JP4168285B2 - インテグリンα4発現のアンチセンス調節 - Google Patents
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Description
本発明はインテグリンα4の発現を調節するための組成物および方法を提供する。特に、本発明はヒトインテグリンα4をコード化する核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドはヒトインテグリンα4発現を調節することが示されている。
炎症とは、感染性または損傷性因子の破壊および損傷を受けた組織の単離を生じる、損傷、感染または組織破壊に応答して組織により惹起される局所的な保護的応答である。典型的な炎症応答は以下のように進行する:外来物としての抗原の認識または組織損傷の認識、可溶性炎症メディエイターの合成および放出、感染または組織損傷部位への炎症性細胞の動員、侵襲している生物体または損傷を受けた組織の破壊および除去、および侵襲している生物体または損傷が解決された後のシステム不活性化。炎症性成分を含む多くのヒト疾患において、炎症性応答を減弱させる通常の恒常性機構は不完全であり、正常組織の損傷および破壊を生じる。
血管指向性MadCAM-1であるので粘膜ホーミングレセプターとして知られているインテグリンα4β7を形成する。α4β7インテグリンは腸管に対する指向性を持つ記憶T細胞の副群を同定し、一方、α4β1(VLA-4)はほとんどの単核白血球上で構成的に発現されているが、循環している好中球では発現されない。VCAM-1とVLA-4の相互作用は、VLA-4がアテローム性動脈硬化症、アレルギーおよび喘息、関節炎および腫瘍細胞転移を含む炎症性疾患の治療標的となる可能性があることを示唆している(Kassner, P.D., et al, Adv. Exp. Med. Biol. 1992, 323, 163-170)。VLA-4はまた骨髄において、造血幹細胞接着の促進(即ち、保持)においても役割を果たしていることが観察されている(Papayannopoulou and Nakamoto, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90, 9374-9378)。
の相互作用の阻害を目指す治療は、カヘキシー、敗血症、手術ストレスまたはTNF-α治療的応用を含むTNF-αの高血清濃度に関連する状態での転移の危険性を減少させるのに有用であろうことを示唆している。腫瘍細胞はしばしばIL-1およびTNF-αを分泌するので、そのような治療はそのような腫瘍細胞に関連する転移の危険性を減少させるのに有用であろう。
3-16)、VLA-4に対するモノクローナル抗体は多発性硬化症のフェーズII臨床試験であることを記載している。CS-1ペプチドアンタゴニストはJackson, D.Y.らにより記載されている(J. Med. Chem. 1997, 40, 3359-3369)。
1996, 179, 91-101)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インテグリンα4の発現を調節する、およびその発現に関連する疾患を処置するのに有用な手段を代表すると信じられている。
本発明はインテグリンα4をコード化する核酸を標的とし、インテグリンα4の発現を調節するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬およびその他の組成物もまた提供される。さらに、細胞または組織中のインテグリンα4の発現を調節する方法が提供され、該方法は該細胞または組織と一つまたはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を接触させることを含む。さらに、治療的にまたは予防的に有効量の、一つまたはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、インテグリンα4の発現に関係する疾患または状態を有するかまたは傾向があることが疑われる動物、特にヒトを治療するための方法が提供される。
本発明は、例えば、以下の発明を包含する。
(1)ヒトインテグリンα4をコード化する核酸分子を標的とし、ヒトインテグリンα4の発現を阻害する、8から30ヌクレオチド長のアンチセンス化合物。
(2)アンチセンスオリゴヌクレオチドである、上記(1)に記載のアンチセンス化合物。
(3)アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 13、15、35、37、39または46を含む、上記(2)に記載のアンチセンス化合物。
(4)少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、上記(2)に記載のアンチセンス化合物。
(5)修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、上記(4)のアンチセンス化合物。
(6)少なくとも一つの修飾糖部分を含む、上記(2)に記載のアンチセンス化合物。
(7)修飾糖部分が2'-O-メトキシエチル糖部分である、上記(6)に記載のアンチセンス化合物。
(8)少なくとも一つの修飾ヌクレオ塩基を含む、上記(2)に記載のアンチセンス化合物。
(9)修飾ヌクレオ塩基が5-メチルシトシンである、上記(8)に記載のアンチセンス化合物。
(10)キメラオリゴヌクレオチドである、上記(2)に記載のアンチセンス化合物。
(11)上記(1)のアンチセンス化合物および医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。
(12)コロイド状分散系をさらに含む、上記(11)に記載の医薬組成物。
(13)アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、上記(11)に記載の医薬組成物。
(14)ヒト細胞または組織においてインテグリンα4の発現を阻害する方法であって、インテグリンα4の発現が阻害されるように該細胞または組織と上記(1)のアンチセンス化合物を接触させることを含む方法。
(15)インテグリンα4に関連する疾患または状態を持っているヒトを処置する方法であって、インテグリンα4の発現が阻害されるように該動物に治療的または予防的に有効量の上記(1)のアンチセンス化合物を投与することを含む方法。
(16)疾患または状態が炎症性疾患または状態または自己免疫疾患または状態である、上記(15)に記載の方法。
(17)疾患または状態が、冒された組織内への白血球移動により特徴付けられる、上記(15)に記載の方法。
(18)冒された組織が中枢神経系組織である、上記(17)に記載の方法。
(19)疾患または状態が慢性関節リューマチ、多発性硬化症、喘息、炎症性腸疾患、糖尿病、肝炎、同種移植片拒絶または腫瘍転移である、上記(15)に記載の方法。
(20)ヒト細胞または組織中のVLA-4レベルを低下させる方法であって、VLA-4のレベルが低下するように該細胞または組織と上記(1)のアンチセンス化合物を接触させることを含む方法。
(21)ヒト細胞または組織中のα4β7レベルを低下させる方法であって、α4β7のレベルが低下するように該細胞または組織と上記(1)のアンチセンス化合物を接触させることを含む方法。
(22)ヒトにおいて循環系内への造血前駆細胞の動員を増加させる方法であって、循環系内への該造血前駆細胞の動員が増加するように該ヒトと上記(1)のアンチセンス化合物を接触させることを含む方法。
(23)アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92または93を含む、上記(2)に記載のアンチセンス化合物。
(24)疾患または状態が転移性疾患または状態である、上記(15)に記載の方法。
(25)疾患または状態がメラノーマである、上記(24)に記載の方法。
(26)第一の型の細胞の第二の型の細胞への接着を減少させる方法であって、該細胞型の少なくとも一つを上記(1)のアンチセンス化合物と接触させることを含む方法。
(27)該第一の細胞型がメラノーマ細胞またはリンパ球である、上記(26)に記載の方法。
(28)該第二の細胞型が内皮細胞である、上記(26)に記載の方法。
本発明はインテグリンα4をコード化する核酸分子機能を調節し、最終的に産生されるインテグリンα4の量を調節する際に使用するためのオリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを用いる。このことはインテグリンα4をコード化する一つまたはそれ以上の核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書で使用される場合、用語“標的核酸分子”および“インテグリンα4をコード化する核酸”とはインテグリンα4をコード化するDNA、そのようなDNAから転写されたRNA(プレ-mRNAおよびmRNAを含む)およびそのようなRNAから誘導されたcDNAも含む。その標的核酸へのオリゴマー化合物の特異的ハイブリダイゼーションは核酸の正常機能を妨害する。特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸機能のこの調節は一般に、“アンチセンス”と称されている。妨害されるべきDNAの機能には複写および転写が含まれる。妨害されるべきRNAの機能には、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位、RNAからのタンパク質の翻訳、一つまたはそれ以上のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAにより引き出されるまたは容易にされるであろう触媒活性などのようなすべての生命機能が含まれる。標的核酸機能に対するそのような妨害の全体での影響はインテグリンα4発現の調節である。本発明の文脈において、“調節”とは遺伝子発現における増加(刺激)または減少(阻害)の両方を意味している。本発明の文脈において、阻害が遺伝子発現調節の好適な形であり、mRNAが好適な標的である。
起こす場合、および特異的な結合が望まれる条件下(即ち、in vivoアッセイまたは治療的処置の場合は生理学的条件下、またはin vitroアッセイの場合はアッセイが実施される条件下)で非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在すれば、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズ可能である。
クボーンにリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオシドであると考えることもできる。
はない。PNA化合物についてのさらなる教えはNielsen et al., (Science, 1991, 254, 1497-1500)にみることができる。
al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好適な修飾には、1998年1月30日に出願された米国特許出願第09/016,520号(本出願と共通して所有され、その内容は本明細書において援用される)に記載されているような2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、O(CH2)2ON(CH3)2基(2-DMAOEとしても知られている)が含まれる。
には、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシルメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(プソイドウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ(特に5-ブロモ)、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、および3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンのような他の合成および天然のヌクレオ塩基が含まれる。さらに別のヌクレオ塩基には米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, , Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, 858-859に記載されているもの、Englischら(Angewandte Chemie, IE, 1991, 30, 613)に記載されているもの、およびSanghvi, Y.S., (Antisense Research and Applications, 15, 289-302)およびCrooke, S.T. and Lebleu, B., ed., (CRC Press, 1993)に記載されているものが含まれる。これらのヌクレオ塩基のあるものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンが挙げられ、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピルウラシルおよび5-プロピニルシトシンが含まれる。5-メチルシトシン置換は核酸二重鎖安定性を0.6-1.2℃増加させることが示されており(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications 1993, 276-278)、現在のところ好適な塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合さらにより特別に好適である。
et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)のような脂質部
分が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸のような有機カルボン酸、スルホン酸、スルホまたはホスホ酸またはN-置換スルファミン酸;および、天然のタンパク質の合成に含まれている20のアルファ-アミノ酸のようなアミノ酸(例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸)、および同様にフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-または3-ホスホグリセラート、グルコース-6-リン酸、N-シクロヘキシルスルファミン酸(シクラメートの形成で)との、またはアスコルビン酸のようなその他の酸性有機化合物とのような、種々の無機および有機酸の塩基性塩が含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた医薬的に許容可能なカチオンにより製造されるであろう。適した医薬的に許容可能なカチオンは当業者にはよく知られており、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび四級アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
る。少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは経口投与に特に有用であると信じられている。
of Therapeutics, 第9版, Hardman et al., 編, McGraw-Hill, New York, NY 1996, 934-935ページ)。種々の天然胆汁酸塩およびその合成誘導体が浸透促進剤として働く。従って、用語“胆汁酸塩”とは天然に存在する胆汁成分ならびにそのいずれかの合成誘導体を含む。好適な胆汁酸塩は1997年7月1日に出願され、係属中の米国特許出願第08/886,829
号(本出願と共通して所有され、本明細書において援用される)に開示されている。現在のところ好適な胆汁酸塩はケノデオキシコール酸(CDCA)(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)であり、一般的には0.5%から2%の濃度で使用される。
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-192;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33;Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51)。キレート剤はDNase阻害剤として働くという利点も与える。
他の糖、微晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド性二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど)、崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。徐放性経口送達系および/または経口投与剤形の腸溶コーティングは米国特許第4,704,295;4,556,552;4,309,406;および4,309,404号に記載されている。
物、特に、第一の核酸を標的とするオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする一つまたはそれ以上の追加のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。二つまたはそれ以上を組み合わせた化合物を一緒にまたは連続的に使用することができる。
実施例1
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホロアミダイト
デオキシおよび2'-アルコキシアミダイト
2'-デオキシおよび2'-メトキシ・ベータ-シアノエチルジイソプロピル・ホスホロアミダイトは市販品(例えば、Chemgenes, Needham MAまたはGlen Research, Inc. Sterling VA)が購入された。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは米国特許第5,506,351号(本明細書において援用される)に記載されているように製造された。2'-アルコキシアミダイトを使用するオリゴヌクレオチド合成のためには、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルが利用されたが、ただし、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を360秒に延長した。
2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2'-フルオロオリゴヌクレオチドは以前に記載されているように(Kawasaki, et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841および米国特許第5,670,633号、本明細書において援用される)合成された。簡単には、出発物質として入手可能な9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンを利用しおよび文献の方法を改良することにより、保護化ヌクレオシドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシンが合成された(それにより2'-アルファ-フルオロ原子が2'-ベータ-トリチル基のSN2-置換により導入された)。従って、N6-ベンゾイル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンが3',5'-ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として中程度の収率で選択的に保護化された。THPおよびN6-ベンゾイル基の脱保護化は標準的方法論を使用して達成され、および標準法を使用して、5'-ジメトキシトリチル-(DMT)および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイト中間体を得る。
2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、出発物質としてテトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)保護化9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニンを使用し、中間体ジイソブチリル-アラビノフラノシルグアノシンへの変換により達成された。TPDS基の脱保護化に続いて、ヒドロキシル基をTHPで保護化してジイソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンが得られた。粗生成物のフッ素による処理に続いて選択的O-脱アシル化およびトリフレート化を行い、THP基を脱保護化した。標準法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイトを得る。
2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は文献の方法を変形することにより達成され、その方法においては2,2'-アンヒドロ-1-ベータ-D-アラビノフラノシルウラシルが70%フッ化水素-ピリジンで処理された。標準法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイトを得る。
2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのアミノ化、続いての選択的保護化により合成され、N4-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンを得た。標準法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイトを得る。
2'-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは以下のように、またはMartin, P., (Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504)の方法に従って製造された。
5-メチルウリジン(リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから市販品として入手可能)(72.0 g、0.279 M)、炭酸ジフェニル(90.0 g、0.420 M)および炭酸水素ナトリウム(2.0 g、0.024 M)をDMF(300 mL)に加えた。混合物は撹拌しながら加熱環流して、発生する二酸化炭素を制御して放出させた。1時間後、わずかに黒くなった溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップ状物は撹拌しながらジエチルエーテル(2.5 L)に注いだ。生成物がゴム状物として生成された。エーテルをデカントし、残渣を最少量のメタノール(約400 mL)に溶解した。この溶液を新しいジエチルエーテル(2.5 L)に注ぎ、硬いゴム状物を得た。。エーテルをデカントし、ゴム状物を真空オーブンで乾燥させると(60℃、1 mmHgで24時間)、固形物が得られ、それを砕くと薄い黄褐色粉末となった(57 g、粗収率85%)。NMRスペクトルは構造と一致し、フェノールがナトリウム塩として夾雑していた(約5%)。この物質は続いての反応にそのまま使用された(または、酢酸エチル中のメタノール濃度勾配(10-25%)を使用するカラムクロマトグラフィーによりさらに精製でき、白色固形物が得られた、mp222-4℃)。
2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン(195 g、0.81 M)、トリス(2-メトキシエチル)ホウ酸(231 g、0.98 M)および2-メトキシエタノール(1.2 L)を2 Lのステンレス圧力容器に加え、160℃に前もって暖めておいた油浴中に置いた。155-160℃で48時間加熱後、容器を開き、溶液を蒸発乾固させ、MeOH(200 mL)で磨砕した。残渣は熱アセトン(1 L)に懸濁した。不溶性塩を濾過し、アセトン(150 mL)で洗浄し、濾液を蒸発させた。残渣(280 g)はCH3CN(600 mL)に溶解し、蒸発させた。シリカゲルかラム(3 kg)を0.5%Et3NH含有CH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)で充填した。残渣はCH2Cl2(250 mL)に溶解し、カラムへ加える前にシリカ(150 g)に吸着させた。生成物を充填溶液で溶出させると、160 g(63%)の生成物が得られた。追加の生成物が不純な分画を再処理する
ことで得られた。
2'-O-メトキシエチル-メチルウリジン(160 g、0.506 M)をピリジン(250 mL)と共蒸留し、乾燥残渣をピリジン(1.3 L)に溶解した。塩化ジメトキシトリチルの最初のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、混合物は室温で1時間撹拌した。第二のジメトキシトリチルのアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、反応液をさらに1時間撹拌した。次に、メタノール(170 mL)を加えて、反応を停止させた。HPLCは約70%の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、CH3CN(200 mL)で磨砕した。残渣をCHCl3(1.5 L)に溶解し、2×500 mLの飽和NaHCO3および2×500 mLの飽和NaClで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過および蒸発させた。275 gの残渣が得られた。残渣は0.5%Et3NH含有EtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で充填および溶出する3.5 kgのシリカゲルカラムで精製した。純粋な分画を蒸発させると164 gの生成物が得られた。不純な分画から約20 gの追加の生成物が得られ、総収量は183 g(57%)であった。
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシエチル(106 g、0.167 M)、DMF/ピリジン(562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製された750 mLの3:1混合物)および無水酢酸(24.38 mL、0.258 M)を混合し、室温で24時間撹拌した。最初にtlc試料をMeOHを加えて反応停止させることにより、tlcで反応をモニターした。tlcで判断することで反応が完了した後、MeOH(50 mL)を加え、混合物は35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3(800 mL)に溶解し、2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび2×200 mLの飽和NaClで抽出した。水層は200 mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層は硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させると122 gの残渣(約90%の生成物)が得られた。残渣は3.5 kgのシリカゲルカラムを用いて精製し、EtOAc/ヘキサン(4:1)で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させると96 g(84%)が得られた。後者の分画からさらに1.5 gが回収された。
第一の溶液は3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(96 g、0.144 M)をCH3CN(700 mL)に溶解することにより調製し、そして放置した。トリエチルアミン(189 mL、1.44 M)をトリアゾール(90 g、1.3 M)のCH3CN(1 L)溶液に加え、-5℃に冷却し、オーバーヘッド攪拌機を使用して0.5時間撹拌した。POCl3を撹拌溶液を0-10℃に保つように、30分かけて滴加し、生じた混合物はさらに2時間撹拌した。後者の溶液に、45分かけて第一の溶液を滴加した。得られた反応混合物は低温室で一夜保存した。反応混合物から塩を濾去し、濾液を蒸発させた。残渣をEtOAc(1 L)に溶解し、不溶性固形物を濾過した。濾液は1×300 mLのNaHCO3および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣をEtOAcと磨砕すると表題化合物が得られた。
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン(103 g、0.141 M)のジオキサン(500 mL)およびNH4OH(30 mL)溶液を室温で2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、MeOH(2×200 mL)と共沸させた。残渣をMeOH(300 mL)に溶解し、2リットルのステンレス圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH(400 mL)を加え、容器を100℃で2時間加熱した(tlcは完全な変換を示した)。容器内容物は蒸発乾固させ、残渣をEtOAc(500 mL)に溶解し、飽和NaCl(200 mL)で1回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去すると85 g(95%)の表題化合物が得られた。
2'-O-メトキシエチル-5'-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(85 g、0.134 M)をDMF(800 mL)に溶解し、撹拌しながら無水安息香酸(37.2 g、0.165 M)を加えた。3時間撹拌後、tlcは反応が約95%完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をMeOH(200 mL)と共沸させた。残渣をCHCl3(700 mL)に溶解し、飽和NaHCO3(2×300 mL)および飽和NaCl(2×300 mL)で抽出し、MgSO4で乾燥し、蒸発させると残渣(96 g)が得られた。残渣は1.5 kgのシリカカラム上で、溶出溶媒として0.5%Et3NH含有EtOAc/ヘキサン(1:1)を使用するクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物分画を蒸発させると90 g(90%)の表題化合物が得られた。
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(74
g、0.10 M)をCH2Cl2(1 L)に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1 g)および2-シアノエトキシ-テトラ-(イソプロピル)ホスファイト(40.5 mL、0.123 M)を窒素雰囲気下、撹拌しながら加えた。得られた混合物は室温で20時間撹拌した(tlcは反応が約95%完了していることを示した)。反応混合物は飽和NaHCO3(1×300 mL)および飽和NaCl(3×300 mL)で抽出した。水相洗浄物はCH2Cl2(300 mL)で逆抽出し、抽出液を合わせ、MgSO4で乾燥して濃縮した。得られた残渣は1.5 kgのシリカカラム上で、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン(3:1)を使用するクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物分画を合わせると90.6 g(87%)の表題化合物が得られた。
アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトは1998年2月14日に出願された米国特許出願第10/037,143号、および1998年1月30日に出願された第09/016,520号(両方とも本出願と共通して所有され、本明細書において援用される)の方法に従って製造された。
オリゴヌクレオチド合成
非置換および置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドはヨウ素による酸化の標準ホスホロアミダイト化学を用いる自動化DNA合成機(Applied Biosystemsモデル380B)で合成された。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは米国特許第4,469,863号(本明細書において援用される)に記載されているように製造された。
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは米国特許第5,130,302および5,177,198号(両方とも本明細書において援用される)に記載されているように製造された。
オリゴヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオシド(MMI連結オリゴヌクレオシドとも称される)、メチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド(MDH連結オリゴヌクレオシドとも称される)、およびメチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド(アミド-3連結オリゴヌクレオシドとも称される)、およびメチレンアミノカルボニル連結オリゴヌクレオシド(アミド-4連結オリゴヌクレオシドとも称される)、ならびに、例えば、交互的にMMIおよびP=OまたはP=S結合を有する混合バックボーン化合物は米国特許第5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240および5、610,289号(すべて本明細書において援用される)に記載されているように製造された。
実施例4
PNA合成
ペプチド核酸(PNA)はPeptide Nucleic Acids(PNA):Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23に示された種々の方法のいずれかに従って製造される。また、米国特許第5,539,082、5,700,922および5,719,262号(本明細書において援用される)に記載されているようにも製造されるであろう。
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドにはいくつかの異なった型がありうる。これらには連結されたヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが、連結されたヌクレオシドの5'および3'“ウィング”セグメント間に位置している第一の型、および“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3'末端または5'末端に位置している第二の“オープンエンド”型が含まれる。第一の型のオリゴヌクレオチドはまた、“ギャップマー”またはギャップ化オリゴヌクレオチドとして本分野では知られている。第二の型のオリゴヌクレオチドは“ヘミマー”または“ウィングマー”として本分野では知られている。
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは前記のように、Applied Biosystems自動化DNA合成機モデル380Bを使用して合成される。オリゴヌクレオチドは自動化合成機およびDNA部分のための2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホロアミダイト、および5'および3'ウィングのための5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホロアミダイトを使用して合成される。標準合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基送達後の待ち工程を600 sに延長し、RNAについて4回および2'-O-メチルについて2回繰り返すように変更した。十分に保護化されたオリゴヌクレオチドは支持体から切断され、リン酸基は3:1アンモニア/エタノール中、室温で一夜脱保護化され、凍結乾燥された。メタノール性アンモニア中、室温で24時間の処理を行ってすべての塩基を脱保護化し、再び凍結乾燥された。2'位を脱保護化するためにペレットを1 M TBAFのTHFに24時間、室温で再懸濁した。反応物は1 M TEAAで停止させ、試料はG25サイズ排除カラムで脱塩する前に、rotovacで1/2容量に減量された。回収されたオリゴについて次に、収量を分光学的に、および純度をキャピラリー電気泳動法および質量分光学的に分析した。
[2'-O-(2-メトキシエチル)]--[2'-デオキシ]--[-2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは前記2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための方法に従って、ただし2'-O-メチルアミダイトを2'-O-(メトキシエチル)アミダイトに置換して製造された。
[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]--[2'-デオキシホスホロチオエート]--[2'-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドは前記2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための方法に従って、ただし2'-O-メチルアミダイトを2'-O-(メトキシエチル)アミダイトに置換し、キメラ構造のウィング部分内のホスホジエステルヌクレオチド間結合を発生させるのにヨウ素による酸化、および中心ギャップのためのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を発生させるために3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド(Beaucage試薬)を利用する硫黄化で製造された。
オリゴヌクレオチド単離
制御孔ガラスカラム(Applied Biosystems)から切断し、濃水酸化アンモニウム中で18時間、55℃で脱保護化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは0.5 M NaClから2.5容量のエタノールで2回沈殿させることにより精製した。合成されたオリゴヌクレオチドは変性ゲル上、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、少なくとも85%が完全長物質であると判断された。合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量は定期的に31P核磁気共鳴分光学法により検査され、いくつかの研究においてはChiangら(J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171)により記載されているようにHPLCによりオリゴヌクレオチドが精製された。HPLC精製物質で得られた結果は非HPLC精製物質で得られた結果と同様であった。
インテグリンα4発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
インテグリンα4発現のアンチセンス調節は本分野では既知の種々の方法でアッセイできる。例えば、インテグリンα4 mRNAレベルは例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはリアルタイムPCR(RT-PCR)により定量できる。リアルタイム定量PCRが現在のところ好適である。RNA分析は全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに対して実施できる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in
Molecular Biology , 1993., 1, 4.1.1-4.2.9および4.5.1-4.5.3)による教えがある。ノーザンブロット分析は本分野では日常的なことであり、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology 1996, 1, 4.2.1-4.2.9)による教えがある。リアルタイム定量(PCR)はPE-Applied Biosystems, Foster City, CA、から市販品として入手可能なABI PRISM 7700 Sequence Detection System、を使用して(使用説明書に従って使用される)都合よく達成できる。PCRの他の方法も本分野で知られている。
ヒトインテグリンα4発現のアンチセンス阻害
本発明に従うと、公開された配列(GenBank寄託番号L12002、SEQ ID NO: 1として本明細書において援用される)を使用して、ヒトインテグリンα4 RNAの異なった領域を標的とする一連のオリゴヌクレオチドが設計された。標的部位はオリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号(配列起源参照物、GenBank寄託番号L12002に与えられているように)により示されている。表1のすべての化合物は18ヌクレオチドの長さであり、ホスホロチオエートバックボーンを持ち、中心にある10塩基デオキシヌクレオチドギャップに2'-メトキシエトキシ(2'MOE)ウィングが隣接している。オリゴヌクレオチド処理2日前に、ヒトA375メラノーマ細胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)を2000細胞/cm2で播種した。細胞は、200 nMオリゴヌクレオチドおよび6μg/ml LIPOFECTINで4時間処理した。細胞は一夜インキュベートし、2 mM EDTAのPBS溶液で採取した。細胞を2%ウシ血清アルブミン、0.2%アジ化ナトリウムのD-PBSを用いて4℃で洗浄した。細胞は200×gで遠心分離し、上清はデカントして捨てた。タンパク質レベルは報告されている方法(Condon and Bennett, J. Biol. Chem. 1996, 271, 30398-30403)に従って、フローサイトメトリーにより決定した。特異的に結合された抗体CD49d-FITC(Immunotech, West
brook, ME, クローンHP2/1)を2μL/試験ウェルで加え、対照IgG(マウスIgG1-FITC, PharMingen, San Diego, CA)はμg/mLの濃度で加えられた。抗体は暗所、4℃で、穏やかにかき混ぜながら30分間、細胞とインキュベートした。細胞を前記のように洗浄し、0.5%ホルムアルデヒドを含む0.3 mlのFacsFlow緩衝液に再懸濁した。細胞はBecton Dickinson FACScanで分析した。結果は平均蛍光強度に基づいて、対照発現のパーセントで表現されている。
インテグリンα4タンパク質発現に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの影響についての用量反応曲線
A375細胞を50、100、200および400 nMの濃度の、ISIS 24473、24475、24477および24451で4時間処理した。細胞はオリゴヌクレオチド処理48および72時間後にトリプシンで採取し、前の実施例のように2μg/mlのCD49d-FITCで染色した。結果は表2に示されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトインテグリンα4タンパク質レベルの阻害
インテグリンα4タンパク質発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量反応効果
インテグリンα4タンパク質発現に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についての用量反応曲線
追加の一連のオリゴヌクレオチドがインテグリンα4タンパク質発現に対する効果について試験され、前のスクリーニングからの活性化合物と比較された。これらのオリゴヌクレオチドはインテグリンα4プロモーター配列(Rosen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 4094-4098;GenBank寄託番号M62841、本明細書ではSEQ ID NO: 41として提供される)を標的とする。これらのオリゴヌクレオチドは表3に示されており、インテグリンα4タンパク質発現に対する効果は表4に示される。バックボーンは混合のものである場合、結合はホスホロチオエート(P=SまたはPS)については“s”、およびホスホジエステル(P=OまたはPO)については“o”で示されている。標的領域が“M62841”と示されている場合、オリゴヌクレオチドはプロモーター領域を標的としており、その配列はGenBank寄託番号M62841で説明されている。残りのオリゴヌクレオチドはGenbank寄託番号L12002に記載されている配列を標的としており、L12002配列上のそれらの標的部位が示されている。
Gコドンからすぐ下流のコード領域)と同一のmRNA領域を標的としており、ヒトmRNA標的とは3つのミスマッチを含む。
ヒトインテグリンα4を標的とする追加のオリゴヌクレオチド
ヒトインテグリンα4タンパク質発現に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についての用量反応曲線
インテグリンα4タンパク質レベルの阻害に対する、追加のオリゴヌクレオチドのスクリーニング
新規オリゴヌクレオチド26640、26641、26642および26644が合成され、前に試験したオリゴヌクレオチドと比較された。オリゴヌクレオチドは表5に示されており、インテグリンα4タンパク質レベルに対するそれらの効果は表6に示されている。標的部位は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列(GenBank寄託番号L12002)のヌクレオチド番号で示されている。
ヒトインテグリンα4を標的とする追加のオリゴヌクレオチド
ヒトインテグリンα4タンパク質発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についての用量反応曲線
マウスP388D(IL-1)細胞におけるマウスインテグリンα4 mRNA発現の、アンチセンス阻害
インテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより改善できると信じられている多くの状態は、ヒトでは検査して研究できないので、De Miersmanらにより報告されている配列(DNA Cell Biol. 1994, 13:743-754;GenBank寄託番号L20788、本明細書ではSEQ ID NO: 48として提供される)を使用し、マウスインテグリンα4を標的とする一連のオリゴヌクレオチドが設計された。これらのオリゴヌクレオチドは表7に示されている。ボールド体で示された塩基は2'-メトキシエトキシ(2'MOE)であり;残りの位置は2'-デオキシである。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する標的(GenBank寄託番号L20788)における最初のヌクレオチド位を示している。
Culture Collection, Manassas VA)を用い、3μg/mlリポフェクチン中、100 nMのオリゴヌクレオチド濃度で4時間スクリーニングされた。細胞を採取し、RNAはCatrimox-14溶液(Iowa Biotechnology Corp, Oakdale IA. Dahle, C.E.およびMacfarlane, D.E., BioTechniques 1993, 15, 1-4)を使用する細胞溶解物により精製された。RNAは1%アガロース/1.1%ホルムアルデヒドゲル上、各々のレーンに18μgのRNAを加えて電気泳動した。インテグリンα4プローブはBednarczukら(Biotechniques 1991 10, 478)の方法に従ってRT-PCRにより作製されたPCR標識1025塩基インテグリンα4断片(3681-4706位)であった。スクリーニングの結果は表8に示されている。
マウスインテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
マウスインテグリンα4 mRNA発現のアンチセンス阻害
マウスインテグリンα4 mRNA発現のアンチセンス阻害-用量反応
マウスインテグリンα4タンパク質発現のアンチセンス阻害
マウスIC-21マクロファージ細胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)がさらなる研究に使用された。追加のオリゴヌクレオチドがマウスインテグリンα4を標的化するために設計された。これらは表10に示されており;すべての2'MOEヌクレオチドはボールド体で示されており、残りの位置は2'-デオキシである。これらの化合物中の
すべての2'-MOEシトシンはすべての5'-メチルシトシンである。IC-21細胞はアッセイの2日前に5×104細胞/ウェルで24ウェルプレートに播種された。細胞は25 nMのオリゴヌクレオチドを含む3μg/ml LIPOFECTINで4時間処理された。ウェルは三重にされた。20時間後、細胞を2 mM EDTAで採取し、CD49d-フィコエリスリン(CD49d-PE)抗体複合体(クローンR1-2)および対照としてラットIgG2B-PEを用いて、実施例8に説明したようにフローサイトメトリーにより分析した。結果は表11に示されている。
マウスインテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
表11
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるインテグリンα4タンパク質発現の阻害
インテグリンα4タンパク質レベルに対するISIS 16431および16433も効果についての用量反応が表12に示されている。細胞は(三重)処理1日前に2.5×104細胞/ウェルで24ウェルプレートに播種された。オリゴヌクレオチド濃度は3μg/ml LIPOFECTIN中、0.2、1、5、25および50 nMであった。細胞は2 mM EDTAで4分処理することにより採取し、次に各々のウェルの内容物当たり1 mlの2%BSA、0.2%アジドが加えられた。タンパク質レベルはCD49d-PE抗体複合体を2μg/mlで、および対照としてラットIgG2Bを2μg/mlで使用して、実施例8に説明したようにフローサイトメトリーにより分析した。ISIS 16431および16433はインテグリンα4タンパク質阻害に対し、約1 nMのIC50を持っていることが観察された。
インテグリンα4タンパク質レベルに対する、16431、16433の用量反応効果
インテグリンα4タンパク質レベルに対する16431、16433の用量反応効果
インテグリンα4 RNAレベルに対するISIS 16433の用量反応効果
マウスインテグリンα4を標的とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチド-最適化
バックボーン化学および2'-メトキシエトキシギャップ配置を最適化するために、ISIS 16433配列(SEQ ID NO: 47、翻訳開始コドンを標的とする)を持つ追加のオリゴヌクレオチドが合成された。これらの化合物はインテグリンα4タンパク質発現を阻害する能力について試験された。化合物および結果は表15および16に示されている。ISIS 17044がインテグリンα4発現を開始レベル以下に減少させることが観察され、疾患の動物モデルでの続いての研究のために選択された。
SEQ ID NO: 47を有するオリゴヌクレオチドの最適化
SEQ ID NO: 47を持つオリゴヌクレオチドの最適化のための用量反応
多発性硬化症のマウス実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)モデル
実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)は多発性硬化症の動物実験モデルとしてしばしば使用される、炎症性、脱髄性中枢神経系疾患である。それは、全脊髄ホモジネートまたはミエリン塩基性タンパク質(MBP)またはプロテオリピドタンパク質(PLP)のようなミエリン鞘のタンパク質成分で免疫することにより、またはMBP-またはPLP-特異的T細胞を移入することにより、遺伝的に感受性のある動物で誘導することができる。Myers et al., J. Immunol. 1993, 151, 2252-2260。
EAE実験1
マウスを実施例15で説明したように、日用量1 mg/kgから20 mg/kgの範囲、皮下注射(SC)によりISIS 17044で処置した。平均ピーク疾患重度および発症までの平均日数が測定され、それらは表17に示されている。
EAE実験1-EAEに対するISIS 17044の影響
実施例17
EAE実験2
マウスを実施例15で説明したように、日用量0.3 mg/kgから3 mg/kgの範囲、皮下注射によりISIS 17044で処置し、および比較のため1 mg/mlが静脈内へ注射された。平均ピーク疾患重度および発症までの平均日数が測定され、それらは表18に示されている。
EAE実験2-EAEに対するISIS 17044の影響
実施例18
EAE実験3
マウスを実施例15で説明したように、日用量0.5 mg/kgから2.0 mg/kgの範囲、皮下注射(SC)によりISIS 17044で処置した。週3回投与計画も試験され、およびスクランブル化対照(ISIS 17614、GCCGACACCCGTTCGTTCGG、2'MOE/デオキシ;P=S;SEQ ID NO: 57)もまた試験された。疾患重度および疾患発症までの時間が測定され、それらは表19に示されている。
EAE実験3-EAEに対するISIS 17044の影響
実施例19
EAE実験4-予防的vs.治療的投与
マウスを実施例15で説明したように、0.01 mg/kgから2.0 mg/kgの日用量、皮下注射(SC)によりISIS 17044で処置した。スクランブル化対照オリゴヌクレオチド、ISIS 17614もまた2 mg/kgで試験された。治療的に1 mg/kg日用量もまた試験された。この投与計
画においては、オリゴヌクレオチド処置は18日目(動物が麻痺の徴候を示し始めた後)に開始され、31日目まで続けられた。疾患重度および疾患発症までの時間が測定され、それらは表20に示されている。
EAE実験4-EAEに対するISIS 17044の影響-治療的(T)vs.予防的(P)投与計画
EAE実験5-予防的vs.治療的投与
マウスを実施例15で説明したように、0.01 mg/kgから2.0 mg/kgの日用量、皮下注射(SC)によりISIS 17044で処置した。スクランブル化対照オリゴヌクレオチド、ISIS 17614もまた2 mg/kgで試験された。治療的に1 mg/kg日用量もまた試験された。この投与計画においては、オリゴヌクレオチド処置は11日目(動物が麻痺の徴候を示し始めた後)に開始され、27日目まで続けられた。疾患重度および疾患発症までの時間が測定され、それらは表21に示されている。
EAE実験5-EAEに対するISIS 17044の影響-治療的(T)vs.予防的(P)投与計画
慢性関節リュウマチのためのマウスコラーゲン誘導関節炎(CIA)モデル
ヒト慢性関節リュウマチのためのモデルが開発され、ここでマウスがウシタイプIIコラーゲンで免疫された(Anderson et al., J. Immunol. 1991 147, 1189-1193、Trentham et al., J. Exp. Med 1977, 146, 857を引用)。関節の膨潤および炎症の後、約3週間内に、慢性関節リュウマチに典型的である関節のゆがみおよび関節硬直が伴う。このモデルは、マウス関節炎に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド17044(マウスインテグリンα4を標的としている)の影響を研究するために使用された。
コラーゲン誘導関節炎(CIA)に対する、インテグリンα4を標的とするアンチセンスオ
リゴヌクレオチドの影響
予備的研究において、ISPH 17044の単一日用量10 mg/kgが、疾患誘導時から50日後の研究終了まで投与された。関節炎発症はISIS 17044処置群において70から30%へ低下した。臨床パラメーターの要約は表22に示されている。
コラーゲン誘導関節炎に対するISIS17044の影響
#脚/マウス=終了時の冒された脚の平均数/群のマウス総数
炎症のピーク日数=測定された各々の関節に対する、発症から最大腫脹時までの日数。
種々の処置群において関節炎を発症したマウスが比較され、結果が表23に示されている。
平均臨床スコア=冒されたマウスの総臨床スコア/群において冒されたマウス総数
実施例23
インテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによるEAEマウスの中枢神経系内への白血球移動の減少
EAE実験3(前記実施例18)のマウスをCO2で殺して脊髄を取り出し、腰部から低位胸部領域まで0.5 cm片に切断した。小片はドライアイスおよびメチルブタン上、O.C.T.組織凍結媒質(Ted Pella Inc., Redding, CA)中に包埋した。4ミクロン凍結切片を切り出し、一夜風乾した。切片は氷冷アセトンで3分間固定し、Dako Autostainer(Dako Corporatio
n, Carpinteria, CA)上に設置し、以下の工程で処理した:0.03%H2O2に5分、PBSで希釈した5%ロバ血清に5分、適切に希釈された一次抗体と45分、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ラット二次抗体(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)と30分。切片は処理の間にPBSで洗浄された。使用されたすべての抗体はBM-8(Bachem Bioscience Inc. (King of Prussia, PA)から)を除いて、PharMingen(San Diego, CA)からのラット抗マウスであった。免疫染色はDAB(Dako Corporation)で発色させ、ヘマトキシリンで対比染色された。
炎症性腸疾患に対する、インテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
炎症性腸疾患(IBD)のマウスモデルは最近Okayasuら(Gastroenterology 1990, 98, 694-702)により開発された。マウスへの硫酸デキストランの投与は、ほとんどすべての詳細な点までヒトIBDを模倣する大腸炎を誘導する。硫酸デキストラン誘導IBDおよびヒトIBDは続いて組織学的レベルで密に比較され、マウスモデルが非常に再現性があり、および信頼できるモデルであることが見いだされている。このモデルは炎症性腸疾患に対するISIS 17044の効果を試験するために使用される。
マウス異所性心臓移植モデルでの生存に対する、インテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
異種移植片拒絶反応の防止におけるインテグリンα4アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的効果を決定するため、マウス血管新生異所性心臓移植モデルにおける活性についてマウスインテグリンα4特異的オリゴヌクレオチドISIS 17044が試験された。Balb/cマウスからの心臓が、本質的にIsobeら(Circulation 1991, 84, 1246-1255)により記載されているような一次血管新生移植片としてC3Hマウスの腹部腔内へ移植された。オリゴヌクレオチドは7日ALZETポンプを通した連続的静脈内投与により投与された。非処置マウスの平均生存時間は通常約9-10日である。1 mg/kgから5 mg/kgのSIS 17044による7日間のマウス処置は平均生存時間を延長させることが予想される。
白血球移動に対する、インテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
組織および器官の白血球浸潤は炎症性過程の主な特色であり、炎症により生じる組織損傷に寄与している。白血球移動に対するISIS 17044の影響が、カラゲナン浸漬スポンジが皮下に移植されたマウスモデルを使用して試験された。カラゲナンは白血球移動および浮腫を刺激する。炎症性滲出液における白血球移動に対するオリゴヌクレオチドの効果は移植されたスポンジに浸潤する白血球の定量により評価された。4時間絶食後、40匹のマウスは各々が5匹のマウスを含む8つの群に無作為に割り振られた。各々のマウスはMETOFANEで麻酔され、1 mlの20 mg/mlのカラゲナン溶液を浸透させたポリエステルスポンジを皮下に移植した。スポンジ移植4時間前に群1に10 ml/kgの食塩水が静脈内へ投与され、担体対照として働いた。インドメタシン(陽性対照)は手術直後、6-8時間後に再び、および移植後21時間後に群2に20 ml/kgの量で3 mg/kgが経口で再び投与された。ISIS 17044は、スポンジ移植3時間前に群3に1 mg/kgから5 mg/kgの用量で皮下投与された。ISIS 17044は、スポンジ移植直後に群4に1 mg/kgから5 mg/kgの用量で静脈内投与された。ISIS 17044は、スポンジ移植2、4、8および18時間後に群5、6、7および8に1 mg/kgから5 mg/kgの用量で静脈内投与された。移植24時間後、スポンジを取りだし、EDTAおよび食塩水(5 ml)に浸し、搾って乾燥させた。スポンジ滲出液混合物中の白血球の総数が決定された。3 mg/kgでのインドメタシンの経口投与は、担体対照群と比較した場合、一般に平均白血球数の75-80%の減少を生じる。
実験的転移アッセイ
転移におけるインテグリンα4の役割を評価するため、1×105のC8161細胞を無胸腺ヌードマウスの側方尾静脈内へ注射することにより実験的転移アッセイが実施された。C8161はヒトメラノーマ細胞株である。C8161細胞のサイトカインTNF-αおよびインターフェロンγによる処理により、細胞がヌードマウス内へ注射された場合に肺転移の数を増加させることが以前に示されている(Miller, D.E. and Welch, D.R., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1990, 13, 353)。4週齢メス無胸腺ヌードマウス(Harlan Spraque Dawley)を使用する。動物はNIHのガイドラインに従って維持された。各々4-8匹のマウスの群が実験的転移アッセイで試験された。
ードマウスに注射した。もしくは、腫瘍細胞(オリゴヌクレオチドで処理されていない)を前記のように無胸腺ヌードマウス内に移植し、腫瘍を持っているマウスを1日おきに、1
mg/kgから5 mg/kgの用量でアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。
ISIS 27104によるC8161細胞の処理はこれらの細胞の転移性能力を減少させ、TNF-α処理により生じたC8161の促進された転移能を除去した。
クローン病のマウスモデルにおけるインテグリンα4アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
SJL/JおよびIL10-/-マウスがクローン病のTNBS(2,4,5,-トリニトロベンゼンスルホン酸)誘導大腸炎モデル(Neurath, M.F., et al., J. Exp. Med., 1995, 182, 1281-1290)に使用された。6週齢から3ヶ月齢の間のマウスを使用して、TNF-αアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を評価する。
肝炎のマウスモデルにおける、インテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
コンカナバリンA誘発肝炎が肝炎のマウスモデルとして使用された(Mizuhara, H., et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 1529-1537)。6週齢から3ヶ月齢の間のメスBalb/cおよびC57BL/6マウスを使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 17044の活性を評価する。
喘息のマウスモデルにおける、インテグリンα4を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
気道炎症がアレルギー性喘息の患者で観察されている。アレルギー性喘息のマウスモデルが開発されている(Hessel et al. J. Immunol. 1998, 160, 2998-3005)。オボアルブミンによるBALB/cマウスの感作は高レベルのオボアルブミン特異的IgGを血清中に誘導する。感作マウスにおけるオボアルブミン吸入は即時型気管支収縮応答を起こす。感作動物におけるオボアルブミンの反復吸入はin vivoで非特異的気道過応答性、および気道組織への白血球の浸潤を誘導する。
能動的感作は0.5 mlの発熱物質を含まない食塩水中の10μgのオボアルブミン(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, グレードII)を1日おきに7回、IP注射(1日1回)することによりが実施された。この方法はマウス血清に高力価の総IgGを産生し、その80%はオボアルブミン特異的IgGである(Hessel et al., 1998, J. Immunol. 160:2998-3005)。最後の注射から4週間後、マウスはオボアルブミンエアロゾル(2 mg/ml)または食塩水エアロゾルに1日1回、8日間にわたって暴露される。エアロゾルはMedix 8001(Sussex, UK)のようなネブライザーで発生させる。動物はエアロゾルのチャレンジに5分間暴露された。
造血前駆細胞の末梢化に対するインテグリンα4のアンチセンスの効果
骨髄から血液循環系への造血前駆細胞の移動(末梢化)は幹細胞移植において臨床的に有用である。この過程に対する薬物化合物の効果(および、患者の骨髄への移植された幹細胞の逆向きで選択的な堆積またはホーミング)を評価するためのマウスモデルが確立されている(Papayannopoulou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 9647-9651)。簡潔には、3-6ヶ月齢の病原体を持たないマウスが使用され、実験の期間中、通気をフィルター濾過したハウジングユニット内で飼った。ホーミングアッセイにおいて一次的または二次的レシピエントとして使用されたマウスはCs源からの1150 cGyの照射に暴露される。
ヒトインテグリンα4を標的とする追加のオリゴヌクレオチドのスクリーニング
ヒトインテグリンα4(Genbank寄託番号L12002、本明細書においてSEQ ID NO: 1として援用される)を標的とする追加のセットのアンチセンスオリゴヌクレオチドが設計された。オリゴヌクレオチドは表24に示されている。オリゴヌクレオチドは5'末端上の3つの2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドおよび3'末端上の8つの2'-MOEヌクレオチドが隣接するデオキシヌクレオチドの9-ヌクレオチド領域から成る“ギャップマー”として合成された。2'-MOEヌクレオチドは表中ではボールド体で示されている。オリゴヌクレオチドは全体がホスホロチオエートバックボーンを持つように合成され、すべてのシトシンは5-メチルシトシンである。オリゴヌクレオチドは前記実施例8で説明したように、リポフェクチン存在下、A375ヒトメラノーマ細胞でスクリーニングされた。結果はまた表24に示されている。表に示したように、オリゴヌクレオチド107234、107235、107236、107237、107238、107239、107240、107241、107242、107243、107244、107245、107246、107248、107249、107251、107252、107253、107254、107255、107256、107257、107258、107259および107260(各々SEQ ID NO: 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92および93)はインテグリンα4タンパク質発現の少なくとも約50%阻害を与え、好適である。これらの中でも、ISIS 107245、107248、107252、107255および107259 (各々SEQ ID NO: 78、81、85、88および92)がさらなる研究のために選択された。
ヒトインテグリンα4を標的とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチド
インテグリンα4タンパク質発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についての用量反応曲線
A375細胞は、BTX Electro Cell Manipulator 600(Genetronics, San Diego CA)を用い、175ボルト、r=1、c=1000、0.2 ml Opti-MEM、1×106細胞/ml、2 mm間隔の電極でのエレクトロポレーションによりISIS 107245、107248、107252、107255および107259で処理された。オリゴヌクレオチド濃度は1、3、10および30μMであった。オリゴヌクレオチド処理24時間後に細胞を採取し、前記の実施例でのようにフローサイトメトリーのために2μg/ml CD49d-FITCで染色した。結果は表25に示されている。
ヒトインテグリンα4を標的とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量反応
ISIS 27104およびISIS 107248の比較
Jurkat T細胞におけるインテグリンα4タンパク質発現のアンチセンス阻害
ISIS 107248は1、3、10、20および30μMの用量で、前記の実施例に従って、Jurkat Tリンパ球細胞でのインテグリンα4発現を阻害する能力について試験された。インテグリンα4タンパク質発現は、オリゴヌクレオチド処理24時間後に、3-30μMのオリゴヌクレオチド用量で約65-72%減少していた。処理48時間後、インテグリンα4タンパク質発現は3μMのオリゴヌクレオチド濃度で60%、10、20および30μMの濃度で90%減少していた。
Jurkat T細胞におけるインテグリンα4 RNA発現のアンチセンス阻害
インテグリンα4 mRNAレベルの定量はABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を製造者の使用説明書に従って使用するリアルタイム定量的PCRにより実施された。これは、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)生成物のハイスループット定量を可能にする、閉鎖チューブ性で、ゲルに基づかない、蛍光検出システムである。PCR完了後に増幅生成物が定量される標準PCRとは対照的に、リアルタイム定量PCRの生成物はそれらが蓄積されるにしたがって定量される。このことはPCR反応中に、フォワードおよびリバースPCRプライマー間を特異的にアニールし、二つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含ませることにより達成される。レポーター色素(例えば、JOEまたはFAM、Operon Technologies Inc., Alameda, CAかまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAから入手できる)はプローブの5'末端に結合され、およびクエンチャー色素(例えば、TAMRA、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAから入手できる)はプローブの3'末端に結合される。プローブおよび色素が無傷である場合、レポーター色素放射を3'-クエンチャー色素が近接することにより停止する。増幅の間、標的配列へのプローブのアニーリングは、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により切断できる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸張期の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断は、プローブの残りの部分(それ故にクエンチャー部分から)からレポーター色素を放出させ、配列特異的蛍光シグナルが発生される。各々のサイクルについて、追加のレポーター色素分子がそれらのそれぞれのプローブから切断され、ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System内に組み込まれているレーザー光学系により蛍光強度が一定の間隔でモニターされる。各々のアッセイにおいて、非処理対照試料からのmRNAの連続希釈を含む一連の平行反応から、試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のパーセント阻害を定量するために使用される標準曲線が作製される。
フォワード・プライマー:GACACGCTGCGCCTCAT(SEQ ID NO: 94、Genbank寄託番号L12002の319-335位でハイブリダイズ)
リバース・プライマー:ATTCAACACTAAGCGGCCACTG(SEQ ID NO: 95、Genbank寄託番号L12002の391-412位でハイブリダイズ)であり、PCRプローブは:
FAM-CCAACCGTCGCATCCCGTGCAA-TAMRA
(プローブはSEQ ID NO: 96;Genbank寄託番号L12002の361-382位でハイブリダイズ)であり、ここでFAM(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光性レポーター色素であり、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
フォワード・プライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO: 97)
リバース・プライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO: 98)であり、およびPCRプローブは:5'JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3'(プローブはSEQ ID NO: 99である)であり、ここで、JOE(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光性レポーター色素であり、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
細胞接着に対するインテグリンα4のアンチセンス阻害効果
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(Clonetics, San Diego CA)をEGM-UV培地(Clonetics)で培養し、TNF-αで20時間処理してVCAM発現を誘導した。A375メラノーマ細胞は前記のようにISIS 107248でエレクトロポレーションを行った。内皮細胞に対する特異的マーカーであるPECAMに対する抗体を使用し、フローサイトメトリーを使用して、HUVECへのA375メラノーマ細胞の接着阻害を定量した。対照(TNF処理、オリゴヌクレオチドなし)と比較し、ISIS 107248(10μM)はHUVECへのA375メラノーマ細胞接着を約85%阻害した。インテグリンα4に対する抗体は、接着を約72%阻害した。増加したVLA-4発現(インテグリンα4は一つの構成物である)とメラノーマ患者の悪化時間および総生存時間との間に統計的に有意な相関が示されているので、メラノーマ細胞は臨床的に適切なモデルである。Schadendorf et al., J. Natl. Cancer Inst., 1995, 87, 366-371。
Claims (19)
- ヒトインテグリンα4をコード化する核酸分子を標的とし、ヒトインテグリンα4の発現を阻害する、SEQ ID NO: 78、81、85、88、または92を含む、最大30ヌクレオチド長のアンチセンス化合物を含んでなる、慢性関節リューマチまたは多発性硬化症である疾患を有するヒトを治療するための医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物が少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物が少なくとも一つの修飾糖部分を含む、請求項1−4のいずれかに記載の医薬組成物。
- 修飾糖部分が2'-O-メトキシエチル糖部分である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物が少なくとも一つの修飾塩基を含む、請求項1−6のいずれかに記載の医薬組成物。
- 修飾塩基が5-メチルシトシンである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物がキメラオリゴヌクレオチドである、請求項1−8のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物が、ヒトインテグリンα4の発現を少なくとも40%を阻害する、請求項1−9のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物が、1以上の2'-O-メトキシエチルヌクレオチドが5'末端および3'末端に隣接するデオキシヌクレオチド領域を含んでなり、ここで、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、アンチセンス化合物の各シトシンが5-メチルシトシンである、請求項1−10のいずれかに記載の医薬組成物。
- SEQ ID NO: 81の塩基配列を有する20ヌクレオチド長のアンチセンス化合物を含んでなる、慢性関節リューマチまたは多発性硬化症である疾患を有するヒトを治療するための医薬組成物であって、
このアンチセンス化合物は、3つの2'-O-メトキシエチルヌクレオチドが5'末端に隣接し、8つの2'-O-メトキシエチルヌクレオチドが3'末端に隣接する、9デオキシヌクレオチドの領域を含んでなり、ここで、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、アンチセンス化合物の各シトシンが5-メチルシトシンである、上記医薬組成物。 - 前記アンチセンス化合物が塩の形である、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記塩がナトリウム塩である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 担体または希釈剤をさらに含む、請求項13または14に記載の医薬組成物。
- SEQ ID NO: 81の塩基配列を有する20ヌクレオチド長のアンチセンス化合物であって、
このアンチセンス化合物は、3つの2'-O-メトキシエチルヌクレオチドが5'末端に隣接し、8つの2'-O-メトキシエチルヌクレオチドが3'末端に隣接する、9デオキシヌクレオチドの領域を含んでなり、ここで、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、アンチセンス化合物の各シトシンは5-メチルシトシンである、上記アンチセンス化合物。 - 請求項16に記載の化合物またはその塩を含んでなる医薬組成物。
- 担体または希釈剤をさらに含む、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記塩がナトリウム塩である、請求項17または18に記載の医薬組成物。
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