JP2000507833A

JP2000507833A - Ｂ７タンパク質の発現を調節するためのオリゴヌクレオチド組成物および方法

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Publication number: JP2000507833A
Application number: JP10530085A
Authority: JP
Inventors: ベネット，シー・フランク; ヴィッカーズ，ティモシー・エイ
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2000-06-27
Anticipated expiration: 2017-12-16
Also published as: CA2274581A1; EP0957926B1; DE69732535T2; EP0957926A4; AU720969B2; KR100452105B1; WO1998029124A1; EP0957926A1; ATE289200T1; ES2238083T3; US6077833A; DE69732535D1; AU5705198A; KR20000062274A; CA2274581C; JP3471025B2

Abstract

(57)【要約】Ｔ細胞の活性化を調節することによる治療に敏感な免疫状態及び障害を診断、予防及び治療するための組成物及び方法が提供される。好ましい態様によると、Ｂ７タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂ７タンパク質の発現を調節するためのオリゴヌクレオチド組成物および方法発明の分野本発明は、Ｔ細胞の活性化の調節に応答する疾患状態の診断薬、研究用試薬及び治療薬に関する。特には、本発明は、Ｔ細胞の活性化を調節するタンパク質の合成に関与する特定の伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）又はＤＮＡとのアンチセンスオリゴヌクレオチドの相互作用に関する。Ｂ７タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズするように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。これらのオリゴヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡの活性の調節、したがってＴ細胞の活性化の調節につながることが見出されている。対症、治療及び予防効果が生じる。また、本発明は、Ｂ７タンパク質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第２の抗炎症剤、例えば、細胞間相互作用を媒介するタンパク質、例えば、細胞接着分子（ＩＣＡＭ）タンパク質に対する第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせで含む医薬組成物にも関する。発明の背景炎症は、感染性及び傷害性作用因子の破壊及び損傷組織の単離を生じる、傷害、感染又は組織破壊に応答して組織が起こす局在性防御応答である。典型的な炎症応答は以下のように進行する：外来物としての抗原の認識又は組織損傷の認識、可溶性媒介物の合成及び放出、感染又は組織損傷部位への炎症細胞の召集、侵入生物又は損傷組織の破壊及び除去、並びにひとたび侵入生物又は損傷が解決された後のこの系の非活性化。炎症性成分による多くのヒトの疾患においては、その炎症性応答を和らげる正常なホメオスタシス機構が欠けており、そのために正常組織の損傷及び破壊が生じる。上述の段階の各々で、細胞−細胞相互作用が免疫応答の活性化に関与する。正常な炎症応答において最も早期に検出される出来事の１つは、血管内皮への白血球の付着、次いで脈管構造を出て感染又は傷害部位に向かう白血球の移動である。一般には、炎症部位に現れる最初の炎症細胞は好中球であり、単球及びリンパ球がそれに続く。細胞−細胞相互作用はＢリンパ球（Ｂ細胞）及びＴリンパ球（Ｔ細胞）の両者の活性化にも重要であり、これらは、それぞれ、体液性及び細胞性免疫応答を強化する。免疫系の大きな特徴は自己（宿主）と非自己（外来性侵入物）とを区別するその能力である。免疫系が示すこの顕著な特異性は主としてＴ細胞が媒介する。Ｔ細胞は感染に対する宿主の防御に関与するが、移植された組織の器官損傷をも媒介し、移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）及び幾つかの自己免疫疾患における細胞の攻撃にも寄与する。抗原特異的免疫応答を誘発するためには、Ｔ細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって届けられる信号を受け取らなければならない。Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用は３つの段階に分割することができる：細胞の付着、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の認識、及び同時刺激。Ｔ細胞の活性化の誘発にはＡＰＣからの少なくとも２つの別々の信号が必要である。第１の信号は抗原特異的であり、ＡＰＣの表面上に発現した主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質、又はＭＨＣ関連ＣＤ１タンパク質に関連してＴＣＲが抗原と相互作用する場合に生じる（“分化クラスター”を意味する“ＣＤ”は異なるＴ細胞表面分子を示すのに用いられる用語である）。第２の（同時刺激の）信号は、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２８と、Ｂ７ファミリーのタンパク質の一員であるＡＰＣ上のそのリガンドとの相互作用に関与する。４４キロダルトンのポリペプチドのジスルフィド結合ホモダイマーであり、かつ免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であるＣＤ２８は、Ｔ細胞を活性化し、かつサイトカインを産生するための、休止Ｔ細胞表面上の主要同時刺激信号受容体の１つである（Allison，Curr．0pin．Immunol.，1994，6，414;Lins1ey 及びLedbetter，Annu．Rev．Immunol.，1993，11，191；Juneら，Immunol．Toda y，1994，15，321）。ＣＤ２８を介する信号伝達は、ＴＣＲ信号伝達と共に相乗的に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生及び未変性Ｔ細胞の増殖の両者を増強する作用をする。Ｂ７−１（別名ＣＤ８０）がＣＤ２８について同定された最初のリガンドであった（Liu及びLinsley，Curr．opin．Immunol.，1992，4 ，265）。Ｂ７−１は通常低水準でＡＰＣ上に発現するが、サイトカインによる活性化又はＣＤ４０のような細胞表面分子のライゲーションの後に上方調節される（Lenschowら，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，1993，90，11054； Nabaviら，Nature，1992，360，266）。初期の研究からはＢ７−１が同時刺激を媒介するＣＤ２８リガンドであることが示唆された（Reiserら，Proc．Natl．Ac ad．Sci．U．S．A.，1992，89，271；Wuら，J．Exp．Med.，1993，178，1789；H arlanら，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，1994，91，3137）。しかしながら、基礎的な混合リンパ球反応に対する抗Ｂ７−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の効果が最小であり、Ｂ７−１欠損マウスが抗原に対して正常に応答することが続いて立証された（Lenschowら，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，1993，90 ，11054；Freemanら，Science，1993，262，909）結果、ＣＤ２８受容体に対する第２のリガンド、Ｂ７−２（別名ＣＤ８６）が発見された。抗Ｂ７−１ｍＡｂとは対照的に、抗Ｂ７−２ｍＡｂはＴ細胞増殖及びサイトカイン産生の強力な阻害因子である（Wuら，J．Exp．Med.，1993，178，1789；Chenら，J．Immunol.， 1994，152，2105；Lenschowら，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，1993，90， 11054）。Ｂ７：ＣＤ２８信号伝達は他のＴ細胞同時刺激経路、例えば、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）信号伝達の必要成分である可能性がある（ Yangら，Science，1996，273，1862）。ＣＤ２８に結合することに加えて、Ｂ７−１及びＢ７−２は細胞溶解性Ｔ−リンパ球関連タンパク質ＣＴＬＡ４に結合する。ＣＴＬＡ４は、構造的にＣＤ２８に関連するが活性化の後にだけＴ細胞上に発現するタンパク質である（Linsley ら，J．Exp．Med.，1991，174，561）。ＣＴＬＡ４の可溶性組換え形態ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ＣＤ２８又はＢ７タンパク質に対するモノクローナル抗体よりも有効なＢ７：ＣＤ２８相互作用の阻害因子であることが決定されている。ＣＴＬＡ４−Ｉｇでのイン・ビボ処置により、ヒツジ赤血球又は可溶性抗原に対する抗体の形成の阻害（Linsleyら，Science，1992，257，792）、心臓同種移植片及び膵島異種移植片の生存の長期化（Linら，J．Exp．Med.，1993，178，1801； Lenschowら，1992，Science，257，789；Lenschowら，Curr．0pin．Immunol.，1 993，5(5)，747-52）、及びＧＶＨＤにおける免疫応答の大幅な抑制（Hakimら， J．Immun.，1995，155，1760）が生じた。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４は、両者とも共通のＢ７受容体を介して作用するにも関わらず、それぞれ反対の同時刺激及び阻害機能を果たすことが提唱されている（Allisonら，Science，1995，270，932 ）。１９９４年６月８日（A2）公開の欧州特許出願ＥＰ０６００５９１では、腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、患者由来の腫瘍細胞をＢ７−１タンパク質を発現するように生体外で組換えにより加工した後、それを患者に再導入する方法が開示されている。その結果、Ｂ７形質移入腫瘍細胞及び非形質移入腫瘍細胞の両者に対して免疫学的応答が刺激される。１９９５年２月２日公開の国際公開ＷＯ９５／０３４０８では、Ｂ７−２タンパク質を含む、Ｔ細胞の活性化を同時刺激する新規ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドをコードする核酸が開示されている。Ｂ７−２タンパク質に対する抗体及びＢ７−２タンパク質を産生する方法も開示されている。１９９５年２月２３日公開の国際公開ＷＯ９５／０５４６４では、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ４−Ｉｇに結合する、Ｂ７−１以外のポリペプチドが開示されている。このようなポリペプチドをコードする核酸を入手する方法も開示されている。１９９５年３月９日公開の国際公開ＷＯ９５／０６７３８では、Ｂ７−２（別名Ｂ７０）タンパク質をコードする核酸が開示されている。Ｂ７−２タンパク質に対する抗体及びＢ７−２タンパク質を産生する方法も開示されている。１９９５年３月１５日(A1)公開の欧州特許出願ＥＰ０６４３０７７では、Ｂ７ −２（別名Ｂ７０）タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体が開示されている。Ｂ７−２タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する方法も開示されている。１９９５年７月１８日発行の米国特許第５,４３４,１３１号では、Ｂ７タンパク質のリガンドとしてのＣＴＬＡ４タンパク質が開示されている。ＣＴＬＡ４融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）を産生する方法及びＢ７タンパク質又はＣＴＬＡ４タンパク質に対する抗体を用いて免疫応答を調節する方法も開示されている。１９９５年８月２４日公開の国際公開ＷＯ９５／２２６１９では、Ｂ７−２タンパク質には結合しない、Ｂ７−１タンパク質に特異的な抗体が開示されている。Ｂ７−１タンパク質に対する抗体を用いて免疫応答を調節する方法も開示されている。１９９５年１２月２１日公開の国際公開ＷＯ９５／３４３２０では、同時刺激作用因子を阻害する第１作用因子、例えばＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、及び細胞接着を阻害する第２作用因子、例えば抗ＬＦＡ−１抗体、を用いてＴ細胞応答を阻害する方法が開示されている。このような方法が、移植組織又は器官の拒絶を阻止するのに特に有用であることが示されている。１９９５年１２月７日公開の国際公開ＷＯ９５／３２７３４では、Ｂ７分子の上方調節を妨げ、又は抗原提示細胞上でのＩＣＡＭ−３の発現を減少させるＦｃ γＲＩＩ架橋因子が開示されている。このようなＦｃγＲＩＩ架橋因子は、凝集ヒトＩｇＧ分子又はヒトＩｇＧ分子の凝集Ｆｃ断片のようなタンパク質を含む。１９９６年４月１８日（A2）及び１９９６年５月１７日（A3）公開の国際公開ＷＯ９６／１１２７９では、（１）Ｂ７−１及びＢ７−２を含む１種類以上の免疫刺激作用因子並びに（２）疾患原因作用因子由来の抗原をコードする遺伝子配列を含む組換えウイルスが開示されている。このような組換えウイルスを用いて疾患を治療する方法も開示されている。現在まで、Ｂ７−１及びＢ７−２のようなＢ７タンパク質の発現を有効に調節し、かつそれを妨げる治療薬は知られていない。したがって、Ｂ７タンパク質のような重要な同時刺激分子を有効に調節する化合物及び方法に対する、長期間求められている必要性が存在する。Ｂ７タンパク質の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドが、様々な炎症もしくは自己免疫疾患、又は炎症性成分を伴う障害もしくは疾患、例えば、喘息、若年性糖尿病、筋無力症、グレーブス病、関節リウマチ、同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、エリテマトーデス、全身エリテマトーデス、糖尿病、多発性硬化症、接触性皮膚炎、鼻炎及び様々なアレルギーに対する活性を有する新規治療クラスの抗炎症剤を提供することが期待される。加えて、Ｂ７タンパク質の発現を調節することが可能なオリゴヌクレオチドは、Ｔ細胞の生体外増殖を操作する新規手段を提供する。発明の要旨本発明によると、Ｂ７−１又はＢ７−２をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、Ｂ７−１もしくはＢ７−２遺伝子から転写されるｍＲＮＡ又はその選択されたＤＮＡ部分に直接結合し、それにより、それぞれ、Ｂ７−１もしくはＢ７− ２ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量又はＢ７−１もしくはＢ７−２遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を調節するように設計されている。オリゴヌクレオチドは、同一性及び数の上で、特定の核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分なヌクレオチド配列を含むことができる。このようなオリゴヌクレオチドは、通常、“アンチセンス”と記載される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、研究用試薬、診断補助剤、及び治療薬として用いられる。それぞれＢ７−１及びＢ７−２タンパク質をコードするＢ７−１及びＢ７−２遺伝子がこのアプローチに特に馴染みやすいことが発見されている。Ｂ７の発現とＴ細胞の活性化及び増殖との関連の結果として、Ｂ７−１又はＢ７−２の発現の阻害はそれぞれＢ７−１又はＢ７−２の合成の阻害につながり、それによりＴ細胞の活性化及び増殖の阻害につながる。加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｂ７転写体の幾つかの代替スプライス済ｍＲＮＡのうちの１つの発現を阻害し、その結果として他の代替スプライス済Ｂ７ｍＲＮＡの発現を増強させるのに用いることができる。このような調節は、様々な炎症もしくは自己免疫障害もしくは疾患、又は炎症性成分を伴う障害もしくは疾患、例えば、喘息、若年性糖尿病、筋無力症、グレーブス病、関節リウマチ、同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、エリテマトーデス、全身エリテマトーデス、糖尿病、多発性硬化症、接触性皮膚炎、鼻炎、様々なアレルギー、並びに癌及びそれらの転移の治療に望ましい。さらに、このような調節は、このような疾患もしくは障害に罹患しやすいことが疑われ、又は罹患しやすいことが知られる動物におけるこのような疾患もしくは障害の発症を予防もしくは調節するのに望ましい。動物を、Ｂ７タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドと接触させることを包含する方法がここで提供される。これらの方法は、例えば、様々な細胞の機能並びに生理学的プロセス及び状態でのＢ７タンパク質の発現の検出及びその役割の決定におけるツールとして、並びにそのような発現に関連する状態の診断に有用である。このような方法は、Ｂ７遺伝子（すなわち、Ｂ７−１又はＢ７−２）の発現の検出に用いることができ、したがって、治療及び診断の両者で有用であるものと信じられる。動物を、Ｂ７遺伝子と特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドと接触させることを包含する、Ｂ７タンパク質の発現を調節する方法がここで提供される。これらの方法は、Ｂ７の発現とＴ細胞の活性化及び増殖との関連の結果として、治療及び診断の両者で有用であるものと信じられる。また、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを用いてＴ細胞のＢ７関連活性化を阻害する方法をも包含する。異常な、もしくは過剰なＴ細胞の活性化及び増殖が生じる状態を治療する方法も提供される。これらの方法は本発明のオリゴヌクレオチドを用い、治療の上で、並びに臨床研究及び診断用のツールとして有用であるものと信じられる。本発明のオリゴヌクレオチドは研究の目的で用いることもできる。このように、本発明のオリゴヌクレオチドによって示される特異的ハイブリダイゼーションは検定、精製、細胞産生物の調製及び当業者が予期し得る他の方法論において用いることができる。ここに開示される方法は、例えば、様々な免疫系の機能並びに生理学的プロセス及び状態でのＢ７−１もしくはＢ７−２の発現の検出及びそれらの役割の決定における臨床研究ツールとして、並びにそれらの発現に関連する状態の診断に有用でもある。本発明のオリゴヌクレオチドによって示される特異的ハイブリダイゼーションは検定、精製、細胞産生物の調製及び当業者が予期し得る他の方法論において用いることができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはＢ７タンパク質をコードする核酸に特異的にハイブリダイズするため、サンドイッチ及び他の検定を構築してこの事実を利用することが容易にできる。本発明のオリゴヌクレオチドの、試料中に存在するＢ７タンパク質をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションの検出は定型的に達成することができる。このような検出には、酵素結合、放射標識又は他の適切な検出系によって本発明のオリゴヌクレオチドを検出可能に標識することが含まれる。本発明を用いて多くの検定を創出することができ、これらの検定は、通常、組織もしくは細胞試料を検出可能に標識した本発明のオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション及び標識の検出によるそのようなハイブリダイゼーションの測定が可能となるように選択された条件下で接触させることを包含し、このような条件は当業者によって理解されるものである。図面の簡単な説明図１は、示されたオリゴヌクレオチドの、ＣＯＳ−７細胞におけるＢ７−１タンパク質の発現に対する阻害効果を示す棒グラフである。図２は、オリゴヌクレオチドの、Ｂ７−１の細胞表面発現に対する阻害効果を示す用量−応答曲線である。実線、ＩＳＩＳ１３８１２；破線、ＩＳＩＳ１３８００；点線、ＩＳＩＳ１３８０５。図３は、示されたオリゴヌクレオチドの、ＣＯＳ−７細胞におけるＢ７−２の細胞表面発現に対する阻害効果を示す棒グラフである。図４は、ＩＳＩＳ１０３７３（２０量体）及びＩＳＩＳ１０９９６（１５量体）を含む示されたオリゴヌクレオチドの、ＣＯＳ−７細胞におけるＢ７−２の細胞表面発現に対する阻害効果を示す棒グラフである。図５は、オリゴヌクレオチドによるＢ７−１又はＢ７−２タンパク質発現の阻害の特異性を示す棒グラフである。交差斜線付きの棒、Ｂ７−１の水準；縞付きの棒、Ｂ７−２の水準。図６は、ＩＣＡＭ−１（ＩＳＩＳ２３０２）又はＢ７−２（ＩＳＩＳ１０３７３）に対するアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドの、ＩＣＡＭ−１及びＢ７−２タンパク質の細胞表面発現に対する阻害効果を示す用量−応答曲線である。×を伴う実線、ＩＳＩＳ１０３７３で処理した細胞上のＢ７−１タンパク質の水準；アスタリスクを伴う破線、ＩＳＩＳ１０３７３で処理した細胞上のＩＣＡＭ−１タンパク質の水準；三角形を伴う実線、ＩＳＩＳ２３０２で処理した細胞上のＢ７−１タンパク質の水準；方形を伴う実線、ＩＳＩＳ１０３７３で処理した細胞上のＩＣＡＭ−１の水準。図７は、示されたオリゴヌクレオチドの、Ｔ細胞の増殖に対する効果を示す棒グラフである。図８は、オリゴヌクレオチドの、ＣＯＳ−７細胞におけるネズミＢ７−２タンパク質の発現に対する阻害効果を示す用量−応答曲線である。アスタリスクを伴う実線、ＩＳＩＳ１１６９６；三角形を伴う破線、ＩＳＩＳ１１８６６。図９は、オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１６９６及びＩＳＩＳ１１８６６の、ＩＣ−２１細胞におけるネズミＢ７−２タンパク質の細胞表面発現に対する効果を示す棒グラフである。左（黒）の棒、オリゴヌクレオチドなし；中央の棒、３ μＭの示されたオリゴヌクレオチド；右の棒、１０μＭの示されたオリゴヌクレオチド。発明の詳細な説明本発明は、Ｂ７−１及びＢ７−２を含むＢ７タンパク質をコードするＲＮＡ及びＤＮＡの機能のアンチセンス阻害に用いられるオリゴヌクレオチドを用いる。また、本発明は、そのようなタンパク質をコードするＤＮＡ又は伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズし、最終的にそれらそれぞれの遺伝子から転写されるそのようなタンパク質の量を調節するように設計されているオリゴヌクレオチドも用いる。このようなｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションはｍＲＮＡの正常な役割を妨害し、細胞内でのその機能を調節する。妨害しようとするｍＲＮＡの機能には全ての生命維持機能、例えば、タンパク質の翻訳部位へのＲＮＡの移行、ＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、及び、おそらくはＲＮＡが携わり得る独立した酵素活性でさえが含まれる。このようなｍＲＮＡ機能の妨害の全体的な効果はＢ７タンパク質の発現の調節であり、ここで、“調節”はＢ７タンパク質の発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の脈絡においては、阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態である。オリゴヌクレオチドは、同一性及び数の上で、特定の核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分なヌクレオチド配列を含むことができる。遺伝子のセンス鎖の一部と特異的にハイブリダイズするこのようなオリゴヌクレオチドは、通常、 “アンチセンス”と記載される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、研究用試薬、診断補助剤、及び治療薬として用いられる。例えば、優れた特異性で遺伝子の発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するのに、例えば、生物学的経路の様々な構成要素の機能を区別するのに、当業者によってしばしば用いられる。したがって、この特異的阻害効果は当業者によって研究用途で利用されている。オリゴヌクレオチドの特異性及び感受性は当業者により治療用途にも利用されている。例えば、以下の米国特許にはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる対症、治療及び他の方法が示されている。米国特許第５,１３５,９１７号は、ヒトインターロイキン−１受容体の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第５,０９８,８９０号はｃ−ｍｙｂ癌遺伝子と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及び特定の癌状態のアンチセンスオリゴヌクレオチド治療に向けられている。米国特許第５,０８７,６１７号は癌患者をアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療する方法を提供する。米国特許第５,１６６,１９５号はＨＩＶのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。米国特許第５,００４, ８１０号は単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５ｍＲＮＡとハイブリダイズし、かつ複製を阻害することが可能なオリゴマーを提供する。米国特許第５,１９４,４２８号はインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第４,８０６,４６３号はアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＨＴＬＶ−IIIの複製の阻害にそれらを用いる方法を提供する。米国特許第５,２８６,７１７号は癌遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第５,２７６,０１９号及び米国特許第５,２６４,４２３号は細胞内での外来性核酸の複製の防止に用いられるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体に向けられている。米国特許第４, ６８９,３２０号はＣＭＶに特異的な抗ウイルス剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドに向けられている。米国特許第５,０９８,８９０号はヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写体の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第５,２４２,９０６号は潜伏ＥＢＶ感染の治療において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスの攻撃の標的を特定の遺伝子とすることが好ましい。オリゴヌクレオチドの関連核酸への“ターゲッティング”は、本発明の脈絡においては、多段階プロセスである。このプロセスは、通常、その機能を調節しようとする核酸配列の同定から開始される。これは、例えば、その発現が特定の障害もしくは疾患状態に関連する細胞性遺伝子（もしくはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、又は感染性作用因子に由来する外来性核酸であり得る。本発明においては、標的は、幾つかの免疫系の障害及び疾患（例えば、炎症及び自己免疫疾患）に加えて、表面上は“正常な”免疫反応（例えば、移植組織に対する宿主動物の拒絶）に関連する細胞性遺伝子であって、それに対する調節が特定の場合に望ましい遺伝子である。また、ターゲッティングプロセスには、所望の効果、そのタンパク質の発現の検出もしくは調節のいずれか、が生じるようにオリゴヌクレオチドを相互作用させるための領域（１つもしくは複数）をこの遺伝子内に決定することが含まれる。ひとたび標的領域が同定されたら、その標的と十分に相補的であり、すなわち、十分良好にハイブリダイズし、かつ所望の効果をもたらすのに十分な特異性を有するオリゴヌクレオチドを選択する。一般には、アンチセンス調節の標的とすることができる５つの領域が存在する：５'非翻訳領域（以下、“５'−ＵＴＲ”）、翻訳開始コドン領域（以下、“ｔＩＲ”）、読取り枠（以下、“ＯＲＦ”）、翻訳終止コドン領域（以下、“ｔＴＲ”）、及び３'非翻訳領域（以下、“３'−ＵＴＲ”）。当該技術分野において公知のように、これらの領域は典型的な伝令ＲＮＡ分子において以下の順序で配置されている（左から右、５'から３'）：５'−ＵＴＲ、ｔＩＲ、ＯＲＦ、ｔＴＲ、３'−ＵＴＲ。当該技術分野において公知のように、幾つかの真核生物の転写体は直接翻訳されるものの、多くのＯＲＦは１つ以上の“イントロン’として知られる配列を含み、これらは翻訳される前に転写体から切除される；ＯＲＦの発現した（切除されなかった）部分は“エクソン”と呼ばれる（Albertsら,Mole cu1ar Biology of the Cell，１９８３,Garland Publishing Inc.,New York,pp ．411-415）。さらに、多くの真核生物のＯＲＦは長さが１０００ヌクレオチド以上であるため、ＯＲＦを、例えば、５'ＯＲＦ領域、中央ＯＲＦ領域、及び３' ＯＲＦ領域に細分することがしばしば好都合である。幾つかの場合には、ＯＲＦは、イン・ビボでの機能的重要性のために標的とすることができる１つ以上の部位を含む。後者の型の部位の例には、遺伝子内ステム−ループ構造（例えば、米国特許第５,５１２,４３８号を参照）及び、未処理ｍＲＮＡ分子において、イントロン／エクソンスプライス部位が含まれる。本発明の脈絡の中で、好ましい遺伝子内部位の１つは、その遺伝子の読取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンを含む領域である。当該技術分野において公知のように、翻訳開始コドンは典型的には５'−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５'−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは“ＡＵＧコドン”、“スタートコドン（start codon）”又は“ＡＵＧスタートコドン”とも呼ばれる。若干の遺伝子はＲＮＡ配列５'−ＧＵＧ、５'−ＵＵＧ又は５'−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを含み、５'−ＡＵＡ、５'−ＡＣＧ及び５'−ＣＵＧがイン・ビボで機能することが示されている。さらに、５−ＵＵＵがイン・ビトロで翻訳開始コドンとして機能する（Brigstockら，Growth Factors，1990，4，45；Gelber tら，Somat．Cell．Mol．Genet.，1990，16，173；Gold及びStormo,in：Escheri chia coli and Salmonella typhimurium：Cellular and Molecular Biology，Vo l.2，1987，Neidhardtら,eds.，American Society for Microbiology，Washingt on,D.C.，p.1303）。したがって、“翻訳開始コドン”及び“スタートコドン” という用語は、各々の場合における開始アミノ酸が典型的にはメチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物）ではあるものの、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物及び原核生物の遺伝子が２つ以上の代替スタートコドンを有することがあり、それらのうちのいずれをも特定の細胞型もしくは組織において、又は特定の一組の条件の下で、異なるアミノ末端配列を有する関連ポリペプチドを産生するために優先的に用いることができることも当該技術分野において公知である（Markussenら，Development，1995，121，3723：Gaoら， Cancer Res.，1995，55，743；McDermottら，Gene，1992，117，193；Perriら， J．Biol．Chem.，1991，266，12536；Frenchら，J．Virol．1989，63，3270；Pu shpa-Rekhaら，J．Biol．Chem.，1995，270，26993；Monacoら，J．Biol．Chem. ，1994，269，347；DeVirgilioら，Yeast，1992，8，1043；Kanagasundaramら， Biochim．Biophys．Acta，1992，1171，198；Olsenら，Mol．Endocrinol.，1991 ，5，1246；Saulら，Apple．Environ．Microbiol.，1990，56，3117；Yaoitaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1990，87，7090； Rogersら，EMBO J.，1990，9，2273）。本発明の脈絡において、“スタートコドン”及び“翻訳開始コドン”は、Ｂ７タンパク質をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳の開始にイン・ビボで用いられるコドン（１つもしくは複数）を指し、これはそのようなコドンの配列（１つもしくは複数）とは無関係である。遺伝子の翻訳終止コドン（又は“ストップコドン（stop codon）”）が３つの配列、すなわち、５'−ＵＡＡ、５'−ＵＡＧ及び５'−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５'−ＴＡＡ、５'−ＴＡＧ及び５'−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得ることも当該技術分野においては公知である。“スタートコドン領域”及び“翻訳開始領域”という用語は、翻訳開始コドンから、いずれの方向へであっても（すなわち、５'又は３'）約２５〜約５０の連続するヌクレオチドを含むようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を指す。同様に、“ストップコドン領域”及び“翻訳終止領域”という用語は、翻訳終止コドンから、いずれの方向へであっても（すなわち、５'又は３'）約２５〜約５０の連続するヌクレオチドを含むようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を指す。本発明の脈絡において、“オリゴヌクレオチド”という用語はリボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマーを指す。この用語には、天然ヌクレオベース(nucleobase)、糖及び共有結合糖間（主鎖）結合を含んでなるオリゴヌクレオチドに加えて、同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾もしくは置換オリゴヌクレオチドは、その望ましい特性、例えば、細胞の取り込みの強化、標的への結合の強化及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増加により、しばしば本来の形態よりも好ましい。本発明で想定される幾つかの好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体的な例には、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合を有するものが含まれる。最も好ましいものは、ホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチド、並びにＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ(ＣＨ₃)−Ｏ− ＣＨ₂［メチレン（メチルイミノ）もしくはＭＭＩ主鎖として知られる］、ＣＨ₂ −Ｏ−Ｎ(ＣＨ₃)−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ(ＣＨ₃)−Ｎ(ＣＨ₃)−ＣＨ₂及びＯ−Ｎ(ＣＨ₃)−ＣＨ₂−ＣＨ₂主鎖を有するものであり、ここで、未変性のホスホジエステル主鎖はＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂で表される。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい（Summerton及びWeller）米国特許第５,０３４,５０６号）。ＮＲ−Ｃ(^*)−ＣＨ₂−ＣＨ₂、ＣＨ₂−ＮＲ−Ｃ(^*)−ＣＨ₂、ＣＨ₂−ＣＨ₂− ＮＲ−Ｃ(^*)、Ｃ(^*)−ＮＲ−ＣＨ₂−ＣＨ₂及びＣＨ₂−Ｃ(^*)−ＮＲ−ＣＨ₂主鎖を有するオリゴヌクレオチドがさらに好ましく、ここで、“^*”はＯ又はＳを表す（アミド主鎖として知られる；DeMesmaekerら，１９９２年１１月２６日公開のＷＯ９２／２０８２３）。他の好ましい態様、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）主鎖においては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖で置換されており、ヌクレオベースはこのポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接、もしくは間接的に結合する（Nielsenら,Science，1991，254,1497；米国特許第５,５３９,０８２号）。他の好ましい修飾オリゴヌクレオチドは、以下のもののうちの１つを２'位に有する１つ以上の置換糖部分を含み得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ₃ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂Ｏ(ＣＨ₂)_nＣＨ₃、Ｏ(ＣＨ₂)_n ＮＨ₂もしくはＯ(ＣＨ₂)_nＣＨ₃（ここで、ｎは１〜約１０である）；Ｃ₁〜Ｃ₁₀ 低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールもしくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ₃；ＯＣＦ₃；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ− アルキル；Ｏ−、Ｓ−、Ｎ−アルケニル；ＳＯＣＨ₃；ＳＯ₂ＣＨ₃；ＯＮＯ₂；ＮＯ₂；Ｎ₃；ＮＨ₂；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ開裂基；リポーター基；介在基（インターカレーター）；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基及び同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には２'−メトキシエトキシ［２' −Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃、別名２'−Ｏ−(２−メトキシエチル)］が含まれる（ Martinら，Helv．Chim．Acta，1995，78，486）。他の好ましい修飾には、２'− メトキシ(２'−Ｏ−ＣＨ₃)、２'−プロポキシ(２'−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃)及び２' −フルオロ(２'−Ｆ)が含まれる。同様の置換をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特には、３'末端ヌクレオチド上の糖の３'位及び５'末端ヌクレオチド上の５'位で行うことができる。また、オリゴヌクレオチドは、ペ゜ントフラノシル基の代わりに糖模倣体、例えば、シクロブチルを有していてもよい。さらに、又はその代わりに、本発明のオリゴヌクレオチドはヌクレオベースの修飾又は置換を含んでいてもよい。ここで用いられる場合、“非修飾”又は“天然”ヌクレオベースにはアデニン(Ａ)、グアニン(Ｇ)、チミン(Ｔ)、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾ヌクレオベースには、天然核酸においては希に、もしくは一時的にのみ見出されるヌクレオベース、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲンチオビオシルＨＭＣ、さらに合成ヌクレオベース、例えば、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ⁶(６−アミノヘキシル)アデニン及び２,６−ジアミノプリンが含まれる（Kornberg,A.，DNA Replication，1974，W .H．Freeman & Co.，SanFrancisco，1974，pp.75-77；Gebeyehu,G.ら，Nucleic Acids Res.，1987，15，4513）。本発明のオリゴヌクレオチドの他の好ましい追加の、もしくは代わりの修飾にはオリゴヌクレオチドへの１つ以上の親油性部分の化学結合が含まれ、これはそのオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを強化する。このような親油性部分は、オリゴヌクレオチドに、そのオリゴヌクレオチド上の幾つかの異なる位置で結合させることができる。幾つかの好ましい位置には、３'末端ヌクレオチドの糖の３'位、５'末端ヌクレオチドの糖の５'位、及びあらゆるヌクレオチドの糖の２'位が含まれる。プリンヌクレオベースのＮ⁶位も、本発明のオリゴヌクレオチドに親油性部分を結合させるのに利用することができる（Gebeyehu,G.ら， NucleicAcids Res.，1987，4513）。このような親油性部分にはコレステリル部分（Letsingerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1989，86，6553）、コール酸（Manoharanら,Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharanら，Ann．N.Y．Acad．Sci.，1 992，660，306；Manoharanら，Bioorg．Med．Chem．Let.，1998，3，2765）、チオコレステロール（Oberhauserら，Nucl．Acids Res.，1992，20，533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら，EMBO J.，1991，10，111；Kabanovら,FEBS Lett.，1990，259，327； Svinarchukら，Biochimie，1993，75，49）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１,２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−rac−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharanら，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651；Sheaら，Nucl．Acids Res.，1990，18，3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharanら，Nucleosides & Nucle otides，1995，14，969）、又はアダマンタン酢酸（Manoharanら，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651）、パルミチル部分（Mishraら，Biochim．Biophys．Act a，1995，1264，229）、又はオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crookeら，J．Pharmacol．Exp．Ther.，19 96，277，923）が含まれるが、これらに限定されるものではない。米国特許第５ ,１３８,０４５号、第５,２１８,１０５号及び第５,４５９,２５５号（これらの内容は参照することによりここに組み込まれる）に開示されるもののような親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、及びそのようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法。本発明には、キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも含まれる。“キメラ”オリゴヌクレオチド又は“キメラ”は、本発明の脈絡においては、各々少なくとも１つのヌクレオチドで形成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には少なくとも１つの領域を含み、ここで、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞による取り込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加がこのオリゴヌクレオチドに付与されるように修飾されている。このオリゴヌクレオチドの追加領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することが可能な酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮＡ分解酵素ＨがＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮＡ分解酵素Ｈの活性化によりＲＮＡ標的の開裂が生じ、それにより遺伝子発現のアンチセンス阻害の効率が大きく高められる。ＲＮＡ標的の開裂はゲル電気泳動及び、必要であれば、当該技術分野において公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術により定型的に検出することができる。例として、このような“キメラ”は“ギャップマー（gapmer ）”、すなわち、その中央部分（“ギャップ”）が、例えばＲＮＡ分解酵素Ｈの、基質の役割を果たし、かつ５'及び３'部分（“両翼”）が標的ＲＮＡ分子に対するより高い親和性を有するもののヌクレアーゼ活性を支持することができないような様式で修飾されている（例えば、２'−フルオロ又は２'−メトキシエトキシ置換）オリゴヌクレオチドであり得る。他のキメラには、“ウィングマー（wingmer）”、すなわち、その５'部分が、例えばＲＮＡ分解酵素Ｈの、基質の役割を果たし、それに対して３'部分が標的ＲＮＡ分子に対するより高い親和性を有するもののヌクレアーゼ活性を支持することができないような様式で修飾され（例えば、２'−フルオロ又は２'−メトキシエトキシ置換）、又はその逆であるオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約３０のヌクレオチドを有する。このようなオリゴヌクレオチドは約１５〜２５のヌクレオチドを有することがより好ましい。当該技術分野において公知であるように、ヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート又は他の共有結合により隣接するヌクレオチドに適切に結合する塩基−糖の組み合わせである。本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、公知の固相合成技術により好都合に、かつ定型的に作製することができる。このような合成のための機器は、例えば、Applied Biosystems（Foster City、CA）を含む幾つかの製造元によって販売されている。これに加えて、又はそれに代えて、当該技術分野において公知の、このような合成のための他のあらゆる手段を用いることができる。同様の技術を他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体の調製に用いることも公知である。本発明のオリゴヌクレオチドは治療用化合物、診断用ツール並びに研究用試薬及びキットとして用いることができる。“治療的使用”という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドをイン・ビボ又は生体外のいずれかで動物細胞と接触させる、予防的、対症的及び治癒的な使用を含むことが意図されている。生体外で動物細胞と接触させる場合、治療的使用には、１種類以上の本発明のオリゴヌクレオチドで治療した後にそのような細胞を動物に組み込むことが含まれる。特定の有用性に結び付けることを意図するものではないが、本発明のオリゴヌクレオチドによる、例えばＴ細胞の増殖の、生体外調節は、例えば、ＡＰＣにおけるＢ７タンパク質の発現を調節することが望ましい潜在的な治療様式において用いることができる。例として、Ｂ７−１タンパク質の発現を阻害するオリゴヌクレオチドは、ＡＰＣの表面上のＢ７−２の有効性を高め、したがって、生体外でＴ細胞上のＢ７−２の同時刺激効果を高めることが期待される（Levineら，Science，1996, 272，1939）。治療的に使用するには、Ｂ７タンパク質の発現又は活性を調節することにより治療又は予防することができる疾患又は障害を有することが疑われる動物を、本発明に従ってオリゴヌクレオチドを投与することにより治療する。本発明のオリゴヌクレオチドは、有効量のオリゴヌクレオチドを適切な薬学的に許容し得る希釈剤又は担体に添加することにより、医薬組成物の形態で用いることができる。当該分野における研究者は、ウイルス性、真菌性及び代謝性疾患に関与する遺伝子の発現を調節することが可能な、アンチセンス、三重鎖及び他のオリゴヌクレオチド組成物を識別している。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに安全に投与されており、幾つかの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織及び動物、特にはヒトを治療するための治療措置において有用となるように構成することができる有用な治療手段であり得ることが確立されている。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞もしくは組織試料中のＢ７特異的核酸の存在を検出するのに用いることができる。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５'末端を³²Ｐ標識することにより放射標識オリゴヌクレオチドを調製することができる（Sambrookら，Molecular Cloning．A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Volume 2,pg.10.59）。次に、放射標識オリゴヌクレオチドをＢ７伝令ＲＮＡ（したがって、Ｂ７タンパク質）を含むことが疑われる細胞もしくは組織試料と接触させ、それらの試料を洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除去する。試料中に残留する放射能は結合したオリゴヌクレオチドの存在を示し、それはそのオリゴヌクレオチドと相補的な核酸の存在を示すものであり、これはシンチレーションカウンター又は他の定型的な手段を用いて定量することができる。このようにして、これらのタンパク質をコードする核酸の発現を検出する。また、本発明の放射標識オリゴヌクレオチドは、組織のオートラジオグラフィーを行って、研究、診断又は治療のためにＢ７タンパク質の局在化、分布及び定量化を決定するのにも用いることができる。このような研究においては、組織切片を放射標識オリゴヌクレオチドで処理して上述のように洗浄した後、定型的なオートラジオグラフィー手順に従って写真用エマルジョンに露出する。このエマルジョンは、現像すると、Ｂ７遺伝子を発現する領域全体にわたって銀粒子の画像を生じる。これらの銀粒子を定量化することにより、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の発現を検出することができ、これらの領域に対するオリゴヌクレオチドのターゲッティングが可能となる。Ｂ７核酸の発現を蛍光検出するための類似の検定を、放射標識の代わりにフルオレセイン又は他の蛍光タグが結合した本発明のオリゴヌクレオチドを用いて開発することができる。このような結合は、固相合成の間に、蛍光標識アミダイト又は多孔性ガラス（controlled pore glass）（ＣＰＧ）カラムを用いて定型的に達成される。フルオレセイン標識アミダイト及びＣＰＧは、例えば、Glen Research、Sterling VAから入手可能である。本発明は、Ｂ７タンパク質をコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチド及びそのようなタンパク質をコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを用いる。Ｂ７タンパク質の発現の有無を検出するためのキットも調製することができる。このようなキットは適切な遺伝子、すなわち、Ｂ７タンパク質をコードする遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドを含む。適切なキット及び検定の形式、例えば“サンドイッチ”検定、は当該技術分野において公知であり、本発明のオリゴヌクレオチドとの使用に容易に適合させることができる。本発明のオリゴヌクレオチドとＢ７タンパク質をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは当該技術分野において公知の手段により検出することができる。このような手段には、オリゴヌクレオチドへの酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射標識又は他のあらゆる適切な検出系が含まれ得る。Ｂ７タンパク質の有無を検出するためのキットも調製することができる。本発明の脈絡において、“ハイブリダイゼーション”は相補的ヌクレオチド間の水素結合を意味し、この水素結合はWatson-Crick、Hoogsteen又は逆 Hoogsteen水素結合であり得る。例えば、アデニン及びチミンが、その対が水素結合の形成によるものである相補的ヌクレオベースである。ここで用いられる場合、“相補的”は、２つのヌクレオチドの間で正確に対を形成する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することが可能である場合、そのオリゴヌクレオチドとそのＤＮＡ又はＲＮＡとはその位置で互いに相補的であるものと考えられる。そのオリゴヌクレオチドとそのＤＮＡ又はＲＮＡとは、各々の分子において対応する位置のうちの十分な数が互いに水素結合することができるヌクレオチドによって占められる場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”及び“相補的”は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性又は正確な対形成を示すのに用いられる用語である。特異的にハイブリダイズ可能であるためにオリゴヌクレオチドがその標的ＤＮＡ配列と１００％相補的である必要がないことは当該技術分野において理解される。標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合がその標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常な機能を妨害して機能の低減又は喪失を生じ、かつ特異的結合が望ましい条件下、すなわち、イン・ビボ検定もしくは治療的処置においては生理学的条件下、又はイン・ビトロ検定においてはその検定が行われる条件下において、非標的配列に対するそのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、そのオリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。治療用組成物の処方及び引き続くそれらの投与は当業者の技術の範囲内にあるものと信じられる。一般に、治療のためには、そのような治療を必要とする患者に、通常は薬学的に許容し得る担体中の本発明によるオリゴヌクレオチドを、患者の年齢及び治療する障害もしくは疾患状態の重篤性に応じて体重ｋｇ当たり０ .０１μｇ〜１００ｇの範囲の用量で投与する。さらに、この治療措置は、その持続期間をその疾患もしくは障害の性質、その重篤性及び患者の全体的な状態に応じて変化させることができ、１日に１回から２０年ごとに１回まで拡張することができる。治療の後、患者を、その患者の状態の変化及び障害もしくは疾患状態の症状の緩和について監視する。オリゴヌクレオチドの投与量は、患者が現在の投与量水準に対して顕著な応答を示さない場合には増加させることができ、あるいは障害もしくは疾患状態の症状の緩和が観察される場合、又は障害もしくは疾患状態が取り除かれている場合には用量を減少させることができる。幾つかの場合には、治療措置の効力を高めるために本発明のオリゴヌクレオチドを他の治療様式と共に用いて患者を治療することがより有効であり得る。本発明の脈絡において、“治療措置”という用語は、治療的、対症的及び予防的な様式を含むことが意図されている。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞接着分子（ＩＣＡＭ）、好ましくはＩＣＡＭ−１を標的とする１種類以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に用いられる。本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる他の抗炎症剤及び／又は免疫抑制剤には、可溶性ＩＣＡＭタンパク質（例えば、ｓＩＣＡＭ−１）、抗体−毒素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニソロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、インターフェロン、交感神経模倣薬、通常の抗ヒスタミン剤（ヒスタミンＨ₁受容体アンタゴニスト、例えば、マレイン酸ブロムフェニラミン（brompheniramine maleate）、マレイン酸クロロフェニラミン（chlorpheniramine maleate）、マレイン酸デキシクロロフェニラミン（dexchlorpheniramine maleate）、トリポリジンＨＣｌ（tripolidine HCl）、マレイン酸カルビノキサミン（carbinoxamine maleate）、フマル酸クレマスチン（clemastine fumarate）、ジメンヒドリネート（dimenhydrinate）、ジフェンヒドラミンＨＣｌ（diphenhydramine HCl）、ジフェニルピラリンＨＣｌ（diphenylpyraline HCl）、コハク酸ドキシルアミン（doxylamine succinate）、クエン酸トリペレンアミン（tripelennamine citrate）、トリペレンアミンＨＣｌ（tripelennamine HCl）、シクリジンＨＣｌ（cyclizine HCl）、ヒドロキシジンＨＣｌ（hydroxyzine HCl）、メクリジンＨＣｌ（meclizine HCl）、メトジラジンＨＣｌ（methdilazine HCl）、プロメタジンＨＣｌ（promethazine HCl ）、酒石酸トリメプラジン（trimeprazine tartrate）、マレイン酸アザタジン（azatadine maleate）、シプロヘプタジンＨＣｌ（cyproheptadine HCl）、ターフェナジン（terfenadine）等を含む）、ヒスタミンＨ₂受容体アンタゴニスト（例えば、ラニチジン（ranitidine））が含まれるが、これらに限定されるものではない。一般には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，15th Ed. ，Berkowら,eds.，1987，Rahway，N.J.，302-336頁及び2516-2522頁を参照。本発明の化合物と共に用いる場合、このような薬剤は個別に、連続的に、又は１種類以上の他のこのような薬剤と組み合わせて用いることができる。本発明の別の好ましい態様においては、あるＢ７ｍＲＮＡ種（例えば、Ｂ７− １）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを第２のＢ７ｍＲＮＡ種（例えば、Ｂ７−２）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる。これは、Ｂ７分子の同時刺激効果を、いずれかのオリゴヌクレオチドを個別に用いて達成することができるものよりも高い程度まで阻害するためである。この態様に関連するものにおいては、代わりの様式でスプライスされたＢ７− １もしくはＢ７−２ｍＲＮＡを各々標的とする２種類以上の本発明のオリゴヌクレオチドを、これらの代わりの様式でスプライスされたｍＲＮＡの両形態の発現を阻害するために互いに組み合わせる。用いられる調節作用因子の特異性に依存して、代わりの様式でスプライスされたｍＲＮＡの一方の形態の阻害が、発症する所定の状態につながる発現を十分に減少させる結果とはならないことが当該技術分野において公知である。したがって、このような組み合わせは、幾つかの場合において、特定のＢ７遺伝子の発現を本発明の方法のうちの１つを実施するのに必要な程度にまで阻害するのに望ましいものであり得る。治療に成功した後、その患者に維持療法を施して疾患状態の再発を予防することが望ましいことがあり、ここではオリゴヌクレオチドを、体重ｋｇ当たり０. ０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で、１日に１回以上ないし２０年毎に１回投与する。自己免疫もしくは炎症状態の傾向にあることが知られ、又はそれが疑われる個人における場合、体重ｋｇ当たり０.０１μｇ〜１００ｇの範囲の予防的用量を１日１回以上ないし２０年毎に１回投与することにより、予防効果を達成することができる。同様にして、個人を、ある医療処置の結果として生じることが予想される炎症状態、例えば、その個人への細胞、組織又は器官の移植から生じる移植片対宿主症に対する感受性を低下させることができる。本発明の医薬組成物は、局所的もしくは全身的処置のいずれが望ましいのか、及び治療しようとする領域に応じて、幾つかの方法で投与することができる。投与は局所（眼、膣、直腸、鼻内、経皮を含む）であっても、経口であっても、又は非経口であってもよい。非経口投与には静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、又はくも膜下もしくは室内投与が含まれる。局所投与用の製剤には経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体及び粉末が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉末もしくは油状基剤、増粘剤等が必要であるか、又は望ましいものであり得る。被覆コンドーム、手袋等も有用であり得る。経口投与用の組成物には粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェイ又は錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいものであり得る。非経口、くも膜下又は室内投与用の組成物には無菌水溶液が含まれ、これもまた緩衝剤、希釈剤及び他の適切な添加物を含むことができる。投薬は治療しようとする疾患状態の重篤性及び応答性に依存し、その一連の治療は数日〜数ヶ月、又は治癒が達成され、もしくは疾患状態の低減が達成されるまで続く。最適投薬スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積の測定から算出することができる。当業者は最適投与量、投薬方法及び反復率を容易に決定することができる。最適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に応じて変化する可能性があり、一般には、イン・ビトロ及びイン・ビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ₅₀に基づいて見積もることができる。一般には、投与量は体重ｋｇ当たり０.０１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月もしくは毎年１回以上投与することができ、あるいは２〜２０年毎に１回の投与であってもよい。以下の例は本発明を説明するものであり、それを限定することを意図するものではない。当業者は、ここに記載される特定の物質及び手順の多数の等価物を認識し、又は定型的な実験により確認することができるであろう。このような等価物は本発明の範囲内にあるものと考えられる。以下の例は説明のためだけに提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。実施例実施例１：核酸の合成オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成機で、ヨウ素での酸化を伴う標準ホスホラミダイト化学を用いて合成した。b−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトはApplied Biosystems（Foster City、CA）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、亜リン酸結合の段階的チア化（thiation）のため、標準酸化瓶をアセトニトリル中の３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシドの０.２Ｍ溶液で置き換えた。チア化サイクル待機工程を６８秒に増加させ、続いてキャッピング工程を行った。本発明の２'−フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを５'−ジメトキシトリチル−３'−ホスホラミダイトを用いて合成し、１９９０年１月１１日出願の米国特許出願連続番号第４６３,３５８号及び１９９０年８月１３日出願の連続番号第５６６,９９７号に開示される通りに調製した。これらの特許出願は本願と同じ譲受人に譲渡されたものであり、参照することによりここに組み込まれる。２'−フルオロオリゴヌクレオチドはホスホラミダイト化学を用い、標準的なＤＮＡ合成プロトコルに僅かな改変を施して調製した：脱保護をメタノール性アンモニアを用いて室温で行った。本発明の２'−メトキシ(２'−Ｏ−メチル)オリゴヌクレオチドを、２'−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピル−ホスホラミダイト（Chemgenes、Needham MA）及び、テトラゾール及び塩基のパルス搬送後の待機工程を３６０秒に増加させたこと以外は非修飾オリゴヌクレオチドの標準的なサイクルを用いて合成した。他の２'−アルコキシオリゴヌクレオチドは、この方法を改変することにより、適切な２'−修飾アミダイト、例えば、Glen Research,Inc.、Sterling、VA から入手できるものを用いて合成した。この合成を開始させるのに用いられる３ '塩基は２'−デオキシリボヌクレオチドであった。本発明の２'−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドはこの手順を僅かに改変することにより調製する。本発明の２'メトキシエトキシ(２'−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃)オリゴヌクレオチドは、Martin,Helv.Chim.Acta １９９５,７８,４８６の方法に従って合成した。合成を容易にするため、最後のヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであった。全ての２'−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃−シトシンは５−メチルシトシンであり、これは以下の手順に従って合成した。５−メチルシトシンモノマーの合成：２,２'−アンヒドロ［１−(β−Ｄ−アラビノフラノシル)−５−メチルウリジン］５−メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa、銚子、日本から購入可能）（７２.０ｇ、０.２７９Ｍ）、炭酸ジフェニル（９０.０ｇ、０.４２０Ｍ）及び重炭酸ナトリウム（２.０ｇ、０.０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に添加した。この混合物を攪拌しながら還流温度まで加熱し、発生する二酸化炭素ガスを制御しながら放出させた。１時間後、この僅かに黒みがかった溶液を減圧下で濃縮した。生じたシロップを、攪拌しながら、ジエチルエーテル（２.５Ｌ）に注ぎ入れた。この生成物はゴム状物質を形成した。エーテルをデカントし、残滓を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を新鮮なエーテル（２. ５Ｌ）に注ぎ入れることで、固いゴム状物質が生じた。エーテルをデカントし、ゴム状物質を真空オーブン内で乾燥（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）させて固体を得、これを粉砕して明黄褐色の粉末とした（５７ｇ、粗収率８５％）。この物質をそのままさらなる反応に用いた。２'−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン２,２'−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、ホウ酸トリス（２−メトキシエチル）（２３１ｇ、０.９８Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１.２Ｌ）を２Ｌステンレス鋼圧力に添加し、１６０℃の予め加熱した油浴に入れた。１５５−１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開き、溶液を蒸発させて乾燥させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共に摩砕した。その残滓を熱アセトン（１Ｌ）に懸濁させた。不溶性塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄して濾液を蒸発させた。その残滓（２８０ｇ）をＣＨ₃ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）に、０.５％のＥｔ₃ＮＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）を充填した。残滓をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍＬ）に溶解し、カラムに添加する前にシリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を充填溶媒で溶出し、１６０ｇ（５３％）の生成物を得た。２'-Ｏ−メトキシエチル−５'-Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン２'−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０.５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共に蒸発させ、乾燥残滓をピリジン（１.３Ｌ）に溶解した。塩化ジメトキシトリチルの第１分量（９４.３ｇ、０.２７８Ｍ）を添加し、その混合物を室温で１時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチルの第２分量（９４.３ｇ、０.２７８Ｍ）を添加し、その反応物をさらに１時間攪拌した。その後、メタノール（１７０ｍＬ）を添加して反応を停止させた。ＨＰＬＣにより、約７０％の生成物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、ＣＨ₃ＣＮ（２００ｍＬ）と共に摩砕した。その残滓をＣＨＣｌ₃（１.５Ｌ）に溶解し、２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ₃及び２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過して蒸発させた。２７５ｇの残滓を得た。その残滓を、０.５％のＥｔ₃ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填及び溶出する３.５ｋｇのシリカゲルカラムで精製した。約２０ｇの追加物を不純物画分から得、総収量が１８３ｇ（５７％）となった。３'−Ｏ−アセチル−２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０.１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦ及び１８８ｍＬのピリジンから調製した３：１混合液７５０ｍＬ）及び無水酢酸（２４ .３８ｍＬ、０.２５８Ｍ）を合わせ、室温で２４時間攪拌した。反応をｔｌｃで、最初にｔｌｃ試料の反応をＭｅＯＨを添加して停止させることにより監視した。ｔｌｃによる判断で反応が完了したら、直ちにＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加し、その混合物を３５℃で蒸発させた。その残滓をＣＨＣｌ₃（８００ｍＬ）に溶解し、２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層を再度２００ｍＬのＣＨＣｌ₃で抽出した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて１２２ｇの残滓を得た（約９０％の生成物）。その残滓を３.５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を用いて溶出した。純粋生成物画分を蒸発させて９６ｇ（８４％）を得た。３'−Ｏ−アセチル−２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン３'−Ｏ−アセチル−２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０.１４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解することにより第１溶液を調製し、脇に寄せた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１.４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１.３Ｍ）の溶液に添加して−５℃に冷却し、オーバーヘッド攪拌機を用いて０.５時間攪拌した。ＰＯＣｌ₃を滴下により３０分間にわたって、０−１０℃に維持したこの攪拌溶液に添加し、得られた混合物をさらに２時間攪拌した。第１溶液を後者の溶液に、滴下により４５分間にわたって添加した。生じた反応混合物を低温室内で一晩保存した。この反応混合物から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。その残滓をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固体を濾過により除去した。濾液を１ ×３００ｍＬのＮａＨＣＯ₃及び２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて蒸発させた。その残滓をＥｔＯＡｃと共に摩砕して表題の化合物を得た。２'-Ｏ−メトキシエチル−５'-Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジンジオキサン（５００ｍＬ）及びＮＨ₄ＯＨ（３０ｍＬ）中の３'−Ｏ−アセチル −２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４− トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０.１４１Ｍ）の溶液を室温で２時間攪拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、残滓をＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）と共沸させた。その残滓をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２リットルステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ₃ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を添加し、容器を１００℃に２時間加熱した（ｔｌｃにより完全な変換が示された）。容器の内容物を蒸発させて乾燥させ、その残滓をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解して飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて表題の化合物８５ｇ（９５％）を得た。Ｎ⁴−ベンゾイル−２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ、０.１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水安息香酸（３７.２ｇ、０.１６５Ｍ）を攪拌しながら添加した。３時間攪拌した後、ｔｌｃにより反応が約９５％完了したことが示された。溶媒を蒸発させ、その残滓をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸させた。その残滓をＣＨＣｌ₃（７００ｍＬ）に溶解して飽和ＮａＨＣＯ₃（２×３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発させて残滓（９６ｇ）を得た。その残滓を、１.５ｋｇシリカカラムで、０.５％のＥｔ₃ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として用いてクロマトグラフ処理した。純粋生成物画分を蒸発させ、表題の化合物９０ｇ（９０％）を得た。Ｎ₄−ベンゾイル−２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン−３'−アミダイトＮ⁴−ベンゾイル−２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン（７４ｇ、０.１０Ｍ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１Ｌ）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７.１ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０.５ｍＬ、０.１２３Ｍ）を、攪拌しながら、窒素雰囲気下で添加した。得られた混合物を室温で２０時間攪拌した（ｔｌｃにより反応が９５％完了したことが示された）。この反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ₃（１×３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。水性洗浄液をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍＬ）で再度抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ₄で乾燥させて濃縮した。得られた残滓を、１.５ｋｇシリカカラムで、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として用いてクロマトグラフ処理した。純粋画分を合わせて、表題の化合物９０.６ｇ（８７％）を得た。精製：多孔性ガラスカラム（Applied Biosystems）から切り離し、濃水酸化アンモニウム中５５℃で１８時間脱ブロックした後、２.５容積のエタノールを含む０.５ＮＮａＣｌから２回沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを精製した。分析ゲル電気泳動を、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液、ｐＨ７.０において行った。オリゴヌクレオチド及びそれらのホスホロチオエート類似体が、電気泳動から、８０％を上回る完全長物質であるものと判定された。公開されているヒトＢ７−１（ｈＢ７−１）及びネズミ（ｍＢ７−１）ｍＲＮＡ配列（それぞれ、Freemanら,J.Immunol.，1989，143，2714及びFreemanら，J ．Exp．Med.，1991，174，625）にハイブリダイズするように設計された配列を有する一連のオリゴヌクレオチド。これらのオリゴヌクレオチドの配列及びそれらに対する修飾、並びにｈＢ７−１ｍＲＮＡ上のそれらの標的部位の各々の位置を表１及び２に示す。同様に、ヒトＢ７−２（ｈＢ７−２）及びネズミＢ７−２（ｍＢ７−２）ｍＲＮＡの公開された配列（それぞれ、Azumaら，Nature，1993 ，366，76；Chenら，J．Immunol.，1994，152，4929）にハイブリダイズするように設計された配列を有する一連のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドの配列及びそれらに対する修飾、並びにｈＢ７−２ｍＲＮＡ上のそれらの標的部位の各々の位置を表３及び４に記載する。ＩＳＩＳ２３０２（配列番号１７）を含む、ＩＣＡＭ−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは１９９６年５月７日発行の米国特許第５,５１４,７８８号に記載されており、これは参照することによりここに組み込まれる。ＩＳＩＳ１０８２（配列番号１０２）及びＩＳＩＳ３０８２（配列番号１０１）は従来記載されている（St epkowskiら，J．Immunol.，1994，153，5336）。それらの初期クローン化に続いて、Ｂ７転写体の代替スプライシングが報告されている。報告されているＢ７−１の代替スプライシングは比較的単純であり、元来報告されているヒト及びネズミＢ７−１ｃＤＮＡ配列（Borrielloら，J．Im munol.，1994，153，5038；Inobeら，J．Immunol.，1996，157，588）の５'末端に対して５'側に伸びるメッセージが生じた。Ｂ７−１の配列を最初に報告する参考文献中に見出されるＢ７−１の配列の番号付けを維持するため、表１及び２において、これらの最初に報告された配列の５'伸長内の位置には負の数字が付与されている（−１位、５'伸長の最も３'側から始まる）。ネズミのＢ７−２転写体の処理はＢ７−１についてこれまで報告されているものよりもかなり複雑である：例えば、少なくとも５つの別個のネズミＢ７−２ｍＲＮＡ、及び少なくとも２つの別個のヒトＢ７−２ｍＲＮＡを代替スプライシングにより産生させることができる（Borrielloら，J．Immunol.，1995，155，5490；Freemanら,ＷＯ９５／０３４０８,１９９５年２月２日公開；また、Jellisら，Immunogenet.，1 995，42，85も参照）。これらのスプライシングの性質は異なる５'エクソンを別個のＢ７−２ｍＲＮＡの産生に用いるようなものであり、その各々は独自の５' 配列を有するものの、最初に報告されたＢ７−２の配列の幾つか、もしくはそれらの全てからなる３'部分を共有する。結果として、Ｂ７−２メッセージの５'伸長内の位置が最初に報告された配列内の位置に独自に関連することはあり得ない。したがって、表３においては（ＷＯ９５／０３４０８の配列番号１のものに対応する）異なる座標の組が、表４においては（Borrielloら，J.Immunol.，1995 ，155，5490に示される）エクソン番号が、最初に報告されたＢ７−２の配列に含まれない標的設定された配列の位置を指定するのに用いられる。さらに、これらの５'伸長メッセージは最初に公開された配列で示されるものの上流に潜在的なフレーム内開始コドンを含むが、簡便にするため、そのようなさらなる潜在的な開始コドンは表１−４における標的部位の説明には示さない。表１−４においては、以下の略語を用いる：ＵＴＲ、非翻訳領域；ＯＲＦ、読取り枠；ｔＩＲ、翻訳開始領域；ｔＴＲ、翻訳終止領域；ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート。化学修飾は以下のように示す。２'フルオロ（２'Ｆ）、２'−メトキシ（２'ＭＯ）又は２'−メトキシエトキシ（２'ＭＥ）修飾を有する残基は、修飾の型をそれぞれの略語で示しながらボールド体で示す(emboldene d)。他に指示されない限り、残基間の結合はホスホジエステル結合である；ホスホロチオエート結合は上付位置に“Ｓ”で示す（例えば、Ｔ^SＡ）。標的の位置は、Freemanら，J．Immunol.，1989，143：2714（ヒトＢ７−１ｃＤＮＡ配列；表１）、Freemanら，J．Exp．Med.，1991，174，625（ネズミＢ７−１ｃＤＮＡ配列；表２）、Azumaら，Nature，1993，366:76（ヒトＢ７−２ｃＤＮＡ配列；表３）及びChenら，J．Immunol.，1994，152:4929（ネズミＢ７−２ｃＤＮＡ配列；表４）に従って番号を付けた。ヌクレオチド塩基のコードは３７C.F.R.§1. 822(b)(1)に示されている。ｃＤＮＡクローン：ヒトＢ７−１の配列をコードするｃＤＮＡを逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて単離した。Daudi細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＣＬ２１３）に由来するポリＡ＋ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて、標準条件下で逆転写した。４２℃で３０分反応させて熱不活性化した後、反応混合物（２０μ Ｌ）を水で１００μＬとした。次に、このＲＴ反応からの一定分量１０μＬを、５０μＬのＰＣＲ反応において、５'プライマー、（センス、配列番号２０）、及び３'プライマー、（アンチセンス、配列番号２１）を用いて増幅した。これらのプライマーは、ＰＣＲ産生物をベクターｐｃＤＮＡ−３（Invitrogen,San Diego,CA）にサブクローン化するための独特の制限部位を含んでいた。５'プライマーは公開されたヒトＢ７−１配列の塩基１〜２６（Freemanら，J．Immunol.，1989，143，2714；プライマーの１３−３８位）との同一性を有するように設計され、クローン化において用いるためのＫｐｎＩ制限部位（プライマーの７−１２位）を含む。３'プライマーは公開されたＢ７− １の配列の塩基１４５０〜１４７１（プライマーの１４−３５位）と相補的であるように設計され、ＸｈｏＩ制限部位（プライマーの７−１２位）を含む。ＰＣＲの後、反応物をフェノールで抽出し、エタノールを用いて沈殿させた。その産生物を適切な制限酵素で消化して完全長断片をアガロースゲルで精製し、同じ酵素で消化することによって調製したベクターｐｃＤＮＡ−３（Invitrogen，San Diego，CA）にライゲートした。得られた構築体ｐｃＢ７−１を、標準的な手順を用いる制限マッピング及びＤＮＡ配列解析により確認した。マウスＢ７−１クローン、ｐｃｍＢ７−１を、ネズミのＢリンパ細胞系７０Ｚ３から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、同様の方法で単離した。また、ヒトＢ７−２の配列、１〜１３９１位をコードするｃＤＮＡもＲＴ−ＰＣＲにより単離した。Daudi細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＣＬ２１３）に由来するポリＡ＋ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて、標準条件下で逆転写した。４２℃で３０分反応させて熱不活性化した後、反応混合物（２０μＬ）を水で１００μＬとした。次に、このＲＴ反応からの一定分量１０μＬを、５０μＬのＰＣＲ反応において、５'プライマー、（センス、配列番号１）、及び３'プライマー、（アンチセンス、配列番号２）を用いて増幅した。５'プライマーは公開されたヒトＢ７−２配列の塩基１−２０（Azumaら， Nature，1993，366，366，76及びGenbank受付番号Ｌ２５２５９；プライマーの１３−３２位）との同一性を有するように設計され、クローン化において用いるためのＫｐｎＩ部位（プライマーの７−１２位）を含む。３'プライマーは公開されたＢ７−２の配列の塩基１３７０−１３９１（プライマーの１３−３３位）と相補的であるように設計され、ＸｈｏＩ制限部位（プライマーの７−１２位）を含む。ＰＣＲの後、反応物をフェノールで抽出し、エタノールを用いて沈殿させた。その産生物をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化して完全長断片をアガロースゲルで精製し、同じ酵素で消化することによって調製したベクターｐｃＤＮＡ−３（Invitrogen，San Diego，CA）にライゲートした。得られた構築体ｐｃＢ７− ２を、標準的な手順を用いる制限マッピング及びＤＮＡ配列解析により確認した。マウスＢ７−２クローン、ｐｃｍＢ７−２を、同様の方法で、Ｐ３８８Ｄ１細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、５'プライマー、（センス、配列番号９９）、及び３'プライマー、（アンチセンス、配列番号１００）を用いて単離した。５'プライマーは公開されたネズミＢ７−２配列（Chenら，J．Immun.，1994,1 52，4929）の塩基１−２０との同一性を有し、これに対して３'プライマーはその配列の塩基１０９６−１１１５と相補的である。両プライマーは、ｃＤＮＡクローンの調製に用いられた他の５'及び３'プライマーに見出されるそれぞれの制限酵素部位を含む。ＲＴ−ＰＣＲ産生物をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、ｐｃＤＮＡ−３（Invitrogen，San Diego，CA）にライゲートした。代替スプライシングから生じるｍＲＮＡに対応する他のｃＤＮＡクローンは、同様の方法で、適切な制限部位を含み、かつ選択されたＢ７ｍＲＮＡとの同一性を有し（５'プライマー）又はそれと相補的な（３'プライマー）プライマーを用いてクローン化する。実施例２：オリゴヌクレオチドによるｈＢ７−１の発現の調節Ｂ７−１の発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力を、形質移入ＣＯＳ−７細胞におけるＢ７−１の細胞表面発現をフローサイトメトリーで測定することにより評価した。方法：Ｔ−１７５フラスコにＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ受付番号CRL１６５１）を７５％集密で播種した。プラスミドｐｃＢ７−１を、標準リン酸カルシウム形質移入により、細胞に導入した。４時間の形質移入の後、これらの細胞をトリプシン処理し、１２ウェル皿に８０％集密で播種した。細胞をこのプラスチックに１時間付着させた後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。ＯｐｔｉＭＥＭ^TM （GIBCO-BRL、Gaithersburg、MD）培地を１５μg／ｍＬのリポフェクチン^TM（ Lipofectin^TM)（GIBCO-BRL、Gaithersburg、MD）及び示された濃度のオリゴヌクレオチドと共に添加した。さらに４時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco ら，Viro1.，1959，8，396；Smithら，Virol.，1960，12，185）中で、同じ濃度の新鮮なオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。Ｂ７−１の細胞表面発現に対するオリゴヌクレオチドの効果を監視するため、オリゴヌクレオチド処理の２４−４８時間後に簡単にトリプシン処理することにより処理ＣＯＳ−７細胞を回収した。これらの細胞をＰＢＳで洗浄した後、５μ Ｌの結合抗Ｂ７−１抗体（すなわち、抗ｈＣＤ８０−ＦＩＴＣ、Ancell、 Bayport、MN；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート）を含む１００μ Ｌの染色緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．１％アジド）に再懸濁した。細胞を４℃で３０分間染色してＰＢＳで洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒドを含む３００μＬに再懸濁した。細胞を回収し、フルオレセインのプロフィールをフローサイトメトリーを用いて決定した。結果：表１に示されるオリゴヌクレオチドを、Ｂ７−１ｃＤＮＡを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞において、Ｂ７−１の発現を阻害するそれらの能力について評価した。それらの結果（図１）から、翻訳開始コドン領域を標的とするＩＳＩＳ１３８０５及び３'非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的とするＩＳＩＳ１３８１２が、Ｂ７−１の発現を５０％を上回って阻害する最も活性なオリゴヌクレオチドとして同定された。したがって、これらのオリゴヌクレオチドが非常に好ましい。ＩＳＩＳ１３７９９（５'非翻訳領域を標的とする）、ＩＳＩＳ１３８０２（５'非翻訳領域を標的とする）、ＩＳＩＳ１３８０６及び１３８０７（両者ともＯＲＦの５'領域を標的とする）、並びにＩＳＩＳ１３８１０（ＯＲＦの中央部分を標的とする）はＢ７−１の発現の３５％〜５０％の阻害を示した。したがって、これらの配列も好ましい。次に、ＩＳＩＳ１３８００（これは、フローサイトメトリー検定においてＢ７ −１の発現の阻害を本質的に示さなかった）並びにＩＳＩＳ１３８０５及び１３８１２を、Ｂ７−１の細胞表面発現を阻害するそれらの能力について、様々なオリゴヌクレオチド濃度で評価した。これらの検定の結果を図２に示す。ＩＳＩＳ１３８１２はＢ７−１の発現の優れた阻害因子であり、ＩＣ₅₀は約１５０ｎＭであった。５'ＵＴＲを標的とするＩＳＩＳ１３８００は本質的に不活性であった。実施例３：オリゴヌクレオチドによるｈＢＴ−２タンパク質の調節初期スクリーニングにおいて、Ｂ７−２の発現を阻害するｈＢ７−２オリゴヌクレオチドの能力を、形質移入ＣＯＳ−７細胞におけるＢ７−２の細胞表面発現をフローサイトメトリーで測定することにより評価した。用いた方法は、（１）ＣＯＳ−７細胞をプラスミドｐｂｃＢ７−２又はＢＢＧ−５８、標準リン酸カルシウム形質移入によって細胞に導入されたヒトＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）発現ベクター（R&D Systems、Minneapolis、MN）、で形質移入し、（２）用いたオリゴヌクレオチドは表２に記載されるものであり、かつ（３）結合抗Ｂ７−２抗体（すなわち、抗ｈＣＤ８６−ＦＩＴＣ又は抗ＣＤ８６−ＰＥ、PharMingen、San D iego、CA；ＰＥ：フィコエリトリン）をフローサイトメトリーの間用いたことを除いて実施例２に示されるものと同様であった。結果：これらの結果を図３に示す。２００ｎＭの濃度で、ＩＳＩＳ９１３３、ＩＳＩＳ９１３９及びＩＳＩＳ１０３７３は５０％以上の阻害活性を示し、したがって非常に好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは３'非翻訳領域（ＩＳＩＳ９１３３）、翻訳開始コドン領域（ＩＳＩＳ９１３９）及び５'非翻訳領域（ＩＳＩＳ１０３７３）を標的とする。同じ濃度で、ＩＳＩＳ１０７１５、ＩＳＩＳ１０７１６及びＩＳＩＳ１０７２１（これらは、それぞれ、ＩＳＩＳ９１３３、ＩＳＩＳ９１３９及びＩＳＩＳ１０３７３の無秩序の対照である）は活性を示さなかった。ＩＳＩＳ１０３６７及びＩＳＩＳ１０３６９での処理では２５％を上回る阻害が生じ、したがって、これらのオリゴヌクレオチドも好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは５'（ＩＳＩＳ１０３６７）及び３'（ＩＳＩＳ１０３６９）非翻訳領域を標的とする。実施例４：オリゴヌクレオチドによるｈＢ７−２ｍＲＮＡの調節方法：リボヌクレアーゼ防御検定のため、Totally RNA^TMキット（Ambion、Austin）T X）を用いるオリゴヌクレオチド処理が完了した１８時間後に細胞を回収した。この検定のためのプローブはプラスミドｐｃＢ７−２（ＢｇｌＩＩで消化することにより直線化）及びｐＴＲＩ−ｂ−アクチン（Ambion Inc.、Austin、TX）から生成させた。ＳＰ６プロモーターからの直線化プラスミドのイン・ビトロ転写をα−³²Ｐ−ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ミリモル）の存在下において行い、Ｂ７−２の３'末端（１０４４−１３９１位）と相補的なアンチセンスＲＮＡを得た。プローブをＤＮＡ分解酵素Ｉで処理した後にゲル精製し、ＤＮＡテンプレートを除去した。リボヌクレアーゼ防御検定を、RPA II^TMキット（Ambion）を用い、製造者の指示に従って行った。全ＲＮＡ（５μg）を、４２℃で一晩、１０⁵ｃｐｍのＢ７−２プローブ又は対照β−アクチンプローブとハイブリダイズさせた。次に、このハイブリダイゼーション反応物を、３７℃で３０分間、０．４単位のＲＮＡ分解酵素Ａ及び２単位のＲＮＡ分解酵素Ｔ１で処理した。保護されたＲＮＡを沈殿させて１０μＬのゲル添加緩衝液に再懸濁させ、５０％ｗ／ｖの尿素を含む６％アクリルアミドゲル上、２０Ｗで電気泳動した。その後、このゲルを露出し、レーンを、PhosphorImager（Molecular Dynamics、Sunnyvale、CA）を用い、本質的に製造者の指示に従って定量した。結果：オリゴヌクレオチド媒介ｈＢ７−２ｍＲＮＡ調節の程度は、一般に、ｈＢ７− ２タンパク質に対してみられる効果に対応する（表５）。タンパク質発現（フローサイトメトリー）検定と同様に、最も活性のオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ９１３３、ＩＳＩＳ９１３９及び１０３７３であった。試験したオリゴヌクレオチドで、同じ細胞におけるｂ−アクチンｍＲＮＡの発現に対する阻害効果を有するものはなかった。表５ｈＢ７−２ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドの活性実施例５：さらなるｈＢ７−１及びｈＢ７−２オリゴヌクレオチド初期スクリーニングの間に同定されたオリゴヌクレオチドに対して修飾された構造及び／又は配列を有するオリゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオチドを、ヒトＢ７−２の発現を調節するそれらの能力について、先の実施例に記載される方法を用いて評価した。ＩＳＩＳ１０９９６、ＩＳＩＳ１０３７３の２０ヌクレオチドの配列から誘導された１５ヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオチド、も調製して評価した。ＩＳＩＳ１０９９６は１５ヌクレオチド、５'-GCG-AGC-TCC-CCG-TAC（配列番号９０）を有し、これはＩＳＩＳ１０３７３の配列内に含まれるものである。ＩＳＩＳ１０３７３及び１０９９６の両者は、Azumaら（Nature,１９９３,３６６,７６）によって提示されたｈＢ７−２の配列の塩基１−６７を含むＢ７−２メッセージ内に位置する潜在的なステム−ループ構造が重複する。それらの作用様式（１つもしくは複数）に関する特定の理論によって結び付けることを意図するものではないが、ＩＳＩＳ１０３７３及びＩＳＩＳ１０９９６は、標的ＲＮＡ内で、二次構造でのループ１疑似一重結び（loop１pseudo-half-knots）として結合する潜在能力を有する。１９９６年４月３０日に発行され、その内容が参照することによりここに組み込まれる米国特許第５,５１５２,４３８号には、疑似一重結びを形成することにより遺伝子の発現を調節する方法が記載されている。それらの作用様式（１つもしくは複数）に関わりなく、ＩＳＩＳ１０３７３よりも長さが短いにも関わらず、１５量体ＩＳＩＳ１０９９６は、Ｂ７−２タンパク質発現検定において、それが誘導される２０量体と同程度に（もしくはそれを上回って）活性である（図４；ＩＳＩＳ１０７２１はＩＳＩＳ１０３７３の無秩序対照である）。関連１６量体、ＩＳＩＳ１０８８９もＢ７−２タンパク質発現検定において活性であった。しかしながら、構造的に関連する１４量体（ＩＳＩＳ１０９９５）、１３量体（ＩＳＩＳ１０９９４）、１２量体（ＩＳＩＳ１０９９３）、１１量体（ＩＳＩＳ１０９９２）及び１０量体（ＩＳＩＳ１０９９１）は、この検定においてほとんど、もしくは全く活性を示さなかった。ＩＳＩＳ１０９９６を以下の方法でさらに誘導体化した。完全に置換した誘導体（ＩＳＩＳ１１５３９）、“ギャップマー”（ＩＳＩＳ１１５４１及び１１５４３）並びに“ウィングマー”（ＩＳＩＳ１１５４５及び１１５４７）を含む、２'メトキシエトキシ置換を有するＩＳＩＳ１０９９６誘導体を調製した。実施例５において説明されるように、２'メトキシエトキシ置換は幾つかのヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ）の作用を妨げるが、その修飾オリゴヌクレオチドの、その標的ＲＮＡ分子に対する親和性を高める。これらのオリゴヌクレオチドを、ｈＢ７−２メッセージを調節するそれらの能力又は機能について、実施例３、４、７及び８の方法に従って試験する。ＩＳＩＳ１０９９６誘導体を、標的ＲＮＡ分子、例えばｈＢ７−２メッセージ、にＲＮＡ分解酵素Ｌを召集するそれらの能力について評価するために調製した。ＲＮＡ分解酵素Ｌは(２'−５')(Ａ)_nに結合し、かつそれによって活性化され、この(２'−５')(Ａ)_nはＡＴＰから(２'−５')(Ａ)_n合成酵素により、例えば、インターフェロンによる活性化で産生される。ＲＮＡ分解酵素Ｌは抗ウイルス機構に関連付けられ、その上細胞の成長の調節にも関連付けられている（Sawai,Chemica Scripta，1986，21，169；Charachonら,Biochemistry，1990,2 9，2550）。(２'−５')(Ａ)_nに結合した抗Ｂ７オリゴヌクレオチドの組み合わせはＲＮＡ分解酵素Ｌの活性化、及びそのオリゴヌクレオチド配列と相補的なＢ７メッセージへのそのターゲッティングを生じるものと期待される。以下のオリゴヌクレオチドは、それらの５'末端に、同一の配列（すなわち、ＩＳＩＳ１０９９６のもの）及び同一の(２'−５')(Ａ)_n“キャップ”を有する：ＩＳＩＳ１２４９２、１２４９５、１２４９６及び１３１０７。アデノシル残基は３'ヒドロキシル基を有し、ホスホロチオエート結合により互いに連結する。このオリゴヌクレオチドの（３'−５'）部分（これは、ヒトＢ７−２ＲＮＡの一部と相補的な配列を有する）は、(２'−５')(Ａ)_n“キャップ”に、そのオリゴヌクレオチドの（３'−５'）部分の５'残基から別のホスホロチオエート結合によりその“キャップ”に結合するｎ−アミノヘキシルリンカーまでのホスホロチオエート結合により結合する。様々な化学的に多様なこの型のオリゴヌクレオチドを、特定のメッセージにＲＮＡ分解酵素Ｌを召集するそれらの能力について試験するため、この４種類のオリゴヌクレオチドの組に対して以下のように化学修飾を施した。ＩＳＩＳ１２４９６は、そのオリゴヌクレオチドの（３'−５'）部分が非修飾であるオリゴヌクレオチドからなる。ＩＳＩＳ１３１０７においては、天然核酸に見出されるリン酸結合がホスホロチオエート結合で置き換えられている。ホスホロチオエート結合はＩＳＩＳ１２４９２及び１２４９５においても用いられており、これらはさらに２'−メトキシエトキシ置換を有する。これらのオリゴヌクレオチドを、ｈＢ７−２メッセージを調節するそれらの能力及び機能について、実施例３、４、７及び８の方法に従って試験する。２'位に修飾を有するＩＳＩＳ１０９９６の誘導体を調製して評価した。これらの修飾オリゴヌクレオチドには、ＩＳＩＳ１１５３９（完全に２'−Ｏ−メチル）、ＩＳＩＳ１１５４１（２'−Ｏ−メチル“翼”及び中央７塩基“ギャップ ”を有する）、ＩＳＩＳ１１５４３（２'−Ｏ−メチル翼及び９塩基ギャップ）、ＩＳＩＳ１１５４５（５'２'−Ｏ−メチル翼を有する）及びＩＳＩＳ１１５４７（３'２'−Ｏ−メチル翼を有する）が含まれていた。２'−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの検定の結果は以下の通りであった。ＩＳＩＳ１０９９６の完全な２'Ｏ−メチル版であるＩＳＩＳ１１５３９は、このタンパク質発現検定においては全く活性ではなかった。ギャップ化及び翼化オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１１５４１、１１５４３、１１５４５及び１１５４７）は各々２００ｎＭで幾らかの活性を示した（すなわち、未処理細胞に対して６０〜７０％の発現）が、親化合物ＩＳＩＳ１０９９６によって示されるもの（すなわち、約５０％の発現）よりは少なかった。同様の結果がＲＮＡ発現検定において見られた。５'ｎ−アミノヘキシルリンカーによりコレステロールが結合しているＩＳＩＳ１０３７３の誘導体であるＩＳＩＳ１０７８２を調製した。コレステロールのような親油性部分は、ある場合に細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを増強することが、取り込みが増強される程度は、それがあったとして、予測不可能のままではあるが、報告されている。ＩＳＩＳ１０７８２、及び親油性部分を含む他のオリゴヌクレオチドを、Ｂ７−２メッセージを調節するそれらの能力又は機能について、実施例３、４、７及び８の方法に従って試験する。以下のｈＢ７−１オリゴヌクレオチドの一連の２'−メトキシエトキシ（ここでは“２'ＭＥ”）及び２'−フルオライド（ここでは“２'Ｆ”）“ギャップマー”誘導体を調製した。ＩＳＩＳ１２３６１（それぞれ、ＩＳＩＳ１２３４８及び１２４７３）、ＩＳＩＳ１２３６２（ＩＳＩＳ１２３４９及び１２４７４）、ＩＳＩＳ１２３６３（ＩＳＩＳ１２３５０及び１２４７５）、ＩＳＩＳ１２３６４（ＩＳＩＳ１２３５１及び１２４７６）、ＩＳＩＳ１２３６５（ＩＳＩＳ１２３５２及び１２４７７）、ＩＳＩＳ１２３６６（ＩＳＩＳ１２３５３及び１２４７８）、ＩＳＩＳ１２３６７（ＩＳＩＳ１２３５４及び１２４７９）、ＩＳＩＳ１２３６８（ＩＳＩＳ１２３５５及び１２４８０）、ＩＳＩＳ１２３６９（ＩＳＩＳ１２３５６及び１２４８１）並びにＩＳＩＳ１２３７０（ＩＳＩＳ１２３５７及び１２４８２）。これらの誘導体の中央非２'−修飾部分（“ギャップ”）は、そのオリゴヌクレオチドがその標的ＲＮＡに結合したとき、２'−修飾部分がＲＮＡ分解酵素Ｌの活性を支持しないにも関わらず、それを支持する。しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドの２'−修飾“翼”は、それらの標的ＲＮＡ分子に対するそれらの親和性を高める（Cook,Chapter 9 In：Antisense Research and Applications，Crookeら,eds.，CRC Press，Boca Raton，1993，p p．171-172）。他の２'修飾はこの位置でのメトキシ（ＭＯ）基の導入である。２'ＭＥ−及び２'Ｆ−修飾オリゴヌクレオチドと同様に、この修飾は、そのようなオリゴヌクレオチド及びそれらの標的ＲＮＡから形成される二重鎖に対するＲＮＡ分解酵素Ｈの作用を妨げるが、その標的ＲＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。ＩＳＩＳ１２９１４及び１２９１５は代替ｈＢ７−１ｍＲＮＡ分子の５'非翻訳領域と相補的な配列を含み、この代替分子は一次ｈＢ７−１転写体の代替スプライシングから生じる。これらのオリゴヌクレオチドは２'メトキシ修飾を含み、そこから生じる標的親和性の強化は、幾つかの組織に少量存在し得る代わりの様式でスプライスされたＢ７−１ｍＲＮＡに対するより高い活性を許容し得る（Inobeら，J．Immun.，1996，157，582）。同様に、他の代替ｈＢ７−１ｍＲＮＡに対するアンチセンス配列を含むＩＳＩＳ１３４９８及び１３４９９は、それらの標的分子に対するそれらの活性を高めるために２'メトキシエトキシ修飾を含み、２'メトキシエトキシ又は２'メトキシ置換がｈＢ７−２オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２９１２、１２９１３、１３４９６及び１３４９７に組み込まれている。これらのオリゴヌクレオチドを、ｈＢ７−１を調節するそれらの能力について本質的に実施例２の方法に従って試験し、又はｈＢ７−２を調節するそれらの能力について、必要であれば代わりの様式でスプライスされた適切なＢ７転写体に対応するｃＤＮＡクローンを標的細胞に形質移入することを除いて、実施例３、４、７及び８の方法に従って試験する。実施例６：アンチセンス調節の特異性本発明の幾つかのオリゴヌクレオチドを細胞表面発現フローサイトメトリー検定において評価し、これらのオリゴヌクレオチドのＢ７−１に対する特異性をＢ７−２に対する活性と対照して決定した。この検定において試験したオリゴヌクレオチドには、Ｂ７−１の発現の阻害因子であるＩＳＩＳ１３８１２（図１；実施例２）及びＢ７−２の発現の阻害因子であるＩＳＩＳ１０３７３が含まれていた。この検定の結果を図５に示す。ＩＳＩＳ１３８１２はＢ７−１の発現を阻害し、Ｂ７−２の発現に対してはほとんど、もしくは全く効果がない。同様に図５からわかるように、ＩＳＩＳ１０３７３はＢ７−２の発現を阻害し、Ｂ７−１の発現に対してはほとんど、もしくは全く効果がない。ＩＳＩＳ１３８７２（配列番号３７、AGT-CCT-ACT-ACC-AGC-CGC-CT）、ＩＳＩＳ１３８１２の無秩序対照、及びＩＳＩＳ１３８０９（配列番号５１）がこれらの検定に含まれ、Ｂ７−１又はＢ７−２のいずれに対しても本質的に活性を示さなかった。実施例７：抗原提示細胞における、オリゴヌクレオチドによるｈＢ７−２の発現の調節抗原提示細胞（ＡＰＣ）において未変性Ｂ７−２遺伝子からの発現を阻害するＩＳＩＳ１０３７３の能力を以下のように評価した。方法：単球を以下のように培養してオリゴヌクレオチドで処理した。樹状細胞については、ＥＤＴＡ処理血液をPolymorphprep^TM（１.１１３g／ｍＬ；Nycomed、オスロ、ノルウェー）上に層状に重ね、５００×ｇで３０分間、２０℃で沈降させた。単核球をその界面から回収した。細胞をＰＢＳ、血清非含有ＲＰＭＩ培地（Mo oreら，N.Y．J．Med.，1968，68，2054）、次いで５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩで洗浄した。単球を、３７℃で１時間のプラスチック細胞培養皿への付着により選択した。付着させた後、細胞を、リポフェクチン^TM（８μ g／ｍＬ）を含む血清非含有ＲＰＭＩ中においてオリゴヌクレオチドで処理した。５％ＦＢＳ及びオリゴヌクレオチドを含むＲＰＭＩを、インターロイキン−４（ＩＬ−４；R&D Systems、Minneapolis、MN）（６６ｎｇ／ｍＬ）及び顆粒球− マクロファージコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；R&D Systems、Minneapolis、 MN）（６６ｎｇ／ｍＬ）と共に細胞に添加し、分化を刺激した（Romaniら，J．E xp．Med.，1994，180，83，1994）。細胞を４８時間インキュベートした後、様々な分子の細胞表面発現をフローサイトメトリーにより測定した。新鮮な血液から単離した単核球を、細胞による取り込みを促進するためにカチオン性脂質の存在下において、オリゴヌクレオチドで処理した。対照オリゴヌクレオチドとして、ＩＳＩＳ２３０２（ＩＣＡＭ−１の発現の阻害因子；配列番号１７）も細胞に投与した。Ｂ７−２タンパク質の発現を、フローサイトメトリーにより、実施例２の方法に従って測定した。先の実施例に記載されていないモノクローナル抗体には抗ｈＣＤ３（Ancell、Bayport、MN）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ（B ecton Dickinson、San Jose、CA）が含まれていた。結果：図６に示されるように、ＩＳＩＳ１０３７３はＢ７−２の発現に対する有意の阻害効果を有し、そのＩＣ₅₀は約２５０ｎＭである。ＩＳＩＳ１０３７３は、１ μＭの用量でさえ、ＩＣＡＭ−１の発現に対する僅かな効果を有するのみであった。ＩＳＩＳ２３０２（配列番号１７）、ＩＣＡＭ−１の発現を阻害することが示されている対照オリゴヌクレオチド、はＢ７−２の発現に対しては効果がないが、ＩＣＡＭ−１の水準を大きく低下させ、そのＩＣ₅₀は約２５０ｎＭであった。同様の条件下で、ＩＳＩＳ１０３７３は、フローサイトメトリーによる測定で、Ｂ７−１、ＨＬＡ−ＤＲ又はＣＤ３の細胞表面発現に影響を及ぼさなかった。実施例８：オリゴヌクレオチドによるＴ細胞の増殖の調節Ｔ細胞の増殖を阻害するＩＳＩＳ２３０２及びＩＳＩＳ１０３７３の能力を以下のように評価した。（実施例６と同様に）オリゴヌクレオチド及びサイトカインで処理した単球を抗原提示細胞としてＴ細胞増殖検定において用いた。分化した単球を別々のドナーに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞と組み合わせた。４８時間後、［³Ｈ］チミジンの取り込みにより増殖を測定した。方法：Ｔ細胞増殖検定のため、細胞をＥＤＴＡ処理全血から、リンパ球を含む高速移動バンドを界面の直下から回収したことを除いて上述の通りに単離した。細胞を実施例６に記載される通りに洗浄した後、ＮＨ₄Ｃｌ溶解により赤血球を除去した。Ｔ細胞を、Ｔ細胞濃縮カラム（R&D Systems、Minneapolis、MN）を用いて、本質的に製造者の指示に従って精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を全Ｔ細胞集団から、抗ＣＤ８結合マグネチックビーズ（AMAC,Inc.、Westbrook、ME）を製造者の指示に従って用いてＣＤ８＋細胞を枯渇させることにより、さらに濃縮した。Ｔ細胞は、Ｃｙ−クロム結合抗ＣＤ４ｍＡｂ（PharMingen、San Diego、CA）を用いるフローサイトメトリーにより、＞８０％ＣＤ４＋であることが測定された。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を実施例６に記載される通りに単離し、マイトマイシンＣ（２５μｇ／ｍＬ）で１時間処理した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＡＰＣ（１０⁵細胞）を３５０μＬの培養培地中で４×１０⁴個のＣＤ４＋Ｔ細胞とあわせた。示された場合には、精製ＣＤ３ｍＡｂも１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。４８時間のインキュベーション期間の最後の６時間に、ウェル当たりの１．５ｕＣｉの［³Ｈ］−チミジンの取り込みを決定することにより増殖を測定した。細胞をフィルタ−上に回収し、シンチレーション計数により放射能を測定した。結果：図７に示されるように、サイトカインで処理しなかった単核球はＴ細胞の増殖を僅かに誘発したが、これは、おそらく、細胞上に発現する同時刺激分子の濃度が低いことによるものである。しかしながら、細胞をサイトカインで処理して樹状様細胞への分化を誘発した場合、ＩＣＡＭ−１及びＢ７−２の両者の発現は大きく上方調節された。これは強力なＴ細胞増殖応答を生じ、その応答は単核細胞を誘発する前に抗ＩＣＡＭ−１（ＩＳＩＳ２３０２）又は抗Ｂ７−２（ＩＳＩＳ１０３７３）オリゴヌクレオチドのいずれかで遮断することが可能であった。対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１０７２１）はＴ細胞の増殖に対してはごく僅かな効果しか有していなかった。抗ＩＣＡＭ−１（ＩＳＩＳ２３０２）及び抗Ｂ７−２（ＩＳＩＳ１０３７３）オリゴヌクレオチドの両者を用いる組み合わせ処理はＴ細胞応答のさらなる低下を生じた。実施例９：オリゴヌクレオチドによるネズミＢ７遺伝子の調節ＣＯＳ−７細胞に一時的に発現するネズミＢ７−２の発現を阻害することが可能なオリゴヌクレオチド（表４を参照）を以下の方法で同定した。ネズミＢ７− ２（ｍＢ７−２）ｃＤＮＡと相補的な一連のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ｍＢ７−２ｃＤＮＡクローンを形質移入したＣＯＳ−７細胞において（結合抗ｍＢ７−２抗体（すなわち、抗ｍＣＤ８６−ＰＥ、PharMingen、San Dieg o、CA）以外は実施例２と同様のサイトメトリーによって測定される）ｍＢ７− ２の水準を低下させるそれらの能力についてスクリーニングした。抗ｍＢ７−２抗体は、受付番号HB−２５３でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマからも得ることができる。ネズミＢ７−１の発現を調節することが可能なオリゴヌクレオチド（表２を参照）を、結合抗ｍＢ７−１抗体をｍＢ７−１ｃＤＮＡクローンで形質移入したＣＯＳ−７細胞と共に用いることを除いて、同様の方法で単離した。ネズミＢ７−２に対しては、同定された最も活性のオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ１１６９６（GGA-TTG-CCA-AGC-CCA-TGG-TG、配列番号１８）であり、これはそのｃＤＮＡの９６−１１５位、翻訳開始（ＡＵＧ）コドンを含む部位、と相補的である。図８はＩＳＩＳ１１６９６及び無秩序対照ＩＳＩＳ１１８６６（CTA-AGT-AGT-GCT-AGC-CGG-GA、配列番号１９）の用量−応答曲線を示す。ＩＳＩＳ１１６９６はＣＯＳ−７細胞におけるＢ７−２の細胞表面発現を阻害し、そのＩＣ₅₀は２００−３００ｎＭの範囲にあり、これらに対してＩＳＩＳ１１８６６は試験した最高濃度（１０００ｎＭ）で２０％未満の阻害を示した。ネズミＢ７−２アンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに評価するため、ＩＣ −２１細胞系を用いた。ＩＣ−２１単球／マクロファージ細胞系はＢ７−１及びネズミＢ７−２（ｍＢ７−２）の両者を構成的に発現する。これらの細胞をリポ多糖（ＬＰＳ；GIBCO−BRL、Gaithersburg、MD）の存在下においてインキュベートすることにより発現の２倍の誘発を達成することができる（Hathcockら， Science，1993，262，905）。ＩＣ−２１細胞（ＡＴＣＣ；受付番号TIB１８６）を、８０％集密で、１２ウェルプレートにおいて、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に播種した。これらの細胞を、一晩、プレートに付着させた。翌日、培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、１５μｇ／ｍＬのリポフェクチン^TM（GIBCO−BRL、Gaithersburg 、MD）を補足した５００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ^TM（GIBCO−BRL、Gaithersburg、 MD）を各ウェルに添加した。その後、オリゴヌクレオチドを示された濃度で培地に直接添加した。４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５μ ｇ／ｍＬのＬＰＳを補足した培養培地中で一晩インキュベートした。翌日、掻き取ることで細胞を回収した後、フローサイトメトリーにより細胞表面発現について分析した。ＩＳＩＳ１１６９６及びＩＳＩＳ１１８６６を、リポフェクチン^TM（GIBCO−B RL、Gaithersburg、MD）の存在下において、ＩＣ−２１細胞に投与した。結果を図９に示す。１０μＭの濃度で、ＩＳＩＳ１１６９６はｍＢ７−２の発現を完全に阻害し（及びｍＢ７−２の水準を発現の構成水準未満に低下させ）、これに対して無秩序対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１８６６は誘発される発現の水準を４０％減少させるだけであった。３μＭの濃度で、誘発される発現の水準はＩＳＩＳ１１６９６により大きく低下し、これに対してＩＳＩＳ１１８６６にはほとんど効果がなかった。２'置換（例えば、２'メトキシ、２'メトキシエトキシ）を含み、ネズミＢ７ −１（ＩＳＩＳ１２９１４、１２９１５、１３４９８、１３４９９）又はネズミＢ７−２（ＩＳＩＳ１３１００、１３１００及び１３１０２）の代替転写物を標的とする修飾オリゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオチドを、ネズミＢ７を調節するそれらの能力について、本質的に上記方法に従い、ＩＣ− ２１細胞又は代わりの様式でスプライスされた適切なＢ７転写体に対応するｃＤＮＡクローンを形質移入したＣＯＳ−７を用いて試験する。実施例１０：オリゴヌクレオチドによる同種移植片拒絶の調節化合物を、心臓同種移植片拒絶を阻害するそれらの能力について評価するためのネズミモデルが従来記載されている（Stepkowskiら，J．Immunol.，1994，153 ，5336）。このモデルを、Ｂ７タンパク質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド単独の、又は細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせでの免疫抑制能を評価するのに用いた。方法：心臓同種移植片拒絶の研究及びＢＡＬＢ／ｃマウスのオリゴヌクレオチド処置は本質的に従来記載される通りに行った（Stepkowskiら，J．Immunol.，1994，1 53，5336）。用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドにはＩＳＩＳ１１６９６、ＩＳＩＳ３０８２（ＩＣＡＭ−１を標的とする）及びＩＳＩＳ１０８２（ヘルペスウイルスＵＬ−１３遺伝子配列を標的とする対照オリゴヌクレオチド）が含まれていた。用いた投与量は（以下に示されるように）個々のオリゴヌクレオチド１、２、２、５、５もしくは１０ｍｇ／ｋｇであった；オリゴヌクレオチドの組み合わせを投与する場合には、各々のオリゴヌクレオチドを１、５もしくは１０ｍｇ／ｋｇの投与量（それぞれ、２、１０及び２０ｍｇ／ｋｇの総オリゴヌクレオチド投与量）で投与した。移植した心臓及びそれらの宿主の生存時間を監視して記録した。結果：未処理マウスの平均生存時間は８.２±０.８日（７、８、８、８、９、９日）であった。マウスをＩＳＩＳ１０８２（配列番号１２５、非関連対照オリゴヌクレオチド）で７日間処置することで、平均生存時間が７.１±０.７日（５ｍｇ／ｋｇ／日；６、７、７、７、８、８）又は７.０±０．８日（１０ｍｇ／ｋｇ／日；６、７、７、８）に僅かに減少した。マウスをネズミＢ７−２オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１６９６（配列番号１０８）で７日間処置することにより、２種類の用量で、平均生存時間が９.３日に増加した（２ｍｇ／ｋｇ／日、９.３± ０.６日、９、９、１０；１０ｍｇ／ｋｇ／日、９.３±１.３日、８、９、９、１１）。マウスをＩＣＡＭ−１オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ３０８２で７日間処置することによってもマウスの平均生存は幾つかの用量にわたって増加した。具体的には、１ｍｇ／ｋｇ／日で、平均生存時間（ＭＳＤ）は１１.０±０．０（１１、１１、１１）であり；２.５ｍｇ／ｋｇ／日で、ＭＳＤは１２.０±２.７（１０、１２、１３、１６）であり；５ｍｇ／ｋｇ／日で、ＭＳＤは１４.１± ２.７（１０、１２、１２、１３、１６、１６、１７、１７）であり；及び１０ｍｇ／ｋｇ／日で、ＭＳＤは１５.３±５.８（１２、１２、１３、２４）であった。マウスを各々１ｍｇ／ｋｇ／日のＩＳＩＳ３０８２及び１１６９６で７日間処置した場合には幾らかの相乗作用が見られた；ＭＳＤは１３.８±１.０（１３、１３、１４、１５）であった。実施例１１：Ｂ７タンパク質をコードする核酸の検出オリゴヌクレオチドを、合成後に、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる５'末端での³²Ｐ標識により放射標識する。Sambrookら，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Volume 2, pg.11.31。Ｂ７タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズすることが可能な放射標識オリゴヌクレオチドを特異的ハイブリダイゼーションが生じ得る条件下でＢ７タンパク質の発現が疑われる組織又は細胞と接触させ、その試料を洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除去する。放射標識オリゴヌクレオチドを特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で正常な組織又は細胞試料と接触させ、その試料を洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除去する同様の対照を維持する。試料中に残存する放射能は結合したオリゴヌクレオチドを示しものであり、それをシンチレーションカウンター又は他の定型的な手段を用いて定量する。試料中に残存する、対照組織又は細胞と比較してより多量の放射能はＢ７遺伝子の発現の増加を示し、それに対して、試料中の、対照よりも少量の放射能はＢ７遺伝子の発現の減少を示す。また、本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはオートラジオグラフィーにおいても有用である。Ｂ７遺伝子の発現が疑われる組織の切片を上述の通りに放射標識オリゴヌクレオチドで処理して洗浄し、次に標準的なオートラジオグラフィーの手順に従って写真用エマルジョンに露光する。正常組織切片の対照も維持する。このエマルジョンは、現像すると、Ｂ７遺伝子を発現する領域全体にわたって銀粒子の画像を生じ、それを定量化する。対照及び試験試料で観察される銀粒子を比較することにより、Ｂ７の発現の程度を決定する。Ｂ７遺伝子の発現を蛍光検出するための類似の検定では、フルオレセイン又は他の蛍光タグで標識した本発明のオリゴヌクレオチドが用いられる。標識オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems、Foster City、CA）で、標準的なホスホラミダイト化学を用いて合成する。b−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトはApplied Biosystems（Foster City、CA）から購入する。フルオレセイン標識アミダイトはGlen Research（Sterling、VA）から購入する。オリゴヌクレオチド及び生物学的試料のインキュベーションを、シンチレーションカウンターの代わりに蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出することを除いて、放射標識オリゴヌクレオチドについて上述される通りに行う。試料中の、対照組織又は細胞と比較して多量の蛍光はＢ７遺伝子の発現の増加を示し、これに対して、試料中の、対照よりも少量の蛍光はＢ７遺伝子の発現の減少を示す。

【手続補正書】【提出日】１９９９年７月２３日（１９９９．７．２３）【補正内容】請求の範囲１．共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｂ７タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記Ｂ７タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド。２．共有結合の少なくとも１つが修飾された共有結合である、請求項１のオリゴヌクレオチド。３．修飾された共有結合がホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、モルホリノ結合、アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間結合、シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合及び複素環糖間結合からなる群より選択される、請求項２のオリゴヌクレオチド。４．ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾された糖部分を有する、請求項１のオリゴヌクレオチド。５．修飾された糖部分が、ヌクレオチドの２'位、３'末端ヌクレオチドの３ '位又は５'末端オリゴヌクレオチドの５'位での修飾である、請求項４のオリゴヌクレオチド。６．修飾が、３'ヒドロキシル基のアジド基での置換及び３'もしくは５'ヒドロキシル基の水素での置換からなる群より選択される、請求項５のオリゴヌクレオチド。７．修飾が、２'位での、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＣＨ₃、−Ｆ、−ＯＣＮ、− ＯＣＨ₃ＯＣＨ₃、−ＯＣＨ₃Ｏ(ＣＨ₂)_nＣＨ₃、−Ｏ(ＣＨ₂)_nＮＨ₂もしくは−Ｏ( ＣＨ₂)_nＣＨ₃（ここで、ｎは１〜約１０である）、Ｃ₁〜Ｃ₁₀低級アルキル基、アルコキシアルコキシ基、置換低級アルキル基、置換アルカリール基、置換アラルキル基、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＣＦ₃、−ＯＣＦ₃、−Ｏ−アルキル基、 −Ｓ−アルキル基、−Ｎ−アルキル基、Ｏ−アルケニル基、Ｓ−アルケニル基、Ｎ−アルケニル基、−ＳＯＣＨ₃、−ＳＯ₂ＣＨ₃、−ＯＮＯ₂、−ＮＯ₂、−Ｎ₃、 −ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルカリール基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキルアミノ基、置換シリル基、ＲＮＡ開裂基、リポーター基、ＤＮＡ介在基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、メトキシエトキシ基及びメトキシ基からなる群より選択される部分の置換又は付加である、請求項５のオリゴヌクレオチド。８．ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾されたヌクレオベースを有する、請求項１のオリゴヌクレオチド。９．修飾されたヌクレオベースが、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、グリコシル５−ヒドロキシメチルシトシン、ゲンチオビオシル５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、６−メチルアデニン、Ｎ⁶−(６−アミノヘキシル)アデニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニン及び２,６−ジアミノプリンからなる群より選択される、請求項８のオリゴヌクレオチド。１０．Ｂ７タンパク質がヒトＢ７−１である、請求項１のオリゴヌクレオチド。１１．配列番号３６の配列を含む、請求項１０のオリゴヌクレオチド。１２．Ｂ７タンパク質がヒトＢ７−２である、請求項１のオリゴヌクレオチド。１３．配列番号３、配列番号９又は配列番号１６の配列を含む、請求項１２のオリゴヌクレオチド。１４．請求項１のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。１５．オリゴヌクレオチドが、細胞による前記オリゴヌクレオチドの取り込みを強化する少なくとも１つの親油性部分を含む、請求項１のオリゴヌクレオチド。１６．親油性部分が、コレステロール部分、コレステリル部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン鎖、ポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸鎖、パルミチル部分、オクタデシルアミン部分及びヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分からなる群より選択される、請求項１５のオリゴヌクレオチド。１７．請求項１５のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。１８．（a）可溶性ＩＣＡＭタンパク質、抗体−毒素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、インターフェロン、交感神経模倣薬、ヒスタミンＨ₁受容体アンタゴニスト、及びヒスタミンＨ₂受容体アンタゴニストからなる群より選択される抗炎症剤又は免疫抑制剤；（b）請求項１のオリゴヌクレオチド；及び（c）薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。１９．（a）共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、前記共有結合の少なくとも１つはホスホジエステル結合以外の結合であり、前記オリゴヌクレオチドはＩＣＡＭタンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドは前記ＩＣＡＭタンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド；（b）請求項１のオリゴヌクレオチド；及び（c）薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。２０．（a）請求項１０のオリゴヌクレオチド；（b）共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｂ７−２タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記Ｂ７−２タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド；及び (c)薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。２１．（a）可溶性ＩＣＡＭタンパク質、抗体−毒素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、インターフェロン、交感神経模倣薬、ヒスタミンＨ₁受容体アンタゴニスト、ヒスタミンＨ₂受容体アンタゴニスト及びＩＣＡＭタンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される抗炎症剤又は免疫抑制剤；（b）請求項１０のオリゴヌクレオチド；（c）共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｂ７−２タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記Ｂ７−２タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド；及び（d）薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。２２．細胞又は組織におけるＢ７タンパク質の発現をin vitroで調節する方法であって、前記細胞又は組織を請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １０５Ａ６１Ｐ 43/00 １０５Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヴィッカーズ，ティモシー・エイアメリカ合衆国カリフォルニア州92057, オーシャンサイド，ルイゼノ・アベニュー 253

Claims

【特許請求の範囲】１．共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｂ７タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記Ｂ７タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド。２．共有結合の少なくとも１つが修飾された共有結合である、請求項１のオリゴヌクレオチド。３．修飾された共有結合がホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、モルホリノ結合、アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間結合、シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合及び複素環糖間結合からなる群より選択される、請求項２のオリゴヌクレオチド。４．ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾された糖部分を有する、請求項１のオリゴヌクレオチド。５．修飾された糖部分が、ヌクレオチドの２'位、３'末端ヌクレオチドの３ '位又は５'末端オリゴヌクレオチドの５'位での修飾である、請求項４のオリゴヌクレオチド。６．修飾が、３'ヒドロキシル基のアジド基での置換及び３'もしくは５'ヒドロキシル基の水素での置換からなる群より選択される、請求項５のオリゴヌクレオチド。７．修飾が、２'位での、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＣＨ₃、−Ｆ、−ＯＣＮ、− ＯＣＨ₃ＯＣＨ₃、−ＯＣＨ₃Ｏ(ＣＨ₂)_nＣＨ₃、−Ｏ(ＣＨ₂)_nＮＨ₂もしくは−Ｏ( ＣＨ₂)_nＣＨ₃（ここで、ｎは１〜約１０である）、Ｃ₁〜Ｃ₁₀低級アルキル基、アルコキシアルコキシ基、置換低級アルキル基、置換アルカリール基、置換アラルキル基、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＣＦ₃、−ＯＣＦ₃、−Ｏ−アルキル基、 −Ｓ−アルキル基、−Ｎ−アルキル基、Ｏ−アルケニル基、Ｓ−アルケニル基、Ｎ−アルケニル基、−ＳＯＣＨ₃、−ＳＯ₂ＣＨ₃、−ＯＮＯ₂、−ＮＯ₂、−Ｎ₃、 −ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルカリール基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキルアミノ基、置換シリル基、ＲＮＡ開裂基、リポーター基、ＤＮＡ介在基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、メトキシエトキシ基及びメトキシ基からなる群より選択される部分の置換又は付加である、請求項５のオリゴヌクレオチド。８．ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾されたヌクレオベースを有する、請求項１のオリゴヌクレオチド。９．修飾されたヌクレオベースが、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、グリコシル５−ヒドロキシメチルシトシン、ゲンチオビオシル５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、６−メチルアデニン、Ｎ⁶−(６−アミノヘキシル)アデニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニン及び２,６−ジアミノプリンからなる群より選択される、請求項８のオリゴヌクレオチド。１０．Ｂ７タンパク質がヒトＢ７−１である、請求項１のオリゴヌクレオチド。１１．配列番号３６の配列を含む、請求項１０のオリゴヌクレオチド。１２．Ｂ７タンパク質がヒトＢ７−２である、請求項１のオリゴヌクレオチド。１３．配列番号３、配列番号９又は配列番号１６の配列を含む、請求項１２のオリゴヌクレオチド。１４．請求項１のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。１５．オリゴヌクレオチドが、細胞による前記オリゴヌクレオチドの取り込みを強化する少なくとも１つの親油性部分を含む、請求項１のオリゴヌクレオチド。１６．親油性部分が、コレステロール部分、コレステリル部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン鎖、ポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸鎖、パルミチル部分、オクタデシルアミン部分及びヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分からなる群より選択される、請求項１５のオリゴヌクレオチド。１７．請求項１５のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。１８．(a)可溶性ＩＣＡＭタンパク質、抗体−毒素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、インターフェロン、交感神経模倣薬、ヒスタミンＨ₁受容体アンタゴニスト、及びヒスタミンＨ₂受容体アンタゴニストからなる群より選択される抗炎症剤又は免疫抑制剤； (b)請求項１のオリゴヌクレオチド；及び (c)薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。１９．(a)共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、前記共有結合の少なくとも１つはホスホジエステル結合以外の結合であり、前記オリゴヌクレオチドはＩＣＡＭタンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドは前記ＩＣＡＭタンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド； (b)請求項１のオリゴヌクレオチド；及び (c)薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。２０．(a)請求項１０のオリゴヌクレオチド； (b)共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｂ７−２タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記Ｂ７−２タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド；及び (c)薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。２１．(a)可溶性ＩＣＡＭタンパク質、抗体−毒素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、インターフェロン、交感神経模倣薬、ヒスタミンＨ₁受容体アンタゴニスト、ヒスタミンＨ₂受容体アンタゴニスト及びＩＣＡＭタンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される抗炎症剤又は免疫抑制剤； (b)請求項１０のオリゴヌクレオチド； (c)共有結合によって連結された８〜３０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｂ７−２タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る配列を有し、かつ前記Ｂ７−２タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド；及び (d)薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。２２．細胞又は組織におけるＢ７タンパク質の発現を調節する方法であって、前記細胞又は組織を請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる方法。２３．動物における炎症を治療する方法であって、前記動物に治療上有効な量の請求項１のオリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる方法。２４．動物における自己免疫疾患を治療する方法であって、前記動物に治療上有効な量の請求項１のオリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる方法。