JP2001526521A

JP2001526521A - 関節炎状態の処置、移植片許容性の誘導および免疫応答逆転のための方法および試薬

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Publication number: JP2001526521A
Application number: JP51903596A
Authority: JP
Inventors: ベイジェルマン，レオニド; スティンチコーム，ダニエル・ティー; ジャーヴィス，セール; ドレイパー，ケネス; パヴコ，パメラ; マクスウィゲン，ジェームズ; グスタフソン，ジョン; アスマン，ナシム; ウィンコット，フランシーヌ; マトゥリック−アダミック，ジャセンカ; カーペイスキー，アレクサンダー; トンプソン，ジェームズ・ディー; モダック，アニル; バーギン，アレックス
Original assignee: リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-12-13
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 2001-12-18

Abstract

(57)【要約】関節病状の発生および維持、移植片許容性の誘導または免疫応答の逆転に関連するＲＮＡを切断する酵素的核酸分子。特に、リボザイム配列は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３、ＣＤ４０および／またはストロメリシンをコードするｍＲＮＡに向けられる。また、４位および／または７位のウラシルが置換されているリボザイム、ならびに２’−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルチオアルキル、または２’−アルキルチオアルキルヌクレオチドを合成する方法も提供される。本出願はさらに、水性エチルアミンでＲＮＡを脱保護する方法、塩基性リボヌクレオシド模倣体を合成する方法、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｕ６小核プロモーター、またはアデノウイルスＶＡ１プロモーターシステムを含む転写ユニットを記載する。

Description

【発明の詳細な説明】関節炎状態の処置、移植片許容性の誘導および免疫応答逆転のための方法および試薬背景技術以下は関連する技術の議論であるが、いずれも本発明の先行技術と認めらるものではない。一つの態様において、本発明は変形性関節症の抑制、特に、マトリックス金属プロテイナーゼによる細胞外マトリックス消化の軽減および除去を導く遺伝子発現の抑制に関している。関節炎にはいくつかの型があるが、変形性関節症および慢性関節リウマチが主たるものである。変形性関節症は軟骨下骨の増殖およびリモデリングを伴う関節軟骨の変性により特徴付けられるゆっくりとした進行性の疾患である。痛み、変形および関節運動の損失などの臨床像を示す。慢性関節リウマチは慢性で全身性の炎症疾患である。慢性関節リウマチは軽度で再発性であるかまたは重度で進行性であり、関節変形および無能力化を導く。関節炎は老人集団の間での機能損傷に主に寄与している。それは廃疾の主たる原因であり、老年者の入院および健康ケア費用の大部分を占めている。関節炎は５５才より年が上の約１００万人の完全な無能力化の主だった原因と推定されており、約１００万人以上に対して重要な寄与原因と考えられている。関節炎の発生率を推定することはいくつかの理由により困難である。第一に、骨関節炎はＸ線像を読みとることにより客観的に診断されるが、疾患のＸ線像的証拠を示す多くの人には明らかな徴候が現れない。第二に、Ｘ線像のデータは具合の悪いすべての関節に対して入手可能ではないので、罹患率の推定は臨床的評価に基づいている。１９８９年のＮＨＡＮＥＳＩサーベイでは、データは脊椎、膝、股関節部および末梢関節の異常が気付かれた筋骨格評価ならびに他の特別の診断に基づいている。これらの観察に基づくと、２５から７４才の間の米国の人口の１２％が変形性関節症を持っている。慢性関節リウマチは世界中に分布しており、すべての人種および民族群が罹患している。米国における正確な罹患率は知られていないが、０．５％から１．５％の範囲と推定されている。慢性関節リウマチはすべての年齢レベルで起こり、一般的に年齢が進むと罹患率が増加する。男性より女性の方が罹患率が２−３倍高く、４０−６０才の年齢の間に発現率のピークがある。本疾患の潜在的病因の役割を評価するため免疫学的因子に加えて、環境、職業および社会的心理因子が研究されてきた。多細胞生物体の細胞外マトリックスは組織の形成および維持に重要な役割を果たしている。細胞外マトリックスの綱は常在性細胞により沈着され、細胞−細胞伝達の透過性障壁だけではなく、細胞接着および移動の骨組みを提供している。正常の増殖および発育または病的状態での結合組織の代謝回転は中性金属プロテイナーゼの一群により媒介されていると考えられており、それらは完全な活性にカルシウムを必要とする亜鉛含有酵素である。金属プロテイナーゼの制御は細胞型特異的に発現され、種により異なっている。最もよく特性付けられたマトリックス金属プロテイナーゼ、間質性コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）はコラーゲンタイプＩ、IIおよびIIIに特異的である。ＭＭＰ −１は三重ヘリックスの三つの鎖すべてを切断し、単一の点から開始して続いて間質性コラーゲンの分解する。間質性コラゲナーゼ活性はリウマチ様滑膜細胞ならびに炎症性関節炎の患者の滑液に観察されている。ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）は金属プロテイナーゼのサブグループであり、二つの遺伝子産物から成っている；７０ｋＤａゼラチナーゼはほとんどの結合組織細胞により発現され、９２ｋＤａゼラチナーゼは炎症性食細胞および腫瘍細胞により発現される。より大きな酵素はマクロファージ、ＳＶ−４０形質転換線維芽細胞および好中球により発現される。より小さな酵素はＨ−ｒａｓ形質転換肺上皮細胞および腫瘍細胞、並びに正常ヒト皮膚線維芽細胞により発現される。これらの酵素はゼラチン（変性コラーゲン）並びに天然のコラーゲンタイプＸＩを分解する。ストロメリシン（ＭＭＰ−３）は細胞外マトリックスを形成する広い範囲の分子に作用する。プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、タイプIVおよびIXコラーゲンおよびゼラチンを消化し、プロコラーゲンからＮ−末端プロペプチド領域を除去することができる（すなわち、コラゲナーゼの活性化）。それはヒト軟骨抽出物、リウマチ様滑膜細胞およびコラーゲン誘導関節炎ラット関節の滑膜および軟骨細胞に観察されている。変形性関節症および慢性関節リウマチの両方とも、これらの疾患に観察される細胞外マトリックス破壊に関与するマトリックス金属プロテイナーゼ合成を誘導するのサイトカインまたは増殖因子を阻害する化合物で主として処置される。現在の臨床処置は種々の金属プロテイナーゼの強力な抑制剤であるデキサメタゾンおよびレチノイド化合物に頼っている。処置細胞の遺伝子発現に対するデキサメタゾンおよびレチノイド化合物の全体的な効果のため別の療法の開発が望まれている（特に長期間の処置に対して）。最近、ガンマ−インターフェロンが培養マクロファージにおいてリポポリサッカライド誘導コラゲナーゼおよびストロメリシン産生を抑制することが示された。また、組織増殖因子−β（ＴＧＦ−β）はインビトロでストロメリシン合成の上皮増殖因子（ＥＧＦ）誘導を阻止することが示された。遺伝子治療法を含む実験プロトコールには金属プロテイナーゼ阻害剤ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の制御された発現が含まれている。後ろの三つの方法の内、γ−インターフェロン処置が現在臨床応用に実施できる。ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＤｒａｐｅｒ、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０２５９５号およびＤｒａｐｅｒら、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１３３８０号は関節炎を処置するためのリボザイムの使用を開示している。第二の態様において、本発明は特に、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３およびＣＤ４０の阻害による移植片許容の誘導、自己免疫疾患の処置、炎症性障害およびアレルギーのための方法に関している。適応免疫応答はＴリンパ球（Ｔ細胞）と称される一群の細胞の活性化、クローン拡大および分化を必要とする。Ｔ細胞活性化はＴ細胞および抗原提示細胞間のいくつかのシグナル伝達を必要とする多段階過程である。次の議論はＴ細胞および抗原提示Ｂ細胞間で交換されるシグナルの詳細である。同様の経路がＴ細胞および単球または濾胞性樹状細胞間で起こっていると考えられている。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）が抗原提示細胞表面のＭＨＣ蛋白質に付随する特定の抗原に結合した時に開始される。この第一の刺激がＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞表面上のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の発現を誘導する。ＣＤ４０Ｌは次にＢ細胞表面上に構造的に発現されているその同種のレセプターＣＤ４０と相互作用する；ＣＤ４０はＢ細胞の活性化を導くシグナルを導入する。Ｂ細胞活性化の結果、Ｂ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ７−３が発現され、それらは順にＴ細胞表面上に構造的に発現されているＣＤ２８と相互作用する。この相互作用はＴ細胞を完全に活性化するのに必要とされる二次的共刺激性シグナルを発生する。Ｔ細胞レセプターおよびＣＤ２８を経た完全Ｔ細胞活性化によりサイトカイン分泌、クローン拡大および分化が導かれる。もし、Ｔ細胞レセプターにＣＤ２８により媒介される二次的共刺激が与えられなかったならば、クローンアネルギー（特定の抗原に対する免疫系の非応答または反応性の低下）または特定クローン欠失（Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９８７Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，５４０９）によりＴ細胞は不活性化される。従って、ＴＣＲに同時に起こる共刺激性シグナルを与えられないと、Ｔ細胞により認識される特異的抗原に対する許容状態が生じる。この共刺激シグナルは抗原提示細胞に存在するＢ７−１−またはＢ７−２またはＢ７−３の、Ｔ細胞表面に構造的に発現されるレセプターであるＣＤ２８への結合により媒介できる（Ｍａｒｓｈａｌｌら、１９９３ＪＣｌｉ．Ｉｍｍｕｎ１３，１６５−１７４；Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，７２１；Ｋｏｕｌｏｖａら、１９９１Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，７５９；Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９２Ｎａｔｕｒｅ３５６，６０７）。Ｂ７（現在Ｂ７−１として知られている；Ｃｏｈｅｎ、１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２，８４４）のいくつかの同族体が活性化Ｂ細胞で発現される（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２，９０７；Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１１０５４；Ａｚｕｍａら、１９９３Ｎａｔｕｒｅ３６６，７６；Ｈｅｔｈｃｏｃｋら、１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２，９０５；Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２，９０９）。Ｂ７−１およびＢ７−３はＴ細胞と接触４８時間後にＢ細胞のサブセットの表面にのみ発現される。対照的に、Ｂ７− ２ｍＲＮＡは非刺激Ｂ細胞により構造的に発現されており、活性化４時間以内に４倍に増加する（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２，９０９；Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓら、１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１１０５９）。Ｔ細胞は最初のＴＣＲシグナルの１２−２４時間以内にアネルギーかまたは活性化経路のどちらかへ進むので、Ｂ７−２が最初の共刺激シグナルに応答する分子であると考えられている。Ｂ７−１およびＢ７−３はクローン拡大に必要な続いてのシグナルを提供するのであろう。Ｂ７− ２に対する抗体は、混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を完全に阻止し（Ａｚｕｍａら、１９９３上記文献）、Ｔ細胞活性化におけるＢ７−２の中心的な役割を支持している。これらの実験はＢ７−２の阻害（例えばリボザイムによる）はアネルギーを誘導するらしいことを示している。同様に、リボザイムによるＣＤ４０発現の阻害はＢ７−２の上方制御を防止し、特定の抗原に対する許容性を誘導するであろう。Ｂ７（Ｂ７−１）は通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在する６０ＫＤの修飾トランスメンブラン糖蛋白質である。Ｂ７は二つのリガンド（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４）を持っている。Ｂ７とＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４との相互作用はＴ細胞応答の活性化を起こす（ＪａｎｅｗａｙおよびＢｏｔｔｏｍｌｙ、１９９４Ｃｅｌｌ７６，２７５）。Ｂ７−２はＡＰＣの表面上に観察される７０ＫＤ（非修飾３４ＫＤ）のトランスメンブラン糖蛋白質である。Ｂ７−２は３２３のアミノ酸蛋白質をコードしており、それはヒトＢ７−１蛋白質と２６％相同である。Ｂ７−１同様、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４はＢ７−２により選択的に結合される。Ｂ７−２はＢ７−１と異なり非刺激Ｂ細胞の表面に発現される（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３上記文献）。ＣＤ４０は骨髄の後期前Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、骨髄由来樹状細胞および濾胞性樹状細胞の表面に観察される４５−５０ＫＤの表面糖蛋白質である（ＣｌａｒｋおよびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ、１９９４Ｎａｔｕｒｅ３６７，４２５）。臓器移植を成功させるには現在の所移植片拒絶を防止および移植片機能を良好に維持するために受容者の免疫系を抑制する必要がある。利用可能な療法にはシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６および種々のモノクローナル抗体が含まれるが、すべて重大な副作用を持っている（Ｃａｉｎｅ、１９９２、ＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｅｄｉｎｎｇｓ２４，１２６０；Ｆｕｌｅｉｈａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１３１５；ＶａｎＧｏｏｌら、１９９４Ｂｌｏｏｄ８３，１７６）。さらに、存在する療法は一般的に免疫を抑制し、患者を種々の日和見感染にかかり易くしている。供与者組織に対する長期の抗原特異性許容性状態を誘導する能力は臓器および組織移植の分野で革命を起こすであろう。臓器移植片拒絶はＴ細胞エフェクター機能により媒介されるので、最終目的は供与者抗原を認識するＴ細胞のサブセットの活性化を特異的に阻止することである。移植の分野における制限は供与臓器の供給である（Ｎｏｗａｋ、１９９４Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６，１１４８）。供与者特異的許容を誘導する能力は、同種移植、異種移植の成功の機会を増加させ、それにより供与者プールを非常に増加させる。そのような移植術には個体の体から同一のまたは異なった個体内の異なった場所への組織および／または臓器の移植（すなわち、組織および／または臓器の内植または移植）が含まれる。移植術にはまた、体の一つの領域から別の領域への組織および／または臓器の移植が含まれる。同一種の遺伝的に似ていない動物間の組織および／または臓器の移植は同種移植術と呼ばれている。動物臓器のヒトへの移植は異種移植術と呼ばれている（総説として、Ｎｏｗａｋ、１９９４Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６，１１４８を参照されたい）。抗原特異的許容を誘導する類似の可能性を持つ現在開発されている一つの療法はＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合蛋白質による処置である。”ＣＴＬＡ４”は高い親和性でＢ７−１およびＢ７−２を結合するＣＤ２８の同族体である。遺伝子工学による可溶性の融合蛋白質、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、はＢ７−１を結合し、それによりＣＤ２８とのその相互作用を阻止する。動物研究によるＣＴＬＡ４−Ｉｇ処置の結果は混乱している。マウス骨髄移植モデルにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ処置は有意に生存率を延長させ、移植片対宿主疾患の症状を回復させた（Ｂｌａｚａｒら、１９９４Ｂｌｏｏｄ８３，３８１５）。ランゲルハンス島異種移植術においてＣＴＬＡ４−Ｉｇは長期（＞１１０日）の供与者特異的許容を誘導した（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９２Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，７８９）。反対に別の研究では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは心臓同種移植片拒絶を遅らせたが最終的に防止はしなかった（Ｔｕｒｋａら、１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１１１０２）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ存在下、マウスをヒツジ赤血球で免疫したが、一次免疫応答のマウントに失敗した（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９２Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，７９２）。しかしながら、二次免疫化はいくらかの応答を惹起し、許容が完全でないことを示している。興味あることに、一次免疫化の２日後にＣＴＬＡ４−Ｉｇが投与された場合は同一の結果が得られており、著者らはＣＴＬＡ４−Ｉｇは免疫応答の開始というより増幅を阻止していると結論付けた。ＣＴＬＡ４−ＩｇはＢ７−１と比較してＢ７−２からはより速く解離することが示されているので、このことはこのモデルにおいて長期の許容性の誘導に失敗していることを説明している（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１，７９３）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは最近ループスープローンマウスにおいて自発的自己免疫疾患の症状を回復させることが示されている（Ｆｉｎｃｋら、１９９４Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１２２５）。Ｌｉｎｓｌｅｙら、ＷＯ９２／０００９２、はＴ細胞上のＣＤ２８レセプターのリガンドとしてのＢ７抗原を記載している。出願は以下のように述べている： ”Ｂ７抗原またはその断片または誘導体はＣＤ２８陽性Ｔ細胞と相互作用し、他の細胞とのＴ細胞相互作用を制御する．．．．Ｂ７抗原またはＣＤ２８レセプターはこれらの分子が付随する細胞の相互作用の阻害に使用され、それによりＴ細胞応答を制御する。” ＤｅＢｏｅｒおよびＣｏｎｒｏｙ、ＷＯ９４／０１５４７、は同種移植片移植拒絶反応、移植片対宿主疾患および慢性関節リウマチを処置するための抗Ｂ７および抗ＣＤ４０抗体の使用を記載している。出願は以下のように述べている： ”．．．抗Ｂ７および抗ＣＤ４０抗体．．．は患者における抗体媒介または免疫系疾患の防止または処置に使用できる。” ＣＤ４０を経るシグナル伝達はＢ−７の誘導を進行させるので、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の阻止は許容性を生み出す可能性を持っているであろう。一つの報告によると、ＣＤ４０Ｌおよびヒツジ赤血球細胞に対する抗体でのマウスの同時処置は、処置中止に続く３週間までは抗原特異性許容性を生み出した（Ｆｏｙら、１９９３Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，１５６７）。抗ＣＤ４０Ｌはまたランゲルハンス島移植モデルで抗原特異性許容性を生み出した（Ｒ．Ｎｏｅｌｌｅ、私信）。Ｂ７に加えて標的化されたＢ細胞におけるＣＤ４０発現の阻害はＴ細胞の活性化に対する二重の保護を与えるようである。移植された臓器の拒絶を防止するために使用される治療薬はすべて細胞毒性化合物であるか、細胞媒介免疫系を抑制するように設計された抗体である。これらの薬剤の副作用は免疫抑制および感染である。最初に承認された薬剤はアザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリンであり；抗体は抗リンパ球および抗胸線細胞グロブリンである。主および副組織適合性型分類により可能な限り供与者とぴったり一致するような患者にこれらのすべてが与えられた。移植の主たる問題点は抗原性不一致および生じる細胞毒性治療の必要性であり、一般的な免疫抑制を起こさずに局所的免疫応答を減少させる治療的改善は移植マーケットを魅了するに違いない。シクロスポリン：１０７０年代の終わりおよび１９８０年代の初期、シクロスポリンの導入は移植分野に革命をもたらした。それは強力な免疫抑制剤であり、免疫適格リンパ球を特異的および可逆的に阻害できた。作用の基本的機構はＴヘルパー細胞によるインターロイキン−２の産生および放出の阻害であるようである。さらに、それはマクロファージによるインターロイキン−１の放出ならびにＢリンパ球の増殖を妨害する。１９８３年にＦＤＡにより承認され、１９８９年までにはほとんど世界中で移植患者に投与されていた。最初はシクロスポリンからの毒性および副作用は最少であると信じられており、それは”特効薬”と歓呼して迎えられた。リンパ腫の出現、特に胃腸管；急性および慢性腎毒性；高血圧；肝毒性；多毛症；貧血；神経毒性；内分泌および神経性合併症；および胃腸窮迫を含む多くの副作用が次第に挙げられてきた。本薬剤の非特異的副作用のため、その使用の際の注意および綿密なモニタリングが必要なことが現在広く認められている。シクロスポリンで処置した死体腎臓移植の１年生存率は８０％であり、薬剤を用いない５０−６０％の率よりも優れている。シクロスポリンを用い、近親の供与者による移植の１年生存率はほとんど９０％である。アザチオプリン：シクロスポリンに加えて、アザチオプリンが移植患者に使用される。アザチオプリンはメルカプトプリン類の一つであり、核酸合成を阻害する。患者は大体１ｍｇ／ｋｇまたは未満の日用量に維持され、白血球数に従って用量を調節する。本薬剤は骨髄要素の低下を起こし、黄痕を引き起こすであろう。コルチコステロイド：ほとんどすべての移植受容者に使用されるプレドニソンは通常アザチオプリンおよびシクロスポリンと共に与えられる。感染、クッシング様顔立の発生および高血圧のような合併症を防ぐため用量は注意深く制御されなければならない。通常、最初の維持プレドニソン用量は０．５ｍｇ／ｋｇ／ｄである。この用量は成人に対し約１０ｍｇ／ｄの維持レベルまで外来患者診療では通常さらに減少される。免疫応答に対するコルチコステロイドの正確な作用部位は知られていない。抗胸腺芽細胞または抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）および抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）：これらは重要な補助的免疫抑制剤である。これらは特に免疫抑制治療およびコルチコステロイド耐性拒絶の治療に有効である。ＡＬＧおよびＡＴＧの両方ともウマ、ウサギまたはヒツジを免疫化することにより作製することができる；主としてウマである。ヒト末梢血、脾臓、リンパ節または胸腺からのリンパ球が免疫原として働く。タクロリムス：１９９４年４月１３日、米国食品医薬品局は臓器移植の拒絶を防止する助けとなる別の薬品を認可した。薬品、タクロリムスは肝臓移植患者への使用のみ認可された。シクロスポリンの代替物、マクロライド免疫抑制タクロリムスは強力で選択的な抗Ｔリンパ球薬であり、１９８４年に発見された。タクロリムスは真菌ストレプトマイセスツクバエンシスから単離され、シクロスポリン類似の、しかしより強力な免疫抑制性を持っている。それは細胞媒介および体液性免疫応答の両方を阻害する。シクロスポリンのように、タクロリムスはその薬物動態学的プロフィールにおいてかなりの個体間変異を示す。タクロリムスのほとんどの臨床研究は完全な形では報告されていず、また広範にはよく調べられてはいない；また、報告されたタクロリムスに対するシクロスポリンの無作為化調査の量も少ない（特に腎移植における）。これらの欠点にも関わらず、タクロリムスはコルチコステロイドと組み合わされた場合、注目すべき救急または一次免疫抑制療法での有効性を示した。タクロリムスによるコルチコステロイド療法の縮小中止の可能性はシクロスポリンと比較すると明かな利点であるように思える。この恩恵は何人かの研究者により報告されている感染性合併症、高血圧および高コレステロール血症発生率の減少により高められる。他の点では、タクロリムスの許容性プロフィールはシクロスポリンのそれと広範囲に類似しているようである。移植片許容性の誘導に加え、Ｔ細胞アネルギーは自己免疫疾患の逆転に使用できる。自己免疫疾患は広い範疇の身体状態を示す。いくつかの例としてはインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）および乾癬が挙げられる。表面上は共通点のないこれらの疾患はすべて特異的自己抗原への不適切な免疫応答という共通の特色を共有している。Ｆｉｎｃｋら、上記文献、はＳＬＥのマウスモデルにおいて、マウスのＣＴＬＡ４−Ｉｇ処置が自己抗体の産生を阻止したことを報告している。実際、この効果はＣＴＬＡ４−Ｉｇ処置を疾患が進んだ段階で開始しても観察されており、自己免疫応答が可逆的過程であったことを示唆している。Ｃｈａｐｐｅｌ、ＷＯ９４／１１０１１、は細胞、組織および臓器に許容性を誘導することによる自己免疫疾患の処置法を記載している。この出願は以下のように述べている− ”許容性が誘導されるべき細胞、組織または臓器の多数の抗原をコードするＤＮＡで細胞が遺伝子工学処理された。細胞にはＢ７抗原のような共刺激性抗原は用いなかった。そのような細胞は、ＤＮＡによりコードされる蛋白質に対するＴ細胞アレルギーを誘導して自己免疫疾患の開始を防止または処置するため、または移植に先立って組織または臓器に許容性を与えるために患者に投与された。” アレルギー反応は環境抗原に対する即時の超過敏応答を表しており、典型的にはＩｇＥ抗体により媒介される。抗原特異的許容性を誘導する能力は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３またはＣＤ４０の下方制御と共に、抗原に暴露されることによるアレルギーを緩和する強力な手段を提供する。Ｔ細胞活性化におけるＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−３の特異的役割はまだ決定されていない。いくつかの研究は、それらの機能は本質的には重複的であること（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，６３１）、または発現の動態学で観察された相違は単に、Ｂ７−２が共刺激性シグナルの開始に重要であり、一方Ｂ７−１はシグナルの増幅に役割を果たしているのを示していることを示唆している。他の研究はより特異的機能を指摘している。例えば、Ｋｕｃｈｒｏｏら、１９９５Ｃｅｌｌ８０，７０７、はＢ７−１発現の阻止ではＴｈ２応答が起こり、一方Ｂ７−２発現の阻止はＴｈ１応答を起こすことを報告している。これらの二つのヘルパーＴ細胞亜集団は免疫応答および炎症性疾患において異なった役割を果たしている。Ｔｈ１細胞自己免疫疾患と強く相関している。アレルギー反応は典型的にはＴｈ２応答により引き金が引かれる。従って、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０またはこれらの組み合わせを標的とする決定は特定の疾患応用に依存するであろう。発明の要約本出願人は関節滑膜中のコラゲナーゼおよびストロメリシン産生阻害がリボザイムおよびアンチセンス分子により達成されることに注目した。リボザイム処置は、前もって存在する組織の損傷に作用している免疫細胞を主とした標的とする現在の処置のパートナーになり得る。コラゲナーゼおよびストロメリシン誘導損傷を軽減する初期のリボザイムまたはアンチセンス処置では、必要に応じて続いての抗炎症剤またはレチノイド処置を行なわなければならない。本様式ではプロテイナーゼの発現は転写および翻訳の療法のレベルで制御できる。リボザイムおよびアンチセンス処置は、臨床徴候の発現に先だって、変形性関節症の放射線学的徴候を示す患者に与えることができる。リボザイムおよびアンチセンス処置は、レチノイドおよびデキサメタゾンによる処置に付随する遺伝子発現への非特異的効果を導くことなく、ストロメリシン発現に強い影響を与えることができる。ストロメリシンがプロコラゲナーゼを活性化することができることは、ストロメリシン発現を減少させるリボザイムまたはアンチセンス分子は変形性関節症（主としてストロメリシンに付随する病理である）および慢性関節リウマチ（主として高められたコラゲナーゼ活性に関連している）の両方の処置にも使用できることを示している。多くのサイトカインおよび増殖因子が傷治癒および前骨関節炎状態の組織損傷間に金属プロテイナーゼ活性を誘導するが、これらの分子は治療的関与の好適な標的ではない。ほとんどの人は処置に先立って放射線学的または臨床的徴候を示すであろうので、第一位の重要性を細胞外マトリックスの破壊に関する分子を阻害することに置いた。金属プロテイナーゼ（もし制御されていないと、本分子は細胞外マトリックスに対して最大級の構造的損傷を与える）で最も融通のきくものはストロメリシンである。さらに、この分子はプロコラゲナーゼを活性化でき、それは順に細胞外マトリックスのコラーゲン主鎖へさらなる損傷を与える。正常条件下、活性ストロメリシンへのプロストロメリシンの変換はＴＩＭＰ（ＭＭＰの組織阻害剤）と呼ばれている阻害剤の存在により制御されている。滑膜細胞のＴＩＭＰレベルはプロストロメリシンのレベルを超えているので、非関節炎組織の滑液には一般的にストロメリシン活性は存在せず、非標的細胞でのストロメリシン活性の阻害による毒性効果は無視してもよい。従って、本発明は、滑膜細胞におけるプロストロメリシン分子の合成を阻害することにより、または上記の他のマトリックス金属プロテイナーゼを阻害することにより関節炎、特に変形性関節症を処置または予防する特異的リボザイム分子の使用を特色とする。マクロファージ、好中球および滑膜細胞で発現される標的とされたｍＲＮＡ（ストロメリシンｍＲＮＡ、ストロメリシン１、２および３、およびコラゲナーゼを含む）の切断はストロメリシンの酵素前駆体形、プロストロメリシンの合成を抑制する。リボザイムは、他の別個のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的な様式で反復的に切断しうる、酵素的活性を有するＲＮＡ分子である。このような酵素的ＲＮＡ分子は実質的にいかなるＲＮＡ転写産物をも標的とすることができるといわれており、インビトロで効果的な切断が達成されている。Ｋｉｍｅｔａｌ．，８４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７８８，１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆａｎｄＧｅｒｌａｃｈ，３３４Ｎａｔｕｒｅ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０ＪＡＭＡ３０３０，１９８８；およびＪｅｆｆｅｒｉｅｓ，ｅｔａｌ．，１７ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ１３７１，１９８９。現在のところ、天然に生ずる酵素的ＲＮＡの６個の基本的変種が知られている。それぞれの酵素的ＲＮＡは、生理学的条件下で、トランスでＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断しうる）。表１はこれらのリボザイムの性質のいくつかをまとめたものである。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。この結合は、標的ＲＮＡを切断させる作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された、酵素的核酸の標的結合部分により行われる。すなわち、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成により標的ＲＮＡに結合し、適正な部位にいったん結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は、それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を破壊するであろう。酵素的核酸はそのＲＮＡ標的に結合して切断させたのち、そのＲＮＡから離脱して他の標的を探し、新たな標的に反復的に結合して切断することができる。 “酵素的ＲＮＡ分子”とは、基質結合領域において特定のｍＲＮＡ標的に対する相補性を有し、かつそのｍＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素的活性をも有するＲＮＡ分子を意味する。すなわち、酵素的ＲＮＡ分子はｍＲＮＡを分子間切断し、このことにより標的ｍＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は、切断を起こさせるのに十分なほど、標的ＲＮＡに酵素的ＲＮＡ分子をハイブリダイズさせる機能を有する。１００％の相補性が好ましいが、５０−７５％程度の低い相補性も本発明において有用である。インビボ処置のためには、３０−４５塩基の相補性が好ましいが、より小さい数もまた有用である。 ”相補性”とは、他のヌクレオチド配列と、伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプの塩基対相互作用（例えば、ホーグステン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）タイプ）のいずれかにより水素結合を形成しうるヌクレオチド配列を意味する。リボザイムの酵素的性質は、他の手法、例えばアンチセンス法（この場合は核酸分子が単に核酸標的に結合して、その翻訳を阻止するだけである）より有利である。これは、治療的処置を行うのに必要なリボザイムの濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用しうることを反映している。すなわち１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらに、リボザイムは特異性の高い阻害剤であり、その阻害の特異性は標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成のメカニズムのみならず、標的ＲＮＡの切断のメカニズムにも依存する。切断部位の近くにおける１つのミスマッチまたは塩基置換は、リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。アンチセンス分子における同様のミスマッチは、それらの作用を妨害しない（Ｗｏｏｌｆ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，７３０５−７３０９）。したがって、リボザイムの作用の特異性は、同一のＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより大きい。本発明の好ましい態様においては、酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成されるが、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に伴う）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡのモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉｅｔａｌ，１９９２，ＡｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８，１８３に記載され；ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌｅｔａｌ．，ＥＰＡ０３６０２５７，ＨａｍｐｅｌａｎｄＴｒｉｔｚ，１９８９Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８，４９２９，およびＨａｍｐｅｌｅｔａｌ．，１９９０，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８，２９９に記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａａｎｄＢｅｅｎ，１９９２Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１１６に記載され；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａｅｔａｌ．，１９８３Ｃｅｌｌ，３５８４９に記載され；ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳｅｖｉｌｌｅａｎｄＣｏｌｌｉｎｓ，１９９０Ｃｅｌｌ６１，６８５−６９６；ＳａｖｉｌｌｅａｎｄＣｏｌｌｉｎｓ，１９９１Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８８，８82６−８８３０；ＣｏｌｌｉｎｓａｎｄＯｌｉｖｅ，１９９３Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２，２７９５−２７９９）により記載され；グループＩイントロンの例は、Ｃｅｃｈｅｔａｌ．，米国特許第４，９８７，０７１号により記載されている。これらの特定のモチーフは本発明を限定するものではなく、当業者は、本発明の酵素的核酸分子において重要なすべては、それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮΛ領域に対して相補的であり、かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう。本発明は、所望の標的のＲＮＡに対して高い特異性を示す一群の酵素的切断剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は、好ましくは、１つまたはいくつかの酵素的核酸により疾患または病状の特異的治療が与えられるように、標的ストロメリシンをコードするｍＲＮＡの高度に保存された配列領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は、必要に応じて特定の細胞に外的に送達することができる。あるいは、リボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡまたはＲＮＡベクターから発現させることができる。１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は自動化された方法によっては困難であり、そのような分子の療法経費は著しい。本発明においては、小型の酵素的核酸モチーフ（例えばハンマーヘッドまたはヘアピン構造のもの）を外的送達に用いる。これらの分子の構造が簡単であることは、酵素的核酸がｍＲＮＡ構造の標的領域内へ侵入する能力を高める。しかし、これらの触媒的ＲＮＡ分子は、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることもできる（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎ，ｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，ｅｔａｌ．，１９９２，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ，ｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ，ｅｔａｌ．，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５;Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ.,１９９５,ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２３，２２５９）。当業者は、適当なＤＮＡベクターから、任意のリボザイムを真核生物細胞中で発現させうることを理解するであろう。このようなリボザイムの活性は、第２のリボザイムにより一次転写産物からそれらを放出させることにより増加させることができる(Ｄｒａｐｅｒｅｔａｌ.,ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９，およびＳｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ，ｅｔａｌ．，１９９２，ＮｕｃｅｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．２７，１５−６；Ｔａｉｒａ，ｅｔａｌ．１９９１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ，ｅｔａｌ．，１９９３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａｅｔａｌ．，１９９４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６)。リボザイム療法は、その極めて高い特異性のため、疾患病理学に寄与する因子をコードするｍＲＮＡを標的とするのに特に適している。すなわち、ストロメリシンｍＲＮＡを切断するリボザイムは、喘息の治療の新規な療法でありうる。したがって、第１の観点において、本発明はストロメリシン産生を阻害するリボザイムを特徴とする。これらの化学的または酵素的に合成されたＲＮＡ分子は、その標的ｍＲＮＡのアクセス可能な領域に結合する基質結合ドメインをも含む。ＲＮＡ分子はまた、ＲＮＡの切断を触媒するドメインを含む。ＲＮＡ分子は、好ましくはハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムである。結合した際に、リボザイムはストロメリシンをコードする標的ｍＲＮＡを切断し、翻訳およびストロメリシン蛋白質の蓄積を防止する。標的遺伝子が発現されないため、治療的効果が認められるであろう。 ”阻害”とは、ストロメリシンをコードするｍＲＮＡおよび蛋白質の活性またはレベルが、リボザイムの不在下で観察されるものよりも低く、好ましくはｍＲＮＡの同一の部位に結合しうるがそのＲＮＡを切断できない非活性ＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低いことを意味する。このようなリボザイムは、上述の疾患および病状、ならびに細胞もしくは組織におけるストロメリシン活性のレベルに関連する他のいずれの疾患または病状の予防にも有用である。”関連する”とは、ストロメリシンｍＲＮＡの阻害、したがってストロメリシン活性のレベルの減少が、疾患または病状の症状をある程度軽減させるであろうことを意味する。リボザイムは直接加えることもできるが、カチオン性脂質とともに複合させるか、リポソーム中に封入するか、または他の方法により標的細胞に送達することができる。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、バイオポリマーに取り込ませてまたは取り込ませずに、注射、エアロゾル吸入、注入ポンプまたはステントを用いて関連する組織にエクスビボまたはインビボで局所的に投与することができる。好ましい態様においては、リボザイムは表ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＶ、ＡＶＩ、ＡＶＩＩＩおよびＡＩＸに示される配列に相補的な結合アームを有する。このようなリボザイムの例は、表ＡＶ、ＡＶＩＩ、ＡＶＩＩＩおよびＡＩＸに示される。このようなリボザイムの例は、本質的にこれらの表において定義される配列からなる。 ”本質的に・・からなる”とは、活性なリボザイムが、標的部位における切断が生ずるように、例に示されるリボザイムと均等な酵素的中心およびｍＲＮＡに結合しうる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。本発明の関連する観点においては、標的分子を切断し、ストロメリシン活性を阻害するリボザイムは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組み換えベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リボザイムを発現するウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス主たはアルファウイルスを基に構築することができるが、これらに限定されない。好ましくは、リボザイムを発現しうる組み換えベクターを上述のように送達し、標的細胞中に存在させる。あるいは、リボザイムを過渡的に発現させるウイルスベクターを用いることができる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現すれば、リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイム発現ベクターの送達は、全身投与（例えば静脈内または筋肉内投与）により、患者から外植した標的細胞に投与した後に患者に再導入することにより、または所望の標的細胞に導入するための他の任意の方法により、行うことができる。 ”ベクター”とは、所望の核酸を送達するために用いられる任意の核酸および／またはウイルスに基づく技術を意味する。この種類の化学物質は、所望の標的ｍＲＮＡの切断に関して高度の特異性を示す。したがって、リボザイム剤はその特定の遺伝子を発現する細胞にのみ影響し、正常組織に対して毒性を有しないであろう。本発明を用いて、骨関節炎またはメタロプロテイナーゼ活性化により媒介される他の病理学的状態を治療するかまたは防止（予防的に）することができる。好ましい投与プロトコルは、ストロメリシン活性レベルを低下させるためのインビボ投与である。すなわち、本発明は、関節病状の発達または維持に関連するｍＲＮＡ、例えば、ストロメリシンをコードするｍＲＮＡ、および特に添付の表に開示されるｍＲＮＡ標的（ハンマーヘッドおよびヘアピン標的部位の両方を含む）を切断する酵素的ＲＮＡ分子（またはリボザイム）を特徴とする。それぞれの場合において、その部位は、本明細書に記載される方法および当該技術分野において知られている方法により、適当な基質結合アームを合成しうる領域によりフランクされており、酵素的活性を与えるために適当なハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフを加えることができる。例えば、図１を参照すると、アームＩおよびＩＩＩは特異的基質結合アームであるように修飾されており、アームＩＩは本質的に示されているままで残っている。ストロメリシンｍＲＮＡを切断するリボザイムは、骨関節炎等の関節疾患に対する新規な治療方法である。本発明は、滑膜細胞におけるプロストロメリシン分子の合成を阻害することにより、またはマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害により、骨関節炎の治療にリボザイムを用いることを特徴とする。本出願人は、リボザイムがストロメリシンの分泌を阻害しうること、および、リボザイムの触媒活性がその阻害的効果に必要であることを示す。当業者は、記載される例から、ストロメリシンをコードするｍＲＮＡを切断する他のリボザイムを容易に設計することができ、これらも本発明の範囲内であることが明らかであることを見いだすであろう。他の関連する観点においては、本発明は、上述の酵素的ＲＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を特徴とする。好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明は、ベクター中に位置する、上述の酵素的ＲＮＡ分子をコードする核酸を、例えばその酵素的ＲＮＡ分子の哺乳動物細胞における発現を可能にする様式で含む発現ベクターを特徴とする。または、患者に上述の酵素的ＲＮＡ分子を投与することにより疾患または病状を治療する方法を特徴とする。本発明は、関節病状の原因となるｍＲＮＡに対して高度の特異性を示す一群の化学的切断剤を提供する。このような酵素的ＲＮＡ分子は、感染細胞に外的にもしくは内的に送達することができる。好ましいハンマーヘッドモチーフにおいては、分子のサイズが小さいため（４０ヌクレオチドより少ない、好ましくは、３２−３６ヌクレオチドの長さ）、治療のコストを低下させることができる。本発明の酵素的ＲＮＡ分子を用いて、関節または前関節の病状を治療することができる。このような治療はまた、非ヒト霊長類の他の関連する遺伝子に拡張することができる。疾患を有する動物は、関節リスクの検出の時点で、または予防的様式で処置することができる。この治療のタイミングは、さらなる関節傷害の機会を減少させるであろう。別の観点においては、本発明は、新規な核酸に基づく技術［例えば、酵素的核酸分子（リボザイム）、アンチセンス核酸、２−５Ａアンチセンスキメラ、トリプレックスＤＮＡ、ＲＮＡ切断化学基含有アンチセンス核酸（Ｃｏｏｋｅｔａｌ．米国特許５，３５９，０５１）］およびそれらを用いて移植片耐性を誘導し、狼癒、慢性関節リウマチ、多発性硬化症等の自己免疫疾患を治療し、アレルギーを治療する方法を特徴とする。１つの好ましい態様においては、本発明は、１つまたはそれ以上の核酸に基づく技術を用いてＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３およびＣＤ４０蛋白質の合成を阻害することにより、移植片耐性を誘導することを特徴とする。当業者は、他の潜在的標的、例えばＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、β１インテグリン（ＶＬＡ４）もまた、本発明において記載される核酸に基づく技術での治療に適していることを認識するであろう。 ”阻害”とは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０の活性、またはＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０によりコードされるｍＲＮＡのレベルが、核酸の不在下で観察されるものより減少することを意味する。１つの態様においては、リボザイムによる阻害は、好ましくは、ｍＲＮＡの同一の部位に結合しうるがそのＲＮＡを切断できない酵素的に非活性のＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低いことを意味する。Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０に”均等な”ＲＮＡとは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、霊長類およびブタを含む種々の動物において移植片拒絶に関連する天然に生ずるＲＮＡ分子を含むことを意味する。 ”アンチセンス核酸”とは、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍｅｔａｌ．，１９９３Ｎａｔｕｒｅ３６５，５６６）相互作用により他のＲＮＡ（標的ＲＮＡ）に結合し、標的ＲＮＡの活性を変更する非酵素的核酸分子を意味する（総説として、ＳｔｅｉｎａｎｄＣｈｅｎｇ，１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１，１００４を参照されたい）。 ”２−５Ａアンチセンスキメラ”とは、５’リン酸化２’−５’−結合アデニレート残基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは、配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し、細胞性２−５Ａ−依存性リボヌクレアーゼを活性化し、これは次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅｅｔａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１３００）。 ”トリプレックスＤＮＡ”とは、配列特異的様式で２本鎖ＤＮＡに結合して、３本鎖ヘリックスを形成しうるオリゴヌクレオチドを意味する。トリプルヘリックス形成は、標的遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅｔａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，５０４）。 ”遺伝子”とは、ＲＮＡをコードする核酸を意味する。Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０ｍＲＮＡ中の特定の部位を切断するリボザイムは、移植片耐性を誘導し、自己免疫疾患、アレルギーおよび他の炎症性病状を治療する新規治療法である。本出願人は、リボザイムがＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０の活性を阻害しうること、および、リボザイムの触媒活性がその阻害的効果に必要であることを示す。当業者は、記載される例から、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０ｍＲＮＡ中のこれらの部位を切断する他のリボザイムを容易に設計することができ、これらも本発明の範囲内であることが明らかであることを見いだずであろう。好ましい態様において、本発明は、所望の標的のＲＮＡに対して高い特異性を示す一群の酵素的切断剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は、好ましくは、１つまたはいくつかの酵素的核酸により疾患または病状の特異的治療が与えられるように、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０蛋白質をコードする標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は、必要に応じて特定の細胞に外的に送達することができる。あるいは、リボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができる。このようなリボザイムは、上述した疾患および病状、ならびに細胞または組織におけるＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０活性のレベルに関連する任意の他の疾患および病状の予防に有用である。”関連する”とは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０ｍＲＮＡの阻害、したがってそれぞれの蛋白質活性のレベルの低下が、疾患または病状の症状をある程度軽減することを意味する。リボザイムは直接加えることもできるが、カチオン性脂質とともに複合体化させるか、リポソーム中に封入するか、または他の方法により標的細胞に送達することができる。核酸または核酸複合体は、バイオポリマー中に取り込ませてまたは取り込ませずに、注射、注入ポンプまたはステントを用いて関連する組織にエクスビボまたはインビボで局所的に投与することができる。好ましい態様においては、リボザイムは、表ＢＩＩ、ＢＩＶ、ＢＶＩ、ＢＶＩＩＩ、ＢＸ、ＢＸＩＩ、ＢＸＩＶ、ＢＸＶ、ＢＸＶＩ、ＢＸＶＩＩ、ＢＸＶＩＩＩおよびＢＸＩＸに示される配列に相補的な結合アームを有する。このようなリボザイムの例は、表ＢＩＩＩ、ＢＶ、ＢＶＩ、ＢＶＩＩ、ＢＩＸ、ＢＸＩ、ＢＸＩＩＩ、ＢＸＩＶ、ＢＸＶ、ＢＸＶＩ、ＢＸＶＩＩ、ＢＸＶＩＩＩおよびＢＸＩＸに示される。このようなリボザイムの例は、本質的にこれらの表に表される配列からなる。本発明の別の態様においては、標的分子を切断し、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ −３および／またはＣＤ４０活性を阻害するリボザイムを、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現させる。組み換えベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルス性ベクターである。リボザイムを発現するウイルス性ベクターは、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスを基に構築することができるが、これらに限定されない。好ましくは、リボザイムを発現しうる組み換えベクターを上述のように送達し、標的細胞中に存在させる。あるいは、リボザイムを過渡的に発現させるウイルス性ベクターを用いることができる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現すれば、リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイムを発現するベクターの送達は、全身投与（例えば静脈内または筋肉内投与）により、患者から外植した標的細胞に投与した後に患者に再導入することにより、または所望の標的細胞に導入するための他の任意の方法により、行うことができる。本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載最初に図面を簡単に説明する。図面図１は、当該技術分野において知られているハンマーヘッドリボザイムドメインの図解的描写である。ステムIIは２塩基対以上の長さでありうる。図２（ａ）は、当該技術分野において知られているハンマーヘッドリボザイムドメインの図解的描写であり；図２（ｂ）は、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，５９６−６００）により基質および酵素部分に分割されたハンマーヘッドリボザイムの図解的描写であり；図２（ｃ）は、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１）により２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様の図解的描写であり；そして図２（ｄ）はＪｅｆｆｒｉｅｓおよびＳｙｍｏｎｓ（１９８９，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１７，１３７Ｔ−１３７１）により２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様の図解的描写である。図３は、ヘアピンイボザイムの一般的構造の図解的描写である。ヘリックス２（Ｈ２）は少なくとも４塩基対（すなわち、ｎは１、２、３または４）にて提供され、ヘリックス５は任意に２以上の長さの塩基（好ましくは３−２０塩基、すなわち、ｍは１−２０またはそれ以上）にて提供されうる。ヘリックス２およびヘリックス５は１つまたはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（すなわち、ｒは１塩基以上）。また、ヘリックス１、４または５を２以上の塩基対により延長することにより（例えば、４−２０塩基対）リボザイム構造を安定化してもよく、好ましくはこれは蛋白質結合部位である。各々の例においては、各ＮおよびＮ’は独立にいずれかの通常の塩基または修飾塩基であり、そして各ダッシュは潜在的塩基対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは、糖、塩基またはリン酸部分で修飾されていてもよい。完全な塩基対形成はヘリックス内において必要ではないが、これが好ましい。ヘリックス１および４は、いくつかの塩基対が維持される限り任意の大きさであってよい（すなわち、ｏおよびｐは各々独立に０から任意の数値、例えば２０である）。必須塩基は構造中において特定の塩基として示されるが、当業者は１つまたはそれ以上が顕著な影響なしに化学的に修飾（脱塩基（ａｂａｓｉｃ））、塩基、糖および／またはリン酸修飾）または他の塩基により置換されていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は２つの別々の分子から、すなわち接続ループを用いずに形成することができる。接続ループが存在する場合には、これは、塩基、糖またはリン酸が修飾されていてもいなくてもよいリボヌクレオチドでありうる。「ｑ」は２塩基以上である。接続ループは非ヌクレオチドリンカー分子で置換されていてもよい。Ｈは塩基Ａ、Ｕ、またはＣを意味する。Ｙはピリミジン塩基を意味する。”− ”は化学結合を意味する。図４は、当該技術分野において知られているデルタ肝炎ウイルスリボザイムドメインの一般的構造の描写である。図５は、自己切断ＶＳＲＮＡリボザイムドメインの一般的構造の描写である。図６はＲＮａｓｅＨアクセス可能性アッセイの図解的描写である。詳しくは、図６の左側は、標的ＲＮＡ上のアクセス可能な部位に結合した相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの図である。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａ、ＢおよびＣと表示された広い線により表される。標的ＲＮＡは細いねじれ線により表される。図６の右側は、切断された標的ＲＮＡから未切断標的ＲＮＡをゲル分離するスキームである。標的ＲＮＡの検出は、ボディー標識Ｔ７転写産物のオートラジオグラフィーによる。各々のレーンに共通のバンドは、未切断標的ＲＮＡを表す；各々のレーンに独特のバンドは、切断された産物を表す。図７は、ＨＨリボザイムによるストロメリシンｍＲＮＡのインビトロ切断を示す。図８は、ＨＳ−２７繊維芽細胞株における２１ＨＨリボザイムによるストロメリシン発現の阻害を示す。図９は、ＨＳ−２７繊維芽細胞株における４６３ＨＨリボザイムによるストロメリシン発現の阻害を示す。図１０は、ＨＳ−２７繊維芽細胞株における１０４９ＨＨリボザイムによるストロメリシン発現の阻害を示す。図１１は、ＨＳ−２７繊維芽細胞株における１３６６ＨＨリボザイムによるストロメリシン発現の阻害を示す。図１２は、ＨＳ−２７繊維芽細胞株における１４１０ＨＨリボザイムによるストロメリシン発現の阻害を示す。図１３は、ＨＳ−２７繊維芽細胞株における１４８９ＨＨリボザイムによるストロメリシン発現の阻害を示す。図１４は、ウサギ膝におけるストロメリシンｍＲＮＡのレベルの１０４９ＨＨリボザイム媒介性減少を示ず。図１５は、ウサギ膝におけるストロメリシンｍＲＮＡのレベルの１０４９ＨＨリボザイム媒介性減少を示す。図１６は、ウサギ膝におけるストロメリシンｍＲＮＡのレベルの１０４９ＨＨリボザイム媒介性減少を示す。図１７は、１０４９２’−Ｃ−アリルＨＨリボザイムの触媒活性に及ぼずホスホロチオエート置換の影響を示す。Ａ）は、１０４９ハンマーヘッドリボザイムー基質複合体の図解的描写である。１０４９Ｕ４−Ｃ−アリルＰ＝Ｓリボザイムは、５つの位置においてリボース残基を含むハンマーヘッドを表す。残りの３１ヌクレオチド位置は２’−ヒドロキシル基置換を含み、ここで３０ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル置換を含み、１つのヌクレオチド（Ｕ₄）は２’− Ｃ−アリル置換を含む。さらに、リボザイム中の５つのヌクレオチドは、５’および３’末端においてホスホロチオエート置換を含む。Ｂ）は、図１７Ａに記載されるリボザイムがウサギ膝においてストロメリシンＲＮＡのレベルを減少させる能力を示す。図１８は、ストロメリシンＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたリボザイムの図解的描写である。１０４９２’−アミノＰ＝Ｓリボザイムは５つの位置においてリボース残基を含むハンマーヘッドを表す。残りの３１ヌクレオチド位置は２’−ヒドロキシル基置換を含み、ここで２９ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル置換を含み、２つのヌクレオチド（Ｕ₄およびＵ₇）は２’−アミノ置換を含む。さらに、このリボザイムの３’末端は３’−３’結合反転Ｔを含み、５’末端の４つのヌクレオチドはホスホロチオエート置換を含む。矢印の先端はＲＮＡ切断部位（部位１０４９）を示す。、１３６３２’−アミノＰ＝Ｓ、ヒトおよびウサギ１３６６２’−アミノＰ＝Ｓリボザイムは、これらがストロメリシンＲＮＡ中の部位１３６３および１３６６を標的とすることを除き、１０４９２’−アミノＰ＝Ｓリボザイムと同一である。図１９は、ウサギ膝におけるストロメリシンｍＲＮＡのレベルの１０４９２ ’−アミノＰ＝Ｓリボザイム媒介性減少を示す。図２０は、ウサギ膝におけるストロメリシンｍＲＮＡのレベルの１３６３２ ’−アミノＰ＝Ｓリボザイム媒介性減少を示す。図２１は、ウサギ膝におけるストロメリシンｍＲＮＡのレベルの１３６６２ ’−アミノＰ＝Ｓリボザイム媒介性減少を示す。図２２ａ−ｄはそれぞれ、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルに対する塩基置換の非限定的例の図解的描写である。図２３は、位置の番号付けをしたハンマーヘッドリボザイム(Ｈｅｒｔｅｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９２，２０：３２５２にしたがう)の図解的描写であり、触媒コアおよび基質結合アームにおける特定の置換を示す。化合物４、９、１３、１７、２２および２３は図２４に記載される。図２４は、ハンマーヘッドリボザイムの触媒コア中において置換しうる種々のヌクレオチドの図解的描写である。図２５は、リボチミジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図２６は、５−メチルシチジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図２７は、５−ブロモウリジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図２８は、６−アザウリジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図２９は、２，６−ジアミノプリンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図３０は、６−メチルウリジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図３１は、部位Ａ（ＨＨ−Ａ）を標的とするハンマーヘッドリボザイムの描写である。６−メチルＵ置換の部位が示される。図３２は、６−メチルＵ−置換（６−メチル−Ｕ４）を含むＨＨ−Ａリボザイムにより触媒されるＲＮＡ切断反応を示す。Ｕ４は６−メチル−Ｕ置換を含まないＨＨ−Ａリボザイムを表す。図３３は、部位Ｂ（ＨＨ−Ｂ）を標的とするハンマーヘッドリボザイムの描写である。６−メチルＵ置換の部位が示される。図３４は、Ｕ４およびＵ７位において６−メチルＵ−置換を含むＨＨ−Ｂリボザイム（６−メチル−Ｕ４）により触媒されるＲＮＡ切断反応を示す。Ｕ４は、６−メチル−Ｕ置換を含まないＨＨ−Ｂリボザイムを表す。図３５は、部位Ｃ（ＨＨ−Ｃ）を標的とするハンマーヘッドリボザイムの描写である。６−メチルＵ置換の部位が示される。図３６は、Ｕ４およびＵ７位において６−メチルＵ−置換を含むＨＨ−Ｃリボザイム（６−メチル−Ｕ４）により触媒されるＲＮＡ切断反応を示す。Ｕ４は、６−メチル−Ｕ置換を含まないＨＨ−Ｃリボザイムを表す。図３７は、ラット平滑筋細胞増殖の６−メチル−Ｕ−置換ＨＨ−Ａリボザイム媒介性阻害を示す。図３８は、ヒト滑液繊維芽細胞におけるストロメリシン蛋白質産生の６−メチル−Ｕ−置換ＨＨ−Ｃリボザイム媒介性阻害を示す。図３９は、ピリジン−２−オンヌクレオシドおよびピリジン−４−オンヌクレオシドホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図４０は、２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −１−デオキシ−１−フェニル−β−Ｄ−リボフラノースホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図４１は、シュードウリジン、２，４，６−トリメトキシベンゼンヌクレオシドおよび３−メチルウリジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図４２は、ジヒドロウリジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図４３Ａ）は、部位Ｂを標的とするハンマーヘッドリボザイムの図解的描写である。Ｂ）は、４位または７位において修飾塩基置換を有するハンマーヘッドリボザイムにより触媒されるＲＮＡ切断反応を示す。図４４は、ＨＨ−Ｂリボザイム（Ａ）；７位にピリジン−４−オン置換を有するＨＨ−Ｂ（Ｂ）；および７位にフェニル置換を有するＨＨ＝Ｂ（Ｃ）；により触媒されるＲＮＡ切断反応の速度論的特性をさらに示す。図４５は、２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −１−デオキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−リボフラノースの合成の図解的描写である。図４６は、２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −１−デオキシ−１−（ｐ−アミノフェニル）−β−Ｄ−リボフラノースの合成の図解的描写である。図４７は、位置の番号付けをしたハンマーヘッドリボザイム(Ｈｅｒｔｅｌｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９２，２０，３２５２にしたがう)の図解的描写であり、特定の置換を示す。図４８は、本発明の２’−アルキル修飾ヌクレオチドを例示する種々の２’− アルキル修飾ヌクレオチドの構造を示す。Ｒ基はアルキル基であり、Ｚは保護基である。図４９は、２’−Ｃ−アリルウリジンおよびシチジンの合成の図解的描写である。図５０は、２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンウリジンの合成の図解的描写である。図５１は、２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンシチジンの合成の図解的描写である。図５２は、２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンアデノシンの合成の図解的描写である。図５３は、２’−Ｃ−カルボキシメチリジンウリジン、２’−Ｃ−メトキシカルボキシメチリジンウリジンおよびそれらの誘導化アミダイトの合成の図解的描写である。Ｘは、ＣＨ₃または上述のようにアルキルであるか、または他の置換基である。図５４は、２’−Ｃ−アリルウリジンおよびシチジンホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図５５は、２’−Ｏ−アルキルチオアルキルヌクレオシドまたは非ヌクレオシド、およびそれらのホスホルアミグイトの合成の図解的描写である。Ｒは、上で定義したようにアルキルである。Ｂは任意の天然に生ずるまたは標準的なオリゴヌクレオチド合成に適した任意のＮ−保護基を有する修飾塩基であり（Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，上掲；Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，上掲）、および／または上述した文献に記載されるようにＨ（非ヌクレオチド）である。ＣＥはシアノエチルであり、ＤＭＴは標準的なブロッキング基である。他の略号は当該技術分野において標準的なものである。図５６は、部位Ｂを標的とする、２’−Ｏ−メチルチオメチル置換を含むハンマーヘッドリボザイム（ＨＨ−Ｂ）の図解的描写である。図５７は、２’−Ｏ−メチルチオメチル置換リボザイムにより触媒されるＲＮＡ切断活性を示す。時間の関数として切断されたパーセントのプロットが示される。反応は、４０ｎＭリボザイム、１ｎＭ基質および１０ｍＭＭｇＣｌ₂の存在下で３７℃で実施した。対照ＨＨ−Ｂリボザイムは以下の修飾を含有していた；２９の位置は２’−Ｏ−メチルで修飾され、Ｕ４およびＵ７位は２’−アミノ基で修飾され、５つの位置は２’−０Ｈ基を含んでいた。対照リボザイムのこれらの修飾は、リボザイムの活性に有意に影響を与えないことが示されている(Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，１９９４ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ３１，１６３)。図５８は、脱塩基デオキシリボースまたはリボース非ヌクレオチド模倣ホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。図５９は、部位Ｂを標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨ−Ｂ）の図解的描写である。矢印は切断部位を示す。図６０は、種々の位置において脱塩基置換を含むＨＨ−Ｂリボザイム（ＨＨ− Ｂａ）の図解的描写である。リボザイムは本明細書に記載されるようにして合成した。”Ｘ”は脱塩基置換の位置を示す。脱塩基置換は、別々にまたは所定の組み合わせで作成された。図６１は、ＨＨ−ＢおよびＨＨ−ＢａリボザイムのインビトロＲＮＡ切断活性を示す。全ＲＮＡは、脱塩基置換を含まないＨＨＡリボザイムを表す。Ｕ４脱塩基は、４位に単一の脱塩基（リボース）置換を有するＨＨ−Ｂａリボザイムを表す。Ｕ７脱塩基は、７位に単一の脱塩基（リボース）置換を有するＨＨ−Ｂａリボザイムを表す。図６２は、ＨＨ−ＢおよびＨＨ−ＢａリボザイムのインビトロＲＮＡ切断活性を示す。脱塩基ステムＩＩループは、ステムＩＩのループ中に４つの脱塩基（リボース）置換を有するＨＨ−Ｂａリボザイムを表す。図６３は、ＨＨ−ＢおよびＨＨ−ＢａリボザイムのインビトロＲＮＡ切断活性を示す。３’−反転デオキシリボースは、その３’末端に反転デオキシリボース（脱塩基）置換を有するＨＨ−Ｂａリボザイムを表す。図６４は、部位Ａを標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨ−Ａ）の図解的描写である。標的Ａは哺乳動物平滑筋細胞の増殖に関与している。矢印は切断の部位を示す。ＨＨ−Ａの不活性なものは、リボザイムを触媒的に不活性にする２塩基置換（Ｇ５ＵおよびＡ１５．１Ｕ）を含む。図６５は、４位に脱塩基置換を有するＨＨ−Ａリボザイム（ＨＨ−Ａａ）の図解的描写である。Ｘは、脱塩基置換の位置を示す。図６６は、ラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）の増殖のリボザイム媒介性阻害を示す。ＨＨ−ＡおよびＨＨ−Ａａリボザイムのいずれも、培養ＲＡＳＭＣの増殖を阻害することができる。触媒的に不活性なＨＨ−Ａリボザイムは、活性なＨＨ−ＡおよびＨＨ−Ａａリボザイムより有意に低い阻害を示す。図６７は、エチルアミン（ＥＡ）を用いる２ポット脱保護プロトコルの図式的描写である。図６８は、２つの半リボザイムからハンマーヘッドリボザイムを合成するのに用いられる方法を示す。ＸおよびＹは、化学的に反応して共有結合を形成しうる反応性部分を表す（実線曲線で表される）。図６９は、初期ループ領域中に配置されて共有結合を形成し、全長リボザイムを与えることができる種々の反応性部分の非限定的例を示す。ＣＨ₂は上述の任意の連結鎖であることができ、例えば、メチレン、エーテル、エチレングリコール、チオエーテル、二重結合、芳香族基および他のものである；それぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一であっても異なっていてもよい；それぞれのＲは独立して、プロトンまたはアルキル、アルケニルおよび他の官能基、またはコンジュゲートであり、例えばペプチド、ステロイド、ホルモン、脂質、核酸配列、およびヌクレアーゼ耐性、改良された細胞結合、改良された細胞取り込みまたは細胞内局在を与える他のものである。図７０は、形成されて全長リボザイムを与えることができる共有結合の非限定的例を示す。モルホリノ基はジアルデヒドの還元反応から生じ、これは１つの半リボザイムの３’末端のリボースのその半リボザイムの５’末端アミンによる酸化的切断から生ずる。１つの半リボザイムの３’末端の酸を他方の半リボザイムの５’末端のアミンとカップリングさせるとアミド結合が生成する。図７１は、２つの半リボザイムのカップリング反応から合成された３つのリボザイムの非限定的例を示す。３つ全てはｃ−ｍｙｂＲＮＡの部位Ａを標的とするものであった（ＨＨ−Ａ）。ＨＨ−Ａ１は、２つのチオールを反応させてジスルフィド連結リボザイムを得ることにより形成された。ＨＨ−Ａ２およびＨＨ− Ａ３はモルホリノ反応を用いて形成された。ＨＨ−Ａ２は、末端アミンを半リボザイムの５’末端に連結させる５原子スペーサーを含む。ＨＨ−Ａ３は、末端アミンを半リボザイムの５’末端に連結させる６炭素スペーサーを含む。図７２は、共有結合していない５および６塩基対ステムＩＩ領域を含む半リボザイムの、全長リボザイムと比較した切断活性を示す。アッセイはリボザイム過剰条件下で実施した。図７３は、共有結合していない７および８塩基対ステムＩＩ領域を含む半リボザイムの、全長リボザイムと比較した切断活性を示す。アッセイはリボザイム過剰条件下で実施した。図７４は、架橋反応から形成されたＨＨ−Ａ１、ＨＨ−Ａ２およびＨＨ−Ａ３（図７２を参照されたい）の、全長リボザイム対照と比較した切断アッセイを示す。アッセイはリボザイム過剰条件下で実施した。図７５は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター構造の図式的描写である。矢印は、転写開始部位およびコーディング領域の方向を表す。Ａ、ＢおよびＣは、コンセンサスＡ、ＢおよびＣボックスプロモーター配列を表す。Ｉは、中間体シス作用プロモーター配列を表す。ＰＳＥは、近位配列要素を表す。ＤＳＥは、遠位配列要素を表す。ＡＴＦは活性化転写因子結合要素を表す。？は、完全に特性決定されていないシス作用配列要素を表す。ＥＢＥＲはエプスタインバーウイルスコードＲＮＡを表す。ＴＡＴＡは当該技術分野においてよく知られたボックスである。図７６は、本発明のｐｏｌＩＩＩＲＮＡの一般式である。図７７は、Ｕ６−Ｓ３５キメラの図解的描写である。Ｓ３５モチーフおよび所望のＲＮＡの挿入の部位が示される。このキメラＲＮＡ転写産物は、Ｕ６小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）プロモーターの制御下にある。図７８は、Ｕ６−Ｓ３５−リボザイムキメラの図解的描写である。キメラは部位１を標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＩ）を含む。図７９は、Ｕ６−Ｓ３５−リボザイムキメラの図解的描写である。キメラは部位ＩＩを標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＩＩ）を含む。図８０は、合成ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＩ）により、およびＵ６−Ｓ３５−ＨＨＩハンマーヘッドリボザイムのインビトロ転写産物により触媒されるＲＮＡ切断反応を示す。図８１は、アクチノマイシンＤアッセイにより測定された、２９３哺乳動物細胞中におけるＵ６−Ｓ３５−ＨＨＩＩＲＮＡ転写産物の安定性を示す。図８２は、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡの図解的描写である。ＲＮＡ二次構造中の種々のドメインが示される。図８３Ａは、プロモーター要素ＡおよびＢボックスを含むＶＡ１−Ｓ３５キメラＲＮＡの二次構造モデルを示す。所望のＲＮＡの挿入の部位およびＳ３５モチーフが示される。転写ユニットはまたＶＡ１ＲＮＡの中心ドメイン中に安定なステム（Ｓ３５様モチーフ）を含み、この位置において所望のＲＮＡは独立したドメインとして主要転写産物から離れている。８３Ｂは、ＶＡ１ＲＮＡの末端７５ｎｔおよびそれに続くＨＨＩリボザイムからなるＶＡ１−キメラを示す。図８４は、アクチノマイシンＤアッセイにより測定した、ＶＡ１−キメラＲＮＡとＶＡ１−Ｓ３５−キメラＲＮＡとの安定性の比較を示す。ＶＡ１−キメラはＶＡ１ＲＮＡの末端７５ｎｔおよびそれに続くＨＨＩリボザイムからなる。ＶＡ１−Ｓ３５−キメラ構造および配列は図８３に示される。リボザイム本発明の１つの観点においては、リボザイムは、ストロメリシン発現をある程度遮断し、疾患の治療またはそのような疾患の診断に用いることができる。リボザイムは、培養細胞に、および骨関節炎の動物モデルの細胞または組織に送達する（Ｈｅｍｂｒｙｅｔａｌ．，１９９３Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１４３，６２８）。これらの系におけるストロメリシンをコードするｍＲＮＡのリボザイム切断は、炎症性細胞機能を防止し、疾患症状を軽減することができる。本発明の他のリボザイムは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０産生をある程度遮断し、疾患の治療またはそのような疾患の診断に用いることができる。リボザイムは、培養細胞に、および移植、自己免疫疾患および／またはアレルギーの動物モデルの細胞または組織に、およびヒト細胞または組織にエクスビボまたはインビボで送達する。これらの系におけるＢ７−１、Ｂ７− ２および／またはＣＤ４０をコードするｍＲＮＡのリボザイム切断は、疾患症状を軽減することができる。標的部位有用なリボザイムの標的はＤｒａｐｅｒら（上掲）、Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲）、ならびにＤｒａｐｅｒら（ＷＯ９５／１３３８０）およびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（ＷＯ９５／２３２２５）に開示されているようにして決定することができる。本明細書ではこれらの文書で提供されているガイドラインを繰り返さずに、以下にこれらの方法の特定の例を提供するが、当業者を制限するものではない。このような標的に対するリボザイムは、これらの出願において記載されているように設計し、そして記載されているように合成して、インビトロおよびインビボで試験する。このようなリボザイムは本明細書に記載されるように最適化し、送達することもできる。マウス、ウサギおよび他の動物のＲＮＡに対する特定の例を提供するが、当業者は均等なヒトＲＮＡ標的を以下で記載するようにして使用しうることを認識するであろう。すなわち、同一の標的を使用することができるが、リボザイム中にヒトＲＮＡ配列を標的とするのに適する結合アームが存在する。このような標的も以下に記載するようにして選択することができる。コンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して、ヒトおよびウサギストロメリシンｍＲＮＡの配列を、アクセス可能な部位についてスクリーニングした。潜在的ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム切断部位を同定した。これらの部位は表ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＶ、ＡＶＩ、ＡＶＩＩＩおよびＡＩＸに示される（これらの表中、配列は全て５’から３’である）。ウサギおよびヒト配列をスクリーニングし、次にリボザイムを設計することができるが、ヒトを標的とする配列が最も有用である。しかし、ウサギを標的とするリボザイムは、ヒトにおいて試験する前にリボザイムの作用の効力を試験するために有用であろう。表中、ヌクレオチド塩基位置は、示されるタイプのリボザイムにより切断されるべき部位として示される。同様にして、コンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して、ヒトおよびマウスＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０ｍＲＮＡの配列を、最適リボザイム標的部位についてスクリーニングした。ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム切断部位を同定した。これらの部位は表ＢＩＩ、ＢＩＶ、ＢＶＩ、ＢＶＩＩＩ、ＢＸ、ＢＸＩＩ、ＢＸＩＶ、ＢＸＶ、ＢＸＶＩ、ＢＸＶＩＩ、ＢＸＶＩＩＩおよびＢＸＩＸに示される（これらの表中、配列は全て５’から３’である）。表中、ヌクレオチド塩基位置は、示されるタイプのリボザイムにより切断されるべき部位として示される。マウスおよびヒト配列をスクリーニングし、次にリボザイムを設計することができるが、ヒトを標的とする配列が最も有用である。しかし、マウスを標的とするリボザイムは、ヒトにおいて試験する前にリボザイムの作用の効力を試験するために有用であろう。表中、ヌクレオチド塩基位置は、示されるタイプのリボザイムにより切断されるべき部位として示される。ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイムをこれらが結合しうるように設計し、コンピューター折りたたみ（Ｊａｅｇｅｒｅｔａｌ．，１９８９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６−７７１０）により別々に分析して、リボザイム配列が適切な二次構造に折りたたまれるかどうかを評価した。結合アームと触媒コアとの間に好ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外する。種々の結合アームの長さを選択して活性を最適にすることができる。一般に、各アームの少なくとも５塩基が標的ＲＮＡと結合しうるか、さもなくば標的ＲＮＡと相互作用することができる。図６を参照すると、一般にＤｒａｐｅｒ（ＷＯ９３／２３５６９）に記載される方法によりｍＲＮＡをアクセス可能な切断部位についてスクリーニングする。簡単には、潜在的ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム切断部位を表すＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ヒトまたはウサギストロメリシンｃＤＮＡクローンからのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写のための基質を生成する。２つのテンプレートから標識ＲＮＡ転写産物をインビトロで合成する。オリゴヌクレオチドおよび標識転写産物をアニーリングさせ、ＲＮａｓｅＨを加え、混合物を３７℃で指示された時間インキュベートする。反応を停止させ、配列決定用ポリアクリルアミドゲルでＲＮＡを分離する。切断された基質のパーセンテージは、ホスファーイメージングシステムを用いてオートラジオグラフィー定量により判定する。これらのデータから、最もアクセス可能であるものとしてハンマーヘッドリボザイム部位が選択された。ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムを、ｍＲＮＡメッセージ中の種々の部位にアニーリングするように設計する。結合アームは上述の標的部位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成する。用いた合成方法は、Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，１０９，７８４５−７８５４；Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，１９９０ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，５４３３−５４４１；Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２３，２６７７，に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい、慣用の核酸保護基およびカップリング基、例えば５’末端にジメトキシトリチル、および３’末端にホスホルアミダイトを用いる。平均段階カップリング収率は＞９８％であった。不活性リボザイムは、Ｇ₅の代わりにＵをそしてＡ₁₄の代わりにＵを使用して合成した（番号は、Ｈｅｒｔｅｌ，ｅｔａｌ．，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，３２５２による）。ヘアピンリボザイムは２つの部分で合成し、アニーリングして活性リボザイムを再構築した（ＣｈｏｗｒｉｒａａｎｄＢｕｒｋｅ，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムは全て、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’− アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈで修飾することにより安定性を高めるように広範囲に修飾した（総説については、ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ１７，３４およびＢｅｉｇｅｌｍａｎｅｔａｌ．，１９９５Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ２７０，２５７０２を参照されたい）。リボザイムは一般的な方法を使用してゲル電気泳動で精製するか、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．（上掲）を参照されたい）で精製し、そして水に再懸濁した。この研究に有用な、化学的に合成したリボザイムの配列は、表ＡＶ、ＡＶＩＩ、ＡＶＩＩＩおよびＡＩＸならびに表ＢＩＩＩ、ＢＶ、ＢＶＩ、ＢＶＩＩ、ＢＩＸ、ＢＸＩ、ＢＸＩＩＩ、ＢＸＩＶ、ＢＸＶ、ＢＸＶＩ、ＢＸＶＩＩ、ＢＸＶＩＩＩおよびＢＸＩＸに示される。当業者は、これらの配列が、活性に影響を及ぼすためにリボザイムの酵素的部分（結合アームを除くすべて）が変更されているはるかに多くのそのような配列の代表例にすぎないことを理解するであろう。例えば、表ＡＶおよびＡＶＩＩに挙げられるハンマーヘッドリボザイムのステム− ループII配列（５’−ＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ−３’）は、最小で２つの塩基対形成したステム構造を形成しうる限り、任意の配列を含むように変更（置換、削除、および／または挿入）することができる。同様に、表ＡＶＩおよびＡＶＩＩに挙げられるヘアピンリボザイムのステムーループIV配列（５’−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−３’）は、最小で２つの塩基対形成したステム構造を形成しうる限り、任意の配列を含むように変更（置換、削除、および／または挿入）することができる。表ＡＶ、ＡＶＩＩ、ＡＶＩＩＩおよびＡＩＸに挙げられる配列は、リボヌクレオチドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドで形成することができる。そのようなリボザイムは、表に具体的に記載されるリボザイムと均等である。リボザイム活性の最適化リボザイム活性はＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（上掲）に記載されているようにして最適化することができる。ここでは詳細は述べないが、これらには、リボザイム結合アーム（ステムＩおよびIII、図２ｃを参照されたい）の長さの変更、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾を有するリボザイムの化学的合成（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ，ｅｔａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎｅｔａｌ．，１９９１,Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３，３１４；ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ，ｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉ，ｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２，ならびにＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，上掲；Ｓｐｒｏａｔ，欧州特許出願９２１１０２９８．４および米国特許５，３３４，７１１；Ｊｅｎｎｉｎｇｓｅｔａｌ．，ＷＯ９４／１３６８８；およびＢｅｉｇｅｌｍａｎｅｔａｌ．，上掲を参照されたい）が含まれる。これらは酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる種々の化学修飾、細胞におけるこれらの活性を増強させる修飾およびステムII塩基の除去によるＲＮＡの合成時間の短縮および化学物質の必要性の減少を記載している。Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲）は、酵素的ＲＮＡ分子の一般的な送達方法を記載している。リボザイムは、当業者に知られている種々の方法によって細胞に投与することができる。例えば、リポソーム中へのカプセル化、イオントホレシス、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセルおよび生物接着性微小球のような他のベヒクル中への取り込みが挙げられるが、これらに限定されない。適応症によっては、リボザイムは、上述のベヒクルとともにもしくはベヒクルなしで、エクスビボで直接細胞または組織に送達することができる。あるいは、ＲＮＡ／ベヒクルの組合せ物は、直接吸入、直接注射またはカテーテル、注入ポンプもしくはステントの使用により局所的に送達される。別の送達経路には、静脈内、筋肉内、皮下もしくは関節注射、エアゾール吸入、経口（錠剤または丸剤形態）、局所、全身、眼、腹腔内および／または鞘内送達が含まれるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のさらに詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲）およびＤｒａｐｅｒら（上掲）に提供されており、これらを本明細書の一部としてここに引用する。別の好ましい態様においては、リボザイムは適当なリボソームベヒクル中でＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０発現（ＡＰＣ）の部位に投与する。ドナー（例えば）から単離されたＡＰＣをエクスビボでリボザイム調製物（または他の核酸治療剤）で処理し、処理細胞をレシピエント中に注入する。あるいは、細胞、組織または臓器を、レシピエントに移植する前に本発明の核酸で直接処理する。細胞内に高濃度のリボザイムを蓄積させるもう１つの手段は、リボザイムをコードする配列をＤＮＡ発現ベクター中に取り込ませることである。リボザイム配列の転写は、真核細胞ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡポリメラーゼ II（ｐｏｌII）またはＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）のプロモーターから行われる。ｐｏｌIIもしくはｐｏｌIIIプロモーターからの転写産物は、全ての細胞で高レベルで発現されろであろう；あるタイプの細胞中のあるｐｏｌIIプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサー等）の性質に依存するであろう。原核細胞ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞内で発現する限り、原核細胞ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎａｎｄＭｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；ＧａｏａｎｄＨｕａｎｇ，１９９３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９３，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ，ｅｔａｌ．，１９９０Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数人の研究者は、このようなプロモーターから発現されたリボザイムが哺乳動物細胞で機能しうることを示している（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，ｅｔａｌ．，１９９２，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ，ｅｔａｌ．，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０,４５８１−９；Ｙｕｅｔａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒｅｔａｌ．，１９９２ＥＭＢＯＪ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ（上掲））。上記のリボザイム転写ユニットは、哺乳動物細胞中に導入するために、種々のベクター中に組み込ませることができる。例えば、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター）またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられるが、これらに限定されない本発明の好ましい態様においては、ストロメリシンＲＮＡを切断するリボザイムを発現する転写ユニットを、プラスミドＤＮＡベクターまたはアデノウイルスＤＮＡウイルスもしくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に挿入する。いずれのウイルスベクターも遺伝子を肺に伝達するために用いられており、いずれのベクターも過渡的遺伝子発現をもたらした（Ｚａｂｎｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９３Ｃｅｌｌ７５，２０７：Ｃａｒｔｅｒ，１９９２Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，５３３）。アデノウイルスベクターは組換えアデノウイルス粒子として送達される。ＤＮＡは、ＲＮＡについて上記で説明したように、単独でまたはベヒクルと複合体を形成させて送達することができる。組み換えアデノウイルスもしくはＡＡＶ粒子は、例えば、インビボでのインキュベーションまたは吸入により、またはエクスビボで細胞もしくは組織に直接適用することにより、治療部位に局所的に投与される。以下に、特に有用な修飾、最適化および合成の方法を記載する。塩基修飾関連する技術に関する以下の記述は、図１に示されるダイアグラムにしたがい、ここではハンマーヘッドリボザイム中の種々のヌクレオチドの番号付けが与えられる。Ｏｄａｉｅｔａｌ，ＦＥＢＳ１９９０，２６７：１５０は、ハンマーヘッドリボザイムの５位のグアノシン（Ｇ）をイノシンで置換すると触媒活性が著しく減少すると述べており、”触媒活性に対するこのグアノシンの２−アミノ基の重要性”を示唆する。ＦｕａｎｄＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１９９２，８９：３９８５は、ハンマーヘッドリボザイムの５位におけるグアノシンの２−アミノ基の削除、または５位または８位のいずれかにおける２’−ヒドロキシル基の削除により、切断効率が減少したリボザイムが得られると述べている。ＦｕａｎｄＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２，３１：１０９４１は、ハンマーヘッドリボザイム中のアデノシン残基を７−デアザアデノシンで置換すると、切断効率の減少を引き起こしうることを述べている。彼らは、”結果は、ハンマーヘッドリボザイム／基質複合体中の６位のアデノシン（Ａ）のＮ⁷−窒素が有効な切断活性に重要であることを示唆する”と述べている。彼らは、さらに、ハンマーヘッドリボザイムの４量体配列ＧＡＵＧ中に位置する５つの重要な官能基が存在することを示している。ＳｌｉｍａｎｄＧａｉｔ，１９９２，ＢＢＲＣ１８３，６０５は、ハンマーヘッドリボザイムのコア中の１２位におけるグアノシンをイノシンで置換すると、リボザイムが不活性化することを述べている。Ｔｕｓｃｈｌｅｔａｌ．，１９９３Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２，１１６５８は、ハンマーヘッドの触媒コア中の５、８及び１２位のグアノシン残基をイノシン、２−アミノプリン、キサントシン、イソグアノシンまたはデオキシグアノシンで置換すると、ハンマーヘッドリボザイムの触媒効率が有意に減少すると述べている。Ｆｕｅｔａｌ．，１９９３Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２，１０６２９は、ハンマーヘッドリボザイムのコア中のグアニンＮ⁷、グアニンＮ²またはアデニンＮ⁶−窒素を削除すると、ハンマーヘッドリボザイムの触媒効率が有意に減少すると述べている。Ｇｒａｓｂｙｅｔａｌ．，１９９３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１，４４４４は、ハンマーヘッドリボザイムのコア中の５、８および１２位のグアノシンをＯ⁶−メチルグアノシンで置換するとｋ_catが約７５倍減少すると述べている。Ｓｅｅｌａｅｔａｌ．，１９９３ＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ７６，１８０９は、ハンマーヘッドリボザイムのコア中の１３、１４および１５位におけるアデニンの７−デアザアデノシンでの置換は、ハンマーヘッドリボザイムの触媒効率を有意に減少させないと述べている。Ａｄａｍｓｅｔａｌ．，１９９４ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ３５，７６５は、ハンマーヘッドリボザイム−基質複合体中の１７位のウラシルを４−チオウリジンで置換すると、リボザイムの触媒効率が５０％減少すると述べている。Ｎｇｅｔａｌ．，１９９４Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３，１２１１９は、ハンマーヘッドリボザイムの触媒コア中の６、９および１３位のアデニンをイソグアノシンで置換すると、リボザイムの触媒活性が有意に減少すると述べている。Ｊｅｎｎｉｎｇｓｅｔａｌ．，米国特許５，２９８，６１２は、”ミニザイム（ｍｉｎｉｚｙｍｅ）”中のヌクレオチドを修飾しうることを記載する。彼らは次のように述べている： ”ヌクレオチドは塩基、糖および一リン酸基を含む。したがって、ヌクレオチド誘導体または修飾は、塩基、糖または一リン酸基のレベルで行うことができる塩基は、種々の基、例えばハロゲン、ヒドロキシ、アミン、アルキル、アジド、ニトロ、フェニル等で置換することができる。” ＷＯ９３／２３５６９、ＷＯ９５／０６７３１、ＷＯ９５／０４８１８およびＷＯ９５／１３３１７８は、リボザイム構造中に導入しうる種々の修飾を記載する。本発明は、ハンマーヘッド、ヘアピン、ＶＳリボザイムまたはデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイム等のリボザイムの基質結合部位において１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むことにより、その標的核酸基質に対して増強されたまたは減少した結合親和性および増強された酵素的活性を有する酵素的ＲＮＡ分子またはリボザイムの製造に関する。本出願人は、リボザイムと基質との間の塩基対形成または水素結合のわずかに小さい程度の変化が、リボザイムのその基質に対する酵素的活性に著しく影響しうることを認識した。すなわち、本出願人は、リボザイムの基質結合アームに沿った水素結合の微妙な程度の変更を用いて、そのような変更ヌクレオチドを含まない未変更リボザイムと比較してリボザイム活性を改良しうることを認識した。すなわち、例えば、グアノシン塩基をイノシンで置き換えてリボザイムとその基質とのより弱い相互作用を生成すること、またはウラシルをブロモウラシル（ＢｒＵ）で置き換えてアデノシンとの水素結合相互作用を増強させることができる。４つの標準的リボヌクレオチド塩基の変更の他の例は図２２ａ−ｄに示され、それぞれの図ではより弱いまたはより強い水素結合能が示される。さらに、本出願人は、いくつかの触媒コアヌクレオチド中の塩基修飾が、未修飾分子と比較して酵素的活性を維持または増強することを見いだした。このようなヌクレオチドは図２３に示される。特に、図２３を参照すると、ハンマーヘッドリボザイムの触媒コアの５’から３’方向の好ましい配列は、ＣＵＧＡＮＧＡＧ・ＣＧＡＡＡ（式中、Ｎは任意の塩基であることができ、または塩基を欠失していてもよい（脱塩基）；Ｇ・Ｃは塩基対である。塩基対形成したステムＩＩ（図１、２および２３）およびステムＩおよびＩＩＩの認識アームの性質は可変である。本発明においては、これらの領域におけるハンマーヘッドリボザイムの触媒活性および／またはヌクレアーゼ耐性を維持または増強する塩基修飾ヌクレオチドの使用が記載される。（修飾することができる塩基には、大文字で示されるものが含まれる）。本発明において有用な塩基置換の例は、図２２、２４−３０、３９−４３、４５−４６に示される。好ましい態様においては、シチジン残基が５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン、図２４、Ｒ＝ＣＨ₃，９）で置換されており、ウリジン残基が５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン（図２４、Ｒ＝ＣＨ₃，４）または５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン、図２４、Ｘ＝Ｂｒ，１３）または６−アザピリミジン（図２４，１７）または６−アルキルウリジン（図３０））で置換されている。グアノシンまたはアデノシン残基は、コアまたはステムのいずれかにおいて、ジアミノプリン残基で置き換えられていてもよい（図２４，２２）。官能基がマグネシウムの錯体形成またはリボザイムの他の機能に重要ではない塩基においては、これらはプリンリボヌクレオシド（図２４，２３）で置き換えられてもよく、これはプリン核の化学的取り込みの間に塩基保護基が必要でないため、リボザイムの化学合成の複雑性を著しく減少させる。さらに、上述したように、塩基修飾ヌクレオチドを用いて同様の修飾を有する認識アームの結合の特異性または強度を増強することができる。塩基修飾ヌクレオチドは一般に、これらが取り込まれる触媒的核酸のヌクレアーゼ耐性を増強するためにも用いることができる。ハンマーヘッドリボザイムモチーフ中のこのような修飾は非限定的例を意味する。当業者は、同様の修飾を有する他のリボザイムモチーフを容易に合成することができ、これらが本発明の範囲内であることを認識するであろう。上述に引用した技術文献に記載される糖部分の置換は、触媒活性および／またはヌクレアーゼ安定性を増強するために行うこともできる。本発明は、インビトロおよびインビボで、標準的速度論アッセイで測定しうるような増加した酵素的活性を有するリボザイムを提供する。すなわち、リボザイムの速度論的性質は、基質結合アーム中において適当な修飾塩基を選択することにより増強される。本出願人は、リボザイムによる基質に対する強い結合は特異性を増強させるが、これはまた切断された基質からのリボザイムの分離を妨害することを認識している。すなわち、本出願人は、塩基対形成の最適化を達成することができる手段を提供する。具体的には、本発明は、修飾された塩基を有し、少なくとも１．５倍（好ましくは、２または３倍）または対応する未修飾リボザイムより高い酵素的活性を有するリボザイムを特徴とする。本発明はまた、修飾された塩基をリボザイム中に取り込ませ、これらをより高い酵素的活性についてスクリーニングすることにより、リボザイムの速度論的活性を最適化する方法を特徴とする。このような選択は、インビトロまたはインビボで行うことができる。増強された活性とは、インビボで測定された活性を含むことを意味し、ここで活性は、触媒活性およびリボザイムの安定性の両方を反映する。本発明においては、これらの性質のインビボでの積は、全ＲＮＡリボザイムと比較して増加しているかまたは有意に減少していない（１０倍より低い）。 ”酵素的部分”とは、ＲＮＡ基質の切断に必須のリボザイムの部分を意味する。 ”基質結合アーム”とは、その基質のある部分と相補的である（すなわち、それと塩基対形成しうる）リボザイムの部分を意味する。一般に、そのような相補性は１００％であるが、所望の場合にはより低くてもよい。例えば、１４塩基中１０塩基程度の低さでも塩基対形成しうる。このようなアームは、一般に図１− ３に示され、以下に議論される。すなわち、これらのアームは、相補的塩基対形成相互作用を介してリボザイムと標的ＲＮＡとを一緒にすることが意図されるリボザイム中の配列である；例えば、標準的ハンマーヘッドリボザイムのステム１およびＩＩＩ中のリボザイム配列は基質結合ドメインを形成する（図１を参照されたい）。 ”未修飾ヌクレオチド塩基”とは、β−Ｄ−リボフラノースの１’炭素に連結した塩基（アデニン、シトシン、グアノシン、ウラシル）の一つを意味する。糖はまた、５’炭素にリン酸結合を有する。これらのヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの３’炭素と次のヌクレオチドの５’炭素との間のホスホジエステルにより結合してＲＮＡを形成する。 ”修飾されたヌクレオチド塩基”とは、未修飾ヌクレオチド塩基の化学的構造中に、水素結合の強度を増加させることにより、またはそれを減少させることにより、その塩基が正常な相補塩基と水素結合する能力に影響を及ぼす修飾を含む任意のヌクレオチド塩基（例えば、上でイノシンおよびブロモウラシルについて例示したように）を意味する。修飾された塩基の他の例としては、図２２ａ−ｄに示されるもの、および複素環誘導体および同様のもの等の当該技術分野においてよく知られている他の修飾が含まれる。好ましい態様においては、修飾されたリボザイムは、ハンマーヘッド、ヘアピン、ＶＳリボザイムまたはデルタ肝炎ウイルスに由来するリボザイムであり、ハンマーヘッドリボザイムは３２−４０ヌクレオチド塩基を含む。修飾された塩基の選択は、最も好ましくは、選択されたリボザイムの酵素的活性（切断の速度論を測定するよう設計された標準的速度論的アッセイにおいて観察される）を増強するように、すなわち、同一のヌクレオチド塩基配列を有し、修飾塩基を有していないリボザイムと比較して、リボザイムによる基質の切断の速度または程度を増強させるように選択される。 ”速度論的アッセイ”または”切断の速度論”とは、標的ＲＮＡの切断の速度を決定する実験を意味する。しばしば、切断速度に及ぼすそのパラメーターの影響を決定するため、１つのアッセイから次のアッセイにリボザイムまたは基質のいずれかの濃度を変化させた一連のアッセイが実施される。 ”切断の速度”とは、切断された標的ＲＮＡの量を時間の関数として測定したものを意味する。ハンマーヘッドコンフィギュレーションおよび修飾された塩基を有し、酵素的活性を維持または増強する酵素的核酸が提供される。このような核酸はまた、一般に未修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性である。この観点における”修飾された塩基”とは、図２２Ａ−Ｄおよび２４、３０、および４２Ｂに示されるもの、またはその同等物を意味し、このような塩基は酵素の触媒コア中で、ならびに基質結合領域中で用いることができる。特に、本発明は、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、ナフチル、６−メチル− ウラシルおよびアミノフェニルより選択される塩基置換を有する修飾リボザイムを特徴とする。上述したように、コア中における置換はインビトロ活性を減少させるかもしれないが安定性を増大させる。すなわち、インビボでは、活性は有意に低下しない。本明細書に例示されるように、このようなリボザイムは、総合的な活性が１０倍低下したとしてもインビボで有用である。本明細書ではこのようなリボザイムは全ＲＮＡリボザイムの酵素的活性を”維持する”と称される。小スケール合成は、３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で、アルキルシリル保護ヌクレオチドについては５分間のカップリング段階で、および２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング段階で、改変した２．５μｍｏｌスケールプロトコルを用いて実施した。表ＣＩＩは、合成サイクルにおいて用いられる試薬の量および接触時間の概要を示す。ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６．５倍過剰（０．１Ｍを１６３μＬ＝１６．３μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍを２３８μＬ＝５９．５μｍｏｌ）をそれぞれのカップリングサイクルにおいて用いた。トリチル画分の比色定量により判定した３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機での平均カップリング収率は９７．５−９９％であった。３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｌｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬は：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中２％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であった；キャピングはＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール(ＡＢＩ)およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）を用いて行った；酸化溶液は１６．９ｍＭＩ₂ 、４９ｍＭピリジン、ＴＨＦ中９％水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。Ｂ＆Ｊ合成等級アセトニトリルは試薬ボトルから直接用いた。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から得た固体から調製した。ＲＮＡの脱保護は次のように実施した。ポリマー結合オリゴリボヌクレオチド（トリチルオフ）を合成カラムから４ｍＬガラスねじ蓋バイアルに移し、メチルアミン（ＭＡ）の溶液に６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した後、上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、次に上清を最初の上清に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して白色粉末とした。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ−ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬＮ＝メチルピロリジノンの溶液２５０μＬ、７５０μＬＴＥＡおよび１．０ｍＬＴＥＡ−３ＨＦによりＨＦ濃度１．４Ｍを与える）に再懸濁し、６５ ℃で１．５時間加熱した。得られた完全脱保護オリゴマーを５０ｍＭＴＥＡＢ（９ｍＬ）で急冷し、次にアニオン交換脱塩を行った。脱保護オリゴマーのアニオン交換脱塩のためには、ＴＥＡＢ溶液を、５ＯｍＭＴＥＡＢ（１ＯｍＬ）で予め洗浄したＱ１ａｇｅｎ５ＯＯ（登録商標）アニオン交換カートリッジ（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．）に負荷した。負荷したカートリッジを５ＯｍＭＴＥＡＢ（１ＯｍＬ）で洗浄した後、ＲＮＡを２ＭＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で溶出し、乾燥して白色粉末とした。不活性ハンマーヘッドリボザイムは、Ｇ₅をＵで、Ａ₁₄をＵで置き換えることにより合成した（番号づけは、Ｈeｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，３２５２にしたがう）。平均の段階的カップリング収率は＞９８％であった（Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。ヘアピンリボザイムは１つの部分として合成するか、または２つの部分として合成し、アニーリングさせて活性リボザイムを再構築する（ＣｈｏｗｒｉｒａａｎｄＢｕｒｋｅ，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムは、一般的方法を用いてゲル電気泳動で精製するかまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９５／２３２２５を参照されたい）により精製し、水に再懸濁する。リボザイム構造に対する種々の修飾を実施して、リボザイムの有用性を増強することができる。このような修飾は、保存期間、インビトロでの半減期、安定性、およびそのようなリボザイムの標的部位への導入の容易性を増強する。例えば、細胞膜への侵入を増強し、標的とする細胞を認識して結合する能力を与える。そのようなリボザイムの例は、Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，ＷＯ９５／１３３７８および以下に提供される。２’デオキシ−２’−ヌクレオチドＥｃｋｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔｅｔａｌ．，１９９０Ｎａｔｕｒｅ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎｅｔａｌ.,１９９１Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３,３１４;ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２，ならびにＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，上掲，Ｓｐｒｏａｔ，欧州特許出願９２１１０２９８．４および米国特許５，３３４，７１１；Ｊｅｎｎｉｎｇｓｅｔａｌ．，ＷＯ９４／１３６８８およびＢｅｉｇｅｌｍａｎｅｔａｌ，上掲は、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に行いうる種々の化学的修飾を記載する。Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．はまた、リボザイム中で必要な種々のリボヌクレオチド、およびこのようなヌクレオチドを特定する方法を記載する。ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒｅｔａｌ．Ｓｙｎ．Ｌｅｔｔ．１９９３，６７７−６８０（本発明に対する従来技術であると認めるものではない）は、ある種の２’−Ｃ−アルキルウリジンおよびチミジン誘導体の合成を記載する。彼らは、”アンチセンス方法論におけるこれらの使用は、非常に限られているようである。”と結論づけている。本発明は、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡの酵素的切断に、およびアンチャンスオリゴヌクレオチドとして特に有用な、オリゴヌクレオチドにおける２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドの使用に関する。本明細書において用いる場合、２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド含有酵素的核酸とは、二本鎖ステム、一本鎖”触媒コア”配列、一本鎖ループまたは一本鎖認識配列（これらに限定されない）を置き換える２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド成分を含む触媒的核酸分子を意味する。これらの分子は、ヌクレオチド塩基配列特異的様式で別のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断（好ましくは、繰り返し切断）することができる。このような触媒的核酸はまた、所望の場合には分子内的に切断するように作用することができる。このような酵素的分子は、実質的に任意のＲＮＡ転写産物を標的とすることができる。また本発明の範囲内に含まれるものは、酵素的核酸に、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいても存在することができる２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドである。ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒらの発見とは逆に、本出願人は、このようなヌクレオチドはアンチャンスまたは酵素的分子の安定性を増強させるため有用であり、分子の所望の活性に影響を及ぼさない位置において用いることができることを見いだした。すなわち、２’−アルキル基の存在はこの修飾を含むオリゴヌクレオチドの結合親和性を減少させるかもしれないが、その部分が必須の塩基対形成領域中になければ、それが分子に与える増強された安定性は有利である。さらに、減少した結合は酵素的活性を減少させるかもしれないが、増強された安定性は活性の喪失の重要性をより低くするであろう。すなわち、例えば、２’−デオキシ−２’−アルキル含有分子が未修飾分子の１０％の活性を有しているが、インビボで１０倍高い安定性を有していれば、これは本発明において有用性を有する。同一の分析がそのような修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドについてもあてはまる。本発明はまた、そのようなヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの合成において有用な新規中間体（この例は、図４８− ５４に示される）、およびその合成の方法に関する。すなわち、本発明は、２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド、すなわち糖分子の２’位にアルキル部分を有するヌクレオチド塩基を特徴とし、好ましい態様においては、ヌクレオチドがウリジンまたはチミジンではないものを特徴とする。すなわち、本発明は好ましくは、酵素的核酸またはアンチャンス分子を製造するのに有用であり、上述の技術文献に記載されていないすべてのヌクレオチドを特徴とする。本発明において有用な種々のアルキル基の例は図４８に示されており、ここでそれぞれのＲ基は任意のアルキルである。これらの例は、本発明において限定的なものではない。特に、”アルキル”基は、飽和脂肪族炭化水素を表し、直鎖、分枝鎖および環状アルキル基を含む。好ましくは、アルキル基は１から１２個の炭素を含む。より好ましくは、これは１から７個の炭素、より好ましくは１から４個の炭素の低級アルキルである。アルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。置換されている場合には、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂またはＮ（ＣＨ₃）₂、アミノ、またはＳＨである。この用語はまた、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、直鎖、分枝鎖および環状の不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含む。好ましくは、アルケニル基は１から１２個の炭素を含む。より好ましくは、これは１から７個の炭素、より好ましくは、１から４個の炭素の低級アルケニルである。アルケニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。置換されている場合には、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂、アミノ、またはＳＨである。用語”アルキル”はまた、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、直鎖、分枝鎖および環状の不飽和炭化水素基であるアルキニル基を含む。好ましくは、アルキニル基は１から１２個の炭素を含む。より好ましくは、これは１から７個の炭素、より好ましくは、１から４個の炭素の低級アルキニルである。アルキニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。置換されている場合には、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂またはＮ（ＣＨ₃）₂、アミノまたはＳＨである。用語”アルキル”は”−Ｏ−アルキル”基を有するアルコキシ基を含まない（ここで”アルキル”は上で定義したとおりであり、Ｏは糖分子の２’位に隣接している）。このようなアルキル基はまた、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環アリール、アミドおよびエステル基を含んでいてもよい。”アリール ”基は、コンジュゲートされたパイ電子系を含む少なくとも１つの環原子を有する芳香族基を表し、これには炭素環式アリール、複素環アリールおよびビアリール基が含まれ、これらは全て任意に置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換某は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアミノ基である。”アルキルアリール”基は、アリール基（上述の）に共有結合したアルキル基（上述の）を表す。炭素環式アリール基は、芳香族環上の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は任意に置換されていてもよい。複素環アリール基は、１から３個の複素原子を芳香族環中の環原子として有し、残りの環原子が炭素原子である基である。適当な複素原子には、酸素、イオウおよび窒素が含まれ、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ビラジニル、イミダゾリル、および同様のものが挙げられ、すべて任意に置換されていてもよい。”アミド”は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。”エステル” は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。、上述した観点にも関連する他の観点においては、本発明は１つまたはそれ以上の２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド（好ましくは、２’−アルキル −ウリジンまたはチミジンではない）を有するオリゴヌクレオチド；例えば２’ −デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドを有する酵素的核酸；およびその２’ 位にアルキル基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む酵素的分子を形成することにより、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子を切断する増強された活性を有する酵素的核酸分子を製造する方法を特徴とする。他の関連する観点においては、本発明は、２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド三リン酸を特徴とする。これらの三リン酸を標準的プロトコルにおいて用いて、本発明の有用なオリゴヌクレオチドを形成することができる。本発明の２’−アルキル誘導体は、これらを含有するオリゴヌクレオチドに増強された安定性を与える。これらはまたインビトロアッセイにおいて絶対的活性を減少させるかもしれないが、インビボでは増強された総合的活性を与えるであろう。以下に、このような分子が有用であることを判定するアッセイを記載する。当業者は、同等のアッセイを容易に案出しうることを認識するであろう。別の観点においては、本発明は、図４７に示す位置、５、６、８、１２、および１５．１においてリボヌクレオチドを含み、コア中の、および所望ならば基質結合アームの他の位置において置換リボヌクレオチドを含み、酵素的活性を有するハンマーヘッドモチーフを特徴とする。（”コア”との用語は、図４７における塩基３と１４との間の位置を表し、結合アームは、３’末端から塩基１５．１、および５’末端から塩基２の塩基に対応する）。本出願人は、コア中のこれらの５つの位置におけるリボヌクレオチドの使用が、モチーフ中の他の部位に修飾ヌクレオチドが存在する場合においても、十分な酵素的活性を有する分子を与えることを見いだした。他のこのような有用なリボヌクレオチドの組み合わせは、Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．（上掲）において議論されるようにして決定することができる。２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび２’−Ｃ−アルキルチオアルキル含有核酸Ｍｅｄｉｎａｅｔａｌ．，１９８８ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２９，３７７３は、アルコールをメチルチオメチルエーテルに転換する方法を記載する。Ｍａｔｔｅｕｃｃｉｅｔａｌ．，１９９０ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，３１，２３８５は、メチルチオメチル前駆体を介する３’−５ ’−メチレン結合の合成を報告している。Ｖｅｅｎｅｍａｎｅｔａｌ．，１９９０Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ１０９，４４９は、３’−５’−メチレン結合含有ダイマーの合成の間の３’−Ｏ−メチルチオメチルデオキシヌクレオシドの合成を報告している。Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，１９９３Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，２９８３は、３’−Ｏ−メチルチオメチルデオキシヌクレオシドを用いる３’−チオホルムアセタールヌクレオシド間結合含有ダイマーの合成を報告している。この文献はまた、ＤＮＡ合成用のホスホルアミダイトを合成する方法を記載する。Ｚａｖｇｏｒｏｄｎｙｅｔａｌ.,１９９１ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ３２，７５９３は、メチルチオメチル修飾を含むヌクレオシドを合成する方法を記載する。本発明は、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡの酵素的切断に、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとして特に有用な、２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドの核酸中への取り込みに関する。本明細書で用いられる用語として、２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド含有酵素的核酸は、１つまたはそれ以上の塩基または領域（二本鎖ステム、一本鎖 ”触媒コア”配列、一本鎖ループまたは一本鎖認識配列の塩基を含むが、これらに限定されない）を置き換える２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド成分を含む触媒的核酸分子であり、これらの分子は別のＲＮＡまたはＤＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で切断（好ましくは、繰り返し切断）することができる。このような触媒的核酸はまた、所望の場合には、分子内的に切断するように作用することができる。このような酵素的分子は実質的に任意のＲＮＡ転写産物を標的とすることができる。また本発明の範囲内に含まれるものは、酵素的核酸中にまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは２−５Ａアンチセンスキメラ中に存在することができる２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドである。このようなヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドは、アンチセンスまたは酵素的分子の活性を増強させるため、有用である。本発明はまた、このようなヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの合成に有用な新規中間体（この例は図に示される）、およびその合成の方法に関する。すなわち、本発明は、糖分子の２’位に２’−Ｏ−アルキルチオアルキル部分を有するヌクレオシドもしくは非ヌクレオシドである、２’−Ｏ−アルキルチオアルキルヌクレオシドもしくは非ヌクレオシドを特徴とする。関連する態様においては、本発明はまた２’−Ｏ−アルキルチオアルキルヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドを特徴とする。すなわち、本発明は、好ましくは、上述の技術文献には記載されていない、酵素的核酸またはアンチセンス分子を作成するのに有用な、上述した２’置換を有するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドを含む。非ヌクレオチドとの用語は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドユニットのかわりに核酸鎖中に取り込ませることができ、糖および／またはホスフェート置換のいずれかを含み、残りの塩基がその酵素的活性を示すことができるような、任意の基または化合物を表す。基または化合物は、一般に認識されるヌクレオチド塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンを含まない脱塩基である。これは、当該技術分野で記載されているように、２’または３’ ＨまたはＯＨのかわりの置換を有していてもよい。Ｅｃｋｓｔｅｉｎｅｔａｌ．およびＵｓｍａｎｅｔａｌ．，（上掲）を参照されたい。ヌクレオチドとの用語は、通常のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、ＴおよびＣ）および修飾されたヌクレオチド、例えば６−メチルＵ、イノシン、５−メチルＣおよび他の物を表す。特に、用語”ヌクレオチド”は、当該技術分野において認識されるように、天然塩基および当該技術分野においてよく知られた修飾された塩基を含む。このような塩基は、一般に、糖部分の１’位に存在する。本明細書中において使用する用語”非ヌクレオチド”は、塩基を欠失した、または塩基のかわりに１’位に他の化学基を有する糖部分を意図する。そのような分子は一般に次の一般式を有する：［式中、Ｒ１は、２’−Ｏ−アルキルチオアルキルまたは２’−Ｃ−アルキルチオアルキルを表し；Ｘは、塩基またはＨを表し；Ｙはリン含有基を表し；そしてＲ２はＨ、ＤＭＴまたはリン含有基を表す（図５５）。リン含有基は、一般に、ホスフェート、チオホスフェート、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイトまたは当該技術分野において知られた他の修飾基である。別の観点においては、本発明は、糖分子の２’位に２’−Ｃ−アルキルチオアルキル部分を有するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド残基である、２’−Ｃ −アルキルチオアルキルヌクレオシドもしくは非ヌクレオシドを特徴とする。関連する観点においては、本発明はまた、２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを特徴とする。すなわち、本発明は、好ましくは、上述の技術文献により記載されていない、上述の酵素的核酸またはアンチセンス分子を作成するのに有用な、すべての２’修飾ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドを含む。特に、”アルキル”基は、この用語が２’−Ｏ−アルキル部分を含むことを除き、上で定義したとおりである。上述した観点と関連する別の観点においては、本発明は、１つまたはそれ以上の２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；例えば２’−Ｏ−メチルチオメチルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドを有する酵素的核酸；およびその２’位に２ ’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキル基を有する少なくとも１つのヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分を含む酵素的分子を形成することにより、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子を切断する増強された活性を有する酵素的核酸分子を製造する方法を特徴とする。別の関連する観点においては、本発明は、２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキルヌクレオチド三リン酸を特徴とする。これらの三リン酸を標準的プロトコルにおいて用いて、本発明の有用なオリゴヌクレオチドを製造することができる。本発明の２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキル誘導体は、これらを含むオリゴヌクレオチドに増強された活性および安定性を与える。さらに別の好ましい態様においては、本発明は、１つまたはそれ以上の２’− Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキル脱塩基（非ヌクレオチド）部分を有するオリゴヌクレオチドを特徴とする。例えば、２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキル脱塩基部分を有する酵素的核酸；および、その２’位に２’−Ｏ−アルキルチオアルキルまたは２’−Ｃ−アルキルチオアルキル基を有する少なくとも１つの位置を有する酵素的分子を形成することにより、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子を切断する増強された活性を有する酵素的核酸分子を製造する方法を特徴とする。関連する態様においては、本発明は、リボザイムの触媒活性を有意に減少させない限り、１つまたはそれ以上の２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキル置換を、酵素的部分、基質結合部分またはその両方に含む酵素的核酸を特徴とする。さらに別の好ましい態様においては、本発明は、核峠合成中のリボフラノースの２’−ヒドロキシル位置のための保護基としての２’−Ｏ−アルキルチオアルキル部分の使用を特徴とする。本発明はすべてのオリゴヌクレオチドに応用可能であるが、本発明の修飾分子は酵素的ＲＮＡ分子に特に有用であることが発見された。従って、以下にそのような分子の例が提供される。当業者は、均等な方法がそのような酵素活性のない他の分子の作成に使用できることを認識するであろう。特に、図１はハンマーヘッドモチーフの塩基の番号付けが示されており、ハンマーヘッドリボザイム中の種々の塩基の番号付けがなされている。図１を参照すると、触媒コア中の５’から３’方向でのハンマーヘッドリボザイムの好適な配列はＣＵＧＡＮＧＡＧ［塩基対］ＣＧＡＡＡである。本発明においては、ハンマーヘッドリボザイムの触媒活性および／またはヌクレアーゼ耐性を維持または促進する２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ −アルキルチオアルキル置換ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドの使用が記載されている。前に議論した任意の修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドによるヌクレオチドの置換は可能である。Ｕｓｍａｎら（上記文献）およびＳｐｏｒａｔら（上記文献）並びにその他の文献は有名なリボザイムモチーフ中に置換できるこれらの塩基を示している。当業者は、本明細書に記載したように酵素活性および安定性を有益に保持したままこれらの塩基を置換することを決定できる。非ヌクレオチドＵｓｍａｎら、ＷＯ９３／１５１８７はリボザイム中の修飾構造の議論において以下のように述べている： ”ポリマー鎖の構築ユニット間の結合はインビトロまたはインビボの両方でユニットをお互いに架橋できる結合であろうことを理解しなければならない。例えば、結合はリン含有結合（例えば、ホスジエステルまたはホスホチオエート）でもよいし、または窒素含有結合（例えば、アミド）でもよい。さらに、キメラポリマーは他のヌクレオチドまたは類似のユニットと共に非ヌクレオチドスペーサー分子を含んでいるであろうことも理解しなければならない。使用されるであろうスペーサー分子の例はＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）に記載されている。” Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、ＷＯ９４／１３６８８は通常のステムII塩基対形成領域を欠くハンマーヘッドリボザイムの議論において以下のように述べている： ”基（Ｘ）ｍ［ステムΠ］の一つまたはそれ以上のリボヌクレオチドおよび／またはデオキシヌクレオチドは例えば、随意に置換されたポリホスホジエステル（ポリ（１−ホスホ−３−プロパノール）のような）、随意に置換されたアルキル、随意に置換されたポリアミド、随意に置換されたグリコールから選択されるリンカーで置き換えられているであろう。随意の置換は本分野ではよく知られており、アルコキシ（メトキシ、エトキシおよびプロポキシのような）、直鎖または分岐鎖低級アルキル（Ｃ₁−Ｃ₅アルキルのような）、アミン、アミノアルキル（アミノＣ₁−Ｃ₅アルキルのような）、ハロゲン（Ｆ、ＣｌおよびＢｒのような）などを含んでいる。生じるエンドヌクレアーゼが基質を切断できる限り、随意の置換基の性質は重要ではない。さらに、適したリンカーにはフェニルまたはシクロヘキシル環を含むような多環式分子が含まれる。リンカー（Ｌ）はポリホスホプロパンジオール、ポリエチレングリコールのようなポリエーテル、二機能性ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、アシムインダセン、シムインダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランセン、アセフェナトリレン、アセアントリセン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン、チアントレン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサンチン、インドリジン、３−Ｈ−インドール、インドール、１−Ｈ−インダゾール、４−Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、４−αＨ−カルバゾール、カルバゾール、Ｂ−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ペリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジンのような二機能性多環式分子（多環式分子は置換または修飾されていてもよい）、またはポリエーテルおよび多環式分子の組み合わせであろう。多環式分子はＣ₁−Ｃ₅アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル基のハロゲンまたはＯ−ＡまたはＣＨ₂−Ｏ−Ａ、式中ＡはＨまたは式ＣＯＮＲ’Ｒ”（式中Ｒ’およびＲ”は同じでも異なっていてもよく、水素または置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリール、シクロアルキルまたはヘテロ環式基である）であるか；またはＡは式−Ｍ−ＮＲ’Ｒ”（式中Ｒ’およびＲ”は同じでも異なっていてもよく、水素、またはＣ₁−Ｃ₅アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキルまたはハロアルキル基、ここでハロ原子はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子であり；−Ｍ−は１から１０の炭素原子を持つ有機残基であり、分岐鎖または直鎖アルキル、アリールまたはシクロアルキル基である）である。一つの態様において、リンカーはテトラホスホプロパンジオールまたはペンタホスホプロパンジオールである。多環式分子の場合、１８またはそれ以上の原子が核酸を架橋していることが好適である。より好適には、３０から５０原子の架橋である（実施例５参照）。別の態様において、リンカーは二機能性カルバゾールまたは一つまたはそれ以上のポリホスホロプロパンジオールに結合された二機能性カルバゾールである。そのような化合物もまたヌクレオチド上の反応性基を通しての結合を可能にする適した官能基を含んでいるであろう。” 本発明は二本鎖核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）ステム（デュープレックスステム）の、またはより好適には、一本鎖領域、触媒コア、ループまたは酵素的核酸の認識アーム中の核酸でのスペーサー要素としての非ヌクレオチド分子の使用に関している。デュープレックスステムは酵素的ＲＮＡ分子に遍在する構造要素である。通常一本鎖ヌクレオチド鎖を通して結合されているそのようなステムの合成を容易にするため、塩基または塩基対模倣物が使用され、そのような分子の合成におけるヌクレオチド要求性を減少させ、ヌクレアーゼ耐性を与える（それらは非核酸成分であるため）。これはリボザイムの触媒コアおよび認識アームに両方にも応用される。特別の不能性ヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド塩基を欠くが、糖およびリン酸部分を持つ残基）は、例えば、図１に示したようなハンマーヘッド構造のＵ４またはＮ７でリボザイムのコア内安定性を提供するのに使用できる。従って、本発明は一つまたはそれ以上の非ヌクレオチド残基を持ち、ＲＮＡまたはＤＮＡを切断する酵素活性を持つ酵素的核酸分子を特色とする。そのような非ヌクレオチド模倣物は図５８に示されており、ハンマーヘッドリボザイム内へのそれらの取り込みは図６０に示されている。これらの非ヌクレオチドリンカーはポリエーテル、ポリアミンまたはポリ炭化水素であろう。特別の例にはＳｅｅｌａおよびＫａｉｓｅｒ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７，１５：３１１３；ＣｌｏａｄおよびＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９３，２１：２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，６３５３；ＭｕＣｕｒｄｙら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｔｉｄｅｓ１９９１，１０：２８７；Ｊａｓｃｈｋｅら，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９９３，３４：３０１：Ｏｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ１９９１，３０：９９４１；Ａｍｏｌｄら，”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド連結剤”と題した国際特許出願第ＷＯ８９／０２４３９号；およびＦｅｒｅｎｔｚおよびＶｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００に記載されているものが含まれ、これらはすべて本明細書において援用される。好適な態様において、酵素的核酸は非ヌクレオチド残基に連結され、分子の酵素活性を供給する一つまたはそれ以上のＲＮＡの延伸物を含んでいる。好適な態様において、酵素的核酸は非ヌクレオチド残基に連結され、分子の酵素活性を供給する一つまたはそれ以上のＲＮＡの延伸物を含んでいる。必要なリボヌクレオチド成分は本分野では既知である、例えば、Ｕｓｍａｎ（上記文献）およびＵｓｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｙｍ．Ｇｅｎｅｓ３１：１６３，１９９４を参照されたい。本明細書において使用される限りにおいて用語、非ヌクレオチド含有酵素的核酸とはリボザイムの一部（例えば、二本鎖ステム、一本鎖”触媒コア”配列、一本鎖ループまたは一本鎖認識配列、しかしこれらに制限されるわけではない）に取って代わる少なくとも一つの非ヌクレオチド成分を含む核酸分子を意味している。これらの分子はヌクレオチド塩基配列中の別々のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を特定の様式で切断（好適には、繰り返し切断）できる。そのような分子はまた、もし望むなら分子内で切断するようにも作用することができる。そのような酵素的分子は実質的に任意のＲＮＡ転写体を標的にできる。そのような分子はまた、エキソヌクレアーゼ切断を防止するためのキャッピング基として有用な、３’または５’非ヌクレオチドを持つ核酸分子を含むこともできる。本発明で有用な非ヌクレオチド模倣物は一般的に上記部分およびＵｓｍａｎらのＷＯ９５／０６７３１に記載されている。当業者はこれらの模倣物を酵素的分子の所望の位置に常法により取り込ませることができることを認識するであろう。最適な位置を決定するための標準的実験により、適した選択を行うことができる（例えば、分子の合成およびその酵素活性の試験により）。最適の分子は酵素活性に必要とされる既知のリボヌクレオチドを含んでいるであろうし、可能な最小の様式で分子構造を変化させる非ヌクレオチドを持っているであろう。酵素的分子合成における合成工程を少なくするため、およびＲＮＡまたはＤＮＡさえとも比較して分子の促進された安定性を提供するために、いくつかのヌクレオチドを一つの非ヌクレオチドに置換することが望まれている。合成本発明は、高い生物学的活性を持つミリグラムからキログラムの量の酵素的ＲＮＡまたは修飾酵素的ＲＮＡの合成、脱保護および精製に関している。そのような合成は一般的にＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂらによるＷＯ９５／２３２２５に詳述されている。本発明は、高い生物学的活性を持つミリグラムからキログラムの量の酵素的ＲＮＡまたは修飾酵素的ＲＮＡの合成、脱保護および精製に関している。一般的に、ＲＮＡは：ＲＮＡアミダイトを活性化するためのテトラゾール、環外アミノ保護基を除去するためのＮＨ₄ＯＨ、２’−ＯＨアルキルシリル保護基を除去するためのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、およびゲル精製および脱保護ＲＮＡの分析に基づいた方法論により合成および精製される。特にこの方法論はある種のＲＮＡ分子の部類、リボザイムに応用されるが、それに制限されるわけではない。化学合成、脱保護、精製および分析法はＵｓｍａｎら、１９８７Ｊ．ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５、Ｓｃａｒｉｎｇｅら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，５４３３−５３４１、Ｐｅｒｒｅａｌｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ１９９１，１９，１１８３−１１８８により提供されている。Ｏｄａｉら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１９９０，２６７，１５０−１５２、はリボザイムの形成に使用されたＲＮＡ断片の逆相クロマトグラフィー精製を記載している。上に示したすべての参照文献はすべて本明細書において援用される。上記の化学合成、脱保護、精製および分析法は時間がかかり（１０−１５分の結合時間）、テトラゾールによるＲＮＡアミダイトの非効率的な活性化の影響も受け、およびＮＨ₄ＯＨによる環外アミノ保護基の除去は時間がかかり（６−２４時間）かつ不完全であり、アルキルシリル保護基のＴＢＡＦ触媒除去の脱塩は時間をくい（６−２４時間）、不完全でおよび困難であり、ゲル電気泳動によるＲＮＡの精製は時間がかかりかつ処理能力が悪く、およびゲル電気泳動によるＲＮＡの精製は低分解能の分析である。ＩｍａｚａｗａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９７９Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１２，２０３９、は２’−アミノ−２’−デオキシリボフラノシルプリンの合成を記載している。彼らは”２’−アミノ機能を保護するために、容易に除去することができるトリフルオルアセチル基を選択した”と述べている。化学結合Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、米国特許第５，２９８，６１２号、はステムII部分を欠くハンマーヘッドリボザイムの組立に非ヌクレオチドの使用を記載している。Ｄｒａｐｅｒら、ＷＯ９３／２３５６９（ＰＣＴ／ＵＳ／０４０２０）、は合成過程の助けとなる二つの部分に分けたリボザイムの合成を記載している（例えば、４０ページ参照）。Ｕｓｍａｎら、ＷＯ９５／０６７３１、はその構造内に非ヌクレオチドを持つ酵素的核酸分子を記載している。そのような非ヌクレオチドは酵素的核酸の形成を可能にするためにヌクレオチドの代わりに使用できる。本発明は酵素的核酸および、特に、ハンマーヘッドおよびヘアピンモチーフリボザイム合成の改良法に関している。本発明は、最終的なリボザイムの収率を著しく高くできるので、リボザイムの反復化学合成に有利である。例えば、３７ｍｅｒハンマーヘッドリボザイムを合成するよりも、二つの部分的リボザイム部分（例えば、２０ｍｅｒおよび１７ｍｅｒ）は著しく高収率で合成でき、二つをお互いに反応させて所望の酵素的核酸を形成させる。図６８を参照すると、ハンマーヘッドリボザイムのための方法を示されており、ここで、各々のｎまたはｎ’は独立して所望のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドであり、各々の黒丸は塩基または他の因子間の対形成を表しており、および実線は共有結合を表している。構造内の各々のｎまたはｎ’はリボヌクレオチド、２’−メトキシ−置換ヌクレオチドまたは最終生成物の所望の酵素活性には有意に影響しない他の型のヌクレオチド（Ｕａｍａｎら、上記文献参照）であろう。示された特定の態様において（それは本発明を制限するものではない）、五つのリボヌクレオチドがｒＧ５、ｒＡ６、ｒＧ８、ｒＧ１２およびｒＡ１５．１に提供される。Ｕ４およびＵ７は不能性（すなわち、ウリジン残基を欠く）であるかまたはリボヌクレオチド（２’−メトキシ置換ヌクレオチド）であるか、またはその他のそのようなヌクレオチドであろう。ａ９、ａ１３およびａ１４は好適には２’−メトキシであるかまたは他の置換基を持っているであろう。このハンマーヘッドリボザイムの合成は図６８の下の部分に示したように３’および５’ 部分を合成することにより実施される。５’および３’部分は各々、化学反応性基ＸおよびＹを持っている。そのような化学反応基の例は図６９に提供されているが、それらに制限されるわけではない。これらの基は化学反応を起こし、図６９に示した結合を提供する。従って、ＸおよびＹは種々の組み合わせで本発明で使用され、二つのリボザイム部分間の化学結合を形成する。従って、本発明は各々独立して化学反応基を各々の５’および３’部分に持つ核酸の３’および５’部分を提供することによる酵素的に活性な核酸（Ｄｒａｐｅｒ、上記文献、により定義されたような）の合成法を特色とする。これらの化学反応基により３’および５’部分間に共有結合が形成されるような条件下で反応が実施される。形成される結合はジスルフィド、モルホリニ、アミド、エーテル、チオエーテル、アミン、二重結合、スルホンアミド、カーボネート、ヒドロゾンまたはエステル結合で有り得るが、それらに制限されるわけではない。結合は、オリゴヌクレオチドの通常の合成時の５’リン酸基および３’ヒドロキシル基間に形成される天然の結合ではない。別の態様では、二つ以上の部分がリボザイムの適切な形成を可能にするＸおよびＹ基の対を用いてお互いに結合できる（図６９参照）。 ”化学反応基”とは別の基と反応できて所望の結合を形成する基を単純に意味している。これらの結合は生じる酵素的核酸の構造に有意に影響を及ぼさない条件下で形成される。当業者は適した保護基をリボザイム部分に提供できることを認識するであろう。好適な態様において、核酸はハンマーヘッドモチーフを持ち、３’および５’ 部分は各々化学反応基をステムII領域にすぐ隣接して持っている（図１参照）。ａ９およびｒＧ１２と名付けられた塩基間のステムII領域は図１に明らかである。このステム内のＣおよびＧはステムII領域の末端を規定している。従って、ステムII領域内の任意のｎまたはｎ’残基は化学反応基を持つように提供できる。この構造から明らかなように、化学反応基は実線部分に提供する必要はなく、任意のｎまたはｎ’に提供できる。この方法では、５’および３’部分の各々の長さはいくつかの塩基分変化できる（図７０）。別の好適な態様において、化学反応基は（ＣＨ₂）_nＳＨ；（ＣＨ₂）_nＮＨＲ；（ＣＨ₂）_nＸ；リボース；ＣＯＯＨ；（ＣＨ₂）_nＰＰｈ₃；（ＣＨ₂）_nＳＯ₂Ｃｌ；（ＣＨ₂）_nＣＯＲ；（ＣＨ₂）_nＲＮＨまたは（ＣＨ₂）_nＯＨであろうが、これらに制限されるわけではない、ここでＣＨ₂は、ＣＨ₂に限定されるわけではなくメチレン、エーテル、エチレングリコール、チオエーテル、二重結合、芳香族基およびその他の基（一般的には最大２０のそのような原子、最も好適には５−１０原子のみ、およびさらにより好適には３−５原子のみが連結基に提供される）からなる種々の原子を含む連結鎖を形成する別の基（末端化学反応基を妨害しない）で置き換えることができ；各々のｎは独立して０から１０までの整数であり、同じでも異なっていてもよく；各々のＲは独立してプロトンまたはアルキル、アルケニル（上記のような）およびヌクレアーゼ耐性、改良された細胞会合、改良された細胞取り込みまたは細胞内局在化を与えるペプチド、ステロイド、ホルモン、脂質、核酸配列およびその他のような機能性基または複合体である。Ｘはハロゲンであり、Ｐｈはフェニル環を表している。さらに別の好適な態様において、条件にはリボースと接触するＮａＩＯ₄の準備、および続いてのＮａＢＨ₄またはＮａＣＮＢＨ₃のような還元剤の準備が含まれ；または条件にはカップリング剤の準備が含まれる。第二の関連する態様において、本発明は上記のような３’および５’化学反応基を持つ酵素的に活性な核酸の５’および３’部分の混合物を特色としている。実施例では半分のリボザイムが提供されるが、三つまたはそれ以上の部分としてリボザイムを提供することができることを当業者は認識するであろう。例えば、ヘアピンリボザイムはヘリックスIVおよび核酸の酵素的活性には重要ではない他のヘリックス中に化学反応基を含ませることにより合成される。ＰｏｌIIIに基づくベクター本発明はインビボまたはインビトロにおける細胞での治療的ＲＮＡの発現のためのＲＮＡポリメラーゼIIIに基づいた方法およびシステムに関している。ＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）プロモーターは、５Ｓ、Ｕ６、アデノウイルスＶＡ１、ボールト（Ｖａｕｌｔ）、テロメラーゼＲＮＡ、ｔＲＮＡ遺伝子などをコードしているＤＮＡ中に見られるもので、ＲＮＡポリメラーゼIIIにより転写される（総説としてＧｅｉｄｕｓｃｈｅｋおよびＴｏｃｃｈｉｎｉ−Ｖｅｌｅｎｔｉｎｉ、１９８８Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，８７３ −９１４；Ｗｉｌｌｉｓ、１９９３Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２，１ −１１を参照されたい）。タイプ１ｐｏｌIIIプロモーターは転写開始部位下流の三つのシス作用性配列要素ａ）５’配列要素（Ａブロック）；ｂ）中間配列要素（Ｉブロック）；ｃ）３’配列要素（Ｃブロック）から成っている。５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子はタイプ１ｐｏｌIIIプロモーターを用いて転写される（Ｓｐｅｃｈｔら、１９９１ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，２１８９−２１９１）。タイプ２ｐｏｌIIIプロモーターは転写開始部位下流の二つのシス作用性配列要素の存在により特徴付けられる。トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アデノウイルスＶＡＲＮＡおよびボールトＲＮＡ（Ｋｉｋｈｏｅｆｅｒら、１９９３Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，７８６８−７８７３）遺伝子はこのプロモーターを用いて転写される（ＧｅｉｄｕｓｃｈｅｋおよびＴｏｃｃｈｉｎｉ−Ｖｅｌｅｎｔｉｎｉ、１９８８上記文献；Ｗｉｌｌｉｓ、１９９３上記文献）。配列組成および二つのシス作用性配列要素の配向−Ａボックス（５’配列要素）およびＢボックス（３’配列要素）はＲＮＡポリメラーゼIIIの最適な転写に必須である。タイプ３ｐｏｌIIIプロモーターは転写開始部位上流にシス作用性プロモーター配列要素のすべてを含んでいる。上流配列要素には伝統的なＴＡＴＡボックス（Ｍａｔｔａｊら、１９８８Ｃｅｌｌ５５，４３５−４４２）、近位配列要素（ＰＳＥ）および遠位配列要素（ＤＳＥ；ＧｕｐｔａおよびＲｅｄｄｙ、１９９１ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，２０７３−２０７５）が含まれる。タイプ３ｐｏｌIIIプロモーター制御下の遺伝子の例はＵ６核内低分子ＲＮＡ（Ｕ６ｓｎＲＮＡ）およびテロメラーゼＲＮＡ遺伝子である。上記の三つの主な型のｐｏｌIIIプロモーターに加えて、いくつかの他の型のｐｏｌIIIプロモーター要素が報告されている（Ｗｉｌｌｉｓ、１９９３上記文献）（図７６参照）。エプスタインーバールーウイルスがコードされているＲＮＡ（ＥＢＥＲ）、ゼノパスセレノーシステインｔＲＮＡおよびヒト７ＳＬＲＮＡは前記のタイプのプロモーターと異なるｐｏｌIIIプロモーターの制御下にある遺伝子の例である。ＥＢＥＲ遺伝子は機能性ＡおよびＢボックス（タイプ２ｐｏｌIIIプロモーターに類似している）を含んでいる。さらに、それらはＥＢＥＲ特異性ＴＡＴＡボックスおよびＡＴＦ転写因子のための結合部位も必要とする（ＨｏｗｅおよびＳｈｕ、１９８９Ｃｅｌｌ５７，８２５−８３４）。セレノーシステインｔＲＮＡ遺伝子はＴＡＴＡボックス、ＰＳＥおよびＤＳＥ（タイプ３ｐｏｌIIIプロモーターに類似している）を含んでいる。ほとんどのｔＲＮＡ遺伝子と異なり、セレノーシステインｔＲＮＡ遺伝子は機能性Ａボックス配列要素が欠けている。それは機能性Ｂボックス（Ｌｅｅら、１９８９Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，９６９６−９７０２）を必要とする。ヒト７ＳＬＲＮＡ遺伝子は転写開始部位の下流に独特の配列要素を含んでいる。さらに転写開始部位の上流に、７ＳＬ遺伝子は転写因子のＡＴＦクラスのための結合部位およびＤＳＥを含んでいる（Ｂｒｅｄｏｗら、１９８９Ｇｅｎｅ８６，２１７ −２２５）。ＧｉｌｂｏａによるＷＯ８９／１１５３９およびＧｉｌｂｏａおよびＳｕｌｌｅｎｇｅｒによるＷＯ９０／１３６４ＴはｐｏｌIIIプロモーター制御下のＤＮＡによる真核細胞の形質転換を記載している。彼らは以下のように述べている： ”安定な遺伝子転移プロトコールを用いるアンチセンスＲＮＡ合成の改良の試みにおいて、アンチセンスＲＮＡの発現を駆動するためにｐｏｌIIIプロモーターの使用を考慮することができる。ｐｏｌIIIブロモーター使用の基礎をなす理論的根拠は、それらがｐｏｌIIプロモーターと比較して細胞中で実質的により高いレベルのＲＮＡ転写体を発生ずることができるということである。例えば、真核細胞において約６ｘ１０⁷ｔＲＮＡ分子および７ｘ１０⁵ｍＲＮＡ分子であると推定されている（すなわち全ｐｏｌII転写体よりも約１００倍以上のこのクラスのｐｏｌIII転写体）。細胞当たり約１００の活性ｔＲＮＡ遺伝子が存在するので、各々のｒＲＮＡ遺伝子は全ｐｏｌII転写体と等しい数の平均ＲＮＡ転写体を発生するであろう。豊富なｐｏｌII遺伝子転写体は全ｍＲＮＡの約１％に相当し、平均ｐｏｌII転写体は全ｍＲＮＡの０．０１％に相当するので、ｔＲＮＡ（ｐｏｌIII）に基づいた転写ユニットはｐｏｌIIに基づいた転写ユニットより１００倍から１０，０００倍以上のＲＮＡを発生できるであろう。いくつかの報告は真核細胞においてＲＮＡを発現するためのｐｏｌIIIプロモーターの使用を記載している。ＬｅｗｉｓおよびＭａｎｌｅｙおよびＳｉｓｏｄｉａはアデノウイルスＶＡ−１プロモーターと種々のＤＮＡ配列（ヘルペスＴＫ遺伝子、グロブリンおよびチューブリン）を融合させ、生じたＤＮＡ構築物を焙養細胞内へ転移させるためのトランスフェクションプロトコールを使用して、導入された細胞内でのＲＮＡの一時的合成を得ている。ＤｅｌａＰｅｎｅおよびＺａｓｌｏｆｆはカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションによりｔＲＮＡ−ヘルペスＴＫ融合ＤＮＡ構築物を発現させた。ＪｅｎｎｉｎｇｓおよびＭｏｌｌｏｙはＶＡ− １遺伝子プロモーターをＳＶ４０に基づくベクターから誘導されたＤＮＡ断片へ融合させることによりアンチセンスＲＮＡ鋳型を構築し、それはアンチセンスＲＮＡの一時的発現および標的遺伝子の制限された阻害を得た”（引用文献省略）。著者らはキメラｔＲＮＡの融合生成物およびＲＮＡ生成物を記載している（ＷＯ９０／１３６４１の図１Ｃ参照）。特に、彼らはヒトｔＲＮＡ_i ^met誘導体３− ５について記載している。３−５はクローン化ヒトｔＲＮＡ遺伝子から遺伝子３ ’末端の１９のヌクレオチドの欠失により誘導された。著者らは端が切り取られた遺伝子は終止信号が与えられたならば転写できること、およびＲＮＡ転写体の３’末端のプロセシングが起こらないことを示している。Ａｄｅｎｉｙｉ−Ｊｏｎｅｓら、１９８４ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，１１０１−１１１５、は”遺伝子工学による遺伝子構築で’持ち運びのできるプロモーター’としてｔＲＮＡ遺伝子を利用するための基礎となるであろう”ある種の構築物を記載している。著者らは成熟ｔＲＮＡ_i ^met配列の３’ 末端の１１のヌクレオチドがプラスミド配列に置き換えられ、成熟ｔＲＮＡを発生するようにプロセシングされない、いわゆるΔ３’−５の生成を記載している。著者らは以下のように述べている： ”本研究で説明されたｔＲＮＡ_i ^met３’欠失プラスミドの性質はある種の遺伝子工学による遺伝子構築での使用の可能性を示唆している。ｔＲＮＡ遺伝子は遺伝子の３’境界へ融合した任意のＤＮＡ配列の転写の促進に理論的に使用でき、ヒトｔＲＮＡ_i ^met遺伝子の効率的ポリメラーゼIIIプロモーターを利用するであろう融合遺伝子を発生する。ＤＮＡ配列のΔ３’−４のようなｔＲＮＡ_i ^met欠失突然変異体へのような融合により、長い読み通し転写体がインビボで発生されるであろう（もちろん、有効なＲＮＡポリメラーゼIII終止配列の不在に依存して）。ＤＮＡ配列のΔ３’−５のようなｔＲＮＡ_i ^met欠失突然変異体への融合は共転写体の発生を導き、融合転写体の５’部分のｔＲＮＡリーダーの続いてのプロセシングは阻害されるであろう。真核生物において５’リーダーとしてｔＲＮＡ配列を持つｍＲＮＡ種の特性で示唆されているように、プロセシングの制御は遺伝子工学による構築におけるいくつかの生物学的使用ができるであろう。そのような”二部分からなる転写体”はＥＦ−Ｔｕのようないくつかの主細菌蛋白質をコードし、インビボで分解から転写体を安定化させる手段としてｔＲＮＡリーダーを使用するであろう。真核生物系において”プロモーターリーダー”としてｔＲＮＡ_i ^met遺伝子を使用する可能性は最近我々の実験室で実現された。プロモーターを持たないヘルペス単純ウイルスタイプＩチミジンキナーゼ遺伝子の前のプラスミドΔ３’−４およびΔ３’−５上に含まれている欠失ｔＲＮＡ_i ^met配列を含む融合遺伝子からＸ．ラエビス卵母細胞および体細胞の両方でＲＮＡポリメラーゼIII依存性転写によりウイルス特異的酵素が得られる。”［参照文献省略］。Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒら、１９９０Ｃｅｌｌ６３，６０１−６１９、は二重コピー（ＤＣ）マウスレトロウイルスベクター中のキメラｔＲＮＡ_i ^met−ＴＡＲ転写ユニットを用いてＴＡＲ含有配列の過剰発現を記載している。Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒら、１９９０ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏ．１０，６５１２、はキメラｔＲＮＡ駆動アンチセンス転写体の発現を記載している。以下のことが示されている： ”ｔＲＮＡ駆動アンチセンスＲＮＡ転写系を好結果で使用できるかは、キメラｔＲＮＡ遺伝子がウイルスＬＴＲに挿入されたレトロウイルスベクターの特定の型、二重コピー（ＤＣ）の使用に依存している。細胞中の異質のＲＮＡ配列を高レベルで安定して発現するためのＲＮＡｐｏｌIIIに基づく転写系の使用には、別の重要な応用がある。最も重要なこととしては、アンチセンスＲＮＡ（リボザイム）または配列特異性結合因子の競合剤が使用されるにしろ、遺伝子の発現および機能の研究ために、真核生物細胞における外因性遺伝子を阻害する能力を著しく改良することであろう。ｔＲＮＡ駆動転写系は生殖系列内への”突然変異” の導入に特に有用であろう（すなわち、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の発生）。ｔＲＮＡはすべての細胞型において至るところに発現されるので、キメラｔＲＮＡ遺伝子は動物のすべての組織で適切に発現されるであろうが、対照的にＲＮＡｐｏｌIIに基づいた転写ユニットはより特異質の振る舞いを行う。相同的組換えはよりエレガントであるが、現在の所、生殖系内への突然変異の導入のためには非常に扱いにくい方法である。どちらの場合にしても、決められた突然変異を運ぶトランスジェニック動物または植物を発生させる能力は、進化の前後関係における遺伝子機能の研究、およびヒト遺伝子障害のための動物モデルの発生に対して非常に価値のある実験道具であろう。さらに、ｔＲＮＡ駆動遺伝子発現法は病原体耐性の家畜および植物の作製にも有用であろう。 ”［参照文献省略］。ＣｏｔｔｅｎおよびＢｉｒｎｓｔｅｉｌ、１９８９ＥＭＢＯＪｒｎｌ．８，３８６１、はリボザイムの細胞内レベルを増加させるためのｔＲＮＡ遺伝子の使用を記載している。著者はリボザイムコード配列をゼノパスｔＲＮＡ^met遺伝子のＡおよびＢボックス内部プロモーター配列間に置いたことを指摘している。彼らはまた、標的とされたハンマーヘッドリボザイムがインビボで活性であったことも指摘している。Ｙｕら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，５３４０、はヘアピンリボザイムを発現するためのＶＡＩプロモーターの使用を記載している。得られた転写体はＶＡＩＲＮＡの最初の１０４ヌクレオチド、続いてのリボザイム配列およびターミネーター配列から成っていた。ＬｉｅｂｅｒおよびＳｔａｕｓｓ、１９９５Ｍｏｌ．ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏ．１５，５４０、はハンマーヘッドリボザイム配列をＶＡＩＲＮＡの中心領域に挿入した。ｐｏｌIIIに基づいたベクターはＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、ＷＯ９５／２３２２５に記載されている。別の実施例は以下に提供される。実施例１：ストロメリシンハンマーヘッドリボザイムリボザイムモチーフを工学処理することにより、ストロメリシンｍＲＮＡ配列に向けられたいくつかのリボザイムが設計された。これらのリボザイムはそのヌクレアーゼ耐性を改良するように修飾して合成された。インビトロでストロメリシン標的配列を切断するリボザイムの能力が評価された。リボザイムはストロメリシン発現レベルを分析することによりインビボでの機能が試験された。リボザイムはリポソームに包含して、陽イオン性脂質と複合させて、マイクロインジェクションによりおよび／またはＤＮＡ／ＲＮＡベクターからの発現により細胞へ送達された。ストロメリシン発現は生物学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、間接的免疫蛍光により、および／またはＦＡＣＳ分析によりモニターされた。ストロメリシンｍＲＮＡレベルはノーザン分析、ＲＮＡｓｅ保護、プライマー伸長分析および／または定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価された。５０％以上のストロメリシン活性および／またはストロメリシンｍＲＮＡの誘導を阻止するリボザイムが同定された。ＲＮＡの翻訳を好適に阻害する様式で標的ＲＮＡを切断するため、関節炎疾患に関係するｍＲＮＡの選択された領域を標的とするリボザイムが選ばれた。翻訳の阻害が好適に細胞複製を阻害するであろうように（例えば、必要な蛋白質の産生を阻害することにより、または望まれない蛋白質（例えば、ストロメリシン）の産生を妨げることにより）遺伝子が選択される。ＲＮＡのこれらのきわどい領域内の有効な標的部位の選択は、種々のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに対する標的ＲＮＡの接触性の試験を必然的に伴うであろう。これらの研究はＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いて実施でき、ＲＮアーゼＨでハイブリッド分子を切断することにより接触性がアッセイされる（下記参照）。もしくは、そのような研究はｍＲＮＡの二次構造予測から設計されたリボザイムプローブを使用でき、切断されたおよび切断されていない分子の存在を検出するためポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により切断生成物をアッセイする。さらに、ウサギストロメリシンｍＲＮＡ配列（１７９５ヌクレオチド）内に潜在的リボザイム標的部位が位置しており、ヒト標的部位と整列させた。ウサギストロメリシンｍＲＮＡ配列はヒト配列と８４％の配列同一性を持っているので、多くのリボザイム標的部位もまた相同的であった。従って、ヒトストロメリシンを標的とし、しかしその上にウサギストロメリシンｍＲＮＡ上に相同的またはほとんど相同的な切断部位（表ＡII−ＡVI、ＡVIII＆ＡIX）を持つリボザイムを試験するためには、ウサギは適当な動物としての可能性を持っている。ウサギ配列中の３１６ＵＨ部位の内３０は、潜在的リボザイム切断部位を取り囲む少なくとも１４のヌクレオチドに関してはヒト配列の対応する部位と同一であった。切断部位にすぐ隣接する（５’）ＲＮＡ基質のヌクレオチドはリボザイムー基質複合体（図１参照）で不対化され、その結果としてヒトおよびウサギ潜在的リボザイム部位の比較には含まれていない。続いての試験のためにヒトリボザイム標的部位を選ぶに際しては、ウサギ配列中の同一またはほとんど同一な部位の存在が考慮された。実施例２：優れた部位潜在的リボザイム標的部位は、１）標的部位が実質的に一本鎖であり、およびそのためリボザイムとの相互作用に利用可能であると予測されるかどうか、２）部位がステムIIを形成するように予測され、しかし一般的に他の分子内塩基対形成を欠くようにリボザイムが設計されているかどうか、および３）可能性のあるリボザイムおよび切断部位の両側に隣接する配列が一緒になって正しく相互作用をするように予測されるかどうかを決定するため、コンピューター折りたたみプログラム（下記のプログラムのＭｕｌｆｏｌｄまたはＭａｃｉｎｔｏｓｈ版、ＬＲＮＡ（Ｚｕｃｋｅｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：４８）を用いてさらに分析された。ステムIIの配列は、その位置にステムを維持するが、しかしリボザイム基質結合アームとの分子内塩基対生成を最少にするように変更できる。これらの最小限の判断基準に基づいて、およびヒトおよびウサギストロメリシンｍＲＮＡ配列で同一であるすべての部位を含ませて、続いての分析のための６６の潜在的な優れたリボザイム標的部位が選ばれた（ラウンド１の標的群）。これらは配列ＩＤ番号：３４、３５、３７、４７、５４、５７、６１、６３、６４、６６、７６、７７、７９、８７、８８、９６、９７、９８、９９、１００、１０７、１１０、１２１、１２６、１２８、１２９、１３３、１４０、１４６、１４８、１５１、１６２、１７０、１７９、１８８、１９２、１９４、１９６、１９９、２０２、２０３、２０７、２０８、２１８、２２０、２２３、２２４、２２５、２２７、２３０、２３２、２３６、２４０、２４５、２４６、２５６、２５９、２６０、２６９、２８０、２８１、２９０、３０２、３２８、３３５および３５３である（表ＡIII参照）。実施例３：近づきやすい部位これらの潜在的に優れた部位のどれかまたはすべてが、その部位へ方向付けられたリボザイムへ近づきやすいかどうかを決定するため、ＲＮＡｓｅＨアッセイが実施された。このアッセイを用いると、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブへの潜在的リボザイム標的部位の接触性が、その特定の部位へのリボザイムを合成することなく評価できる。もし、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドが潜在的リボザイム標的部位へハイブリダイズできたら、次にＲＮＡｓｅＨ（ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡを切断する能力を持っている）は標的ＲＮＡを特定の部位で切断できるであろう。ＲＮＡｓｅＨによる標的ＲＮＡの特異的切断は、部位がオリゴヌクレオチド結合に対して”開いている”または”近づきやすい” ことの指標であり、従って、その部位はリボザイム結合に対しても開いているであろうことが予想される。各々のＤＮＡオリゴヌクレオチド／部位に対して発生した特異的ＲＮＡｓｅＨ切断生成物の相対量を比較することにより、潜在的リボザイム部位が接触性に従って順位付けできる。ＲＮＡｓｅＨアッセイを用いて標的部位を分析するため、潜在的標的部位に相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチド（一般的に１３−１５ヌクレオチドの長さ）が合成される。本体標識基質ＲＮＡ（完全長かまたは全ＲＮＡの約５００− ６００ヌクレオチドのサブフラグメント）は³²Ｐ標識ヌクレオチドの存在下、インビトロ転写により製造された。Ｇ−５０セファデックスカラムによるスピンクロマトグラフィーにより³²Ｐ標識基質ＲＮＡから取り込まれていないヌクレオチドを除去し、さらに精製することなく使用された。アッセイを実施するには、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ中、３７℃で５分間³²Ｐ標識基質ＲＮＡを特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１μＭおよび０．１μＭ最終濃度）と前もってインキュベートする。過剰のＲＮＡｓｅＨ（０．８単位／１０μ ｌ反応液）を加え、インキュベーションをさらに１０分間続ける。等量の９５％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンサイアノールＦＦの添加により反応を停止させ、その後試料は９５℃で２分間加熱し、急速に冷却して変性ポリアクリルアミドゲルに加える。ＲＮＡｓｅＨ切断ＲＮＡ生成物は変性ポリアクリルアミドゲル上、非切断ＲＮＡから分離され、オートラジオグラフィーにより可視化し、切断生成物の量を定量する。６６の潜在的リボザイム部位（ラウンド１）のＲＮＡｓｅＨ分析が実施され、最も大きなＲＮＡｓｅＨ切断を支持するＤＮＡオリゴヌクレオチド／部位が決定された。これらのアッセイは基質として完全長ヒトおよびウサギストロメリシンＲＮＡを使用して実施された。ヒトストロメリシンＲＮＡで決定された結果は６６部位の内の２３が高レベルのＲＮＡｓｅＨ切断を支持し、さらに１３が中レベルのＲＮＡｓｅＨ切断を支持したことを示した。これら二つの群の中の２２の部位が続けての研究のために選ばれた。この選択をするのに使用された二つの判断基準は１）ヒトストロメリシンＲＮＡにおいて少なくとも中程度のＲＮＡｓｅＨ切断を支持した特定の部位およびウサギおよびヒトストロメリシン配列間に二つまたはそれ以下のヌクレオチド相違しか持たない部位である。ウサギストロメリシンＲＮＡへのＲＮＡｓｅＨの接触性が決定されたが、これらの選択のための特定の判断基準としては用いられなかった。多分、不適正はＤＮＡオリゴヌクレオチドの不適正ＲＮＡ基質へのハイブリダイゼーションの効率を悪くし、そのためにより少ないＲＮＡｓｅＫ切断が観察されるのでウサギ配列に完全には相補的でないＤＮＡオリゴヌクレオチドはＲＮＡｓｅＨ切断相対量のよい指標ではないであろう。実施例４：リボザイムの分析次に、ＲＮＡｓｅＨアッセイで判断され、近づきやすいと予言された２２の部位（表ＡＶ）に対してリボザイムが合成された。これら２２の部位の１１が対応するウサギ部位と同一であった。２２の部位は配列ＩＤ番号：３４、３５、５７、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４０、１６２、１７０、１７９、１８８、２２３、２２４、２３６、２４５、２４６、２５６、２５９、２６０、２８１である。最も正しく折りたたむためにコンピューター折りたたみプログラム（Ｍｕｌｆｏｌｄ）によりリボザイム単独およびリボザイムー基質組み合わせのどちらかが予言されたかに依存して、７ヌクレオチドかまたは８ヌクレオチドの認識アームを持つ２２のリボザイムが化学的に合成された。合成後、リボザイムはＨＰＬＣかまたはゲル精製により精製された。これらの２２のリボザイムは次に、ヒトおよびウサギ完全長ストロメリシンＲＮＡの両方を切断するそれらの能力が試験された。完全長、本体標識ストロメリシンＲＮＡは［α−³²Ｐ］ＣＴＰ存在下でのインビトロ転写により合成され、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通過させ、さらに精製することなく基質ＲＮＡとして使用された。アッセイは、２Ｘ濃度の精製リボザイムを含むリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃、１０ｍＭＭｇＣｌ₂）を前もって暖め、この２Ｘリボザイム混合物を同様に切断緩衝液中に前もって暖めてある等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始させた。最初のスクリーニングとして、１μ Ｍおよび０．１μＭリボザイムの最終濃度（すなわちリボザイム過剰）を用いて３７℃で１時間アッセイを実施した。等量の９５％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンサイアノールＦＦの添加により反応を停止させ、その後試料は９５℃で２分間加熱し、急速に冷却して変性ポリアクリルアミドゲルに加える。完全長基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により発生した特異的ＲＮＡ生成物はゲルのオートラジオグラフ上で可視化した。試験した２２のリボザイムの内、２１はインビトロでヒトおよびウサギ基質ＲＮＡを部位特異的様式で切断することができた。すべての場合、適当な長さのＲＮＡ切断生成物が可視化された。ＲＮＡの大きさは、ゲルの隣接するレーンで電気泳動された分子量標品と比較することにより判断した。リボザイム反応中に切断された基質ＲＮＡの分画はインビトロでのそのリボザイムの活性の評価として使用できる。完全長基質ＲＮＡに対するこれら２２のリボザイムの活性は、上記のように１μＭのリボザイムを用いるリボザイム切断アッセイにおいて、切断された基質ＲＮＡが約１０％から９５％を超える範囲にわたった。これらのリボザイムの７つのサブセットが続いての研究に選択された。これら７つのリボザイム（表ＡＶに示されている）はヒトおよびウサギストロメリシンＲＮＡの両方に対し、２２のリボザイムの中で最も高い活性を持つものであった。これら７つの部位の内の５つは、切断部位に隣接する両方向の最低７つのヌクレオチドに関してヒトおよびウサギストロメリシンＲＮＡ間で同一の配列を持っていた。これらの部位は８８３、９４７、１１３２、１２２１および１４１０であり、リボザイムは配列ＩＤ番号：３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３および３７４である。実施例５：アーム長試験特定の部位でのリボザイムの切断活性に対するアーム長変化の影響をインビトロで試験するため、結合アーム長に変化を持つこれら７つの部位へのリボザイムが設計された。各々の部位に対し、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチドおよび１２ヌクレオチドの結合アームを持つリボザイムからなるリボザイムの完全な組が合成された（すなわち、各々の部位に対して５つのリボザイム）。これらのリボザイムは合成後ゲル精製され、上記のようにリボザイム切断アッセイで試験された。３５のリボザイム（７つの部位の各々に対して５つの変化したアーム長を持つリボザイム）の分析後、２つのリボザイムがインビトロで最も活性であることが明らかになった。これら２つのリボザイムはヌクレオチド６１７およびヌクレオチド８２０のヒト配列切断部位に向かう７つのヌクレオチドアームを持っていた。これらはＲＺ６１７Ｈ７／７およびＲＺ８２０Ｈ７／７と称され、ヒト（Ｈ）配列切断部位（６１２または８２０）およびリボザイム分子の５’および３’側のアーム長を意味している。実施例６：細胞培養におけるリボザイムの効率試験次に、インビトロで２つの最も活性なリボザイム（ＲＺ６１７Ｈ７／７およびＲＺ８２０Ｈ７／７）の細胞中でのストロメリシンｍＲＮＡ切断能力が試験された。ヒトまたはウサギ滑膜線維芽細胞の初代培養物がこれらの試験に使用された。これらの効力試験に対し、７ヌクレオチドアームを持ち、分子の５’末端の５つのヌクレオチドおよび分子の３’末端の５つのヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾を受けているリボザイムが合成された。比較のため、１２ヌクレオチドアームを持ち、結合アームの両端の５つの位置で２’Ｏメチル修飾を受けた同一の部位へのリボザイム（ＲＺ６１７Ｈ１２／１２およびＲＺ８２０Ｈ１２／１２）もまた合成された。触媒コア領域に２つのヌクレオチド変化を含む不活性リボザイムもまた対照として使用するために製造された。不活性リボザイム中の触媒コアは活性リボザイムのＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡに対してＣＵＵＡＵＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＵである。不活性化リボザイムは、完全長ＲＮＡに対し１μＭ濃度で１時間の典型的リボザイム切断アッセイで測定した場合インビトロで切断活性を示さなかった。一般的なアッセイは以下のようである：ストロメリシンを産生する線維芽細胞は一夜血清飢餓状態で培養し、次の日にリボザイムまたは対照を細胞に与えた。細胞は無血清培地で維持した。リボザイムは遊離のリボザイムとして、または陽イオン性脂質（トランスフェクタム^TM、リポフェクチン^TMおよびリポフェクタミン^TMを含む）、伝統的なリポソーム、非リン脂質リポソームまたは生分解性ポリマーのような種々の送達媒介体と会合させて細胞に応用できる。リボザイム添加時、または３時間後、ストロメリシン発現を大きく増加させるためにインターロイキン−１α（典型的には２０単位／ｍｌ）が添加されるであろう。ストロメリシン産生は通常２４時間までの時間変化がモニターされるであろう。もしリボザイムが細胞内でストロメリシンｍＲＮＡの切断に有効であれば、ストロメリシンｍＲＮＡ量は減少するかなくなるであろう。細胞性ストロメリシンｍＲＮＡレベルの減少、ならびに完全長ストロメリシンｍＲＮＡのリボザイム切断により発生したＲＮＡの出現は、ノーザンブロット分析、ＲＮＡｓｅ保護アッセイおよび／またはプライマー伸長アッセイにより分析できる。ストロメリシン蛋白質産生に対する細胞性ストロメリシンｍＲＮＡのリボザイム切断の影響も多くのアッセイにより測定できる。これらには以下に記載するようなＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）および免疫蛍光アッセイが含まれる。さらに、一次基質（プロテオグリカン）の分解を測定することによりストロメリシンの酵素活性をモニターする機能性アッセイも報告されている。実施例７：ストロメリシン蛋白質の分析インターロイキン−１α誘導ヒト滑膜線維芽細胞の培地内への分泌されたストロメリシンは、ヒトストロメリシンを認識する抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定された。インターロイキン−１αで誘導する３時間前、２−４ｘ１０⁵の血清を除いた細胞にトランスフェクタム^TM−リボザイム複合体（０．１５μＭのリボザイム最終濃度）が与えられた。トランスフェクタム^TMは、１：１（ｗ／ｗ）ジオレオイルポスファチジルエタノールアミンが含まれていろことを除いて使用説明書（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．）に従って調製された。トランスフェクタム^TM−リボザイム複合体は５：１の電荷比で調製された。インターロイキン−１ αの添加２４時間後に培地を採取した。対照（ＮＯＲＺ）はトランスフェクタム^TM単独を細胞に応用した。７ヌクレオチドアームまたは１２ヌクレオチドアームを持つ不活性酵素は、上記のように触媒コアに２つの不活性化変化を持っている。細胞試料は二重に調製され、各々の試料からの順化培地をいくつかに希釈してアッセイが実施された。ＥＬＩＳＡの結果は１００％にセットされた対照（ＮＯＲＺ）に対するストロメリシン存在のパーセントとして次に示されている。ＲＺ標的部位処置６１７Ｈ８２０ＨＲＺ７／７０６．８３０７．０５ＲＺ１２／１２１８．４７３３．９０不活性ＲＺ７／７１００１００不活性ＲＺ１２／１２１００１００ＮＯＲＺ対照１００１００上記の結果は明らかに、活性リボザイム（ＲＺ６１７Ｈ７／７およびＲＺ８２０Ｈ７／７）での処理は細胞により分泌されるストロメリシンの量に劇的な影響を与えた。非処置（対照細胞または不活性リボザイムで処置した細胞）と比較した場合、ストロメリシンレベルは約９３％減少した。１２ヌクレオチド結合アームを持つように合成された同一部位へのリボザイムもまた効果的であり、対照の約６６から約８１％のストロメリシンの減少を起こした。前のインビトロリボザイム切断アッセイにおいて、ＲＺ６１７Ｈ７／７およびＲＺ８２０Ｈ７／７は同一の部位へ向かう１２ヌクレオチドアームを持つリボザイム（６１７Ｈ１２／１２およびＲＺ８２０Ｈ１２／１２）よりも完全長ＲＮＡ基質に対してはより優れた切断活性を持っていた。実施例８：免疫蛍光アッセイストロメリシン検出の別の方法は免疫蛍光により細胞中のストロメリシン蛋白質を可視化することである。このアッセイのためには、細胞からの蛋白質分泌を防止するために細胞はモネンシンで処理される。モネンシン添加後細胞に保持されているストロメリシンは通常のまたは共焦点顕微鏡を用いる免疫蛍光により可視化できる。一般的に、細胞は血清を除いて一夜培養され、次の日にリボザイムで数時間処理される。次にモネンシンを加え、約５−６時間後、モネンシン処理細胞は常法により固定しおよび透過性を上げ、ヒトストロメリシン認識抗体とインキュベートした。蛍光発色団へ結合された第二抗体とさらにインキュベーションした後、細胞を顕微鏡で観察した。不活性リボザイムまたは培地単独で処理した細胞に比較して減少したリボザイム処理細胞中の蛍光は、リボザイム処理により減少したストロメリシン蛋白質のレベルを示している。上記の免疫蛍光技術により可視化されたように、ＲＺ６１７Ｈ７／７またはＲＺ８２０Ｈ７／７（１．５μＭの遊離リボザイムまたは０．１５μＭのトランスフェクタム^TMと複合させたリボザイムの最終濃度で）でのヒト滑膜線維芽細胞の処理により、対照と比較した場合に蛍光、すなわちストロメリシン蛋白質の著しい減少が生じた。対照は培地またはトランスフェクタム^TM単独での処置であった。２つの不活性化変化を触媒コアに持つ対応する不活性リボザイムによる細胞の処理は、リボザイム処理をしない対照と同様な免疫蛍光の結果であった。ウサギ滑膜線維芽細胞もまたＲＺ６１７Ｈ７／７またはＲＺ８２０Ｈ７／７、ならびにウサギ標的配列へ完全に相補的であるようにするため適切な１つの塩基が変更されている２つの対応するリボザイム（ＲＺ６１７Ｒ７／７またはＲＺ８２９Ｒ７／７）で処理された。リボザイム処理されていない対照と比べ、インターロイキン−１α誘導ウサギ滑膜線維芽細胞では免疫蛍光はこれら４つのリボザイム（ウサギまたはヒトｍＲＮＡ配列に特異的にかかわらず）での処理により目に見えるほど減少した。ウサギ滑膜線維芽細胞における免疫蛍光研究においては、ヒトストロメリシンに対する抗体が使用された。実施例９：細胞性ＲＮＡのリボザイム切断本実施例においては下記の方法が使用された。プライマー伸長アッセイ完全長ＲＮＡ、ならびに問題とするＲＮＡの３’リボザイム切断生成物を検出するためにプライマー伸長反応が使用された。本方法には推定リボザイム切断部位の下流（３’）にあるＲＮＡ上の位置にハイブリダイズできるＤＮＡプライマー（一般的には約２０ヌクレオチドの長さ）の合成が含まれる。使用前に、プライマーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐ［ＡＴＰ］で５’末端が標識され、ゲルから精製される。標識プライマーは次に標準法により細胞溶解物から単離された核酸の集団とインキュベートされた。反応緩衝液は５０ｍＭトリス −ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌおよび１０ｍＭＤＴＴであった。３０分の伸長反応が行われ、そこではＲＮＡにハイブリダイズしたすべてのＤＮＡプライマーが、ＲＮＡを鋳型として用いてＤＮＡプライマーの３’末端にヌクレオチドを加えるであろう酵素、逆転写酵素の基質であった。逆転写酵素はＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手され、本質的に使用解説書従って使用される。最良には、逆転写酵素はＲＮＡ基質がなくなるまでｃＤＮＡを形成しながらＤＮＡプライマーを伸長する。従って、リボザイム切断ＲＮＡ基質としては、ｃＤＮＡ生成物は得られる完全長または非切断ＲＮＡ基質のｃＤＮＡ生成物より短いであろう。伸長により生成された³²Ｐ−標識ｃＤＮＡの大きさの相違は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により区別でき、オートラジオグラフィーにより可視化される。しかしながら、ＲＮＡ基質中の強い二次構造は逆転写酵素による早期停止を導くことができる。より短いｃＤＮＡのこの遠因は、これらの早期に停止した生成物の一つが問題とするリボザイム切断生成物の期待される位置へ電気泳動されなければ一般的には問題とならない。従って３’切断生成物は、その期待されるサイズおよびそれらが対照のレーンには存在しないことに基づいて容易に同定される。しかしながら、ＲＮＡ中の二次構造による強い停止は、存在する総完全長および切断ＲＮＡを定量する場合は問題となる。この理由のため、切断の相対量のみが容易に決定できる。プライマー伸長アッセイはトランスフェクタム^TM−複合ＲＺ６１７Ｈ７／７、ＲＺ８２０Ｈ７／７、ＲＺ６１７Ｈ１２／１２およびＲＺ８２０Ｈ１２／１２で処理された細胞から単離されたＲＮＡに対して実施された。対照細胞はトランスフェクタム^TM単独で処理されていた。これら４つのリボザイムの不活性体のトランスフェクタム^TM複合体で処理された細胞からのＲＮＡに対するプライマー伸長物もまた調製された。２０ヌクレオチドプライマー配列は５’ＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣ３’であり、それはリボザイム部位８２０の約２８５ヌクレオチド下流の領域と相補的である。部位６１７へのリボザイムに対し、３ ’切断生成物のためのｃＤＮＡ長は４８８ヌクレオチドであり、８２０に対して、ｃＤＮＡ生成物は２８５ヌクレオチドである。完全長ｃＤＮＡは１１０５ヌクレオチドの長さであろう。１ｍｌの０．１５μＭリボザイムが約２−３ｘ１０⁵ の血清飢餓状態のヒト滑膜線維芽細胞に与えられた。３時間後、２０単位／ｍｌのインターロイキン−１αが細胞に加えられ、インキュベーションを２４時間続けた。３’生成物に対して正しいサイズの³²Ｐ−標識ｃＤＮＡが、部位６１７および８２０に活性なリボザイムで処理されている細胞からのＲＮＡを含むレーンで明瞭に見られた。観察できる３’切断生成物の相対量を比較することにより、７ヌクレオチドアームを持つリボザイムは１２ヌクレオチドアームを持つリボザイムよりも活性であると判断された。これはこれらの試料からの順化培地のＥＬＩＳＡ分析により得られたデータとよく相関している。さらに、不活性リボザイムで細胞を処理しても、３’切断生成物に対応するｃＤＮＡは観察されなかった。ＲＮＡ基質のリボザイム切断は細胞ＲＮＡの調製の間にまたはプライマー伸長反応自身の間に起こっていないことを保証するため、いくつかの対照実験が実施された。一つの対照実験では、インビトロ転写により製造された本体標識ストロメリシンを細胞溶解物に加えられた。この溶解物は次に、典型的なＲＮＡ調製が行われ、非放射性プライマーが使用されたプライマー伸長分析が行われた。もし、細胞溶解時に細胞中に存在するリボザイムが続いての分析の条件下で活性であるならば、加えた本体標識ストロメリシンＲＮＡは切断されるであろう。しかしながら、今回はその場合ではなかった。完全長ＲＮＡのみがゲル分析で観察され、リボザイム切断生成物は存在しなかった。リボザイム処理細胞からのＲＮＡで検出された切断生成物は細胞中のリボザイム切断により生じ、続いての分析の間に生じてはいないことは明らかである。実施例１０：ＲＮＡｓｅ保護アッセイＲＮＡｓｅ保護分析により、細胞中で基質ＲＮＡのリボザイム切断により発生した３’および５’生成物の両方が同定できる。ＲＮＡｓｅ保護アッセイは溶解物リボヌクレアーゼ保護キット（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．）で提供されるプロトコールに記載されているように本質的には実施される。ＲＮＡｓｅ保護のためのプローブはリボザイム切断部位を取り囲む配列と相補的であるＲＮＡである。この”アンチセンス”プローブＲＮＡは、５’プライマーがＴ７プロモーター配列を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドであるポリメラーゼ連鎖反応により作製された鋳型からインビトロで転写された。プローブＲＮＡは反応に³²Ｐ［ＣＴＰ］を含ませることにより転写の間に本体が標識され、Ｇ−５０セファデックスでのクロマトグラフィーにより取り込まれなかったヌクレオチド三リン酸から分離精製される。プローブＲＮＡ（１００，０００から２５０，０００ｃｐｍ）は細胞溶解物からのＲＮＡまたは細胞溶解物から精製されたＲＮＡと３７℃で一夜ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、ＲＮＡｓｅＴ₁およびＲＮＡｓｅＡを加えてすべての一本鎖ＲＮＡを分解させ、得られた生成物はゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析する。この分析により、完全長、非切断標的ＲＮＡは完全長プローブを保護するであろう。リボザイム切断標的ＲＮＡについては、切断はプローブが結合する領域で起こっているのでＲＮＡｓｅ消化からプローブの一部のみが保護されるであろう。このことから二つの保護プローブ断片が生じ、そのサイズはリボザイム切断が起こった位置を反映し、そのサイズは合計すると完全長保護ブローブのサイズになる。ＲＮＡｓｅ保護分析は活性または不活性リボザイムで処理されているウサギ滑膜線維芽細胞から単離された細胞ＲＮＡに対して実施された。試験されたリボザイムはウサギ配列に特異的な７ヌクレオチドアームを持っていたが、ヒトリボザイム部位６１７および８２０に対応している（すなわち、ＲＺ６１７Ｒ７／７、ＲＺ８２０Ｒ７／７）。同一の部位への不活性リボザイムもまた７ヌクレオチドアームを持ち、上記のように２つの不活性化変化を含んでいた。不活性リボザイムは、１μＭの濃度での典型的なインビトロでの１時間リボザイム切断反応において、完全長ウサギストロメリシンＲＮＡに対しては活性ではなかった。すべての試料に対して、１ｍｌの０．１５μＭリボザイムがトランスフェクタム^TM複合体として血清飢餓状態にした細胞へ投与された。３時間後にインターロイキン− １αを添加し、細胞は２４時間後に採取した。活性なリボザイムで処理された細胞からの試料に対し、リボザイム切断を示している適当なサイズのプローブ断片が観察できた。部位６１７に対しては１２５および２９７ヌクレオチドに対応する２つの断片が存在し、部位８２０に対しては、２つの断片は３２８および９４ヌクレオチドの長さであった。リボザイムで処理されていないまたは不活性リボザイムを受け取った細胞からのＲＮＡ試料にはＲＮＡ切断生成物を表しているプローブ断片は観察されなかった。しかしながら、完全長保護プローブ（４２２ヌクレオチドの長さ）は観察でき、これらの試料中に完全長、非切断ストロメリシンＲＮＡが存在していることを示している。線維芽細胞への遊離およびトランスフェクタム複合化リボザイムの送達リボザイムは陽イオン性脂質に複合させてまたは遊離型で線維芽細胞に送達できる。遊離リボザイムを送達するためには、貯蔵リボザイムの適当な希釈（最終濃度は通常１．５μＭ）が無血清培地で行われる：もし放射活性トレーサーを使用しなければならないなら（すなわち³²Ｐ）、リボザイムの比活性は８００−１２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌに調節される。陽イオン性脂質トランスフェクタムと複合させてリボザイムを送達するには、脂質は最初に１／１（ｗ／ｗ）ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）を含む貯蔵溶液として調製される。リボザイムはトランスフェクタム／ＤＯＰＥと１／５（ＲＺ／ＴＦ）電荷比で混合され；３６−ｍｅｒリボザイムに対しては、これは４５倍モル過剰のトランスフェクタムである（トランスフェクタムは分子当たり４つの陽電荷を持っている）。室温で１０分間インキュベーションした後、混合物は希釈され、一般的に０．１５ μＭのリボザイム濃度で応用される。³²Ｐ実験では、リボザイムの比活性は遊離リボザイム実験の比活性と同じである。２４時間後、与えたトランスフェクタム−リボザイムｃｐｍの約３０％が細胞に付随している（ヌクレアーゼ耐性様式で）。ｃｐｍの約１０−１５％が無損傷のリボザイムを意味している；これは細胞当たり約２０００−２５００万のリボザイムである。遊離リボザイムについては、与えた量の約０．６％が２４時間後に細胞に付随している。この内、約１０−１５％が無損傷である；これは細胞当たり約６０−８０万のリボザイムである。実施例１１：ＨＨリボザイムによるストロメリシンｍＲＮＡのインビトロ切断さらなるＨＨリボザイム切断部位をスクリーニングするため、実施例２および表３に掲げたいくつかの部位を標的とするリボザイムが合成された。これらのリボザイムは広範囲に修飾された：５’ヌクレオチドはホスホロチオエート置換を含んでいる；触媒コアの５つのリボース残基を除いて、すべての他のリボザイム内の２’−ヒドロキシル基は２’−Ｏ−メチル基かまたは２’−Ｃ−アリル修飾で置換されている。前記の修飾は制限を意味する修飾ではない。当業者はその他の態様を本分野で既知の技術により容易に生じさせることができることを認識するであろう。インビトロでＲＮＡを切断する能力でこれらのリボザイムが試験された。図７を参照すると、部位２１、４６３、１０４９、１３６６、１４０３、１４１０および１４８９（各々配列ＩＤ番号：３５、９８、２０２、２６３、２７９、２８１および２９２）を標的とするＨＨリボザイムによりインビトロでのＲＮＡ切断が３７℃でアッセイされた。基質ＲＮＡは［γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’末端標識された。”リボザイム過剰”条件下の標準切断反応において、約１ｎＭの基質および４０ｎＭのリボザイムは９０ ℃で２分間加熱し、続いて氷上で１０分間急いで冷却することにより別々に変性させた。基質およびリボザイム反応混合物は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１７．５、および１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含む緩衝液中、３７℃で１０分間復元させた。切断反応はリボザイムおよび基質を混合し、３７℃でインキュベートすることにより開始させた。一定の時間間隔で５μｌを採り、反応は等容量のホルムアミド停止混合液を混合することにより停止させた。試料は２０％ポリアクリルアミド／尿素ゲルで分離された。時間の関数として切断されたＲＮＡ基質のパーセントをプロットしたものが図７に示されている。プロットは６つすべてのリボザイムが標的ＲＮＡを効率よく切断することを示している。しかしながら、いくつかのＨＨリボザイムは他のものより効率的であった（例えば、１０４９は１３６６ＨＨよりも速く切断した）培養ＨＳ−２７細胞におけるリボザイム効力アッセイ（以下の実施例で使用された）；ヒト包皮線維芽細胞（ＨＳ−２７）細胞株または初代ヒト滑膜線維芽細胞（ＨＳＦ）でリボザイムがアッセイされた。すべての細胞はアッセイ前日に１０％ウシ胎児血清を含む２４ウェルプレートに５ｘ１０⁴細胞／ウェルの密度で播種された。播種２４時間後、培地をウェルから除き単層をダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。２４時間細胞を０．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；１ｍｌ／ウェル）を含む培地でインキュベートして細胞を血清飢餓状態にした。リボザイム／脂質複合体は以下のように調製された：リボザイムおよびリポフェクタミンを別々に無血清ＤＭＥＭに２０ｍＭへペス、ｐＨ７．３加えた培地で２Ｘの最終濃度まで希釈し、次に等量を混合し、激しくかき混ぜて３７℃で１５分インキュベートした。リポフェクタミン：リボザイムの電荷比は３：１であった。細胞はＣａ²⁺およびＭｇ²⁺を含むＰＢＳで二度洗浄した。細胞は次にリボザイム／脂質複合体で処理し、３７℃で１．５時間インキュベートした。次にＦＢＳが１０％の最終濃度まで添加された。ＦＢＳを添加して２時間後、リボザイム含有溶液を除去し、５０ｕ／ｍｌＩＬ−１、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭへペスｐＨ７．３を加えた。ＩＬ−１で誘導して１６時間後に上清液を採取し、ＥＬＩＳＡによりストロメリシン発現をアッセイした。ストロメリシン発現を測定するため、マトリックス金属プロテイナーゼ３に対するポリクローナル抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＮＨ）が検出抗体として使用され、抗ストロメリシンモノクローナル抗体がサンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体として使用された。実施例１２：ヒト線維芽細胞におけるストロメリシン発現のリボザイム媒介阻害図８から１３を参照すると、ヒトストロメリシン−１ｍＲＮＡ内の部位２１、４６３、１０４９、１３６６、１４０３、１４１０および１４８９を標的とするＨＨリボザイムが上記のようにＨＳ−２７線維芽細胞またはＨＳＦ細胞株内へトランスフェクトされた。触媒コア領域に２ヌクレオチド変化を含む触媒的に不活性なリボザイムもまた合成され、対照として使用された。不活性リボザイム中の触媒コアは、活性なリボザイムではＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡであるのに対しＣＵＵＡＵＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＵであった。不活性リボザイムは、完全長ＲＮＡに対して１μＭ濃度で１時間の典型的リボザイム切断アッセイで測定した場合、インビトロで切断活性を示さなかった。ストロメリシン蛋白質のレベルは上記の鋭敏なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて測定された。図中、＋ＩＬ−１はストロメリシン発現を誘導するため細胞がＩＬ−１で処理されたことを意味している。−ＩＬ−１は細胞が処理されなかったことを意味している。図８から１３は活性ＨＨリボザイムでトランスフェクトされた細胞で発現されたストロメリシン蛋白質のレベルの劇的な減少を示している。ストロメリシン産生レベルのこの減少は、触媒的に不活性なリボザイムでトランスフェクトされた細胞で観察されたいくらかの非特異的阻害を上回っている。不活性リボザイムでトランスフェクトされた対照細胞と比較した場合、ストロメリシン産生において平均して５０％を超える阻害（活性ＨＨリボザイムでトランスフェクトされた細胞において）である。これらの結果は、ＨＳ−２７細胞におけるストロメリシン産生の減少は触媒的に活性なＨＨリボザイムによるヒトストロメリシン−１ｍＲＮＡの配列特異的切断により媒介されることを示唆している。触媒的に不活性なリボザイムでトランスフェクトした細胞でのストロメリシン蛋白質産生の減少は、不活性リボザイムの標的ＲＮＡへの結合により起こされるいくらかの”アンチセンス効果”によるものであり、物理的に翻訳を阻害しているのであろう。実施例１３：ウサギ膝関節におけるストロメリシン発現のリボザイム媒介阻害細胞ばいようにおけるリボザイム効力を拡張するため、ウサギストロメリシン蛋白質発現のリボザイム媒介阻害を研究する合理的な動物モデルとしてウサギ膝関節への使用が選択された。動物研究のためには、ヒトストロメリシン−１ｍＲＮＡ内の部位１０４９を標的とするＨＨリボザイム（１０４９ＨＨ）が選択された；部位１０４９はウサギストロメリシンｍＲＮＡ内の部位１０６０と１００％同一であるため（表ＡIIIおよびＡIV）。このことはヒトならびにウサギ系において同一のリボザイムの効力を比較することを可能にする。オスニュージーランドホワイトラビット（３−４ｋｇ）をケタミン−ＨＣｌ／キシラジンで麻酔し、両方の膝の動脈内へ（Ｉ．Ｔ．）１００μｇのリボザイム（例えば、配列ＩＤ番号：２０２）を含む０．５ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）またはＰＢＳのみ（対照）を注射した。ＩＬ−１（ヒト組換え体ＩＬ−１α、２５ｎｇ）をリボザイム投与２４時間後にＩ．Ｔ．で投与した。各々のウサギは一つの膝にＩＬ−１を他の膝はＰＢＳのみを受けた。ＩＬ−１注入後６時間で滑膜を採取し、液体窒素で急速に凍結させて−８０℃で保存した。全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で抽出され、ノーザンブロット分析および／またはＲＮａｓｅ保護アッセイで分析された。簡単に記すと、０．５μｇの細胞ＲＮＡは１．０％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分離され、約１６時間のキャピラリー輸送によりＺｅｔａ−ＰｒｏｂｅＧＴナイロン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）へ移された。ブロットは２時間焼き固め、次に１０ｍｌのチャーチハイブリダイゼーション緩衝液（７％ＳＤＳ、５００ｍＭリン酸、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ウシ血清アルブミン）中、６５℃で２時間前ハイブリダイズされた。ブロットは６５℃で約１６時間、ウサギストロメリシンｍＲＮＡに対する１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの完全長³²Ｐ− 標識相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）プローブとハイブリダイズされた（ｃＲＮＡは前ハイブリダイゼーション緩衝液へ１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと一緒に加えられた。ブロットは５％ＳＤＳ、２５ｍＭリン酸、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡで１０分間室温で洗浄された。続いて同一の緩衝液で６５ ℃で２回洗浄し（各々の洗浄は１０分）、続いて１％ＳＤＳ、２５ｍＭリン酸および１ｍＭＥＤＴＡで２回洗浄した（各々の洗浄は１０分）。ブロットはオートラジオグラフィーにかけられた。ブロットは上記のように１８ＳｒＲＮＡに対する１００ｎｔｃＲＮＡで再探査された。オートラジオグラフィー後、ストロメリシン発現は走査型デンシトメーターで定量化され、１８ＳｒＲＮＡバンド強度でデータを標準化した。図１４−１６に示したように、触媒的に活性な１０４９ＨＨリボザイムはウサギ膝関節におけるストロメリシン発現の減少を媒介した。阻害は配列特異的であるようで、５０−７０％の範囲である。実施例１４：ホスホロチオエート置換リボザイムはウサギ膝関節のストロメリシン発現を阻害する５’末端に４つのホスホロチオエート結合を含むリボザイムは哺乳類細胞においてリボザイム効力を促進する。図１７を参照して、ストロメリシンｍＲＮＡ内の部位１０４９を標的とするハンマーヘッドリボザイムが設計および合成され、ここでリボザイムはその５’および３’末端に５つのホスホロチオエート結合を含んでいる。さらに、これらのリボザイムは３０ヌクレオチド位に２’−Ｏ−メチル置換、Ｕ４位に２’−Ｃ−アリル置換および５つの位置に２’−ＯＨを含んでいる（図１７Ａ）。上記のように、これらのリボザイムはリボザイム効力を試験するためにウサギ膝関節に投与された。１０４９Ｕ４−Ｃ−アリルＰ＝Ｓ活性リボザイムはウサギ膝関節においてストロメリシンＲＮＡレベルの５０％以上の減少を示した。１０４９Ｕ４−Ｃ−アリルＰ＝Ｓリボザイムの不活性化体はストロメリシンＲＮＡレベルの約３０％の減少を示した。図１８を参照して、ストロメリシンｍＲＮＡ内の３つの独特な部位を標的とするハンマーヘッドリボザイムが設計および合成され、ここでリボザイムはその５ ’末端に４つのホスホロチオエート結合を含んでいる。さらに、これらのリボザイムは２９ヌクレオチド位に２’−Ｏ−メチル置換、Ｕ４およびＵ７位に２’− アミノ置換および５つの位置に２’−ＯＨを含んでいる。上記のように、これらのリボザイムはリボザイム効力を試験するためにウサギ膝関節に投与された。図１８−２１に示したように、部位１０４９、１３６３および１３６６を標的とするリボザイムはすべてウサギ膝関節において効果的である。３つすべてのリボザイムがウサギ膝関節において約５０％ストロメリシンＲＮＡレベルを減少させた。図１７および１８に記載した配列および化学修飾はそれらに制限することを意味してはいない。当業者は他のリボザイムおよび他の化学修飾を含む類似の実施態様を本分野で既知の技術を用いて容易に発生できることを認識するであろうし、それらは本発明の範囲内である。リボザイムの触媒活性に有意に影響することなくリボザイム内のある種の位置（例えば、Ｕ４およびＵ７位）が６−メチルＵおよび不能性（塩基を含まないヌクレオチド）残基で置換できるような化学修飾が示された。同様に、リボザイムの活性に影響することなく、逆転Ｔの代わりに３’−３’結合不能性逆転リボース残基をリボザイム３’末端の保護に使用できる。Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３およびＣＤ４０はいくつかの判断基準において魅力的なリボザイム標的である。Ｔ細胞活性化の分子機構は確立されている。明確なおよび予報的な動物モデルで効力が試験できる。移植片拒絶の臨床的最終点は明白である。送達は生体外であろうので、正しい細胞集団の処置が保証されるであろう。最後に、疾患状態は重度であり、現在の治療は不適当である。蛋白質に基づく治療は処置期間の数週間に遭遇するすべての抗原に対するアネルギーを誘導するが、生体外リボザイム療法は真に供与者特異性アネルギーに対する直接的およびエレガントな方法を提供する。同様に、自己抗原に対する免疫応答の破壊的過程を逆転させることにより自己免疫疾患およびアレルギーが予防または処置できる。特に、本発明の核酸は天然に存在する抗原への応答を鈍らせることができる。実施例１５：Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０ハンマーヘッドリボザイムリボザイムモチーフを工学処理することにより、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７− ３および／またはＣＤ４０がコードされたｍＲＮＡ配列に向かういくつかのリボザイムを設計した。これらのリボザイムはそのヌクレアーゼ耐性を改良するように修飾して合成された。インビトロで標的配列を切断するリボザイムの能力が評価された。外因性Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０の発現を誘導できるいくつかの共通ヒト細胞株が入手可能である。もしくは、マウス脾臓細胞が単離でき、ＩＬ−４または組換え体ＣＤ４０リガンドでＢ７−１またはＢ７−２を発現するように誘導できる。Ｂ７−１およびＢ７−２はモノクローナル抗体で容易に検出できる。適当な蛍光性試薬および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の使用は細胞ごとに基づく表面Ｂ７−１またはＢ７−２の直接定量化を可能にするであろう。活性リボザイムはＢ７−１またはＢ７−２の発現を直接的に減少させることが期待される。ＣＤ４０を標的とするリボザイムはＣＤ４０リガンドによるＢ７−２の誘導を防止するであろう。移植のいくつかの動物モデルが入手可能である−マウス、ラット、ブタモデル（Ｆｏｄｏｒら、１９９４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，１１１５３）；またはヒヒ（Ｎｏｅａｋ、１９９４Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６，１１４８に、による総説）。Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０蛋白質レベルはＦＡＣＳ分析により臨床的にまたは実験的に測定可能である。Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０がコードされたｍＲＮＡレベルはノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長分析および／または定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価されるであろう。Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０活性および／またはＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７− ３および／またはＣＤ４０蛋白質をコードしているｍＲＮＡの誘導をインビトロで２０％以上阻止するリボザイムが同定されるであろう。自己免疫疾患のいくつかの動物モデルが入手可能である−アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を持つＬｅｗｉｓラット（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９３Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６８５，８６）；多発性硬化症の動物モデル（Ｗｅｋｅｒｌｅら、１９９４Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６，ｓ４７）および慢性関節リウマチ（ｖａｎＬａａｒら、１９９４Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８，２０６）。アレルギーのいくつかの動物モデルが入手可能であり、ＫｅｍｅｎｙおよびＤｉａｚ−Ｓａｎｃｈｅｚ、１９９０Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８２，４２３、およびＰｒｅｔｏｌａｎｉら、１９９４Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７２５，２４７、により総説が報告されている。それらをコードしているＲＮＡリボザイムおよび／または遺伝子は遊離送達、リポソーム送達、陽イオン性脂質送達、アデノ付随ウイルスベクター送達、アデノウイルスベクター送達、レトロウイルスベクター送達またはプラスミドベクター送達によりこれらの動物モデル実験（前記参照）において送達されるであろう。供与者ＡＰＣへのリボザイムを構造的に発現するリボザイムベクターの１回の投与、または安定な抗Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０リボザイムまたは一時的に発現するリボザイムベクターの一回またはそれ以上の投与、続いての受容個体への注入は移植片拒絶の発生を減少させるであろう。もしくは、移植片組織を移植前に上記のように処理してもよい。実施例１６：６−メチル−ウリジンホスホルアミダイトの合成図３０を参照すると、ヘキサメチルジシラザン（５０ｍＬ）および乾燥ピリジン（５０ｍＬ）の混合物中の６−メチル−ウラシル（２．７７ｇ，２１．９６ｍｍｏｌ）の懸濁液を３時間還流した。得られた６−メチルウラシルのトリメチルシリル誘導体の透明溶液を蒸発乾固させ、乾燥トルエンとともに２回共蒸発させて痕跡量のピリジンを除去した。得られた透明油状物の乾燥アセトニトリル中の溶液に、１−Ｏ−アセチル−２’，３’，５’ートリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ −リボース（１０．１ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃に冷却した。上述の撹拌溶液に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（４．３５ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を０℃で１．５時間、次に室温で１時間撹拌した。その後、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を蒸発させ、残渣をシリカゲル上で酢酸エチル−ヘキサン（２：１）混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、９．５ｇ（８３％）の化合物２および０．８ｇの対応するＮ¹，Ｎ³−ビス−誘導体を得た。ピリジン（６０ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）の混合物中の化合物（４．２ｇ，７．３６ｍｍｏｌ）の冷却（−１０℃）溶液に、定常的に撹拌しながら水酸化ナトリウム（１６ｍＬ）の氷冷２Ｍ水性溶液を加えた。反応混合物を−１０℃でさらに３０分間撹拌し、次にＤｏｗｅｘ５０（Ｐｙ⁺）で中和してｐＨ７とした。樹脂を濾別し、Ｈ₂Ｏ−ピリジン（４：１）の混合物２００ｍＬで洗浄した。合わせた”母液”と洗浄液を蒸発乾固させ、乾燥ピリジンと多数回共蒸発させることにより乾燥した。残渣を乾燥ピリジンに再溶解し、次に塩化ジメトキシトリチル（２．９９ｇ，８．０３ｍｍｏｌ）と混合した。反応混合物を室温で一夜放置した。反応をメタノール（２５ｍＬ）で急冷し、混合物を蒸発させた。残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル上でＣＨ₂Ｃｌ₂中のＭｅＯＨの直線勾配（２％から５％）を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、３．４ｇ（８３％）の化合物６を得た。実施例１７：６−メチル−シチジンホスホルアミダイトの合成トリエチルアミン（１３．４ｍｌ，１００ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌの無水アセトニトリル中の１，２，４−トリアゾール（６．２２ｇ，９０ｍｍｏｌ）およびオキシ塩化リン（１．８９ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）の撹拌氷冷混合物に滴加した。得られた懸濁液に、３０ｍｌのアセトニトリル中の２’，３’，５’−トリ−Ｏ −ベンゾイル−６−メチルウリジン（５．７ｇ，１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。次に、これを真空下で濃縮して最小容量とした（乾固させない）。残渣をクロロホルムに溶解し、水、飽和水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。残渣を１００ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解し、５０ｍＬの２９％水性ＮＨ₄ＯＨで一夜処理した。溶媒を真空下で除去した。残渣をピリジン（６０ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）の混合物に溶解し、−１５℃ に冷却し、水酸化ナトリウムの氷冷２Ｍ水性溶液を撹拌しながら加えた。反応混合物を−１０から−１５℃でさらに３０分間撹拌し、次にＤｏｗｅｘ５０（Ｐｙ⁺ ）で中和してｐＨ７とした。樹脂を濾別し、Ｈ₂Ｏ−Ｐｙ（４：１）の混合物２００ｍＬで洗浄した。合わせた母液および洗浄液を蒸発乾固させた。残渣を水性メタノールから結晶化させて、１．６ｇ（６２％）の６−メチルシチジンを得た。乾燥ピリジン中の６−メチルシチジン（１．４ｇ，５．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、３．１１ｍＬのトリメチルクロロシランを加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。次に、無水酢酸（０．５１ｍＬ，５．４４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温でさらに３時間撹拌した。ＴＬＣが出発物質の消失を示した後、反応をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で急冷し、氷冷し、水で処理した（２０ｍＬ，１時間）。溶媒を真空下で除去し、乾燥ピリジンとともに４回共蒸発させることにより残渣を乾燥した。最後に、これを乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル（２．２ｇ，６．５２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌し、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で急冷した。溶媒を真空下で除去した。残留油状物を塩化メチレンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を分離し、蒸発させ、残渣をシリカゲル上で塩化メチレン中ＭｅＯＨ勾配（３％から５％）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、２．４ｇ（７４％）の化合物（４）を得た。実施例１８：６−アザ−ウリジンおよび６−アザ−シチジンの合成乾燥ピリジン中の６−アザウリジン（５ｇ，２０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に塩化ジメトキシトリチル（８．２９ｇ，２４．４７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一夜放置した。次に、これをメタノール（５０ｍＬ）で急冷し、溶媒を真空下で除去した。残留油状物を塩化メチレンに溶解し、飽和水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を分離し、蒸発乾固させた。残渣を乾燥ピリジンと多数回共蒸発させることによりさらに乾燥させ、最後に乾燥ピリジンに溶解した。無水酢酸（４．４３ｍＬ，４６．７ｍｍｏｌ）を上述の溶液に加え、反応混合物を室温で３時間放置した。次に、これをメタノールで急冷し、上述のように後処理した。残渣をシリカゲル上で塩化メチレン中２％ＭｅＯＨの混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、９．６ｇ（７５％）の化合物を得た。トリエチルアミン（２３．７ｍｌ，１７０．４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの無水アセトニトリル中の１，２，４−トリアゾール（１０．６ｇ，１５３．３６ｍｍｏｌ）およびオキシ塩化リン（３．２２ｍｌ，３４．０８ｍｍｏｌ）の撹拌氷冷混合物に滴加した。得られた懸濁液に、４０ｍｌのアセトニトリル中の２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−アザウリジン( ７．１３ｇ，１１．３６ｍｍｏｌ)の溶液を滴加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。次に、これを真空下で濃縮して最小容量とした（乾固させない）。残渣をクロロホルムに溶解し、水、飽和水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。残渣を１５０ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解し、５０ｍＬの２９％水性ＮＨ₄ＯＨで室温で２０時間処理した。溶媒を真空下で除去した。残渣をシリカゲル上で塩化メチレン中のＭｅＯＨ直線勾配（４％から１０％）を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、３．１ｇ（５０％）のアザシチジンを得た。無水ピリジン中の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−アザシチジン（３ｇ，５．５３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリメチルクロロシラン（２．４１ｍＬ，１９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で４時間放置した。次に、無水酢酸（０．６３ｍＬ，６．６４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温でさらに３時間撹拌した。その後、これをＭｅＯＨ（１５ｍＬ）で急冷し、溶媒を真空下で除去した。残渣をＴＨＦ中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液で処理し（２０℃ ，３０ｍｉｎ）、蒸発乾固させた。残留油状物を塩化メチレンに溶解し、飽和水性炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄した。分離した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させた。残渣をシリカゲル上で塩化メチレン中４％ＭｅＯＨを溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、２．９ｇ（８９．８％）の化合物を得た。ＴＢＤＭＳ基の導入の一般的方法：５０ｍＬの乾燥ＴＨＦおよびピリジン（４ｅｑ）中の保護ヌクレオシドの撹拌溶液に、ＡｇＮＯ₃（２．４ｅｑ）を加えた。１０分後、塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（１．５ｅｑ）を加え、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し１００ｍＬの５％水性ＮａＨＣＯ₃中に入れた。溶液をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上でヘキサン−酢酸エチル（３：２）混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ホスフィチル化の一般的方法：乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の保護ヌクレオシド（１ｍｍｏｌ）の氷冷撹拌溶液に、ジクロロメタン（３ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｅｑ）および２−シアノエチルＮ’Ｎ −ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．２ｅｑ）の予め混合した溶液をアルゴンブランケット下でシリンジを用いて滴加した。同時に、別のシリンジで、Ｎ−メチルイミダゾール（１ｅｑ）を加え、室温で２時間撹拌を続けた。その後、反応混合物を再び氷冷し、１５ｍｌの乾燥メタノールで急冷した。５分間撹拌した後、混合物を真空下で（＜４０℃）濃縮し、シリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン−酢酸エチル混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、対応するホスホルアミダイトを白色泡状物として得た。実施例１９：６−メチル−ウリジンで置換したＨＨＡリボザイムのＲＮＡ切断活性部位Ａを標的とするハンマーヘッドリボザイム（図３１を参照されたい）を上述のように固相合成を用いて合成した。Ｕ４位を６−メチル−ウリジンで修飾した。インビトロＲＮＡ切断アッセイ基質ＲＮＡは、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて５’末端標識した。切断反応は、リボび４０ｎＭの未標識リボザイムを、９０℃で２分間加熱し、氷上で１０−１５分間スナップ冷却することにより、別々に変性させ再生させた。リボザイムおよび基質を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含む緩衝液中で３７℃で１０分間別々にインキュベートした。反応は、リボザイムと基質溶液とを混合して３７℃でインキュベートすることにより開始した。５μｌのアリコートを一定の時間間隔で取り出し、等量の２×ホルムアミド停止ミックスと混合することにより反応を急冷した。試料は２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。結果を定量し、切断された標的ＲＮＡのパーセンテージを時間の関数としてプロットした。図３２を参照すると、Ｕ４位に６−メチル−ウリジン修飾を含むハンマーヘッドリボザイムは標的ＲＮＡを効率よく切断する。実施例２０：６−メチル−ウリジンで置換したＨＨＢ−リボザイムのＲＮＡ切断活性部位Ｂを標的とするハンマーヘッドリボザイム（図３３を参照されたい）を上述のように固相合成を用いて合成した。Ｕ４およびＵ７位を６−メチル−ウリジンで修飾した。ＲＮＡ切断反応は上述のように実施した。図３４を参照すると、Ｕ４およびＵ７位に６−メチル−ウリジン修飾を含むハンマーヘッドリボザイムは、標的ＲＮＡを効率よく切断する。実施例２１：６−メチル−ウリジンで置換したＨＨＣリボザイムのＲＮＡ切断活性部位Ｃを標的とするハンマーヘッドリボザイム（図３５を参照されたい）を上述のように固相合成を用いて合成した。Ｕ４およびＵ７位を６−メチル−ウリジンで修飾した。ＲＮＡ切断反応は上述のように実施した。図３６を参照すると、Ｕ４位に６− メチル−ウリジン修飾を含むハンマーヘッドリボザイムは、標的ＲＮＡを効率よく切断する。図２３、３１、３３、３５および他のものに掲げられる配列およびこれらの図に記載される修飾は、非限定的例を意味する。当業者は、アミノ酸、ペブチドおよびコレステロール等の（これらに限定されない）他の２’−ヒドロキシル基修飾を含むリボザイムおよびＲＮＡの変異体（塩基置換、削除、挿入、突然変異、化学的修飾）を、当該技術分野において知られた技術を用いて容易に生成しうること、およびこれらも本発明の範囲に含まれることを理解するであろう。実施例２２：６−メチル−Ｕ−置換リボザイムＨＨＡによるラット平滑筋細胞増殖の阻害ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＡ）は、ｃ−ｍｙｂｍＲＮＡ中のユニーク部位（部位Ａ）を標的とする。ｃ−ｍｙｂ蛋白質の発現は、ラット平滑筋細胞の増殖に必須であることが示されている(Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ.，１９９２Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，４６２５)。上述のｃ−ｍｙｂＲＮＡ中の部位Ａを切断したリボザイムを、その平滑筋細胞増殖に及ぼす影響についてアッセイした。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，（上掲）に記載されるように、ラット血管平滑筋細胞を単離し、培養した。ＨＨＡリボザイムを脂質と複合体形成させ、ラット平滑筋細胞中に送達した。血清飢餓細胞をＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，（上掲）に記載されるように刺激した。簡単には、血清飢餓平滑筋細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮＡ／脂質複合体を加えた。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次に培養液を除去し、１０％ＦＢＳ、添加物および１０μＭブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を含むＤＭＥＭを加えた。いくつかのウエルにおいては、ＦＢＳを除いて非刺激増殖のベースラインを決定した。プレートを３７℃で２０−２４時間インキュベートし、１００％メタノール中の０．３％Ｈ₂Ｏ₂で固定し、標準的方法によりＢｒｄＵ取り込みについて染色した。この方法においては、増殖してＢｒｄＵを取り込んだ細胞は茶色に染色され；非増殖細胞は淡紫色に対染色される。ＢｒｄＵ陽性細胞およびＢｒｄＵ陰性細胞の両方を顕微鏡下で計数した。ウエルあたり合計３００−６００個の細胞を計数した。続く実験においては、ＢｒｄＵを取り込んだ全細胞のパーセンテージ（％細胞増殖）を示す。誤差は、二重ウエルの範囲を表す。次に、％細胞増殖値から以下のようにして阻害のパーセントを計算する：％阻害＝１００−１００（リボザイム−０％血清）／（対照−０％血清）。図３７を参照すると、ＨＨＡの４位で６−メチル−Ｕで置換された活性リボザイムは、ラット平滑筋細胞増殖を首尾よく阻害した。コア中に２つの塩基置換を有する触媒的に不活性なリボザイム（不活性ＨＨＡ）（これらの突然変異はハンマーヘッドリボザイムを不活性化する；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，上掲）は、ラット平滑筋細胞増殖を有意に阻害しない。実施例２３：６−メチル−Ｕ置換リボザイムＨＨＣによるヒト滑液繊維芽細胞におけるストロメリシン生成の阻害ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＣ）は、ストロメリシンｍＲＮＡ中のユニーク部位（部位Ｃ）を標的とする。一般的アッセイは、Ｄｒａｐｅｒｅｔａｌ．，（上掲）に記載のように行った。簡単には、ストロメリシンを産生する繊維芽細胞を一夜血清飢餓とし、翌日リボザイムまたは対照を細胞に与えた。細胞を無血清培地で維持した。リボザイムを、遊離リボザイムとして、またはカチオン性脂質(トランスフェクタム(商標)、リポフェクチン（商標）およびリポフェクタミン（商標）を含む)、慣用のリポソーム、非リン脂質リポソームまたは生分解性ポリマー等の種々の送達ベヒクルと組み合わせて細胞に適用した。リボザイム添加のときに、または３時間後までに、インターロイキン−１α（典型的には２０ユニット／ｍｌ）を細胞に加えて、ストロメリシン発現の大きな増加を誘導することができる。次に、ストロメリシンの生成を経時的に、通常は２４時間まで監視することができる。ＩＬ−１誘導の１６時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりストロメリシン発現についてアッセイした。サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，上掲）において、マトリックスメタロプロテイナーゼ３に対するポリクローナル抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＮＨ）を検出抗体として用い、抗ストロメリシンモノクローナル抗体を捕捉抗体として用いて、ストロメリシン発現を測定した。図３８を参照すると、６−メチル−Ｕ修飾を含むＨＨＣリボザイムは、ストロメリシン蛋白質生成のレベルの有意な減少をもたらした。触媒的に不活性なＨＨＣは、蛋白質レベルに対して有意な影響を及ぼさなかった。実施例２４：ピリジン−２（４）−オンヌクレオシド３’−ホスホルアミダイトの合成１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−２（４）−ピリドン（３）および（９）の製造の一般的方法図３９を参照すると、２−または４−ヒドロキシピリジン（１）または（８）（２．０９ｇ，２２ｍｍｏｌ）、１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノース（２）（１０．０８ｇ，２０ｍｍｏｌ）およびＢＳＡ（５．５ｍｌ，２２ｍｍｏｌ）を７０℃（油浴）でアルゴン下で乾燥アセトニトリル（１００ｍｌ）に溶解し、混合物を１０分間撹拌した。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＴｆｌ）（５．５ｍｌ，２８．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに、１については１時間、８については４時間撹拌した。次に、混合物を室温（ＲＴ）に冷却し、ＣＨＣｌ₃（２００ｍｌ）で希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ₃溶液で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、真空下で蒸発乾固させた。残渣はシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。３の精製にはジクロロメタン中の１−５％メタノール勾配（収率９８％）を、９の精製にはジクロロメタン中の２−１０％メタノール勾配（収率８４％）を用いた。１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２（４）−ピリドン（４）および（１０）３または９（１８ｍｍｏｌ）を０．３ＭＮａＯＣＨ₃（１５０ｍｌ）に溶解し、溶液を室温で１時間撹拌した。次に、混合物をＤｏｗｅｘ５０ＷＸ８（Ｐｙ⁺）で中和し、イオン交換剤を濾別し、濾液を真空下で濃縮してシロップとした。残渣を水（１００ｍｌ）に溶解し、溶液をクロロホルム（２×５０ｍｌ）およびエーテル（２×５０ｍｌ）で洗浄した。水性層を蒸発乾固させ、次に残渣を酢酸エチルから結晶化し（３．９ｇ，９１％４；Ｎｉｅｄｂａｌｌａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ１，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．ａｎｄＴｉｐｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｅｄ．；Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.；ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７８，ｐ４８１−４８４）；１０はエタノールから結晶化した（３．６ｇ，８４％）（Ｎｉｅｄｂａｌｌａａ８−３６７１）。１−（２−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ−５−Ｏ−ＤＭＴ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２（４）−ピリドン標準的方法（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＧａｉｔＥｄ．；ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４，ｐ２７を参照されたい）にしたがって４または１０を５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０．５−１０％メタノールの勾配）を行った後、５を収率７６％で、ピリジン−４−オン誘導体を収率６７％で黄色泡状物として得た。これらの化合物を、Ｈａｋｉｍｅｌａｈｉｅｔａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９８２，６０，１１０６−１１１３に記載の条件下で塩化ｔ−ブチルジメチルシリルで処理し、反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中２０−５０％酢酸エチルの勾配）により精製して、より速く移動する２ ’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ異性体（それぞれ６８．５％および５５％）を無色泡状物として得た。１−［２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３− Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］−２（４）−ピリドン（７）および（１１）１−（２−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−５−Ｏ−ＤＭＴ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２（４）−ピリドンを、Ｔｕｓｃｈｌｅｔａｌ.,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３，３２，１１６５８−１１６６８に記載された条件下でホスフィチル化し、７についてはヘキサン中１５−５０％酢酸エチルの勾配（１％Ｅｔ₃Ｎ）を（収率８９％）、１１についてはジクロロメタン（１％Ｅｔ₃Ｎ）を用いて、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより単離した（収率９４％）。ホスホルアミダイト７および１１を、先に記載された（ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５，上掲）合成、脱保護、精製および試験方法を用いて、リボザイムおよび基質中に取り込ませた。平均段階カップリング収率は約９８％であった。実施例２５：２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −１−デオキシ−１−フェニル−β−Ｄ−リボフラノース（８）ホスホルアミダイトの合成５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ−イソプロビリデン−１−デオキシ−１−フェニル−β−Ｄ−リボフラノース（３）図４０を参照すると、ＣｚｅｍｅｃｋｉａｎｄＶｉｌｌｅ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４，６１０−６１２により記載された方法と同様の方法を用いて化合物３を製造した。彼らの結果とは逆に、我々は、ｔ−ブチルジメチルシリルのかわりに酸により耐性のｔ−ブチルジフェニルシリル基を５−Ｏ−保護に用いることにより、表題化合物を得ることに成功した。１−デオキシ−１−フェニル−β−Ｄ−リボフラノース（５）化合物３（１ｇ，２．０５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解し、溶液をＴＨＦ中の１ＭＴＢＡＦ（３ｍｌ，３ｍｍｏｌ）と混合した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次に蒸発させてシロップとした。残渣をシリカゲルカラムに負荷し、ヘキサン、続いてヘキサン中５−７０％酢酸エチルの勾配で溶出した。５−Ｏ−脱シリル化生成物を無色泡状物として得た（０．６２ｇ，収率８８％）。この物質を７０％酢酸に溶解し、１００℃（湯浴）で３０分間加熱した。減圧下で蒸発乾固させ、残留シロップをトルエンから結晶化させて、５を得た（０．４９ｇ，収率９４％）、ｍｐ１２Ｏ−１２１℃。２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−１−デオキシ−１−フェニル−β−Ｄ−リボフラノース（７）化合物５（７７０ｍｇ，３．６６ｍｍｏｌ）を標準的方法（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＧａｉｔＥｄ．；ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４，ｐ２７）にしたがって５−Ｏ−ジメトキシトリチル化して、１．４ｇ（収率７５％）の５−Ｏ−ジメトキシトリチル誘導体を黄色泡状物として得、続いてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０．５−２％メタノールの勾配）を行った。この物質をＨａｋｉｍｅｌａｈｉｅｔａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９８２，６０，１１０６−１１１３に記載される条件下で塩化ｔ−ブチルジメチルシリルで処理し、反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中２−１０％酢酸エチルの勾配）により精製して、より遅く移動する２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ異性体７（０．６ｇ，収率３５％）を無色泡状物として得た。より速く移動する３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ異性体６もまた単離した（０．５５ｇ，収率３２％）。２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−１−デオキシ−１−フェニル−β−Ｄ−リボフラノース（８）化合物７（０．８７ｇ，１．３９ｍｍｏｌ）を、Ｔｕｓｃｈｌｅｔａｌ．，上掲に記載される条件下でホスフィチル化し、溶出にトルエン中０．５％酢酸エチル（１％Ｅｔ₃Ｎ）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより生成物を単離した（０．８５ｇ，収率７４％）。実施例２６：シュードウリジン、３−メチルウリジンおよび２，４，６−トリメトキシベンゼンヌクレオシドホスホルアミダイトの合成ホスホルアミダイトは、シュードウリジン、３−メチルウリジンまたは２，４，６−トリメトキシベンゼンヌクレオシド（Ｇａｓｐａｒｕｔｔｏｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９２２０，５１５９−５１６６；ＫａｌｖｏｄａａｎｄＦａｒｋａｓ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ１，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．ａｎｄＴｉｐｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｅｄ．；Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７８，ｐ４８１−４８４）から出発して、以下に記載する標準的プロトコルにより製造することができる（図４１）。ＴＢＤＭＳ基の導入の一般的方法：５０ｍＬの乾燥ＴＨＦおよびピリジン（４ｅｑ）中の保護ヌクレオシドの撹拌溶液に、ＡｇＮＯ₃（２．４ｅｑ）を加えた。１０分後、塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（１．５ｅｑ）を加え、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過して１００ｍＬの５％水性ＮａＨＣＯ₃中に入れた。溶液をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上でヘキサン−酢酸エチル（３：２）混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ホスフィチル化の一般的方法：乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の保護ヌクレオシド（１ｍｍｏｌ）の氷冷撹拌溶液に、ジクロロメタン（３ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｅｑ）および２−シアノエチルＮ’Ｎ −ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．２ｅｑ）の予め混合した溶液をアルゴンブランケット下でシリンジを用いて滴加した。同時に、別のシリンジで、Ｎ−メチルイミダゾール（１ｅｑ）を加え、室温で２時間撹拌を続けた。その後、反応混合物を再び氷冷し、１５ｍｌの乾燥メタノールで急冷した。５分間撹拌した後、混合物を真空下で（＜４０℃）濃縮し、シリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン−酢酸エチル混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、対応するホスホルアミダイトを白色泡状物として得た。シュードウリジン、３−メチルウリジンまたは２，４，６−トリメトキシベンゼンホスホルアミダイトは、Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ，１９９５上掲に記載のように、固相合成を用いてリボザイム中に取り込ませた。リボザイムは、シュードウリジンを有するリボザイムを除き、上述の標準的プロトコルを用いて脱保護した。シュードウリジン修飾リボザイムは、エタノール性アンモニア（３：１）の混合物中で、５５℃、２４時間のかわりに、まず室温でインキュベーションすることにより脱保護した。実施例２７：ジヒドロウリジンホスホルアミダイトの合成図４２を参照すると、ジヒドロウリジンホスホルアミダイトを、Ｃｈａｉｘｅｔａｌ，１９８９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１７，７３８１− ７３９３に記載される方法に基づいて、所定の改良を加えて合成した。ｉ．ウリジン（１；１０ｇ，４１ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの蒸留水に溶解し、この溶液に２ｇのＲｈ（アルミナ上１０％）を加えた。スラリーを水素６０ｐｓｉとし、水素化を１６時間続けた。ＵＶ吸収物質の消失により反応を監視した。出発物質はすべてジヒドロウリジン（ＤＨＵ）およびテトラヒドロウリジン（ＮＭＲに基づいて２：１）に転換された。テトラヒドロウリジンはこの段階では除去しなかった。ｉｉ．ジヒドロウリジン（２；１０ｇ，４１ｍｍｏｌ）を４００ｍｌの乾燥ピリジンに溶解した。ジメチルアミノピリジン（０．２４４ｇ，２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（７．９３ｍｌ，５６ｍｍｏｌ）、および塩化ジメトキシトリチル（１６．３ｇ，４８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下で一夜撹拌した。反応を５０ｍｌのメタノールで急冷し、４００ｍの１５％炭酸水素ナトリウムで、次に４００ｍｌのブラインで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、次に乾燥して泡状物とした。５’−ＤＭＴ−ＤＨＵ（３）は、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０．５−５％メタノール勾配）により精製した。最終収量＝９ｇ；１６．４ｍｍｏｌ。ｉｉｉ．５’−ＤＭＴ−ＤＨＵ（３；９．０ｇ，１６．４ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解した。ピリジン（４．９ｍｌ，６０ｍｍｏｌ）および硝酸銀（３．３５ｇ，１９．７ｍｍｏｌ）を室温で加え、アルゴン下で１０分間撹拌し、次に塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ｔＢＤＭＳ−Ｃｌ；３．０ｇ，１９．７ｍｍｏｌ）を加え、スラリーをアルゴン下で一夜撹拌した。反応溶液をセライトを通して濾過して５００ｍｌの水性５％炭酸水素ナトリウム中に入れ、次に２００ｍｌのクロロホルムで抽出した。有機相を２５０ｍｌのブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、次に蒸発させて黄色泡状物とした。２’−ｔＢＤＭＳ，５’−ＤＭＴ−ＤＨＵ（５）は、シリカゲルクロマトグラフィーにより３’−ｔＢＤＭＳ，５’−ＤＭＴ−ＤＨＵ（４）から精製し（ヘキサン中１０ −５０％エーテルの勾配）、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、次に乾燥して白色粉末とした。最終収量＝５．１ｇ；７．７ｍｍｏｌ。生成物を高真空下に４８時間保持した。ｉｖ．５’−ＤＭＴ，２’−ｔＢＤＭＳ−ＤＨＵ（５；２．１０ｇ，３．１７ｍｍｏｌ）を４０ｍｌ無水ジクロロメタンに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２．２１ｍｌ，１２．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１．２７ｍｌ，１．５９ｍｍｏｌ）、およびクロロ−ジイソプロピルシアノエチルホスホルアミダイト（１．２ｍｌ，５．２２ｍｍｏｌ）を加え、反応溶液をアルゴン下で３時間撹拌した。反応を４ｍｌの無水メタノールで急冷し、次に蒸発させて油状物とした。最終生成物（６）は、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０−１％エタノール；１％トリエチルアミン）により精製した。最終収量＝２．２ｇ；２．５ｍｍｏｌ。ジヒドロウリジンは、Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５（上掲）に記載されるようにして、改良を加えて、固相合成を用いてリボザイム中に取り込ませた。すなわち、ヌクレオシドオキサリルポリスチレン誘導化支持体（Ａｌｕｌｅｔ．ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９１，１９，１５２７−１５３２）を用いた。ジヒドロウリジン置換を含むリボザイムを、無水エタノール中３０％メチルアミンを用いて室温で１５分間脱保護し、次に無水ＴＨＦ中のフッ化ｔｅｒｔ−ブチル−アンモニウムで室温で２４時間処理した。実施例２８：２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −１−デオキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−リボフラノース（７）ホスホルアミダイトの合成１−デオキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−リボフラノース（４）図４５を参照すると、表題化合物は、Ｏｈｒｕｉｅｔａｌ．，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７２，３６，１６５１−１６５３の方法にしたがって、ナフタレン１およびテトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース２から合成した。２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−１−デオキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−リボフラノース（７）７は、４から３段階で合成した：ａ）４，４’−ジメトキシトリチルトリフレートを用いる５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化、続いてクロマトグラフィーによるαおよびβアノマーそれぞれの分離；ｂ）２’−Ｏ−シリル化はＨａｋｉｍｅｌａｈｉｅｔａｌ.，１９８２(上掲)に記載のように実施した(収率３２％) ；ｃ）３’−Ｏ−ホスフィチル化は、本質的にＴｕｓｃｈｌｅｔａｌ．，１９９３（上掲）に記載のように実施した（収率８５％）。このホスホルアミダイトは、Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５（上掲）に記載のように、固相合成を用いてリボザイム中に取り込ませる。ナフチル置換を含むリボザイムを上述の標準的プロトコルを用いて脱保護した。実施例２９：２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −１−デオキシ−１−（ｐ−アミノフェニル）−β−Ｄ−リボフラノースホスホルアミダイトの合成５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−１−デオキシ−１−（ｐ−ブロモフェニル）−β−Ｄ−リボフラノース（３）図４６を参照すると、３は、４−ブロモ−１−リチオベンゼンおよびｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボノ−１，４−ラクトンから、ＣｚｅｒｎｅｃｋｉａｎｄＶｉｌｌｅ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４，６１０−６１２に記載の方法と同様の方法を用いて製造した。彼らの結果とは逆に、我々は、５−Ｏ−保護にｔ−ブチルジメチルシリルのかわりに酸により耐性のｔ−ブチルジフェニルシリル基を用いることにより、表題化合物を得ることに成功した。５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−１−デオキシ−１−（ｐ−アミノフェニル）−β−Ｄ−リボフラノース（５）化合物３は、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉｅｔａｌ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９１，７４，３９７−４０６に記載のように、液体アンモニアおよびＣｕｌを用いてアミノ化して、表題化合物を収率６３％で得た。５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−１−デオキシ−１−［ｐ−（Ｎ−ＴＦＡ）アミノフェニル］−β−Ｄ−リボフラノース（６）乾燥ピリジン（２０ｍｌ）中の５（１．２ｇ，２．８８ｍｍｏｌ）を無水トリフルオロ酢酸（０．５ｍｌ，３．６ｍｍｏｌ）で０℃で１時間処理した。次に、反応混合物をメタノール（５ｍｌ）で急冷し、蒸発させてシロップとした。シロップを５％水性ＮａＨＣＯ₃とジクロロメタンとの間に分配し、有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、減圧下で蒸発乾固させた。この物質をさらに精製することなく次の段階で用いた。１−デオキシ−１−［ｐ−（Ｎ−ＴＦＡ）アミノフェニル］−β−Ｄ−リボフラノース（７）表題化合物は、脱保護フェニル類似体の合成と同一の方法により６から製造した（５’−Ｏ−脱シリル化および２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン基の切断についての総収率８２％）。２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−１−デオキシ−１−［ｐ−（Ｎ−ＴＦＡ）アミノフェニル］−β−Ｄ−リボフラノース（１０）フェニル類似体の場合と同一の３段階の順番を用いて、７から１０を総収率３２％で得た。このホスホルアミダイトは、Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５（上掲）に記載されるように、固相合成を用いてリボザイム中に取り込ませた。アミノフェニル置換を含むリボザイムは、上述の標準的プロトコルを用いて脱保護した。実施例３０：修飾塩基で置換されたＨＨ−Ｂにより触媒されるＲＮＡ切断反応部位Ｂを標的とするハンマーヘッドリボザイム（図４３Ａを参照されたい）を上述のように固相合成を用いて合成した。Ｕ４およびＵ７位を図４３Ｂに示される種々の塩基修飾で置換した。ＲＮＡ切断反応は上述のように実施した。図４３Ｂを参照すると、４位および７位に塩基修飾を含むハンマーヘッドリボザイムは、様々な程度の効率で標的ＲＮＡを切断した。７位における塩基修飾のあるものは、その位置における標準的塩基と比較して、ハンマーヘッドリボザイムの触媒効率を増強するようである( 図４３Ｂ,ピリジン−４−オン、フェニルおよび３−メチルＵ修飾を参照されたい)。７位にピリジン−４−オン置換またはフェニル置換のいずれかを有するＨＨ− Ｂリボザイムをさらに特徴づけした（図４４）。７位にピリジン−４−オン修飾を有するＨＨ−Ｂリボザイムは、７位にＵを有するリボザイムと比較して、１０倍高いｋ_catでＲＮＡを切断するようである(図４４Ａと４４Ｂを比較されたい) 。７位にフェニル基を有するＨＨ−Ｂリボザイムは、７位にＵを有するハンマーヘッドリボザイムより３倍高いｋ_catでＲＮＡを切断する（図４４Ｃを参照されたい）。図２３、３１、３３、３５、４３に掲げられる配列およびこれらの図に記載される修飾は、非限定的例を意味する。当業者は、アミノ酸、ペプチドおよびコレステロール等の（これらに限定されない）他の２’−ヒドロキシル基修飾を含むリボザイムおよびＲＮＡの変異体（塩基置換、削除、挿入、突然変異、化学的修飾）が、当該技術分野において知られた技術を用いて容易に生成しうること、およびこれらも本発明の範囲内であることを認識するであろう。実施例３１：２’デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド表Ｄ２は、短い基質に対するインビトロでの特定の触媒パラメーター（ｔ_Aおよびｔ_S）および示される修飾触媒的核酸のヒト血清中における安定性の概要である。Ｕ４およびＵ７は、図１に示されるウラシル塩基を表す。２’位における修飾が表に示される。図４７は、ハンマーヘッドモチーフの塩基の番号づけを示し、ここではハンマーヘッドリボザイム中の種々のヌクレオチドの番号づけが与えられる。図４７を参照すると、ハンマーヘッドリボザイムの触媒コアの５’−から３’−方向の好ましい配列はＣＵＧＡＮＧＡＧＣＧＡＡＡ［と塩基対形成］である。本発明においては、ハンマーヘッドリボザイムの触媒活性および／またはヌクレアーゼ耐性を維持または増強する２’−Ｃ−アルキル置換ヌクレオチドの使用が記載される。任意のヌクレオチドを図４８に示される任意の修飾ヌクレオチドで置換することが可能であるが、そしてこれらは実際に合成されたが、主として選択された置換を有する２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオチドからなる基本構造が、最大の触媒活性を維持するために（Ｙａｎｇｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２，３１，５００５−５００９およびＰａｏｌｅｌｌａｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．１９９２，１１，１９１３−１９１９）、および合成の容易さのために選択された。しかし、これらは本発明を限定するものではない。図４７および表Ｄ２からのリボザイムを合成し、触媒活性およびヌクレアーゼ耐性についてアッセイした。８および１７を除き、全ての修飾リボザイムは、野生型の触媒活性の少なくとも１／１０を維持していた。表Ｄ２から、すべての２ ’修飾リボザイムは、ヒト血清(示されている)および以下に示される他の体液( 実施例３、データは示されていない)において、安定性の非常に大きくかつ有意の増加を示した。最も強いヌクレアーゼ活性の順番は、ウシ胎児血清＞ヒト血清＞ヒト血漿＞ヒト滑液であった。これらの２’−置換の安定性および活性に及ぼす影響の総合的な測定として、比βを計算した（表Ｄ２）。このβ値は、試験した全ての修飾リボザイムが総合的な安定性および活性について有意な（１００倍より高い−１７００倍より高い）増加を有することを示した。このようなβの増加は、これらの修飾リボザイムのインビボでの寿命が有意に増加し、このことによりより強い生物学的効果がもたらされるであろうことを示す。図４８からの２’−修飾ヌクレオチドのより一般的な置換もまた、得られた修飾リボザイムのｔ_1/2を増加させた。しかし、これらのリボザイムの触媒活性は１０倍より大きく低下した。図５３においては、化合物３７は誘導化２’−Ｃ−アルキルホスホルアミダイトを製造するための一般的中間体として用いることができる（式中、ＸはＣＨ₃ またはアルキル、または上述した他の基である）。以下は、２’−Ｃ−アルキル置換ホスホルアミダイトを用いる核酸の合成、アミダイトの合成、およびこれらの酵素的活性およびヌクレアーゼ耐性についての試験を示す別の非限定的例である。これらの例は、図４８−５４に図解される。実施例３２：２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドおよび他の２’修飾ヌクレオチドを含むハンマーヘッドリボザイムの合成用いた合成方法は、一般に、Ｕｓｍａｎ，Ｎ．；Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｋ．Ｋ．；Ｊｉａｎｇ，Ｍ．−Ｙ．；Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，７８４５−７８５４およびＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．；Ｆｒａｎｋｌｙｎ，Ｃ．；Ｕｓｍａｎ，Ｎ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，５４３３−５４４１に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい、慣用の核酸保護基およびカップリング基、例えば５’末端にジメトキシトリチル、および３’末端にホスホルアミダイトを用いた（化合物１０、１２、１７、２２、３１、１８、２６、３２、３６および３８）。他の２’修飾ホスホルアミダイトは、次のものにしたがって製造した。３および４：Ｅｃｋｓｔｅｉｎｅｔａｌ．国際公開ＷＯ９２／０７０６５；および５：Ｋｏｉｓｅｔａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９９３，１２，１０９３−１１０９。平均段階カップリング収率は約９８％であった。図５に示されるように、２’−置換ホスホルアミダイトをハンマーヘッドリボザイム中に取り込ませた。しかし、これらの２’−アルキル置換ホスホルアミダイトは、ハンマーヘッドリボザイムのみならず、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩまたはグループＩＩイントロンの触媒的核酸に、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り込ませることができる。したがって、これらは、任意の核酸構造において一般的に使用しうる。実施例３３：リボザイム活性アッセイ精製５’末端標識ＲＮＡ基質（１５−２５ｍｅｒ）および精製５’末端標識リボザイム（〜３６ｍｅｒ）を別々にいずれも９５℃に加熱し、氷上で急冷し、３７℃で平衡化した。リボザイム保存溶液は、１ｍＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭまたは８ｎＭであり、最終基質ＲＮＡ濃度は、約１ｎＭであった。総反応容量は５０ｍＬであった。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５および１０ｍＭＭｇＣｌ₂であった。反応は基質とリボザイム溶液とをｔ＝０において混合することにより開始した。１、５、１５、３０、６０および１２０分の時点において５ｍＬのアリコートを取り除いた。それぞれの時点のアリコートをホルムアミド負荷緩衝液中で急冷し、分析のために１５％変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。定量的分析は、ホスファーイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を用いて実施した。実施例３４：安定性アッセイ５００ｐｍｏｌのゲル精製５’末端標識リボザイムをエタノール中で沈殿させ、遠心分離によりペレット化した。それぞれのペレットを、室温で２０秒間ボルテックスすることにより、２０ｍＬの適当な液体（ヒト血清、ヒト血漿、ヒト滑液またはウシ胎児血清）中に懸濁させた。試料を３７℃のインキュベーター中に置き、０、１５、３０、４５、６０、１２０、２４０および４８０分のインキュベート後に、２ｍＬのアリコートを回収した。９５％ホルムアミドおよび０．５ ×ＴＢＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ）を含む２０ｍＬの溶液にアリコートを加えて、さらなるヌクレアーゼ活性を急冷し、ゲルに負荷するまで試料を凍結した。リボザイムは、２０％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル中で電気泳動によりサイズ分画した。ホスファーイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）でバンドをスキャンすることによりそれぞれの時点における無傷のリボザイムの量を定量し、無傷のリボザイムのパーセンテージをインキュベーション時間に対してプロットし、グラフを外挿することにより、それぞれのリボザイムの半減期を決定した。実施例３５：３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３− ジイル）−２’−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−ウリジン（７）３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）− ウリジン、６（１５．１ｇ，３１ｍｍｏｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．ＬｅｒｏｙＴｏｗｎｓｅｎｄ，１９８６ｐｐ．２２９ −２３１にしたがって合成）およびジメチルアミノピリジン（７．５７ｇ，６２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、５０ｍＬのアセトニトリル中のフェニルクロロチオノホルメート（５．１５ｍＬ，３７．２ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、反応溶液を８時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン／１：１）は出発物質の消失を示した。反応混合物を蒸発させ、残渣をクロロホルムに溶解し、水およびブラインで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して、蒸発乾固させた。残渣をシリカゲル上でＥｔＯＡｃ：ヘキサン／２：１を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１６．４４ｇ（８５％）の７を得た。実施例３６：３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１．３− ジイル）−２’−Ｃ−アリル−ウリジン（８）乾燥トルエン中の３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−ウリジン、７（５ｇ，８．０３ｍｍｏｌ）およびアリルトリブチルチン（１２．３ｍＬ，４０．１５ｍｍｏｌ）のアルゴン下で還流している溶液に、過酸化ベンゾイル（０．５ｇ）を１時間かけて少しずつ加えた。得られた混合物をアルゴン下でさらに７−８時間還流させた。次に反応溶液を蒸発させ、生成物８をシリカゲル上でＥｔＯＡｃ：ヘキサン／１：３を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量２．８２ｇ（６８．７％）。実施例３７：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−ウリジン（９）１０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の８(１．２５ｇ，２．４５ｍｍｏｌ)の溶液を、ＴＨＦ中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液(３．７ｍＬ)で室温で１０分間処理した。得られた混合物を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムに負荷し、ＩＬのクロロホルムで洗浄し、所望の脱保護化合物をクロロホルム：メタノール／９：１で溶出した。適当な画分を合わせ、溶媒を蒸発により除去し、残渣を乾燥ピリジンと共蒸発させることにより乾燥させた。油状残渣を乾燥ピリジンに再溶解し、塩化ジメトキシトリチル（１．２ｅｑ）を加え、反応混合物を無水状態に一夜放置した。反応をメタノール（２０ｍＬ）により急冷し、蒸発させ、クロロホルムに溶解し、５％水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上で、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン／１：１を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、０．８５ｇ（５７％）の９を白色泡状物として得た。実施例３８：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−ウリジン−３ ’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１０）５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−ウリジン（０．６４ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を乾燥アルゴン下で乾燥ジクロロメタンに溶解した。Ｎ，Ｎ −ジイソプロピルエチルアミン（０．３９ｍＬ，２．２４ｍｍｏｌ）を加え、溶液を氷冷した。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３５ｍＬ，１．５７ｍｍｏｌ）を撹拌した反応溶液に滴加し、室温で撹拌を２時間続けた。次に反応混合物を氷冷し、１２ｍＬの乾燥メタノールで急冷した。５分間撹拌した後、混合物を真空下で濃縮し（４０℃）、シリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中１０−６０％ＥｔＯＡｃ勾配の混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：０．７８ｇ（９０％）、白色泡状物。実施例３９：３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３− ジイル）−２’−Ｃ−アリル−Ｎ⁴−アセチル−シチジン（１１）トリエチルアミン（６．３５ｍＬ，４５．５５ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの無水アセトニトリル中の１，２，４−トリアゾール（５．６６ｇ，８１．９９ｍｍｏｌ）およびオキシ塩化リン（０．８６ｍＬ，９．１１ｍｍｏｌ）の撹拌氷冷混合物に滴加した。得られた懸濁液に、３０ｍＬのアセトニトリル中の３’，５’−Ｏ −（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｃ−アリルウリジン（２．３２ｇ，４．５５ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応溶液を真空下で最小容量まで濃縮した（乾固させない）。残渣をクロロホルムに溶解し、水、飽和水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。得られた泡状物を５０ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解し、２９％水性ＮＨ₄ＯＨで室温で一夜処理した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール／９：１）は、出発物質の完全な転換を示した。溶液を蒸発させ、無水ピリジンと共蒸発させることにより乾燥し、ピリジン中の無水酢酸（０．５２ｍＬ，５．４６ｍｍｏｌ）で一夜アセチル化した。反応混合物をメタノールで急冷し、蒸発させ、残渣をクロロホルムに溶解し、炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させ、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中３％ＭｅＯＨ）により精製した。収量２．３ｇ（９０％）、白色泡状物。実施例４０：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−Ｎ⁴−アセチルシチジンこの化合物は、ウリジン誘導体９と同様にして、収率５５％で得られた。実施例４１：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−Ｎ⁴−アセチル−シチジン３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１２）２’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−Ｎ⁴−アセチルシチジン（０．８ｇ，１．３１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で乾燥ジクロロメタンに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４６ｍＬ，２．６２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を氷冷した。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３８ｍＬ，１．７ｍｍｏｌ）を撹拌反応溶液に滴加し、室温で２時間撹拌を続けた。次に反応混合物を氷冷し、１２ｍＬの乾燥メタノールで急冷した。５分間撹拌した後、混合物を真空下で濃縮し（４０℃）、シリカゲル上で２％トリエチルアミンを含むクロロホルム：エタノール／９８：２の混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：０．９１ｇ（８５％）、白色泡状物。実施例４２：２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジンＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’ −Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン１４（Ｈａｎｓｓｋｅ，Ｆ．；Ｍａｄｅｊ，Ｄ．；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９８４，４０，１２５およびＭａｔｓｕｄａ，Ａ．；Ｔａｋｅｎｕｋｉ，Ｋ．；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．；Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．；Ｕｅｄａ，Ｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９１，３４，８１２）（２．２ｇ，４．５５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１ＭＴＢＡＦで２０分間処理し、真空下で濃縮した。残渣を石油エーテル中で砕き、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン（１．０ｇ，３．３ｍｍｏｌ，７２．５％）は、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の２０％ＭｅＯＨで溶出された。実施例４３：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン（１５）２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン（０．９１ｇ，３．７９ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌの溶液を１５分間かけて滴加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて反応を急冷した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ₂ Ｃｌ₂（１００ｍＬ）中に取り、飽和ＮａＨＣＯ₃、水およびブラインで洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを溶出液として用いてシリカゲルカラムにより精製して、１５（０．４３ｇ，０．７９ｍｍｏｌ，２２％）を得た。実施例４４：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン３ ’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１７）乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍＬ）中に溶解した１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ウラシル（０．４３ｇ，０．８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で丸底フラスコ中に入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．２８ｍＬ，１．６ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．２５ｍＬ，１．１２ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、エタノール（１ｍＬ）で急冷した。１０分後混合物を真空下で（４０℃）蒸発させてシロップとした。生成物（０．３ｇ，０．４ｍｍｏｌ，５０％）はシリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中２５−７０％ＥｔＯＡｃ勾配を溶出液として用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｒｆ０．４２（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ１５：１）。実施例４５：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３− ジイル）ウリジン１４（１．９２ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（２．５ｇ，９．２５ｍｍｏｌ）をジグリム（２０ｍＬ）に溶解し、１６０℃の湯浴温度に加熱した。ジグリム（５０ｍＬ）中のクロロジフルオロ酢酸ナトリウムの温溶液（６０℃）を約１時間かけて加えた（平衡滴下ロートから滴加）。得られた混合物をさらに２時間撹拌し、真空下で濃縮した。残渣をＣＨ₂ Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ −２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン（３．１ｇ，５．９ｍｍｏｌ，７０％）は、ＥｔＯＡｃ中２５％ヘキサンにより溶出された。実施例４６：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジンＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’ −Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン（３．１ｇ，５．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１ＭＴＢＡＦで２０分間処理し、真空下で濃縮した。残渣を石油エーテル中で砕き、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン（１．１ｇ，４．０ｍｍｏｌ，６８％）は、ＣＨ₂Ｃｌ₂中２０％ＭｅＯＨで溶出された。実施例４７：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン− ウリジン（１６）２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン（１．１ｇ，４．０ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ− Ｃｌ（１．４２ｇ，４．１８ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間かけて滴加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて反応を急冷した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）中に取り、飽和ＮａＨＣＯ₃、水およびブラインで洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、シリカゲルカラム上で４０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを溶出液として用いて精製し、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン１６（１．０５ｇ，１．８ｍｍｏｌ，４５％）を得た。実施例４８：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン− ウリジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１８）乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍＬ）中に溶解した１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（０．５７７ｇ，１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で丸底フラスコに入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｍＬ，２ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４４ｍＬ，１．４ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、エタノール（１ｍＬ）で急冷した。１０分後、混合物を真空下で（４０℃）蒸発させてシロップとした。生成物（０．４０４ｇ，０．５２ｍｍｏｌ，５２％）は、シリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中２０−５０％ＥｔＯＡｃ勾配を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。Ｒｆ０．４８（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ／１５：１）。実施例４９：２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン（２０）トリエチルアミン（４．８ｍＬ，３４ｍｍｏｌ）を、０℃において、アセトニトリル（２０ｍＬ）中のＰＯＣｌ₃（０．６５ｍＬ，６．８ｍｍｏｌ）および１，２，４−トリアゾール（２．１ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ −（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン１９（１．６５ｇ，３．４ｍｍｏｌ）の溶液を上述の反応混合物に滴加し、室温で４時間撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１００ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、ジオキサン（１０ｍＬ）および水性アンモニア（２０ｍＬ）に溶解した。混合物を１２時間撹拌し、真空下で濃縮した。残渣を無水ピリジン（２×２０ｍＬ）と共沸させた。ピリジンに溶解した残渣に無水酢酸（３ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ₃（５ｍＬ）で急冷した。混合物を真空下で濃縮し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１００ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃ （１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチルシチジン２０（１．３ｇ，２．５ｍｍｏｌ，７３％）はヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃで溶出された。実施例５０：１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン（２１）ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’ −Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン２０（１．３ｇ，２．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）中の１ＭＴＢＡＦで２０分間処理し、真空下で濃縮した。残渣を石油エーデル中で砕き、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ−２’−メチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．５６ｇ，１．９９ｍｍｏｌ，８０％）は、ＣＨ₂Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで溶出された。２’−デオキシ−２’−メチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．５６ｇ，１．９９ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（０．８１ｇ，２．４ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間かけて滴加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて反応を急冷した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）中に取り、飽和ＮａＨＣＯ₃（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、シリカゲルカラム上でＥｔＯＡｃ：ヘキサン／６０：４０を溶出液として用いて精製して、２１（０．８８ｇ，１．５ｍｍｏｌ，７５％）を得た。実施例５１：１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン３’−（２− シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２１）乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）中に溶解した１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン２１（０．８８ｇ，１．５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で丸底フラスコ中に入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍＬ，４．５ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４ｍＬ，１．８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、エタノール（１ｍＬ）で急冷した。１０分後、混合物を真空下で（４０℃ ）蒸発させてシロップとした。生成物２２（０．８２ｇ，１．０４ｍｍｏｌ，６９％）をシリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中５０−７０％ＥｔＯＡｃ勾配を溶出液として用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。Ｒｆ０．３６（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ／２０：１）。実施例５２：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン（２４）Ｅｔ₃Ｎ（６．９ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）を、０℃において、アセトニトリル（２０ｍＬ）中のＰＯＣｌ₃（０．９４ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）および１，２，４− トリアゾール（３．１ｇ，４５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン２３（［実施例４５に記載］２．６ｇ，５ｍｍｏｌ）の溶液を上述の反応混合物に滴加し、室温で４時間撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１００ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＮａ₂ＳＯ₄ で乾燥し、真空下で濃縮し、ジオキサン（２０ｍＬ）および水性アンモニア（３０ｍＬ）に溶解した。混合物を１２時間撹拌し、真空下で濃縮した。残渣を無水ピリジン（２×２０ｍＬ）と共沸させた。ピリジンに溶解した残渣に無水酢酸（５ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ₃（５ｍＬ）で急冷した。混合物を真空下で濃縮し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１００ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン２４（２．２ｇ，３．９ｍｍｏｌ，７８％）は、ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃで溶出された。実施例５３：１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン( ２５) ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン− ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４− Ｎ−アセチル−シチジン２４（２．２ｇ，３．９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３ｍＬ）中の１ＭＴＢＡＦで２０分間処理し、真空下で濃縮した。残渣を石油エーテル中で砕き、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．８９ｇ，２．８ｍｍｏｌ，７２％）はＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％ＭｅＯＨで溶出された。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．８９ｇ，２．８ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（１．０３ｇ，３．１ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間かけて滴加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて反応を急冷した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）中に取り、飽和ＮａＨＣＯ₃（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、シリカゲルカラム上でＥｔＯＡｃ：ヘキサン／６０：４０を溶出液として用いて精製して、２５（１．２ｇ，１．９ｍｍｏｌ，６８％）を得た。実施例５４：１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチルシトシン３’ −（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（２６）乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）に溶解した１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４ −Ｎ−アセチルシトシン２５（０．６ｇ，０．９７ｍｍｏｌ）をアルゴン下で丸底フラスコ中に入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ，２．９ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４ｍＬ，１．８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、エタノール（１ｍＬ）で急冷した。１０分後、混合物を真空下で（４０℃）蒸発させてシロップとした。白色泡状物の生成物２６（０．５２ｇ，０．６３ｍｍｏｌ，６５％）は、シリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中３０−７０％ＥｔＯＡｃ勾配を溶出液として用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。Ｒｆ０．４８（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ／２０：１）。実施例５５：２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン −１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２８）無水酢酸（４．６ｍＬ）を、ＤＭＳＯ（３７ｍＬ）中の３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｌｏｕ，Ｃ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．；Ｍｏｄａｋ，Ａ．：Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．；Ｓｉｂａｎｄａ，Ｓ．；Ｕｂａｓａｗａ，Ａ．Ｊ．ＣｈｅｍＳｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ．１９８９，１７３５）（６．２ｇ，９．２ｍｍｏｌ）の溶液に加え、得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物を真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ中に取り、水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して、２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）アデノシン２８（４．８ｇ，７．２ｍｍｏｌ，７８％）を得た。実施例５６：２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２９）アルゴン加圧下、ヘキサン（１１．２ｍＬ，１４．６ｍｍｏｌ）中のｓｅｃ− ブチルリチウムを、−７８℃に冷却したＴＨＦ（２５ｍＬ）中のヨウ化トリフェニルメチルホスホニウム（７．０７ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。均一なオレンジ色の溶液を−３０℃に暖め、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の２’−ケト −３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６ −Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン２８（４．８７ｇ，７．３ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン加圧下でこの混合物に移した。室温に暖めた後、２４時間撹拌を続けた。ＴＨＦを蒸発させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍＬ）で置き換え、水（２０ｍＬ）を加え、溶液を２％ＨＣｌの冷却溶液で中和した。有機層をＨ₂ Ｏ（２０ｍＬ）、５％水性ＮａＨＣＯ₃（２０ｍＬ）、中性とするためにＨ₂Ｏ、およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）後、溶媒を真空下で蒸発させて、粗化合物を得、これをシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。軽石油エーテル：ＥｔＯＡｃ／７：３による溶出により、純粋な２’ −デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン２９（３．８６ｇ，５．８ｍｍｏｌ，７９％）を得た。実施例５７：２’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシンＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解した２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’ −Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４− ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（３．８６ｇ，５．８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）中の１ＭＴＢＡＦで２０分間処理し、真空下で濃縮した。残渣を石油エーテル中で砕き、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。２ ’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（１．８ｇ，４．３ｍｍｏｌ，７４％）は、ＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％ＭｅＯＨにより溶出された。実施例５８：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）アデノシン（２９）２’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）− アデノシン（０．７５ｇ，１．７７ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（０．６６ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間かけて滴加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて反応を急冷した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ₂ Ｃｌ₂（１００ｍＬ）中に取り、飽和ＮａＨＣＯ₃、水およびブラインで洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、５０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを溶出液として用いてシリカゲルカラムで精製して、２９（０．８１ｇ，１．１ｍｍｏｌ，６２％）を得た。実施例５９：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４ −ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（３１）乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍＬ）に溶解した１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−Ｎ−（４ −ｔ−ブチルベンゾイル）−アデニン２９をアルゴン下で丸底フラスコ中に入れた。ジイソプロピルエチルアミンを加え、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトを滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、エタノール（１ｍＬ）で急冷した。１０分後、混合物を真空下で（４０℃ ）蒸発させてシロップとした。生成物をシリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中の３０−５０％ＥｔＯＡｃ勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（０．７ｇ，０．７６ｍｍｏｌ，６８％）。Ｒｆ０．４５（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ／２０：１）実施例６０：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３− ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）アデノシン２８（６．７ｇ，１０ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（２．９ｇ，１１ｍｍｏｌ）をジグリム（２０ｍＬ）に溶解し、１６０℃の湯浴温度に加熱した。ジグリム（５０ｍＬ）中のクロロジフルオロ酢酸ナトリウム（２．３ｇ，１５ｍｍｏｌ）の温溶液（６０℃）を約１時間かけて加えた（平衡滴下ロートから滴加）。得られた混合物をさらに２時間撹拌し、真空下で濃縮した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上でクロマトグラフィーを行った。．２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（４．１ｇ，６．４ｍｍｏｌ，６４％）は、ＥｔＯＡｃ中１５％ヘキサンで溶出された。実施例６１：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ− ブチルベンゾイル）−アデノシンＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン− ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６− Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（４．１ｇ，６．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１ＭＴＢＡＦで２０分間処理し、真空下で濃縮した。残渣を石油エーテル中で砕き、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）アデノシン（２．３ｇ，４．９ｍｍｏｌ，７７％）は、ＣＨ₂Ｃｌ₂ 中２０％ＭｅＯＨで溶出された。実施例６２：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン− ６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（３０）２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２．３ｇ，４．９ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌの溶液を１５分間かけて滴加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて反応を急冷した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）中に取り、飽和ＮａＨＣＯ₃、水およびブラインで洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、シリカゲルカラム上で５０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを溶出液として用いて精製して、３０（２．６ｇ，３．４１ｍｍｏｌ，６９％）を得た。実施例６３：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン− ６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（３２）乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（２５ｍＬ）に溶解した１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６ −Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデニン３０（２．６ｇ，３．４ｍｍｏｌ）をアルゴン下で丸底フラスコに入れた。ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ，６．８ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．０６ｍＬ，４．７６ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、エタノール（１ｍＬ）で急冷した。、１０分後、混合物を真空下で（４０℃）蒸発させてシロップとした。３２（２．３ｇ，２．４ｍｍｏｌ，７０％）は、シリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中２０−５０％ＥｔＯＡｃ勾配を溶出液として用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｒｆ０．５２（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ／１５：１）。実施例６４：２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−３’，５ ’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン（３３）メチル（トリフェニルホスホルアニリジン）アセテート（５．４ｇ，１６ｍｍｏｌ）をアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂中の２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン１４の溶液に加えた。混合物を室温で３０時間撹拌した。ＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を加え、溶液を２％ＨＣｌの冷却溶液で中和した。有機層をＨ₂Ｏ（２０ｍＬ）、５％水性ＮａＨＣＯ₃（２０ｍＬ）、中性とするためにＨ₂Ｏ、およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）後、溶媒を真空下で蒸発させて粗生成物を得、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。軽石油エーテル：ＥｔＯＡｃ／７：３による溶出により、純粋な２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン３３（５．８ｇ，１０．８ｍｍｏｌ，６７．５％）を得た。実施例６５：２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン（３４）Ｅｔ₃Ｎ・３ＨＦ（３ｍＬ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍＬ）およびＥｔ₃Ｎ（１５ｍＬ）に溶解した２’−デオキシ−２’−メトキシカルボキシメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン３３（５ｇ，９．３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。１時間後に、得られた混合物を真空下で蒸発させ、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行い、２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン３４（２．４ｇ，８ｍｍｏｌ，８６％）をＴＨＦ：ＣＨ₂Ｃｌ₂／４：１で溶出した。実施例６６：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン（３５）２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン３４（１．２ｇ，４．０２ｍｍｏｌ）をピリジン（２０ｍＬ）に溶解した。ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（１．５ｇ，４．４２ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間かけて滴加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて反応を急冷した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）中に取り、飽和ＮａＨＣＯ₃、水およびブラインで洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮し、シリカゲルカラム上でＣＨ₂Ｃｌ₂中２−５％ＭｅＯＨを溶出液として用いて精製して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ −２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン３５（２．０３ｇ，３．４６ｍｍｏｌ，８６％）を得た。実施例６７：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（３６）乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）に溶解した１−（２’−デオキシ−２’−２’− メトキシカルボニルメチリジン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ウリジン３５（２．０ｇ，３．４ｍｍｏｌ）をアルゴン下で丸底フラスコに入れた。ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ，６．８ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．９１ｍＬ，４．０８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、エタノール（１ｍＬ）で急冷した。１０分後、混合物を真空下で（４０℃）蒸発させてシロップとした。５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’ −メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ −ジイソプロピルホスホルアミダイト）３６（１．８ｇ，２．３ｍｍｏｌ，６７％）は、シリカゲル上で１％トリエチルアミンを含むヘキサン中３０−６０％ＥｔＯＡｃ勾配を溶出液として用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｒｆ０．４４（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ／９．５：０．５）。実施例６８：２’−デオキシ−２’−カルボキシメチリジン−３’，５’−Ｏ− （テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン（３７）２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン３３（５．０ｇ，１０．８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解し、１ＮＮａＯＨ溶液（５０ｍＬ）を室温で撹拌溶液に加えた。混合物を２時間撹拌し、ＭｅＯＨを真空下で除去した。１ＮＨＣｌ溶液で水性層のｐＨを４．５に調節し、ＥｔＯＡｃ（２ｘ１００ｍＬ）で抽出し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空下で濃縮して、粗生成物を得た。２’−デオキシ−２’−カルボキシメチリジン−３’ ，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン３７（４．２ｇ，７．８ｍｍｏｌ，７３％）は、ＣＨ₂Ｃｌ₂中１０−１５％ＭｅＯＨ勾配を用いてシリカゲルカラムで精製した。実施例６９：５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ウリジンからの２’− Ｃ−アリル−Ｕホスホルアミダイトの合成図５４を参照すると、ホスホルアミダイト５および８の合成スキームを簡単にするために、主要中間体４の合成における出発物質として、５’−Ｏ−ＤＭＴ− ３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ウリジン１０（標準的ＲＮＡモノマーの製造における副生成物）の可能性も調べた。Ｒｏｂｉｎｓ（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．，ＷｉｌｓｏｎＪ．Ｓ．ａｎｄＨａｎｓｓｋｅ，Ｆ．（１９８３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５，４０５９）にしたがう出発シントン１０のフェノキシチオカルボニル化は、驚くべきことに、ＴＢＤＭＳ基の注目すべき移動なしにチオエステル１１（９１％）を生成した（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，Ｆｒａｎｃｌｙｎ,Ｃ.＆Ｕｓｍａｎ,Ｎ．(１９９０) ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，５４３３−５４４１）。化合物１０および１１についての¹ＨＮＭＲデータの比較分析は、１１のＨ−２’の共鳴シグナルは出発化合物１０と比較して２．０ｐｐｍ（６．０６から４．１３）の高磁場へのシフトを示し、同時にＨ−３’およびＨ−１’の化学シフトはわずかに変化したのみであった：１１では４．８３ｐｐｍ（Ｈ−３’）および６．４８ｐｐｍ（Ｈ−１’）であり、１０では４．３６ｐｐｍ（Ｈ−３’）および５．９３ｐｐｍ（Ｈ−１’）であり、Ｈ−４’の化学シフトは実質的に変化せず、Ｃ−２−ＯＨにおけるアシル化を示した。中間体１１の２−２’−アゾビス−（２−メチルプロピオニトリル）でのヘック（Ｈｅｃｋ）アリル化（他の基は標準的な方法により導入することができる）により、２’−Ｃ−アリル誘導体１２（７０％）および関連する２’−デオキシ副生成物（１５％）が形成された。続く１２の脱シリル化により、チオエステル２から合成したものと同一の５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体４が得られた。この経路のための出発物質は商業的に入手可能であるため、このことは主要シントン４ならびに他の２’一修飾モノマーへのより労力の少ない方法である。この方法論は、化合物１１（または他の塩基についてのその均等物）を中間体として用いて他の２’−Ｃ−アリル基を導入するために用いることができる。実施例７０：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−３’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン（１１）の合成１００ｍｌの乾燥アセトニトリル中の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’− Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルウリジン（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手可能）（５．０ｇ，７．５７ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（１．８ｇ，１５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、２５ｍｌのアセトニトリル中のフェニルクロロチオホルメート（１．２６ｍｌ，９．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル− ヘキサン１：１）は、出発物質の消失を示した。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をシリカゲル上でＣＨ₂Ｃｌ₂を溶出液としてフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、５．５１ｇ（９１．３％）の生成物を得た。実施例７１：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−３’−Ｏ−ｔ −ブチルジメチルシリル−ウリジン（１２）の合成乾燥トルエン（１５０ｍｌ）中の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ− フェノキシチオカルボニル−３’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン( ５．５ｇ，６．９ｍｍｏｌ)およびアリルトリブチルチン（１０．７ｍ１，３４．５ｍｍｏｌ）のアルゴン下還流溶液に、５０ｍｌの乾燥トルエン中の２，２’ −アゾビス−（２−メチルプロピオニトリル）（０．２８ｇ，１．７２ｍｍｏｌ）の溶液を１時間かけて滴加した。得られた混合物をアルゴン下でさらに２時間還流した。その後、これを真空下で濃縮し、シリカゲル上でヘキサン中の酢酸エチルの勾配（０−３０％）を溶出液として用いて、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量３．３８ｇ（７０．０％）。実施例７２：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−３’−Ｏ−ｔ −ブチルジメチル−シリル−ウリジン（１２）からの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリルウリジン（４）の合成一般的方法Ａを用いるＴＢＤＭＳ誘導体１２の標準的脱保護により、２’−Ｃ −アリル誘導体３から製造した化合物と同一の生成物４（収率８０％）を得た。用途酵素的切断またはアンチセンス状況における使用について上述したように、本発明のアルキル置換ヌクレオチドを用いて、安定なオリゴヌクレオチドを形成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、三リン酸形態を用いて標準的方法により酵素的に形成することができる。このようなオリゴヌクレオチドの投与は標準的方法による。Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５を参照されたい。以下は、２’−Ｏ−メチルチオアルキル−置換ホスホルアミダイトを用いる核酸の合成およびアミダイトの合成を示す非限定的例である。実施例７３：２’−Ｏ−アルキルチオアルキルヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチド含有ハンマーヘッドリボザイムの合成合成の方法は、Ｕｓｍａｎ，Ｎ．；Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｋ．Ｋ．；Ｊｉａｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｒ．，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，７８４５−７８５４およびＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．；Ｆｒａｎｋｌｙｎ，Ｃ．；Ｕｓｍａｎ，Ｎ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，５４３３−５４４１に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい、慣用の核酸保護基およびカップリング基、例えば５’末端にジメトキシトリチル、３’末端にホスホルアミダイトを用いる。これらの２’−Ｏ−アルキルチオアルキル置換ホスホルアミダイトは、ハンマーヘッドリボザイムのみならず、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩまたはグループIIイントロン触媒的核酸に、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り込ませることができる。したがって、これらは任意の核酸構造において一般に用いられる。実施例７４：塩基保護３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ヌクレオシド（２）の合成図５５を参照すると、”ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ．ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”，ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９９１にしたがう”マーキーヴィクス（Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ）”保護基の塩基保護ヌクレオシドへの標準的取り込みにより、保護されたヌクレオシド（２）が収率８５−１００％で得られた。簡単には、非限定的例において、ウリジン（２０ｇ，８１．９ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと２回共蒸発させることにより乾燥し、無水ピリジンに再溶解した。上述の溶液を冷却（０℃）し、３０ｍＬの無水ジクロロエタン中の１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルシロキサン（２８．８２ｍＬ，９０．０９ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら滴加した。添加が完了した後、反応混合物を室温まで暖め、さらに２時間撹拌した。次に、これをＭｅＯＨ（２５ｍＬ）で急冷し、蒸発乾固させた。残渣を塩化メチレンに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ₃およびブラインで洗浄した。有機層を蒸発乾固させ、次にトルエンと共蒸発させて痕跡量のピリジンを除去して、３９ｇ（９８％）の化合物２（Ｂ＝Ｕｒａ）を得、これをさらに精製することなく用いた。他の３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル） −ヌクレオシドは、上述のプロトコルを用いて、塩基保護ヌクレオシドから出発し、必要な場合には生成物をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーを行うことにより最終的に精製して、収率７５−９０％で得られた。実施例７５：２’−Ｏ−メチルチオメチルヌクレオシド（３）の合成の一般的方法図５５を参照すると、塩化メチレン（１００ｍＬ）または塩化メチレン−アセトニトリル（１：１）混合物中の、塩基保護３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ヌクレオシド（２）（７ｍｍｏｌ）、メチルジスルフィド（７０ｍｍｏｌ）、２，６−ルチジン（７ｍｍｏｌ）の混合物の撹拌氷冷溶液に、アルゴン加圧下で、塩化メチレン中の過酸化ベンゾイル（２８ｍｍｏｌ）の溶液を１時間かけて滴加した。完全に添加した後、反応混合物をアルゴン下で０℃でさらに１時間撹拌した。溶液を室温まで暖め、塩化メチレン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ₃およびブラインで２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をシリカ上で塩化メチレン中１−２％メタノールを溶出液として用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、対応するメチルチオメチルヌクレオシドを収率５５−７０％で得た。実施例７６：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルチオメチル−ヌクレオシド（６）方法Ａ．１０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の塩基保護３’，５ ’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルヌクレオシド（３）（２．００ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（３．０ｍｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液で室温で１０−１５分間処理した。得られた混合物を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムに負荷し、１Ｌのクロロホルムで洗浄し、所望の脱保護化合物をジクロロメタン中５−１０％メタノールで溶出した。適当な画分を合わせ、溶媒を蒸発により除去し、残渣を乾燥ピリジンと共蒸発させることにより乾燥した。油状残渣を乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル（１．２ｅｑ）を加え、反応混合物を無水状態に一夜放置した。反応をメタノール（２０ｍｌ）で急冷し、蒸発させ、クロロホルムに溶解し、飽和水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル誘導体を収率７０ −８０％で得た。方法Ｂ．あるいは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルチオメチル−ヌクレオシド（６）は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ｔ− ブチルジメチルシリルヌクレオシド（４）を出発物質として用いて合成することができる。化合物４は、ＲＮＡホスホルアミダイト合成の副生成物として商業的に入手可能である。実施例３に記載のように、化合物４を３’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−Ｏ−メチルチオメチルヌクレオシド５に転換する。１０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の塩基保護３’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−Ｏ−メチルチオメチルヌクレオシド５（２．００ｍｍｏｌ）の溶液をＴＨＦ（３．０ｍｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液で室温で１０−１５分間処理した。得られた混合物を蒸発させ、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、ヌクレオシド６を収率９０％で得た。実施例７７：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルチオメチル−ヌクレオシド−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（７）Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．；Ｆｒａｎｋｌｙｎ，Ｃ．；Ｕｓｍａｎ，Ｎ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，５４３３−５４４１にしたがうヌクレオシド６の標準的ホスフィチル化によりホスホルアミダイトを収率７０−８５％収量で得た。実施例７８：２’−Ｏ−メチルチオフェニルヌクレオシドの合成の一般的方法アセトニトリル（１００ｍＬ）中の塩基保護３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ヌクレオシド（１４．７ｍｍｏｌ）、チオアニソール（１４７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（５８．８ｍｍｏｌ）の混合物の撹拌氷冷溶液に、アルゴン加圧下で過酸化ベンゾイル（３６．７５ｍｍｏｌ）を３時間かけて少しずつ加えた。添加が完了した後、反応混合物を室温まで暖め、アルゴン下でさらに１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させた。残渣をシリカ上でＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：１）の混合物を溶出液として用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、対応するメチルチオフェニルヌクレオシドを収率５５−６５％で得た。実施例７９：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルチオフェニル− ヌクレオシドこれらの化合物は、上述の実施例７６および７６にしたがって合成した。実施例８０：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルチオフェニル− ヌクレオシド−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．；Ｆｒａｎｋｌｙｎ，Ｃ．；Ｕｓｍａｎ，Ｎ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，５４３３−５４４１にしたがう標準的ホスフィチル化により、ホスホルアミダイトを収率７０−８５％で得た。実施例８１：２’−Ｏ−メチルチオメチル置換含有リボザイム非限定的例において、２’−Ｏ−メチルチオアルキル置換をハンマーヘッドリボザイムモチーフ中の種々の位置に行った（図５６、Ｕ４およびＵ７位を含む）。この非限定的例においては、ハンマーヘッドリボザイムは標的部位Ｂを標的とした。ハンマーヘッドリボザイム（図５６を参照されたい）は、上述のように固相合成を用いて合成した。いくつかの位置を別々にまたは組み合わせて、２’−Ｏ− メチルチオメチル基で修飾した。インビトロＲＮＡ切断アッセイ：基質ＲＮＡは、[γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて５’末端標識した。切断反応は、リボび４０ｎＭ未標識リボザイムを、９０℃で２分間加熱し、氷上で１０−１５分間スナップ冷却することにより、別々に変性し再生した。リボザイムおよび基質は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含む緩衝液中で、３７℃で１０分間別々にインキュベートした。反応は、リボザイムおよび基質溶液を混合し、３７℃でインキュベートすることにより開始した。一定の時間間隔で５μｌのアリコートを取り出し、等量の２×ホルムアミド停止ミックスと混合することにより反応を急冷した。試料を２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。結果を定量し、切断された標的ＲＮＡのパーセンテージを時間の関数としてプロットした。図５７を参照すると、種々の位置において２’−Ｏ−メチルチオメチル修飾を含むハンマーヘッドリボザイムは、標的ＲＮＡを効率的に切断した。驚くべきことに、すべての２’−Ｏ−メチルチオメチル置換リボザイムは対照ハンマーヘッドリボザイムより高い効率で標的ＲＮＡを切断した。図５６に挙げられる配列および図５６および５７に記載される修飾は、非限定的例を意味する。当業者は、他の２’−ヒドロキシル基修飾の組み合わせを含むリボザイムおよびＲＮＡの変異体（塩基置換、削除、挿入、突然変異、化学的修飾）を、当該技術分野において知られた技術を用いて容易に生成することができ、これらも本発明の範囲内であることを認識するであろう。以下は、非ヌクレオチドホスホルアミダイトを用いる非ヌクレオチド模倣体含有触媒的核酸の合成を示す非限定的例である。このような非ヌクレオチドは、ハンマーヘッドタイプリボザイムの結合アーム、コアまたはループ隣接ステムＩＩ中に位置させることができる。当業者は、本明細書の教示にしたがって、これらの領域中の最適な位置を決定することができる。驚くべきことに、脱塩基部分をこのようなリボザイムのコア中に位置させることができる。実施例８２：脱塩基ヌクレオチドの合成１−デオキシ−Ｄ−リボフラノースホスホルアミダイト９の合成は図５８に示される。我々の最初の努力は、”１ポット”方法によりＤ−リボースから製造されたシントン１の脱酸素化に集中した。ロビンス（Ｒｏｂｉｎｓ）条件下でのアセトニド１のフェノキシチオカルボニル化により、β−アノマ−２（Ｊ_1,2＝１．２Ｈｚ）が中程度の収量（４５−５５％）で得られた。Ｂｕ₃ＳｎＨ／ＡＩＢＮを用いるラジカル脱酸素化により、リビトール誘導体３が収率５０％で形成された。続いて９０％ＣＦ₃ＣＯＯＨ（１０ｍ）で脱保護し、ジメトキシトリチル基を導入することにより、主要中間体４が収率４０％で得られた（Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２，３１，５００５−５００９；Ｐｅｒｒｅａｕｌｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９１，３０，４０２０−４０２５；Ｐａｏｌｅｌｌａｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１９９２,１１，１９１３−１９１９；Ｐｅｉｋｅｎｅｔａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５３，３１４−３１７）。この経路の総収量が低いため、我々は４に到達するための異なる方法を早急に調べた（図５８）。フェニルチオグリコシド（Ｋｅｃｋ反応において首尾よく用いられた）が別法であるようであった。しかし、関与するアシル基による対応する臭化グリコシルのＣ２−位におけるフリーラジカル還元は、２−アシル基をＣ１位に移動させうることが知られている（Ｂｕ₃ＳｎＨ濃度に依存する）。したがって、我々は、フェニルチオグリコシド５をＢｚ₂Ｏ₂（２ｅｑ）の存在下でＢｕ₃ＳｎＨ（６．１ｅｑ）によりラジカル還元し、トリベンゾエート６を収率６３％で単離した（図９Ｂ）。続く脱ベンゾイル化およびジメトキシトリチル化により、シントン４を収率７０％で得た。標準的条件を用いてＴＢＤＭＳ基を導入したところ、４：１比で２−および３−異性体８および７が形成された。２つの位置異性体をシリカゲルクロマトグラフィーにより分離した。２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル誘導体８をホスフィチル化して、ホスホルアミダイト９を収率８２％で得た。実施例８３：インビトロＲＮＡ切断アッセイリボザイムおよび基質ＲＮＡは、上述のように合成した。［γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて基質ＲＮＡを５’末端標識した。切断反応は、リボザイム”過剰”条件下でザイムを、９０℃で２分間加熱し、氷上で１０−１５分間スナップ冷却することにより、別々に変性させ再生させた。リボザイムおよび基質を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含む緩衝液中で３７℃で１０分間別々にインキュベートした。反応は、リボザイムと基質溶液とを混合して３７℃でインキュベートすることにより開始した。一定の時間間隔で５μｌのアリコートを取り出し、等量の２×ホルムアミド停止ミックスと混合することにより反応を急冷した。試料は２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。結果を定量し、切断された標的ＲＮＡのパーセンテージを時間の関数としてプロットした。図５９を参照すると、部位Ｂを標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨ− Ｂ）の一般構造が種々の塩基番号とともに示される。ＨＨ−Ｂ中のヌクレオチド位置のいくつかにおいて種々の置換を作成した。特に、図６０を参照すると、置換は、Ｘ４およびＸ７とマークされたＵ４位およびＵ７位、およびループＩＩ内のＸとマークされた位置に作成された。これらの置換リボザイムのＲＮＡ切断活性は、続く図に示される。特に、図６１は、脱塩基置換Ｕ４および脱塩基置換Ｕ７による切断を示す。認識されるように、Ｕ４またはＵ７における脱塩基置換は、切断活性に有意に影響を及ぼさない。さらに、図６２に示されるように、ステムＩＩループにすべて脱塩基部分を含むことは、酵素的活性を有意に減少させない。さらに、図６３に示されるように、３’反転デオキシリボースを含むことは、ＲＮＡ切断活性を不活性化させない。実施例８４：平滑筋細胞増殖アッセイハンマーヘッドリボザイム（ＨＨ−Ａ）は、ｃ−ｍｙｂｍＲＮＡ中のユニーク部位（部位Ａ）を標的とする。ｃ−ｍｙｂ蛋白質の発現は、ラット平滑筋細胞の増殖に必須であることが示されている（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，１９９２Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，４６２５）。ｃ−ｍｙｂＲＮＡ中の部位Ａを切断した上述のリボザイムを、その平滑筋細胞増殖に及ぼす影響についてアッセイした。記載されたように（Ｓｔｎｃｈｃｏｍｂｅａｌ．，上掲）、ラット血管平滑筋細胞を単離し培養した。これらの初代ラット大動脈平滑筋細胞(ＲＡＳＭＣ)を２４−ウエルプレートに播種し(５ ×１０³細胞／ウエル)、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）および１０％血清の存在下で３７℃で約１６時間インキュベートした。これらの細胞を、ＤＭＥＭ（０．５％血清を含む）中で３７℃で４８−７２時間血清飢餓状態とした。血清飢餓処理の後、細胞をリポフェクタミン（ＬＦＡ） −複合体化リボザイム（１００ｎＭのリボザイムをＬＦＡ：リボザイム装填比が４：１であるようにＬＦＡと複合体化させた）で処理した。リボザイム：ＬＦＡ複合体を血清飢餓処理ＲＡＳＭＣ細胞とともに３７℃で４時間インキュベートした。リボザイム：ＬＦＡ複合体を細胞から除去した後（４時間後）、１０％血清を加えて平滑筋細胞増殖を刺激した。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を加えて細胞を染色した。細胞を血清で３７℃で２４時間刺激した。血清刺激の後、ＲＡＳＭＣ細胞を過酸化水素（メタノール中０．３％Ｈ₂Ｏ₂）で４℃で３０分間急冷した。次に細胞を０．５ｍｌの２ＮＨＣｌで室温で２０分間変性した。馬血清（０．５ｍｌ）を用いて細胞を４℃で３０分間から１６時間以内でブロックした。ＲＡＳＭＣ細胞を、まず細胞を抗−ＢｒｄＵ（一次）抗体で室温で６０分間処理することにより染色した。細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ビオチニル化アフィニティー精製抗マウスＩｇＭ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）二次抗体で染色した。細胞をアビジンビオチニル化酵素複合体（ＡＢＣ）キット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を用いて対染色した。増殖：非増殖細胞の比は、顕微鏡下で染色細胞を計数することにより判定した。増殖しつつあるＲＡＳＭＣはＢｒｄＵを取り込み、茶色に染色される。非増殖細胞はＢｒｄＵを取り込まず、紫色に染色される。図６４を参照すると、部位Ａを切断する、ＨＨ−Ａと称されるリボザイムが示される。図６５に示される、Ｕ４を脱塩基部分で置換すると、上述のラット大動脈平滑筋細胞増殖アッセイを用いて、図６６に示されるように、活性リボザイムが得られる。本発明の方法は概してリボザイムのＨＰＬＣ精製を特徴とする。そのような精製の一例が以下に与えられ、ここでは固相上で製造された合成リボザイムをブロックする。次にメタノール性アンモニアでの処理、続くフッ化テトラブチルアンモニウムでの処理によりこの物質を固相から離脱させ、逆相ＨＰＬＣで精製して、部分的にブロックされたリボザイムを”失敗”配列から除去する。そのような ”失敗”配列は、所望の酵素的ＲＮＡ分子より所望の塩基の１つまたはそれ以上ランダムな様式で短いヌクレオチド塩基配列を有し、および遊離末端５’−ヒドロキシル基を有するＲＮＡ分子である。適正な配列を有するリボザイム中のこの末端５’−ヒドロキシルは、依然として親油性ジメトキシトリチル基により保護されている。そのような部分的にブロックされた酵素的ＲＮＡを精製した後、これを標準的方法により脱保護して、同一のまたは同様のＨＰＬＣ逆相カラムを通して、他のＲＮＡ分子もしくはヌクレオチドまたは脱ブロックおよび合成方法において生成した他の分子等の他の混入成分を除去する。得られる分子は、高度に精製された形の天然型の酵素的に活性なリボザイムである。以下は、そのような方法の例を提供する。これらの例は容易にスケールアップして、グラムまたはキログラムの量のリボザイムを製造および精製することができる。実施例８５：ＨＰＬＣ精製、逆相この例においては、リボザイムの合成に固相ホスホルアミダイト化学を用いた。用いたモノマーは、ウリジン、Ｎ−ベンゾイル−シトシン、Ｎ−フェノキシアセチルアデノシン、およびグアノシンの２’−ｔ−ブチルージメチルシリルシアノエチルホスホルアミダイト（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）であった。固相合成は、ＡＢＩ３９４または３８０ＢＤＮＡ／ＲＮＡ合成機のいずれかにおいて、それぞれの機械について提供される標準的プロトコルを用いて実施した。唯一の例外は、カップリング段階を１０から１２分間に増加させたことであった。ホスホルアミダイト濃度は０．１Ｍであった。合成は、１μｍｏｌスケールで、１μｍｏｌＲＮＡ反応カラム（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて実施した。平均カップリング効率は、離脱したトリチルカチオンの熱測定により判定して、３９４モデルについては９７％と９８％との間、３８０Ｂモデルについては９７％と９９％との間であった。最終的５’−ＤＭＴ基は除去しなかった。合成後、リボザイムをＣＰＧ支持体から切断し、塩基およびホスホトリエステル部分を無菌バイアル中で乾燥エタノール性アンモニア（２ｍＬ）中で５５℃で１６時間インキュベーションすることにより除去した。反応混合物をドライアイス上で冷却した。後に、冷液体を無菌ねじ蓋バイアル中に移し、凍結乾燥した。２’−ｔ−ブチルジメチルシリル基をリボザイムから除去するために、得られた残渣を乾燥ＴＨＦ（ＴＢＡＦ）中の１Ｍフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム中に、各シリル基について２０倍過剰の試薬を用いて、周囲温度で１６時間懸濁した。等量の無菌１Ｍ酢酸トリエチルアミン、ｐＨ６．５を加えることにより反応を急冷した。試料を冷却し、スピードバックで最初の容量の半量に濃縮した。リボザイムは、Ｃ４３００Å ５μｍＤｅｌｔａＰａｋカラムでアセトニトリル勾配を用いるＨＰＬＣにより２段階で精製した。第１段階、または”トリチルオン”段階は、５’−ＤＭＴ−保護リボザイムの５’−ＤＭＴ基を欠失している失敗配列からの分離である。この段階において用いた溶媒は、Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）およびＢ（アセトニトリル）であった。溶出プロファイルは、２０％Ｂ、１０分間、次に２０％Ｂから５０％Ｂの直線勾配、５０分間、５０％Ｂ、１０分間、５０％Ｂから１００％Ｂの直線勾配、１０分間、および１００％Ｂから０％Ｂの直線勾配、１０分間であった。第２段階は、Ｃ４３００Å ５μｍＤｅｌｔａＰａｋカラムでのアセトニトリル勾配を用いる、完全に脱保護された、すなわち２％トリフルオロ酢酸または８０％酢酸酸での処理による５’−ＤＭＴ基の除去に続く、リボザイムの精製である。この第２段階に用いた溶媒は：Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）およびＢ（８０％アセトニトリル、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）であった。溶出プロファイルは、５％Ｂ、５分間、５％Ｂから１５％Ｂの直線勾配、６０分間、１５％Ｂ、１０分間、および１５％Ｂから０％Ｂの直線勾配、１０分間であった。トリエチルアンモニウム塩型のリボザイムを含む画分を冷却し、スピードバックで凍結乾燥した。固体残渣を最小容量のエタノールに溶解し、アセトン中の過塩素酸ナトリウムを加えることにより、ナトリウム塩形のリボザイムを析出させた（Ｋ⁺またはＭｇ²⁺塩は、同等の様式で製造することができる）。リボザイムを遠心分離により回収し、アセトンで３回洗浄し、凍結乾燥した。実施例８６：ＲＮＡおよびリボザイムの、エチルアミン（ＥＡ）を用いる環外アミノ保護基の脱保護ポリマー結合オリゴヌクレオチド（トリチルオンまたはトリチルオフのいずれか）をエチルアミン（ＥＡ）の溶液に２５−５５℃で１０−３０分間懸濁して、環外アミノ保護基を除去した（図６７を参照されたい）。上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ／３：１：１で洗浄し、ボルテックスし、次に上清を最初の上清に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥させて、白色粉末とした。表ＥＶＩＩは、塩基脱保護について本明細書に概要を記載した改良を用いて得られた結果をまとめたものである。このデータから、５５℃で１０分間または４０℃で１０分間のＥＡが有効であることが明らかである。ＨＰＬＣピーク構造は、これらのスキームの間でほぼ同一であり、エチルアミン脱保護オリゴの収量は、実際にはメチルアミンよりわずかに高い。ＲＮＡ分子の脱保護の第２段階は、ＴＢＡＦを８−２４時間用いる２’−ヒドロキシルアルキルシリル保護基の除去により実施することができる（Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，７８４５−７８５４）。本出願人は、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で５５−６５℃で無水ＴＥＡ・ＨＦを０．５−１．５時間用いることが、同等のまたはよりよい結果を与えることを見いだした。以下は、本発明の好ましい態様の例である。当業者は、これらが限定的例ではなく、当業者を本発明の完全な意味に導くために提供されるものであることを認識するであろう。日常的な方法を用いて、以下に例示されない他のカップリング領域を利用することができる。リボザイムを２つの部分で合成し、ライゲートせずに触媒活性について試験した。図７２を参照すると、５から８塩基対のステムＩＩを含む半リボザイムの切断活性は、４０ｎＭで１回の回転条件で、図７３および７４に示されるように、全長オリゴマーの活性に匹敵した。同一の半リボザイムを初期ステムＩＩループに架橋させるのに適当な修飾を含むように合成した。半リボザイムを精製し、種々の架橋方法を用いて化学的にライゲートさせた。得られた全長リボザイム（図７１を参照されたい）は、図７４に示されるように、直線的に合成した全長オリゴマーと同様の切断活性を示した。実施例８７図７０を参照すると、ハンマーヘッドリボザイムの５’側半分をリボース基を含むように用意した。これをＮａＩＯ₄で酸化的に切断して、還元条件下でアミノ基を有するリボザイムの３’側半分と反応させた。得られたリボザイムはモルホリノ基により連結した２つの半リボザイムからなるものであった。３’ＯＨを有する５’半分ハンマーヘッド１等量（２００μｇ）および５’Ｃ５−ＮＨ₂を有する３’半分ハンマーヘッド５等量（１０００μｇ）（すべてＨＨ−Ａを有する）をこの反応に用いた。限定されたオリゴヌクレオチドをまず３．６等量の過ヨウ化ナトリウムでＤＥＰＣ水中で氷上で６０分間酸化し、７．２等量のエチレングリコールで氷上で３０分間急冷し、５等量のアミノオリゴを加えた。０．５モルのトリシン緩衝液、ｐＨ９を加えて最終トリシン濃度２０ｍＭとし、氷上に３０分間放置した。次に５０等量の水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、酢酸でｐＨを６．５に下げ、反応溶液を氷上で６０分間放置した。、次に得られた全長リボザイムをその後の分析用に精製した。実施例８８：アミド結合再び図７０および７１を参照すると、リボザイムの５’半分はその２’位においてカルボキシル基を有しており、これを３’アミン含有半リボザイムとカップリングさせる。カップリング試薬を提供することにより、アミド結合を有する全長リボザイムが得られる。実施例８９：ジスルフィド結合図７０および７１を参照すると、２５０μｇのＲＰＩ３８８１および２５０μ ｇのＲＰＩ３６３６半リボザイムをジチオスレイトールで３７℃で一夜別々に脱保護した。これらを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）中で１：１モル比で一緒に混合し、４Ｍ硫酸銅および０．８ｍＭ１，１０−フェナントロリン（最終濃度）を室温（２０−２５℃）で２時間加え、得られた混合物をゲル精製した。全長リボザイムの総精製収量は３０％であった。トランスリボザイム切断反応用の内部標識基質ＲＮＡを作成するために、増幅される配列の上流にＴ７ＲＮＡプロモーターを配置するプライマーを用いるＰＣＲにより、１．８ＫＢ領域（部位Ａを含む）を合成した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、標準的転写緩衝液中で［α−³²Ｐ］ＣＴＰの存在下で標的ＲＮＡを転写させた。反応混合物を１５ユニットのリボヌクレアーゼフリーＤＮａｓｅｌで処理し、フェノール、続いてクロロホルム：イソアミルアルコール（２５：１）で抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した。乾燥ペレットを２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、−２０℃で保存した。未標識リボザイム（２００ｎＭ）および内部標識１．８ＫＢ基質ＲＮＡ（＜１０ｎＭ）を、標準的切断緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含む）中で、９０℃に２分間加熱し３７℃まで１０分間でゆっくり冷却することにより、別々に変性し再生した。反応は、リボザイムと基質混合物とを混合し３７℃でインキュベートすることにより開始した。一定の時間間隔で５μｌのアリコートを取り出し、等量の２×ホルムアミドゲル負荷緩衝液を加えることにより急冷し、ドライアイス上で凍結した。試料を５％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルで分離し、ホスファーイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いるゲルの放射性分析イメージングにより結果を定量的に分析した。確立されたウイルス感染を効果的に阻害する抗ウイルス剤治療はほとんど利用可能ではない。したがって、予防的免疫がウイルス病原体に対する保護の選択方法になっている。しかし、異なるウイルス、例えば慣用の風邪をもたらすもの、およびＨＩＶ（ＡＩＤＳの病因）のための効果的なワクチンは実施可能ではない。したがって、ウイルス感染と戦うための新規の抗ウイルス方法が開発されつつある。遺伝子治療は、潜在的別法である。ここでは、抗ウイルス遺伝子を感受性細胞中に安定的にトランスフェクトする。このような遺伝子治療方法は、抗ウイルス遺伝子を発現する細胞が、ウイルス感染に対して免疫となるため、”細胞内免疫感作”と称されている（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８８Ｎａｔｕｒｅ３３５，３９５−３９６）。多くの形の抗ウイルス遺伝子が開発されており、これには、蛋白質に基づく抗ウイルス剤、例えばトランスドミナント阻害性蛋白質(Ｍａｌｉｍｅｔａｌ．，１９９３Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｂｅｖｅｃｅｔａｌ．，１９９２Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）８９，９８７０−９８７４；Ｂａｈｎｅｒｅｔａｌ．，１９９３Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，３１９９−３２０７)およびウイルス活性化自殺遺伝子(Ａｓｈｏｒｎｅｔａｌ.，１９９０Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）８７，８８８９−８８９３)が含まれる。蛋白質に基づく抗ウイルス剤は組織培養においては効果的であるが、インビボでは免疫原性である可能性を有する。したがって、そのような外来抗ウイルス蛋白質を発現する処理細胞は、正常な免疫機能により根絶されるであろうと考えられる。蛋白質に基づく抗ウイルスの代替は、ＲＮＡに基づく分子、例えばアンチセンスＲＮＡ、デコイＲＮＡ、アゴニストＲＮＡ、アンタゴニストＲＮＡ、治療的編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）ＲＮＡおよびリボザイムである。ＲＮＡは免疫原性ではない。したがって、そのような治療的ＲＮＡを発現する細胞は免疫根絶に感受性ではない。実施例９０：Ｕ６−Ｓ３５キメラの設計および構築Ｕ６−Ｓ３５と称される転写ユニットを、Ｓ３５モチーフの特徴的な分子内ステムを含むように設計した（図７６を参照されたい）。図７７、７８および７９に示されるように、所望のＲＮＡ（例えばリボザイム）をＵ６−Ｓ３５キメラの指示された領域中に挿入することができる。この構築物はタイプ３ｐｏｌIIIプロモーター、例えば哺乳動物Ｕ６小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）プロモーターの制御下にある（図７５を参照されたい）。Ｕ６−Ｓ３５−ＨＨＩおよびＵ６−Ｓ３５ −ＨＨＩＩはＵ６−Ｓ３５キメラの非限定的例である。非限定的例として、本出願人は、真核生物Ｕ６プロモーターに由来する安定な活性リボザイムＲＮＡを構築した（図７８）。安定性のために、本出願人は、図７６および図７７に記載されるように、Ｓ３５モチーフを取り込ませた。リボザイムが非構造スペーサー配列によりＳ３５モチーフから分離されるように、リボザイム配列をステムの頂点に取り込ませた（図７７、７８、７９）。スペーサー配列は、それぞれの所望のＲＮＡ配列についてあつらえることができる。Ｕ６− Ｓ３５キメラは非限定的例を意味し、当業者は、既知の任意のＲＮＡポリメラーゼプロモーターから図７７、７８および７９に開示される構造を導くことが可能であること、およびそれらが本発明の範囲内であることを認識するであろう。必要なすべては、転写産物の５’領域がその３’領域と相互作用して安定な分子内構造（Ｓ３５モチーフ）を形成すること、およびＳ３５モチーフが所望のＲＮＡから非構造スペーサー配列のストレッチにより分離されていることである。スペーサー配列は、所望のＲＮＡの効率を高めるようである。 ”非構造”とは、二次および三次構造を有しないこと、例えば配列それ自体中に、好ましくは、結合しているＲＮＡ中の他の配列とも安定な塩基対形成構造を有しないことを意味する。 ”スペーサー配列”とは、Ｓ３５ドメインを所望のＲＮＡから分離する任意の非構造ＲＮＡ配列を意味する。スペーサー配列は、１ヌクレオチドまたはそれ以上でありうる。Ｕ６−Ｓ３５−リボザイムキメラのインビトロ触媒活性Ｕ６−Ｓ３５−ＨＨＩリボザイムＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。ＨＨＩＲＮＡはＲＮＡホスホルアミダイト化学を用いて、Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓに記載のようにして化学的に合成した。リボザイムＲＮＡをゲル精製し、精製リボザイムＲＮＡを５５℃で５分間加熱した。用いた標的ＲＮＡは、約６５０ヌクレオチド長さのものであった。内部³²Ｐ標識した標的ＲＮＡは上述のようにして調製した。標的ＲＮＡを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂中で３７ ℃に予熱し、次に時間０においてリボザイムＲＮＡと混合した（２００ｎＭのリボザイム最終濃度を与える）。適当な時間において、アリコートを除き、９５％ホルムアミド中で希釈することにより反応を停止した。試料を変性尿素ポリアクリルアミドゲルで分離し、生成物をホスホイメージャー（登録商標）で定量した。図８０に示されるように、Ｕ６−Ｓ３５−ＨＨＩリボザイムキメラは、化学的に合成したＨＨＩリボザイムと同様に効率よくその標的ＲＮＡを切断した。実際、Ｕ６−Ｓ３５−ＨＨＩリボザイムキメラは合成リボザイムより効率が高いようであった。Ｕ６−Ｓ３５−リボザイム転写産物の蓄積アクチノマイシンＤアッセイを用いて、哺乳動物細胞における転写産物の蓄積を測定した。適当な転写ユニットをコードするプラスミド（２μｇＤＮＡ／ウエル、６ウエルプレート）で、リン酸カルシウム沈殿法（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，１９８２ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮＹ）を用いて細胞を一夜トランスフェクトした。一夜トランスフェクションした後、培地を置き換え、細胞をさらに２４時間インキュベートした。次に、５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含む培地中で細胞をインキュベートした。指示された時間に、細胞をグアニジウムイソチオシアネート中で溶解させ、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉａｎｄＳａｃｃｈｉ，１９８７Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６に記載されるように、全ＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿により精製した。ＲＮＡは、ノザンブロット分析により分析し、特定のＲＮＡのレベルをホスホイメージャー（登録商標）で放射性分析により定量した。時間０におけるＲＮＡのレベルを１００％とした。図８１に示されるように、図７９に示されるＵ６−Ｓ３５−ＨＨＩＩリボザイムは、２９３哺乳動物細胞中でかなり安定であり、約２時間の半減期を有している。実施例９１：ＶＡ１−Ｓ３５キメラの設計および構築図８３Ａを参照すると、ＶＡ１プロモーターからリボザイムを発現させるために、本出願人は、２つの修飾を有する野生型ＶＡ１配列からなる転写ユニットを構築した：中心ドメイン中のループから延びる”Ｓ３５様”モチーフ（図８２）；３’末端は、転写産物の５’領域と３’領域との間により完全な相互作用があるように変更されている（特に、”Ａ−Ｃ”バルジが”Ａ−Ｕ”塩基対に変更されており、停止配列はＳ３５モチーフのステムの一部である）。ＶＡ１−Ｓ３５−リボザイム転写産物の蓄積上述のように、アクチノマイシンＤアッセイを用いて哺乳動物細胞における転写産物の蓄積を測定した。図８４に示されるように、ＶＡ１−Ｓ３５−キメラ( 図８３Ａに示される)は、２９３哺乳動物細胞において、分子内Ｓ３５モチーフを欠失したＶＡ１−キメラ（図２５Ｂに示される）と比較して約１０倍高い安定性を有する。リボザイムの他に、アンチセンス等の所望のＲＮＡ、治療的編集ＲＮＡおよびデコイを指示されたＵ６−Ｓ３５またはＶＡ１−Ｓ３５キメラ中に容易に挿入して、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ発現の治療的レベルを達成することができる。図に掲げられた配列は非限定的例を意味する。当業者は、当該技術分野において知られた技術を用いて上述の例の変異体（突然変異、挿入および削除）を容易に生成しうること、およびこれらも本発明の範囲内であることを認識するであろう。診断用途本発明のリボザイムは、診断道具として用いて、疾患細胞内の遺伝的浮動および突然変異を試験するか、またはストロメリシン、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７− ３および／またはＣＤ４０または他のＲＮＡの細胞内における存在を検出することができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により、標的ＲＮＡの塩基対形成および三次構造を変化させる分子の任意の領域における突然変異の検出が可能となる。本発明に記載される多重リボザイムを用いることにより、ＲＮＡ構造およびインビトロでのならびに細胞および組織における機能に重要なヌクレオチド変化を位置づけることができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの切断を用いて、遺伝子発現を阻害し、疾患の進行における特定の遺伝子産物の役割（本質的な）を特定することができる。このようにして、疾患の重要な媒介物として他の遺伝的標的を特定することができる。このような実験は、コンビナトリアル治療（例えば、異なる遺伝子を標的とする多重リボザイム、既知の小分子阻害剤と結合させたリボザイム、またはリボザイムおよび／または他の化学的もしくは生物学的分子の組合せによる断続的治療）の可能性を与えることにより、疾患進行のよりよい治療をもたらすであろう。本発明のリボザイムの他のインビトロの用途は当該技術分野においてよく知られており、これにはＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０または他のＲＮＡ関連状態に関連するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。このようなＲＮＡは、標準的な方法論を用いてリボザイムで処置した後の切断生成物の存在を判定することにより検出される。特定の例においては、野生型または突然変異型の標的ＲＮＡのみを切断しうるリボザイムをアッセイに用いる。第１のリボザイムを用いて試料中に存在する野生型ＲＮＡを同定し、第２のリボザイムを用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として、野生型および変異型ＲＮＡの両方の合成基質を両方のリボザイムで切断して、反応における相対的なリボザイム効率および”非標的”ＲＮＡ種の切断がないことを示すことができる。合成基質からの切断生成物はまた、試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを生成するためにも役立つ。すなわち、それぞれの分析は、２つのリボザイム、２つの基質および１つの未知試料を必要とし、これらを組み合わせて６つの反応とする。切断生成物の存在は、ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて判定し、それぞれのＲＮＡの全長および切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで分析することができる。標的細胞における変異型ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定上の危険性を見抜くためには、結果を定量することが絶対的に必要というわけではない。その蛋白質生成物が表現型（すなわち、Ｂ７−１、Ｂ７− ２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０）の発現に関与すると示唆されるｍＲＮＡの発現は危険性の確立に適切である。類似した比活性のプローブを両方の転写産物用に用いる場合には、ＲＮＡレベルの質的比較が適切であり、初期診断費用を軽減するであろう。ＲＮＡレベルを質的に比較しようと量的に比較しようと、突然変異型対野生型の比がより高いことは危険性がより高いことと相関関係があろう。他の態様は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。表１リボザイムの特徴グループＩイントロンサイズ：約２００から＞１０００ヌクレオチド標的配列中、切断部位のすぐ５’側にＵを必要とする。切断部位の５’側で４−６ヌクレオチドに結合する。このクラスには７５個を越えるメンバーが知られている。ＴｅｔｏｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａｒＲＮＡ、真菌ミトコンドリア、クロロプラスト、Ｔ４ファージ、らん藻類、および他のものに見いだされている。ＲＮａｓｅＰＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ）サイズ：約２９０から４００ヌクレオチドリボヌクレオ蛋白質酵素のＲＮＡ部分。ｔＲＮＡ前駆体を切断して、成熟ｔＲＮＡを形成する。このグループには約１０個のメンバーが知られており、すべて細菌由来のものである。ハンマーヘッドリボザイムサイズ：約１３から４０ヌクレオチド切断部位のすぐ５’側に標的配列ＵＨを必要とする。切断部位の両側で可変数のヌクレオチドに結合する。このクラスには１４個のメンバーが知られている。感染剤としてＲＮＡを用いる多くの植物病原体（ウイルソイド）において見いだされている（図１）。ヘアピンリボザイムサイズ：約５０ヌクレオチド切断部位のすぐ３’側に標的配列ＧＵＣを必要とする。切断部位の５’側の４−６ヌクレオチドおよび３’側の可変数のヌクレオチドに結合する。このクラスには３個のメンバーのみが知られている。感染剤としてＲＮＡを用いる３つの植物病原体（タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡ、アラビスモザイクウイルスおよびチコリイエローモットルウイルス）において見いだされている（図３）。デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムサイズ：５０−６０ヌクレオチド（現在のところ）最近、標的ＲＮＡの切断が示された。配列要件は完全には決定されていない。結合部位および構造的要件は完全には決定されていないが、切断部位の５’側の配列は必要ではない。このクラスには１個のメンバーのみが知られている。ヒトＨＤＶにおいて見いだされている（図４）。ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡリボザイムサイズ：約１４４ヌクレオチド（現在のところ）最近、標的ＲＮＡの切断が示された。配列要件は完全には決定されていない。結合部位および構造的要件は完全には決定されていない。このクラスには１個のメンバーのみが知られている。ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡにおいて見いだされている（図５）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/16 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０８／３６３，２５４ (32)優先日平成６年12月23日(1994．12．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／３９０，８５０ (32)優先日平成７年２月17日(1995．2．17) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／４２６，１２４ (32)優先日平成７年４月20日(1995．4．20) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／４３２，８７４ (32)優先日平成７年５月２日(1995．5．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／４３４，５０９ (32)優先日平成７年５月４日(1995．5．4) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０００，９５１ (32)優先日平成７年７月７日(1995．7．7) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０００，９７４ (32)優先日平成７年７月７日(1995．7．7) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／５４１，３６５ (32)優先日平成７年10月５日(1995．10．5) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者ジャーヴィス，セールアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，グレンウッド・ドライブ 2925，ナンバー 301 (72)発明者ドレイパー，ケネスアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，クラウド・コート 4619 (72)発明者パヴコ，パメラアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，クラウド・コート 4619 (72)発明者マクスウィゲン，ジェームズアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，フランクリン・ドライブ 4866 (72)発明者グスタフソン，ジョンアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，フランクリン・ドライブ 4866 (72)発明者アスマン，ナシムアメリカ合衆国コロラド州80304，ボウルダー，カルミア 2954，ナンバー 37 (72)発明者ウィンコット，フランシーヌアメリカ合衆国コロラド州80501，ロングモント，ノース・ナインティフィフス・ストリート 7920 (72)発明者マトゥリック−アダミック，ジャセンカアメリカ合衆国コロラド州80303，ボウルダー，サウス・フォーティセカンド・ストリート 760 (72)発明者カーペイスキー，アレクサンダーアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，ウィリアムズ・フォーク・トレイル 5121，ナンバー 209 (72)発明者トンプソン，ジェームズ・ディーアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，グレンウッド・ドライブ 2925，ナンバー 301 (72)発明者モダック，アニルアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，ホープトマン・コート 3855 (72)発明者バーギン，アレックスアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，ギャトリング・レーン 3115

Claims

【特許請求の範囲】１．ハンマーヘッドモチーフを有する酵素的核酸であって、前記核酸は少なくとも５個のリボース残基を含み、かつ、前記核酸は前記核酸の位置番号４において２’−Ｃ−アリル修飾を含み、かつ前記核酸は、少なくとも１０個の２’−Ｏ −メチル修飾を含み、かつ前記核酸は３’末端修飾を含むことを特徴とする酵素的核酸。２．前記核酸が前記３’末端において３’−３’連結反転リボース部分を有する、請求項１記載の酵素的核酸。３．ハンマーヘッドモチーフを有する酵素的核酸であって、前記核酸は少なくとも５個のリボース残基を含み、かつ前記核酸は前記核酸の位置番号４および／または位置番号７において２’−アミノ修飾を含み、かつ前記核酸は少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸はその３’末端において３ ’−３’連結反転リボースまたはチミジン部分を含むことを特徴とする酵素的核酸。４．ハンマーヘッドモチーフを有する酵素的核酸であって、前記核酸は少なくとも５個のリボース残基を含み、かつ前記核酸は前記核酸分子の位置番号４および／または位置番号７において非ヌクレオチド置換を含み、、かつ前記核酸は少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸はその３’末端において３’−３’連結反転リボースまたはチミジン部分を有することを特徴とする酵素的核酸。５．配列番号３４、３５、５７、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４０、１６２、１７０、１７９、１８８、２２３、２２４、２３６、２４５、２４６、２５６、２５９、２６０、および２８１から選択される配列を有する標的ｍＲＮＡを切断する酵素的核酸であって、前記核酸は少なくとも５個のリボース残基を含み、かつ前記核酸は前記核酸分子の位置番号４および／または位置番号７において６−メチルウリジン置換を含み、かつ前記核酸は少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸はその３’末端において３’−３ ’連結反転リボースまたはチミジン部分を含むことを特徴とする酵素的核酸。６．配列番号３４、３５、５７、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４０、１６２、１７０、１７９、１８８、２２３、２２４、２３６、２４５、２４６、２５６、２５９、２６０、および２８１から選択される配列を有する標的ｍＲＮＡを切断する酵素的核酸であって、ここで、前記核酸は、少なくとも５個のリボース残基を含み、かつ前記核酸は前記核酸の位置番号４において２’− Ｃ−アリル修飾を含み、かつ前記核酸は少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸はその３’末端において２’−３’連結反転リボースまたはチミジン部分を含むことを特徴とする酵素的核酸。７．前記核酸が７個の５’末端ヌクレオチドのうち少なくとも３個においてホスホロチオエート連結を含む、請求項１−６のいずれかに記載の酵素的核酸。８．Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０をコードするｍＲＮＡの合成および／または発現をブロックする核酸分子。９．前記分子が酵素的核酸分子である、請求項８記載の核酸。１０．前記酵素的核酸の結合アームが表ＢＩＩ、ＢＩＶ、ＢＶＩ、ＢＶＩＩＩ、ＢＸ、ＢＸＩＩ、ＢＸＩＶ、ＢＸＶ、ＢＸＶＩ、ＢＸＶＩＩ、ＢＸＶＩＩＩおよびＢＸＩＸのいずれかのヌクレオチド塩基配列に相補的な配列を含む、請求項９記載の核酸分子。１１．前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項９または１０に記載の核酸分子。１２．前記核酸分子がヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸モチーフのものである、請求項９または１０記載の酵素的核酸分子。１３．前記リボザイムが前記領域のＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む、請求項９または１０記載の酵素的核酸分子。１４．前記リボザイムが前記領域のＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む、請求項１３記載の酵素的核酸。１５．本質的に表ＢＩＩＩ、ＢＶ、ＢＶＩ、ＢＶＩＩ、ＢＩＸ、ＢＸＩ、ＢＸＩＩＩ、ＢＸＩＶ、ＢＸＶ、ＢＸＶＩ、ＢＸＶＩＩおよびＢＸＶＩＩＩに示される配列から選択されるいずれかのリボザイム配列からなる酵素的核酸分子。１６．請求項８または９記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。１７．前記細胞がヒト細胞である、請求項１６記載の細胞。１８．請求項９または１０に記載の酵素的核酸分子をコードする核酸を、哺乳動物細胞中でその酵素的ＲＮＡ分子を発現および／または送達しうる様式で含む発現ベクター。１９．請求項１８記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。２０．前記細胞がヒト細胞である、請求項１９記載の細胞。２１．Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０のレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって、患者、組織ドナーまたは対応する細胞集団に、治療的有効量の、請求項８、９または１０に記載の酵素的核酸分子を投与することを含む方法。２２．患者に請求項２１記載の発現ベクターを投与することによる、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３および／またはＣＤ４０活性のレベルに関連する状態を治療する方法。２３．前記患者がヒトである、請求項２１または２２に記載の方法。２４．レシピエントにドナーのアロ抗体に対する許容性を誘導する方法であって、ドナーからの抗原提示細胞を請求項８または９記載の核酸で処理し、前記処理された抗原提示細胞を前記レシピエントに注入することを含む方法。２５．移植片許容性を増強する方法であって、移植前に請求項８または９に記載の核酸を前記移植片の細胞と接触させることを含む方法。２６．自己免疫疾患を治療する方法であって、患者の抗原提示細胞を請求項８または９に記載の核酸と接触させることを含む方法。２７．前記細胞をエクスビボで前記核酸と接触させる、請求項２６記載の方法。２８．前記細胞を前記疾患に特徴的な自己抗体と接触させる、請求項２６記載の方法。２９．前記細胞が前記患者に再注入される、請求項２８記載の方法３０．少なくとも１つの修飾塩基置換を有する酵素的核酸であって、前記塩基置換は、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、ナフチル、６−メチル−ウラシルおよびアミノフェニルからなる群より選択されることを特徴とする酵素的核酸。３１．前記核酸がハンマーヘッドモチーフを有する、請求項３０記載の酵素的核酸。３２．請求項３０または３１に記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。３３．前記核酸が４位または７位において前記修飾塩基置換を含む、請求項３１記載の酵素的核酸。３４．前記置換が６−メチルウラシルである、請求項３３記載のリボザイム。３５．前記置換がピリジン−４−オンである、請求項３３記載のリボザイム。３６．前記置換がフェニルである、請求項３３記載のリボザイム。３７．前記置換がピリジン−２−オンである、請求項３３記載のリボザイム。３８．前記置換がシュードウラシルである、請求項３３記載のリボザイム。３９．前記置換が２，４，６−トリメトキシベンゼンである、請求項３３記載のリボザイム。４０．前記置換がジヒドロウラシルである、請求項３３記載のリボザイム。４１．前記置換が３−メチルウラシルである、請求項３３記載のリボザイム。４２．前記置換がナフチルである、請求項３３記載のリボザイム。４３．前記置換がアミノフェニルである、請求項３３記載のリボザイム。４４．２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオシド。４５．２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド。４６．１つまたはそれ以上の２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。４７．２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドを含む酵素的核酸。４８．ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子を切断する増強された活性をを有する酵素的核酸分子製造する方法であって、その２’位にアルキル基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを有する前記酵素的分子を形成する工程を含む方法。４９．２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド三リン酸。５０．５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−塩基から２’−Ｃ−アリル誘導体を合成する方法であって、（ａ）２’ヒドロキシル基をフェノキシチオカルボニル基で置換して５’−Ｏ −ＤＭＴ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−塩基をフェノキシチオカルボニル化してチオエステルを得、そして（ｂ）前記チオエステルをヘックアシル化して２’−Ｃ−アリル誘導体を形成し、ここで前記２’−フェノキシチオカルボニル基は前記２’−Ｃ−アルキル基で置換されており、前記２’−Ｃ−アリル誘導体を得る、の各工程を含む方法。５１．次の式：［式中、Ｒ１は２’−Ｏ−アルキルチオアルキルまたは２’−Ｃ−アルキルチオアルキルを表し、Ｘは、塩基またはＨを表し、Ｙはリン含有基を表し、Ｒ２はＯ、ＤＭＴまたはリン含有基を表す］を有する化合物。５２．請求項５１記載の１つまたはそれ以上の化合物を含むオリゴヌクレオチド。５３．請求項５１記載の化合物を含む酵素的核酸。５４．前記化合物が三リン酸の形態である、請求項５１記載の化合物。５５．前記核酸がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項５３記載の酵素的核酸。５６．前記核酸がヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、ＶＳＲＮＡまたはＲＮａｓｅＰＲＮＡモチーフのものである、請求項５３記載の酵素的核酸。５７前記ハンマーヘッドリボザイムが４位および／または７位において２’− Ｏ−メチルチオメチルで置換されている、請求項５５記載の酵素的核酸。５８．前記ハンマーヘッドのステムＩＩ中の１つのモノマーが少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルチオメチルで置換されている、請求項５５または５７に記載の酵素的核酸。５９．前記核酸が１つまたはそれ以上の位置において２’−Ｏ−メチルチオフェニルで置換されている、請求項５５または５６記載の酵素的核酸。６０．請求項５１−５９のいずれかに記載の化合物を含む哺乳動物細胞。６１．前記細胞がヒト細胞である、請求項６０記載の細胞。６２．ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子を切断する活性を有する酵素的核酸分子を製造する方法であって、その２’位において２’−Ｏ−アルキルチオアルキルおよび／または２’−Ｃ−アルキルチオアルキル基を有する少なくとも１つの位置を有する前記酵素的分子を形成する工程を含む方法。６４．触媒コア中の４位および７位における通常生ずるウラシルからなる群より選択される部位中に非ヌクレオチドを有するハンマーヘッドリボザイム。６５．ステムＩＩおよびループＩＩを有するハンマーヘッドリボザイムであって、前記ループＩＩが非ヌクレオチドを含むリボザイム。６６．その３’末端において非ヌクレオチドを有するハンマーヘッドリボザイム。６７．請求項６４−６７のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。６８．前記細胞がヒト細胞である、請求項６７記載の細胞。６９．図５８に記載される、脱塩基リボヌクレオシド模倣体の合成方法。７０．ＲＮＡの脱保護の方法であって、水性エチルアミン（ＥＡ）を２５℃−６０℃で５−３０分間提供して、保護ＲＮＡから環外アミノ保護基を除去する工程を含む方法。７１．前記エチルアミンが４０℃で１０分間提供される、請求項７０記載の方法。７２．前記エチルアミンが５５℃で１０分間提供される、請求項７０記載の方法。７３．前記基を無水トリエチルアミン・フッ化水素（ａＨＦ・ＴＥＡ）トリメチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンと６０℃−７０℃で０．２５−２４時間接触させることを含む、さらにＲＮＡアルキルシリル保護基の脱保護を含む請求項７０記載の方法。７４．前記ＲＮＡが酵素的ＲＮＡである、請求項７０−７３のいずれかに記載の方法。７５．酵素的核酸を合成する方法であって、独立した化学的反応性基をそれぞれ５’および３’位に有する前記酵素的核酸の３’部分および５’部分を、前記３’および５’位の間に前記化学的反応性基により共有結合が形成される条件下で用意し、前記結合は、ジスルフィド、モルホリノ、アミド、エーテル、チオエーテル、アミン、二重結合、スルホンアミド、エステル、カーボネート、ヒドラゾンからなる群より選択され、前記結合は５’ ホスフェート基と３’ヒドロキシル基との間に形成される天然の結合ではない、の工程を含む方法。７６．前記核酸がハンマーヘッドモチーフを有し、前記３’および５’位がそれぞれステムＩＩ領域中またはこれに隣接して前記化学的反応性基を有する、請求項７５記載の方法。７７．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＳＨであり、化学的反応性基の他方が（ＣＨ₂）_nＳＨであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。７８．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方がリボースであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。７９．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方がＣＯＯＨであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。８０．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＸであり、化学的反応性基の他方が（ＣＨ₂）_nＯＨまたは（ＣＨ₂）_nＳＨであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよく、Ｘはハロゲンである、請求項７５記載の方法。８１．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方がＣＨＯであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。８２．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＰＰｈ₃であり、化学的反応性基の他方がＣＨＯであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。８３．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方が（ＣＨ₂）_nＳＯ₂Ｃｌであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。８４．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＯＨであり、化学的反応性基の他方がＣＯＯＨであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。８５．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＣＯＨであり、化学的反応性基の他方が（ＣＨ₂）_nＮＨ₂であり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。８６．前記化学的反応性基の一方が（ＣＨ₂）_nＣＯＸであり、化学的反応性基の他方が（ＣＨ₂）_nＯＨであり、ここでそれぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。８７．前記条件が、ＮａＩＯ₄を前記リボースと接触させ、つづいてＮａＢＨ₄ またはＮａＣＮＢＨ₃を提供することを含む、請求項７８記載の方法。８８．前記条件がカップリング試薬を提供することを含む、請求項７９記載の方法。８９．（ＣＨ₂）_nＳＨ、（ＣＨ₂）_nＮＨ₂、リボース、ＣＯＯＨ、（ＣＨ₂）_n Ｘ、（ＣＨ₂）_nＰＰｈ₃、ＣＨＯ、（ＣＨ₂）_nＳＯ₂Ｃｌ、（ＣＨ₂）_nＣＯＸ、（ＣＨ₂）_nＸ、（ＣＨ₂）_nＯＨ、（ＣＨ₂）_nＣＯＨ、および（ＣＨ₂）_nＳＨ（式中、それぞれのｎは独立して０から１０の整数であり、同一または異なっていてもよく、Ｘはハロゲンである）からなる群よりそれぞれ選択される３’および５’ 化学的反応性基を有する酵素的核酸の５’部分および３’部分を含む混合物。９０．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＳＨであり、化学的反応性基の他方が連結基−ＳＨであり、ここでそれぞれの連結基は同一であっても異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。９１．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方がリボースである、請求項７５記載の方法。９２．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方がＣＯＯＨである、請求項７５記載の方法。９３．前記化学的反応性基の一方が連結基−Ｘであり、化学的反応性基の他方が連結基−ＯＨまたは連結基−ＳＨであり、ここでそれぞれの連結基は同一であっても異なっていてもよく、Ｘはハロゲンである、請求項７５記載の方法。９４．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方がＣＨＯである、請求項７５記載の方法。９５．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＰＰｈ₃であり、化学的反応性基の他方がＣＨＯである、請求項７５記載の方法。９６．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＮＨ₂であり、化学的反応性基の他方が連結基−ＳＯ₂Ｃｌであり、ここでそれぞれの連結基は同一であっても異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。９７．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＯＨであり、化学的反応性基の他方がＣＯＯＨである、請求項７５記載の方法。９８．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＣＯＨであり、化学的反応性基の他方が連結基−ＮＨ₂であり、ここでそれぞれの連結基は同一であっても異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。９９．前記化学的反応性基の一方が連結基−ＣＯＸであり、化学的反応性基の他方が連結基−ＯＨであり、ここでそれぞれの連結基は同一であっても異なっていてもよい、請求項７５記載の方法。１００．前記条件が、ＮａＯＩ₄を前記リボースと接触させること、および続いてＮａＢＨ₄またはＮａＣＮＢＨ₃を提供することを含む、請求項９１記載の方法。１０１．前記条件がカップリング試薬を提供することを含む、請求項１００記載の方法。１０２．連結基−ＳＨ、連結基−ＮＨ₂、リボース、ＣＯＯＨ、連結基−Ｘ、連結基−ＰＰｈ₃、ＣＨＯ、連結基−ＳＯ₂Ｃｌ、連結基−ＣＯＸ、連結基−Ｘ、連結基−ＯＨ、連結基−ＣＯＨ、および連結基−ＳＨ（式中、それぞれの連結基は同一または異なり、Ｘはハロゲンである）からなる群よりそれぞれ選択される３’および５’化学的反応性基を有する酵素的核酸の５’部分および３’部分を含む混合物。１０３．所望の治療的ＲＮＡ部分を含む転写された天然に生じないＲＮＡ分子であって、前記分子は前記ＲＮＡ中の３’領域と５’相補的ヌクレオチドとの間の塩基対形成相互作用により形成された分子内ステムを含み、前記ステムは少なくとも８塩基対を含み、前記分子はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターシステムから転写されることを特徴とするＲＮＡ分子。１０４．所望の治療的ＲＮＡ部分を含む転写された天然に生じないＲＮＡ分子であって、前記分子は前記ＲＮＡ中の３’領域と５’相補的ヌクレオチドとの間の塩基対形成相互作用により形成された分子内ステムを含み、前記ステムは少なくとも８塩基対を含み、前記分子はＵ６小核ＲＮＡプロモーターシステムから転写されることを特徴とするＲＮＡ分子。１０５．所望の治療的ＲＮＡ部分を含む転写された天然に生じないＲＮＡ分子であって、前記分子は前記ＲＮＡ中の３’領域と５’相補的ヌクレオチドとの間の塩基対形成相互作用により形成された分子内ステムを含み、前記ステムは少なくとも８塩基対を含み、前記分子はアデノウイルスＶＡ１ＲＮＡプロモーターシステムから転写されることを特徴とするＲＮＡ分子。１０６．所望の治療的ＲＮＡ部分を含む転写された天然に生じないＲＮＡ分子であって、前記分子は前記ＲＮＡ中の３’領域と５’相補的ヌクレオチドとの間の塩基対形成相互作用により形成された分子内ステムを含み、前記ステムは少なくとも８塩基対を含み、前記分子はキメラアデノウイルスＶＡ１ＲＮＡであることを特徴とするＲＮＡ分子。１０７．所望の治療的ＲＮＡ部分を含む転写された天然に生じないＲＮＡ分子であって、前記分子は前記ＲＮＡ中の３’領域と５’相補的ヌクレオチドとの間の塩基対形成相互作用により形成された分子内ステムを含み、前記ステムは少なくとも８塩基対を含み、前記分子内ステムはスペーサー配列により前記所望のＲＮＡから分離されていることを特徴とするＲＮＡ分子。１０８．前記スペーサー配列が約５−５０ヌクレオチドである、請求項１０７記載のＲＮＡ分子。