ES2279632T3 - Modulacion antisentido de la expresion de integrina alfa 4. - Google Patents

Modulacion antisentido de la expresion de integrina alfa 4. Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido antisentido de hasta 30 nucleótidos de longitud que comprende la SEQ ID NO: 81, en el que dicho oligonucleótido antisentido tiene como objetivo una molécula de ácido nucleico que codifica la integrina a4 humana e inhibe la expresión de la integrina a4 humana.

Description

Modulación antisentido de la expresión de integrina \alpha4.
Campo de la invención
La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de la integrina \alpha4. En particular esta invención se refiere a compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, especialmente susceptibles de hibridación con los ácidos nucleicos que codifican la integrina \alpha4 humana. Se ha demostrado que tales oligonucleótidos modulan la expresión de la integrina \alpha4 humana.
Antecedentes de la invención
La inflamación es una respuesta protectora localizada provocada por los tejidos en respuesta a una lesión, infección, o destrucción del tejido dando como resultado la destrucción del agente infeccioso o lesivo y el aislamiento del tejido lesionado. Una respuesta inflamatoria típica progresa como sigue: reconocimiento de un antígeno como extraño o reconocimiento de un daño tisular, síntesis y liberación de mediadores inflamatorios solubles, reclutamiento de células inflamatorias al sitio de la infección o daño tisular, destrucción y separación del organismo invasor o del tejido dañado, y desactivación del sistema una vez que el organismo invasor o el daño han sido resueltos. En muchas enfermedades humanas con un componente inflamatorio, los mecanismos homeostásicos normales que atenúan las respuestas inflamatorias son defectuosos, dando como resultado daño y destrucción del tejido normal.
Las interacciones célula-célula están implicadas en la activación de la respuesta inmunitaria en cada una de las etapas descritas antes. Uno de los sucesos más tempranamente detectables en una respuesta inflamatoria normal es la adhesión de los leucocitos al endotelio vascular, seguida por la migración de leucocitos fuera de la vasculatura hacia el sitio de la infección o lesión. La adhesión de estos leucocitos, o glóbulos blancos sanguíneos, al endotelio vascular es una etapa obligada en la migración fuera de la vasculatura (Harlan, J.M., Blood 1985, 65, 513-525). Esta respuesta está mediada por la interacción de las moléculas de adhesión expresadas sobre la superficie celular de los leucocitos y las células endoteliales vasculares. El antígeno muy tardío 4 (también llamado VLA-4 \alpha4\beta1 o CD49d/CD29) es un receptor de adhesión homodimérico que está compuesto de subunidades \alpha y \beta ligadas no covalentemente y sirve para mediar en la adhesión de los leucocitos a la molécula-1 de adhesión de las células vasculares (VCAM-1) que se expresa sobre células endoteliales estimuladas con citocina. Esta interacción entre VCAM-1 y VLA-4 contribuye a la extravasación de leucocitos en afecciones inflamatorias agudas y crónicas, incluyendo la esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide, asma, psoriasis y alergia.
La fibronectina es también un ligando para el VLA-4. La fibronectina desempeña un importante papel en muchos procesos incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y la metástasis de las células tumorales (Guan, J. L. and Hynes, R.O., Cell 1990, 60, 53-61).
El VLA-4 es un heterodímero de una integrina \alpha4 y una integrina \beta1. La integrina \alpha4 puede formar también un heterodímero con una cadena de integrina \beta7 para formar la integrina \alpha4\beta7 que es conocida como un receptor de alojamiento (homing) mucosal porque su ligando principal es la MadCAM-1 de adhesión a la mucosa vascular. La integrina \alpha4\beta7 identifica un subconjunto de células T de memoria con un tropismo para el tracto intestinal, mientras que la integrina \alpha4\beta1 (VLA-4) es expresada de forma constitutiva en la mayor parte de los leucocitos mononucleares, pero no en los neutrófilos circulantes. La interacción de VCAM-1 con VLA-4 da a entender que el VLA-4 es una diana terapéutica potencial para las enfermedades inflamatorias, incluyendo la ateroesclerosis, alergia y asma, artritis, y metástasis de las células tumorales (Kassner, P. D., et al., Adv. Exp. Med. Biol. 1992, 323, 163-170). Se ha encontrado también que el VLA-4 desempeña un papel en la promoción de la adhesión (es decir, retención) de las células madres hematopoyéticas en la médula ósea (Papayannopoulou and Nakamoto, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90, 9374-9378).
El asma es una enfermedad inflamatoria asociada con la infiltración de eosinófilos en el pulmón. El VLA-4 se expresa en los eosinófilos. Metzger, W.J. (Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 467-478) usaron un modelo de asma en conejo para demostrar que tanto un anticuerpo anti-VLA-4 como un péptido CS-1 podrían reducir la infiltración de eosinófilos en el pulmón y reducir el desarrollo del asma. La artritis reumatoide es otra enfermedad asociada con la inflamación. Müller-Ladner, U., et al., (J. Rheumatology 1997, 24, 1873-1880) encontraron que la forma de fibronectina alternativamente dividida que contiene CS-1 era expresada en el sinovio reumatoide. Adicionalmente, encontraron que no solamente la expresión de la fibronectina producía un reclutamiento de las células que expresan VLA-4, sino que los fibroblastos del sinovio reumatoide expresaban VLA-4. Seiffge, D. (J. Rheumatology 1996, 23, 2086-2091) usaron un modelo de rata para artritis para demostrar que un anticuerpo monoclonal frente a la cadena \alpha4 de VLA-4 daba como resultado una mejoría de los síntomas.
El VLA-4 desempeña también un papel en una serie de enfermedades autoinmunes. Marazuela, M., et al., (Eur, J, Immunol. 1994, 24, 2483-2490) encontraron un aumento de la expresión tanto de la ruta VLA-4/VCAM-1 como de la ruta LFA/CAM-1,3 en la enfermedad de Graves y en la tiroiditis de Hashimoto, lo que da a entender que ambas desempeñan un papel en estas enfermedades. El VLA-4 desempeña también un papel en la esclerosis múltiple. Se ha encontrado que los anticuerpos frente a VLA-4 previenen la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), una enfermedad inducida experimentalmente que tiene similitudes con la esclerosis múltiple (Yednock, T.A., Nature 1992, 356, 63-66). Se detectaron niveles elevados de expresión de VLA-4 en un paciente con lupus eritematoso sistémico (Takeuchi, T., et al., Clin. Rheumatology 1995, 14, 370-374). El VLA-4 está implicado en las respuestas celulares a dos procedimientos quirúrgicos, los trasplantes y los procedimientos de reconstrucción vascular. El rechazo al alotrasplante es una respuesta común al trasplante de un tejido extraño. Se ha encontrado que los péptidos CS-1 evitan tanto el rechazo agudo (Coito, A.J., et al., Transplantation 1998, 65, 699-706) como el rechazo crónico (Korom, S., et al., Transplantation 1998, 65, 854-859) al bloquear la unión de VLA-4 a la fibronectina. Durante la cirugía de reconstrucción vascular, una causa común de fallo es la hiperplasia de la íntima que resulta de la acumulación de los monocitos y linfocitos. En un modelo de babuino, Lumsden, A.B., et al., (J. Vasc. Surg. 1997, 26, 87-93) demostraron que un anticuerpo anti-VLA-4 reducía la hiperplasia de la íntima.
El VLA-4 desempeña también un papel en la metástasis de las células tumorales. En la metástasis, las células tumorales deben cruzar la matriz extracelular, entrar en el sistema circulatorio e invadir un nuevo tejido. Bao, L. et al., (Differentiation 1993, 52, 239-246) detectaron la expresión de VLA-4 de muchas líneas de células tumorales humanas, incluyendo carcinoma de mama, melanoma y carcinoma renal, y encontraron que la presencia de VLA-4 guardaba una buena correlación con el potencial metastásico. Kawaguchi, S. et al., (Jpn. J. Cancer Res. 1992, 83, 1304-1316) transfectaron un cDNA que codifica la subunidad \alpha4 de VLA-4 a una línea de células de fibrosarcoma humano. Estas células sobre-expresaron VLA-4 y mostraron un aumento de la capacidad invasiva in vitro. Se ha demostrado que el aumento de la metástasis por IL-1 (Garafalo, A., et al., Cancer Res. 1995, 55, 414-419) o por TNF-\alpha (Okahara, H. et al., Cancer Res. 1994, 54, 3233-3236) implica la interacción entre VLA-4 y VCAM-1. Estos autores sugieren que una terapia dirigida hacia la inhibición de esta interacción debería ser útil para reducir el riesgo de metástasis con condiciones asociadas con altas concentraciones séricas de TNF-\alpha, incluyendo caquexia, sepsis, estrés quirúrgico, o aplicaciones terapéuticas del TNF-\alpha. Debido a que las células tumorales segregan a menudo IL-1 y TNF-\alpha, dicha terapia puede ser útil para reducir el riesgo de metástasis asociada con tales células tumorales.
El VLA-4 está implicado en promover la retención de las células progenitoras hematopoyéticas en la médula ósea. Se ha encontrado que los anticuerpos frente a la integrina \alpha4 (pero no frente a la integrina \beta2) movilizan selectivamente las células madres/progenitoras al torrente sanguíneo (Papayannopoulou and Nakamoto, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90, 9374-9378). Esta movilización tiene relevancia clínica en el campo del transplante de médula ósea ya que evita la necesidad de recoger médulas haciendo que haya células progenitoras hematopoyéticas disponibles en la sangre circulante.
Aunque los esteroides y otros fármacos antiinflamatorios son eficaces para tratar las enfermedades y afecciones inflamatorias, su uso a largo plazo produce a menudo efectos secundarios tales como un aumento del riesgo de infecciones causadas por deterioro de la migración y función de los leucocitos fagocíticos. Existe alguna preocupación de que la inhibición de la función de la cadena de la integrina \beta1 pueda estar asociada con el aumento de la susceptibilidad a las infecciones, como se ha demostrado por un anticuerpo monoclonal frente a \beta1 (también llamada CD18) en los conejos (Foster, C.A., J. Allergy Clin. Immunol., 1996, 98, 270-277). Se cree que la inhibición selectiva de la cadena \alpha4 puede ser un método más deseable. La inhibición de la cadena \alpha4 se cree que reduce igualmente los niveles del heterodímero VLA-4 así como el heterodímero \alpha4\beta7.
Las intervenciones terapéuticas potenciales que tienen como objetivo VLA-4 incluyen los anticuerpos monoclonales, y los antagonistas peptídicos. Leger, O.J.P., et al., (Human Antibodies 1997, 8, 3-16) describen un anticuerpo monoclonal frente a VLA-4 que está en ensayos clínicos de fase II para la esclerosis múltiple. Los antagonistas del péptido CS-1 han sido descritos por Jackson, D.Y., et al., (J. Med. Chem. 1997, 40, 3359-3369).
Hayashi et al., (Cell. Struct. Funct. 1991, 16, 241-249) han usado un vector que expresa un RNA complementario de la integrina \beta1 de pollo para reducir la expresión de la integrina \beta1, dando como resultado una alteración de la unión y de la forma de las células.
Los oligonucleótidos antisentido que tienen como objetivo diferentes integrinas han sido usados como instrumentos para analizar las interacciones funcionales de las integrinas en conjuntos complejos. Lallier and Bronner-Frase (Science, 1993, 259. 692-695) han usado oligonucleótidos-fosforotioatos que tienen como objetivo regiones conservadas y no conservadas de integrinas \beta1 de pollo, \alpha4 humana, \alpha1 de rata y \alpha5 humana, para determinar los efectos de estas integrinas sobre la unión celular. Estos mismos oligonucleótidos se inyectaron también en las rutas migratorias de la cresta neural craneal en embriones aviares, y se demostró que aquellos oligonucleótidos que inhibían la unión celular in vitro también causaban anormalidades de la cresta neuronal y/o del tubo neuronal in vivo (Kil et al., Devel. Biol. 1996, 179, 91-101).
La Solicitud de Patente EP 688 748 (Carolus et al.) describe análogos de oligonucleótidos derivatizados en 3', incluyendo una secuencia que tiene como objetivo la subunidad \beta1 de VLA-4.
Se cree que los oligonucleótidos antisentido representan un medio útil para modular la expresión de la integrina \alpha4 y para tratar enfermedades asociadas con su expresión.
Sumario de la invención
La presente invención se dirige a compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que tienen como objetivo un ácido nucleico que codifica la integrina \alpha4, y que modulan la expresión de la integrina \alpha4. Se proporcionan también composiciones farmacéuticas y otras composiciones que comprenden los compuestos antisentido de la invención. Se proporcionan además métodos para modular la expresión de la integrina \alpha4 en células o tejidos, que comprenden poner en contacto dichas células o tejidos con uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la invención. Se proporcionan además métodos para tratar a un animal, particularmente un ser humano, sospechoso de tener o estar predispuesto a tener una enfermedad o afección asociada con la expresión de la integrina \alpha4, administrando una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención emplea compuestos antisentido oligoméricos, particularmente oligonucleótidos, para uso en la modulación de la función de las moléculas de ácido nucleico que codifican la integrina \alpha4, modulando finalmente la cantidad de integrina \alpha4 producida. Se consigue esto proporcionando compuestos antisentido que se hibridan específicamente con uno o más ácidos nucleicos que codifican la integrina \alpha4. Como se usa aquí, los términos "ácido nucleico objetivo" y "ácido nucleico que codifica la integrina \alpha4" engloban el DNA que codifica la integrina \alpha4, el RNA (incluyendo pre-mRNA y mRNA) transcrito de dicho DNA, y también el cDNA derivado de dicho RNA. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico objetivo interfiere con la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico objetivo por los compuestos que se hibridan específicamente con él, se denomina en general "antisentido". Las funciones de DNA a ser interferidas incluyen la replicación y la transcripción. Las funciones de DNA a ser interferidas incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, la traslocación del RNA al sitio de traducción de la proteína, traducción de la proteína desde el RNA, corte y empalme del RNA para dar una o más especies mRNA, y actividad catalítica que puede estar comprometida o facilitada por el RNA. El efecto global de tal interferencia con la función del ácido nucleico objetivo es la modulación de la expresión de la integrina \alpha4. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa o bien un aumento (estimulación) o bien una reducción (inhibición) en la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión de un gen y el mRNA es un objetivo preferido.
Es preferible para los antisentido dirigirse a ácidos nucleicos específicos como objetivo. En el contexto de la invención, "dirigir hacia un objetivo" un compuesto antisentido, siendo el objetivo un particular ácido nucleico, es un procedimiento de múltiples etapas. El procedimiento comienza usualmente con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función debe ser modulada. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o mRNA transcrito del gen) cuya expresión está asociada con un particular trastorno o enfermedad, o una molécula de ácido nucleico procedente de un agente infeccioso. En la presente invención, el objetivo es una molécula de ácido nucleico que codifica la integrina \alpha4. El procedimiento de dirigir hacia el objetivo incluye también la determinación de un sitio o sitios dentro de este gen para que tenga lugar la interacción antisentido de tal modo que se produzca el efecto deseado, por ejemplo, la detección o modulación de la expresión de la proteína. Dentro del contexto de la presente invención, un sitio intragénico preferido es la región que engloba el codón de iniciación o terminación de la traducción del marco de lectura abierta (ORF) del gen. Puesto que, como es conocido en la técnica, el codón de iniciación de la traducción es típicamente 5'-AUG (en las moléculas de mRNA trascrito, 5'-ATG en la molécula correspondiente de DNA), el codón de iniciación de la traducción se denomina también el "codón AUG", el "codón de comienzo" o el "codón AUG de comienzo". Se ha demostrado que una minoría de genes que tienen un codón de iniciación de la traducción que tiene la secuencia de RNA 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG, funcionan in vivo. Así pues, los términos "codón de iniciación de la traducción" y "codón de comienzo" pueden englobar muchas secuencias de codones, aun cuando el aminoácido iniciador en cada caso es típicamente metionina (en las eucariotas) o formilmetionina (en las procariotas). Es también conocido en la técnica que los genes eucarióticos y procarióticos pueden tener dos o más codones de comienzo alternativos, y cualquiera de ellos se puede utilizar preferentemente para la iniciación de la traducción en un tipo particular de célula o tejido, o bajo un particular conjunto de condiciones. En el contexto de la invención, "codón de comienzo" y "codón de iniciación de la traducción" se refieren al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de una molécula de mRNA transcrita desde un gen que codifica la integrina \alpha4, prescindiendo de la secuencia o secuencias de dichos codones.
Es también conocido en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o "codón de parada") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA, (las correspondientes secuencias de DNA son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA respectivamente). Los términos "región del codón de comienzo" y "región del codón de iniciación de la traducción" se refieren a una porción de tal mRNA o gen que engloba desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de iniciación de la traducción. Similarmente, los términos "región del codón de parada" y "región del codón de terminación de la traducción" se refieren a una porción de tal mRNA o gen que engloba desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de terminación de la traducción.
El marco de lectura abierta (ORF) o "región codificadora" que es conocida en la técnica como referida a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, es también una región que puede ser marcada como objetivo de un modo efectivo. Otras regiones objetivos incluyen la región 5' no traducida (5'UTR) conocida en la técnica como referida a la porción de un mRNA en la dirección 5' desde el codón de iniciación de la traducción, y que incluye por tanto los nucleótidos entre el sitio caperuza 5' y el codón de iniciación de la traducción de un mRNA o de los correspondientes nucleótidos en el gen, y la región 3' no traducida (3'UTR) conocida en la técnica como referida a la porción de un mRNA en la dirección 3' desde el codón de terminación de la traducción, y que incluye por tanto los nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un mRNA o de los correspondientes nucleótidos en el gen. La caperuza 5' de un mRNA comprende un residuo de guanosina N7-metilada unido a la mayor parte del residuo 5' del mRNA a través de una unión 5'-5'-trifosfato. La región caperuza 5' de un mRNA se considera que incluye la propia estructura caperuza 5' así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la caperuza. La región caperuza 5' puede ser también una región objetivo preferida.
Aunque algunos transcritos de mRNA eucarióticos están directamente traducidos, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de un transcrito antes de que sea traducido. Las regiones restantes (y por tanto traducidas) son conocidas como "exones" y se cortan y empalman para formar una secuencia continua de mRNA. Los sitios de corte y empalme de mRNA, esto es las uniones intrón-exón, también pueden ser regiones objetivos preferidas, y son particularmente útiles en situaciones en que el corte y empalme aberrante está implicado en la enfermedad, o en que una sobreproducción de un particular producto de corte y empalme de mRNA está implicado en la enfermedad. Las uniones aberrantes por fusión debidas a reordenamientos o deleciones son también objetivos preferidos. Se ha encontrado a su vez que los intrones pueden ser también regiones objetivos eficaces y por tanto preferidas para los compuestos antisentido dirigidos, por ejemplo, hacia DNA o pre-mRNA.
Una vez que se han identificado uno o más sitios objetivo, se eligen oligonucleótidos que sean suficientemente complementarios con el objetivo, es decir que se hibriden suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.
En el contexto de esta invención, "hibridación" significa enlace de hidrógeno, que puede ser enlace de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se emparejan por medio de la formación de enlaces de hidrógeno. "Complementario" como se usa aquí, se refiere a la capacidad para un emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un oligonucleótido es capaz de formar un enlace de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de DNA o RNA, entonces el oligonucleótido y el DNA o RNA se consideran como complementarios uno a otro en esa posición. El oligonucleótido y el DNA o RNA son complementarios uno a otro cuando un suficiente número de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden unirse por hidrógeno uno con otro. Así pues, "específicamente hibridizable" y "complementario" son términos que se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento preciso de tal modo que se forma una unión estable y específica entre el oligonucleótido y el DNA o RNA objetivo. Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no necesita ser 100% complementaria con su ácido nucleico objetivo para ser específicamente hibridizable. Un compuesto antisentido es específicamente hibridizable cuando la unión del compuesto a la molécula de DNA o RNA objetivo interfiere con la función normal del DNA o RNA objetivo para causar una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido con las secuencias no objetivos en condiciones en las que se desea una unión específica, esto es, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, en las condiciones en que se realizan los ensayos.
Los compuestos antisentido se usan comúnmente como reactivos de investigación y diagnóstico. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con excelente especificidad, son usados a menudo por los expertos ordinarios para elucidar la función de genes particulares. Los compuestos antisentido se usan también, por ejemplo, para distinguir entre las funciones de diferentes miembros de una ruta biológica. La modulación antisentido ha sido aprovechada por tanto para uso en investigación.
La especificidad y sensibilidad del antisentido ha sido aprovechada también por los expertos en la técnica para usos terapéuticos. Los oligonucleótidos antisentido se han empleado como restos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades en animales y en el hombre. Los oligonucleótidos antisentido se han administrado de manera segura y efectiva a los seres humanos y actualmente hay numerosos ensayos clínicos en marcha. Se ha establecido de este modo que los oligonucleótidos pueden tener útiles modalidades terapéuticas que se pueden configurar para que sean útiles en regímenes de tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente los seres humanos.
En el contexto de esta invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (RNA) o ácido desoxirribonucleico (DNA) o sus compuestos miméticos. Este término incluye los oligonucleótidos compuestos de nucleobases presentes en la naturaleza, azúcares y enlaces internucleósidos (cadena principal) covalentes así como los oligonucleótidos que tienen porciones que no están presentes en la naturaleza que funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos son preferidos a menudo sobre las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mejor captación celular, mejor afinidad por el ácido nucleico objetivo y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Aunque los oligonucleótidos antisentido son una forma preferida de compuesto antisentido, la presente invención comprende otros compuestos antisentido oligoméricos, incluyendo pero sin limitarse a ellos, los oligonucleótidos miméticos tal como se describen más adelante. Los compuestos antisentido de acuerdo con esta invención comprenden preferiblemente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 nucleobases. Son particularmente preferidos los oligonucleótidos antisentido que comprenden desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 nucleobases (es decir, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 nucleósidos unidos). Como es conocido en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un pentofuranosil-azúcar, el grupo fosfato puede estar unido a cualquiera de los restos hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Para formar oligonucleótidos, los grupos fosfatos enlazan covalentemente los nucleósidos adyacentes uno con otro para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los respectivos extremos de esta estructura polimérica lineal se pueden unir adicionalmente para formar una estructura circular, pero generalmente se prefieren las estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura de los oligonucleótidos, los grupos fosfatos son comúnmente mencionados como formadores de la cadena principal internucleósidos del oligonucleótido. El enlace normal o cadena principal de RNA y DNA es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
Ejemplos específicos de los compuestos antisentido preferidos útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Como se define en esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la cadena principal y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. Para los fines de esta memoria descriptiva, y como a veces se referencia en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su cadena principal internucleósidos, se pueden considerar también como oligonucleótidos.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificadas preferidas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilfosfonato y otros alquilfosfonatos incluyendo 3'-alquilen-fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino-fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que tienen enlaces normales 3'-5', los análogos de estos con enlaces 2'-5', y los que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósido están unidos 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. Se incluyen también diferentes sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de los anteriores enlaces que contienen fósforo, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las Patentes de EE.UU. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496;
5.455.233; 5.966.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.591.308; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificadas preferidas que no incluyen un átomo de fósforo en ellas, incluyen cadenas principales que están formadas por enlaces internucleósidos de alquilo de cadena corta o de cicloalquilo, enlaces internucleósidos de heteroátomos mixtos y de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos de corta cadena o heterocíclicos. Estas incluyen las que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilen-formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida, cadenas principales de amida; y otras que tienen mezcla de partes componentes de N, O, S y CH_{2}.
Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de los anteriores oligonucleósidos, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las Patentes de EE.UU. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225;
5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360;
5.677.437; y 5.677.439.
En otros oligonucleótidos miméticos preferidos, tanto el enlace del azúcar como el enlace internucleósidos, es decir, la cadena principal, de las unidades nucleotídicas están reemplazados con nuevos grupos. Las unidades de las bases se mantienen para hibridación con un apropiado compuesto de ácido nucleico objetivo. Uno de tales compuestos oligoméricos, un oligonucleótido mimético del que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se menciona como un ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos PNA, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido está reemplazada con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se mantienen y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de los compuestos PNA, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las Patentes de EE.UU. 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Descripciones adicionales de los compuestos PNA se pueden encontrar en Nielsen et al., (Science, 1991, 254, 1497-1500).
Las realizaciones más preferidas de la invención son oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleótidos con cadenas principales de heteroátomos, y en particular -CH_{2}-NH-O-CH_{2}-, -CH_{2}-N(CH_{3})-O-CH_{2}- [conocidas como una cadena principal de metileno (metilimino) o MMI], -CH_{2}-O-N-(CH_{2})-CH_{2}-, -CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2}- y -O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}- [donde la cadena principal nativa de fosfodiéster se representa como -O-F-O-CH_{2}-] de la Patente de Estados Unidos mencionada antes 9.489.677, y las cadenas principales de amida de la Patente de Estados Unidos mencionada antes 5.602.240. También son preferidos los oligonucleótidos que tienen estructuras de cadena principal de morfolino de la Patente de Estados Unidos mencionada antes 5.034.506.
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Los oligonucleótidos modificados pueden contener también uno o más restos de azúcar sustituido. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S-, o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C_{1} a C_{10} o alquenilo y alquinilo C_{2} a C_{10}. Son particularmente preferidos O[(CH_{2})_{n}O]_{m}CH_{3}, O(CH_{2})_{n}OCH_{3}, O(CH_{2})_{n}NH_{2}, O(CH_{2})_{n}CH_{3}, O(CH_{2})_{n}ONH_{2}, y O(CH_{2})_{n}ON[(CH_{2})_{n}CH_{3})]_{2}, donde n y m son un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C_{1} a C_{10}, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH_{3}, OCN, Cl, Br, CN, CF_{3}, OCF_{3}, SOCH_{3}, SO_{2}CH_{3}, ONO_{2}, NO_{2}, N_{3}, NH_{2}, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo que escinde el DNA, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido,o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinémicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH_{2}-CH_{2}OCH_{3}, conocido también como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación preferida incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH_{2})_{2}ON(CH_{3})_{2}, conocido también como 2'-DMAOE, como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos número de serie 09/016.520, presentada el 30 de Enero de 1998, Patente de Estados Unidos expedida ahora 6.127.533, que es del mismo propietario que la presente solicitud.
Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH_{3}), 2'-aminopropoxi (2'-O-CH_{2}CH_{2}NH_{2}) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden hacer modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar sobre el nucleótido 3' terminal o en los oligonucleótidos enlazados 2'-5' y en la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos pueden tener también azúcares miméticos tales como restos de ciclobutilo en lugar de pentofuranosil-azúcar. Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las Patentes de EE.UU. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.446.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.0531; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos aceptada 08/468.037, presentada el 6 de Junio de 1995, Patente de Estados Unidos expedida ahora 5.859.221, que es del mismo propietario que la presente solicitud.
Los oligonucleótidos pueden incluir también modificaciones o sustituciones de las nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente "bases"). Como se usan aquí, las nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las bases purínicas adenina (A) y guanina (G, y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil- y otros alquil-derivados de adenina y guanina, 2-propil- y otros alquil-derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (seudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil-, 8-hidroxil- y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil- y otros uracilos y citosinas sustituidas en 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina, y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras nucleobases incluyen las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 3.687.808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley and Sons, 1990, 858-859, las descritas por Englisch et al., (Angewandte Chemie, IE, 1991, 30, 613) y las descritas por Sanghvi, Y.S. (Antisense Research and Applications, 15, 289-302), y Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed., (CRC Press, 1993). Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen las pirimidinas sustituidas en 5, las 6-azapirimidinas y las purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, incluyendo la 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de la 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2ºC (Sanghvi, Y.S. Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, 1993, 276-278) y son actualmente las sustituciones preferidas de bases, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de 2'-O-metoxietil-azúcar.
Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de algunas de las nucleobases modificadas comentadas antes así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero sin limitarse a ellas, la Patente de Estados Unidos indicada antes 3.687.808, así como las patentes de EE.UU. 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121;
5.596.091; 5.624.617; 5.681.941; y 5.750.692.
Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica unir químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Tales restos incluyen, pero sin limitarse a ellos, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo residuos de dodecanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 59, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetraedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o adamantano-ácido acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de dichos conjugados de oligonucleótidos, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las Patentes de EE.UU.: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045;
5.419.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 9.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737;
4.824.941; 9.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963;
5.214.136; 5.245.022; 5.259.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723;
5.416.203; 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371;
5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928; y 5.688.941.
No es necesario en un compuesto dado que todas las posiciones estén uniformemente modificadas, y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas antes se pueden incorporar en un único compuesto o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente invención incluye también compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, formada cada una de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en la que el oligonucleótido está modificado de forma que confiere al oligonucleótido un aumento de resistencia a la degradación por las nucleasas, un aumento de la captación celular, y/o un aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir los híbridos RNA:DNA o RNA:RNA. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de RNA de un dúplex RNA:DNA. La activación de la RNasa H por tanto, da como resultado la escisión del RNA objetivo, con lo que mejora notablemente la eficiencia de la inhibición de la expresión del gen por el oligonucleótido. Por consiguiente, se pueden obtener a menudo resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, comparados con los desoxioligonucleótidos-fosforotioatos que se hibridan a la misma región objetivo. La escisión del RNA objetivo se puede detectar rutinariamente por electroforesis en gel y si fuera necesario, por métodos asociados de hibridación del ácido nucleico, conocidos en la técnica.
Los compuestos antisentido quiméricos de la invención se pueden formar como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o oligonucleótidos miméticos como se ha descrito antes. Tales compuestos han sido denominados también en la técnica híbridos o gápmeros. Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de dichas estructuras híbridas, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las Patentes de EE.UU.: 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos aceptada número de serie 08/465.880, presentada el 6 de Junio de 1995, Patente de Estados Unidos expedida ahora 5.955.589, que es del mismo propietario que la presente solicitud.
Los compuestos antisentido usados de acuerdo con esta invención se pueden preparar conveniente y rutinariamente mediante una técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis es vendido por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Se puede emplear adicional o alternativamente para dicha síntesis cualquier otro medio conocido en la técnica. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y los derivados alquilados.
Los compuestos antisentido de la invención se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido de origen biológico, ni construcciones de vectores genéticos diseñadas para dirigir la síntesis in vivo de moléculas antisentido.
Los compuestos de la invención, también se pueden mezclar, encapsular, conjugar o asociar de otra manera con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas al receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras formulaciones, para ayudar a la captación, distribución y/o absorción. Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de dichas formulaciones que ayudan a la captación, distribución y/o absorción, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las Patentes de EE.UU.: 5.108.921; .359.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.597.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016;
5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.
Los compuestos antisentido de la invención engloban todas las sales, ésteres, o sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción se refiere también a los profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, a las sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes.
El término "profármaco" indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en forma activa (esto es, fármaco) dentro del cuerpo o en sus células por la acción de enzimas endógenos u otros compuestos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones de profármacos de los oligonucleótidos de la invención se preparan como derivados SATE [(S-acetil-2-tioetil)fosfato] según los métodos descritos en el documento WO 93/24510 para Gosselin et al., publicado el 9 de Diciembre de 1993 o en el documento WO 94/26764 para Imbach et al.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención; esto es, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y que no transmiten al mismo efectos toxicológicos indeseados.
Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalino-térreos o aminas orgánicas. Son ejemplos de metales usados como cationes, sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares. Son ejemplos de aminas adecuadas, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina, y procaína (véase, por ejemplo, Berge et al., J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19). Las sales de adición de bases de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma de ácido libre se puede regenerar poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando el ácido libre de la manera convencional. Las formas de ácido libre difieren algo de sus respectivas formas de sales en ciertas propiedades físicas tales como solubilidad en disolventes polares, pero aparte de eso las sales son equivalentes a sus respectivos ácidos libres para los fines de la presente invención. Como se usa aquí una "sal farmacéutica de adición" incluye una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los componentes de las composiciones de la invención. Estas incluyen las sales de ácido orgánico o inorgánico de las aminas. Las sales de ácido preferidas son los hidrocloruros, acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen sales básicas de una variedad de ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como, por ejemplo, con ácidos inorgánicos, tales como por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos orgánicos carboxílico, sulfónico, sulfo- o fosfo-ácidos o ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o isonicotínico; y con aminoácidos, tales como los 20 alfa-aminoácidos implicados en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 4-metilbencenosulfónico, ácido naftalen-2-sulfónico, ácido naftalen-1,5-disulfónico, 2- o 3-fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato. ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos), o con otros compuestos de ácidos orgánicos, tales como ácido ascórbico. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos se pueden preparar también con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen los cationes alcalinos, alcalino-térreos, amonio y amonio cuaternario. También son posibles los carbonatos e hidrogenocarbonatos.
Para los oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a ellas, (a) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas tales como espermina y espermidina, etc.; (b) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; y (d) sales formadas con aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo.
Los compuestos antisentido de la presente invención se pueden utilizar para diagnóstico, terapéutica, profilaxis y como reactivos y kits de investigación. Para terapéutica, un animal, preferiblemente un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno que se pueda tratar por modulación de la expresión de la integrina \alpha4, se trata por administración de los compuestos antisentido de acuerdo con esta invención. Los compuestos de la invención se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto antisentido a un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. El uso de los compuestos antisentido y de los métodos de la invención también puede ser útil profilácticamente, por ejemplo, para prevenir o retardar la infección, la inflamación o la formación de un tumor.
Los compuestos antisentido de la invención son útiles para investigación y diagnóstico, porque estos compuestos se hibridan con los ácidos nucleicos que codifican la integrina \alpha4, haciendo posible que sean construidos fácilmente ensayos en sandwich y otros ensayos para aprovecharse de este hecho. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido de la invención con un ácido nucleico que codifica la integrina \alpha4, se puede detectar por medios conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir la conjugación de una enzima con el oligonucleótido, el radiomarcado del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También se pueden preparar kits que utilizan tales medios de detección para detectar el nivel de integrina \alpha4 en una muestra.
La presente invención incluye también composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la invención. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser tópica (incluyendo la administración oftálmica y la administración a las membranas mucosales incluyendo la administración vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por medio de un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o perfusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o la administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Se cree que son particularmente útiles para la administración oral los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2'-O-metoxietilo.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles condones recubiertos, guantes y similares.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o en medio no acuoso, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser deseables agentes espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, ayudantes de la dispersión o aglutinantes.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que pueden contener también tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a ellos, mejoradores de la penetración, compuestos portadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos de la presente invención pueden incluir también mejoradores de la penetración con el fin de mejorar la administración alimentaria de los oligonucleótidos. Los mejoradores de la penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de las cinco categorías generales, esto es, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, tensioactivos y no tensioactivos (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Se pueden incluir uno o más mejoradores de la penetración de una o más de estas categorías generales. Los mejoradores de la penetración están descritos en la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente 08/886.829, presentada el 1 de Julio de 1997, Patente de Estados Unidos expedida ahora 6.747.014, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente 08/961.469, presentada el 31 de Octubre de 1997, Patente de Estados Unidos expedida ahora 6.083.923, ambas del mismo propietario que la presente solicitud.
Los diferentes ácidos grasos y sus derivados que actúan como mejoradores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido laúrico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, dicaprato, tricaprato, recinoleato, monooleína (por otro nombre 1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, gliceril-1-monocaprato, 1-dodecilaxacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, mono- y di-glicéridos y sus sales fisiológicamente aceptables (esto es, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol. 1992, 44, 651-654). Son ejemplos de algunos ácidos grasos preferidos actualmente, caprato de sodio y laurato de sodio, usados solos o en combinación a concentraciones de 0,5 a 5%.
Los mejoradores de la penetración preferidos están descritos en la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente 08/886.829, presentada el 1 de Julio de 1997, que es del mismo propietario que la presente solicitud.
Las funciones fisiológicas de la bilis incluyen la facilitación de la dispersión y absorción de los lípidos y vitaminas solubles en grasas (Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds. McGraw-Hill, New York, NY 1996, pages 934-935). Diferentes sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como mejoradores de la penetración. Por tanto, el término "sal biliar" incluye todos los componentes naturales de la bilis así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares preferidas están descritas en la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente 08/886.829, presentada el 1 de Julio de 1997, que es del mismo propietario que la presente solicitud y que se incorpora aquí como referencia. Una sal biliar actualmente preferida es el ácido quenodesoxicólico (CDCA) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), generalmente usado a concentraciones de 0,5 a 2%.
Se pueden usar formulaciones complejas que comprenden uno o más mejoradores de la penetración. Por ejemplo, se pueden usar sales biliares en combinación con ácidos grasos para preparar formulaciones complejas. Las combinaciones preferidas incluyen CDCA combinado con caprato de sodio o laurato de sodio (generalmente de 0,5 a 5%).
Los agentes quelantes incluyen, pero sin limitarse a ellos, etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato, 5-metoxisalicilato y homovanilato de sodio), derivados N-acilo de colágeno, laureth-9 y derivados N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51). Los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de servir también como inhibidores de la DNasa.
Los agentes tensioactivos incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril-éter y polioxietilen-20-cetil-éter (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-191); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol. 1988, 40, 252-257).
Los agentes no tensioactivos incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-192); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco de sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol. 1987, 39, 621-626).
Como se usa aquí, "compuesto portador" se refiere a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, que no tiene actividad biológica por sí mismo) pero es reconocido como un ácido nucleico mediante procedimientos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo degradando el ácido nucleico biológicamente activo o favoreciendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de la última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñones u otros reservorios extracirculatorios, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente esterificado con ácido tiofosfórico en el tejido hepático se reduce cuando se coadministra con ácido poli-inosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'-isotiocianoestilben-2,2'-disulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug. Dev., 1996, 6, 177-183).
Por contraste con un compuesto portador, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" (excipiente) es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser líquido o sólido y se selecciona teniendo en cuenta la forma prevista de administración de manera que proporcione el deseado volumen, consistencia, etc., cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); agentes de carga (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.). Los sistemas de administración oral de liberación sostenida y/o los recubrimientos entéricos para formas farmacéuticas administradas oralmente están descritos en las Patentes de EE.UU. 4.704.295; 4.556.552; 4.309.406; y 4.309.404.
Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos por la técnica. De este modo, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales farmacéuticamente activos compatibles, tales como, por ejemplo, agentes antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diferentes formas farmacéuticas de la composición de la presente invención, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, agentes para aumentar la opacidad, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, si se añaden, no deben interferir excesivamente en las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la invención.
Sin tener en cuenta el método por el cual los compuestos antisentido de la invención se introducen en un paciente, se pueden usar sistemas de dispersión coloidal como vehículos de administración para mejorar la estabilidad in vivo de los compuestos y/o para dirigir los compuestos hacia un órgano, tejido o tipo de célula particular. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen, pero sin limitarse a ellos, complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones aceite-en-agua, micelas, mezcla de micelas, liposomas y complejos de lípidos:oligonucleótidos de estructura no caracterizada. Un sistema de dispersión coloidal preferido es una pluralidad de liposomas. Los liposomas son esferas microscópicas que tienen un núcleo acuoso rodeado por una o más capas exteriores hechas de lípidos ordenados en una configuración bicapa (véase, en general, Chonn et al., Current OP. Biotech., 1995, 6, 698-708).
La preparación de liposomas está descrita en la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente 08/961.469, presentada el 31 de Octubre de 1997, Patente de Estados Unidos expedida ahora 6.083.923, que es del mismo propietario que la presente solicitud.
Ciertas realizaciones de la invención proporcionan liposomas y otras composiciones que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo no-antisentido. Ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitarse a ellos, fármacos anticáncer tales como daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostazas nitrogenadas, clorambucilo, melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FudR), metotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etopósido, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1987, Berkow et al., eds., Rahway, N.J. 1206-1228. Los fármacos antiinflamatorios que incluyen, pero sin limitarse a ellos, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y los fármacos antivirales, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, se pueden asociar también en composiciones de la invención. Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1987, Berkow et al., eds., Rahway, N.J. pages 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos no-antisentido están también dentro del alcance de la invención. Se pueden usar conjuntamente o secuencialmente dos o más compuestos asociados.
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En otra realización relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que tienen como objetivo un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido que tienen como objetivo un segundo ácido nucleico. Se pueden usar conjuntamente o secuencialmente dos o más compuestos asociados.
La formulación de composiciones terapéuticas y su subsiguiente administración se considera que está dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y respuesta de la enfermedad a ser tratada, durando el tratamiento desde varios días a varios meses, o hasta que se consigue la curación o una disminución de la enfermedad. Las pautas posológicas óptimas se pueden calcular a partir de las medidas de acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos pueden determinar fácilmente las dosis óptimas, la metodología de administración y el ritmo de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales, y se pueden estimar en general basándose en las EC_{50} encontradas como eficaces en los modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosis varía de 0,01 \mug a 100 g por kg de peso corporal, y se puede dar una o más veces diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar fácilmente los ritmos de repetición de la dosis basándose en las medidas de los tiempos de residencia y las concentraciones del fármaco en los fluidos o tejidos corporales. Después de un tratamiento satisfactorio, puede ser deseable mantener al paciente con terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia de la enfermedad, durante la cual se administra el oligonucleótido en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01 \mug a 100 g por kg de peso corporal, una o más veces al día, hasta una vez cada 20 años.
Aunque la presente invención ha sido descrita específicamente según algunas de sus realizaciones preferidas, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar la invención y no pretenden limitar a la misma.
Ejemplos Ejemplo 1 Nucleósido-fosforamiditas para desoxi- y 2'-alcoxi-amiditas para síntesis de oligonucleótidos
Las 2-desoxi- y 2'-metoxi-beta-cianoetildiisopropil-fosforamiditas se compran de fuentes comerciales (por ejemplo, Chemgenes, Needham MA o Glen Research, Inc., Sterling VA). Otras nucleósido-amiditas sustituidas con 2'-O-alcoxi se preparan como se describe en la Patente de EE.UU. 5.506.351, incorporada aquí como referencia. Para los oligonucleótidos sintetizados usando 2'-alcoxi-amiditas, se utiliza el ciclo estándar para oligonucleótidos no modificados, excepto que la etapa de espera después de la administración en pulsos de tetrazol y la base se aumenta a 360 segundos. Los oligonucleótidos que contienen 5-metil-2'-desoxicitidina(5-Me-C)-nucleótidos se sintetizan según métodos publicados (Sanghvi et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203) usando fosforamiditas disponibles comercialmente (Glen Research, Sterling, VA o ChemGenes, Needham, MA).
2'-Fluoro-amiditas 2'-Fluorodesoxiadenosina-amiditas
Los 2'-fluoro-oligonucleótidos se sintetizan como se ha descrito previamente (Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841) y en la Patente de EE.UU. 5.670.633, incorporada aquí como referencia. En resumen, el nucleósido protegido N6-benzoil-2'-desoxi-2'-fluoroadenosina se sintetiza utilizando como material de partida 9-beta-D-arabinofuranosiladenina disponible comercialmente y modificando los procedimientos publicados por lo que se introduce el átomo 2'-alfa-fluoro mediante un desplazamiento S_{N}2 de un grupo 2'-beta-tritilo. De este modo, la N6-benzoil-9-beta-D-arabinofuranosiladenina se protege selectivamente con rendimiento moderado como el intermedio 3',5'-ditetrahidropiranilo (THP). La desprotección de THP y los grupos N6-benzoilo se consigue utilizando metodologías estándar, y se usan métodos estándar para obtener los intermedios 5'-dimetoxitril- (DMT) y 5'-DMT-3'-fosforamidita.
2'-Fluorodesoxiguanosina
La síntesis de 2'-desoxi-2'-fluoroguanosina se lleva a cabo utilizando como material de partida 9-beta-D-arabinofuranosiladenina protegida con tetraisopropildisiloxanilo (TPDS), y por conversión al intermedio diisobutiril-arabinofuranosiladenina. La desprotección del grupo TPDS va seguida de la protección del grupo hidroxilo con THP para dar arabinofuranosiladenina protegida con diisobutiril-di-THP. La O-desacilación selectiva y triflación va seguida por el tratamiento del producto crudo con fluoruro y después desprotección de los grupos THP. Se usan metodologías estándar para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.
2'-Fluorouridina
La síntesis de 2'-desoxi-2'-fluorouridina se lleva a cabo por la modificación de un procedimiento de las publicaciones científicas en el cual 2,2'-anhidro-1-beta-D-arabinofuranosiluracilo se trata con fluoruro de hidrógeno al 70% en piridina. Se usan procedimientos estándar para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.
2'-Fluorodesoxicitidina
La 2'-desoxi-2'-fluorocitidina se sintetiza por aminación de la 2'-desoxi-2'-fluorouridina, seguida por protección selectiva para dar N4-benzoil-2'-desoxi-2'-fluorocitidina. Se usan procedimientos estándar para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.
Amiditas modificadas con 2'-O-(2-metoxietilo)
Se prepararon nucleósido-amiditas sustituidas con 2'-O-2-metoxietilo como sigue, o alternativamente, por los métodos de Martin, P., (Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504).
2,2'-Anhidro[1-(beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina]
Se añadieron a DMF (300 ml), 5-metiluridina (ribosiltimina, disponible comercialmente de Yamasa, Choshi, Japan) (72,0 g, 0,279 M), carbonato de difenilo (90,0 g, 0,420 M) y bicarbonato de sodio (2,0 g, 0,024 M). Se calentó la mezcla a reflujo, con agitación, dejando que el dióxido de carbono gas que se desprende fuera liberado de manera controlada. Después de 1 hora, se concentró bajo presión reducida la solución ligeramente oscurecida. El jarabe resultante se vertió sobre éter dietílico (2,5 litros) con agitación. El producto formó una goma. Se decantó el éter y se disolvió el residuo en una cantidad mínima de metanol (alrededor de 400 ml). Se vertió la solución sobre éter fresco (2,5 litros) para dar una goma pegajosa. Se decantó el éter y se secó la goma en una estufa de vacío (60ºC a 1 mm de Hg durante 24 h) para dar un sólido que se trituró hasta un polvo ocre claro (57 g, 85% de rendimiento crudo). El espectro NMR fue consistente con la estructura, contaminada con fenol, como su sal de sodio (aproximadamente 5%). El material se usó tal cual para reacciones posteriores (o se puede purificar después por cromatografía en columna usando un gradiente de metanol en acetato de etilo (10-25%) para dar un sólido blanco, punto de fusión 222-4ºC).
2'-O-Metoxietil-5-metiluridina
Se añadieron 2,2'-anhidro-5-metiluridina (195 g, 0,81 M), tris(2-metoxietil)-borato (231 g, 0,98 M) y 2-metoxietanol (1,2 litros) a un recipiente a presión de 2 litros de acero inoxidable y se puso en un baño de aceite precalentado a 160ºC. Después de calentamiento durante 48 horas a 155-160ºC, se abrió el recipiente y se evaporó la solución a sequedad y se trituró con MeOH (200 ml). Se suspendió el residuo en acetona caliente (1 litro). Se filtraron las sales insolubles, se lavaron con acetona (150 ml) y se evaporó el filtrado. Se disolvió el residuo (280 g) en CH_{3}CN (600 ml) y se evaporó. Una columna de gel de sílice se empaquetó en CH_{2}Cl_{2}/acetona/MeOH (20:5:3) conteniendo 0,5% de Et_{3}NH. Se disolvió el residuo en CH_{2}Cl_{2} (250 ml) y se adsorbió sobre sílice (150 g) antes de cargarlo en la columna. Se eluyó el producto con el disolvente del empaquetado de la columna para dar 160 g (63%) de producto. Se obtuvo material adicional recuperando las fracciones impuras.
2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
Se co-evaporó con piridina (250 ml) 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (160 g, 0,506 M), y el residuo seco se disolvió en piridina (1,3 l). Se añadió una primera alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante una hora. Se añadió una segunda alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M), y se agitó la reacción durante una hora adicional. Se añadió entonces metanol (170 ml) para parar la reacción. La HPLC indicó la presencia de aproximadamente 70% de producto. Se evaporó el disolvente y se trituró con CH_{3}CN (200 ml). Se disolvió el residuo en CHCl_{3} (1,5 l) y se extrajo con 2 x 500 ml de NaHCO_{3} saturado y 2 x 500 ml de NaCl saturado. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. Se obtuvieron 275 g de residuo. Se purificó el residuo sobre una columna de gel de sílice de 3,5 kg, empaquetada y eluida con EtOAc/hexano/acetona (5:5:1) conteniendo 0,5% de Et_{3}NH. Se evaporaron las fracciones puras para dar 183 g de producto. Se obtuvieron aproximadamente 20 g adicionales a partir de las fracciones impuras para dar un rendimiento total de 183 g (57%).
3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
Se reunieron 2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (106 g, 0,167 M), DMF/piridina (750 ml de una mezcla 3:1 preparada a partir de 562 ml de DMF y 188 ml de piridina) y anhidrido acético (24,38 ml, 0,258 M) y se agitaron a temperatura ambiente durante 24 horas. Se hizo seguimiento de la reacción por TLC sofocando primero la muestra de TLC con la adición de MeOH. Una vez que la reacción fue completa, comprobado por la TLC, se añadió MeOH (50 ml) y se evaporó la mezcla a 35ºC. Se disolvió el residuo en CHCl_{3} (800 ml) y se extrajo con 2 x 200 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio y 2 x 200 ml de NaCl saturado. Las capas acuosas se volvieron a extraer con 200 ml de CHCl_{3}. Los extractos orgánicos reunidos se secaron con sulfato de sodio y se evaporaron para dar 122 g de residuo (aproximadamente 90% de producto). Se purificó el residuo sobre una columna de gel de sílice de 3,5 kg, empaquetada y eluida con EtOAc/hexano (9:1). Las fracciones de producto puro se evaporaron para dar 96 g (84%). Se recuperaron 1,5 g adicionales de las últimas fracciones.
3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina
Se preparó una primera solución disolviendo 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (96 g, 0,144 M) en CH_{3}CN (700 ml) y se dejó a un lado. Se añadió trietilamina (189 ml, 1,44 M) a una solución de triazol (90 g, 1,3 M) en CH_{3}CN (1 l), se enfrió a -5ºC y se agitó durante 0,5 h usando un agitador suspendido. Se añadió POCl_{3}, gota a gota a lo largo de un periodo de 30 minutos, a la solución en agitación mantenida a 0-10ºC, y se agitó la mezcla resultante durante 2 horas adicionales. Se añadió gota a gota la primera solución a lo largo de un periodo de 45 minutos, a la última solución. La mezcla de reacción resultante se mantuvo durante la noche en una sala fría. Se filtraron las sales de la mezcla de reacción y se evaporó la solución. Se disolvió el residuo en EtOAc (1 litro) y los sólidos insolubles se separaron por filtración. Se lavó el filtrado con 1 x 300 ml de NaHCO_{3} y 2 x 300 ml de NaCl saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó. El residuo se trituró con EtOAc para dar el compuesto del epígrafe.
2'-O-2-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina
Se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas una solución de 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina (103 g, 0,141 M) en dioxano (500 ml) y NH_{4}OH (30 ml). Se evaporó la solución en dioxano y se sometió el residuo a azeotropía con MeOH (2 x 200 ml). Se disolvió el residuo en MeOH (300 ml) y se transfirió a un recipiente a presión de 2 litros de acero inoxidable. Se añadió MeOH (400 ml) saturado con NH_{3} gas y se calentó el recipiente a 100ºC durante 2 horas (la TLC demostró una conversión completa). Se evaporaron los contenidos del recipiente a sequedad y se disolvió el residuo en EtOAc (500 ml) y se lavó una vez con NaCl saturado (200 ml). Los extractos orgánicos reunidos se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporó el disolvente para dar 85 g (95%) del compuesto del epígrafe.
N4-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina
Se disolvió en DMF (800 ml) 2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (85 g, 0,134 M) y se añadió con agitación anhídrido benzoico (37,2 g, 0,165 M). Después de agitar durante 3 horas, la TLC demostró que la reacción era completa en aproximadamente un 95%. Se evaporó el disolvente y el residuo se sometió a azeotropía con MeOH (200 ml). Se disolvió el residuo en CHCl_{3} (700 ml) y se extrajo con NaHCO_{3} saturado (2 x 300 ml) y NaCl saturado (2 x 300 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó para dar un residuo (96 g). Se cromatografió el residuo sobre una columna de gel de sílice de 1,5 kg, usando como disolvente de elución EtOAc/hexano (1:1) que contiene 0,5% de Et_{3}NH. Las fracciones puras se evaporaron para dar 90 g (90%) del compuesto del epígrafe.
N4-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina-3'-amidita
Se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (1 litro) N4-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0,10 M). Se añadieron con agitación bajo atmósfera de nitrógeno, tetrazoldiisopropilamina (7,1 g) y 2-cianoetoxitetra(isopropil)fosfito (40,5 ml, 0,123 M). Se agitó la mezcla resultante durante 20 horas a temperatura ambiente (la TLC demostró que la reacción era completa en un 95%). Se extrajo la mezcla de reacción con NaHCO_{3} saturado (1 x 300 ml) y NaCl saturado (3 x 300 ml). Los lavados acuosos se volvieron a extraer con CH_{2}Cl_{2} (300 ml) y los extractos se reunieron, se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron. El residuo obtenido se cromatografió sobre una columna de sílice de 1,5 kg, usando EtOAc/hexano (3:1) como el disolvente de elución. Las fracciones puras se reunieron para dar 90,6 g (87%) del compuesto del epígrafe.
2'-(Aminooxietil)-nucleósido-amiditas y 2'-(dimetilaminooxietil)-nucleósido-amiditas
Las aminooxietil- y las dimetilaminooxietil-amiditas se preparan por los métodos de las solicitudes de Patentes de Estados Unidos número de serie 60/037.143, presentada el 14 de Febrero de 1998, y número de serie 09/016.520, presentada el 30 de Enero de 1998, Patente de Estados Unidos expedida ahora 6.127.533, cada una de las cuales es del mismo propietario que la presente solicitud.
Ejemplo 2 Síntesis de oligonucleótidos
Se sintetizaron oligonucleótidos con enlaces fosfodiéster (P=O) sustituidos y sin sustituir en un sintetizador automático de DNA (Applied Biosystems model 3808) utilizando la química estándar de las fosforamiditas con oxidación por yodo.
Los fosforotioatos (P=S) se sintetizaron como los oligonucleótidos-fosfodiéster excepto que la botella estándar de oxidación fue reemplazada por una solución 0,2 M de 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona en acetonitrilo para la etapa de formación del grupo tio de los enlaces fosfito. La etapa de espera para la formación del grupo tio se aumentó a 68 segundos y fue seguida por la etapa de recubrimiento (caperuza) del extremo. Después de separación de la columna CPG y desbloqueo con hidróxido de amonio concentrado a 55ºC (18 h), se purificaron los oligonucleótidos precipitando dos veces con 2-5 volúmenes de etanol en una solución 0,5 M de NaCl.
Los oligonucleótidos-fosfinatos se preparan como se describe en la Patente de EE.UU. 5.508.270, incorporada aquí como referencia.
Los oligonucleótidos-alquil-fosfonatos se preparan como se describe en la Patente de EE.UU. 4.469.863.
\newpage
Los oligonucleótidos-3'-desoxi-3'-metilen-fosfonatos se preparan como se describe en Pas patentes de EE.UU. 5.610.289 o 5.625.050.
Los oligonucleótidos-fosforamidita se preparan como se describe en la Patente de EE.UU. 5.256.775 o en la Patente de EE.UU. 5.366.878.
Los oligonucleótidos-alquilfosforotioatos se preparan como se describe en las Solicitudes PCT publicadas PCT/
US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Los oligonucleótidos-3'-desoxi-3'-amino-fosforamidatos se preparan como se describe en la Patente de EE.UU. 5.476.925.
Los oligonucleótidos-fosfotriéster se preparan como se describe en la Patente de EE.UU. 5.023.243.
Los oligonucleótidos-boranofosfatos se preparan como se describe en las Patente de EE.UU. 5.130.302 y 5.177.198.
Ejemplo 3 Síntesis de oligonucleósidos
Los oligonucleósidos ligados a metilenmetilimino, identificados también como oligonucleósidos ligados a MMI, los oligonucleósidos ligados a metilendimetilhidrazo, identificados también como oligonucleósidos ligados a MDH, y los oligonucleósidos ligados a metilencarbonilamino, identificados también como oligonucleósidos ligados a amida-3, y los oligonucleósidos ligados a metilenaminocarbonilo, identificados también como oligonucleósidos ligados a amida-4, así como los compuestos de cadena principal mixta que tienen, por ejemplo, enlaces alternativos MMI y P=O o P=S, se preparan como se describe en las Patentes de EE.UU. 5.378.825; 5.386.023; 5.489.677; 5.602.240 y 5.610.289.
Los oligonucleósidos ligados a formacetal y tioformacetal se preparan como se describe en las Patentes de EE.UU. 5.264.562 y 5.264.564.
Los oligonucleósidos ligados a óxido de etileno se preparan como se describe en la Patente de EE.UU. 5.223.618.
Ejemplo 4 Síntesis de PNA
Los ácidos nucleicos peptídicos (los PNA) se preparan de acuerdo con cualquiera de los diferentes procedimientos descritos en Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23. También se pueden preparar de acuerdo con las Patentes de EE.UU. 5.539.082; 5.700.922. y 5.719.262.
Ejemplo 5 Síntesis de oligonucleótidos quiméricos
Los oligonucleótidos, oligonucleósidos o mezcla de oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos de la invención pueden ser de varios tipos diferentes. Estos incluyen un primer tipo en el que el segmento "de separación" ("gap") de los nucleósidos ligados, está posicionado entre los segmentos "de los lados" "wing" 5' y 3' de los nucleósidos ligados y un segundo tipo de "extremo abierto" en el que el segmento "gap" está localizado o bien en el terminal 3' o bien en el terminal 5' del compuesto oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo son conocidos también en la técnica como "gápmeros" u oligonucleótidos con separación. Los oligonucleótidos del segundo tipo son conocidos también en la técnica como "hemímeros" o "wíngmeros".
[2'-O-Me]-[2'-desoxi]-[2'-O-Me]-oligonucleótidos-fosforotioatos quiméricos
Los oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos de oligonucleótido-2'-O-alquilfosforotioato y oligonucleótido-2'-desoxifosforotioato se sintetizan usando un sintetizador de DNA automático de Applied Biosystems Modelo 380B, como antes. Los oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automático y 2'-desoxi-5'-dimetoxitritil-3'-O-fosforamidita para la porción DNA y 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita para los lados (wings) 5' y 3'. El ciclo de síntesis estándar se modifica aumentando la etapa de espera después de la adición de tetrazol y base a 600 s repetido cuatro veces para el RNA y dos veces para el 2'-O-metilo. El oligonucleótido totalmente protegido se separa del soporte y el grupo fosfato es desprotegido en amoniaco/etanol 3:1 a temperatura ambiente durante la noche y después se liofiliza hasta sequedad. Se realiza entonces un tratamiento en amoniaco metanólico durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger todas las bases y la muestra se liofiliza de nuevo hasta sequedad. Se resuspende el sedimento en TBAF 1 M en THF durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger las posiciones 2'. Se sofoca entonces la reacción con TEAA 1 M y se reduce entonces la muestra a 1/2 de su volumen en rotovac antes de ser desalada en una columna de exclusión molecular G25. El oligo recuperado se analiza entonces espectrofotométricamente en cuanto a rendimiento y en cuanto a pureza por electroforesis capilar y por espectrometría de masas.
[2'-O-(2-Metoxietil)]-[2'-desoxi]-[2'-O-(metoxietil)]-oligonucleótidos-fosforotioatos quiméricos
Los [2'-O-(2-metoxietil)]-[2'-desoxi]-[2'-O-(metoxietil)]-oligonucleótidos-fosforotioatos quiméricos se prepararon por el mismo procedimiento anterior seguido para los 2'-O-metil-oligonucleótidos quiméricos, reemplazando las 2'-O-metil-amiditas por las 2'-O-(metoxietil)amiditas.
[2'-O-(2-Metoxietil)fosfodiéster]-[2'-desoxi-fosforotioato]-[2'-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]-oligonucleótidos quiméricos
Los [2'-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]-[2'-desoxi-fosforotioato]-[2'-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]-oligonucleótidos quiméricos se preparan por el mismo procedimiento anterior seguido para los 2'-O-metil-oligonucleótidos quiméricos, reemplazando las 2'-O-metil-amiditas por las 2'-O-(metoxietil)-amiditas, oxidación con yodo para generar los enlaces fosfodiéster internucleótidos dentro de las porciones wing de las estructuras quiméricas y sulfurización utilizando 1,1 dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) para generar los enlaces de fosforotioato internucleótidos para el centro gap.
Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos o mezcla de oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos se sintetizan según la Patente de EE.UU. 5.623.065, que se incorpora aquí como referencia.
Ejemplo 6 Aislamiento de oligonucleótidos
Después de separación de la columna de vidrio de poro controlado (Applied Biosystems) y desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC durante 18 horas, los oligonucleótidos u oligonucleósidos se purifican por precipitación dos veces en NaCl 0,5 M con 2,5 volúmenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida en geles desnaturalizantes y se determinó que era un material con al menos un 85% de la longitud total. Las cantidades relativas de los enlaces de fosforotioato y fosfodiéster obtenidas en la síntesis fueron chequeadas periódicamente por espectroscopía de ^{31}P-resonancia magnética nuclear, y para algunos estudios se purificaron los oligonucleótidos por HPLC, como se describe por Chiang et al., (J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171). Los resultados obtenidos con el material purificado por HPLC son similares a los obtenidos con material no purificado por HPLC.
Ejemplo 7 Análisis de la inhibición de la expresión de la integrina \alpha4 por los oligonucleótidos
La modulación antisentido de la expresión de la integrina \alpha4 se puede ensayar en una variedad de modos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los niveles de mRNA de la integrina \alpha4 se pueden cuantificar, por ejemplo, por análisis de transferencia Northern, reacción competitiva en cadena de la polimerasa (PCR), o PCR en tiempo real (RT-PCR). Actualmente se prefiere la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de RNA se puede llevar a cabo sobre el RNA celular total o poli(A)+ mRNA. Los métodos de aislamiento del RNA están descritos, por ejemplo, en Ausubel F.M., et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1993, 1, 4.1.1-4.2.9 y 4.5.1-4.5.3). El análisis de transferencia Northern es rutinario en la técnica, y está descrito, por ejemplo, en Ausubel F.M., et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1996, 1, 4.2.1-4.2.9). La (PCR) cuantitativa en tiempo real se puede realizar convenientemente usando el sistema de detección de secuencias comercialmente disponible ABI PRISM™ 7700, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. y se usa siguiendo las instrucciones del fabricante. Otros métodos de PCR son también conocidos en la técnica.
Los niveles de la proteína integrina \alpha4 se pueden cuantificar en una variedad de modos bien conocidos en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ELISA, o selección de células activadas por fluorescencia (FACS). Se pueden identificar anticuerpos dirigidos a la integrina \alpha4 y obtener los mismos de una variedad de fuentes, tales como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI) o se pueden preparar por los métodos convencionales de generación de anticuerpos. Los métodos para la preparación de antisueros policlonales están descritos, por ejemplo, en Ausubel F.M., et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1997, 2, 11.12.1-11.12.9). La preparación de anticuerpos monoclonales está descrita, por ejemplo, en Ausubel F.M., et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1997, 2, 11.4.1-11.11.5).
Los métodos de inmunoprecipitación son convencionales en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Ausubel F.M., et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1998, 2, 10.16.1-10.16.11). El análisis por transferencia Western (immunotransferencia) es convencional en la técnica y se puede encontrar, por ejemplo, en Ausubel F.M., et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1997, 2, 10.8.1-10.8.21). Los ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) son convencionales en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Ausubel F.M., et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1991, 2, 11.2.1-11.2.22).
Ejemplo 8 Inhibición antisentido de la expresión de la integrina \alpha4 humana
Según la presente invención, se diseñaron una serie de oligonucleótidos para dirigirse a diferentes regiones del RNA de la integrina \alpha4 humana como objetivos, usando secuencias publicadas (GenBank, número de acceso L12002, incorporadas aquí como SEQ ID NO: 1). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 1. Los sitios objetivos se indican por los números de nucleótido, como se dan en la referencia de la fuente de la secuencia (GenBank, número de acceso L12002), a los que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos de la Tabla 1 tienen una longitud de 18 nucleótidos, con una cadena principal de fosforotioato y un gap centrado de desoxinucleótido de 10 bases flanqueado por wings de 2'-metoxietoxi (2'MOE). Se distribuyeron células del melanoma humano A375 (American Type Culture Collection, Manassas, Va.) en placas, a 2000 células/cm^{2} dos días antes del tratamiento con oligonucleótido. Se trataron las células con oligonucleótidos a una dosis de oligonucleótido 200 nM y 6 \mug/ml de LIPOFECTIN durante cuatro horas. Se incubaron las células durante la noche y se recogieron con EDTA 2 mM en PBS. Se lavaron las células en seroalbúmina bovina al 2%, azida de sodio al 0,2% en D-PBS a 4ºC. Se centrifugaron las células a 200 x g, y se decantó el sobrenadante. Se determinaron los niveles de proteínas por citometría de flujo según métodos publicados (Condon and Bennett, J. Biol. Chem. 1996, 271, 30398-30403). Se añadió el anticuerpo específico conjugado CD49d-FITC (Immunotech, Westbrook, ME, clon HP2/1) a 2 \mul/pocillo de ensayo, y se añadió la IgG control (IgGI-FITC de ratón, PharMingen, San Diego, CA) a una concentración de \mug/ml. Se incubaron los anticuerpos con las células durante 30 minutos a 4ºC en la oscuridad, con una agitación suave. Se lavaron de nuevo las células como anteriormente y después se resuspendieron en 0,3 ml de tampón FacsFlow con 0,5% de formaldehído. Se analizaron las células en un Becton Dickinson FACScan. Los resultados se expresan como porcentaje de la expresión control basándose en la intensidad media de la fluorescencia.
Como se muestra en la Tabla 1, los oligonucleótidos 24453, 24473, 24475, 24477 y 24451 produjeron al menos aproximadamente 50% de inhibición de la expresión de la proteína integrina \alpha4 y se sometieron a estudio posterior.
Ejemplo 9 Curvas dosis-respuesta para el efecto de los oligonucleótidos antisentido sobre la expresión de la proteína integrina \alpha4
Se trataron células A375 con ISIS 24473, 24475, 24477 y 24451 a concentraciones 50, 100, 200 y 400 nM durante 4 horas. Se recogieron las células con tripsina a las 48 y 72 horas después del tratamiento con el oligonucleótido y se tiñeron con 2 \mug/ml de CD49d-FITC como en el ejemplo anterior. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1 
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Todos los oligonucleótidos tienen cadenas principales de fosforotioato (P = S o PS) y "wings" de 2'-metoxietoxi (2'MOE) que flanquean a un gap de 2'-desoxi. Los nucleótidos 2'MOE se muestran en negrita. Todas las citosinas son 5-metil-citosinas (5meC). Sitio objetivo se refiere a los números de nucleótido sobre el objetivo (GenBank, número de acceso L12002; SEQ ID NO: 1).
TABLA 2
3
Ejemplo 10 Curvas dosis-respuesta del efecto de los oligonucleótidos antisentido sobre la expresión de la proteína integrina \alpha4
Se ensayaron series adicionales de oligonucleótidos en cuanto a los efectos sobre la expresión de la proteína integrina \alpha4 y se compararon con los compuestos activos procedentes de cribados anteriores. Estos oligonucleótidos están dirigidos hacia una secuencia promotora de la integrina \alpha4 (Rosen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 4094-4098; GenBank, número de acceso M62841, proporcionada aquí como SEQ ID NO: 41). Estos oligonucleótidos se muestran en la Tabla 3 y sus efectos sobre la expresión de la proteína integrina \alpha4 se muestran en la Tabla 4. Cuando las cadenas principales son mixtas, los enlaces se muestran como "s" para el fosforotioato (P=S o PS) y "o" para el fosfodiéster (P=O o PO). Cuando la región objetivo se indica como ``M62841'', los oligonucleótidos están dirigidos hacia la región promotora cuya secuencia está descrita en GenBank, número de acceso M62841. Los restantes oligonucleótidos están dirigidos hacia la secuencia descrita en GenBank, número de acceso L12002 y sus sitios objetivos sobre la secuencia L12002 están indicados
Se incluye para comparación una secuencia de ratón (SEQ ID NO: 47). Ésta tiene como objetivo la misma región mRNA que la secuencia humana 27104 (región que codifica justo hacia abajo del codón AUG) y contiene 3 desapareamientos con el mRNA objetivo humano.
TABLA 3
4
TABLA 4
6
7
En este ensayo, los oligonucleótidos 24475, 27104 y 27108 demostraron una inhibición del 40% o mayor y son los preferidos. La secuencia de oligonucleótido (SEQ ID NO: 47) que tiene como objetivo la integrina \alpha4 de ratón, que tiene sólo tres desapareamientos con el gen objetivo humano, también mostró una inhibición >40% a la dosis más alta.
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Ejemplo 11 Cribado de oligonucleótidos adicionales para la inhibición de los niveles de la proteína integrina \alpha4
Se sintetizaron nuevos oligonucleótidos 26640, 26641, 26642 y 26644 y se compararon con los oligonucleótidos previamente ensayados. Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 5 y su efecto sobre los niveles de la proteína integrina \alpha4 se muestra en la Tabla 6. Los sitios objetivos indican los números de nucleótidos en la secuencia objetivo (GenBank, número de acceso L12002) con los que se hibridan los oligonucleótidos.
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TABLA 5
8
TABLA 6
10
En este ensayo, los oligonucleótidos 27104, 24451, 26640, 24453, 26642, 24477 y 26644 demostraron un inhibición del 40% o mayor y son los preferidos. La secuencia de oligonucleótido (SEQ ID NO: 47) que tiene como objetivo la integrina \alpha4 de ratón, que tiene sólo tres desapareamientos con el gen objetivo humano, también mostró una inhibición >40% a la dosis más alta.
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Ejemplo 12 Inhibición antisentido de la expresión de mRNA de la integrina \alpha4 murina en células P388D (IL-1) de ratón
Puesto que muchas afecciones que se cree que podrían ser mejorables por los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la integrina \alpha4 no son fáciles de estudiar en los seres humanos, se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigirse a la integrina \alpha4 murina usando la secuencia publicada de De Miersman et al., DNA Cell Biol., 1994, 13:743-754; GenBank, número de acceso L20788, proporcionada aquí como SEQ ID NO: 48). Estos oligonucleótidos se muestran en la Tabla 7. Las bases nucleotídicas mostradas en negrita son 2'-metoxietoxi (2'MOE); las posiciones restantes son 2' desoxi. El sitio objetivo se refiere a la posición del primer nucleótido sobre el objetivo (GenBank, número de acceso L20788) a la que se une el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos se cribaron inicialmente en células de macrófago murino P388D (IL-1) (American Type Culture Collection, Manassas VA) durante 4 horas a una concentración de oligonucleótido 100 nM en 3 \mug/ml de lipofectin. Se recogieron las células y se purificó el RNA por lisis celular usando solución Catrimox-14 (Iowa Biotechnology Corp, Oakdale, IA. Dahle, C. E. and Macfarlane, D. E., BioTechniques 1993, 15, 1-4. El RNA se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1%/formaldehído al 1,1% con 18 \mug de RNA cargados en cada pista. La sonda de integrina \alpha4 era un fragmento (posiciones 3681-4706) de integrina \alpha4 de 1025 bases marcado por la PCR, preparado por RT-PCR según el método de Bednarczuk et al. (Biotechniques 1991, 10, 478). Los resultados del cribado se muestran en la Tabla 8.
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TABLA 7
12
TABLA 8
13
Como se muestra en la Tabla 8, ISIS 15607, que tiene como objetivo 5'UTR, e ISIS 15608 y 15609, que tienen ambos como objetivo el codón de iniciación de la traducción, fueron los más activos en este ensayo. Las curvas dosis-respuesta para ISIS 15607, 15608 y 15609 se muestran en la Tabla 9. Los resultados son los promedios de muestras duplicadas.
TABLA 9
14 
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Ejemplo 13 Inhibición antisentido de la expresión de la proteína integrina \alpha4 murina
Las células de macrófago murino IC-21 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) se usaron para estudios adicionales. Se diseñaron oligonucleótidos adicionales para dirigirse a la integrina \alpha4 murina como objetivo. Éstos se muestran en la Tabla 10; todos los 2' MOE-nucleótidos se muestran en negrita y las posiciones restantes son 2' desoxi. Todas las 2'-MOE-citosinas de estos compuestos son 5' metilcitosinas. Las células IC-21 se sembraron a 5 x10^{4} células/pocillo en placas de 24 pocillos dos días antes del ensayo. Se trataron las células con 3 \mug/ml de LIPOFECTIN durante 4 horas con oligonucleótido 25 nM. Los pocillos estaban triplicados. Se recogieron las células con EDTA 2 mM después de 20 horas y se analizaron por citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 8, usando el anticuerpo conjugado de CD49d-ficoeritrina (CD49d-PE) (clon R1-2) y IgG2B-PE de rata como control. Los resultados se muestran en la Tabla 11.
TABLA 10
16 
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Todas las 2' MOE-citosinas de la Tabla 10 son 5-metilcitosinas.
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TABLA 11
18 
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Los ISIS 16430, 16431, 16433, 16434, 16434, 16435, 16436 y 16437 dieron una inhibición mejor del 50% en este ensayo y son preferidos.
El efecto dosis-respuesta de los ISIS 16431 y 16433 sobre los niveles de la proteína integrina \alpha4 se muestran en la Tabla 12. Se sembraron las células (por triplicado) a 2,5 x10^{4} células/pocillo en placas de 24 pocillos el día antes del tratamiento. Las concentraciones de oligonucleótido fueron 0,2, 1, 5, 25 y 50 nM en 3 \mug/ml de LIPOFECTIN. Se recogieron las células con EDTA 2 mM durante 4 minutos, después se añadió 1 ml de BSA al 2%, azida al 0,2% por contenido de cada pocillo. Los niveles de proteína se analizaron por citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 8, usando el anticuerpo conjugado CD49d-PE a 2 \mug/ml, y IgG2B-PE de rata a 2 \mug/ml como control. Se encontró que los ISIS 16431 y 16433 tienen unas IC_{50} de aproximadamente 1 nM para la inhibición de la proteína integrina \alpha4.
TABLA 12
19
Otro experimento dosis-respuesta sobre ISIS 16433 se llevó a cabo con un control mezclado incluido. Las células IC-21 se trataron con oligonucleótido 0,3, 1, 3, 10 y 30 nM con 3 \mug/ml de LIPOFECTIN durante 4 horas. Se incubaron las células durante 24 horas, se recogieron con tripsina, se tiñeron con 2 \mug/ml de CD49d-PE y IgG2B de rata como en los Ejemplos anteriores. Los resultados se muestran en la Tabla 13. Se encontró que ISIS 16433 a concentración 30 nM inhibe los niveles de proteína hasta niveles inferiores a los niveles basales.
TABLA 13
20
Se realizó otro experimento de dosis-respuesta para determinar la IC_{50} de ISIS 16433 para la inhibición de RNA de la integrina \alpha4. Se trataron las células IC-21 por duplicado con ISIS 16433 a 6,25, 12,5, 25 o 50 nM con 3 \mug/ml de LIPOFECTIN.
Se purificó el RNA con el Kit Qiagen Qiashredder/RNEASY™ siguiendo las instrucciones del fabricante. Se cebaron las sondas aleatoriamente usando un Kit Prime-a-Gene (Promega, Madison, WI). Los resultados se muestran en la Tabla 14. Se demostró que ISIS 16433 tiene una IC_{50} de aproximadamente 10 nM para la reducción del RNA de la integrina \alpha4.
TABLA 14
21
Ejemplo 14 Oligonucleótidos antisentido adicionales que tienen como objetivo la optimización de la integrina \alpha4 murina
Se sintetizaron oligonucleótidos adicionales con la secuencia de ISIS 16433 (SEQ ID NO: 47, dirigida hacia el codón de iniciación de la traducción) con el fin de optimizar la química de la cadena principal y la localización del gap 2' metoxietoxi. Se ensayaron estos compuestos en cuanto a su capacidad de inhibir la expresión de la proteína integrina \alpha4. Los compuestos y resultados se muestran en las Tablas 15 y 16. Se encontró que el ISIS 17044 reduce la expresión de la integrina \alpha4 hasta por debajo de los niveles de partida y se escogió para estudio posterior en modelos animales de enfermedades.
TABLA 15
22
Los enlaces de la cadena principal internucleósidos son todos P=S excepto para ISIS 17160. "o" indica un enlace fosfodiéster (P=O) y "s" indica un enlace fosforotioato (P=S).
TABLA 16
24
Ejemplo 15 Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratón, modelo para esclerosis múltiple
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es una enfermedad inflamatoria, desmielinizante del sistema nervioso central usada frecuentemente como un modelo animal para la esclerosis múltiple. Es inducible en animales genéticamente susceptibles mediante inmunización con homogenato de la médula espinal completa o componentes proteínicos de la vaina de mielina tales como la proteína básica de la mielina (MBP) o la proteína proteolipídica (PLP), o por transferencia de células T específicas de MBP o PLP. Myers et al., J. Inmunol. 1993, 151, 2252-2260.
Se inmunizaron ratones CSJLF-1 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) con el péptido p13 (HSLGKWLGHPDKF-amida, sintetizado por Research Genetics, Huntsville, AL, SEQ ID NO. 60) que corresponde a los residuos 139-151 de PLP y es encefalitogénico en estos ratones. Se inmunizaron los ratones esencialmente como se describe en Myers et al., (J. Neuroimmunology 1992, 41, 1-8). En resumen, se inyectaron los ratones en las plantas de las patas traseras y en la base de la cola con 50-100 \mug de péptido p13, emulsionado en CFA (Difco, Detroit, MI) enriquecido con 4 mg/ml de bacterias Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco) inactivadas por calor. Al tiempo de las inyecciones plantares y de nuevo 2 días más tarde, se inyectaron también los ratones intravenosamente con 500 ng de toxina pertussis (Sigma, St. Louis, MO).
Se trataron los ratones con el oligonucleótido antisentido ISIS 17044 a diferentes dosis, empezando un día antes de la inmunización con p13 excepto cuando se indica otra cosa. El oligonucleótido estaba formulado en solución salina al 0,9% y se administró diariamente por inyección subcutánea, con administración continuada hasta que más del 50% del grupo control inmunizado con p13 pero tratado con solución salina empezó a mostrar síntomas de la enfermedad. Se terminó entonces la administración y se observaron los ratones en cuanto a los efectos del tratamiento a lo largo de la enfermedad. Se realizó una puntuación de la gravedad de la enfermedad en una escala de 0 a 5 con 0 = sin síntomas, 1 = cola flácida, 2 = debilidad en las patas traseras, 3 = parálisis de las patas traseras, 4 = parálisis de las patas traseras y delanteras y 5 = moribundo o muerto. Se midió también el tiempo hasta el comienzo de la enfermedad y se comparó con el de los ratones control inmunizados con p13 que recibieron solución salina en lugar de oligonucleótido.
Ejemplo 16 Experimento EAE 1
Se trataron ratones con ISIS 17044 como se describe en el Ejemplo 15, con dosis diarias que varían desde 1 mg/kg a 20 mg/kg, inyectadas subcutáneamente (SC). Se midieron la media de los picos de gravedad de la enfermedad y el promedio del número de días hasta el comienzo de la enfermedad y se muestran en la Tabla 17.
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TABLA 17
26
Como se muestra, el 17044 redujo la gravedad de la enfermedad o retrasó el comienzo de la enfermedad.
Ejemplo 17 Experimento EAE 2
Se trataron ratones con ISIS 17044 como se describe en el Ejemplo 15, con dosis diarias que varían desde 0,3 mg/kg a 3 mg/kg, inyectadas subcutáneamente, y 1 mg/kg inyectado intravenosamente para comparación. Se midieron la media de los picos de gravedad de la enfermedad y el promedio del número de días hasta el comienzo de la enfermedad y se muestran en la Tabla 18.
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TABLA 18
27
Como se muestra, el 17044 redujo la gravedad de la enfermedad y retrasó el comienzo de la enfermedad en todas las concentraciones.
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Ejemplo 18 Experimento EAE 3
Se trataron ratones con ISIS 17044 como se describe en el Ejemplo 15, con dosis diarias que varían desde 0,5 mg/kg a 2,0 mg/kg, inyectadas subcutáneamente (SC). Se ensayó también una pauta posológica de tres veces por semana, y un control mezclado (ISIS 17614, GCCGACACCCGTTCGTTCGG, 2' MOE/desoxi; P=S; SEQ ID NO: 57). Se midieron la gravedad de la enfermedad y el tiempo hasta el comienzo de la enfermedad y se muestran en la Tabla 19.
TABLA 19
28
Como se muestra, el 17044 redujo la gravedad de la enfermedad o retrasó el comienzo de la enfermedad.
Ejemplo 19 Experimento EAE 4-Administración profiláctica frente a administración terapéutica
Se trataron ratones con ISIS 17044 como se describe en el Ejemplo 15, con dosis diarias que varían desde 0,01 mg/kg a 2,0 mg/kg, inyectadas subcutáneamente (SC). Se ensayó también el oligonucleótido, ISIS 17614 como control mezclado a 2,0 mg/kg. Se ensayó también una dosis diaria de 1 mg/kg, administrada terapéuticamente. En este régimen, el tratamiento con el oligonucleótido empezó el día 18, después de que los animales habían empezado a mostrar síntomas de parálisis, y continuó hasta el día 31. Se midieron la gravedad de la enfermedad y el tiempo hasta el comienzo de la misma y se muestran en la Tabla 20.
TABLA 20
29
Como se muestra, el 17044 redujo la gravedad de la enfermedad cuando se administra terapéuticamente (el tiempo para el comienzo de la enfermedad no se espera que aumente ya que la administración empieza después del comienzo de la enfermedad).
Ejemplo 20 Experimento EAE 5-Administración profiláctica frente a administración terapéutica
Se trataron ratones con ISIS 17044 como se describe en el Ejemplo 15, con dosis diarias que varían desde 0,01 mg/kg a 2,0 mg/kg, inyectadas subcutáneamente (SC). Se ensayó también el oligonucleótido, ISIS 17614 como control de mezcla a 2,0 mg/kg. Se ensayó también una dosis diaria de 1 mg/kg, administrada terapéuticamente. En este régimen, el tratamiento con el oligonucleótido empezó el día 11, después de que los animales habían empezado a mostrar síntomas de parálisis, y continuó hasta el día 27. Se midieron la gravedad de la enfermedad y el tiempo hasta el comienzo de la misma y se muestran en la Tabla 21.
TABLA 21
30
Como se muestra, el 17044 redujo la gravedad de la enfermedad cuando se administra terapéuticamente (el tiempo para el comienzo de la enfermedad no se espera que aumente ya que la administración empieza después del comienzo de la enfermedad).
Ejemplo 21 Artritis inducida por colágeno (CIA) en ratón, modelo para artritis reumatoide
Se ha desarrollado un modelo para la artritis reumatoide humana en el que se inmunizan ratones con colágeno bovino tipo II. Anderson et al., J. Immunol. 1991 147, 1189-1193, citando a Trentham et al., J. Exp. Med. 1977, 146, 857. La hinchazón e inflamación de las articulaciones aparece en aproximadamente 3 semanas, con distorsión y anquilosis de la articulación típicas de la artritis reumatoide. Este modelo se ha usado para estudiar los efectos del oligonucleótido antisentido 17044, dirigido a la integrina \alpha4 de ratón como objetivo, en artritis de ratones.
Se obtuvieron ratones DBA/1LacJ de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Se usaron ratones hembras de 6 a 8 semanas de edad y se asignaron a grupos, diez ratones por grupo. El día 0 se inmunizaron los ratones en la base de la cola con 100 \mug de colágeno bovino tipo II que había sido emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA). El día 7, se administró una segunda dosis de refuerzo de colágeno por la misma vía. El día 14 se inyectaron los ratones subcutáneamente con 100 \mug de lipopolisacáridos (LPS). Se registraron los pesos semanalmente. Se inspeccionaron los ratones diariamente en cuanto al comienzo de la CIA, que se caracteriza por eritema y edema. Después del comienzo de la enfermedad, se midieron la anchura de las patas y la anchura posterior de los tobillos de las articulaciones afectadas y no afectadas tres veces a la semana usando un calibre de tensión constante. Adicionalmente, se evaluaron clínicamente las extremidades y se puntuaron de 0-4, donde 0 = normal; 1 = hinchazón de un dígito; 2 = inflamación presente en más de un dígito; 3 = distorsión de la articulación con o sin inflamación; y 4 = anquilosis, detectada mediante la manipulación de la articulación. La progresión de todas las medidas se registró hasta el día 50. Al final del periodo de observación para cada ratón, se separaron todas las patas y se examinaron histológicamente.
El oligonucleótido, el fármaco control positivo (ciclofosfamida, 5 mg/kg), y el vehículo se administraron diariamente a cada ratón intraperitonealmente (IP) empezando el día -3 y continuando durante el curso del estudio. Cada animal recibió 10 mg/kg como una dosis diaria de una sola vez.
Ejemplo 22 Efecto del oligonucleótido antisentido dirigido hacia la integrina \alpha4 en la artritis inducida por colágeno (CIA)
En un estudio preliminar, se administró una dosis única de 10 mg/kg diarios de ISPH 17044 desde el tiempo de inducción de la enfermedad hasta la conclusión del estudio 50 días más tarde. Se redujo la incidencia de la artritis desde 70 a 30% en el grupo tratado con ISIS 17044. En la Tabla 22 se muestra un resumen de los parámetros clínicos.
TABLA 22
31
Se compararon los ratones que desarrollaron artritis en los diferentes grupos de tratamiento y en la Tabla 23 se muestran los resultados.
TABLA 23
32
Ejemplo 23 Reducción del tráfico de leucocitos en el sistema nervioso central de ratones con EAE, por el oligonucleótido antisentido dirigido a la integrina \alpha4
Los ratones del experimento EAE 3 (Ejemplo 18 anterior) fueron sacrificados con CO_{2} y se separó la médula espinal y se cortó en piezas de 0,5 cm a lo largo de las regiones lumbar y torácica inferior. Se incrustaron las piezas en un medio de congelación de tejido O.C.T. (Ted Pella Inc., Redding, CA) sobre hielo seco y metilbutano. Se cortaron secciones congeladas de cuatro micrómetros y se secaron al aire durante la noche. Se fijaron las secciones durante tres minutos en acetona enfriada en hielo y se pusieron en un Dako Autostainer (Dako Corporación, Carpinteria, CA) y se trataron en las siguientes etapas: 5 minutos en H_{2}O_{2} al 0,03%, 5 minutos en suero de burro al 5% diluido en PBS, 45 minutos en un anticuerpo primario diluido apropiadamente, 30 minutos en anticuerpo secundario anti-rata de burro marcado con peroxidasa de rábano (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Se lavaron las secciones entre tratamientos con PBS. Todos los anticuerpos usados fueron anti-ratón de rata procedentes de PharMingen (San Diego,CA), excepto BM-8, que era de Bachem Bioscience Inc. (King of Prussia, PA). Se desarrolló la inmunotinción con DAB (Dako Corporación) y se hizo tinción de contraste con hematoxilina.
El tratamiento con 1 mg/kg de ISIS 17044 demostró que reducía el tráfico de leucocitos en las médulas espinales y cerebros de los ratones CSJLF1 directamente inmunizados para desarrollar EAE. En experimentos preliminares, el tráfico de leucocitos medido por la expresión de VLA-4, del que la integrina \alpha4 es una de dos subunidades, CD4 (un marcador de células T), BM-8 (un marcador de macrófagos) y CD18 (contenido en las moléculas de adhesión LFA-1 y MAC-1 encontradas en los leucocitos) se redujo significativamente. Las células T CD4+ fueron virtualmente eliminadas del sistema nervioso central de los ratones tratados con ISIS 17044 en un experimento. Se había demostrado que estas células eran críticas para la inducción de EAE. En un segundo experimento (experimento EAE 4, Ejemplo 19 anterior), se confirmaron estos resultados, y aparecieron como un efecto dosis-dependiente, con 1,0 mg/kg de 17044 causando una mayor reducción de la afluencia de leucocitos hacia el sistema nervioso central que lo había hecho 0,1 mg/kg de 17044. El oligonucleótido control mezclado ISIS 17614 no fue efectivo para reducir la afluencia celular en este experimento.
Ejemplo 24 Efecto de los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la integrina \alpha4 sobre la enfermedad inflamatoria del intestino
Recientemente ha sido desarrollado un modelo de ratón para la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) por Okayasu et al. (Gastroenterology 1990, 98, 694-702). La administración de sulfato de dextrano a los ratones induce una colitis que recuerda la IBD humana en casi todos los detalles. Posteriormente, la IBD inducida por sulfato de dextrano y la IBD humana han sido estrechamente comparadas a nivel histológico y se ha encontrado que el modelo de ratón es un modelo sumamente reproducible y fiable. Este modelo se usa aquí para ensayar el efecto de ISIS 17044 sobre la enfermedad inflamatoria del intestino.
Se mantienen en condiciones estándar ratones hembras Swiss Webster (8 semanas de edad) con un peso de aproximadamente 25 a 30 gramos. Se deja que se aclimaten los ratones durante 5 días como mínimo antes de iniciar los procedimientos experimentales. Los ratones reciben sulfato sódico de dextrano al 5% en el agua de bebida (disponible ad libitum) durante 5 días. Concomitantemente, se administran el oligonucleótido ISIS 17044 en un vehículo farmacéutico, el vehículo solo (control negativo) o TGF-\beta (conocido como protector de la colitis mediada por sulfato de dextrano en los ratones). El ISIS 17044 se administra diariamente en inyección subcutánea de 1 mg/kg a 5 mg/kg durante 5 días. El TGF-\beta se administra como 1 \mug/ratón intracolónicamente.
Se sacrifican los ratones el día 6 y se somete el colon a evaluación histopatológica. Hasta el sacrificio, se monitoriza la actividad de la enfermedad observando a los ratones en cuanto a cambios de peso y observando las heces para signos de colitis. Los ratones se pesan diariamente. Las heces se observan diariamente en cuanto a cambios de consistencia y a presencia de hemorragia oculta o macroscópica. Se utiliza un sistema de puntuación para desarrollar un índice de la actividad de la enfermedad para el cual la pérdida de peso, consistencia de las heces y presencia de hemorragia se clasifican en una escala de 0 a 3 (siendo 0 normal y siendo 3 el más gravemente afectado) y se calcula un índice. Se analizan estadísticamente los cambios inducidos por el fármaco en el índice de actividad de la enfermedad. Se ha demostrado que el índice de actividad de la enfermedad tiene una correlación sumamente buena con la IBD en general.
Ejemplo 25 Efecto del oligonucleótido antisentido dirigido hacia la integrina \alpha4 sobre la supervivencia en el modelo murino de transplante de corazón heterotópico
Para determinar los efectos terapéuticos del oligonucleótido antisentido dirigido a la integrina \alpha4 para prevenir el rechazo de alotrasplantes, se ensaya el oligonucleótido ISIS 17044 específico de la integrina \alpha4 murina en cuanto a la actividad en un modelo murino de transplante de corazón heterotópico vascularizado. Se trasplantan corazones de ratones Balb/c a la cavidad abdominal de ratones C3H como injertos primarios vascularizados esencialmente como está descrito por Isobe et al., (Circulation 1991, 84, 1246-1255). Se administra el oligonucleótido por administración intravenosa continua mediante una bomba ALZET durante 7 días. El tiempo medio de supervivencia de los ratones no tratados es usualmente de aproximadamente 9-10 días. El tratamiento de los ratones durante 7 días con 1 mg/kg a 5 mg/kg de ISIS 17044 se espera que aumente el tiempo medio de supervivencia.
Ejemplo 26 Efecto del oligonucleótido antisentido dirigido hacia la integrina \alpha4 sobre la migración de los leucocitos
La infiltración de tejidos y órganos por los leucocitos es un aspecto importante del proceso inflamatorio y contribuye al daño del tejido resultante de la inflamación. El efecto de ISIS 17044 sobre la migración de los leucocitos se examina usando un modelo de ratón en el que se implantan subcutáneamente esponjas empapadas con carragenina. La carragenina estimula la migración de los leucocitos y el edema. El efecto del oligonucleótido sobre la migración de los leucocitos en los exudados inflamatorios se evalúa cuantificando la infiltración de los leucocitos en las esponjas implantadas. Después de cuatro horas en ayunas, 40 ratones se asignan aleatoriamente a ocho grupos que contiene cada uno cinco ratones. Se anestesia cada ratón con METOFANE y se implanta subcutáneamente una esponja de poliéster impregnada con 1 ml de una solución de 20 mg/ml de carragenina. Se administra intravenosamente solución salina al Grupo 1 a 10 ml/kg cuatro horas antes de la implantación de la esponja y esto sirve como el control con vehículo. Se administra oralmente indometacina (control positivo) a 3 mg/kg a un volumen de 20 ml/kg al Grupo 2 inmediatamente después de la cirugía, de nuevo 6-8 horas más tarde y de nuevo a las 21 horas post-implantación. Se administra intravenosamente ISIS 17044 a una dosis de 1 mg/kg a 5 mg/kg al Grupo 3 cuatro horas antes de la implantación de la esponja. Se administra intravenosamente ISIS 17044 a una dosis de 1 mg/kg a 5 mg/kg al Grupo 4 inmediatamente después de la implantación de la esponja. Se administra intravenosamente ISIS 17044 de 1 mg/kg a 5 mg/kg a los grupos 5, 6, 7 y 8 a las 2, 4, 8 y 18 horas después de la implantación de la esponja, respectivamente. Veinticuatro horas después de la implantación, se separan las esponjas, se sumergen en EDTA y solución salina (5 ml) y se secan exprimiéndolas. Se determinan los números totales de leucocitos en las mezclas del exudado de las esponjas. La administración oral de indometacina a 3 mg/kg generalmente produce una reducción de 75-80% en la media del número de leucocitos cuando se compara con el grupo control con vehículo.
Ejemplo 27 Ensayo de metástasis experimental
Para evaluar el papel de la integrina \alpha4 en la metástasis, se realizan ensayos de metástasis experimental inyectando 1 x 10^{5} células C8161 en la vena lateral de la cola de ratones lampiños atímicos. La C8161 es una línea de células del melanoma humano. El tratamiento de las células C8161 con la citocina TNF-\alpha e interferón \gamma, ha demostrado previamente que produce un aumento del número de metástasis de pulmón cuando se inyectaron las células en los ratones atímicos (Miller, D. E. and Welch, D. R., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1990, 13, 353). Se usan ratones atímicos hembras de cuatro semanas (Harlan Sprague Dawley). Se mantienen los animales según las recomendaciones del NIH. Se ensayan cada uno de los grupos de 4-8 ratones en ensayos de metástasis experimental.
El tratamiento de las células C8161 con el oligonucleótido antisentido ISIS 27104, complementario de la integrina \alpha4 humana, se realiza en la presencia del lípido catiónico, LIPOFECTIN (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD). Se siembran las células en placas de cultivo de tejido de 60 mm a 10^{6} células/ml y se incuban a 37ºC durante 3 días, se lavan con Opti-MEM (Gibco/BRL) 3 veces y se añaden 100 \mul de medio Opti-MEM a cada pocillo. Se mezclan oligonucleótido 0,5 \muM y 15 \mug/ml de LIPOFECTIN a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añaden 25 \mul de la mezcla oligonucleótido-LIPOFECTIN a las placas apropiadas y se incuban a 37ºC durante 4 horas. La mezcla oligonucleótido-LIPOFECTIN se separa y se reemplaza con medio DME-F12 que contiene 10% de suero fetal de ternera. Después de 4 horas, se añaden 500 U/ml de TNF-\alpha a los pocillos apropiados y se incuban durante 18 horas a cuyo tiempo se separan las células de las placas, se cuentan y se inyectan a los ratones lampiños atímicos. Alternativamente, se implantan células tumorales (no tratadas con oligonucleótido) en los ratones lampiños atímicos como antes y los ratones que tienen tumor se tratan un día sí y uno no, con el oligonucleótido antisentido a dosis de 1 mg/kg
a 5 mg/kg.
Después de 4 semanas, se sacrifican los ratones, se fijan los órganos en fijador de Bouin y se puntúan las lesiones metastásicas sobre los pulmones con la ayuda de un microscopio de disección.
El tratamiento de las células C8161 con ISIS 27104 disminuye el potencial metastásico de estas células, y elimina la capacidad metastásica incrementada de C8161 que resulta del tratamiento con TNF-\alpha.
Ejemplo 28 Efecto del oligonucleótido antisentido dirigido a la integrina \alpha4 en un modelo murino de la enfermedad de Crohn
Se usan ratones SJL/J y IL10-/- en un modelo de colitis inducida por TNBS (ácido 2,4,5,-trinitrobenceno-sulfónico) para la enfermedad de Crohn (Neurath, M. F., et al., J. Exp. Med., 1995, 182, 1281-1290). Se usan ratones con una edad entre 6 semanas y 3 meses para evaluar la actividad de los oligonucleótidos antisentido frente a TNF-\alpha.
Los ratones C3H/HeJ, SJL/JK y IL10-/- se mantienen en ayunas durante la noche antes de la administración de TNBS. Se inserta lentamente en el colon de los ratones, un tubo de polietileno delgado, flexible, de manera que la punta queda aproximadamente a 4 cm cerca del ano. Se inyectan lentamente 0,5 mg de TNBS en etanol al 50% desde el catéter ajustado a una jeringa de 1 ml. Se mantienen los animales invertidos en una posición vertical durante aproximadamente 30 segundos. Se administra el oligonucleótido ISIS 17044 o bien al primer signo de síntomas o bien simultáneamente con la inducción de la enfermedad. Los animales, en la mayoría de los casos, reciben dosis cada día. La administración es por inyección i.v., i.p., s.c., con minibombas o intracolónica. Se recogen tejidos experimentales al final del régimen de tratamiento para evaluación histoquímica.
Ejemplo 29 Efecto del oligonucleótido antisentido dirigido hacia la integrina \alpha4 en un modelo murino de hepatitis
Se utiliza la hepatitis inducida con concanavalina A como un modelo murino de hepatitis (Mizuhara, H., et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 1529-1537). Se usan ratones hembras Balb/c y C57BL/6 con edades entre 6 semanas y 3 meses, para evaluar la actividad del oligonucleótido antisentido ISIS 17044.
Se inyectan intravenosamente los ratones con el oligonucleótido. Se inyectan entonces intravenosamente los ratones pretratados con 0,3 mg de concanavalina A (Con A) para inducir la lesión hepática. Dentro de las 24 horas después de la inyección de Con A, se extraen los hígados de los animales y se analizan en cuanto a muerte celular (apoptosis) mediante métodos in vitro. En algunos experimentos, se recoge sangre de la vena retro-orbital.
Ejemplo 30 Efecto del oligonucleótido antisentido dirigido hacia la integrina \alpha4 en un modelo murino de asma
En los pacientes con asma alérgica se observa inflamación en las vías respiratorias. Se ha desarrollado un modelo murino de asma alérgica, (Hessel et al. J. Inmunol. 1998, 160, 2998-3005). La sensibilización de ratones BALB/c con ovoalbúmina induce un alto nivel en suero de IgE específica de la ovoalbúmina. La inhalación de ovoalbúmina en los ratones sensibilizados causa una respuesta broncoconstrictiva inmediata. La inhalación repetida de ovoalbúmina en los animales sensibilizados induce la hiper-respuesta no específica de las vías respiratorias in vivo, y la infiltración de leucocitos en el tejido de las vías respiratorias.
Se obtienen ratones machos BALB/c libres de patógenos (6-8 semanas) de Jackson Laboratories. Se realiza una sensibilización activa mediante 7 inyecciones IP de 10 \mug de ovoalbúmina (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, grado II) en 0,5 ml de solución salina libre de pirógenos en días alternos, una inyección al día. Esto produce altos títulos de IgE total en el suero de ratón de los cuales el 80% es IgE específica de ovoalbúmina (Hessel et al., J. Immunol. 1998, 160: 2998-3005). Cuatro semanas después de la última inyección, se exponen los ratones o a aerosoles de ovoalbúmina (2 mg/ml) o a aerosoles de solución salina, una vez al día durante ocho días. El aerosol se genera con un nebulizador tal como Medix 8001 (Sussex, UK). Los animales fueron expuestos durante 5 minutos por enfrentamiento al aerosol.
Se administra el oligonucleótido antisentido 17044 a los ratones durante el periodo de enfrentamiento. Treinta minutos antes del primero y quinto enfrentamiento a la inhalación, los ratones sensibilizados fueron inyectados intravenosamente con una dosis de 1 mg/kg a 5 mg/kg de ISIS 17044 en PBS.
La receptividad de las vías respiratorias a la metacolina se mide in vivo 24 horas después de la última exposición al aerosol usando el método de presión por desbordamiento de aire, en el cual se mide la resistencia bronquial a la inflación. Se anestesian los ratones por inyección IP de uretano a 2 g/kg y se ponen sobre una manta caliente. Se canula la tráquea y se coloca un pequeño catéter de polietileno en la vena yugular para las administraciones IV. Se suprime la respiración espontánea mediante inyección IV de cloruro de tubocurarina (3,3 mg/kg). Cuando se para la respiración, se une la cánula traqueal a una bomba de respiración. A intervalos, se administraron dosis crecientes de metacolina que varían de 40 a 1280 \mug/kg. El aumento de la presión por desbordamiento de aire (causada por la reducción de la corriente de aire a los pulmones como resultado de aumentar el tono de las vías respiratorias) se mide en su pico y se expresa como un porcentaje de aumento.
El lavado broncoalveolar se usa para medir la infiltración de leucocitos del tejido de las vías respiratorias. Tres y 24 horas después del último aerosol, se anestesian los ratones por inyección IP de 0,25 ml de pentobarbitona de sodio (60 mg/ml). Se abren el abdomen y el pecho, y se extirpa la aorta abdominal. Por debajo de la laringe, se hace una pequeña incisión, y se inserta en la tráquea una cánula flexible de polietileno y se fija con una ligadura. Se lavan los ratones cinco veces con alícuotas de 1 ml de solución salina libre de pirógenos calentada a 37ºC. Se reúnen las células derivadas de cada lavado, se lavan con PBS frío y se vuelven a suspender en 200 \mul de PBS frío. Se contaron los números totales de células y se dividieron en categorías.
Ejemplo 31 Efecto del oligonucleótido antisentido dirigido a la integrina \alpha4 en la periferalización de las células progenitoras hematopoyéticas
La movilización (periferalización) de las células progenitoras hematopoyéticas desde la médula ósea a la circulación sanguínea es clínicamente útil en el transplante de células madres. Se ha establecido un modelo murino para evaluar los efectos de los fármacos en este proceso (y su inverso, el alojamiento selectivo de las células madres transplantadas a la médula ósea del receptor) (Papayannopoulou et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 1995, 92, 9647-9651). En resumen, se usan ratones libres de patógenos de 3-6 meses de edad y se mantienen en una jaula con caudal de aire filtrado durante la realización del experimento. Los ratones usados como receptores primarios o secundarios en el ensayo de alojamiento se exponen a irradiación 1150-cGy emitida desde una fuente de Cs.
Se preparan suspensiones de células individuales a partir de la sangre periférica, médula ósea y bazo. Se obtiene sangre periférica en heparina libre de conservantes por punción cardiaca y se recogen las células nucleadas usando tampón hemolítico de NH_{4}Cl. Se obtienen células de la médula ósea tratando la médula femoral, en condiciones estériles, con medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) que contiene 10% v/v de suero fetal bovino y estreptomicina (50 \mug/ml) y penicilina (50 U/ml). Se obtienen suspensiones de células esplénicas mediante disección en sentido longitudinal del bazo con un escalpelo y raspado de los contenidos celulares de la cápsula, seguido por un vigoroso pipeteado. Todas las suspensiones celulares se lavan dos veces en IMDM con 10% de suero fetal bovino. Se obtienen los recuentos celulares usando a hemocitómetro.
Se realizan ensayos de unidades formadoras de colonias en el cultivo (CFU-C) y unidades formadoras de colonias en el bazo (CFU-S) como se describe en Papayannopoulou et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 9647-9651).
Para evaluar la movilización de células progenitoras hematopoyéticas en los animales normales, se administra el oligonucleótido diariamente mediante inyección IV (a dosis que varía de 1 mg/kg a 5 mg/kg) durante tres días. Se sacrifican los ratones el cuarto día. Las células nucleadas presentes en 0,25-0,5 ml de sangre periférica se ponen en placas en cultivos progenitores clonogénicos para evaluar el contenido en CFU-C, como se describe en Papayannopoulou et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 9647-9651).
Ejemplo 32 Cribado de oligonucleótidos adicionales dirigidos a la integrina \alpha4 humana
Se diseñó un set adicional de oligonucleótidos antisentido para dirigirse a la integrina \alpha4 humana (GenBank, número de acceso L12002, incorporado aquí como SEQ ID NO: 1). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 24. Los oligonucleótidos fueron sintetizados como "gápmeros" que consisten en una región de desoxinucleótidos de 9 nucleótidos flanqueada por tres 2'-O-metoxietil- (2'-MOE)-nucleótidos en el extremo 5' y ocho 2'-MOE-nucleótidos en el extremo 3'. Los 2'-MOE-nucleótidos se muestran en negrita en la Tabla. Se sintetizaron los oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato desde el principio al fin, y todas las citosinas son 5-metilcitosinas. Los oligonucleótidos se cribaron en presencia de lipofectin en células de melanoma humano A375 como se ha descrito en el Ejemplo 8 anteriormente en esta memoria. Los resultados se muestran también en la Tabla 24. Como se muestra en la tabla, los oligonucleótidos 107234, 107235, 107236, 107237, 107238, 107239, 107240, 107241, 107242, 107243, 107244, 107245, 107246, 107248, 107249, 107251, 107252, 107253, 107254, 107255, 107256, 107257, 107258, 107259 y 107260 (SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 y 93, respectivamente) dieron como mínimo aproximadamente una inhibición del 50% de la expresión de la proteína integrina \alpha4 y son preferidos. De estos, los ISIS 107245, 107248, 107252, 107255 y 107259 (SEQ ID NO: 78, 81, 85, 88 y 92) se seleccionaron para un estudio posterior.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 24
33
Ejemplo 33
Curvas dosis-respuesta para el efecto de los oligonucleótidos antisentido sobre la expresión de la proteína integrina \alpha4
Se trataron células A375 con ISIS 107245, 107248, 107252, 107255 y 107259 por electroporación a 175 voltios, r = 1, c = 1000, 0,2 ml de Opti-MEM, 1 x 10^{6} células/ml, electrodo gap de 2 mm usando un BTX Electro Cell Manipulator 600 (Genetronics, San Diego CA). Las concentraciones del oligonucleótido fueron 1, 3, 10 y 30 \muM. Se recogieron las células 24 horas después del tratamiento con el oligonucleótido y se tiñeron con 2 \mug/ml de CD49d-FITC para citometría de flujo como en los ejemplos anteriores. Los resultados se muestran en la Tabla 25.
TABLA 25
34
Se comparó ISIS 107248 directamente con ISIS 27104 en cuanto a capacidad para inhibir la expresión de la integrina \alpha4 en células de melanoma A375. Los resultados se muestran en la Tabla 26. Se electroporaron los oligonucleótidos en las células como en el Ejemplo anterior.
TABLA 26
35
Ejemplo 34 Inhibición antisentido de la expresión de la proteína integrina \alpha4 en células Jurkat T
Se ensayó ISIS 107248 a dosis 1, 3, 10, 20 y 30 \muM en cuanto a capacidad para inhibir la expresión de la integrina \alpha4 en células linfocitos Jurkat T según los Ejemplos anteriores. La expresión de la proteína integrina \alpha4 se redujo en aproximadamente 65-72% a una dosis de oligonucleótido de 3-30 \muM a las 24 horas después del tratamiento con el oligonucleótido. A las 48 horas después del tratamiento, la expresión de la proteína integrina \alpha4 se redujo en un 60% a 3 \muM y en un 90% a la concentración de oligonucleótido 10, 20 y 30 \muM.
Ejemplo 35 Inhibición antisentido de la expresión de RNA de la integrina \alpha4 en células Jurkat T
Se realizó la cuantificación de los niveles de mRNA de la integrina \alpha4 mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7700 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Éste es un sistema de detección de fluorescencia en tubo cerrado, no basado en gel, que permite una cuantificación de alto rendimiento de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. A diferencia de la PCR estándar, en la que los productos de amplificación se cuantifican una vez que se ha completado la PCR, los productos de la PCR cuantitativa en tiempo real se cuantifican según se van acumulando. Esto se lleva a cabo incluyendo en la reacción de la PCR una sonda de oligonucleótido que produce un anillamiento específico entre los cebadores directo e inverso de la PCR, y contiene dos colorantes fluorescentes. Un colorante indicador (por ejemplo, JOE o FAM, obtenidos de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 5' de la sonda y un colorante de sofocamiento (por ejemplo, TAMRA, obtenido de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y los colorantes están intactos, la emisión del colorante indicador se sofoca por la proximidad del colorante de sofocamiento en 3'. Durante la amplificación, el anillamiento de la sonda a la secuencia objetivo crea un sustrato que puede ser escindido por la actividad de 5'-exonucleasa de la polimerasa Taq. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación de la PCR, la escisión de la sonda por la polimerasa Taq libera el colorante indicador del resto de la sonda (y por tanto del resto de sofocamiento) y se genera una señal fluorescente específica de la secuencia. Con cada ciclo, se escinden moléculas adicionales de colorante indicador desde sus respectivas sondas, y se monitoriza la intensidad de la fluorescencia a intervalos regulares mediante óptica láser incluida en el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7700. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones en serie de mRNA a partir de las muestras control no tratadas genera una curva estándar que se usa para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento de las muestras de ensayo con el oligonucleótido antisentido.
Los reactivos de la PCR se obtuvieron de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo añadiendo 20 \mul de cóctel PCR (1 x tampón TAQMANT A, MgCl_{2} 5,5 mM, una concentración 300 \muM de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, una concentración 600 \muM de dUTP, 400 nM de cada uno de los cebadores directo e inverso (o 100 nM en el caso de G3PDH), 100 nM de la sonda, 20 Unidades de inhibidor RNAsa, 1,25 Unidades de AMPLITAQ GOLD™, y 12,5 Unidades de transcriptasa inversa MuLV) a 5 \mul (100 ng) de solución total de mRNA, purificada usando el kit RNEasy™ (Qiagen, Valencia CA). La reacción RT se llevó a cabo mediante incubación durante 30 minutos a 48ºC. Después de una incubación de 10 minutos a 95ºC para activar el AMPLITAQ GOLD™, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo PCR de dos etapas: 95ºC durante 15 segundos (desnaturalización) seguido por 60ºC durante 1,5 minutos (anillamiento/extensión). Las sondas de integrina \alpha4 y los cebadores fueron diseñados para hibridarse con la secuencia de la integrina \alpha4 humana, usando la información de secuencias publicada (GenBank, número de acceso L12002), incorporada aquí como SEQ ID NO: 1).
Para la integrina \alpha4 los cebadores de la PCR fueron:
cebador directo: GACACGCTGCGCCTCAT (SEQ ID NO: 94, se hibrida en la posición 319-335 de GenBank, número de acceso L12002)
cebador inverso: ATTCAACACTAAGCGGCCACTG (SEQ ID NO: 95, se hibrida en la posición 391-412 de GenBank, número de acceso L12002) y la sonda de la PCR fue:
FAM-CCAACCGTCGCATCCCGTGCAA-TAMRA
(la sonda es la SEQ ID NO: 96; se hibrida en la posición 361-382 de GenBank, número de acceso L12002) en la que FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante de sofocamiento.
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Para GAPDH los cebadores de la PCR fueron:
cebador directo: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 97)
\newpage
cebador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 98) y la sonda de la PCR fue: 5' JOE-CAAGCTT
CCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (la sonda es la SEQ ID NO: 99) en la que JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante de sofocamiento.
24 horas después del tratamiento de las células de melanoma A375 con ISIS 107248 por electroporación (concentraciones del oligonucleótido 0,3, 1, 3, 10 y 30 \muM), se aisló el RNA total usando el kit RNeasy™ (Qiagen, Valencia CA) y se llevó a cabo la RT-PCR. Los niveles de mRNA de la integrina \alpha4 se redujeron aproximadamente 23%, 38%, 70%, 80% y 85% en comparación con el control, a las dosis de oligonucleótido 0,3, 1, 3, 10 y 30 \muM, respectivamente.
Ejemplo 36 Efecto de la inhibición antisentido de la integrina \alpha4 sobre la adhesión celular
Se cultivaron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (Clonetics, San Diego CA) en medio EGM-UV (Clonetics) y se trataron con TNF\alpha durante 20 horas para inducir la expresión de VCAM. Las células de melanoma A375 se electroporaron con ISIS 107248 como se ha descrito antes. Usando un anticuerpo frente a PECAM, un marcador específico para las células endoteliales, se utilizó citometría de flujo para cuantificar la inhibición de la adherencia de las células de melanoma A375 a las HUVEC. En comparación con el control (tratado con TNF, sin oligonucleótido), el ISIS 107248 (10 \muM) inhibió la adherencia de las células de melanoma A375 a HUVEC aproximadamente un 85%. Un anticuerpo frente a la integrina \alpha4 inhibió la adherencia aproximadamente un 72%. Las células de melanoma representan un modelo clínicamente relevante porque se ha demostrado una correlación estadísticamente significativa entre el aumento de la expresión de VLA-4 (del que la integrina \alpha4 es un miembro) y el tiempo de progresión y el tiempo de supervivencia global de los pacientes con melanoma. Schadendorf et al., J. Natl. Cancer Inst., 1995, 87, 366-371.
Se realizó un ensayo similar de adherencia usando células Jurkat T en lugar de células de melanoma, detectando de nuevo la adherencia a HUVEC. Debido a que las células Jurkat son más pequeñas y menos complejas, se pueden separar de las HUVEC basándose en las diferencias en la dispersión de luz frontal y lateral. Se cuantificaron células Jurkat adherentes para 5000 sucesos HUVEC. A concentraciones de oligonucleótido 1, 3, 10, y 30 \muM de ISIS 107248, la adherencia de las células Jurkat a HUVEC fue 0, 12%, 32% y 63%, respectivamente. El anticuerpo frente a la integrina \alpha4 dio una inhibición del 96%, un anticuerpo frente a VCAM-1 dio una inhibición del 67%, y una combinación de ISIS 107248 y anticuerpo frente a VCAM-1 dio una inhibición del 78%.
<110> Bennett, C. Frank
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Condon, Tom P. 
\hskip1cm
Cowsert, Lex M. 
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<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE INTEGRINa \alpha4
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<130> ISPH-0391
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<140>
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<141>
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<150> 09/166.203
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<151> 5 de Octubre de 1998
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<160> 60
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<210> 1
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<211> 3567
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (411)..(3527)
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<300>
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<308> L12002 Genbank
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<309> 15-02-1996
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<400> 1
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36
37
38
39
40 
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<210> 2
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia antisentido
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctccgtctct gcctacgc 
\hfill
18 
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<210> 3
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggtgctcg cgctgctt 
\hfill
18 
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<400> 4
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cctgggatgc cgcgcact 
\hfill
18 
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\hfill
18 
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\hfill
18 
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\hfill
18 
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cccgggttcg cgcctcgc 
\hfill
18 
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\hfill
18 
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<212> DNA
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gtggctgtgc agcacgac 
\hfill
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<223> secuencia antisentido
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\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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gcacgtctgg ccgggatt 
\hfill
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccactgattg tctctctc 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
18 
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcttattttc attcttta 
\hfill
18 
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<212> DNA
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttcttttact cagttctg 
\hfill
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 17
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tcacataatc ttgataac 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
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cccatcacaa ttaaatcc 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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ttatttgtag ttatattg 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia antisentido
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cctaaataac ttccaaat 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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gaaaatgacc agctccga 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia antisentido
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tttcatgtaa gatattta 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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ccacagcaca gacagaag 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tggtgctctg catgggtg 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tacacaaaca ctcttcct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgtttcca ttgcattc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcagcatat ttgtcact 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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ttgtcaatgt cgccaaga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tcatcttctt gtggagct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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ccatctgcac ggccattg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtccaaacat acttaacg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Secuencia artificial
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tatctgcatc aatttgtc 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgaaaagc accaactg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttgtcctta gcaagaca 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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tcagggtggc ttaaagaa 
\hfill
18 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atccattttc aacacagt 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccttatat gagaaaca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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caatttgaaa gaagtcct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccattctct caatttga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 40
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ggcgggctgt tttccatt 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1152)..(1283)
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\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> M62841 genbank
\vskip0.400000\baselineskip
<309> 30-10-1994
\newpage
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<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaggcccct ggggaacatt 
\hfill
20 
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<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agacgttatg gctattctct 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgcccttat atgagaaaca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaagccat gcgctctcgg 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcagccat gcgctcttgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1771
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1193)..(1387)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1709)..(1771)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> L20788 Genbank
\vskip0.400000\baselineskip
<309> 18-04-1996
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
43
44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgccccgt ttctgtggcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggatgcttca ggctctggcc 
\hfill
20 
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<210> 51
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<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagcgatcg tagtggccag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggtgctgg caggcgacag 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgaagtgc agcagcgtgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccactgac cagagttgca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacctcgctt ccgcagccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggaccagta ccagggttac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgacaccc gttcgttcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acctcctcgc tcacgcgcta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcttccgca gccatgcgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia peptídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe}
\newpage
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE INTEGRINA \alpha4
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<130> P026838EP:HGH
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<140> EP 99942290.0
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<141> 19.08-99
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<150> PCT/US99/18796
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<151> 1999-08-19
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<150> US 09/266,203
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<151> 05-10-1998
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<160> 99
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<210> 1
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<211> 3567
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (411)..(3527)
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<300>
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<308> L12002 Genbank
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<309> 15-02-1996
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<400> 1
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45
46
47
48
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ctccgtctct gcctacgc 
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cgggtgctcg cgctgctt 
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cctgggatgc cgcgcact 
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gcacgtctgg ccgggatt 
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gcttattttc attcttta 
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ttcttttact cagttctg 
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ttatttgtag ttatattg 
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cctaaataac ttccaaat 
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gaaaatgacc agctccga 
\hfill
18 
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tttcatgtaa gatattta 
\hfill
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ccacagcaca gacagaag 
\hfill
18 
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tggtgctctg catgggtg 
\hfill
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tacacaaaca ctcttcct 
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tttgtttcca ttgcattc 
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tgcagcatat ttgtcact 
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgtcaatgt cgccaaga 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcatcttctt gtggagct 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 30
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatctgcac ggccattg 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia antisentido
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gtccaaacat acttaacg 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia antisentido
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tatctgcatc aatttgtc 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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accgaaaagc accaactg 
\hfill
18 
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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cttgtcctta gcaagaca 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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tcagggtggc ttaaagaa 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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atccattttc aacacagt 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccttatat gagaaaca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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caatttgaaa gaagtcct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia antisentido
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<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccattctct caatttga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 40
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<211> 18
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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ggcgggctgt tttccatt 
\hfill
18 
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<210> 41
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<211> 1300
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<222> (1152)..(1283)
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\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> M62841 genbank
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<309> 30-10-1994
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\vskip1.000000\baselineskip
51
52 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
20 
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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gaaggcccct ggggaacatt 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agacgttatg gctattctct 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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ttgcccttat atgagaaaca 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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cccaagccat gcgctctcgg 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcagccat gcgctcttgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1771
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<212> DNA
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<213> Mus musculus 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1193)..(1387)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1709)..(1771)
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\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> L20788 Genbank
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<309> 18-04-1996
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53
54 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia antisentido
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cacgccccgt ttctgtggcc 
\hfill
20 
\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 50
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ggatgcttca ggctctggcc 
\hfill
20 
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<210> 51
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<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggagcgatcg tagtggccag 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccggtgctgg caggcgacag 
\hfill
20 
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<210> 53
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
gatgaagtgc agcagcgtgt 
\hfill
20 
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<210> 54
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggccactgac cagagttgca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacctcgctt ccgcagccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggaccagta ccagggttac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgacaccc gttcgttcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acctcctcgc tcacgcgcta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcttccgca gccatgcgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia peptídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtccgcaga gcgcgggatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agactcgcg tcctggcccgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcggaggc gcagggccgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggtttctg ccgccgagcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgcgacggt tggccaacgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccagcacat cggctctcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttcccaagc catgcgctct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgcttccca agccatgcgc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcctcgcttc ccaagccatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgcctcgc ttcccaagcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccttgccct tatatgagaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acttccttgc ccttatatga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagttatct gtgacttcac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatactgagg tcctcttccg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgagatcaac agaagtacaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagccttcc acataacata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatagatt tgtattgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgatataa ctccaactgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taatcatcat tgcttttact 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagaagtcct taatcatcat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgagtctgt tttccattct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttgtaaaca gtgtctttta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtaaaaga agtccaaaca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttgcatga agacataata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagagtaatc attgctgaga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctttggctg tattattacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctttagtg tttctctacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagtctaaga cttctccagt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggcaagca catatggtaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaaatgaac ctctgcccac 
\hfill
20 
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<210> 91
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaaagtgat aatggtccac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaacacagc ccgtaggaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgccagtt tggcctataa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacacgctgc gcctcat 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attcaacact aagcggccac tg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de la sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaaccgtcg catcccgtgc aa 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaggtgaag gtcggagtc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagatggtg atgggatttc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagcttccc gttctcagcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE INTEGRINA \alpha4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P026838EP:HGH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 99942290.0
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 19-08-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/18796
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 19-08-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/166.203
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 05-10-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (411)..(3527)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> L12002 Genbank
\vskip0.400000\baselineskip
<309> 1996-02-15
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
55
56
57
58
59
60 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctccgtctct gcctacgc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggtgctcg cgctgctt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgggatgc cgcgcact 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaggcgca gcgtgtcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaagttgca cgggatgc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaacattca acactaag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgggttcg cgcctcgc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgcgctctc agtgtcca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtggctgtgc agcacgac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actgaagcgt tggcgagc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcacgtctgg ccgggatt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccactgattg tctctctc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatccattt tctcctgg 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttattttc attcttta 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 18
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcttttact cagttctg 
\hfill
18 
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcacataatc ttgataac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 18
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<220>
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<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccatcacaa ttaaatcc 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttatttgtag ttatattg 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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cctaaataac ttccaaat 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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gaaaatgacc agctccga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tttcatgtaa gatattta 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccacagcaca gacagaag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggtgctctg catgggtg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacacaaaca ctcttcct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgtttcca ttgcattc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcagcatat ttgtcact 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgtcaatgt cgccaaga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatcttctt gtggagct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatctgcac ggccattg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtccaaacat acttaacg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatctgcatc aatttgtc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgaaaagc accaactg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttgtcctta gcaagaca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcagggtggc ttaaagaa 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
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<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atccattttc aacacagt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccttatat gagaaaca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caatttgaaa gaagtcct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccattctct caatttga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcgggctgt tttccatt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1152)..(1283)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> M62841 genbank
\vskip0.400000\baselineskip
<309> 30-10-1994
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
61
62 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttagtgaca aagacgttat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaggcccct ggggaacatt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agacgttatg gctattctct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgcccttat atgagaaaca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaagccat gcgctctcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcagccat gcgctcttgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1771
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1193)..(1387)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1709)..(1771)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> L20788 Genbank
\vskip0.400000\baselineskip
<309> 18-04-1996
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
63
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgccccgt ttctgtggcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatgcttca ggctctggcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagcgatcg tagtggccag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggtgctgg caggcgacag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgaagtgc agcagcgtgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccactgac cagagttgca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacctcgctt ccgcagccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggaccagta ccagggttac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgacaccc gttcgttcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acctcctcgc tcacgcgcta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcttccgca gccatgcgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia peptídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtccgcaga gcgcgggatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agactcgcg tcctggcccgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcggaggc gcagggccgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggtttctg ccgccgagcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgcgacggt tggccaacgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccagcacat cggctctcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttcccaagc catgcgctct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgcttccca agccatgcgc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcctcgcttc ccaagccatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgcctcgc ttcccaagcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccttgccct tatatgagaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acttccttgc ccttatatga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagttatct gtgacttcac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatactgagg tcctcttccg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgagatcaac agaagtacaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagccttcc acataacata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatagatt tgtattgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgatataa ctccaactgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taatcatcat tgcttttact 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagaagtcct taatcatcat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgagtctgt tttccattct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttgtaaaca gtgtctttta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtaaaaga agtccaaaca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttgcatga agacataata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagagtaatc attgctgaga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctttggctg tattattacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctttagtg tttctctacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagtctaaga cttctccagt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggcaagca catatggtaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaaatgaac ctctgcccac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaaagtgat aatggtccac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaacacagc ccgtaggaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgccagtt tggcctataa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacacgctgc gcctcat 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attcaacact aagcggccac tg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de la sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaaccgtcg catcccgtgc aa 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaggtgaag gtcggagtc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagatggtg atgggatttc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagcttccc gttctcagcc 
\hfill
20

Claims (23)

1. Un oligonucleótido antisentido de hasta 30 nucleótidos de longitud que comprende la SEQ ID NO: 81, en el que dicho oligonucleótido antisentido tiene como objetivo una molécula de ácido nucleico que codifica la integrina \alpha4 humana e inhibe la expresión de la integrina \alpha4 humana.
2. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, que comprende al menos un enlace internucleósidos modificado.
3. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 2, en el que el enlace internucleósidos modificado es un enlace fosforotioato.
4. El oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende al menos un resto de azúcar modificado.
5. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 4, en el que el resto de azúcar modificado es un resto de 2'-O-metoxietil-azúcar.
6. El oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende al menos una nucleobase modificada.
7. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 6, en el que la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
8. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, que es un oligonucleótido quimérico.
9. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, que comprende además un sistema de dispersión coloidal.
11. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, para uso en terapéutica.
12. Un método in vitro para inhibir la expresión de la integrina \alpha4 en células o tejidos humanos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, de tal modo que se inhibe la expresión de la integrina \alpha4.
13. El uso de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para administrar a un ser humano que tiene una enfermedad o afección asociada con la integrina \alpha4, de tal modo que se inhibe la expresión de la integrina \alpha4, donde la enfermedad o afección es una enfermedad o afección inflamatoria, una enfermedad o afección autoinmune, o una enfermedad o afección metastásica.
14. El uso de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para administración a un ser humano para reducir los niveles de VLA-4 en células y tejidos, donde la reducción de VLA-4 en células y tejidos trata o previene una enfermedad o afección inflamatoria, una enfermedad o afección autoinmune, o una enfermedad o afección metastásica.
15. El uso según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde la enfermedad o afección es artritis reumatoide, esclerosis múltiple, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes, hepatitis, rechazo de alotrasplantes o metástasis tumoral.
16. El uso según la reivindicación 14, donde la enfermedad o afección es artritis reumatoide, esclerosis múltiple, asma, o metástasis tumoral.
17. El uso según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde la enfermedad o afección es esclerosis múltiple.
18. El uso según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde la enfermedad o afección es una enfermedad o afección metastásica.
19. El uso según la reivindicación 18, donde la enfermedad o afección es melanoma.
20. Un método in vitro para reducir los niveles de VLA-4 en células o tejidos humanos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, de tal modo que se reducen los niveles de VLA-4.
\newpage
21. Un método in vitro para reducir los niveles de \alpha4\beta7 en células o tejidos humanos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, de tal modo que se reducen los niveles de \alpha4\beta7.
22. El uso de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para la administración a un ser humano para aumentar la movilización de las células progenitoras hematopoyéticas en la circulación de dicho ser humano.
23. Un método in vitro para reducir la adherencia de células de un primer tipo a células de un segundo tipo, que comprende poner en contacto al menos uno de dichos tipos de células con un oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1.
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