DE69617374T2

DE69617374T2 - Verfahren zum immunologischen Nachweis eines Hämoglobinderivates und Behandlungsreagenz zur Verwendung darin

Info

Publication number: DE69617374T2
Application number: DE69617374T
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Amano; Hiroshi Shinoki
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1995-12-14
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2002-07-25
Anticipated expiration: 2016-12-14
Also published as: DE69617374D1; JP3269765B2; EP0779513B1; JPH09166594A; US6027907A; EP0779513A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines Hämoglobinderivats, vorzugsweise von glyciertem Hämoglobin als Hämoglobinderivat, und speziell von Hämoglobin A1c. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Behandlungsreagens, das in dem oben genannten Bestimmungsverfahren eingesetzt wird.
Hämoglobin (Hb) ist ein in Erythrozyten vorkommendes respiratorisches Pigment, das in großem Umfang für den Sauerstofftransport verantwortlich ist. Ein Hämoglobinmolekül umfasst vier Polypeptid-Untereinheiten (jeweils zwei α- Kettensysteme und β-Kettensysteme); jede Untereinheit wird durch Assoziation eines Globinproteins mit einem Hämmolekül, das ein Eisen-Protoporphyrin-Komplex ist, gebildet. Die Hämoglobin-Hauptklasse (mehr als 90%) wird in normalem Erwachsenen-Hämoglobin (HbA: zur Unterscheidung von glyciertem Hämoglobin HbA&sub1;, das nachfolgend noch beschrieben wird, auch als HbA&sub0; bezeichnet) gefunden und hat die Zusammensetzung α&sub2;ß&sub2;-Untereinheiten; Spurenkomponenten, wie z. B. HbA&sub2; (α&sub2;β&sub2;) werden auch beim normalen Erwachsenen gefunden.
Beim Erwachsenen-Hämoglobin HbAs gibt es verschiedene Klassen von Hämoglobinderivaten. Die Bestimmung der Gehalte an solchen Hämoglobinderivaten im Blut hat bei verschiedenen Krankheitsbildern an Bedeutung gewonnen. Unter den Klassen der Hämoglobinderivate erweist sich glyciertes Hämoglobin als besonders wichtig. Dieses glycierte Hämoglobin ist der generische Ausdruck zur Bezeichnung der Fraktionen HbA1a1. HbA1a2, HbA1b und HbA1c, in die HbA durch Ionenaustauscherharzfraktionierung eingeteilt wird. Es wird als HbA&sub1; bezeichnet (auch glykosyliertes Hämoglobin genannt). Alle diese Unterklassen der glycierten Hämoglobine haben dieselbe Primärstruktur, die durch Bildung eines Aldimins (Schiff'sche-Base) durch die Aminogruppe des N-terminalen Valins in der Kette der β-Untereinheit von normalem Hämoglobin HbA mit Glucose (oder Glucose-6- phosphat oder Fructose) mit anschließender Bildung eines Ketoamins durch Amadori-Umlagerung stabilisiert ist.
Insbesondere das glycierte Hämoglobin, das an Glucose gebunden ist, wird als HbA1c bezeichnet (glykosyliertes Hämoglobin, das gelegentlich im Folgenden auch als Hämoglobin A1c bezeichnet wird); es bildet den größeren Teil der glycierten Hämoglobine. Der Anteil an glykosyliertem Hämoglobin ist proportional zum Blutglucosespiegel und liegt bei etwa 5% des Gesamthämoglobins Hb eines normalen erwachsenen Menschen. Es ist möglich, dass sich Spiegel in den Bereich von 8 bis 16% bei Patienten mit Diabetes erhöhen. Die Bestimmung der Menge an glykosyliertem Hämoglobin HbA1c wird daher als guter Index zur Kontrolle des Kohlenhydrat- Stoffwechsels angesehen. Da das Ketoamin, das durch eine nichtenzymatische Reaktion mit Blutglucose gebildet wird, stabil ist, werden die glykosylierten Hämoglobine HbA1c während des Erythrozytenlebens (durchschnittlich 120 Tage) nicht zersetzt. Der Hämoglobin A1c-Gehalt im Blut wird daher als Hinweis auf den Blutglucosegehalt in den vergangenen ein bis zwei Monaten angesehen. Das Ergebnis ist, dass der Blutglucosespiegel in den letzten zwei Monaten oder so auf der Basis des Verhältnisses von HbA1c zu dem Gesamthämoglobin Hb bestimmt werden kann. Somit wird die Analyse des Hämoglobins A1c im Blut als Index verwendet, der eine Langzeitkontrolle des Blutglucosespiegels im Gegensatz zum Kurzzeitindex, z. B. dem Blutglucosespiegel, der im Allgemeinen kurz nach einer Mahlzeit ansteigt, erlaubt.
Für die Analyse des Hämoglobins A1c wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Diese Verfahren basieren im Allgemeinen auf Techniken, wie z. B. Elektrophorese, Ionenaustauscherchromatographie und Affinitätschromatographie.
Diese Verfahren eignen sich nicht für die klinische Untersuchung, die zahlreiche Proben verarbeiten muss, da sie teure analytische Apparaturen erfordern und für eine Analyse viel Zeit beanspruchen. In dieser Hinsicht bieten immunologische Analyseverfahren, wie der Immunoassay, der Antikörper gegen Hämoglobin A1c verwendet, den Vorteil, dass relativ einfache Verfahren eingeführt werden und großer Zeitaufwand vermieden wird. Besonders, weil spezifische Antikörper gegen den glykosylierten N-terminalen Rest von HbA1c als spezifische Antikörper gegen HbA1c z. B. in den ungeprüften japanischen Offenlegungsschriften (Kokai) Nrn. 8743/1989, 172064/1986 und 280571/1986 beschrieben sind, wurden verschiedene immunologische Bestimmungsverfahren für HbA1c entwickelt (z. B. ungeprüfte japanische Offenlegungsschriften (Kokai) Nrn. 277967/1988 und 46566/ 1991).
Auf dem Gebiet der immunologischen Bestimmung von HbA1c werden verschiedene Behandlungen versucht, um durch Behandlung des HbA1c in einer gegebenen Probe eine Analyse mit größerer Empfindlichkeit zu realisieren. Die meisten der Verfahren, die für eine solche Behandlung eingeführt sind, sind allerdings nicht einfach auf einen Enzymimmunoassay anzuwenden, da die Behandlungen in diesen Verfahren hauptsächlich auf dem Denaturierungsprozess von HbA1c, das ein Glykoprotein ist, beruhen.
Die ungeprüfte japanische Offenlegungsschrift Nr. 155268/ 1989 (entspricht U. S. 4 970 171 und EP-A-0 315 864), beschreibt z. B. ein Verfahren zur Bestimmung von HbA1c in Blut, indem Hämoglobin in Blut mit Thiocyanat denaturiert wird und außerdem mit einem Oxidationsmittel, z. B. Ferricyanid in Methämoglobin umgewandelt wird. In diesem Verfahren wird Hämoglobin zu Methämoglobin, das einen spezifischen Absorptionspeak bei 540 nm hat, umgewandelt oder denaturiert, welches in einfacher Weise nachgewiesen werden kann, wodurch die Bestimmung des Gesamthämoglobingehalts erleichtert wird. Das Oxidationsmittel verstärkt die Wirksamkeit der Denaturierung des Thiocyanat-Denaturierungsmittels; dadurch wird die Nachweisempfindlichkeit für HbA1c in der Probe verbessert. Obgleich es wünschenswert ist, dass diese Behandlung auf einen Immunoassay zur Analyse des HbA1c angewendet werden kann, ist die Realisierung einer solchen Anwendung schwierig, da das markierte Enzym ebenfalls durch Thiocyanat oder das Oxidationsmittel angegriffen und inaktiviert wird. Obgleich der Enzymimmunoassay in wirksamer Weise an die Bedingungen, dass das Thiocyanat und das Oxidationsmittel nach Beendigung der Behandlung aus der Probe entfernt werden, angepasst werden kann, werden zur Entfernung der Mittel lästige Arbeitsgänge benötigt. Da dieses Verfahren ein Cyanid verwendet, das für die Umwelt gefährlich ist, tritt außerdem das Problem der Abfallflüssigkeit auf.
Die ungeprüfte japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 20452/1989 (entsprechend U. S. 4 800 167 und EP-A- 0 286 915) offenbart ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamthämoglobingehalts ohne Verwendung eines Cyanids. Dieses Verfahren verwendet als Denaturierungsreagens eine wässrige Polyvinylpyrrolidon(PVP)-Lösung, die auf einen Level im Bereich von pH 12 bis 14 alkalisch gemacht ist. Dieses Denaturierungsreagens soll PVP zur Stabilisierung des Hämoglobins verwenden, wenn es mit Alkali solubilisiert wird; dadurch wird ein Produkt mit einem Hauptabsorptionspeak bei der Wellenlänge von etwa 575 nm erhalten. Die Anwendung dieses Verfahrens zur Bestimmung von HbA1c ist denkbar. Allerdings erweist sich eine solche Anwendung als ungünstig, da die Zuckergruppierung des HbA1c- Moleküls in Gegenwart von starkem Alkali möglicherweise gespalten oder aufgebrochen wird, wodurch sich die Antigenität des HbAlc-Moleküls ändert. Die Bestimmung von HbA1c durch den Enzymimmunoassay hat auch den Nachteil, dass auch die enzymatische Aktivität des markierenden Enzyms des zu unterdrückenden Antikörpers leidet, da die meisten Enzyme ihre optimalen pH-Werte im Allgemeinen im neutralen Bereich (pH 6 bis 8) haben. Noch wichtiger ist, dass die immunologische Reaktion (Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion) selbst möglicherweise durch die Bedingungen eines hohen pH unterdrückt wird. Daher wird dieses Behandlungsverfahren nicht einfach auf den Immunoassay angewendet.
Die ungeprüfte japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 11510/1996 (entspricht DE 4 206 932A) offenbart ein Verfahren, bei dem eine Blutprobe mit einem Hämolysereagens behandelt wird, das ein ionisches Detergens (oberflächenaktives Mittel) enthält, das einen pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 9,5 hat. Der Gesamthämoglobingehalt in der hämolysierten Probe wird durch kolorimetrische Bestimmung analysiert. Die Menge an Hämoglobin A1C in der hämolysierten Probe wird durch immunologische Bestimmung analysiert. Beispiele für ionische Detergentien, die bei dieser Behandlung zu verwenden sind, umfassen anionische Detergentien, z. B. SDS (Natriumdodecylsulfat) und kationische Detergentien, z. B. TTAB (Tetradecyltrimethylammoniuxabromid). Diese ionischen Detergentien sind auf dem Fachgebiet als Hämolysereagentien wohl bekannt. Da diese ionischen Detergentien auch eine Wirkung zur Denaturierung von Proteinen haben, haben sie einen nachteiligen Effekt auf die markierten Enzyme und hemmen unvermeidlich deren enzymatische Aktivität. Im heterogenen Enzymimmunoassay, der eine B/F- Trennung erfordert, kann das ionische Detergens gleichzeitig mit der B/F-Trennung nach der Antigen-Antikörper- Bindungsreaktion entfernt werden, so dass ein nachteiliger Effekt durch das ionische Detergens auf die enzymatische Aktivität verhindert werden kann. Wenn das Behandlungsverfahren mit ionischen Detergentien für den homogenen Enzymimmunoassay, der die B/F-Trennung nicht erfordert, übernommen wird, bleibt allerdings das ionische Detergens in der behandelten Probenlösung zurück und hemmt die Enzymaktivität des markierenden Enzyms, was in einer geringeren Empfindlichkeit für praktische Verwendungen resultiert.
Die japanische Patentschrift Nr. 23891/1995 (EP-A-185 870, U. S. 4 647 654) offenbart ein Verfahren, bei dem ein Protein, z. B. HbA1c, mit einem chaotropen Reagens behandelt und denaturiert wird, wodurch das Epitop des Proteins freigelegt wird und die Affinität desselben zu einem Antikörper verstärkt wird. Dieses Verfahren ist für eine schnelle Bestimmung ungeeignet, da der Schritt der Denaturierung einen langen Zeitraum zwischen einer und mehreren Stunden bei Temperaturen unter 37ºC beansprucht. Da das in diesem Verfahren verwendete Denaturierungsreagens Guanidin-Salzsäure, Harnstoff, SDS oder Protease ist, ist vorgesehen, die Enzymaktivität, in der gleichen Weise wie in den oben beschriebenen Techniken des Standes der Technik zu inaktivieren. Für einen homogenen Enzymimmunoassay ist dieses Verfahren daher in der Praxis zur Erzielung einer notwendigen HbA1c-Bestimmung ungeeignet.
JP 2 226 0710 (Derwent Abstract AN-90-316861) beschreibt die Bestimmung von Glykoprotein durch Inkontaktbringen von Glykoprotein mit einem Reaktionsmittel, das durch Behandlung eines Trägers, der mit Dihydroxyborylglykoprotein immobilisiert ist, mit einer Markierungsverbindung, die fähig ist, reversibel mit Dihydroxyborylglykoprotein zu reagieren, erhalten wird, und Bestimmung der Menge der freigesetzten Markierungsverbindung. EP 0 573 972 offenbart ein Verfahren zur Messung von glyciertem Hämoglobin, bei dem eine Probe mit einem Anti-Hämoglobin-Antikörper, der an eine feste Phase gebunden ist, in Kontakt gebracht wird. Beide Referenzen beschreiben keine Verfahren, die die Behandlung der Probe mit einem Reagens, das 2-Butanol enthält, umfasst.
In Anbetracht der vorstehend beschriebenen Gegebenheiten wurde die vorliegende Erfindung vollendet. Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur immunologischen Bestimmung eines Hämoglobinderivats, das eine Analyse des Hämoglobinderivats durch einfache und schnelle Arbeitsweise mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht und insbesondere einen Immunoassay, der ein homogenes System umfasst, anpasst. Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Behandlungsreagenses zur Verwendung in dem oben beschriebenen Bestimmungsverfahren.
Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur immunologischen Bestimmung eines Hämoglobinderivats gelöst; umfassend die Schritte:
- Behandeln einer Probenlösung, die das Hämoglobinderivat enthält, mit einem Behandlungsreagens, das 2-Butanol enthält, und
- immunologisches Analysieren der behandelten Probenlösung zur Bestimmung der Menge des Hämoglobinderivats in der Probenlösung.
Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch die Bereitstellung eines Behandlungsreagenses zur Behandlung eines Hämoglobinderivats gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es 2-Butanol und ein Hämolyseagens enthält.
Fig. 1 ist ein Diagramm, das den Effekt einer 2-Butanol- Behandlung auf den homogenen Enzymimmunoassay zeigt. Im Diagramm kennzeichnet - - die Resultate, die mit einem Behandlungsreagens 1 erhalten werden, das kein 2-Butanol enthält (Vergleichsbeispiel); und -Δ- kennzeichnet die Resultate, die mit einem Behandlungsreagens 2 erhalten werden, das 2-Butanol enthält (gemäß der vorliegenden Erfindung);
Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Effekte der Behandlung, die 2-Butanol bei unterschiedlichen Konzentrationen verwendet, auf den homogenen Enzymimmunoassay zeigt; und
Fig. 3 ist ein Diagramm, das eine Eichkurve zeigt, die im Bestimmungsverfahren in Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nach einem Behandlungsreagens für Hämoglobin A1c gesucht, das es möglich macht, dass ein homogener Enzymimmunoassay mit hoher Empfindlichkeit ohne Hemmung der Enzymaktivität des markierenden Enzyms durchgeführt wird. Nach Untersuchung zahlreicher wasserlöslicher organischer Lösungsmittel haben die Erfinder festgestellt, dass nur die Behandlung mit 2-Butanol den homogenen Enzymimmunoassay in seiner Nachweisempfindlichkeit verbessert. Die Erfinder haben auch festgestellt, dass 2-Butanol die Enzymaktivität des Markierungsenzyms nicht hemmt.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass der Effekt der Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit bei anderen wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, z. B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, 1-Butanol, t-Butylalkohol, 1,2- Dihydroxybutan, 1,3-Dihydroxybutan, 1,4-Dihydroxybutan, 2,3-Dihydroxybutan, 1,5-Dihydroxypentan, 2,4-Dihydroxypentan und Acetonitril, fehlt.
Das 2-Butanol (CH&sub3;CH(OH)CH&sub2;CH&sub3;, sek.-BuOH) im erfindungsgemäßen Behandlungsreagens ist bei einer Konzentration, bei der die Endkonzentration bei der Behandlung nicht mehr als etwa 20 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1,0 bis etwa 5,0 Gew.-% sein kann, für das Hämoglobinderivat wirksam. Bei einer Konzentration, die diesen Bedingungen genügt, wird 2- Butanol keine nachteilige Wirkung auf die Enzymaktivität der Markierungsenzyme, die gängigerweise im Enzymimmunoassay eingesetzt werden, haben. Vorzugsweise wird die Behandlung mit 2-Butanol bei einer Temperatur zwischen etwa 15ºC und etwa 40ºC, bevorzugter bei einer Temperatur zwischen etwa 20ºC und etwa 38ºC durchgeführt. Bei Temperaturen in diesem Bereich ist die Behandlung mit 2-Butanol innerhalb von fünf Minuten beendet.
Das Behandlungsreagens der Erfindung wird in einer Lösung auf Wasserbasis eingesetzt. Die Lösung des Behandlungsreagenses auf Wasserbasis beinhaltet eine Hämolysereagenskomponente. Es kann auch einen pH-Puffer und ein Stabilisierungsreagens eingearbeitet enthalten.
Die Probe, die ein Hämoglobinderivat, z. B. Hämoglobin A1c enthält, kann eine Vollblutprobe sein. In diesem Fall kann die Hämolysewirkung, die durch 2-Butanol verursacht wird, ausgenützt werden. Die Blutprobe kann andernfalls vorbereitend mit einem bekannten Hämolysereagens zur Freisetzung von Hämoglobin aus Erythrozyten behandelt werden und kann dann einer Denaturierungsbehandlung mit 2-Butanol unterzogen werden. Ein im Handel erhältliches Hämolyseagens, oberflächenaktives Mittel oder Saponin können zu diesem Zweck eingesetzt werden. Alternativ kann die Hämolyse durch einen osmotischen Schock unter Verwendung eines nicht-isotonen Verdünnungsmittels oder einer Hochkonzentrations-Pufferlösung erreicht werden. Bei Bedarf können die Erythrozytenmembranen durch Ultraschallzerkleinerung aufgebrochen werden. Die Hämolyse kann durch Gefrieren und Tauen durchgeführt werden.
Das Behandlungsreagens enthält sowohl 2-Butanol wie auch ein Hämolysereagens, um die Hämolysebehandlung und gleichzeitig die Behandlung mit 2-Butanol durchzuführen. Im klinischen Standardtest erweist sich dieses Verfahren wegen der Einfachheit der Arbeitsweise als zweckdienlich. Wenn ein oberflächenaktives Mittel als Hämolysereagens verwendet wird, ist es bevorzugt, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel zu verwenden, da das nichtionische oberflächenaktive Mittel auf die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms keinen hemmenden Effekt hat. Die Endkonzentration des oberflächenaktiven Mittels im Schritt der Zugabe desselben zur Blutprobe (vor der Hämolysebehandlung) liegt im Bereich von 0,01% bis 5%, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5%.
Vorteilhafte Beispiele für das nichtionische oberflächenaktive Mittel, das vorteilhafterweise zu verwenden ist, umfassen:
- Alkylphenolpolyethylenoxid-Kondensate, z. B. p- (1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100, das durchschnittlich 9 oder 10 Oxyethyleneinheiten enthält, Triton X-165, das durchschnittlich 16 Oxyethyleneinheiten enthält, und Triton X-405, das durchschnittliche 40 Oxyethyleneinheiten enthält, Chemical Abstracts-Registrier-Nr. 9002-93-1);
- Alkylphenolpolyglycidol-Kondensate, z. B. p-Nonylphenoxypolyglycidol, das durchschnittlich 10 Glycidoleinheiten enthält;
- Polyethylenoxid-Kondensate höherer aliphatischer Alkohole, z. B. Laurylalkoholpolyethylenoxid-Kondensate (wie z. B. Brij 35, Chemical Abstracts-Registrier-Nr. 9002- 92-0) und Cetylalkoholpolyethylenoxid-Kondensate (wie z. B. Brij 58, Chemical Abstracts-Registrier-Nr. 9004-95-9);
- höhere Fettsäureester-Kondensate von Polyethylenglykol, z. B. Stearinsäureesterpolyethylenglykol-Kondensate (wie z. B. Myrj 52 und Myrj 59, Chemical Abstract- Registrier-Nr. 9004-99-3); und
- Polyethylenglykol-Kondensate von höheren aliphatischen Sorbitanestern, z. B. Polyethylenglykol-Kondensate von Sorbitanmonolaurinsäureestern (wie z. B. Tween 20, Chemical Abstract-Registrier-Nr. 9005-64-5).
Die Pufferlösung für das 2-Butanol-Behandlungsreagens der vorliegenden Erfindung ist nur notwendig, damit es unfähig ist, die immunologische Bindungsreaktion und die nachfolgende enzymatische Reaktion zu hemmen. Solche Pufferlösungen können aus einer Vielzahl herkömmlicher Pufferlösungen ausgewählt werden. Vorzugsweise wird MES-, HEPES- oder Tris-Pufferlösung in einer Konzentration von 10 bis 200 mM eingesetzt. Der pH-Wert des Behandlungsreagenses liegt im neutralen Bereich oder in der Nähe davon, indem das Reagens keine Wirkung auf die immunologische Bindungsreaktion hat. Geeigneterweise stimmt dieser pH-Wert mit dem optimalen pH für die enzymatische Reaktion des zu verwendenden Markierungsenzyms überein. Die Pufferlösung kann darin BSA (bovine serum albumin = Rinderserumalbumin) als Stabilisator für den enzymmarkierten Antikörper eingearbeitet haben.
Das 2-Butanol enthaltende Behandlungsreagens der vorliegenden Erfindung hemmt die enzymatische Reaktion nicht. Nach Behandlung der Probe kann die behandelte Probenlösung daher dem Enzymimmunoassay, insbesondere dem homogenen Enzymimmunoassay, der nach der immunologischen Reaktion keinen B/F-Trennungsprozess aufweist, unterworfen werden.
Es kann jedes immunologische Bestimmungsverfahren, das ein Verfahren der immunologischen Reaktion zwischen HbA1c und anti-HbA1c-Antikörper verwendet, in die vorliegenden Erfindung eingeführt werden. Beispiele für das immunologische Verfahren, das für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden kann, umfassen das Sandwichverfahren unter Verwendung einer Enzymmarkierung (ELISA), RIA, das Latex- Agglutinierungs-Verfahren, und homogene Immunoassayverfahren, wie z. B. CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay) und EMIT (Enzyme Multiplied Immuno Test). Das Behandlungsreagens ist für den homogenen Enzymimmunoassay, der in der ungeprüften japanischen Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 171460/1985 beschrieben ist, am wirksamsten und für diesen am besten geeignet. In diesem Fall wird die Vollblutprobe mit dem Behandlungsreagens, das ein oberflächenaktives Mittel und 2-Butanol enthält, behandelt oder die Vollblutprobe wird mit einem oberflächenaktiven Mittel hämolysiert und dann mit einem 2-Butanol-enthaltenden Behandlungsreagens behandelt. Danach wird ein enzymmarkierter anti-HbA1c- Antikörper der behandelten Probe zugesetzt, um die Antigen-Antikörper-Reaktion hervorzurufen. Die HbA1c-Konzentration oder der HbA1c-Gehalt in der Probe kann aus der Abnahme der enzymatischen Aktivität bestimmt werden.
Das immunologische Bestimmungsverfahren gemäß der Erfindung ist nicht auf das nasse Analysensystem, wie es oben beschrieben ist, beschränkt. Die immunologische Bestimmung kann auch in einem trockenen System unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements durchgeführt werden. Beispiele für ein solches Verfahren umfassen das trockene Analysenverfahren, das einen homogenen Enzymimmunoassay verwendet, wie er in der ungeprüften japanischen Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 276551/1992 (entspricht EP-A-0 503 459) offenbart ist. Im trockenen Analysensystem wird eine flüssige Probe auf ein analytisches Element aufgetragen oder aufgetüpfelt, um die immunologische Bindungsreaktion und die enzymatische Reaktion innerhalb des Elements durchzuführen. Die Probenlösung wird vorbereitend mit 2- Butanol, das im Behandlungsreagens vorliegt, behandelt und dann wird ein Aliquot der behandelten Probenlösung auf das trockene analytische Element aufgetragen. Wenn das nasse Verfahren für die immunologische Bestimmung verwendet wird, wird das im Schritt der Behandlung zugesetzte 2- Butanol durch die Zugabe einer enzymmmarkierten Antikörperlösung verdünnt. Dagegen umfasst das trockene System keinen Verdünnungsschritt im gesamten Verfahren. Daher ist die Konzentration an 2-Butanol im Verlauf der enzymatischen Reaktion im Wesentlichen dieselbe wie die im Verlauf der 2-Butanol-Behandlung. Zum Zweck der Minimierung des nachteiligen Effekts von 2-Butanol auf die enzymatische Reaktion ist es passend, die 2-Butanol-Konzentration auf einen Level im ungefähren Bereich von 1 bis 2,5 Gew.-% zu verringern. Die Begünstigung der immunologischen Bindungsreaktion kann nicht beeinträchtigt werden, da der Effekt der Behandlung von HbA1c bei einer 2-Butanol-Konzentration von 2,5 Gew.-% im Wesentlichen gesättigt ist. Wenn 2- Butanol in einer Konzentration von etwa 5,0% vorliegt, was die Obergrenze des Konzentrationsbereichs während des Verlaufs der oben beschriebenen Behandlung darstellt, kann die enzymatische Aktivität durch die Obergrenze der Konzentration nicht halbiert werden. Demnach kann die scheinbare Verringerung der enzymatischen Aktivität des Markierungsenzyms durch Erhöhung der Menge des Markierungsenzyms kompensiert werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird nur die Bestimmung der Aktivität des Markierungsenzyms unter Verwendung des trockenen analytischen Elements durchgeführt. Genauer ausgedrückt, es wird ein trockenes Analyseelement mit einer Substratschicht, die das Substrat zur Untersuchung des Markierungsenzyms enthält, hergestellt. Die Flüssigkeitsprobe wird mit der Behandlungsreagenslösung der Erfindung behandelt, und dann wird die behandelte flüssige Probe zu einer Lösung gegeben, die einen enzymmarkierten Antikörper enthält, damit eine Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion stattffindet. Nach Beendigung der Antigen-Antikörper- Bindungsreaktion wird ein Aliquot des Reaktionsgemisches auf das trockene analytische Element aufgetüpfelt, um die enzymatische Aktivität zu messen.

BEISPIEL 1:

Herstellung von GMB-Amylase

Maleimidgruppen wurden durch die folgenden Behandlungsschritte in α-Amylase eingeführt. Zu 1 ml einer 5 mg/ml- Lösung von Bacillus-subtilis-α-Amylase (in einer 0,1 M Glycerophosphatpufferlösung, pH 7,0) wurden 100 ul einer 100 mg/ml-Lösung von GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)- succinimid; hergestellt von DOJIN KAGAKU) in DMF gegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration durch eine Sephadex G-25-Säule unterzogen, welche dann mit einer 0,1 M Glycerophosphatpufferlösung (pH 7,0) eluiert wurde. Die durchgehende Fraktion wurde gesammelt, wodurch N-(γ- Maleimidobutyryloxy)amidierte Amylase (GMB-Amylase) erhalten wurde. Die Konzentration der auf diese Weise erhaltenen GMB-Amylase-Lösung war 1,35 mg/ml.

(A) Herstellung von monoclonalem anti-humanem HbA1c-Antikörper

Es wurde ein monoclonaler Antikörper IgG gegen das humane HbA1c durch ein üblicherweise verwendetes Verfahren hergestellt, wobei immunisierte Zellen (Milzzellen), die durch Immunisierung gegen Mäuse erhalten worden waren, mit murinen Myelomazellen verschmolzen wurden, worauf ein Clonierungsprozess folgte. Genau war beschrieben, 7 ug natürliches humanes Hämoglobin A1c, gelöst in 1 mM KCN (pH 7, 5), 143 ul RPMI-1640-Medium (enthaltend 1 g/l Natriumcarbonat, 600 mg/l L-Glutamin und 10 mM HEPES: pH 6,8) und 200 ul vollständiges Freund's-Adjuvans wurden vermischt, und das Gemisch wurde als erste Immunstimulierung einer Maus durch subkutane Injektion verabreicht. Alle zwei Wochen wurde ein Immuno-Boosting durchgeführt. Schließlich wurden B- Lymphozyten aus der immunisierten Mausmilz gesammelt und mit murinen Myelomazellen zum Clonieren fusioniert. Aus den resultierenden Clonen wurde die Zelllinie selektiert, die den Antikörper produziert, der spezifische Reaktivität zu humanem HbA1c hat, der aber praktisch keine Kreuzreaktivität zu anderen Hämoglobin-Unterklassen hat; die so erhaltenen Antikörper-bildenden Zellen wurden kultiviert. Durch Reinigung des Antikörpers wurde der monoclonale Antikörper, der für humanes HbA1c spezifisch ist, antihumanes HbA1c-IgG erhalten.

(B) Herstellung von anti-humanem HbA1c-IgG-Fab'

Der resultierende anti-humane HbA1c-Antikörper-IgG wurde in einer Menge von 20 mg in 10 ml einer 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 5,5) gelöst und dann mit 600 ug aktiviertem Papain versetzt, worauf ein Rühren des Gemisches bei 37ºC für zwei Stunden folgte. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine SUPERDEX-200-Gel-Säule aufgetragen, die vorher mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,0, enthaltend 1 mM EDTA) äquilibriert worden war; darauf folgte eine Elution mit derselben Phosphatpufferlösung. Die Peakfraktion des Eluats mit dem Molekulargewicht von etwa 100.000 Dalton wurde gesammelt, wodurch ein anti-humanes HbA1c-IgG- F(ab')&sub2; erhalten wurde. 2 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,0), die 10 mg des auf diese Weise hergestellten anti-humanen HbA1c-IgG-F(ab')&sub2; enthielt, wurde mit 200 ul einer wässrigen 10 mg/ml-Lösung von 2-Mercaptoethylamin- HC&sub1;-Salz versetzt, um die Reaktion bei 37ºC 90 Minuten lang unter Rühren ablaufen zu lassen. Das Reaktionsgemisch wurde einer Gelfiltration durch Sephadex G-25, das vorher mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,0) äquilibriert worden war, unterworfen. Die durchgehende Fraktion wurde gesammelt, wobei ein anti-humanes HbA1c-IgG-Fab' erhalten wurde (im Folgenden als "Fab'" bezeichnet).

(C) Herstellung von α-Amylase/Fab'-Verbindung

0,1 mg/ml-Lösung von anti-humanem HbAlc-IgG-Fab' (im Folgenden vereinfacht als "Fab'" bezeichnet), die in (B) oben hergestellt worden war, wurde in einer Menge von 6,5 ml mit 2 mg GMB-Amylase, die in (A) oben hergestellt worden war, versetzt, und das Reaktionsgemisch wurde zur Durchführung der Reaktion über Nacht bei 4ºC gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine SUPERDEX-200 aufgetragen, die vorher mit 20 mM Glycerophosphatpufferlösung (pH 7,0, enthaltend 10 mM CaCl&sub2;) äquilibriert worden war. Die Fraktion mit dem Molekulargewicht von nicht weniger als 300.000 wurde unter Erhalt eines enzymmarkierten Antikörpers (α-Amylase/Fab'-Verbindung) gesammelt.

BEISPIEL 2 (Nasses System):

Bestimmung von HbA1c
Unter Verwendung des oben erhaltenen enzymmarkierten Antikörpers wurde humanes HbA1c durch einen homogenen Enzymimmunoassay unter Verwendung der folgenden Lösungen analysiert.

Behandlungsreacrens 1 (Kontrolle; Vergleichsbeisniel)

0,1 M MES-Pufferlösung (pH 6,0), 1% BSA (Rinderserumalbumin), 0,01% Natriumazid und 0,05% Triton X-100.

Behandluncrsreacsens 2 (gemäß der Erfindung)

0,1 M MES-Pufferlösung (pH 6,0), 1% BSA (Rinderserumalbumin), 0,01% Natriumazid, 0,05% Triton X-100 und 5,0% 2- Butanol.

Reaktionspufferlösung

50 mM Maleinsäure (pH 6,5)

Verdünnungsnufferlösung von α-Amylase/Fab'-Verbindung

20 mM Glycerophosphat (pH 7,0), 10 mM CaCl&sub2;, 0,85% NaCl und 0,05% Natriumazid.
Die HbA1c-Lösung (hergestellt von Exocell, 13 mg/ml, PBS) wurde mit den Behandlungsreagentien 1 und 2 auf verdreifachte Volumina verdünnt, um Reihenverdünnungen mit HbA1c- Konzentrationen im Bereich von 0 bis 300 ug/ml herzustellen. Etwa 5 Minuten ab Beginn der Verdünnung (bedeutet, dass die Behandlung etwa 5 Minuten in Anspruch nahm) wurden 50 ul jeder der Reihenverdünnungslösungen zu einer 200-fach verdünnten Lösung der α-Amylase/Fab'-Verbindung, die im Beispiel hergestellt worden war, gegeben, um diese 20 Minuten lang bei 37ºC miteinander reagieren zu lassen. Andererseits wurde eine Neo-Amylase-Test-Tablette "Dai- ichi" (hergestellt von Dai-ichi Pure Chemicals Co., Ltd., enthaltend 45 mg blaue Stärke und 3 mg BSA) in 4 ml Reaktionspufferlösung unter Herstellung einer Testlösung gelöst. 1 ml der Testlösung wurde zu jeder Reaktionslösung gegeben, um eine enzymatische Reaktion bei 37ºC für eine Stunde ablaufen zu lassen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 0,5 ml 0,5 N Na&sub2;CO&sub3;-Pufferlösung beendet. Nach einem Rühren wurde die Lösung 5 Minuten lang einer Zentrifugation bei 3000 UpM unterworfen, und der Überstand wurde entnommen. Der Überstand wurde einer Lichtabsorptionsanalyse bei 620 nm unterworfen, um die Menge an blauem Farbstoff zu bestimmen, der durch die enzymatische Reaktion solubilisiert worden war und im Überstand gelöst war. Fig. 1 zeigt die Wechselbeziehung zwischen der beobachteten Extinktion und der Konzentration an humanem HbA1c.
Verglichen mit dem Behandlungsreagens 1, das kein 2- Butanol enthielt (Kontrolle, im Diagramm durch das Zeichen - - bezeichnet), zeigte das Behandlungsreagens 2, das 2- Butanol enthielt (erfindungsgemäßes Behandlungsreagens, im Diagramm durch das Zeichen -Δ- gekennzeichnet), eine starke Abnahme der Aktivität des Markierungsenzyms als Folge der Zugabe von HbA1c, das dem Test unterzogen wurde. Basierend auf der Menge des HbA1c, das zur Halbierung der Extinktion von der ursprünglichen Größe, etwa 1,0, notwendig ist, vor dem Zusatz des HbA1c, wurde eine Erhöhung der Empfindlichkeit mit dem Behandlungsreagens der Erfindung auf das etwa 20-fache des ursprünglichen Werts festgestellt. Eine stärkere Veränderung der Extinktion wurde bezüglich der Schwankung des HbA1c beobachtet. Es wurde festgestellt, dass das Behandlungsreagens der Erfindung die Bestimmung von HbA1c, die bei höherem S/N-Verhältnis, nämlich mit höherer Empfindlichkeit, erreicht werden sollte, ermöglichte. Wie aus der Extinktion vor Zusatz des HbA1c zu ersehen ist, hat das erfindungsgemäß verwendete 2-Butanol keine Wirkung auf die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms.

BEISPIEL 3:

Es wurde ein Enzymimmunoassay durchgeführt, indem genau dem Verfahren von Beispiel 2 gefolgt wurde, außer dass die 2-Butanol-Konzentration im Behandlungsreagens in 1% und 2,5% geändert wurde. Wie in Fig. 2 dargestellt ist, nahm die Empfindlichkeit entsprechend dem Ansteigen der 2- Butanol-Konzentration zu. Die Daten geben an, dass 2- Butanol, das bei Konzentrationen im Bereich von 1 bis 2,5% verwendet wurde, bei der Erhöhung der Empfindlichkeit sehr effektiv war.

BEISPIEL 4:

Herstellung eines trockenen Analyseelements zur HbA1c- Bestimmung

Auf eine farblose und transparente Polyethylenterephthalat(PET)-Folie (Träger), die mit einer Gelatine-Unterschicht beschichtet war und eine Dicke von 180 um hatte, wurde eine Reagenslösung, die ein Vernetzungsreagens enthielt, aufgetragen, anschließend wurde unter Erhalt einer Reagensschicht getrocknet, so dass die entsprechenden Komponenten die unten angegebenen Beschichtungsmengen hatten.
Alkalisch behandelte Gelatine 14,5 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend 9 bis 10 (durchschnittlich) Oxyethyleneinheiten) 0,2 g/m²
Glucoseoxidase 5000 IE/m²
Peroxidase 15.000 IE/m²
Glucoamylase 5000 IE/m²
2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4- [4-(dimethylamino)phenyl]-5-phenethylimidazol(Leuko-Farbstoff)-acetat 0,38 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]- methan 0,1 g/m²
Auf der Reagensschicht wurde eine wässrige Lösung eines Klebemittels aufgebracht, so dass die folgenden Beschichtungsmengen erreicht wurden, dann wurde unter Bildung einer Klebeschicht getrocknet.
Alkalisch-behandelte Gelatine 14,5 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend 9 bis 10 (durchschnittlich) Oxyethyleneinheiten) 0,2 g/m²
Dann wurde eine wässrige Lösung, die das folgende Reagens enthielt, über die Oberfläche der Klebeschicht zu den folgenden Beschichtungsmengen und unter Aufquellen der Gelatineschicht aufgetragen; dann wurde ein Trikot-Strickgewebe, das durch Stricken von gesponnenem PET-Garn mit 36 Gauge, entsprechend 50 Denier, hergestellt worden war und eine Dicke von etwa 250 um hatte, durch Pressen mit einem einheitlichen leichten Druck auflaminiert, wodurch eine poröse Ausbreitungsschicht erhalten wurde.
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend 9 bis 10 (durchschnittlich) Oxyethyleneinheiten) 0,2 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]- methan 0,1 g/m²
Anschließend wurde auf die Ausbreitungsschicht eine wässrige Lösung eines Substrats aufgetragen, anschließend wurde unter Erhalt der folgenden Beschichtungsmengen getrocknet, wodurch die poröse Ausbreitungsschicht (Strickgewebeschicht) die Funktion einer Subtratschicht hatte. Auf diese Weise wurde ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Analyse von HbA1c hergestellt.
MEGAFAC F142D
(Fluorhaltiges oberflächenaktives Mittel, hergestellt von DAI NIPPON INK & CHEMICALS INC.) (enthaltend durchschnittlich 10 Oxyethyleneinheiten) 0,1 g/m²
Carboxymethylierte Stärke 5 g/m²
Mannit 2 g/m²
Amylaseinhibitor (hergestellt von FUJIREBIO INC. und unter dem Produktcode "1-1001C" vertrieben; JP-A-61-74587) 1 Million E/m²
Das so hergestellte Element wurde in Spitzen mit jeweils 15 mm geschnitten und jede Spitze wurde in einen Objektträgerrahmen, der in der ungeprüften japanischen Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 63452/1982 beschrieben ist, gebracht, um so einen Analysenobjektträger für die quantitative Bestimmung von HbA1c herzustellen. Der Amylaseinhibitor "1-1001C", der hier verwendet wird, war ein Inhibitor, der auf gleiche Amylasespezies, die möglicherweise in einer Probe enthalten sind, wirken sollte und unfähig war, die enzymatische Aktivität der Bacillus subtilis-α- Amylase, die als Markierungsenzym verwendet wurde, zu hemmen (ungeprüfte japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 122112/1993).
Die HbA1c-Lösung (hergestellt von Exocell, 13 mg/ml, PBS) wurde mehrmals mit den Behandlungsreagentien 1 und 2 auf die nacheinander verdoppelten Volumina verdünnt, wodurch Reihenverdünnungen mit HbA1c-Konzentrationen im Bereich von 7,5 bis 240 mg/ml hergestellt wurden. Das Behandlungsreagens 1 und das Behandlungsreagens 2 wurden in ihrer unmodifizierten Form jeweils als Lösung, die HbA1c in einer Konzentration von 0 mg/dl enthielt, eingesetzt. Etwa 5 Minuten nach Beginn der Verdünnung (dies bedeutet, dass die Behandlung etwa 5 Minuten in Anspruch nahm) wurden 50 ul jeder der Reihenverdünnungslösungen zu einer 30-fach verdünnten Lösung der α-Amylase-Fab'-Verbindung, die in Beispiel 1 hergestellt worden war, gegeben, um diese 20 Minuten lang bei 37ºC miteinander reagieren zu lassen. Anschließend wurden 10 ul jeder der Reaktionslösungen auf den vorher beschriebenen HbA1c-Analyseobjektträger aufgetragen, der bei 37ºC gehalten wurde; dann wurde die optische Dichte des reflektierten Lichts bei 650 nm von der PET-Trägerseite aus gemessen. Die Differenz der optischen Dichte (ΔOD&sub6;&submin;&sub4;) des reflektierten Lichts, gemessen nach Ablauf von 4 Minuten bzw. 6 Minuten wurde bestimmt. Auf der Basis der Bestimmungsresultate wurde eine Eichkurve erstellt. Die so erstellte Eichkurve ist in Fig. 3 dargestellt.
Verglichen mit dem Behandlungsreagens 1, das kein 2- Butanol enthielt (Kontrolle, in der Fig. 3 durch die Markierung -Δ- gekennzeichnet) zeigte das Behandlungsreagens 2, das 2-Butanol enthielt (erfindungsgemäßes Behandlungsreagens, in Fig. 3 durch die Markierung-O-gekennzeichnet) eine starke Abnahme der Aktivität des Markierungsenzyms als Folge der Zugabe von HbA1c, das dem Test unterzogen worden war. Zum Zwecke der quantitativen Beurteilung des Empfindlichkeitsverhältnisses wurden die HbA1c-Mengen, die für eine Verringerung der Extinktion von der ursprünglichen Größenordnung aus etwa 0,35 (Behandlungsreagens 1 zur Kontrolle) und etwa 0,32 (Behandlungsreagens 2 gemäß der Erfindung) vor Zusatz von HbA1c auf etwa ¹/&sub4; notwendig sind, nämlich die HbA1c-Mengen, die zur Senkung der ursprünglichen Extinktionsgröße auf etwa ³/&sub4; (etwa 0,16 im Behandlungsreagens 1 zur Kontrolle und etwa 0,24 im Behandlungsreagens 2 für die vorliegende Erfindung) notwendig sind, als Empfindlichkeitskriterien durch eine angenäherte alternative Beurteilung der HbA1c-Mengen, die zur Halbierung der Extinktion notwendig sind, verwendet. Wie aus den HbA1c-Mengen, die in Fig. 3 durch die unterbrochene Linie angegeben werden, zu ersehen ist, wurde festgestellt, dass das erfindungsgemäße Behandlungsreagens eine deutliche Empfindlichkeitserhöhung bewirkt, die zwischen dem etwa 12-Fachen und dem etwa 20-Fachen der ursprünglichen Größe liegt. Eine größere Änderung der Extinktion wurde hinsichtlich der Schwankung des HbA1c beobachtet. Es wurde bestätigt, dass das erfindungsgemäße Behandlungsreagens es ermöglicht, dass die HbA1c-Bestimmung ein höheres S/N- Verhältnis, nämlich höhere Empfindlichkeit erreicht.
Wie oben beschrieben wurde, wird erfindungsgemäß eine Probe, die ein Hämoglobinderivat, wie z. B. Hämoglobin A1c enthält, mit 2-Butanol-enthaltendem Behandlungsreagens vermischt und behandelt. Das günstige Resultat ist, dass der Immunoassay nicht nur mit hoher Nachweisempfindlichkeit, sondern auch mit einem hohen S/N-Verhältnis durchgeführt werden kann. Auch wenn ein Enzym als Markierung für einen Antikörper oder ein Antigen im Assay verwendet wird, wird das vorliegende Behandlungsreagens die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms nicht beenträchtigen oder hemmen. Dementsprechend kann das erfindungsgemäße Verfahren bei verschiedenen Enzymimmunoassays, einschließlich eines homogenen Enzymimmunoassays, eingeführt werden. So kann eine zu analysierende Probe schnell durch ein einfaches Verfahren mit hoher Empfindlichkeit zur Bestimmung des Hämoglobinderivats, wie z. B. Hämoglobin A1c untersucht werden.

Claims

1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines Hämoglobinderivats, umfassend die Schritte:

- Behandeln einer Probenlösung, die das Hämoglobinderivat enthält, mit einem Behandlungsreagenz, das 2-Butanol enthält, und

- immunologisches Analysieren der behandelten Probenlösung zur Bestimmung der Menge des Hämoglobinderivats in der Probenlösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die immunologische Bestimmung durch das Verfahren der immunologischen Enzymanalyse durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein Enzym-markierter Antikörper gegen das Hämoglobinderivat zu der behandelten Probenlösung gegeben wird, so dass eine Antigen-Antikörper- Reaktion stattfindet, und wobei ein Aliquot der Reaktionslösung nach Beendigung der Antigen-Antikörper-Reaktion auf ein trockenes analytisches Element aufgetragen wird, um die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms zu bestimmen, wodurch die Menge des Hämoglobinderivats, das in der Probenlösung enthalten wird, bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein Aliquot der behandelten Probenlösung auf ein trockenes analytisches Element aufgetragen wird, so dass eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem Hämoglobinderivat und einem Enzym-markierten Antikörper gegen das Hämoglobinderivat stattfindet und eine enzymatische Reaktion des Markierungsenzyms innerhalb dieses Elements stattfindet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probenlösung eine Vollblutprobe ist und diese Vollblutprobe vor der Behandlung mit dem Behandlungsreagenz einer Hämolyse unterworfen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probenlösung eine Vollblutprobe ist, das Behandlungsreagenz auch ein Hämolyseagens enthält und die Hämolyse der Vollblutprobe und die Behandlung des Hämoglobinderivats mit 2-Butanol gleichzeitig durchgeführt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Behandlungsreagenz 2- Butanol in einer Menge enthält, so dass die Endkonzentration des selben bei der Behandlung im geeigneten Bereich von 1,0- 5,0 Gew.-% sein kann.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Hämoglobinderivat glyciertes Hämoglobin (glycated hemoglobin) ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das glycierte Hämoglobin glycosyliertes Hämoglobin (HbA1c) ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Hämolyseagens ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.

11. Behandlungsreagenz zur Behandlung eines Hämoglobinderivats, dadurch gekennzeichnet, dass es 2- Butanol und ein Hämolyseagens enthält.

12. Behandlungsreagenz nach Anspruch 11, wobei der Gehalt an 2-Butanol so ist, dass die Endkonzentration des selben nach Zugabe und Behandlung der Probe in einem geeigenten Bereich von 1,0-5,0 Gew.-% sein kann.

13. Behandlungsreagenz nach Anspruch 11, wobei das Hämoglobinderivat glyciertes Hämoglobin ist.

14. Behandlungsreagenz nach Anspruch 13, wobei das glycierte Hämoglobin glycosyliertes Hämoglobin (HbA1c) ist.

15. Behandlungsreagenz nach Anspruch 14, wobei das Hämolyseagens ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.