JPH02196787A - シュードウリジン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １束上り旦■方１ 本発明は新規なシュードウリジン誘導体及びこれをハプ
テンとして得られるモノクローナル抗体に関する。

従　技術とその問題点 ガンの治療には、その早期発見が不可欠でおり、従来よ
りこれを目的とする各種ガンマ−カーの研究、開発が行
なわれてきており、現在もなお上記マーカーの開発を含
めたガンの早期発見のための技術の開発が種々試みられ
ている。

しかして、一般に生体が癌化すればオンコジーン（Ｏｎ
ＣＯ−ｇｅｎｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａが活性化され、ＤＮＡ、
ｍ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡの代謝が正常細胞に比し相対的
に早くなり、その結果、生体内産生量も増加すると考え
られる。しかもこの内のｔ−ＲＮＡの産生量は伯の核酸
よりも著しく増加することが報告されている。該ｔＲＮ
Ａは、生命科学のドグマでおるＤＮＡ−ｍＲＮＡ−ｔＲ
ＮＡ−蛋白質（酵素）のプロセスを見ても明らかな通り
、従来より種々提案されている一般的腫瘍マーカー、例
えばＡＦＰ　（アルファーフェトプロティン、Ｐｒ０Ｃ
。

５ｏｕｔｈ　Ａｆｒ、Ａｓ５ｏｃ、Ｐａｔｈｏｌ、、ヱ
、６７　（１９６９）：Ｂｕｌｌ、Ｓｏｃ、Ｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｌ、、　４旦、１３８９−１３９８（１９６７）
）が蛋白であることと対比して、之等に比し生体内でよ
り早く産生される。従って、該ｔ−ＲＮＡは現在知られ
ている一般的腫瘍マーカーに比し、ガンの早期発見を可
能とするマーカーとしての可能性が非常に高い。しかる
に、組織中のｔ−ＲＮＡの測定には実際上非常な困難が
伴われ不可能に近い。これに対し、上記ｔ−ＲＮＡの特
異的な構成成分であるシュードウリジン（Ｐｓｅｕｄｏ
ｕｒｉｄｉｎｅ）は、生体の代謝経路テハ代謝されずそ
のままの形で尿中に排出される。この尿中のシュードウ
リジンを正確に測定できる簡便な方法が確立できれば、
これによって間接的に↑−ＲＮＡ量を調べることができ
、このシュードウリジンを腫瘍マーカーとする新しい測
定系の確立が、ｔ−ＲＮＡ測定の代用として、ガンの早
期発見に貢献するものと期待できる。

一方、シュードウリジンが血中及び尿中に存在すること
は確認されており、また健常人の血中及び尿中量に比べ
て、癌患者ではそれぞれ一桁程高値を示す旨の報告もあ
る（ｃａｎｃｅｒ、　−艷Ω。

２４５７−２４６４　（１９８２）：Ｃａｎｃｅｒ、５
７゜１５７１−１５７５　（１９８６））。

しかして、従来より一般に抗体を利用する免疫測定法（
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）はよく知られているが、かか
るシュードウリジンを該免疫測定法により測定しようと
しても、該測定法に利用できる抗体自体未だ未知である
。しかも通常の抗体作成法に従ってシュードウリジンの
塩基部分のアミノ基を利用したり、糖鎖部分を過ヨウ素
分解して生じるアルデヒド基を利用して抗体を作成しよ
うとしても、之等の方法ではシュードウリジンの基本骨
格としての特性が壊れてしまい、得られる抗体自体特異
性がなくなり、かかる抗体の利用では正確な測定は困難
である。また現在、シュードウリジンの測定法としては
、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法が知られ
ているが、この方法はその簡便性は勿論のこと正確性等
の面でも、側底ガンの早期診断法としての実用性は見出
せない。

４　点を解決するための　段 本発明者らは上記現状に鑑み、シュードウリジンをマー
カーとする癌の早期発見のための診断技術乃至測定系の
確立を最終目的として鋭意研究を重ねてきた。その過程
で上記シュードウリジンの免疫測定法（ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ）に利用できる該シュードウリジンに対する抗
体、該抗体の作成のための免疫原、該免疫原のハプテン
としての新しい誘導体の合成に成功し、ここに本発明を
完成するに至った。

即ち、本発明は一般式 Ｃ式中Ａは炭素数８〜１８の脂肪酸残基を示す。〕で表
わされるシュードウリジン誘導体に係わる。

本発明誘導体を表わす上記一般式（１）において、Ａで
定義される炭素数８〜１８の脂肪酸残基には、例えばカ
プリル酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ト
リデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチ
ン酸、ステアリン酸等の直鎖状飽和脂肪酸の残基：イソ
カプリル酸、イソカプリン酸、インラウリン酸、１１−
メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３−メチルテ
トラブカン酸、イソパルミチン酸、イソステアリン酸等
の分枝鎖状飽和脂肪酸の残基；カプロイン酸、トウハク
酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸
、オレイン酸、リノール酸、リルン酸等の不飽和脂肪酸
の残基等が包含され、之等の内では特に直鎖状飽和脂肪
酸の残基が好ましい。

上記一般式（１）で表わされる本発明誘導体の内で特に
好ましいものとしては、例えば下記一般式（２）で表わ
されるものを例示できる。

（式中ｎは、６〜１６の整数を示す。）本発明誘導体は
、シュードウリジンの免疫測定法に有用な特異抗体の作
成のための免疫原、殊にそのハプテンとして有用である
。即ち、本発明誘導体はこれをハプテンとして通常の担
体蛋白と結合させて得られる免疫抗原より、−船釣方法
に従いシュードウリジンに対する特異抗体を容易に製造
できる。殊に、本発明誘導体はそれらが溶液中でミセル
を形成し、リポソーム様の乗合分子となり、該誘導体の
シュードウリジン部分（親水性部分）が外側を向くので
、シュードウリジンの基本母格を破壊することなく抗原
（ハプテン）としての特異性を保持でき、所望の特異抗
体を容易に製造可能とする利点がある。また、かくして
得られる抗体はその利用によりシュードウリジンの免疫
測定、ひいてはガンの測定に有用である。

以下、本発明誘導体の製造法につき詳述する。

水明誘導体は、例えば式 で表わされるシュードウリジンを出発原料として、これ
に適当な不活性溶媒中、塩基性化合物の存在下に、一般
式 ％式％（４） 〔各式中Ａは前記に同じ。Ｘはハロゲン原子を示す。〕 で表わされる脂肪酸のハロゲン化物もしくは無水物を反
応させることにより製造できる。

上記において不活性溶媒としては、通常のもの、例えば
ベンゼン、クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、
ジオキサン、テトラヒドロフラン、ごリジン等を使用で
きる。塩基性化合物としても通常のもの、例えばピリジ
ン、トリエチルアミン等を使用できる。

上記反応における脂肪酸のハロゲン化物及び無水物とし
ては、前記一般式（１）に示す本発明誘導体の基Ａを与
える対応する脂肪酸のハロゲン化物（塩化物等）及び無
水脂肪酸を利用できる。該脂肪酸のハロゲン化物（４）
又は脂肪酸の無水物（５）のシュードウリジン（３）に
対する使用量は、通常少なくとも等モル量程度、好まし
くは等モル−約３倍モル量程度の範囲から選択されるの
がよい。反応温度は一般に約り℃〜３７℃程度、好まし
くは約２０〜２５℃程度とされ、反応は約２０〜３０時
間程度で終了する。

上記反応終了後、本発明誘導体は、通常の分離手段、例
えば溶媒抽出法、再結晶法、カラムクロマドグラフィー
等により反応系内より単離精製することができる。

かくして得られる本発明誘導体は、溶媒中でシュードウ
リジン部分が外側に向いたミセルを形成して、一種のリ
ポソームの形をとるため、この溶媒溶液形態で所望の免
疫抗原として利用することもできるが、特に上記リポソ
ーム様形態での免疫原としての利用性を高めるために、
上記溶媒溶液中には更に必要に応じて例えばメチルアル
ブミンや低比重りボタンバク（ＬＤＬ）　、シリカゲル
等の適当な免疫原性増強物質を添加存在させるのが望ま
しい。

上記免疫原性増強物質を添加存在させた所望の免疫原の
調整は、例えば代表的には、まず本発明誘導体をメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ＞等の適当な溶媒に溶解させ、
これと上記担体物質の適当量及びアジュバントとを、適
当な溶媒中に添加することにより行なわれ、かくして所
望のリボソーム様形態の免疫原を収）ｑできる。上記に
おいて用いられる溶媒としては、一般には水もしくはｐ
Ｈ５〜１０程度の通常の緩衝液、好ましくはＤＨ６〜８
程度の緩衝液を使用できる。また、上記免疫原性増強物
質及びアジュバントの使用割合は、適宜決定でき、特に
限定されるものではないが、通常本発明誘導体に対して
免疫原性増強物質は約０．１〜２．０重量％程度、好ま
しくは約０．１１重量％程度、アジュバントは約１〜２
倍容量程度の範囲とするのが望ましい。上記免疫原の調
整温度としては、通常Ｏ〜４０″Ｃ程度、好ましくは室
温付近を採用できる。

かくして得られる免疫原は、これを利用してシュードウ
リジンに対して特異反応性を有する所望の抗体（抗シュ
ードウリジン抗体）を製造することができる。該抗体の
製造は、−膜内方法に従い、例えば具体的には上記免疫
原を哺乳動物に投与し、生体内に所望抗体（ポリクロー
ナル抗体）を産生させ、これを採取するか、或いは上記
免疫原で免疫された哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と
哺乳動物の形質細胞腫細胞とのハイブリドーマを作成し
、これより所望抗体（モノクローナル抗体）を産生する
クローンを選択、培養することにより行なわれ、特に後
者の方法は好ましい。、上記いずれの方法においても、
抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特に制限は
なく、ウサギ、モルモット、マウス、ラット等の各種の
ものを利用できるが、特に上記モノクローナル抗体の製
造の場合には、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との
適合性を考慮して、一般にはマウス、ラット等を選択し
て用いるのが好ましい。

上記抗体の製造法において免疫は一般的方法により、例
えば免疫抗原を哺乳動物に静脈内、皮肉、皮下、腹腔内
注射等により投与することにより実施できる。より具体
的には、免疫抗原を、所望により通常のアジュバントと
併用して、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、総投
与量が、例えばマウスでは約１０〜１００μｑ程度にな
るようにすることにより行ない得る。抗体の採取は上記
最終投与の１〜２週間経過後、免疫化された動物から採
血し、これを遠心分離）変、血清を分離することにより
行なわれる。

また上記モノクローナル抗体の製造において用いられる
免疫細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出した
牌臓細胞を使用するのが好ましい。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動
物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のもの、
例えばＩ）３　（Ｉ）３／Ｘ６３−ＡＱ８）　　（Ｎａ
ｔｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７（１９７５）　）
　、ｐ３−Ｕ　１　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓｉ
ｎ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、　８ユ、１−７（１９７Ｂ＞　）　、Ｎ５−
１　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　５゜５１１−
５１９　（１９７６））、ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ、旦
、４０５−４１５　（１９７６））、５Ｐ２１０　（Ｎ
ａｔｕｒｅ、２７６．２６９−２７０（１９７８）　）
　、ＦＯ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、３５゜１
−２１　　（１９８０））、ｘ６３．６．５．３゜（Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１２３．　１５４８−１５５
０（１９７９））、５１９４　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、
、１４８゜３１３−３２３　（１９７８））等や、ラッ
トにおけるＲ２１０　（Ｎａｔｕｒｅ、　２７７、１３
１−１３３（１９７９））等の骨髄腫細胞等を使用でき
る。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばマイルスタイン（Ｈｉ　１ｓｔｅｉｎ）ら
の方法（）ｌｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　ｖｏｌ、　７３　、　ｐＤ３（１９８１））等に準
じて行なうことができる。

より具体的には、上記融合反応は、通常の融合促進剤、
例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウ
ィルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常の培地中で実施さ
れ、培地には更に融合効率を高めるためにジメチルスル
ホキシド等の補助剤を必要に応じて添加することもでき
る。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方
法と変りはなく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細
胞を約１〜１０倍程度用いるのが普通である。融合反応
時の培地としては、上記形質細胞腫細胞の増殖に通常使
用される各種のもの、例えばＲＰＭ１１６４０培地、Ｍ
ＥＭ培地、その他のこの種細胞培養に一般に利用される
ものを例示でき、通常２等培地は牛胎児血清（ＦＯ３）
等の血清補液を抜いておくのがよい。融合は上記免疫細
胞と形質細胞腫細胞との所定量を、上記培地内でよく混
合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平
均分子１１０００〜６０００程度のものを、通常培地に
約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて混ぜ合ぜることに
より行なわれる。以後適当な培地を逐次添加して遠心し
、上清を除去する操作を繰返すことにより所望のハイブ
リドーマが形成される。

得られるハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、
例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン及
びチミジンを含む培地）で培養することにより行なわれ
る。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドー
マ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時
間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られる
ハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とする
抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇ
ｖａｌｌ、Ｅ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　
　７Ω、４１９−４３９　（１９８０））、プラーク法
、スポット法、凝集反応法、オクテロニ−（ｏｕｃｈｔ
ｅｒ＋ｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ＞法
等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法（「
ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ
＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、昭和５７年３月
５日〕に従い実施することができ、この検索には前記免
疫抗原が利用できる。

かくして得られる所望のモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することがで
き、また成体窒素中で長期間保存することができる。

上記ハイブリドーマからの目的抗体の採取は、該ハイブ
リドーマを、常法に従って培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性の必る哺乳動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採
用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、グル濾過
法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手段に
より精製することができ、かくして所望の抗シュードウ
リジン抗体を製造できる。

得られる抗体は、シュードウリジンに特異反応性を有す
るものであり、従ってその利用によれば、免疫測定法に
よって各種検体、例えば血や尿等の中に存在するシュー
ドウリジン量を正確に測定することができ、この測定値
の対比によって、癌のスクリーニング及び診断を行なう
ことができる。

本発明はかかる癌の診断方法及びそのための癌診断用キ
ットをも提供するものである。

本発明に従うシュードウリジンの測定は、上記特定の抗
体を使用することを必須の要件として、その基本的操作
は、通常の免疫検定法、例えばラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等に従うことが
できる。之等各免疫検定法における操作、手順等は一般
に採用されているそれらと特に異ならず、例えば公知の
直接法、間接法、競合法等に準じることができる。

上記において検体としては、体液、例えば血液、尿等を
好ましく使用できる。

上記方法において標準抗原（スタンダード）としては、
前述した精製抗原を使用できる。不溶化法（不溶化抗原
又は不溶化抗体を用いる方法）を採用する場合は、常法
に従い上記標準抗原又は抗体は、不溶性担体に化学的又
は物理的に反応させることにより製造される。ここで不
溶性担体としては、例えばセルロース粉末、セファデッ
クス、セファロース、ポリスチレン、を戸紙、カルボキ
シメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、
プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロ
ン、ガラスピーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエー
テル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレ
ン−マレイン酸共重合体等を使用できる。不溶化は、共
有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導
体法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイミド樹脂
法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法
、臭化シアン活性化多糖休演、セルロースカルボナート
誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アルキル化法
、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてゲルター
ルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を用い
る＞、ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学的反応；或
いはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法
；ガラスピーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物
理的吸着法によって行なわれる。

標識抗原又は標識抗体としては、前記標準抗原又は抗体
を、通常の放射性物質、酵素標識物質、螢光物質等の各
種標識剤で標識化したものを用い得る。ここで放射性物
質としては、　　　■等の放射性ヨード等を、螢光物質
としては、フルオレツセイン・イソチオシアナート（Ｆ
ＩＴＣ＞、テトラメチルローダミン・インチオシアナー
ト（ＴＲＩＴＣ＞　、置換ローダミン・イソチオシアナ
ート（ＸＲＩＴＣ＞　、ローダミンＢ・イソチオシアナ
ート、ジクロロトリアジンフルオレツセイン（ＤＴＡＦ
）等を、酵素標識物質としては、パーオキシダーゼ（Ｐ
ＯＸ）　、マイクロパーオキシダーゼ、キモトリプシノ
ーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラ
ーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナーゼ等をそれぞれ挙げること
ができる。これら標識剤による標識方法もまた常法に従
うことができる（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２５
４゜９３４９−９３５１　（１９７９）：Ｎａｔｕｒｅ
。

１９４．４９５　（１９６２）：螢光抗体法、医化学実
験講座Ｎｏ、　４．２６３−２７０；Ａｃｔａ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、５ｕｌ）Ｏｌ、、１６８．２０
６　（１９７２）　：Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、
ＳＣｉ、　、ＵＳＡ、５７，７１３（１９６７）等参照
〕。

上記方法における検体（体液）中のシュードウリジンの
測定・定量は、該検体と上記標準抗原、不溶化抗原、不
溶化抗体、標識抗原及び標識抗体のいずれかを免疫反応
させることにより実施される。その際測定系に利用され
る溶媒としては、反応に悪影響を与えない通常のもの、
例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩
衝液、酢酸緩衝液等のｐＨ４〜８程度の緩衝液を好まし
いものとして例示できる。また測定の際の免疫反応条件
は特に制限はなく、通常のこの種測定法と同様のものと
することができる。即ち該免疫反応は一般に４５°Ｃ以
下、好ましくは約４〜４０℃の温度条件下、１〜４０時
間を要して行なわれる。

免疫反応終了後の結合体及び遊離体（Ｂ−Ｆ）の分離も
公知の方法に従い、例えば不溶化法を採用したときは、
遠心分離、炉別、洗浄、デカンテーション等の手段によ
り固相一液相を分離して実施できる。その他の場合には
例えばデキストラン−活性炭法、第２抗体法等の常法に
従えばよい。

本発明に従うシュードウリジンの測定操作を、液相法を
例にとり詳述すれば、該方法は（１）まず測定しようと
する検体中の被検物質と一定量の抗体とを、標識抗原の
一定量と競合反応させ、次いでデキストラン−チャコー
ル法（Ｄｅｘｔｒａｎ−ｃｈａｃｏａｌ）でＢ−Ｆ分離
を行ない、そのいずれか一方の標識剤活性を測定して被
検物質量を定量する、 （２）まず被検物質と一定量の標識抗原とを、−定量の
抗体と競合反応させ、次いで第２抗体法によりＢ−Ｆ分
離し、そのいずれか一方の標識剤活性を測定して被検物
質量を定量する等の方法により実施できる。

上記測定法の実施に特に便利な方法は、血液や尿等の体
液中のシュードウリジン量を測定するためのキットを使
用する方法である。このようなキットには、シュードウ
リジンと特異的に抗原抗体反応をする抗体、即ち抗シュ
ードウリジン抗体を含有せしめることが重要である。こ
の抗体試薬には、グリセロールやウシ血清蛋白のような
安定化剤及び／又は保存剤を添加することができる。好
ましくは、この抗体試薬は凍結乾燥したものであり、キ
ットには水溶性もしくは水と混和しうる溶媒を含有させ
ることができる。更にこの抗体試薬には再構成された試
薬系を一定のＤＨに保つための緩衝液及び／又は使用前
に試料が悪化するのを防ぐための保存剤及び／又は安定
剤を添加することができる。緩衝液はキット試薬の必須
成分ではないが、上記測定法の実施の際にｐＨを４〜８
程度とするものを用いるのが好ましい。また再構成剤は
好ましくは水を含んだものでおるが、水の一部又は全部
を水と混和し得る溶媒で置き換えることもできる。水と
混和し得る溶媒は当業者に周知であり、例えばグリセリ
ン、アルコール類、グリコール類、グリコールエーテル
類等を使用できる。

及−皿−ニー皇−ヌ 本発明のシュードウリジン誘導体は、抗シュードウリジ
ン抗体の製造のための免疫原として利用でき、その利用
により得られる上記抗シュードウリジン抗体の利用によ
れば、免疫検定法によって、非常に簡便に且つ高精度、
高感度にて体液中のシュードウリジン量を測定でき、こ
の測定値を健常人の当該値と比較することにより、被検
者における癌のスクリーニング及び／又は診断が可能で
ある。殊に上記抗体を利用する免疫検定法は、既存の癌
マーカーを利用するそれに比し、癌の早期発見に極めて
有効である。

大−一度一−Ｖ 以下、本発明を更に詳しく説明するため本発明誘導体の
製造例、免疫抗原の調製例及び抗体の調製例及び該抗体
の利用による尿中シュードウリジンの測定例を実施例と
して挙げる。

実施例　１ バルミトイル　シュードウリジンの製造■　シュードウ
リジン（シグマ社製＞２４０ｍｇ（１ｍＭ）を、ピリジ
ン及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ＞（いずれも和光
紬薬社製）の４：１（容積比）混液５回に溶解後、これ
に塩化バルミトイル（和光紬薬社製）５４０ｍｇ（２ｍ
Ｍ）を加えて室温で一昼夜反応させた。

得られた反応物に過剰量のジエチルエ”−テル（和光Ｉ
ＩＴ！薬社製）を加え、沈澱を析出させ、これを濾紙に
て濾過し、沈澱物を更にジエチルエーテルで洗浄後、エ
タノール（和光紬薬社製）に溶解させて４°Ｃで再結晶
させ、得られた結晶を更に上記と同様にしてジエチルエ
ーテル洗浄し、最後に減圧乾燥して、本発明誘導体を得
た。

■　上記で得られた結晶をＮＭＲ分析に付すことにより
、該結晶が５′−モノーパルミトイ　シュードウリジン
（本発明誘導体）の単一物であることを確認した。

該ＮＭＲ分析図は第１図の通りでおり、主なＮＭＲデー
ターは次の通りである。

７．３２　（ｄ、Ｊ＝１．２．ピリミジン環の６位−日
）、 ４．６９　（ｄｄ、Ｊ＝５．４，１．２．　リボースの
１′位−目）、 ４．３５　（ｄｄ、Ｊ＝１２．０，３．５．　リボース
の５′位−日）、 ４．２４　（ｄｄ、Ｊ＝１２．０．５．８．　リボース
の５′位−日）、 ４．１２　（ｄｄｄ　、Ｊ＝５．８，５．４，３．５゜
リボースの４′位−日）、 ４．０２　（ｔ、Ｊ＝５．４．リボースの２′３′位−
日）、 ４．００　（ｔ、Ｊ＝５．４．リボースの２′３′位−
Ｈ〉、 ２．３３　（ｔ、Ｊ＝７．７．アシル基のＨ）、１．６
１　（ｍ、バルミトイルの一〇Ｈ２＞、１．２６（ｍ、
バルミトイルの一〇Ｈ２＞、０．８８　（ｔ、Ｊ＝７．
３．バルミトイルのＣＨ３） 上記単一物のフラクションを集めて、５′−モノ−バル
ミトイルシュードウリジンを得た。その収率は８６％で
めった。

尚、上記ＮＭＲのデーターは次のように帰属される。即
ち、０．８８．１．２６．１．６１及び２．３３ＣＤｍ
のシグナルは、エステル結合したパルミチン酸を示して
いる。４．３５及び４．２４ｃｐｍのシグナルは、５′
−位の水酸基が化学シフトしていることから、パルミチ
ン酸が５′−位の水酸基に結合していることを示してい
る。

４．６９ＣＩ）ｍ　　（ｄ、ｄ　、　Ｊ＝５．４＞（７
）シクナルハ１′−位のプロトンを示している。７．５
１ｃｐｍのシグナルは、ピリミジン塩基のプロトンを示
している。之等のことから５′−位のバルミトイル化が
確認される。

また上記で得られた結晶の融点は、シリコンオイルで測
定した結果、１６９．２乃至１７０．８℃であった。

実施例　２ ■　免疫原の調製 １％のメチル化牛血清アルブミン（メチル−ＢＳＡ）を
含む生理食塩水１１１ｉ２中に、ＤＭＳＯ１００μＱ中
に実施例１の■で調製した本発明誘導体１００μＱを含
む溶液の１００μＱを混和し、これにフロイントの完全
アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊ
ｕｖａｎｔ、ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄ
ｅｔｒｏｉｔ。

Ｈｉｃｈｉｏａｎ　ＵＳＡ）　１　ｎ１２を加え、全量
を混合してエマルジョン状態として、免疫原を調製した
。

■　上記■で調製した免疫原１００μＱをマウス［Ｂａ
１ｂ／ＣＩに皮下投与し、２週間後に同液を同量分皮下
投与（２回目）し、更に２週間後に同液を同量分皮下投
与（３回目）した。但し、２回目以降の免疫には上記完
全アジュバントと等量の不完全アジュバントとを使用し
た。

最終免疫の３〜４日後に、上記で免疫されたマウスの牌
細胞とマウス骨髄腫瘍細胞［ｐ３Ｕ１、Ｃｕｒｒｅｎｔ
　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａ
ｎｄＩｍｍｕｎｏ＋ｏｇｙ、旦１．１−７　（１９７Ｂ
））とを１０：１　（重量比）の割合で用い、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ−４０００＞を細胞融合促進剤
として用いて、細胞融合を行なった（　Ｍｅｔｈｏｄｎ
　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　７３．　ｐ３（１９８１
）等参照〕。

かくして得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、ＨＡ
Ｔ培地で選別後、その上清を本発明誘導体をコートした
９６穴マイクロプレート及びパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウスグロブリン抗体〔イー、ソイ。ラブ（Ｅ、　Ｙ
、　ｔａｂ、　）社製〕を用いた酵素免疫法により試験
して、目的のシュードウリジンに対する抗体産生株を検
出した。

限界希釈法によりクローニングを繰返して、所望の抗体
産生クローンの３株（之等をそれぞれｒＯＡＬ８８１Ｊ
、ｒＯＡＬ８１２Ｊ及びｒＯＡＬ８１４Ｊと命名する）
を得た。

各クローンから得られたそれぞれの抗体の特性を以下の
方法に従って求めた。

ａ）　抗体のサブクラス マウス抗体サブクラス検出キット（バイオ・ラット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）社製）を用いて決定した。

ｂ）　交叉反応性 既存のシュードウリジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〉
、ウラシル（和光紬薬社製）及びアデノシンリボース（
和光紬薬社製）を用いて、競合法（Ａ、Ｌ、５ｔｅｉｎ
ｅｒ、ＣＪ、Ｐａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｄ、Ｈ，に１ｐｎ
ｉｓ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４７．１１０６−１１１３
（１９７２）　：　Ａ、Ｌ、５ｔｅｉｎｅｒ、Ａ、Ｓ、
Ｐａｇｌｉａｒａ、Ｌ、Ｒ。

Ｃｈａｓｅ　ａｎｄ　Ｄ、Ｈ、Ｋｉｐｎｉｓ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４７゜１１１４−１１２０
　（１９７２））により、抗体の交叉反応性を調べた。

上記特性試験の結果を下記第１表に示す。

第　　　１　　　表 なあ、上記抗体産生株０ＡＬ８”１４は、工業技術院微
生物工業研究所に、受託番号　微工研菌奇第１０４３７
号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０４３７＞として寄託されてい
る。

実施例　３ 本発明シュードウリジン誘導体を用いて作成したモノク
ローナル抗体による尿中シュードウリジンのアッセイ ■　アッセイ操作法 ２５μＱのスタンダード［標準物質］もしくは被検検体
（人尿）を、予め０．５μｇ／１００μＱのシュードウ
リジン−ＢＳＡを同相化した後、０．２％ゼラチンを含
む５０ｍＭ　　ＰＢＳでブロッキングした９６穴プレー
トの各ウェルに分注した。

上記各ウェルに次いで０ＡＬ８１４の産生するモノクロ
ーナル抗体を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４＞
１００μＱを加え、４°Ｃで一夜インキユベートし、そ
の後、５０ｍＭ　　ＰＢＳ中に０．０１％ツイーン２０
（和光紬薬社製）を含む洗浄液にて各ウェルを２回洗浄
した。

更に各ウェルに、抗マウスＩｇＧ・アルカリホスファタ
ーゼの標識体（ＺＹＭＥＤ社′ＩＡ＞を３０００倍希釈
した溶液１００μＱを加え、室温で１時間インキュベー
トし、その後、上記と同一の洗浄液で２回洗浄した。

上記で処理されたウェルに、次いで酵素基質液［１Ｍ　
　ジェタノールアミン１鵬中にｐ−ニトロフェニルホス
フェート２ｍｇを含む液（ｐＨ１０，０）］の１００μ
Ｑを加えて、室温で３０分間反応させ、５０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ　　４Ｎａ溶液を加えて、反応を停止させた。

上記反応液中のシュードウリジン量を、４０５ｎｍでの
吸光度測定により求めた。なお、この測定はタイターチ
エツク（アボット社製）により行なった。

■　各種ヌクレオチドに対する反応性 上記■記載の方法において、被検検体として既知量の各
種ヌクレオチドを含む緩衝液を用いて、これに各ヌクレ
オチドに対するモノクローナル抗体の反応性を調べた。

上記ヌクレオチドとしてシュードウリジン（図中（１）
として示す）、アデノシン（図中（２）として示す）、
ｃ−ＡＭＰ（図中（３）として示す）、グアノシン（図
中（４）として示す）、チミジン（図中（５）として示
ｖ）、シトシン（ず中（６）として示す）、リボース（
図中（７）として示す）及びウリジン（図中（８）とし
て示す）を用いて得られた結果を第２図に示す。

第２図において横軸は用いた各種ヌクレオチドの添加量
（ナノモル／ｍＱ）であり、縦軸は前記■記載の方法に
準じて測定されたＢ／Ｂｏ（％）である。

該図より、本発明誘導体を用いて作成したモノクローナ
ル抗体を利用した方法によれば、シュードウリジンが選
択的に測定できることが判る。

■　患者の尿中シュードウリジンの測定前記■に記載の
方法に準じて、１日４回に別けて採取した患者の尿を被
検検体とし、これら各サンプル中のシュードウリジン量
をそれぞれ測定した。

６名の患者につき行なった上記試験の結果、各患者の４
回の測定値はいずれも日内交差５％以内であった。この
ことから上記測定法は信頼性のあることが判った。

また、患者８名につき経日的に採取した尿中のシュード
ウリジン量を、同様にして測定したところ、測定値は再
現性のあるものであり、いずれも日差再現１０％以内で
あった。

■　添加回収試験 前記■に記載の方法に準じて、患者の尿に１００〜８０
０ナノモル／ｍＱのシュードウリジンを添加したものを
検体とし、これらのシュードウリジン量をそれぞれ測定
した。

その結果、測定値は上記シュードウリジン添加量をよく
反映しており、シュードウリジン無添加の患者尿の測定
値を差引いた添加シュードウリジンの回収値（％）が１
０％以内のばらつきのないものであった。

■　希釈試験 前記■に記載の方法に準じて、患者尿をそれぞれ２．４
及び８倍に希釈して、之等各希釈検体のシュードウリジ
ン量を測定した。

患者３名につき行なった上記試験結果を第３図に示す。

第３図において、横軸は希釈倍率を、縦軸はシュードウ
リジン測定量を示し、（１）〜（３）は各患者を示す。

該図より、各患者の尿中シュードウリジン測定値は、希
釈倍率に応じて直線的に増加しており、この測定法によ
れば正確にシュードウリジンを測定できることが明らか
である。

■　前記■に記載の方法に従い、健常者１７名、膀胱癌
患者１７名及び腎癌患者２０名の各患者尿中のシュード
ウリジン量を測定した。

その結果、健常者の測定平均値は２８．１±６．１ナノ
モノ／噌であったのに対して、膀胱癌患者の測定平均値
は４０．６±１６．１ナノモル／ｒｒｌ！Ｑであり腎癌
患者のそれは４４．７±１５．７であり、この値より本
測定法によって癌の診断を行ない得ることが明らかとな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得た５′−モノバルミトイル　シ
ュードウリジンのＮＭＲ分析図でおる。 第２図は実施例３の■に従い、本発明シュードウリジン
誘導体を用いて作成したモノクローナル抗体とシュード
ウリジン、その他のヌクレオチドとの反応性を調べたグ
ラフである。 第３図は実施例３の■に従い、患者の尿中シュードウリ
ジン量を測定した結果を示すグラフでおる。 （以　上） ィ雫シヲＬ戸ごイｆ５牽

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ａは、炭素数８〜１８の脂肪酸残基を示す。〕 で表わされるシュードウリジン誘導体。
2. （２）請求項（１）に記載のシュードウリジン誘導体を
   ハプテンとして得られ、シュードウリジンと反応性を有
   することを特徴とするモノクローナル抗体。