JPWO2006137447A1 - シュードウリジン保護体の安定結晶 - Google Patents
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Abstract
本発明はＲＮＡオリゴマーなどの原料として有用な下記構造式で示される安定で高純度のシュードウリジン保護体の結晶を提供する。（式中、Ｍはトリチル基及びその誘導体を示す。）また、エステル系溶媒及び／又はアルコール系溶媒を用いて、シュードウリジン保護体を含む溶液からシュードウリジン保護体を晶析することを特徴とする、上記結晶の製造法に関する。この方法は、シリカゲルカラム処理を必要としないため、操作が簡便であり、環境汚染の付加も少なく、かつ安価に目的とするシュードウリジン保護体を製造することができる。
Description
本発明は、ＲＮＡオリゴマーなどの原料として有用なシュードウリジン保護体の結晶及びその製造法に関するものである。
シュードウリジンのホスホロアミダイト体は、修飾ヌクレオシドを含むＲＮＡオリゴマーの化学的自動合成時の原料として使用されている。例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７７，１２５（１９９５）では、イーストのｔＲＮＡ合成時にシュードウリジンのホスホロアミダイト体が原料の１つとして使用されている。
また、近年、遺伝子創薬（アプタマー、ＲＮＡ干渉等）が注目されており、このようなオリゴマー合成時の原料の１つとして、シュードウリジンのホスホロアミダイト体が用いられている。
シュードウリジンを含むＲＮＡオリゴマーを化学的に自動合成する際、５’位および２’位水酸基を適当な保護基で保護したシュードウリジンの３’−ホスホロアミダイト体が通常用いられる。具体的には、上記の文献においては、５’位を４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、２’位をｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基でそれぞれ保護したシュードウリジンの３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト体が使用されている。
このようなホスホロアミダイト体は、シュードウリジンの５’位をＤＭＴｒ化し、続いて２’位をＴＢＤＭＳ化した後、３’位をアミダイト化する方法で合成されており、第一工程のシュードウリジンのＤＭＴｒ化は、ピリジン中、室温下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）とシュードウリジンとを反応させ、分液処理後、シリカゲルカラムで精製し、目的の保護体を取得している。なお、上記文献ではシュードウリジンの５’-ＤＭＴｒ体の性状について記述されていない。しかし、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，７８，１７０５（１９９５）においては、同様に合成されたシュードウリジンの５’-ＤＭＴｒ体が無色泡状物（colorless foam）として取得されたと記述されている。
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７７，１２５（１９９５）
ＨＥＬＶＥＴＩＣＡ ＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ，７８，１７０５（１９９５）
上記ＤＭＴｒ化反応において、シュードウリジンの５’位の他にも２’位及び／又は３’位もＤＭＴｒ化された保護体が副産物として生成し、次工程の２’位ＴＢＤＭＳ化において、それら副産物による副反応により目的の保護体の収量が低下する等の問題があった。このため、ＤＭＴｒ化反応後のシリカゲルカラムによる精製工程は必須の処理工程と認識されている。
しかしながら、シリカゲルカラムを使用した精製処理は、操作が煩雑であると共に、有機溶媒を大量に必要とするため、環境に悪影響を及ぼし、かつ目的化合物の製造コストを上昇させる主要な原因となっていた。
また、従来法で得られる泡状の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンは、非晶質（アモルファス）であるため、安定性に欠け、品質にバラツキが生じやすい等の問題点も有していた。
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、全く意外にも、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンが、エステル系及び／又はアルコール系の有機溶媒を用いる晶析処理で結晶として取得することができ、かつシリカゲルカラムによる精製処理を必要とせず、得られた結晶も高純度で安定であることを見出し、この知見を発展させ、本発明を完成した。。
すなわち、本発明は下記の構造式で示されるシュードウリジン保護体の結晶を提供するものである。
（式中、Ｍはトリチル基及びその誘導体を示す。）
（式中、Ｍはトリチル基及びその誘導体を示す。）
このような本発明の一形態においては、式中のＭはジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基又はトリチル基のいずれかとすることができ、一例として式中のＭは４，４’−ジメトキシトリチル基とすることができる。
また、本発明にかかる製造法は、前記構造式のシュードウリジン保護体の結晶を製造する製造法であって、エステル系溶媒及び／又はアルコール系溶媒を用いて、シュードウリジン保護体を含む溶液からシュードウリジン保護体を晶析することを特徴とする。
本発明の製造法の好適な一実施形態によれば、前記エステル系溶媒は、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ｎ−ブチル等の酢酸エステル類とすることができ、前記アルコール系溶媒は、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の炭素数７以下の直鎖又は分岐を有するアルコール類であるとすることができる。また、本発明においては、エステル系溶媒で粗結晶を得た後、アルコール系溶媒でその粗結晶を再結晶することも可能である。
[本発明の結晶]
本発明の結晶は、次の構造式で示されるシュードウリジン保護体の結晶に関するものである。
本発明の結晶は、次の構造式で示されるシュードウリジン保護体の結晶に関するものである。
（式中、Ｍはトリチル基及びその誘導体を示す。）
式中、Ｍで表されるトリチル基の誘導体としては、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基を例示することができ、特に４，４’−ジメトキシトリチル基が好適な保護基として挙げることができる。
このようなシュードウリジン保護体の結晶は、シリカゲルカラムによる精製処理を行わずとも、ＨＰＬＣ分析で、目的とするシュードウリジン保護体の結晶を９５％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは９８％以上含み、その他の類縁化合物は５％以下、好ましくは２％以下の純度を有する。
なお、その他の類縁化合物としては、たとえば２’，５’−Ｏ−ジ（トリチル又はその誘導体）シュードウリジン、３’，５’−Ｏ−ジ（トリチル又はその誘導体）シュードウリジンなどのシュードウリジンのジトリチル体を意味する。
本発明のシュードウリジン保護体の結晶は、粉末Ｘ線分析において特徴的なピークを有し、たとえば５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジン結晶をＣｕ−Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（２θ）が、４．６，８．０，９．３，１２．３，１２．９，１４．５，１６．６，１７．３，１８．６，１９．１，２０．３，２１．４，２１．８，２３．７，２４．７および２６．１（°）付近に特徴的ピークを示す（図１参照）。
また、５’−Ｏ−トリチルシュードウリジン結晶の場合には、回折角（２θ）が４．６０,９.１０,１３.０２,１４.５８,１６.６８,１７.９２,１９.１４,２０.７８,２１.３６および２４．７６に特徴的なピークが認められ（図３参照）、５’−Ｏ−（４−モノメトキシトリチル）シュードウリジン結晶の場合には、回折角（２θ）が４.６０,９.７６,１２.２０,１２.９４,１６.６０,１７.８４,１８.５２,１９.０４,２０.６６,２１.２４,２１.７０および２４．６０に特徴的なピークが認められる（図４参照）。
一般に、粉末Ｘ線回折における回折角（２θ）は、５％未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が５％未満の誤差で一致する結晶も本発明のシュードウリジン保護体の結晶に包含される。
[本発明結晶の製造法]
本発明の結晶は、エステル系溶媒及び／又はアルコール系溶媒を用いて、シュードウリジン保護体を含む溶液からシュードウリジン保護体を晶析することにより調製することができる。
本発明の結晶は、エステル系溶媒及び／又はアルコール系溶媒を用いて、シュードウリジン保護体を含む溶液からシュードウリジン保護体を晶析することにより調製することができる。
エステル系溶媒としては、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ｎ−ブチル等の酢酸エステル類を用いることができ、アルコール系溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の炭素数７以下の直鎖もしくは分岐を有するアルコール類を用いることができる。このような溶媒の中でも、酢酸エチルとエタノールが特に好ましい。
シュードウリジン保護体の晶析法は、特に限定されるものではないが、エステル系溶媒で粗結晶を得、次にアルコール系溶媒でさらに再結晶するという手順が、高純度の結晶を取得する点では好ましい。
具体的に、最初に、有機溶媒中、シュードウリジンと保護基の塩化物とを室温下数時間反応させる。反応後、反応液を水とエステル系溶媒とで分液し、有機層を減圧下濃縮した後、残渣をエステル系溶媒で共沸し、シュードウリジン保護体をエステル系溶媒に加熱溶解する。
加熱溶解後、シュードウリジン保護体含有液を室温（２３〜２７℃）下で放置してシュードウリジン保護体の粗結晶を得、次ぎに得られた粗結晶をアルコール系化合物で共沸後、アルコール系溶媒に加熱溶解し、室温下で放置し、析出した結晶をろ取することで、シュードウリジン保護体の高純度の結晶を取得することができる。なお、結晶の取得収率が低い場合には、上記結晶のろ液から、上記した晶析処理を実施することで、２番結晶を回収してもよい。
かくして得た結晶は、室温〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃下、３〜６時間減圧乾燥させ製品とする。
[実施例]
[実施例]
以下、実施例、試験例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例よって限定されないことは明らかである。
[実施例１]
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジン結晶の製造
モレキュラシーブス４Ａで乾燥したピリジン（３６ｍｌ）でシュードウリジン（４．７７ｇ，１８．３ｍｍｏｌ）を２回共沸脱水した後、ピリジン（７２ｍｌ）に懸濁した。室温撹拌下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（７．４５ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加え、すり栓で蓋をして同温度で２時間撹拌した。
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジン結晶の製造
モレキュラシーブス４Ａで乾燥したピリジン（３６ｍｌ）でシュードウリジン（４．７７ｇ，１８．３ｍｍｏｌ）を２回共沸脱水した後、ピリジン（７２ｍｌ）に懸濁した。室温撹拌下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（７．４５ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加え、すり栓で蓋をして同温度で２時間撹拌した。
反応液に室温下、水（７ｍｌ）を加え、減圧下濃縮し、残渣に酢酸エチル（１１０ｍｌ）を加え、水（３０ｍｌ）で２回、飽和重曹水（３０ｍｌ）で１回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチル（５５ｍｌ）で３回共沸し、酢酸エチル（５５ｍｌ）を残渣に加えて加熱溶解し、２５℃下で２２時間放置し、析出した結晶をグラスフィルターでろ取した。
ろ取した結晶を酢酸エチルで１回洗浄した後、酢酸エチル（９３ｍｌ）を加え加熱懸濁後、２５℃下で１時間放置し、析出した結晶をグラスフィルターでろ取した。ろ取した結晶を酢酸エチルで１回洗浄した後、エタノール（７４ｍｌ）で３回共沸し、エタノール（７４ｍｌ）に加熱溶解後、２５℃下で２１時間放置し、析出した結晶を桐山ロートでろ取した。
結晶を酢酸エチルで１回洗浄し、９０℃下３時間５ｍｍＨｇにて減圧乾燥し、白色針状晶（１番晶）を４．２１ｇ（４２％）得た。さらに、１番晶を分離したろ液を、減圧下濃縮し、残渣をエタノール（１８ｍｌ）で１回共沸し、エタノール（１８ｍｌ）に加熱溶解した後、１番晶の一部を種晶（３ｍｇ）として添加し、２５℃下で３日間放置し、１番晶と同様にろ取、乾燥を実施し、白色針状晶を１．６２ｇ（１６％）得た（２番晶）。
得られた結晶（１番晶）を粉末Ｘ線回折で分析したところ、回折角（２θ）が４．６２，８．００，９．２６，１２．２６，１２．９２，１４．５２，１６．６２，１７．３４，１８．６２，１９．０６，２０．３２，２１．３８，２１．７６，２３．７２，２４．７２および２６．０６に特徴的なピークが認められた（図１参照）。
また、熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、約１２３．６℃付近に特徴的吸熱ピークを示した（図２参照）。
さらに、ＮＭＲの分析結果は以下の通りであった。なお、２番晶の機器分析結果も、１番晶と同じ結果であった。１Ｈ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．９−１１．２（ｂｒ ｄ， ２Ｈ，ＮＨ）、７．１８−７．４２（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ−Ｈ ａｎｄ Ｈ−６），６．８８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．９９（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．７６（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），４．５３（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）、３．８１−３．９５（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２’，３’ａｎｄ４’）、３．７４（ｓ，６Ｈ，ＯＭｅ），３．１２（ｄ，Ｊ＝１．５，１０．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’）、３．０７（ｄ，Ｊ＝５．１，１１．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’）
[実施例２]
５’−Ｏ−トリチルシュードウリジン結晶の製造
モレキュラシーブス４Ａで乾燥したピリジン（５ｍｌ）でシュードウリジン（０．６１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を２回共沸脱水した後、ピリジン（９．８ｍｌ）に懸濁した。室温撹拌下、トリチルクロリド（０．８３６ｇ，３ｍｍｏｌ）を加え、すり栓で蓋をして同温度で１日間撹拌した。
５’−Ｏ−トリチルシュードウリジン結晶の製造
モレキュラシーブス４Ａで乾燥したピリジン（５ｍｌ）でシュードウリジン（０．６１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を２回共沸脱水した後、ピリジン（９．８ｍｌ）に懸濁した。室温撹拌下、トリチルクロリド（０．８３６ｇ，３ｍｍｏｌ）を加え、すり栓で蓋をして同温度で１日間撹拌した。
反応液に室温下、水（１ｍｌ）を加え、減圧下濃縮し、残渣に酢酸エチル（１５ｍｌ）を加え、水（４ｍｌ）で２回、飽和重曹水（４ｍｌ）で１回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチル（７．７ｍｌ）で２回共沸し、エタノール（２４ｍｌ）を残渣に加えて加熱溶解し、２５℃下で２日間放置し、析出した結晶を桐山ロートでろ取した。
結晶を酢酸エチルで１回洗浄し、９０℃下３時間５ｍｍＨｇにて減圧乾燥し、白色結晶（１番晶）を０．５９５ｇ（４９％）得た。さらに、１番晶を分離したろ液を、減圧下濃縮し、残渣をエタノール（６ｍｌ）で１回共沸し、エタノール（６ｍｌ）に加熱溶解した後、２５℃下で２日間放置し、１番晶と同様にろ取、乾燥を実施し、白色結晶を０．２１１ｇ（１７％）得た（２番晶）。
得られた結晶（１番晶）を粉末Ｘ線回折で分析したところ、回折角（２θ）が４．６０,９.１０,１３.０２,１４.５８,１６.６８,１７.９２,１９.１４,２０.７８,２１.３６および２４．７６に特徴的なピークが認められた（図３参照）。
[実施例３]
５’−Ｏ−（４−モノメトキシトリチル）シュードウリジン結晶の製造
モレキュラシーブス４Ａで乾燥したピリジン（５ｍｌ）でシュードウリジン（０．６１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を２回共沸脱水した後、ピリジン（９．８ｍｌ）に懸濁した。
室温撹拌下、４−メトキシトリチルクロリド（０．９２６ｇ，３ｍｍｏｌ）を加え、すり栓で蓋をして同温度で１５時間撹拌した。
５’−Ｏ−（４−モノメトキシトリチル）シュードウリジン結晶の製造
モレキュラシーブス４Ａで乾燥したピリジン（５ｍｌ）でシュードウリジン（０．６１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を２回共沸脱水した後、ピリジン（９．８ｍｌ）に懸濁した。
室温撹拌下、４−メトキシトリチルクロリド（０．９２６ｇ，３ｍｍｏｌ）を加え、すり栓で蓋をして同温度で１５時間撹拌した。
反応液に室温下、水（１ｍｌ）を加え、減圧下濃縮し、残渣に酢酸エチル（１５ｍｌ）を加え、水（４ｍｌ）で２回、飽和重曹水（４ｍｌ）で１回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチル（７．７ｍｌ）で１回共沸し、酢酸エチル（１５ｍｌ）を残渣に加えて加熱溶解し、２５℃下で２時間放置し、析出した結晶をグラスフィルターでろ取した。
ろ取した結晶を酢酸エチルで１回洗浄した後、エタノール（１０．４ｍｌ）で１回共沸し、エタノール（１０．４ｍｌ）に加熱溶解後、２５℃下で１８時間放置し、析出した結晶を桐山ロートでろ取した。
結晶を酢酸エチルで１回洗浄し、９０℃下３時間５ｍｍＨｇにて減圧乾燥し、白色結晶（１番晶）を０．５８２ｇ（４５％）得た。さらに、１番晶を分離したろ液を、減圧下濃縮し、残渣をエタノール（５ｍｌ）で１回共沸し、エタノール（５ｍｌ）に加熱溶解した後、２５℃下で１日間放置し、１番晶と同様にろ取、乾燥を実施し、白色結晶を０．１６９ｇ（１３％）得た（２番晶）。
得られた結晶（１番晶）を粉末Ｘ線回折で分析したところ、回折角（２θ）が４.６０,９.７６,１２.２０,１２.９４,１６.６０,１７.８４,１８.５２,１９.０４,２０.６６,２１.２４,２１.７０および２４．６０に特徴的なピークが認められた（図４参照）。
[試験例１]
純度検定試験
実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶純度を、高速液体クロマトグラフィー法にて分析した。その結果を表１に示す。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件で行った。
純度検定試験
実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶純度を、高速液体クロマトグラフィー法にて分析した。その結果を表１に示す。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件で行った。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ａ−３１２（６．０ｘ１５０ｍｍ，５μｍ） 移動相：７０％ＣＨ３ＣＮ−５０ｍＭＴＥＡＡ
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
ＵＶ：２６０ｎｍ
温度：室温
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
ＵＶ：２６０ｎｍ
温度：室温
類縁化合物１及び同２：未同定ではあるが、２’，５’−Ｏ−ジ（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンまたは３’，５’−Ｏ−ジ（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンと推定される。
[試験例２]
水分測定試験
カールフィッシャー法（電量滴定法、気化温度１３０℃）により測定した結果、乾燥の程度により水分含量は変動するものの、実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶の水分（ｗ／ｗ）は「１．３％（１番晶）」、「１．７％（２番晶）」であった。
水分測定試験
カールフィッシャー法（電量滴定法、気化温度１３０℃）により測定した結果、乾燥の程度により水分含量は変動するものの、実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶の水分（ｗ／ｗ）は「１．３％（１番晶）」、「１．７％（２番晶）」であった。
[試験例３]
安定性試験（1）
実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶について気密容器中６０℃、相対湿度３０％下での残存率を高速液体クロマトグラフィーで測定し、別途調製した非晶質と比較することでその安定性を評価した。その結果を表２に示す。結晶が熱に対してより安定であることを確認した。
安定性試験（1）
実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶について気密容器中６０℃、相対湿度３０％下での残存率を高速液体クロマトグラフィーで測定し、別途調製した非晶質と比較することでその安定性を評価した。その結果を表２に示す。結晶が熱に対してより安定であることを確認した。
[試験例４]
安定性試験（2）
実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶についてデシケーター中２５±２℃、相対湿度３３％、５７％、７５％下での残存率を高速液体クロマトグラフィーで測定し（１４日放置後測定）、別途調製した非晶質と比較することでその安定性を評価した。その結果を表３に示す。相対湿度７５％下で顕著な差が生じ、結晶が湿気に対してより安定であることを確認した。
安定性試験（2）
実施例１で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シュードウリジンの結晶についてデシケーター中２５±２℃、相対湿度３３％、５７％、７５％下での残存率を高速液体クロマトグラフィーで測定し（１４日放置後測定）、別途調製した非晶質と比較することでその安定性を評価した。その結果を表３に示す。相対湿度７５％下で顕著な差が生じ、結晶が湿気に対してより安定であることを確認した。
本発明により、安定で高純度のシュードウリジン保護体の結晶を初めて提供できるようになった。また、本発明の方法は、シリカゲルカラム処理を必要としないため、操作が簡便であり、環境汚染の付加も少なく、かつ安価に目的とするシュードウリジン保護体を製造することができる。
Claims (9)
- 下記構造式で示されるシュードウリジン保護体の結晶。
- Ｍがジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基又はトリチル基のいずれかである、請求項１記載の結晶。
- Ｍが４，４’−ジメトキシトリチル基である、請求項１記載の結晶。
- ９８％（ｗ／ｗ）以上の純度を有する請求項１記載の結晶。
- エステル系溶媒及び／又はアルコール系溶媒を用いて、シュードウリジン保護体を含む溶液からシュードウリジン保護体を晶析することを特徴とする、請求項１記載の結晶の製造法。
- エステル系溶媒が、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ｎ−ブチル等の酢酸エステル類である、請求項５記載の製造法。
- アルコール系溶媒が、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の炭素数７以下の直鎖又は分岐を有するアルコール類である、請求項５記載の製造法。
- エステル系溶媒が酢酸エチルであり、アルコール系溶媒がエタノールである、請求項５記載の製造法。
- エステル系溶媒で粗結晶を得た後、アルコール系溶媒でその粗結晶を再結晶する請求項５記載の製造法。
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