.

상기의 표준용액 50㎕를 주입한 후, 상기의 용출용매를 1㎖/분의 유속으로 흘려 주었다. 표준용액 주입 후 8.5분이 경과하면, 펌프 2(도 3참고)를 작동하여 컬럼후 반응의 반응용액을 0.3㎖/분의 유속으로 펌핑하여 컬럼 후반부에 유입시켜 주었다. 표준 용액 주입 후 14.5분이 경과되면, 펌프 2(도 3참고)의 작동을 멈추어 반응용액의 유입을 중지하였다. 형광검출기의 여기 및 방출 파장은 표준용액 주입 후 9.5분까지는 비타민 B6의 여기 및 방출 파장인 295nm와 395nm로 조절하였고, 9.5분에서 15.0분 사이에는 비타민 B1(사이오크롬)의 여기 및 방출 파장인 360nm와 435nm로 조절하였으며, 표준용액 주입 후 15.0분이 경과한 이후에는 비타민 B2의 여기 및 방출 파장인 440nm와 565nm로 조절하였다. 상기의 조건에서 분석된 비타민들의 검출 피크들은 도 1의 크로마토그램에 나타내었다.

실시예 2

상기 실시예 1의 표준원액을 점진적으로 희석하여, 비타민 B1, B2, B6의 농도가 각각 0.005∼0.2ppm, 0.025∼1.0ppm, 0.025∼1.0ppm의 범위가 되도록 제조하였다. 이를 상기 실시예 1과 같은 방법으로 각 농도별로 3회씩 수행하여 비타민 B1, B2, B6의 표준 검정식(calibration equation), 상관 계수(R², correlation coefficient) 및 검출한계를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 기재하였다.

[표 1]

* 표준 검정식 : Y,농도(mg/ℓ )=기울기× 피크면적,X + 접점(y절편)

* R²: 상관계수(1일 때 가장 이상적인 상태임)

비교예

상기 실시예 1과 동일하게 실험하되, 컬럼후 반응을 분석 전 범위에서 실시하였다. 상기 과정 후 컬럼에서 분리되어 형광검출기를 통하여 측정된 피크치를 도 2에 제시하였다. 도 2에서 보듯이 비타민 B2와 B6은 분석 전 범위에 걸쳐 실시된 컬럼후 반응에 의해 대부분 파괴되어 이에 대한 피크치들이 측정되지 않았다.

본 발명에 의하여 비타민 B1, B2, B6를 포함하는 시료를 분석하면 비타민 B1이 HPLC로 분석되어 나오는 머무름 시간 전후 동안에 컬럼후 반응을 부분적으로 수행하도록 조절함으로써 비타민 B2와 B6의 파괴를 막고, 효과적으로 이 3종의 비타민들을 동시에 HPLC와 형광 검출기로 분석함으로써 분석시간을 단축시키고 분석비용을 절감하며, 미량의 시료를 분석할 수 있는 것이다.

도 1은 본 발명의 분석방법에 따라 부분적인 컬럼후 반응(Post column reaction)을 이용하여 측정된 비타민 B1, B2, B6의 피크치를 나타낸 그래프

도 2는 본 발명과 동일한 분석방법을 이용하되, 분석 전과정에서 컬럼후 반응을 수행한 경우의 비타민 B1, B2, B6는 파괴되어 검출되지 않고, 비타민 B1만 검출되어 나타난 피크치를 보여주는 그래프

도 3은 본 발명의 분석방법에 대한 대략적인 기기 구성도

Claims (4)

1. 비타민 B1, B2, B6을 포함하는 시료를 HPLC 컬럼에 주입시키는 단계와, 용출용매를 흘려 비타민을 분리, 용출시키는 단계와, 컬럼후 단계에서 비타민 B1의 머무름시간 전부터 후까지 계속 비타민 B1에 특이적인 반응용액을 주입하는 단계와, 상기의 과정을 거치는 동안 분리된 비타민 B1, B2, B6를 형광 검출기로 분석하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 부분적인 컬럼후 반응을 이용한 비타민 B1, B2, B6의 동시 분석방법.
2. 제 1항에 있어서, 비타민 B1에 특이적인 반응용액은 페리시안화칼륨인 것을 특징으로 하는 부분적인 컬럼후 반응을 이용한 비타민 B1, B2, B6의 동시 분석방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 용출 용매는 증류수, 아세토니트릴, 암모니아수 및 1-헥산술폰산나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 부분적인 컬럼후 반응을 이용한 비타민 B1, B2, B6의 동시 분석방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 용출 용매는 증류수 1ℓ 내에 아세토니트릴 132.5㎖, 암모니아수 0.465㎖ 및 1-헥산술폰산나트륨 883.5mg을 첨가한 것을 특징으로 하는 부분적인 컬럼후 반응을 이용한 비타민 B1, B2, B6의 동시 분석방법.