HRP930253A2

HRP930253A2 - IMMUNOLOGICAL METHOD TO DETERMINE HbAIc

Info

Publication number: HRP930253A2
Application number: HR930253A
Authority: HR
Inventors: Johann Karl; Lorenz Kerscher; Erich Schneider
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1992-03-05
Filing date: 1993-03-03
Publication date: 1995-10-31
Also published as: KR930020162A; CA2090981C; HU9300596D0; NZ247054A; JP2637677B2; CN1081765A; CZ29193A3; DE59310046D1; ES2148190T3; US5541117A; ZA931533B; EP0559164A2; SI9300108A; ATE193378T1; PT559164E; EP0559164A3; NO930770L; IL104902A0; DK0559164T3; CA2090981A1

Description

Izum se odnosi na postupak za određivanje sadržaja pojedinih derivata hemoglobina u uzorku krvi. Podrobnije, prikazani izum se odnosi na postupak za određivanje sadržaja derivata hemoglobina kao što je glikozirani hemoglobin koji zahtjeva posebno određivanje ukupnog sadržaja hemoglobina i određivanje derivata hemoglobina da bi se odredio udio derivatiziranog hematoglobina u krvi.

Zavisno o nivou šećera u krvi, mala količina glukoze se podiže vezama eritrocita do N-terminalnog valin ostatka β lanca u globinu u ne enzimatskoj reakciji. Reakcija koja treba formirati stabilan glikozirani hemoglobin derivat HbA1c (keto-aminsku formu), odvija se u dva stupnja. Prvo, glukoza se veže na hemoglobin putem brzog reverzibilnog pripajanja s formiranjem labilnog glikoziranog hemoglobin derivata (Schiffova baza). Stabilni oblik se formira ireverzibilnom polaganom reakcijom mijenjanja smještaja (Amadori promjena smještaja). Odnos HbA1c prema ukupnom hemaglobinu je 3 – 6% kod ljudi s zdravim metabolizmom. Kod pacijenata s dijabetesom, odnos HbA1c može porasti proporcionalno nivou koncentracije glukoze u krvi za vrijeme prethodna četiri do dvanaest tjedana do vrijednosti 12%, ponekad čak do 20%. Određivanje relativnog odnosa HbAlc prema sadržaju ukupnog hemaglobina omogućava dobivanje bitnog parametra za promatranje smjera kontrole šećera u krvi.

Opisani su nizovi postupaka za određivanje glikoziranog hemoglobina. Uobičajeni postupci se zasnivaju na tehnikama kao što su elektroforeza, izoelektrično fokusiranje i kolorimetrijska određivanja, a isto tako dobro i na ionskoj izmjeni i afinitetnoj kromatografiji. Nakon proizvodnje specifičnih poliklonskih antitjela (US patent 4,247,533) i monoklonskih antitijela (EP-A-0 316 306, EP-A-0 201 187) koja su bila opisana, razvijeni su nizovi imunoloških postupaka za otkrivanje HbAlc.

EP-A-0 185 870 opisuje imunološki postupak za određivanje proteina uključujući HbA1c. Upotrebljena su monoklonska antitijela koja prepoznaju specifične linearne peptidne epitope. Denaturacija je specifična za oslobađanje epitopa, između ostalog pomoću chaotropnih reagensa. Ovaj denaturacijski korak traje od jednog do nekoliko sati na temperaturama ispod 37°C, a na temperaturama preko 50°C zahtjeva jednu minutu. Simultano određivanje sadržaja ukupnog hemoglobina u uzorku, do sada nije postignuto.

U EP-A-0 201 187 je opisan postupak za određivanje HbAlcu kojem su upotrebljena monoklonska antitijela nasuprot HbAlc, koja su dobivena imunizacijom nativnog humanog HbAlc. Test se provodi na temperaturama od 4 do 37°C gdje svaki inkubacijski korak može trajati do 72 sata. Određivanje ukupnog hemoglobina i sadržaja HbA1c u istom uzorku nije opisano.

Postupak za određivanje relativnog sadržaja HbAlc u uzorku krvi je opisan u EP-A-0 315 864. Hemoglobin je denaturiran pomoću thiocyanata i preveden u methemoglobin dodatnim oksidirajućim agensom, obično ferricyanidom. I sadržaj ukupnog hemoglobina, kao i sadržaj HbAlc može se odrediti u uzorku krvi obrađenom na ovaj način.

Upotreba litijevih soli, obično lithium thiocyanata, da lizira eritrocite i denaturira derivate hemoglobina, opisana je u EP-A-0 407 860. Sadržaj HbAlc može biti određen imunološki. Da bi se odredio ukupni hemoglobin mora se dodati oksidirajuće sredstvo, obično ferricyanid, koji prevodi hemoglobin u methemoglobin.

Nedostatak poslijednjih dviju metoda je u tome, da bi se hemoglobin preveo u cyano-methemoglobin, mora se upotrijebiti cyanid. U Clin. Biochem. 15 (1982) 83 - 88 opisana je zamjena cyanida s natrium laurylsulfatom (SLS) da bi se odredio ukupni hemoglobin. Naravno u tim referencama nema naznake da bi SLS mogao biti prikladan za pre-obradu u imunološkom određivanju derivata hemoglobina, posebno HbAlc.

Reagens bez cyanida za određivanje ukupnog hemoglobina u uzorku krvi je također opisan u EP-A-0 184 787. Reagens je ionsko površinski aktivno sredstvo s pH najmanje 11.3, povoljnije s većim od 13.7. Imunološko određivanje derivata hemoglobina još do sada nije postignuto. Vrlo visoka pH vrijednost bi bila nedostatak za imunološko određivanje glikoziranog hemoglobin derivata budući da udio šećera može biti uklonjen iz hemoglobina u jako alkalnom mediju. Ako je upotrebljeno antitijelo povezano s enzimom, enzimska reakcija može biti inhibirana budući da je optimalan pH za upotrebljavane enzime uglavnom od 6 do 8. Imunološka reakcija, također može biti inhibirana visokom pH vrijednošću.

Zbog toga još uvijek postoji potreba za imunološkim postupkom detekcije za određivanje derivata hemoglobina u krvi pri kojem se hemoliza može provesti pri niskim temperaturama - kakve su na primjer sobne temperature, koji ne zahtjeva dugi inkubacijski period za pripremu uzoraka i koji izbjegava upotrebu ekološki štetnih reagensa kao što je cyanid. Kao dodatak, moglo bi biti moguće simultano odrediti ukupni hemoglobin u istom hemolizatu kao i odnos derivata hemoglobina prema ukupnom sadržaju hemoglobina u krvi bez daljnje obrade hemolizata. Predmet prikazanog izuma je da pronađe imunološki detekcijski postupak za određivanje derivata hemoglobina u krvi.

To je postignuto izumom koji je detaljnije opisan u zahtjevima. To je postignuto imunološkim detekcijskim postupkom za određivanje sadržaja derivata hemoglobina u uzorku krvi koji je karakteriziran time da se uzorak obradi s hemolizrajućim sredstvom koje sadrži ionski detergens pri pH od 5 do 9.5, te se derivat hemoglobina određuje imunološki u hemoliziranom uzorku krvi.

Izum se odnosi na postupak za određivanje sadržaja derivata hemoglobina i ukupnog hemoglobina u uzorku krvi koji obuhvaća obradu uzorka krvi s hemolizirajućim sredstvom koje sadrži ionski detergens pri pH od 5 do 9.5, određivanje sadržaja ukupnog hemoglobina fotometrički u hemoliziranom uzorku i određivanje derivata hemoglobina imunološki u hemoliziranom uzorku.

Izum se dodatno odnosi na hemolizirajuće sredstvo koje sardrži ionski detergens s pH od 5 do 9.5, njegovu upotrebu za

pripremu uzoraka krvi za imunološko određivanje derivata hemoglobina i, ukoliko se želi, za određivanje sadržaja ukupnog hemoglobina, te isto tako na test opremu koja sadrži hemolizirajuće sredstvo.

Djelovanje hemolizirajućeg sredstva vodi do lize eritrocita prisutnih u uzorku krvi i do konverzije hemoglobina u specifični hemoglobin kromofor. Hemoglobin kromofor koji se formira, može biti korišten za određivanje sadržaja ukupnog hemoglobina putem njegove karakteristične apsorpcije i za određivanje derivata hemoglobina putem imunološke reakcije specifičnih epitopa. U principu, svi uobičajeni postupci mogu biti upotrebljeni kao imunološki postupci za određivanje kakvi su na primjer sendvič testovi, IEMA testovi, testovi precipitacije i aglutinacije kao i testovi zasnovani na FPIA i CEDIA tehnikama. Mogući su mokri kao i suhi testovi.

Ionski detergensi koji se mogu upotrijebiti u hemolizirajućem sredstvu su anionski detergensi, obično natrium dodecyl-sulfate (SDS), natrium dioctylsulfosuccinate (DONS), kationski detergensi, povoljni su tetradecyltrimethylammonium bromide (TTAB) ili cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) ili zwitter-ionski detergensi, povoljno Zwittergent 3-14. Hemolizirajuće sredstvo je dodano u uzorak krvi u iznosu koji je odgovarajući za lizu eritrocita, konverziju hemoglobina u specifični hemoglobin kromofor i za oslobađanje epitopa iz derivata hemoglobina. Hemolizirajuće sredstvo se dodaje u uzorak krvi u odnosu l:10 do 1:400 tako da je koncentracija ionskog detergensa u rezultirajućoj smjesi 0.01 do 5% težinskog udjela, povoljno 0.5 do 1.5% težinskog udjela. pH vrijednost hemodijalizirajućeg sredstva je u blago kiselom ili blago alkalnom području. pH je povoljan između 5.0 i 9.5, posebno povoljan je 7.4. Svi uobičajeni puferi se mogu upotrijebiti da bi se namjestila pH vrijednost hemolizirajućeg sredstva. HEEES, MES, TRIS ili fosfatni puferi se uobičajeno upotrebljavaju.

Hemolizirajuće sredstvo može sadržavati dodatne reagense koji na primjer služe za uklanjanje interferencije u imunološkoj reakciji, oksidiranje hemoglobina, za uklanjanje zamućenja, za stabiliziranje ili za konzerviranje. Neki detergensi, uključujući SDS, mogu interferirati s imunološkim reakcijama. U rijetkim slučajevima javljaju se zamućenje i flokulacija nakon dodavanja hemolizirajućeg reagensa, a tome ima više razloga. Na primjer SDS je slabo topiv na niskim temperaturama. Iznenađujuće, pronađeno je da ove interferencije mogu biti izbjegnute dodatkom ne ionskih detergensa, povoljno je kad su detergensi polyoxyethylenski etheri kao Brij 35 i 58 ili Triton X100, a isto tako dobri su polyoxyethylenski esteri kao što su Myrj 52 i 59 ili Tween 20. Ne ionski detergensi se obično dodaju u hemolizirajuće reagense u takvim iznosima da, nakon dodatka uzorka, koncentracije rezultirajuće smjese budu od 0.01 do 5% težinskog udjela, te je povoljno od 0.1 do 0.5% težinskog udjela.

U hemolizirajući reagens može se dodati još jedno uobičajeno korišteno sredstvo ferricyanide, na primjer hexacyanoferrate (III). Naravno, uz kationski detergens moguća je pojava precipitacije. Nadalje, kad se upotrebljava ferricyanide neophodna je zaštita od svjetla. Iznenađujuće, pronađeno je da kad se dodaju konzervansi čiji je mehanizam djelovanja zasnovan na oksidativnom ataku thiolnih grupa, kakav je na primjer methyl-isothiazolone ili BronidoxRK, dodatak ferricyanida može biti u potpunosti izostavljen. Ti konzervansi uz kationske detergense rezultiraju smeđe-zeleno obojenim hemoglobin kromoforom čija je maksimalna apsorpcija na 570 nm. Posebna prednost je prvo da dodatak ovih konzervansa vodi do konverzije hemoglobina u specifični hemoglobin kromofor, a isto tako i dobro konzerviranje hemolizirajućeg reagensa, te drugo završna točka hemolize je lako prepoznatljiva promjenom u boji od crvene do smeđe-zelene. Konzervansi se koriste u hemolizirajućim reagensima u koncentracijama 0.005 do 0.2% težinskog udjela, povoljno je od0.01 do 0.02% težinskog udjela.

Hemoliza, konverzija hemoglobina u specifični hemoglobin kromofor, a isto tako i priprema uzorka za testiranje hemoglobin derivata sa stanovišta hemolizirajućih reagensa, se završi nakon 1 do 10 minuta na niskim temperaturama, obično 4 do 37°C i posebno su povoljne sobne temperature (20°C). U većini slučajeva dovoljna je inkubacija od 2 minute za završetak pripreme uzorka.

Uzorak krvi pripremljen na ovaj način je zatim razrijeđen s reakcijskim puferom u odnosu od 1:10 do 1:100. Kao puferi se mogu upotrijebiti svi poznati puferi koji ne interferiraju s imunološkom reakcijom. Uobičajeno se koriste MES i HEPES pufer pri koncentracijama od l0 do 200 mmol/1. pH vrijednost reakcijskog pufera je 5.0 do 8.0. Ako imunološki test uključuje enzimsku reakciju, reakcijski pufer ima vrijednost pH koja odgovara optimalnom pH za enzimsku reakciju. Kao dodatak, reakcijski pufer već može sadržavati reagense neophodne za testiranje derivata hemoglobina posebno specifične vezne dijelove, visoko specifična poliklonska ili monoklonska antitijela.

Iznenađujuće, pokazalo se da je u ovom slučaju, dodatak još jednog detergensa, povoljan je ne ionski detergens kao što je Brij ili Myrj, prednost u osiguravanju optimalnih uvjeta za pripremu uzorka za otkrivanje hemoglobin derivata kakav je glikozirani hemoglobin i isto tako za imunološku reakciju te da izbjegava interferencije. Detergens se dodaje u reakcijski pufer u iznosu koji rezultira koncentracijom od 0.01 do 5% težinskog udjela, povoljna je koncentracija 0.5% težinskog udjela u rezultirajućoj smjesi.

Ako se, kao dodatak određivanju hemoglobin derivata, želi odrediti sadržaj ukupnog hemoglobina u istom uzorku, apsorpcija se mjeri na valnim duljinama od 400 do 650 nm, povoljno je 500 do 650 nm te je posebno povoljno na 546 ili 570 nm u pravilu da bi se odredio sadržaj ukupnog hemoglobina nakon dodavanja reakcijskog pufera. U slučaju mokrog testa, apsorpcija se na ovoj valnoj dužini određuje fotometrijski u kiveti, a u slučaju suhog testa, apsorpcija se može odrediti reflektirajućom fotometrijom nakon nanošenja rezultirajuće smjese na test nosač.

Takav test nosač za određivanje sadržaja ukupnog hemoglobina može biti napravljen vrlo jednostavno jer ne mora sadržavati nikakve kemikalije. Apsorpcijska podloga stavljena na transparentnu foliju nosača je odgovarajuća za jednostavne zahtjeve. Zbog osiguranja reakcije i napretkom razvoja test traka, ostali noseći slojevi mogu biti uključeni kao transportni ili dozirni dijelovi.

Sadržaj ukupnog hemoglobina i sadržaj hemoglobin derivata može također biti određen u različitim obrocima uzorka nakon dodavanja hemolizirajućeg reagensa. U tom slučaju sadržaj ukupnog hemoglobina je određen fotometrički u obroku smjese uzorka i hemolizirajućeg reagensa, ako je neophodno, nakon odgovarajućeg razrijeđivanja. Reakcijski pufer se dodaje u drugi obrok smjese i zatim se derivat hemoglobina odredi imunološki. U principu, za određivanje derivata hemoglobina kakav je HbA1c prikladi su svi suvremeni imunološki postupci. Kao što je prethodno opisano, moguće je proizvesti poliklonska i mono-klonska antitijela protiv derivata hemoglobina, posebno HbA1c, koja specifično vežu epitope derivata hemoglobina (US 4,24-7, 533, SP-A-0 316 306 i EP-A-0 201 187).

Različiti imunološki testovi, vrsta kao i postupak za otkrivanje mjernih signala su poznati postupci u znanosti. Sendvič testovi s enzimskim oznakama (ELISA), IEKA test postupci, RIAs, testovi precipitacije i aglutinacije te homogene imunoanalize kao što su CEDIAR, EMIT ili FPIA tehnologije su na primjer prikladne.

Mokri testovi za imunološko određivanje derivata hemoglobina se obično provode prema TINIA tehnici te korak odijeljivanja nije neophodan u tom slučaju. U uzorak se dodaju analitički specifična antitijela i polyhapten kao aglutinacijska sredstva. Polyhapten se sastoji od nosača npr. albumin, dextran ili IgG, na kojeg je vezano nekoliko epitopa koji mogu vezati specifična antitijela. Budući da se precipitacija antitijela može zbivati jedino putem polyhaptena, povećanje zamućenja koje se može odrediti nefelometrijski ili turbidimetrijski, je vezano uz smanjenje sadržaja analita u uzorku.

Hemoglobin derivat specifično antitijelo je obično već prisutno u reakcijskom puferu. Nakon dodavanja reakcijskog pufera, sadržaj ukupnog hemoglobina u reakcijskoj smjesi može prvo biti određen fotometrijski. Precipitacijska reakcija započinje dodatkom otopine koja sadrži polyhapten. Nakon kratkog inkubacijskog perioda, za kojeg je obično dovoljno 5 minuta, mjeri se rezultirajući turbiditet na prikladnoj valnoj dužini, povoljna je valna dužina od 340 do 600 nm, posebno povoljna je 340 nm te se iz toga odredi koncentracija derivata hemoglobina.

Budući da se mjerenje ukupnog hemoglobina provodi na valnim dužinama od 500 do 650 nm, povoljno 546 ili 570 nm, dva mjerenja ne interferiraju jedno s drugim i mogu zbog toga biti provedena jedno iza drugoga u jednoj kiveti u istoj reakcijskoj otopini.

Kada se priprema otopina polyhaptena, tj. tekući galenski oblik polyhaptena ili glikoziranog proteina ili peptida, pronađeno je da nije stabilna u fosfatnom puferu koji se obično koristi pri pH od 7.0 do 7.5 i može dovesti do raspadanja glikoproteina za vrijeme dužeg stajanja. Takve nestabilnosti glikoziranih proteina u fosfatnom puferu su poznate iz literature Ahmed i suradnici, J. Biol. Ghem. 261 (1986), 4889-4894. Stabilizacija glikoziranih peptida, proteina i polyhaptena je postignuta upotrebom MES pufera pri koncentraciji od 5 do 200 mmol/l, povoljno 20 do 50 mmol/l te kod pH 5.0 do 8.0, povoljno između 6.0 do 6.5, te istovremenim dodavanjem EDTA ili ekvivalentnog kompleksnog sredstva odgovarajuće koncentracije 1 do 50 mmol/l, posebno je povoljno 0.1 do 20 mmol/l. Dodavanje albumina goveđeg seruma (BSA) određene koncentracije od 0.1 do 2%, posebno povoljno 1%, ima daljnji pozitivan učinak na stabilnost otopine polyhaptena. Ovakva otopina polyhaptena može biti uskladištena tokom više od 12 mjeseci na 4°C bez opažanja uočljivih nestabilnosti polyhaptena ili glikoziranih proteina ili peptida. Kad se podvrgne tokom tri tjedna temperaturi od 35°C, uočava se smanjenje signala od svega 15 do 20% od originalnog apsorpcijskog signala.

Imunološko određivanje derivata hemoglobina putem suhog testa se obično provodi prema IEMA test tehnici. Nakon dodavanja reakcijskog pufera u hemalizirani uzorak krvi, doda se specifično enzimatski označeno antitijelo. U preferiranom obliku, antitijelo je već prisutno u reakcijskom puferu. Nakon kratke inkubacije, smjesa se aplicira na nosač testa. Slobodna enzimatski označena antitijela su vezana na matricu epitopa tj. test nosač zona na koju je povezano nekoliko epitopa na koje se mogu vezati specifična antitijela. U slijedećoj zoni, test zoni, kompleks derivata hemoglobina i označenog antitijela je određen reflektirajućom fotometrijom, konverzijom prikladnog enzimatskog supstrata. Supstrat može biti prisutan u test zoni ili se može postići pristup dovođenjem test zone u kontakt s slijedećom zonom koja sadrži supstrat.

Na tržište su stavljeni reagensi koji su neophodni za postupak prema prikazanom izumu u obliku test opreme koja, kao dodatak hemolizirajućem sredstvu sadrži ostale reagense u otopljenom ili liofiliziranom obliku ili aplicirane na test nosač u najmanje dva odvojena pakiranja.

Prikazani izum je objašnjen i slijedećim primjerima:

Primjer 1:

Simultano određivanje ukupnog hemoglobina i HbAlc u mokrom testu

Eksperimenti su provedeni na Hitachi 717 od Boehringer Mannheim GmbH. Sadržaj ukupnog hemaglobina je mjeren fotometrijski na valnoj dužini 546 nm. Imunološka detekcija HbAlc je provedena turbidimetrijskim mjerenjem na 340 nm prema TINIA test tehnici. Sva određivanja i inkubacije su provedene na temperaturi od 37°C.

Upotrebljene su slijedeće otopine:

Hemolizirajući reagens:

20 mM NaPO4 pufer pH 7.0

1.0 % SDS

0.1 % natriura azide

0.002 % kalium hexacyanoferrate (III)

0.5 % Brij 35

Reakcijski pufer

20 mM MES pufer pH 6.0

150 mM natrium chloride

3.0 % PEG 6000

0.5 % Brij 35

0.1 % albumin goveđeg seruma

0.1 °/o natrium azide

10 mM EDTA

6 mg/ml PAB <HbA1c> S-IgG (DE) (polyklonska ovčja AB nasuprot HbAlc) ili

100μg/ml MAB <HbAlc> M-IgG (DE) (monoklonska mišja AB nasuprot HbAlc)

Polyhapten otopina

20 mM MES pufer pH 6.0

150 mM natrium chloride

6.0 % PEG 6000

0.5 % Brij 35

0.1 % albumin goveđeg seruma

25 μg/ml polyhapten HbAlc-β-l-4- (cys, MHS)-BSA 18:1

Hemolizirajući reagens je dodan u uzorak krvi u odnosu 100:1 i inkuhiran tokom 2 minute na 25°C. Doda se 250 μl reakcijskog pufera u 50 μl hemoliziranog uzorka. Nakon 4 minute, izmjeri se apsorpcija ukupnog hemoglobina na 546 nm (A1). Apsorpcija na 340 nm (A2) je mjerena minutu kasnije i zatim je dodano 50 μ1 otopine polyhaptena pipetom te inkulirano tokom 5 minuta. Kasnije se izmjeri turbiditet na 340 nm (A3).

Da bi se odredila vrijednost HbA1c u g/dl, grafički je prikazana apsorpcijska razlika ΔA= A3 - k.A2 nasuprot HbA1c koncentraciji, te je određena grafički.

[image]

Koncentracija ukupnog hemoglobina se proračuna iz konstantnog faktora K množenjem s A1 (K= molarni ekstinkcioni koeficijent hemoglobin kromofora x faktor razrijeđenja). EDTA ukupne krvi je razrijeđen s različitim iznosima hemolizirajućeg reagensa da bi se dobila kalibracijska krivulja.

Kalibracijske krivulje su prikazane dijagramima u slikama 1 i 2. Na slici 1 koncentracija ukupnog hemoglobina je grafički prikazana nasuprot A1. To daje linearni odnos. Tako je moguće to umnožavati s konstantnim faktorom prilikom proračunavanja. Na slici 2 je grafički prikazana apsorpcijska razlika ΔA = A3 - k.A2 nasuprot sadržaju HbA1c.

U slijedećim eksperimentima prvo je pipetom dodana otopina polyhaptena u hemolizirani uzorak krvi i nakon 5 minuta inkubacije započeta je reakcija precipitacije dodavanjem reakcijskog pufera koji sadrži specifično antitijelo. Ovaj dio s pipetiranjem vodi do značajno niže osjetljivosti određivanja HbAlc (slika 3) u usporedbi s dijelom pipetiranja prethodno spomenutim u kojem se prvo dodaje antitijelo, a zatim polyhapten.

Primjer 2:

Test trake za određivanje ukupnog hemoglobina i HbAlc

300 μ1 hemolizirajućeg reagensa je dodano u 30 μl ukupne krvi i inkubirano tokom 10 minuta na 20°C. Hemolizirajući reagens se sastoji od 0.18% SDS otopine koja je puferirana na pH 7.

Da bi se odredio ukupni hemoglobin, 32 μl hemoliziranog krvnog uzorka je naneseno na test traku. Struktura test trake je prikazana na slici 4. Ona se uglavnom sastoji od netretiranog staklenog dozirnog dijela (1), netretiranog staklenog transportnog dijela (2), netretiranog polyester vlakna (3) i transparentne polykarbonatne folije (4). Test traka ne sadrži dodatne kemikalije. Upotrebljavajući ovaj eksperimentalni postupak, sadržaj ukupnog hemoglobina u uzorku krvi može biti izmjeren veoma precizno na valnoj dužini od 576 nm.

Dobiveni su koeficijenti varijacije ispod 2.5% (Tabela 1).

Tabela 1:

Određivanje ukupnog hemaglobina

Koeficijent varijacije (CV) je proračunat za svaki slučaj od 10 pojedinačnih mjerenja.

[image]

Da bi se odredila koncentracija HbAlc, dodano je 1200 μl reakcijskog pufera u 32 μ1 hemoliziranog uzorka i inkubirano tokom 10 minuta. Reakcijski pufer se sastoji od 100 mM Hepes, pH 7.4, 100 mM NaCl i 0.1% Brij 35 s MAB-enzim konjugatom. 32 μl smjese se nanese na test traku koja je prikazana na slici 5. Slobodni antitijelo-enzim konjugat je vezan na epitop matricu (11). U susjednoj zoni, transportni dio (12), HbAlc antitijelo-enzim kompleks je određen reflektirajućom fotometrijom reakcijom supstrata nakon što je dio sa supstratom (13) doveden u kontakt sa transportnim dijelom (12). (Tabela 2).

Tabela 2:

Određivanje koncentracije HbAlc putem test traka Koeficijent varijacije (CV) je proračunat za svaki slučaj od 10 pojedinačnih mjerenja.

[image] Primjer 3:

Utjecaj različitih ionskih detergensa na određivanje HbAlc

Eksperimenti su izrađeni kako je opisano u primjeru 1. Hemolizirajući reagens ima slijedeći sastav:

20 mM NaPO4 pofera pH 7.2

0.1 % natrium azide

0.02 % kalium hexacyanoferrate (III)

0.5 % Brij 35

Ionski detergensi prikazani u tabeli 3 su bili prisutni u koncentracijama prikazanim u tabeli.

U slučaju TTAB i CTAB nije uključen kalium hexacyanoferrate (III) u hemolizirajući reagens jer dolazi do precipitacije s tim detergensima.

Sastav reakcijskog pufera i otopine polyhaptena odgovara primjeru 1.

Kao uzorak krvi je upotrebljen standard sa sadržajem HbAlc od 3.2 g/dl. Svi ionski detergensi ovdje testirani, rezultiraju lizom stanica i oslobađanjem epitopa. Anionski detergens SDS i kationski detergensi TTAB i CTAB su se pokazali najprihvatljivijima.

Tabela 3:

HbAlc određivanje

Utjecaj različitih ionskih detergensa u hemolizirajućem reagensu.

Apsorpcija je mjerena na 340 nm.

[image]

Primjer 4:

Ovisnost niza dinamičkog mjerenja određivanja HbAlc o koncentraciji Brij 35

Eksperimenti su provedeni kao u primjeru 1, u hemolizirajućem reagensu je konstantno upotrebljavan 1% SDS. Koncentracija Brij 35 u reakcijskom puferu je mjenjana unutar niza prikazanog u tabeli 4. Standard HbAlc spomenut u primjeru 3 je služio kao uzorak.

Mjerene vrijednosti rastu od 47 mA za kontrolni uzorak do 233 mA uz dodatak 0.1% Brij 35. Preferirana koncentracija Brij 35 je od 0.1 do 1.0%.

Tabela 4:

Utjecaj različitih koncentracija Brija u reakcijskom puferu na određivanje HbAlc

Apsorpcija je mjerena na 340 nm

[image] Primjer 5:

Utjecaj različitih detergensa u reakcijskom puferu na određivanje HbAlc

Eksperimenti su provedeni analogno onima iz primjera 4. U reakcijskom puferu su bili upotrebijeni detergensi prikazani u tabeli 5. Niz dinamičkog mjerenja je izveden uglavnom dodavanjem Brij 35, 56 i 58 kao i Myrj 52 i 59. Naravno, ostali ne ionski detergensi kao Triton i zwitterionski detergensi kao što je Zwittergent 3-14- također su pokazali osnovno pozitivni učinak u usporedbi s kontrolnim.

Tabela 5:

Utjecaj detergensa u reakcijskom puferu

[image]

Primjer 6:

Simultano određivanje ukupnog hemoglobina i HbAlc sa specifičnim smeđe-zelenim hemoglobin chromaphorom

Eksperimenti su provedeni na Hitachi 717 Boehringer Mannheim GmbH. Sadržaj ukupnog hemoglobina je mjeren fotometrijski na valnoj dužini 570 nm. Imunološko određivanje HbAlc je provedeno prema TINIA test tehnici turbidimetrijskim mjerenjem na 340 nm. Sva određivanja i inkubacije su provedene na temperaturi 37°C

Upotrebijene su slijedeće otopine:

Hemolizirajući reagens:

20 mM NaPO4 pufer pH 7.4

1.0 % tetradecyltrimethylammonium bromide (TTAB)

0.01 % methylisothiazolone

0.02 % BronidoxR K

0.5 % Brij 35

10 mM EDTA

Reakcioni pufer:

20 mM MES pufer pH 6.0

150 mM natrium chloride

3.0 % PEG 6000

0.5 % Brij 35

0.01 % methylisothiazolone

0.02 % BronidoxR K

1.2 mg/ml PAK <HbAlc> S-IgG (DE) (polyklonska ovčja AB nasuprot HbAlc)

Otopina polyhaptena:

20 mM MES pufer pH 6.0

150 mM natrium chloride

6.0 % PEG 6000

0.5 % Brij 35

20 μm/ml polyhapten

Hemolizirajući reagens je dodan u uzorak krvi u odnosu 100:1 i inkubiran tokom 2 minute na 25°C. 250 μ1 reakcijskog pufera je dodano u 10 μ1 hemoliziranog uzorka. Nakon 4 minute je mjerena apsorpcija ukupnog hemoglobina na 570 nm (A1). Nakon jedne minute mjerena je apsorpcija na 340 nm (A2) i zatim pipetom dodano 50 μl otopine polyhaptena i inkubirano tokom pet minuta. Nalon toga je mjeren turbiditet na 340 nm (A3).

Da bi se odredila vrijednost HbA1c u g/dl, razlika u apsorpciji ΔA = A3 - k.A2 je grafički prikazana nasuprot HbAlc, te

je određena grafički.

[image]

Koncentracija ukupnog hemoglobina je proračunata iz konstantnog faktora K množenjem s Al (K= molarni ekstinkcioni koeficijent hemoglobin chromophora x faktor razrijeđenja). Karakterističan apsorpcijski spektar je prikazan na slici 6. EDTA-ukupna krv s poznatim hemoglobinom i sadržajem HbAlc složi kao osnova. EDTA-ukupna krv se razrijedi s različitim iznosima hemolizirajućeg reagensa da bi se dobila kalibracijska krivulja.

Kalibracijske krivulje su grafički prikazane na slici 7 i slici 8. Na slici 7 grafički je prikazana koncentracija ukupnog hemoglobina nasuprot A1. To daje linearni odnos. Tako se može množiti s konstantnim faktorom K u proračunima. Na slici 8 je grafički prikazana razlika u apsorpciji ΔA = A3 - k.A2 nasuprot sadržaju HbAlc.

Claims

1. Postupak za određivanje sadržaja derivata hemoglobina u uzorku krvi, naznačen time, da je uzorak krvi obrađen s hemolizirajućim reagensom koji sadrži ionski detergens s pH od 5 do 9.5 i da je derivat hemoglobina određen imunološki u hemoliziranom uzorku krvi.

2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da je uzorak krvi obrađen tokom 10 minuta s hemolizirajućim reagensom na temperaturama od 4 do 37°C.

3. Postupak prema zahtjevu 1 ili 2, naznačen time, da hemolizirajući reagens kao dodatak sadrži ne ionski detergens.

4. Postupak prema jednom od zahtjeva od 1 do 3, naznačen time, da je reakcijski pufer koji sadrži ne ionski ili zwitterionski detergens dodan u hemolizirani uzorak, te se derivat hemoglobina određuje imunološki u rezultirajućoj smjesi.

5. Postupak prema jednom od zahtjeva od 1 do 4, naznačen time, da je derivat hemoglobina HbAlc.

6. Postupak za određivanje sadržaja derivata hemoglobina i ukupnog hemoglobina u uzorku krvi, naznačen time, da je uzorak krvi obrađen s hemolizirajućim reagensom koji sadrži ionski detergens s pH od 5 do 9.5; da je sadržaj ukupnog hemoglobina određen u hemoliziranom uzorku; i da je derivat hemoglobina određen imunološki u hemoliziranora uzorku.

7. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time, da je sadržaj ukupnog hemoglobina određen mjerenjem karakteristične apsorpcije specifičnog hemoglobin chromophora.

8. Postupak prema jednom od zahtjeva 6 ili 7, naznačen time, da hemolizirajući reagens kao dodatak sadrži ne ionski detergens.

9. Postupak prema jednom od zahtjeva 6 ili 7, naznačen time, da je reakcijski pufer koji sadrži ne ionski ili zwitterionski detergens dodan u hemolizirani uzorak te je u rezultirajućoj smjesi određen ukupni hemoglobin i derivat hemoglobina.

10. Hemolizirajući reagens, naznačen time, da sadrži ionski detergens s pH od 5 do 9.5.

11. Hemolizirajući reagens prema zahtjevu 10, naznačen time, da sadrži ne ionski detergens.

12. Hemolizirajući reagens prema jednom od zahtjeva 10 ili 11, naznačen time, da je uključeno i prikladno oksidirajuće sredstvo ili konzervans čiji je mehanizam djelovanja osnovan na oksidativnom napadu thiolnih grupa.

13. Upotreba hemolizirajućeg reagensa prema jednom od zahtjeva 10 do 12, naznačen time, da obuhvaća imunološko određivanje derivata hemoglobina ili simultano određivanje derivata hemoglobina i sadržaja ukupnog hemoglobina u uzorku.

14. Test oprema za imunološku detekciju derivata hemoglobina, naznačena time, da se sastoji od najmanje dva odijeljena pakiranja od kojih jedno sadrži hemolizirajući reagens prema jednom od zahtjeva 10 do 12, a drugo sadrži daljnju smjesu reagensa koja sadrži reagense neophodne za imunološku detekciju derivata hemoglobina.

15. Test oprema prema zahtjevu 14, naznačena time, da su reagensi neophodni za imunološki test naneseni na test nosač.

16. Stabilizacija otopine glikoziranog proteina, peptida ili polyhaptena, naznačena time, da je upotrebljen MES pufer pH 5.0 do 8.0, te otopina sadrži EDTA.

17. Stabilizacija otopine prema zahtjevu 16, naznačena time, da je dodan BSA.