WO2006137447A1

WO2006137447A1 - シュードウリジン保護体の安定結晶

Info

Publication number: WO2006137447A1
Application number: PCT/JP2006/312426
Authority: WO
Inventors: Kenji Kitano
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2006-12-28
Also published as: EP1897878A1; US20100216985A1; JP5192807B2; US7968521B2; JPWO2006137447A1; EP1897878A4

Abstract

　　本発明はＲＮＡオリゴマーなどの原料として有用な下記構造式で示される安定で高純度のシュードウリジン保護体の結晶を提供する。（式中、Ｍはトリチル基及びその誘導体を示す。）　また、エステル系溶媒及び／又はアルコール系溶媒を用いて、シュードウリジン保護体を含む溶液からシュードウリジン保護体を晶析することを特徴とする、上記結晶の製造法に関する。この方法は、シリカゲルカラム処理を必要としないため、操作が簡便であり、環境汚染の付加も少なく、かつ安価に目的とするシュードウリジン保護体を製造することができる。

Description

明細書

シユードウリジン保護体の安定結晶

技術分野

[0001] 本発明は、 RNAオリゴマーなどの原料として有用なシユードウリジン保護体の結晶及びその製造法に関するものである。

背景技術

[0002] シユードウリジンのホスホロアミダイト体は、修飾ヌクレオシドを含む RNAオリゴマーの化学的自動合成時の原料として使用されている。例えば、 Biochimie, 77, 125 ( 1995)では、イーストの tRNA合成時にシユードウリジンのホスホロアミダイト体が原料の 1つとして使用されている。

[0003] また、近年、遺伝子創薬 (アブタマ一、 RNA干渉等）が注目されており、このようなオリゴマー合成時の原料の 1つとして、シユードウリジンのホスホロアミダイト体が用いられている。

[0004] シユードウリジンを含む RNAオリゴマーをィ匕学的に自動合成する際、 5，位および 2 ，位水酸基を適当な保護基で保護したシユードウリジンの 3 '—ホスホロアミダイト体が通常用いられる。具体的には、上記の文献においては、 5'位を 4, 4'ージメトキシトリチル（DMTr)基、 2 '位を t -ブチルジメチルシリル (TBDMS)基でそれぞれ保護したシユードウリジンの 3， - (2—シァノエチル一 N, N—ジイソプロピル）ホスホロアミダイト体が使用されている。

[0005] このようなホスホロアミダイト体は、シユードウリジンの 5，位を DMTr化し、続いて 2，位を TBDMS化した後、 3'位をアミダイト化する方法で合成されており、第一工程のシユードウリジンの DMTr化は、ピリジン中、室温下、 4, 4，ージメトキシトリチルクロリド (DMTrCl)とシユードウリジンとを反応させ、分液処理後、シリカゲルカラムで精製し、目的の保護体を取得している。なお、上記文献ではシユードウリジンの 5 ' -DMTr 体の性状について記述されていない。しかし、 Helvetica Chimica Acta, 78, 17 05 (1995)においては、同様に合成されたシユードウリジンの 5， -DMTr体が無色泡状物（colorless foam)として取得されたと記述されて、る。 [0006] 非特許文献 l : Biochimie, 77, 125 (1995)

非特許文献 2 : HELVETICA CHIMICA ACTA, 78, 1705 (1995) 発明の開示

[0007] 上記 DMTr化反応において、シユードウリジンの 5'位の他にも 2'位及び Z又は 3' 位も DMTr化された保護体が副産物として生成し、次工程の 2'位 TBDMSィ匕において、それら副産物による副反応により目的の保護体の収量が低下する等の問題があった。このため、 DMTrィ匕反応後のシリカゲルカラムによる精製工程は必須の処理工程と認識されている。

[0008] し力しながら、シリカゲルカラムを使用した精製処理は、操作が煩雑であると共に、有機溶媒を大量に必要とするため、環境に悪影響を及ぼし、かつ目的化合物の製造コストを上昇させる主要な原因となっていた。

[0009] また、従来法で得られる泡状の 5' -0- (4, 4'ージメトキシトリチル)シユードゥリジンは、非晶質 (アモルファス)であるため、安定性に欠け、品質にバラツキが生じやす V、等の問題点も有して、た。

[0010] 本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、全く意外にも、 5' -0- (4, 4 ，ージメトキシトリチル）シユードウリジン力エステル系及び Z又はアルコール系の有機溶媒を用いる晶析処理で結晶として取得することができ、かつシリカゲルカラムによる精製処理を必要とせず、得られた結晶も高純度で安定であることを見出し、この知見を発展させ、本発明を完成した。。

[0011] すなわち、本発明は下記の構造式で示されるシユードウリジン保護体の結晶を提供するものである。

(式中、 Mはトリチル基及びその誘導体を示す。 )

このような本発明の一形態においては、式中の Mはジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基又はトリチル基のいずれかとすることができ、一例として式中の Mは 4, 4 '—ジメトキシトリチル基とすることができる。

[0013] また、本発明に力かる製造法は、前記構造式のシユードウリジン保護体の結晶を製造する製造法であって、エステル系溶媒及び Z又はアルコール系溶媒を用いて、シユードウリジン保護体を含む溶液力ゝらシユードウリジン保護体を晶析することを特徴とする。

[0014] 本発明の製造法の好適な一実施形態によれば、前記エステル系溶媒は、酢酸ェチル、酢酸メチル、酢酸 n—ブチル等の酢酸エステル類とすることができ、前記アルコール系溶媒は、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の炭素数 7以下の直鎖又は分岐を有するアルコール類であるとすることができる。また、本発明においては、ェステル系溶媒で粗結晶を得た後、アルコール系溶媒でその粗結晶を再結晶することも可能である。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]図 1は、 5，一O— (4, 4，ージメトキシトリチル)シユードウリジン結晶の粉末 X線回折パターンを示したものである。

[図 2]図 2は、 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）シユードウリジン結晶の TGZDT Aカーブを示したものである。

[図 3]図 3は、 5'—O—トリチルシユードウリジン結晶の粉末 X線回折パターンを示したものである。

[図 4]図 4は、 5，一O—（4ーメトキシトリチル)シユードウリジン結晶の粉末 X線回折パターンを示したものである。

発明を実施するための最良の形態

[0016] [本発明の結晶]

本発明の結晶は、次の構造式で示されるシユードウリジン保護体の結晶に関するものである。

(式中、 Mはトリチル基及びその誘導体を示す。 )

[0018] 式中、 Mで表されるトリチル基の誘導体としては、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基を例示することができ、特に 4, 4'—ジメトキシトリチル基が好適な保護基として挙げることができる。

[0019] このようなシユードウリジン保護体の結晶は、シリカゲルカラムによる精製処理を行わずとも、 HPLC分析で、目的とするシユードウリジン保護体の結晶を 95% (wZw) 以上、好ましくは 98%以上含み、その他の類縁ィ匕合物は 5%以下、好ましくは 2%以下の純度を有する。

[0020] なお、その他の類縁ィ匕合物としては、たとえば 2' , 5' O ジ（トリチル又はその誘導体)シユードウリジン、 3' , 5，一 O ジ（トリチル又はその誘導体)シユードウリジンなどのシユードウリジンのジトリチル体を意味する。

[0021] 本発明のシユードウリジン保護体の結晶は、粉末 X線分析において特徴的なピークを有し、たとえば 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）シユードウリジン結晶を Cu—K α線を用いた粉末 X線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（2 0 )力 4. 6, 8. 0, 9. 3, 12. 3, 12. 9, 14. 5, 16. 6, 17. 3, 18. 6, 19. 1, 20 . 3, 21. 4, 21. 8, 23. 7, 24. 7および 26. 1 (。；)付近に特徴的ピークを示す（図 1 参照)。

[0022] また、 5'—Ο トリチルシユードウリジン結晶の場合には、回折角（2 Θ )が 4. 60,9.

10, 13.02,14.58, 16.68, 17.92, 19.14,20.78, 21.36および 24. 76に特徴的なピークが認められ（図 3参照）、 5' -0- (4 モノメトキシトリチル)シユードウリジン結晶の場合には、回折角（2 0 )が 4.60,9.76, 12.20,12.94,16.60,17.84, 18.52,19.0 4,20.66,21.24,21.70および 24. 60に特徴的なピークが認められる（図 4参照）。

[0023] 一般に、粉末 X線回折における回折角（2 Θ )は、 5%未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末 X線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が 5%未満の誤差で一致する結晶も本発明のシユードウリジン保護体の結晶に包含される。

[0024] [本発明結晶の製造法]

本発明の結晶は、エステル系溶媒及び Z又はアルコール系溶媒を用いて、シユードウリジン保護体を含む溶液力シユードウリジン保護体を晶析することにより調製することがでさる。

[0025] エステル系溶媒としては、酢酸ェチル、酢酸メチル、酢酸 n—ブチル等の酢酸エステル類を用いることができ、アルコール系溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の炭素数 7以下の直鎖もしくは分岐を有するアルコール類を用いることができる。このような溶媒の中でも、酢酸ェチルとエタノールが特に好ましい。

[0026] シユードウリジン保護体の晶析法は、特に限定されるものではな、が、エステル系溶媒で粗結晶を得、次にアルコール系溶媒でさらに再結晶するという手順が、高純度の結晶を取得する点では好まし、。

[0027] 具体的に、最初に、有機溶媒中、シユードウリジンと保護基の塩ィ匕物とを室温下数時間反応させる。反応後、反応液を水とエステル系溶媒とで分液し、有機層を減圧下濃縮した後、残渣をエステル系溶媒で共沸し、シユードウリジン保護体をエステル系溶媒に加熱溶解する。

[0028] 加熱溶解後、シユードウリジン保護体含有液を室温 (23〜27°C)下で放置してシュ一ドウリジン保護体の粗結晶を得、次ぎに得られた粗結晶をアルコール系化合物で共沸後、アルコール系溶媒に加熱溶解し、室温下で放置し、析出した結晶をろ取することで、シユードウリジン保護体の高純度の結晶を取得することができる。なお、結晶の取得収率が低い場合には、上記結晶のろ液から、上記した晶析処理を実施することで、 2番結晶を回収してもよい。

[0029] 力べして得た結晶は、室温〜 100°C、好ましくは 60〜90°C下、 3〜6時間減圧乾燥させ製品とする。

[実施例]

[0030] 以下、実施例、試験例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例よつて限定されないことは明らかである。

[0031] [実施例 1]

5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル)シユードウリジン結晶の製造

モレキュラシ一ブス 4Aで乾燥したピリジン（36ml)でシユードウリジン（4. 77g, 18. 3mmol)を 2回共沸脱水した後、ピリジン（72ml)に懸濁した。室温撹拌下、 4, 4' - ジメトキシトリチルクロリド（7. 45g, 22mmol)をカ卩え、すり栓で蓋をして同温度で 2時間撹拌した。

[0032] 反応液に室温下、水（7ml)をカ卩え、減圧下濃縮し、残渣に酢酸ェチル（110ml)を加え、水（30ml)で 2回、飽和重曹水（30ml)で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を酢酸ェチル（55ml)で 3回共沸し、酢酸ェチル（5 5ml)を残渣にカ卩えて加熱溶解し、 25°C下で 22時間放置し、析出した結晶をグラスフィルターでろ取した。

[0033] ろ取した結晶を酢酸ェチルで 1回洗浄した後、酢酸ェチル（93ml)を加え加熱懸濁後、 25°C下で 1時間放置し、析出した結晶をグラスフィルターでろ取した。ろ取した結晶を酢酸ェチルで 1回洗浄した後、エタノール（74ml)で 3回共沸し、エタノール（74 ml)に加熱溶解後、 25°C下で 21時間放置し、析出した結晶を桐山ロートでろ取した

[0034] 結晶を酢酸ェチルで 1回洗浄し、 90°C下 3時間 5mmHgにて減圧乾燥し、白色針状晶（1番晶）を 4. 21g (42%)得た。さらに、 1番晶を分離したろ液を、減圧下濃縮し、残渣をエタノール（18ml)で 1回共沸し、エタノール（18ml)に加熱溶解した後、 1 番晶の一部を種晶（3mg)として添加し、 25°C下で 3日間放置し、 1番晶と同様にろ取、乾燥を実施し、白色針状晶を 1. 62g (16%)得た (2番晶)。

[0035] 得られた結晶（1番晶）を粉末 X線回折で分析したところ、回折角（2 Θ )が 4. 62, 8 . 00, 9. 26, 12. 26, 12. 92, 14. 52, 16. 62, 17. 34, 18. 62, 19. 06, 20. 32, 21. 38, 21. 76, 23. 72, 24. 72および 26. 06に特徴的なピーク力 S認められた (図 1参照)。

[0036] また、熱重量測定 Z示差熱分析 (TG/DTA)装置 (昇温速度 5°CZ分)で分析したところ、約 123. 6°C付近に特徴的吸熱ピークを示した（図 2参照)。 [0037] さらに、 NMRの分析結果は以下の通りであった。なお、 2番晶の機器分析結果も、 1番晶と同じ結果であった。 1H— NMR: (DMSO— d6) 10. 9— 11. 2 (br d, 2

H, NH)、 7. 18- 7. 42 (m, 10H, Ar— H and H— 6) , 6. 88 (d, J = 8. 8Hz, 4H, Ar-H) , 4. 99 (br s, 1H, OH) , 4. 76 (d, J = 5. 7Hz, 1H, OH) , 4. 53 ( d, J = 3. 8Hz, 1H, H— 1 ' )、 3. 81— 3. 95 (m, 3H, H— 2' , 3' and4' )、 3. 74 ( s, 6H, OMe) , 3. 12 (d, J= l. 5, 10. 2Hz, 1H, H— 5，）、 3. 07 (d, J = 5. 1, 1

I. 2Hz, 1H, H— 5，）

[0038] [実施例 2]

5，—O—トリチルシユードウリジン結晶の製造

モレキュラシ一ブス 4Aで乾燥したピリジン（5ml)でシユードウリジン（0. 61g, 2. 5 mmol)を 2回共沸脱水した後、ピリジン（9. 8ml)に懸濁した。室温撹拌下、トリチルクロリド (0. 836g, 3mmol)を加え、すり栓で蓋をして同温度で 1日間撹拌した。

[0039] 反応液に室温下、水（lml)をカ卩え、減圧下濃縮し、残渣に酢酸ェチル（15ml)を加え、水（4ml)で 2回、飽和重曹水（4ml)で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を酢酸ェチル（7. 7ml)で 2回共沸し、エタノール（24 ml)を残渣に加えて加熱溶解し、 25°C下で 2日間放置し、析出した結晶を桐山ロートでろ取した。

[0040] 結晶を酢酸ェチルで 1回洗浄し、 90°C下 3時間 5mmHgにて減圧乾燥し、白色結晶（1番晶）を 0. 595g (49%)得た。さらに、 1番晶を分離したろ液を、減圧下濃縮し、残渣をエタノール（6ml)で 1回共沸し、エタノール（6ml)に加熱溶解した後、 25°C 下で 2日間放置し、 1番晶と同様にろ取、乾燥を実施し、白色結晶を 0. 211g (17%) 得た (2番晶)。

[0041] 得られた結晶（1番晶）を粉末 X線回折で分析したところ、回折角（2 Θ )が 4. 60,9.

10, 13.02,14.58, 16.68, 17.92, 19.14,20.78, 21.36および 24. 76に特徴的なピークが認められた（図 3参照)。

[0042] [実施例 3]

5，— O— (4—モノメトキシトリチル)シユードウリジン結晶の製造

モレキュラシ一ブス 4Aで乾燥したピリジン（5ml)でシユードウリジン（0. 61g, 2. 5 mmol)を 2回共沸脱水した後、ピリジン（9. 8ml)に懸濁した。

室温撹拌下、 4—メトキシトリチルクロリド (0. 926g, 3mmol)を加え、すり栓で蓋をして同温度で 15時間撹拌した。

[0043] 反応液に室温下、水（1ml)を加え、減圧下濃縮し、残渣に酢酸ェチル（15ml)を加え、水（4ml)で 2回、飽和重曹水（4ml)で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を酢酸ェチル（7. 7ml)で 1回共沸し、酢酸ェチル（1 5ml)を残渣に加えて加熱溶解し、 25°C下で 2時間放置し、析出した結晶をグラスフィルターでろ取した。

[0044] ろ取した結晶を酢酸ェチルで 1回洗浄した後、エタノール（10. 4ml)で 1回共沸し、エタノール（10. 4ml)に加熱溶解後、 25°C下で 18時間放置し、析出した結晶を桐山ロートでろ取した。

[0045] 結晶を酢酸ェチルで 1回洗浄し、 90°C下 3時間 5mmHgにて減圧乾燥し、白色結晶（1番晶）を 0. 582g (45%)得た。さらに、 1番晶を分離したろ液を、減圧下濃縮し、残渣をエタノール（5ml)で 1回共沸し、エタノール（5ml)に加熱溶解した後、 25°C 下で 1日間放置し、 1番晶と同様にろ取、乾燥を実施し、白色結晶を 0. 169g (13%) 得た (2番晶)。

[0046] 得られた結晶（1番晶）を粉末 X線回折で分析したところ、回折角（2 Θ )が 4.60,9.7 6, 12.20,12.94,16.60,17.84,18.52,19.04,20.66, 21.24,21.70および 24. 60 に特徴的なピークが認められた（図 4参照)。

[0047] [試験例 1]

純度検定試験

実施例 1で得た 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル)シユードウリジンの結晶純度を、高速液体クロマトグラフィー法にて分析した。その結果を表 1に示す。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件で行った。

[0048] カラム： YMC— Pack ODS— A A— 312 (6. 0x150mm, 5 /z m) 移動相： 70 %CH3CN- 50mMTEAA

流速： 0. 5ml/ min

UV: 260nm 温度：室温

[0049] [表 1]

[0050] 類縁ィ匕合物 1及び同 2 :未同定ではある力 2' , 5'—Ο—ジ (4, 4'ージメトキシトリチル）シユードウリジンまたは 3' , 5'—0—ジ（4, 4'ージメトキシトリチル）シユードゥリジンと推定される。

[0051] [試験例 2]

水分測定試験

カールフィッシャー法 (電量滴定法、気化温度 130°C)により測定した結果、乾燥の程度により水分含量は変動するものの、実施例 1で得た 5' -0- (4, 4'ージメトキシトリチル)シユードウリジンの結晶の水分 (wZw)は「1. 3% (1番晶）」、「1. 7% (2番晶）」であった。

[0052] [試験例 3]

安定性試験 (1)

実施例 1で得た 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチノレ)シユードウリジンの結晶につ V、て気密容器中 60°C、相対湿度 30%下での残存率を高速液体クロマトグラフィーで測定し、別途調製した非晶質と比較することでその安定性を評価した。その結果を表 2に示す。結晶が熱に対してより安定であることを確認した。

[0053] [表 2]

[0054] [試験例 4]

安定性試験 (2) 実施例 1で得た 5， -0- (4, 4'ージメトキシトリチノレ)シユードウリジンの結晶についてデシケーター中 25± 2°C、相対湿度 33%、 57%、 75%下での残存率を高速液体クロマトグラフィーで測定し (14日放置後測定)、別途調製した非晶質と比較することでその安定性を評価した。その結果を表 3に示す。相対湿度 75%下で顕著な差が生じ、結晶が湿気に対してより安定であることを確認した。

[0055] [表 3]

産業上の利用可能性

[0056] 本発明により、安定で高純度のシユードウリジン保護体の結晶を初めて提供できるようになった。また、本発明の方法は、シリカゲルカラム処理を必要としないため、操作が簡便であり、環境汚染の付加も少なぐかつ安価に目的とするシユードウリジン保護体を製造することができる。

Claims

請求の範囲下記構造式で示されるシユードウリジン保護体の結

[化 1]

(式中、 Mはトリチル基及びその誘導体を示す。 )

[2] Mがジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基又はトリチル基のいずれかである、請求項 1記載の結晶。

[3] Mが 4, 4'ージメトキシトリチル基である、請求項 1記載の結晶。

[4] 98% (w/w)以上の純度を有する請求項 1記載の結晶。

[5] エステル系溶媒及び Z又はアルコール系溶媒を用いて、シユードウリジン保護体を含む溶液カもシユードウリジン保護体を晶析することを特徴とする、請求項 1記載の結晶の製造法。

[6] エステル系溶媒力酢酸ェチル、酢酸メチル、酢酸 n—ブチル等の酢酸エステル類である、請求項 5記載の製造法。

[7] アルコール系溶媒力エタノール、メタノール、イソプロパノール等の炭素数 7以下の直鎖又は分岐を有するアルコール類である、請求項 5記載の製造法。

[8] エステル系溶媒が酢酸ェチルであり、アルコール系溶媒がエタノールである、請求項

5記載の製造法。

[9] エステル系溶媒で粗結晶を得た後、アルコール系溶媒でその粗結晶を再結晶する請求項 5記載の製造法。