JPS62215599A - グルシト−ルリジン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腹１ユＪυＬ１且Ｉ一 本発明は、新規なグルシトールリジン誘導体に関する。

来の　術　び発明の　的 近年、生理的条件下において、特に糖尿病患者において
糖と蛋白との非酵素的結合反応、即ち血中の高濃度のグ
ルコースのアルデヒド基と、生体内の比較的半減期の長
い蛋白のＮ末端及び側鎖のアミノ基との非酵素的結合反
応が明らかにされ、この結合により生じるアルジミン（
シッフ塩基）は、更にアマトリ転位により安定したケト
アミンを生成し、グルコシル化蛋白となることが解明さ
れると共に、このグルコシル化蛋白の測定値が空腹時の
血糖値とよく相関し、しかも該値は糖尿病患者では健常
人と明確に区別される高値となり、従って、該グルコシ
ル化蛋白値が血糖コントロール指標として有効で、その
測定により糖尿病の診断、病態の解明、予後の経過の究
明等が可能であることが明らかにされた。

しかして、上記グルコシル化蛋白の測定法としては、従
来ＴＢＡ法（Ｔ　１ｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　　ａｃｉ
ｄ）法、即ち血清に弱酸を加えて加熱して５−ヒドロキ
シメチルフルフラール（５−ＨＭ　Ｆ　）を遊離させ、
そのチオバルビッール酸（ＴＢＡ）との結合による発色
を比色定量する方法や硼酸アフイニティクＯマドグラフ
ィー、即ち蛋白に結合した糖のシス−ジオール基を利用
して、アミノフェニル硼酸をセファロースＣＬ−６Ｅ３
等の適当な担体に固定したゲルカラムにかけ、ゲルに吸
着したグルコシル化蛋白を溶出させて分離し、これを紫
外吸収又はローリ−法等により比色測定する方法等が知
られている。

また、操作の容易性や迅速な測定を行なうために、免疫
検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）による上記グルコ
シル化蛋白の測定技術も検討され、そのための抗体につ
いても幾つか提案されている。

しかしながら、既存の測定技術においては、操作の繁雑
さや測定に長時間を要する等の操作上の問題点に加え、
特に正確性、再現性の点等から、未だ斯界の要望に応え
るものはなかった（ｒａ床検査Ｊ　ＭＯＯＫ、Ｎｏ、１
８．ｐ　６Ｏ−６８（１９８４’）、特開昭５９−１１
９２６４号公報参照）。

斯かる現状において、本発明者らは、先に、既存のグル
コシル化蛋白の測定法に代って、より特異性が高く、被
検者における非酵素的グルコシル化の的６ｉｆｆな把握
を可能とする正確性、再現性に１・Ｊれ、また簡便で迅
速な測定を行なうことができ、スクリーニング手段とし
ても好適な新しい測定技術の開発に、成功したく特願昭
６１−１０７５８号）。

即ち、蛋白とグルコースとの非酵素的結合反応によれば
、蛋白中のりジン残基のε−アミノ基がグルコシル化さ
れてアルジミン及びケトンが形成され、かかる反応は生
体内でも生じていると考えられる。該ケトアミンの測定
によれば、非酵素的グルコシル化の度合を知ることがで
き、これは該ケトアミンと選択的に結合する抗体の利用
により実施される。

しかしながら、上記ケトアミンは、平衡状態で溶液中に
異なる立体配座、即ち、ｒ！Ａ鎖ケトース並びに６員環
ピラノース及び５員環フラノース構造の両者のα−及び
β−アノマーで存在することが知られている。従って、
斯界の要望に合致する高感度、高精度の免疫測定を実施
するべく、ケトアミンを認識するモノクローナル抗体を
用いる方法を採用しようとしても、モノクローナル抗体
がそのｌ　Ｉの面で極めて特異性の高い故に、所望の効
果は望み難い。

一方、本発明者らの研究によれば、上記アルミジン及び
ケトアミンの還元処理によれば、立体配座的にも安定な
グルシトールリジンアダクト（グルシトール蛋白）が生
成し、還元処理した体液を検体として使用することによ
り、モノクローナル抗体の有利性を充分に生かした測定
技術が提供できることが確認され、かくして上記のグル
シトールリジン（還元型グルコシル化リジン）残基をエ
ピトープとするモノクローナル抗体を用いることを特徴
とする新しい免疫測定技術が確立された。

本発明の目的は、上記（ｉｌｌ究成果に基づく免疫測定
法において、標準抗原（スタンダード）として有用な新
規なグルシトールリジン誘導体を提供することにある。

発　　明　　の　　構　　成 本発明によれば、式 で表わされるグルシトールリジン誘導体が提供される。

本発明化合物は、以下に詳述する体液中のグルコシル化
蛋白の測定法において、スタンダードとして有用であり
、該化合物の利用によれば、斯界の要求に合致する、優
れたグルコシル化蛋白の測定が可能であり、ひいては糖
尿病の診断や維持管理に極めて有用である。

本発明化合物は、例えば公知の６−アミノ−２−（ベン
ゾイルアミノ）アセチルアミノ−ヘキサン酸とグルコー
スとの非１’ｔ？素的結合反応物を還元処理することに
より製造される。上記非酵素的結合反応は、通常の方法
に従い実施でき、例えば通常の緩衝液等の適当な溶媒中
、約２０〜３７℃程度で約７２〜１８０時間程度インキ
ュベートすればよい。また上記還元処理は、この非酵素
的結合反応と同時に行なうのがよく、該還元処理は、一
般にシッフ塩基の還元もしくはカルボニル基の水酸基へ
の還元に通常用いられている反応方法に従い実施できる
。その具体例としては、例えばＮａ　ＢＨ＆　、Ｎａ　
ＣＮＢＨＡ等の水素化還元剤を用いる還元法を例示でき
る。之等の還元剤は、通常反応に使用したグルコースに
対して等モルｍ〜２倍モル量程度使用され、反応は約２
０〜３７℃で７２〜１８０時間を要して実施され得る。

反応終了後、本発明化合物は、通常の方法に従い、例え
ば薫留した後、カラムクロマトグラフィー等の精製操作
を施すことにより単離精製できる。

以下、本発明化合物を利用するグルコシル化蛋白の測定
技術につき詳述する。

該方法は、グルシトールリジン残基を特異的に認識する
モノクローナル抗体を使用する測定技術である。

該方法に用いられる上記抗体は、例えばグルシトールリ
ジン残基を保有する免疫抗原で免疫された哺乳動物の形
質１胞（免疫細胞〉を、哺乳動物の形質細胞腫細胞と融
合させてハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）を作
成し、これより上記グルシトシルリジン残基を認識する
抗体を産生ずるクローンを選択し、該クローンより目的
とする抗体（モノクローナル抗体）を得る方法により製
造できる。

上記において、用いられる免疫抗原としては、グルシト
ール残基がリジンに、もしくはリジン残基を介して担体
蛋白に、結合した還元型グルコシル化リジン（グルシト
シルリジン）もしくは還元型グルコシル化蛋白（グルシ
トール蛋白）が一般に使用できるが、グルシトシルリジ
ン構造を保有する限り、上記のものに限定されず、各種
のものが使用できる。その代表例としては、例えば還元
型グルコシル化β−リボプロティン（Ｇ　１ｃ−ＬＤＬ
）、還元型グルコシル化ポリリジン（Ｇｌｃ−ＰＬ）　
、還元型グルコシル化牛血清アルブミン（ＧＩＣ−ＢＳ
Ａ）、グルシトシルリジン（Ｇｌｃ−し）等を例示でき
るが、勿論上記本発明化合物もまた、該免疫抗原として
利用することができる。

之等の抗原の製造は、通常の方法に従うことができ、例
えばリジン又は担体蛋白とグルコースとの非酵素的結合
反応による結合物（アルジミンもしくはケトアミン）を
還元処理すればよく、この操作は本発明化合物の製造に
おけるそれと同様のものでよい。

また、前記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物
としては、特に限定されないが、細胞融合に使用する形
質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般には、マウス、ラット等が有利に使用される。

免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動
物に静脈内投与もしくは腹腔的注射等により投与するこ
とにより行なわれる。・より具体的には、免疫抗原をＰ
ＢＳ等で適当濃度に希釈し、動物に２〜１４日毎に数回
投与し、総投与母が約１〜１００μｇ／マウス程度にな
るようにするのが好ましい。免疫細胞としては、上記最
終投与の約３日後に摘出した牌細胞を使用するのが好ま
しい。

また上記免疫細胞と融合される他方の親１１１胞として
の哺乳動物の形質細胞Ｉｌｌ細胞としては、既に公知の
種々の細胞株、例えばｐ　３　（ｐ　３／ｘ６３−ＡＯ
８）（Ｎａｔｕｒｅ、２５６．４９５−４９７（１９７
５）　）　、ｐ３−Ｌｌ　１　（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐ
ｉｃｓｉｎ　　Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　
　ｌ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８１．　１−７　　（１９
７８））　　、Ｎ５−１　　（Ｅｕｒ、Ｊ。

（ｍｍｕｎｏｌ、、６，５１１−５１９　（１９７６）
）、ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ、８．　４０５−４１５（
１９７６））、５Ｐ２１０　　（Ｎａｔｕｒｅ、２７６
゜２６９−２７０　　（１９７８））、ＦＯ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、３５．１−２１　　（１
９８０））ｘ６３．６．５．３．　　（Ｊ、　　Ｉｎｕ
ｅｕｎｏｌ、、１２３゜１５４８−１５５０（１９７９
））、８１９４（Ｊ　、　　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、Ｌ４
ｉ、　　３１　’３−３２３（１９７８））等や、ラッ
トにおけるＲ２１０（Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３１−
１３３　（１９７９））等の骨髄腫細胞等が使用される
。

上記免疫細胞と形質細胞ｌ！細胞との融合反応は、基本
的には、公知の方法例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ　）らの方法（Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｉｏａｙ、Ｖｏｌ、　７３　、　ｐｐ３　（１９８１
）　）等に準じて行ない得る。より具体的には上記融合
反応は、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中
で行なわれる。融合促進剤としては、通常用いられるも
の、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、セン
ダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により
融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助
剤を添加使用することもできる。免疫ｍ胞と形質細胞腫
細胞との使用比は、通常の方法と変りがなく、例えば形
質細胞腫細胞に対し、免疫細胞を約１〜１０倍程度用い
ればよい。上記融合時の培地としては、例えば上記形質
細胞ｌｌｌ１ｌｌ胞株の増殖に使用されるようなＲＰＭ
　Ｉ−’Ｉ　６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種の
細胞培養に使用される通常の各種培地を利用でき、通常
は牛胎児血清（ＦＯ８）等の血清補液を抜いておくのが
よい。融合は、上記免疫箱胞と形質細胞腫細胞との所定
最を上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温し
たＰＥＧ溶液、例えば平均分子！ｉ１０００〜６０００
程度のものを、通常培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度
で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当
な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰
返すことにより所望のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の１１Ｉ　ＪＪａ（未融合細胞等）が死滅
するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。

かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法
に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クロー
ン化が行なわれる。

該産生株の検索は、例えばＥＬｆＳＡ法（εｎａｖａｌ
ｌ、　Ｅ　、、Ｍｅｔｈ、Ｅ　ｎｚｖｍｏｌ、、７０　
、４１９〜４３９　（１９８０））　、プラーク法、ス
ポット法、凝集反応法、オクテロニイ−（Ｏｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等
の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法〔「ハ
イブリドーマ法とモノクローナル抗体」、（株）Ｒ＆Ｄ
プランニング発行、ｐｐ３０〜５３、昭和５７年３月５
日〕に従って行なわれる。該検索は、前記した免疫抗原
を使用して行なえばよく、殊にグルシトールリジン残基
以外の抗原決定基と結合する可能性のある抗体を排除す
るために、免疫原として使用した免疫抗原とは異なる免
疫抗原の使用が望ましい。

かくしてグルシトールリジン残基を認識する抗体を産生
ずる所望のハイブリドーマが得られる。

之等は、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で
容易に長期間保存可能である。

該ハイブリドーマからの所望のモノクローナル抗体の採
取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培
養上清として、或いはハイブリド−マをこれと適合性の
ある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る
方法等が採用される。

前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後
者の方法は、抗体の大ｍ生産に適している。

また上記により得られる抗体は更に、塩析、吸収法、ゲ
ル濾過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の
精製手段により精製することもできる。

かくして得られるモノクローナル抗体は、グルシトール
リジン残基に極めて高い特異性を有し、従って、該抗体
の利用によれば、被検者における非酵素的グルコシル化
の度合を、的確に把握することができる。またこれによ
って、より的確な糖尿病の診断及び血糖コントロールが
可能である。

本発明は、上記特定の抗体を使用して被検者の体液中の
非酵素的グルコシル化蛋白を測定する方法並びに該測定
法のための測定用キットであって、本発明化合物をスタ
ンダードとして使用する新規な技術をも提供するもので
ある。

上記グルコシル化蛋白の測定は、本発明化合物をスタン
ダードとして使用することを必須の要件として、その基
本的操作は、通常の免疫検定法、例えばＲＩＡ法、醇素
免疫測定法（Ｅ　ＩＡ）等に従うことができる。之等各
免疫検定法における操作、手順等は一般に採用されてい
るそれらと特に異ならず、例えば公知の競合法、サンド
インチ法等に準じることができる。

上記方法（以下これを本発明方法という）において検体
としては、還元処理された体液を使用できる。かかる体
液としては、血液、尿、細胞組織液、リンパ液、胸水、
腹水、羊水、胃液、膵液、髄液、唾液等を例示できる。

２等体液の還元処理は、記述の方法に準じることができ
、通常、還元剤を約１０〜１００ｎ＋　ＭｉｌＪ度程度
使用して、３０分〜１８０時間程度を要して行ない得る
。２等検体は、またその還元処理に先立ち、予めその中
の蛋白性画分を採取（もしくはグルコースの除去）を行
なってから用いるのが最も好ましい。該画分の採取は、
それ自体公知の方法、例えばアセトン、メタノール、エ
タノール、ブＯパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）等の有機溶媒等を蛋白沈澱剤として用いる処理方法
、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウ
ム等の塩析剤を用いる処理方法、透析膜、平板膜、中空
繊維膜等を用いる限外濾過処理方法等及び之等の組合せ
により実施できる。尚、上記において公知の方法に従っ
て、アルブミンやリボプロティン分画にまで精製した後
、これを還元処理して検体として用いるときには、非酵
素的グルコシル化蛋白の総１に代り、特定の蛋白に特異
的な非酵素的グリコジル化量を知ることができる。

また上記方法は、不溶化法（不溶化抗原又は不溶化抗体
を用いる方法）によることもできる。この場合、不溶化
抗原及び不溶化抗体は、常法に従い本発明化合物もしく
は前記免疫抗原又は前記抗体を、不溶性担体に化学的又
は物理的に反応させることにより製造される。ここで不
溶性担体としては、例えばセルロース粉末、セファデッ
クス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシ
メチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プ
ラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン
、ガラスピーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテ
ル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン
−マレイン酸共重合体等を使用できる。不溶化は、共有
結合法としてのジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体
法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイミド樹脂法
、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、
臭化シアン活性化多糖休演、セルロースカルボナート誘
導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アルキル化法、
架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてゲルタール
アルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を用いる
）、Ｕａｉ反応による担体結合法等の化学的反応；或い
はイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法；
ガラスピーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理
的吸着法によって行なわれる。

標識抗原又は標識抗体としては、本発明化合物もしくは
前記免疫抗原又は前記抗体を、通常の放射性物質、酵素
標識物質、螢光物質等の各種標識剤で標識化したものが
用いられる。該標識剤としての放射性物質としては、１
２５１等の放射性ヨード等を、螢光物質としては、フル
オレツセイン・イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、テト
ラメチルローダミン・イソチオシアナート （ＴＲＩＴＣ）　、置換ローダミン・インチオシアナー
ト（ＸＲＩＴＣ）　、ローダミンＢ・イソチオシアナー
ト、ジクロロトリアジンフルオレツセイン（ＤＴＡＦ）
等を、酵素標識物質としてはパーオキシダーゼ（ＰＯＸ
）　、マイクロバーオギシダーゼ、キモトリプシノーゲ
ン、プロ力ルボキシベブチダーゼ、グリセロアルデヒド
−３−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ
、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナーゼ等をそれぞれ例示できる。こ
れらによる標識方法も常法に従うことができる（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ＋、、２５４．９３４９−９３５１
（１９７９）；Ｎａｔｕｒｅ　、１９４．４９５（１９
６２）：螢光抗体法、医化学実験講座Ｎｏ。

４、２６３−２７０　：Ａｃｔａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ。

５ｕｌ）Ｉ）１．．１６８．２０６　（１９７２）　：
　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ｔＪＳＡ、　５７　、
７１３（１９６７）等参照〕。

本発明方法における検体中の被検物質（還元型グルコシ
ル化リジン残基量）の測定・定量方法は、本発明化合物
をスタンダードとして、上記不溶化抗原、不溶化抗体、
標識抗原及び標識抗体のいずれかを用いて免疫反応させ
ることにより実施される。その際測定系に利用される溶
媒としては、反応に悪影響を与えない通常のもの、例え
ばクエン酸緩衝液、リン酸ｍｍ液、トリス−塩１緩衝液
、酢酸緩衝液等のｐＨ４〜８程度の緩衝液を好ましいも
のとして例示できる。また測定の際の免疫反応条件は特
に制限はなく、通常のこの種測定法と同様のものとする
ことができる。即ち該免疫反応は一般に４５℃以下、好
ましくは約４〜４０℃の温度条件下、１〜４０時間を要
して行なわれる。

免疫反応終了後の結合体及び遊離体（Ｂ−Ｆ）の分離も
公知の方法に従い、例えば不溶化法を採用したときは、
遠心分離、炉別、洗浄、デカンテーション等の分離手段
により固相一液相を分離することができる。その他の場
合には例えばデキストラン−活性炭法、第２抗体法等の
常法に従えばよい。

以下、本発明方法を、操作の簡便な不溶化法を例にとり
説明すれば、該方法は （１）まず測定しようとする検体中の被検物質と一定量
の不溶化抗原とを、標識抗体の一定量と競合反応させ、
次いでＢ−Ｆ分離を行ない、そのいずれか一方の標識剤
活性を測定して被検物質ｍを定量する、 （２）まず被検物質と一定量の標識抗原とを、一定量の
不溶化抗体と競合反応させ、次いでＢ−Ｆ分離し、その
いずれか一方の標識剤活性を測定して被検物質量を定量
する、 （３）被検物質と不溶化抗体とを反応させて免疫複合体
を形成させ、この複合体に標識抗体の一定量を反応させ
、複合体に結合した標識抗体の標識剤活性を測定して被
検物質量を定量する、等の方法により、いずれも本発明
化合物をスタンダードとして使用することにより、実施
することができる。

か（して、検体中の還元型グルコシル化リジン残基ωの
測定ができ、これは被検者における非酵素的グルコシル
化の度合を鋭敏に反映する。尚、本発明者らのωＩ究に
より、体液中の特定の蛋白のに特異的な上記測定法が開
発された。該・方法は、例えばアルブミンを例にとれば
、以下に示す方法により実施され、極めて簡便である。

（４）検体に、不溶化抗ヒト血清アルブミン抗体を加え
て、免疫複合体を形成させ、この複合体に、標識抗体を
反応さけ、複合体に結合した標識抗体の標識活性を測定
する ことにより、アルブミンに特異的な非酵素的グルコシル
化の度合いを把握できる。

以上の各ｌ方法により測定される、非酵素的グルコシル
化の度合は、本発明化合物をスタンダードとして使用す
ることにより、例えば単位蛋白ｍもしくは特定の、例え
ばアルブミン分子中の、グルシトールリジン残基のモル
数として表わすことができる。更に本発明化合物は、反
応儂の不明な他のスタンダードのモル数換算の基準物と
なり得る。

上記測定法を実施するのに特に便利な方法は、キットを
使用する方法である。このようなキットには、スタンダ
ードとして本発明化合物を含有せしめることが必須であ
り、更に前記モノクローナル抗体を抗体試薬として含有
させることが重要である。この抗体試薬には、グリセロ
ールやウシ血清蛋白のような安定化剤及び／又は保存剤
を添加することができる。好ましくは、この抗体試薬は
凍結乾燥したものであり、キットには水溶性もしくは水
と混和しうる溶媒を含有させることができる。更にこの
抗体試薬には、再構成された試薬系を一定のｐＨに保つ
ための緩衝液及び／又は使用前に試料が悪化するのを防
ぐための保存剤及び／又は安定剤を添加することができ
る。スタンダードは、通常適当な緩衝液等に溶解した溶
液形態とされる。緩衝液はキット試薬の必須成分とは考
えられないが、本発明の測定法を実施する際に、ｐＨを
４〜８程度とするものを用いるのが好ましい。また再構
成剤は好ましくは水を含んだものであるが、水の一部又
は全部を水と混和し得る溶媒で置き換えることもできる
。水と混和し得る溶媒としては当業者に周知であり、例
えばグリセリン、アルコール類、グリコール類、グリコ
ールエーテル類等を使用できる。

発　　明　　の　　効　　果 本発明によれば、グルシトールリジン残基を保有し、ス
タンダードとして有用なグルシトールリジン誘導体が提
供される。該誘導体は、免疫反応性に優れ、その利用に
より非酵素的グルコシル化の度合を的確に把握すること
ができ、被検者における糖尿病の診断及び血糖コントロ
ールを良好に行なうことが可能である。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例及び参考
例を挙げる。

実施例１ 本発明グルシトールリジン誘導体の製）貴Ｎ−２−（Ｎ
−ベンゾイルグリシル）−Ｌ−リジン（蛋白質研究奨、
励会）２００１０（ｌ及びＤ−グルコース１２９ｍｇを
、水及びジオキサン（１：１）混液１０−に溶解させ、
これにＮａ　ＢＣＮＨ３１００ｎ＋ａを加え、空温で３
〜４日間保持した。次いで反応系内に酢酸を加えて反応
を停止させ、蒸留後、メタノールを加えて蒸留した。

これを、ＴＳＫｌ　２ＯＴカラム（東洋曹達社製）を用
いたカラムクロマトグラフィー〔溶媒Ａ１９０％アセト
ニトリル、内部標ｔＢ５０ｍＭＴＦＡ、溶媒８２５％ア
セトニトリル、グラジェントＡ１０冗＋Ｂ９０％→Ａ６
０％十Ｂ４０％〕により精製して、リテンションタイム
が９，９３分く２−７分）に本発明化合物、即ちＮ２−
（Ｎ−ベンゾイルグリシル）−Ｎ６−Ｄ−グルシド−ル
ーし一リジンを得た。収率５８．２％。

得られた本発明化合物のＰＭＲ分析図を第１図に示す。

主なピークは次の通りである。

ＰＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ　ｓ　、２．５０ｐｐｍ　）：δ
（ｐｐｍ　）（４００ＭＨ）＝ ８．６９　（ｔ　、Ｊ−６，０）、８．３０　（＋１１
　＞８．１５　（ｄ、Ｊ＝７．９） ７．８７　（ｄ　、Ｊ−７，６） ７．５４　（ｔ　、Ｊ−７，６） ７．４８　（ｔ　、Ｊ−７，６） ４．２３　（ｄ（ｌｄ、Ｊ−８，３，７，９，４，６）
３．９８　（ｄｄ、Ｊ−１６，７，６，０）３．８７　
（ｄｄ、Ｊ−１６，７，６，０）３．６７　（ｄｄ、Ｊ
−４，８，１，２）３．６０　（ｄｄ、Ｊ−１０，４，
２，８）３．４０〜３．５１　（ｍ　） ３．０７　（ｄｄ、Ｊ−１２，５，３，７＞２．９４　
（ｄｄ、Ｊ−１２，５，８，０）２．８８　（ｎ＋　）
、１．７４．１．６１　（ｍ　）、１、３４　（Ｉｆ　
） また上記で得た本発明化合物を、６　Ｎ　−１−Ｉ　Ｃ
Ｑを用いて加水分解（１２０℃、２０時間）後、アミノ
酸アナライザー（日立８３５）によりアミノ酸分析を行
なった。

その結果グリシン及びグルシトールリジンがほぼ等モル
量にて確認された。

参考例１ ■　免疫抗原の製造 β−リポプロティン（ＬＤＬ、シグマ社製）１ｏＯａ１
ｇを、５０　　ｍＭ　　ＰＢＳ　（ＥＩ　８７．４＞１
０１？に溶解させ、これにＤ−グルコース７００Ｉｌ１
ｇ及びＮａ　ＣＮＢＨｔ　２００ｆｉｌＯを加え、室温
で４〜７日間保持した。次いで反応系内に酢酸を加えて
反応を停止させ、蒸留水に対して透析した。透析液を凍
結乾燥して、目的とする還元型グルコシル化蛋白（ＧＩ
Ｃ−ＬＤＬ）を得た。

上記においてβ−リポプロティンに代え、ポリリジン（
ＰＬ、蛋白質研究奨励金’）　、ＢＳＡ、リジン（Ｌ）
及びヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）の各々を用い、同様
にして還元型グルコシル化蛋白及び還元グルコシル化ア
ミノｌ！ｔ（Ｇ１．Ｃ−ＰＬ。

Ｇｌｃ−ＢＳＡ、Ｇｌｃ−Ｌ及びＧ　Ｉｃ−ＨＳ　Ａ　
）のそれぞれを得た。

上記で得た各グルコシル化蛋白を６Ｎ　　ＨＯ２を用い
て加水分解（１２０℃、２０時間）後、アミノ酸アナラ
イザーによりアミノ酸分析を行ない、全リジン（Ｌｙｓ
ｉｎｅ）に対するＧｌｃ−Ｌの含有比率を求めた。

その結果、Ｇ　Ｉｃ−Ｌ　Ｄ　Ｌでは２９．８９％であ
り、（３１ｃｍ　Ｐ　Ｌでは２４．１０％であり、Ｇ　
Ｉｃ−ＢＳＡでは１５．５６％であり、Ｇ　ＩＣ−１−
Ｉ　Ｓ　Ａでは約１０％（これを「１０％ＧＩＣ−ＨＳ
　Ａ　Ｊとする）であった。尚、上記と同様にして同含
有比率が６１．６％のＧｌｃ−Ｈ８Ａ（これをｒ６１．
６％Ｇｌｃ−Ｈ８ＡＪとする）も得た。

■　モノクローナル抗体の製造 ■−・１　前記で１１たＧｌｃ−ＬＯＬを、３ａｔｂ　
／ｃ系マウスに５μｇ／マウスの投与量で皮下投与した
。

隔週に５回上記投与を繰返して免疫し、最終免疫の３日
後に牌臓を摘出し、牌細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で
３回洗浄した。

マウス骨髄腫ａｍ株Ｐ　３−　ＬＪ　１　（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　ｌ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　。

８１．１−７　（１９７８））を同様に洗浄後、そのｌ
Ｘ１０”個と上記牌細胞１×１０７個とを５０ｍ９３１
！心管に入れ混合した。２００Ｘｇ、５分遠心後、上清
をパスツールピペットで除去した。

３７℃に保温したポリエチレングリコール２０００（和
光純薬社製）３５Ｗ／Ｖ％のＲＰＭＩ−１６４０溶液１
−を滴下し、１０分間かけてゆっくり混合した。３７℃
に保温した１５％ＦＣ３及び１ｍＭピルベートを含有す
るＲＰＭ［−１６４０（以下、これを「完全ＲＰＭＩＪ
という）５−を加え１０分間、更に完全ＲＰＭＩの同儂
を加え４分間、次いで完全ＲＰＭＩの５ｉ１１２を滴下
して１分間それぞれゆっくりと撹拌した。２００×ｇで
５分間遠心後、上清を除去し、この操作を再度繰返した
後、３７℃に保温した完全ＲＰＭＩに、１１１１１ａＩ
Ｘ１０フ個／−となるように懸濁し、２４穴のプレート
（ファルコン社）に１１１ＩＩ２ずつ接種し、３７℃、
５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。２４時間
後１．０Ｘ１０−’Ｍヒポキサンチン、４．ＯＸｌ　０
−　’　Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジ
ンを含む完全ＲＰＭＩ培地（以下ｒＨＡＴ培地」という
）１−を各ウェルに添加した。以後、上清の半分を第３
．４及び５日目にそれぞれ新しいＨＡＴ培地に代え、第
６日目に同様に上清の半分を、１．０Ｘ１０−’Ｍヒボ
キサンチン及び１．ｅｘｌｏ−５Ｍチミジンを含む完全
ＲＰＭＩ培地（以下ｒ）−ＩＴ培地」という）に代えた
。同様に、第６．７及び９日目に上清の半分をＨＴ培地
に代え、第１０８目に上清の半分を完全ＲＰＭＩ培地に
代えた。以後、この完全ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。

かくして得られるハイブリドーマを、限界希釈法により
クローニングした。即ちハイブリドーマ２、５Ｘ１０１
１１／１１１０、Ｂａ１ｂ　／ｃ系ママウス胸腺細胞４
Ｘ１０個／ｌｌｌ１２となるように完全ＲＰＭＩ培地に
調製し、これをハイブリビーフ５個／ウェルとなるよう
に２００ウエルのプレートに播き、培養した。増殖して
くるハイブリドーマを更に同様にバイプリドーマ０．２
５個／ウェルとしてクローニングした。

目的の抗体を産生ずるりＯ−ンの検索は、前記免疫抗原
（Ｇｌｃ−ＢＳＡ）を固定したプレートもしくはビーズ
を用い、１２５　■もしくは酵素で標識したヤギ抗マウ
ス免疫グロブリン（カッベル社）を使用した固定法によ
り行なった。

かくしてクローンＮｏ、ＯＡＬ−Ｍ−１０で表わされ、
後述の特異反応性を有するモノクローナル抗体を産生ず
る所望のハイブリドーマを得た。

■−２上記■−１で得られたクローンＮＯ，ＯＡＬ−Ｍ
−１０を一完全ＲＰＭＩ培地にて５％炭酸ガスインキュ
ベーター中で、３７℃にて４８時間培養した。培養液を
遠心分離（３０００ｒｐｍ　、１０分）して、所望のモ
ノクローナル抗体を含む培養上清を得た。

尚、上記抗体は、ｌ０Ｇ２ａサブクラスに属していた。

これは各種マウス免疫グロブリンクラスに対するウサギ
抗体（Ｌ　１ｔｔｏｎ、Ｂ　１ｏｎｅｔｉｃｏ、　　ｌ
　ｎｃ。

Ｋ　ｅｎｓ＋ｎｇｔｏｎ、ｆｖｌ　Ｄ　２０７９５　）
及び１２５Ｉ標識プロテインＡを使用したイエ−（Ｙｅ
ｈ）らの方法（Ｍ　ｉｎｇ−Ｙａｎ！１１　Ｙｅｈ　ｅ
ｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

５（ｊｉ、、ＬｌｓＡ、Ｖｏｌ、７６、Ｎｏ、６．２９
２７−２９３１　（１９７９））に準じた試験により確
認された。

■−３上記■−１で得たクローンＮｏ、ＯＡＬ−Ｍ−１
０の”＋　ｘ　ｉ　ｏｓ個を、ＲＰＭｌ−１６４０培地
０．５ｍＧに懸濁させ、Ｂａ１ｂ／ｃ系マウスに腹腔内
投与した。２〜３選間後、蓄積した腹水を採取し、目的
抗体を含む腹水２〜５−／マウスを得た。この抗体の濃
度は約０．２〜１ｍａ／ｍＱであった。この腹水５−に
ＰＢＳ５ＷｔＪ及び飽和硫安１〇−を加え、０℃下にゆ
るやかに撹拌した。遠心分離（１００００ｒｏｎ＋ｘ３
０分、４℃）して得た沈漬を、０．０５Ｍトリス塩酸（
ＤＨ８，６）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラ
ム（ファルマシア社製）のゲル濾過に付した。ボイドボ
リウム付近に溶出された分画を同上緩衝液で平衡化した
プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ　（ファルマシ
ア社製）に付し、ＩｇＧ分画を吸着させた後、Ｉ）８５
．５の５０＋ｅＭクエン酸緩衝液で充分洗浄後、ｐＨ４
，３の酢酸緩衝液でＩＩＪＧ２ａを溶出させ、精製抗体
ＯＡＬ−Ｍ−１０を得た。

■　不溶化抗体の１１製 前記■−３で得た精製抗体を、０．１５ＭＮａＣ＜！及
び０．０５％Ｎａ　Ｎ３を含む５０ｍＭＰＢＳ　（ｐ　
Ｈ−７，４）にて２０μ９蛋白量／ｌｌｌＩ２に調製し
た。

ポリスチレンビーズ（Ｐ　ｒｅｃｉｓｉｏｎ　　Ｐ　１
ａｓｔｉｃＣＯ，Ｌ　ｔｄ、、Ｕ　Ｓ　Ａ、直径６．４
ｍｍ＞１万個を、希釈した「ママレモン」　（ライオン
株式会社、原液１．５閾／Ｑ蒸留水）でよく洗浄し、更
に蒸留水で洗浄した。次いでこれを０．５Ｍ苛性ソーダ
水溶液中に３日間浸漬した後、洗浄液がｐＨ約６になる
まで蒸留水で洗浄した。

上記抗体溶液１００舖に、このビーズ８００個を加え、
２時間減圧下に時々撹拌しながら放置し、次いで４℃下
で一晩放置した。ビーズを濾過し、生理食塩水で洗浄後
、０．５％血漿ＢＳＡ　（生化学工業社）を含む５０　
ｍＭＰＢｓ　（ｐ　ｌ−１−７，４＞中に減圧下２時間
、更に４℃下−晩装置した。ビーズを枦取し、充分に洗
浄して不溶化抗体を得た。

■　標識抗原の調製 ■−１前記で１ｑた免疫抗原Ｇｌｃ−ＢＳＡ５０μ０を
０．１Ｍホウ酸緩衝液（（ｌ　Ｈ＝８．２）２００μ９
に溶かした溶液に、Ｎａ１２５　（（ＮＥＮ社）の１ｍ
Ｃ１を加えた。ヨードゲン（［０ｄＯＱｅｎ　；ｐ　１
ｅｒｃｅ社）４０Ｍｇ／２０μＱのジクロルメタン溶液
をガラス試験管に入れ、窒素ガス気流下に溶媒をとばし
て乾燥し、この試験管に、上記抗原溶液を加え、０℃下
に５分間、かるく撹拌しながら反応させた。この反応物
を別の試験管に移し、反応を停止させた後、ゲル濾過（
セファクリール＄２００．１ｘ３３ｃｍ、溶出液＝０．
２％ゼラチン含有５０ｍＭ　　ＰＢＳ（ｐＨ７，４））
により、放射活性のピークに一致するアルブミン分画を
採取して、１２５　Ｉ−標識抗原を得た。

また上記の他に、クロラミンＴ法（Ｎａｔｕｒｅ。

１９４．４９６　（１９６２））及びポルトン−ハンタ
ー法（１３１ａｃｈｅｎ＋、　Ｊ　、、８９　、１１４
（１９６３））に従っても、それぞれ良好な１２５　Ｉ
−標識抗原を得た。

■−２パーオキシダーゼのりジン残基を利用して酵素標
識抗原を作成した。即ち、１０１１（＋／−パーオキシ
ダーゼを５０ｍＭリン酸塩！ｌ衝液に溶かし、これにグ
ルコース７０＋１１（＋及びＮａ　ＢＨｔ　２０ｍ０を
加え、４℃で７日間反応させた。透析後、ゲル濾過及び
アフイニテイクロマトグラフイーにより精製して所望の
標識抗原を得た。

■　標識抗体の調製 前記■−３で得た精製抗体を用い、上記■−１と同様に
して、１２５　■−標識抗体を得た。

■　不溶化抗原の調製 前記で得た免疫抗原Ｇｌｃ−ＰＬを用い、上記■と同様
にして不溶化抗原を得た。

■　抗体の特異性 前記で得た免疫抗原のうち、可溶性のＱｌｃ−ＢＳＡ、
Ｇｌｃ−ＬＤＬ及びＧｌｃ−Ｌをスタンダードとして使
用した。対照としてβ−リボプロティン、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−ソルビトール、リジン及びポリリジンを使用し
た。

前記■−２で得た抗体の１２倍希釈液１００μ９１段階
希釈系列の上記スタンダード又は対照の１００μＱ及び
前記■−１で得た１２５１−標識抗原１００μＱ（約２
００００ｃｐｍ）を、アッセイバッファー（０，１５Ｍ
　　Ｎａ　ＣＱ、０．１％ゼラチン及び０．０２％Ｎａ
　Ｎ３を含む５０　　ｍＭソジウムホスフエートバツフ
ァー、ｐＨ７，４）３００μＱに加え、４℃下に一晩イ
ンキユベートした。抗マウスＩＣＩＧヤギ抗体（ｘ４０
、株式会社日本抗体研究所２４）１００μＱ１正常マウ
ス血清（Ｘ４００）１００μＱ及び１２．５％ポリエチ
レングリコール２００μＱを加えて、ｖ瀉下に３０分間
インキュベートした。遠心分離（３０００ｒｐｍｘ３０
分）及びデカンテーションにより、Ｂ−Ｆ分離を行ない
、両者の放射能を測定した。

結果を第２図に示す。図中、縦軸はＢ　／　Ｂ　。

（％）を、下段横軸はスタンダードの濃度（μｇ／鵬）
及び上段横軸は対照の濃度（μ（１／＋１１１２）を各
々示す。また図において（１）はＧ　ｌｃ−Ｂ　Ｓ　Ａ
、（２）はＧｌｃ−ＬＤＬ、（３）はＧｌｃ−Ｌ、（４
）はβ−リポプロティン、（５）はＤ−グルコース、（
６）はＤ−ソルビトール、（７）はリジン・及び（８）
はポリリジンのそれぞれの結果を示している。

上記第２図より、上記抗体は、グルシトールリジン残基
に極めて高い特異反応性を有することが明らかである。

■　標準曲線（検量線） 上記■において、本発明化合物をスタンダードとして使
用することにより、標準曲線を作成した。

結果を第３図に示す。図中、縦軸はＢ　／　Ｂ　。

（％）を、横軸はスタンダードの濃度（ｎｇ／　ｙａ　
）を示す。また図において（１）は本発明化合物をスタ
ンダードとした結果を、また（２）は６１．６％Ｇｌｃ
−Ｈ８Ａを同様にスタンダードとした結果をそれぞれ示
している。

上記より、６１．６％Ｇ　Ｉｃ−ＨＳ　Ａは、前記アミ
ノ酸分析の結果から、６１．６％のリジン残塁がグルコ
シル化されてはいるが、本発明化合物を基準物とするこ
とにより、６１．６％Ｇｌｃ−Ｈ８Ａの免疫反応に関与
するＧ１ｃｍＬＶＳ残基は、全リジン残基の２８．６％
であることが確認された。

■−１糖尿病患者及び正常人より、血清を採取分離した
。

この血清台５０μＱに８０％エタノール２鵬を加えて混
合し、遠心分離（３０００ｒｐｍ　ｘｌ　５分）して沈
渣を得た。これを１０ｍＭ　　ＮａＢＨｔを含む５０ｍ
　Ｍ　　ＰＢＳ５００μＱに溶解し、３０分間放置した
。５％酢酸１０μＱを加えて反応を停止させ、更に０．
１％ゲラチンを含む５０ｍＭＰＢＳ５００μＱを加え、
以下かくしてＳｇｌ製したものを「検体」として使用し
た。

■−２上記各検体の１００μＱ及び前記■で得た１２５
　Ｉ標識抗体の１００μＱ（約４００００ｃｐｍ　）を
３７℃下に１時間インキュベートした。

これに前記■で得た不溶化抗原（ビーズ）１個を加え、
更に３７℃下で１時間インキュベートした。

ビーズを蒸留水で洗浄後、その放射能を測定した。

その結果、正常人と糖尿病患者とは、明確に区別され、
糖尿病患者においては、非酸素的グルコシル化の度合が
高いことが確認された。

■−３上記検体の２５０μＱに、不溶化抗ヒト血清アル
ブミン抗体（ビーズ）１個を加え、３７℃下に１時間イ
ンキュベートした。蒸留水で洗浄後、前記■で得た１２
５Ｉ−標識抗体の約４００００ｃｐ＋ｎを加えて、３７
℃下で１時間インキュベートした。蒸留水で洗浄後、そ
の放射能を測定した。

この測定結果は、前記第３図に示す標準曲線より、グル
シトールリジン残基のモル数として表示することができ
、糖尿病患者における非酸素的グルコシル化の度合の高
さが正確に把握された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明化合物のＰＭＲ分析図であり、第２図は
抗体の特異性を求めたグラフであり、第３図は本発明化
合物をスタンダードとする標準曲線を示すものである。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされることを特徴とするグルシトールリジン誘導
   体。