JP3998089B2 - 新規抗アポトーシスbcl−2−関連タンパク質のアンチセンスモジュレーション - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートするための組成物および方法を提供する。特に、本発明は抗アポトーシスヒトbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートすることが示されている。
【0002】
発明の背景
プログラム細胞死、あるいはアポトーシスは、細胞数の調節が細胞増殖と細胞死とのバランスにあるため、成長および発生の不可欠な特徴である。アポトーシスは受動的な過程というよりもむしろ活動的な過程であり、多くの外来性あるいは内在性のシグナルのいくつかの結果として細胞自殺が起こる。アポトーシス細胞死は核の凝集、ヌクレオソーム間隔でのDNAのエンドヌクレオリティック(endonucleolytic)分断化(“ラダーリング(laddering)”)および原形質膜の泡状化(blebbing)により特徴付けられる。プログラム細胞死は、例えば免疫系の発生および神経系の発生に不可欠な役割をしている。前者では、自己反応性抗原受容体を提示するT細胞がアポトーシスにより除去される。後者では、神経構造の重要な再形成が一部アポトーシスを通して起こる。
【0003】
アポトーシスに関係している遺伝子および遺伝子産物は増えている。これらの一つはbcl-2で、アポトーシスをブロックあるいは遅延することが示される細胞内在膜タンパク質である。bcl-2の過剰発現は過形成、自己免疫および化学療法により誘導されるアポトーシスも含む、アポトーシスに対する抵抗性、への関連を示している(Fangら、J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398)。bcl-2-関連遺伝子のファミリーは記載されている。全てのbcl-2ファミリーの構成員は、保存性の高い二つのドメイン、BH1およびBH2を共有する。bcl-2ファミリーの構成員は、A1、mcl-1、bcl-w、bax、bad、bakおよびbcl-xを含むが、これらには限定されない。A1、mcl-1、bcl-wおよびbcl-xl(bcl-xの長い型)は現在、アポトーシスに対する保護を与えることが知られており、ここで“抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質”として言及する。これらの中でA1およびmcl-1は、“新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質”として知られる。対して、bax、bad、bakおよびbcl-xs(bcl-xの短い型)は現在、この保護的な効果を阻害することにより細胞死を促進させることが知られている。本発明は新規抗アポトーシスヒトbcl-2-関連タンパク質、特にヒトA1およびmcl-1、およびアンチセンス技術を使用したこれらのタンパク質の発現の阻害に関する。
【0004】
A1をコードする遺伝子(また、胎児の肝臓で発現するbcl-2-関連遺伝子、あるいはbfl-1、およびグラスゴー再配置配列(Glasgow Rearranged Sequence)、あるいはGRSとしても知られる)は、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子で処理したマウスの造血細胞において、初期反応遺伝子として同定された。続いて、そのヒトホモログはbcl-2、特にBH1およびBH2ドメインと広範な(extensive)相同性を持つことが分かった。A1の発現レベルと臨床的試料における胃癌の発生との相関が注目された(Choiら、1995, Oncogene 11, 1693-1698;WO 96/30513)。ヒトA1のコーディング配列がクローン化され(Karsanら、1996, Blood 87, 3089-3096;Genbank寄託番号U29680)、造血細胞だけでなく、様々な非造血組織による発現も発見された。A1は、ホルボールエステルおよび炎症性サイトカイン、およびおそらく血管内皮成長因子により急速な誘導が可能である。A1は、胎児の発生中の生理学的な細胞死を制御する役割があると信じられている(Carrioら、1996, Am. J. Path., 149, 2133-2142)。A1配列の中にはわずかな変異が存在し、当初“GRS”として同定されたヒトA1配列は、当初“bfl-1”として同定されたA1配列と二つのアミノ酸が異なっている。GRS配列は当初、慢性骨髄性白血病の患者から得たDNAを使用したNIH3T3細胞増殖巣形成アッセイ(NIH3T3 focus formation assay)により分離された(Kennyら、Oncogene 14, 1997 997-1001)。これらの研究者は、癌細胞株U-937(組織球性リンパ腫)、HL-60(前骨髄性白血病)、およびRaji(バーキットリンパ腫)細胞において高レベルのA1発現を発見した。A1の発現はまた、THP-1(急性骨髄性白血病)、BJAB(バーキットリンパ腫)、活性化Jurkat(急性T-細胞白血病)細胞およびK-562赤白血病(CML急性転化(blast crisis))細胞においても発見された。
【0005】
mcl-1は当初、分化途上のヒト骨髄性白血病細胞株ML-1から同定された。その発現は、分化マーカーが現れる以前のML-1細胞の分化の誘導あるいは“プログラム化”の初期に増加することが分かった。mcl-1のコーディング領域は配列が決定され、カルボキシル末端領域においてbcl-2と配列相同性の明らかな領域を持つことが分かった(Kozopasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1993, 90, 3516-3520;Genbank寄託番号L08246)。bcl-2と異なり、mcl-1は、急速なターンオーバーをうける様々なタンパク質に存在する強力なPEST配列(プロリン、グルタミン酸、セリンおよびスレオニンに富む)を含む。
【0006】
外来的に導入されたmcl-1の過剰発現により、細胞傷害性の薬剤(化学療法的薬剤エトポシド、カルシウムイオノフォアあるいはUV照射)の暴露、あるいは必要な成長因子の添加停止などのように、通常はアポトーシス細胞死を起こす状況下で、生存力の延長が起きることが示されている(Zhouら、Blood 89, 1997, 630-643)。
【0007】
アポトーシスが関係している疾患および状態は二つのカテゴリー、すなわち細胞生存を増強するもの(すなわち、アポトーシスを減少させる)および細胞死を過剰にするもの(すなわち、アポトーシスを増加させる)、に分類される。増強された細胞の生存による細胞の過度の蓄積をともなう疾患は、癌、自己免疫障害およびウイルス感染を含む。最近まで、直接的には細胞障害性薬物はある生命維持機能を妨げることによって、標的細胞を殺すと考えられていた。しかし、最近、異なる作用機構を持ついくつかの細胞障害性薬剤に暴露すると、悪性細胞および正常細胞の両方において、アポトーシスが誘導されることが示されている。栄養因子の損失によりアポトーシスを誘導できるため、栄養(trophic)因子のレベルの操作(例えば、抗エストロゲン化合物、あるいは様々な成長ホルモンレベルを減少させる化合物による)は、アポトーシスを促進させる一つの臨床的アプローチである。アポトーシスはまた、発生中の潜在的に自己反応を起こすリンパ球の除去、および免疫あるいは炎症反応の完成後の過剰細胞の除去にとって必要不可欠である。最近の研究では、不適当なアポトーシスが、異常な自己反応リンパ球を生き延びさせることによりおこる自己免疫疾患の病原性の根底にある可能性があることが、明らかに示されている。不十分なアポトーシスが関係していると信じられているこれらおよび他の症状にとって、アポトーシスの促進は所望される。本発明に従う新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の阻害は、アポトーシスの促進を起こすと信じられる。
【0008】
2番目のカテゴリーにおいて、AIDSおよびアルツハイマー病あるいはパーキンソン病などの神経変性障害は、アポトーシスの促進(あるいは好ましくないアポトーシス)による過剰な細胞死が関与している障害を象徴している。筋萎縮性側索硬化、網膜色素変性、およびてんかんは、アポトーシスが関与する他の神経性障害である。アポトーシスは、虚血、例えば心筋梗塞および卒中により特徴付けられる症状において起こることが報告されている。アポトーシスはまた、毒素および薬剤による閉塞性黄疸および肝臓傷害を含む多くの肝臓障害にも関係している。アポトーシスはまた、いくつかの腎臓疾患、すなわち多発性嚢胞腎、ならびに糖尿病を含む膵臓障害において鍵となる現象としても同定される(Thatteら、Drugs, 1997, 54, 511-532)。好ましくないアポトーシスが関与していると信じられているこれら、および他の疾患および症状にとって、アポトーシスの阻害剤が所望される。
【0009】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、いくつかのbcl-2ファミリーの役割を解明した。bcl-2を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した広範な研究が行われており、ヒトbcl-2を標的とするアンチセンス化合物(G3139, Genta Incorporated)は、リンパ腫および前立腺癌の臨床試験に入っている。
【0010】
Amarante-Mendesら(Oncogene, 1998, 16, 1383-1390)は、bcrおよびbcl-xを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。後者はbcl-xlの発現を抑制制御し、スタウロスポリン(staurosporine)に対するHL-60 Bcr-Abl細胞の感受性を増加させる。
【0011】
米国特許5,583,034(Greenら)は、抗アポトーシス遺伝子の核酸配列、好ましくはbcr-ablの翻訳開始部位とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。
【0012】
Wangらは、bcl-x翻訳開始部位を標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用して、マウスWEHI-231リンパ腫細胞おいてCD40L-媒介性アポトーシス救出(rescue)をブロックした(J. Immunol., 1995, 155, 3722-3725)。
【0013】
Fujioらは、マウスおよびラットbcl-x mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、bcl-xlタンパク質発現を減少させた(J. Clin. Invest., 1997, 99, 2898-2905)。テストした化合物はWangらのものと同じであった。オリゴヌクレオチド処理は、マウスおよびラットの心筋細胞において白血病阻害因子の細胞保護効果を阻害した。
【0014】
Pollmanらは、ホスホロチオエートバックボーンをもつアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、血管内膜細胞においてbcl-xl発現の抑制制御をした(Nature Med., 1998, 4, 222-227)。この結果、アポトーシスの誘導および血管病変の緩解が起きた。アンチセンス配列はマウス/ヒトbcl-xの翻訳開始コドン(保存配列)を標的とし、ウサギに使用した。Gibbonsらの米国特許5,776,905は、好ましくは抗アポトーシス遺伝子に特異的なアンチセンス分子を用い、より好ましくはbcl-x、最も好ましくはbcl-xlを用いて、脈管疾患をともなう哺乳類の脈管構造中の脈管内膜病変細胞の標的化欠損の方法を開示する。
【0015】
Thompsonら、米国特許5,646,008およびWO 95/00642は、プログラム化された脊椎動物細胞死を促進あるいは阻害するbcl-2以外のポリペプチドをコードする、単離および精製されたポリヌクレオチドを記載する。好ましくは、ポリペプチドはbcl-xl、bcl-xsあるいはbcl-x1である。ポリペプチド、単離され精製されたポリヌクレオチドの一部と同一あるいは相補的なポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、抗体および治療的および診断的使用方法も提供する。
【0016】
Yangら、WO 98/05777は、アンキリンドメインを含むbcl-xファミリーの新規アイソフォームであるbcl-xγ(ガンマ)を開示する。このアイソフォームに対するポリペプチドおよび核酸配列、ならびにとりわけアンチセンス方法を含む、bcl-xγ活性をモジュレートする方法を記載する。
【0017】
Chaoら(Molec. Cell. Biol., 1998, 18, 4883-4898)は、アンチセンス配向(orientation)での全ヒトmcl-1 cDNAを含有するアンチセンス構造物を使用して、TF-1細胞における内因性mcl-1の抑制制御が、これらの細胞のアポトーシスを誘導できることを示した。
【0018】
Coryら(WO 97/35971)は、効果的な量のbcl-w発現のモジュレーターとbcl-w遺伝子を接触させることにより、哺乳類においてbcl-wの発現をモジュレートする方法を開示する。bcl-wに対してアンチセンス配列を使用することを含むbcl-w発現の亢進および減少の両方を開示する。
【0019】
WO 96/30513(Shinら)は、Bcl-2関連遺伝子、Bfl-1の配列、および癌診断のためのBcl-2関連遺伝子の使用を開示する。
WO 94/29330は、とりわけ、mcl-1ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列、後者を含有する宿主細胞およびベクター、mcl-1ポリペプチドに結合する抗体、およびこれらの化合物を使用した診断的および治療的方法を開示する。mcl-1関連細胞増殖障害をもつ被験体を治療する方法は一般的に開示され、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボゾームアプローチを含む。特異的な配列あるいは標的とする情報は提供されない。
【0020】
発明の概要
本発明はアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを示し、それらは新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸を標的とするものであり、これらのファミリーの構成員の発現をモジュレートするものである。より好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトA1あるいはヒトmcl-1を標的とする。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物も提供する。さらに、本発明の一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物あるいは組成物と、細胞あるいは組織を接触させることを含む、前記の細胞あるいは組織において新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートする方法を提供する。細胞あるいは組織においてアポトーシスを促進させる方法も提供する。さらに、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質に関連する疾患あるいは症状を有するか、あるいはなりやすいという疑いのある動物、特にヒトを治療する方法を提供し、あるいは本発明の一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物あるいは組成物の、治療的あるいは予防的に効果的な量を投与することによってアポトーシスの増加が所望される動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
【0021】
発明の詳細な説明
本発明は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質、特にヒトA1およびmcl-1の発現をモジュレートできるアンチセンス化合物を包含する。A1およびmcl-1はアポトーシスを阻害し、それゆえこれらの標的の阻害剤はアポトーシスの促進剤として所望される。
【0022】
本発明は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に、究極的には、産生したbcl-2-関連タンパク質の量のモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを用いる。これは、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする一つあるいはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズする、アンチセンス化合物を提供することで達せられる。ここで使用されるように、“標的核酸”および“新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸”という用語は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードするDNA、そのDNAから転写される(プレmRNAおよびmRNAを含む)RNA、およびそのRNA由来のcDNAも含む。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、核酸の正常機能を干渉する。標的核酸のこの機能をそれと特異的にハイブリダイズする化合物によってモジュレートすることは、一般的に“アンチセンス”として言及される。干渉されるDNAの機能は複製および転写を含む。干渉されるRNAの機能は、全ての生命の機能、例えばタンパク質翻訳部位へのRNAの移動、RNAからのタンパク質の翻訳、一つあるいはそれ以上の種類のmRNAを産するためのRNAのスプライシング、およびRNAに関わりあるいはRNAにより容易にされうる触媒活性などを含む。そのような標的核酸機能の干渉の全体的な効果は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現のモジュレーションにある。本発明の文脈において、“モジュレーション”は遺伝子発現の増加(刺激)あるいは減少(阻害)のどちらかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形であり、mRNAは好ましい標的である。
【0023】
特異的核酸をアンチセンスの標的とすることは好ましい。本発明の文脈において、特異的な核酸に対してアンチセンス化合物を“標的とする”ことは、複数段階の過程である。過程は通常、機能がモジュレートされるべき核酸配列の同定から始まる。例えば、これはその発現が特定の障害あるいは疾患状態と関連する細胞性遺伝子(あるいは遺伝子から転写されたmRNA)、あるいは感染病原体由来の核酸分子でありうる。本発明において、標的は新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸分子である。標的化の過程は、所望する効果、例えばタンパク質発現の検出あるいはモジュレーションを得られるように、アンチセンス相互作用が起こるようにするための本遺伝子内の一つあるいは複数の部位の決定を含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始あるいは停止コドンを含む領域である。当該技術分野で知られるように、翻訳開始コドンは典型的には5'-AUG(転写されたmRNA分子において;対応するDNA分子では5'-ATG)であるため、翻訳開始コドンは“AUGコドン”、“開始コドン”あるいは“AUG開始コドン”としても言及される。少数の遺伝子はRNA配列5'-GUG、5'-UUGあるいは5'-CUGをもつ翻訳開始コドンをもち、5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGはin vivoで機能することを示している。従って、“翻訳開始コドン”および“開始コドン”という用語は、各々の例において開始アミノ酸が典型的に(真核生物では)メチオニンあるいは(原核生物では)ホルミルメチオニンであるにも関わらず、多くのコドン配列を含むことができる。真核生物あるいは原核生物の遺伝子が二つあるいはそれ以上の代替の開始コドンをもち、そのうちのいずれの一つが特定の細胞型あるいは組織において、あるいは特定の一連の状態のもとで翻訳開始に優先的に利用しうることも、当該技術分野で知られている。本発明の文脈において、“開始コドン”および“翻訳開始コドン”は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳を開始させるためにin vivoで使用される一つあるいは複数のコドンについて言及し、そのようなコドンの配列には関わらない。
【0024】
遺伝子の翻訳終了コドン(あるいは“停止コドン”)は三つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA(対応するDNA配列はそれぞれ5'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGA)の一つをもちうることも、当該技術分野で知られている。“開始コドン領域”および“翻訳開始コドン領域”という用語は、翻訳開始コドンからのどちらかの方向(すなわち、5'あるいは3')において、約25から約50までの隣接するヌクレオチドを含むようなmRNAあるいは遺伝子の一部について言及する。同様に、“停止コドン領域”および“翻訳終了コドン領域”という用語は、翻訳終了コドンからのどちらかの方向(すなわち、5'あるいは3')において、約25から約50までの隣接するヌクレオチドを含むようなmRNAあるいは遺伝子の一部について言及する。
【0025】
翻訳開始コドンと翻訳終了コドンの間の領域について言及することが当該技術分野で知られる、オープンリーディングフレーム(ORF)あるいは“コーディング領域”は、効果的に標的とされうる領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの一部について言及すると当該技術分野で知られる5'非翻訳領域(5'UTR)を含み、従って、mRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドンの間のヌクレオチドあるいは遺伝子上で対応するヌクレオチドを含み、そして、翻訳終了コドンから3'方向におけるmRNAの一部について言及すると当該技術分野で知られる3'非翻訳領域(3'UTR)を含み、従って、mRNAの翻訳終了コドンと3'末端の間のヌクレオチドあるいは遺伝子上で対応するヌクレオチドを含む。mRNAの5'キャップは、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの最も5'-側の基(5'-most residue)に結合するN7-メチル化グアノシンを含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造そのものならびにキャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられている。5'キャップ領域は好ましい標的領域でもありうる。
【0026】
いくつかの真核生物のmRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは“イントロン”として知られる一つあるいはそれ以上の領域を含有し、翻訳前に転写物から除去される。残存(およびそれ故翻訳される)領域は“エクソン”として知られ、一緒にプライスされて連続的なmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわちイントロン-エクソン結合部は好ましい標的領域でもあり、異常型スプライシングが疾患と関係する場合、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患と関係する場合において特に利用される。再構成あるいは欠損による異常型の融合結合も好ましい標的である。イントロンは効果的であり、それ故、例えばDNAあるいはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物の好ましい標的領域でもありうる、ということも分かっている。
【0027】
ひとたび一つあるいはそれ以上の標的部位が同定されれば、標的と十分に相補的な、すなわち十分よく十分に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが選択され、所望する効果を与える。
【0028】
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”は、相補的なヌクレオシド間あるいはヌクレオチドの塩基間での、ワトソン-クリック、フーグステン(Hoogsteen)あるいは逆転フーグステン(reversed Hoogsteen)水素結合でありうる、水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは水素結合形成を介して対になる相補的なヌクレオ塩基である。ここで使用する“相補的”は、二つのヌクレオチド間の正確な対形成の能力について言及する。例えば、もしオリゴヌクレオチドのある部位のヌクレオチドが、DNAあるいはRNAの同部位にあるヌクレオチドと水素結合が可能であると、その時オリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNAはその部位で互いに対して相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNAは、各々の分子において十分に多くの対応する位置が互いに水素結合可能であるヌクレオチドで占められている時には、互いに対して相補的である。従って、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定的で特異的な結合がオリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNA標的間で起こるような、十分な程度の相補性あるいは正確な対形成を示すのに使用される用語である。特異的にハイブリダイズするためには、アンチセンス化合物の配列がその標的の配列と100%相補的である必要はない、ということは当該技術分野で理解されている。アンチセンス化合物は、標的DNAあるいはRNA分子と化合物の結合が標的DNAあるいはRNAの正常機能を干渉して有用性を失わせる時に、そして、特異的な結合が望ましい状況下、すなわちin vivoアッセイあるいは治療的処置、およびin vitroアッセイの場合における生理学的状況下、アッセイが行われる状況下で、非標的配列とアンチセンス化合物の非特異的な結合を避けるために十分な程度の相補性がある時に、特異的なハイブリダイズが可能である。
【0029】
アンチセンス化合物は一般に研究用試薬および診断試薬として使用される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、強い特異性により遺伝子発現を阻害でき、しばしば当業者により特定の遺伝子の機能を解明するために使用される。アンチセンス化合物は、例えば生物学的な経路の様々な構成員の機能の識別をするためにも使用される。それゆえ、アンチセンスモジュレーションは研究的使用のために利用されている。
【0030】
アンチセンスの特異性および感受性は、当該技術者により治療的使用のためにも利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける疾患状態の治療において治療的部分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレチドは安全かつ効果的にヒトに投与されており、多くの臨床試験が現在進行中である。このように、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療計画において有用であるように形づくられうる有用な治療的モダリティーでありうる、ということが確立されている。本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸(RNA)あるいはデオキシリボ核酸(DNA)あるいはその模倣物のオリゴマーあるいはポリマーについて言及する。この用語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖および共有ヌクレオシド間(バックボーン)結合、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾されたあるいは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞性取り込みの亢進、核酸標的との親和性の亢進、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の向上などの所望される特徴のため、しばしば本来の形態以上に好ましい。
【0031】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態である一方で、本発明は他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含し、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣物を含むが、これらには限定されない。本発明に従ったアンチセンス化合物は、好ましくは約8から約30のヌクレオ塩基を含む。約8から約30のヌクレオ塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい(すなわち、約8から約30の結合したヌクレオシド)。当該技術分野で知られるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環式の塩基である。そのような複素環式の塩基の二つの最も一般的な分類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、リン酸基は糖の2'、3'あるいは5'の水酸基部分のいずれかと結合しうる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖のポリマー化合物を形成する。この直鎖のポリマー構造の各々の末端は順次さらに結合して環状構造を形成することができる。しかし、開環直鎖構造が一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するとして一般に言及される。RNAおよびDNAの通常の結合あるいはバックボーンは、3'から5'のホスホジエステル結合である。
【0032】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例は、修飾されたバックボーンあるいは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において定義されるように、修飾されたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバックボーン内にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のため、および当該技術分野において時々言及されるように、ヌクレオシド間のバックボーンにリン原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると考えられる。
【0033】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは、例えば、通常3'-5'結合を有する、ホスホロチオエート(phosphorothioate),キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホトリエステル(phosphotriester)、アミノアルキルホスホトリエステル(aminoalkylphosphotriester)、3'-アルキレンホスホネート(alkylene phosphonate)およびキラルのホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート(phosphinate)、3'-アミノホスホールアミデート(phosphoramidate)およびアミノアルキルホスホールアミデート(aminoalkylphosphoramidate)、チオノホスホールアミデート(thionophosphoramidate)チオノアルキルホスホネート(thionophosphonate)、チオノアルキルリン酸トリエステル(thionoalkylphosphotriester)およびボラノホスフェート(boranophosphate)、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対合が5'-3'に対して3'-5'に結合するか、または5'-2'に対して2'-5'を結合する反転した極性を持つもの、を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。
【0034】
上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.:3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;および5,625,050を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。
【0035】
その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子およびアルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは一つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子あるいはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを持つ。これらは、(一部はヌクレオシドの糖部分から形成される)モルホリノ結合;シロキサンバックボーン;スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;アルケン含有バックボーン;スルファメートバックボーン;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン;スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン;アミドバックボーン;および混合したN、O、SおよびCH2構成部分を有する他のもの、を持つものを含む。
【0036】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.:5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;および5,677,439を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。
【0037】
他の好ましいヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖とヌクレシチド間結合の両方、すなわちバックボーンは、新規基に置き換えられる。塩基単位は、適した核酸標的化合物とハイブリダイゼーションするために維持される。このような一つのオリゴマー化合物、優れた素晴らしいハイブリダイゼーション特性を持つことを示しているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(PNA)として言及される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンはアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンに置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接あるいは間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.:5,539,082;5,714,331;および5,719,262を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら(Science, 1991, 254, 1497-1500)に見つけられる。
【0038】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオシドであり、そして特に、上記で参照される米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-〔メチレン(メチルイミノ)あるいはMMIバックボーンとして知られている〕、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-O-N(CH3)-CH2-CH2-〔ここで、本来のホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-として示される〕、および上記で参照される米国特許 5,602,240のアミドバックボーンである。また、上記で参照される米国特許5,034,506のモルホリノバックボーン構造を持つオリゴヌクレオチドも好ましい。
【0039】
修飾オリゴヌクレオチドは一つあるいはそれ以上の置換糖部分も含有しうる。好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位に以下のものの一つを含む:OH;F;O-、S-、あるいはN-アルキル;O-、S-、あるいはN-アルケニル;O-、S-あるいはN-アルキニル;あるいはO-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換あるいは非置換のC1からC10アルキル、あるいはC2からC10アルケニルおよびアルキニルでありうる。O〔(CH2)nO〕mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON〔(CH2)nCH3,〕〕2は特に好ましく、ここでのnおよびmは1から約10までである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位に以下のものの一つを含む:C1からC10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルあるいはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、あるいはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基および同様な特性を持つ置換基。好ましい修飾は、アルコキシアルコキシ基、2'-メトキシエトキシ(2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)あるいは2'-MOEとしても知られる)を含む(Martinら、Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)。さらなる好ましい修飾は、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基を含む。
【0040】
他の好ましい修飾は、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)、および2'-フルオロ(2'-F)を含む。同様な修飾はオリゴヌクレオチドの他の部位、特に3'末端ヌクレオチド、あるいは2'-5'結合オリゴヌクレオチドにおける糖の3'部位および5'末端ヌクレオチドの5'部位でもおこなわれうる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物も持ちうる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.:4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053l 5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;および5,700,920を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。
【0041】
オリゴヌクレオチドはヌクレオ塩基(しばしば当該技術分野において簡単に“塩基”として言及される)修飾あるいは置換も含みうる。ここで使用されるように、“非修飾の”あるいは“天然の”ヌクレオ塩基は、プリン塩基のアデニン(A)およびグアニン(G)、およびピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。修飾ヌクレオ塩基は、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン、などの他の合成および天然のヌクレオ塩基を含む。さらなるヌクレオ塩基は、米国特許No. 3,687,808にて開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering(pp. 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990)にて開示されるもの、Englischら(Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613)により開示されるもの、およびSanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B.編、Antisense Research and Applications(CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 289-302)にて開示されるものを含む。これらのヌクレオ塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和力を高めるのに特に有用である。これらには、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンを含み、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6-1.2℃増加することを示し(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, 1993, CRC Press, Boca Raton, pp. 276-278)、現在では好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾との組合せ時はより一層特別に好ましい。
【0042】
上記記載の修飾ヌクレオ塩基の特定のものならびに他の修飾ヌクレオ塩基の調製を教示する代表的な米国特許は、上記記載のU.S. 3,687,808、ならびにU.S.:4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;5,681,941;および5,750,692を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。
【0043】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞性分布あるいは細胞性取り込みを亢進する一つあるいはそれ以上の部分あるいは結合部をオリゴヌクレオチドに対して化学的に結合することを含む。そのような部分は、コレステロール部分(Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1059)、チオエステル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharanら、Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309;Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauserら、Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールあるいはウンデシル残基(Saison-Behmoarasら、EMBO J., 1991, 10, 1111-1118;Kabanovら、FEBS Lett., 1990, 259, 327-330;Svinarchukら、Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールあるいはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654;Sheaら、Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミンあるいはポリエチレングリコール鎖(Manoharanら、Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、あるいはアダマンタン酢酸(Manoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishraら、Biochim. Biophys. Acta., 1995, 1264, 229-237)、あるいはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)などの脂質部分を含むが、それらには限定されない。
【0044】
そのようなオリゴヌクレオチド結合物の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.:4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717;5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241;5,391,723;5,416,203;5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928および5,688,941、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。
【0045】
与えられた化合物の全ての部分にとって一様に修飾することは必ずしも必要ではなく、実際に前記の修飾の一つ以上は単一の化合物中に、あるいはオリゴヌクレオチド内の単一のオリゴヌクレオシドにおいてさえ取り込まれうる。本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈において、“キメラの”アンチセンス化合物あるいは“キメラ”は、二つあるいはそれ以上の化学的に別個な領域を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドであり、それらは各々少なくとも一つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド、で構成されている。これらのオリゴヌクレオチドは典型的に少なくとも一つの領域を含み、ここで標的核酸についてヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞性取り込み、および/あるいは増加した結合親和力をオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが修飾される。オリゴヌクレオチドの追加的な領域は、RNA:DNAあるいはRNA:RNAハイブリッドを開裂させうる酵素のための基質として機能しうる。例として、RNase HはRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を開裂させる細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、RNase Hの活性化によりRNA標的が開裂し、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率がより大きく亢進する。RNA標的の開裂は日常的にゲル電気泳動により、もし必要ならば、当該技術分野で知られる関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により検出できる。
【0046】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記したように、二つあるいはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/あるいはオリゴヌクレオチド模倣物の合成構造物として形成されうる。そのような化合物は当該技術分野においてハイブリッドあるいはギャップマーとしても言及されている。そのようなハイブリッド構造物の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.:5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;および5,700,922、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。
【0047】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、固相合成のよく知られる技術を通して都合良く日常的に作製されうる。そのような合成の装置は、例えば、アプライドバイオシステムズ(Foster City, CA)を含むいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野で知られるそのような合成のいくつかの他の手段は、追加的にあるいは代替的に使用されうる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために、同様な技術を使用することはよく知られている。
【0048】
本発明のアンチセンス化合物はin vitroで合成され、アンチセンス分子のin vivoでの合成を指向するために設計される生物学的起源、あるいは遺伝的ベクター構築物のアンチセンス組成物は含まない。
【0049】
本発明の化合物は、その他の分子、分子構造物あるいは化合物の混合物、例えば、取り込み、分散および/あるいは吸収を援助するためのリポソーム、レセプター標的分子、経口用、直腸用、局所用あるいはその他の製剤、と混合され、カプセルに包まれ、あるいはそうでなければ結合されうる。そのような取り込み、分散および/あるいは吸収を援助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.:5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;および5,595,756、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。
【0050】
本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩類、エステル、あるいはそのエステルの塩類、あるいはヒトを含めた動物に投与する際に、生物学的に活性な代謝産物あるいはその残余を(直接的あるいは間接的に)提供することができる他の化合物を含む。それゆえ、例えば、本開示は本発明の化合物のプロドラッグおよび医薬的に許容可能な塩類、そのようなプロドラッグの医薬的に許容可能な塩類、およびその他の生物学的等価物に対しても作成される。
【0051】
“プロドラッグ”という用語は、体内あるいはその細胞内で、内在性酵素あるいは他の化学物質および/あるいは条件によって活性型(すなわち、薬剤)に変換される、不活性型で調製される治療的薬剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、WO 93/24510あるいはWO 94/26764において開示される方法に従って、SATE〔(S-アセチル-2-チオエチル)リン酸〕誘導体として調製される。
【0052】
“医薬的に許容可能な塩類”という用語は、本発明の化合物の生理学的および医薬的に許容可能な塩類:すなわち、親化合物の所望する生物学的活性を保持し、それに対する所望しない毒物学的な効果を与えない塩類である。
【0053】
医薬的に許容可能な塩基付加塩類は、アルカリおよびアルカリ土類金属あるいは有機アミンなどの、金属あるいはアミンで形成される。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカイン(例えば、Bergeら、“Pharmaceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照)。前記酸性化合物の塩基付加塩類は、十分な量の所望する塩基と遊離酸型を接触させることにより調製され、従来の様式で塩類を産生する。遊離酸型は、酸と塩類型を接触させ、従来の様式で遊離酸を分離することにより再生されうる。遊離酸型は、極性溶媒中での安定性などの特定の物理的特性において、それら各々の塩類型と多少は異なっているが、それ以外については、塩類はそれら各々の遊離酸と本発明の目的にとって等価である。ここで使用されるように、“医薬的な付加塩類”は、本発明の組成物の成分の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩類を含む。これらはアミンの有機あるいは無機酸性塩類を含む。好ましい付加塩類は、塩酸、酢酸、サリチル酸、硝酸およびリン酸などの酸性塩類である。その他の適した医薬的に許容可能な塩類は当業者によく知られており、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸あるいはリン酸などの無機酸を有するもの;例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸(glucaric acid)、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸(mandelic acid)、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボル酸(embolic acid)、ニコチン酸あるいはイソニコチン酸などの有機物カルボン酸、スルホン酸、硫酸あるいはリン酸あるいはN-置換スルファミン酸を有するもの;例えばグルタミン酸あるいはアスパラギン酸など、およびフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-あるいは3-ホスホグリセレート、グルコース-6-ホスフェート、(シクラメートの形成を伴う)N-シクロヘキシルスルファミン酸などの天然のタンパク質合成に関連する20のアルファ-アミノ酸などのアミノ酸を有するもの、あるいはアスコルビン酸などのその他の有機化合物を有するもの、の様々な無機あるいは有機酸の塩基性塩類を含む。化合物の医薬的に許容可能な塩類はまた、医薬的に許容可能な陽イオンを用いて調製されうる。適した医薬的に許容可能な陽イオンは当業者によく知られており、アルカリ陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよび第四アンモニウム陽イオンを含む。炭酸塩あるいは炭酸水素塩も可能である。
【0054】
オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩類の好ましい例は、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンで形成される塩類;(b)例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、その他の無機酸で形成される酸付加塩類;(c)例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸で形成される塩類;(d)塩素、臭素、およびヨウ素などの元素状態での陰イオンで形成される塩類、を含むが、これらには限定されない。
【0055】
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防のためおよび研究用試薬およびキットとして使用できる。治療のために、一つあるいはそれ以上の新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートすることで治療できる疾患あるいは障害を持つと疑われる動物、好ましくはヒトは、本発明に従ってアンチセンス化合物を投与することで治療される。本発明の化合物は、適した医薬的に許容可能な希釈剤あるいはキャリアーに効果的な量のアンチセンス化合物を加えることにより、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、例えば予防的に、例えば炎症あるいは腫瘍形成を阻止するためあるいは遅らせるために、有用でありうる。
【0056】
本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物が新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸とハイブリダイズし、サンドイッチおよびその他のアッセイを本事実を利用するために容易に組み立てることが可能になるため、研究および診断にとって有用である。新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸と本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、当該技術分野で知られる手段により検出できる。そのような手段は、オリゴヌクレオチドと酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射性標識あるいはその他の適する検出手段を含みうる。試料中の新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質のレベルを検出するためのそのような検出手段を使用するキットも調製されうる。
【0057】
本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所性あるいは全身性の治療のどちらが望ましいかに依存し、および治療すべき部位に依存する多くの方法において投与されうる。投与は、局所的投与(眼を含みおよび膣および直腸運搬を含む粘膜に対して)、例えばネブライザーを含む、粉末あるいはエアロゾルの吸入あるいは吹き付けによる肺への投与;胸腔内、鼻腔内、表皮および経皮、経口あるいは非経口でありうる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内あるいは筋肉内注射あるいは注入;あるいは例えば髄腔内あるいは脳室内などの頭蓋内投与を含む。少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル修飾をもつオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると信じられている。
【0058】
局所的な投与のための医薬組成物および製剤は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体および粉末を含みうる。従来の医薬的キャリア、水性、粉末あるいは油性基剤、濃縮剤などは必要であり、あるいは望ましい場合がある。コートされたコンドーム、グローブおよびその他も有用でありうる。
【0059】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末あるいは顆粒、水あるいは非水性の媒質における懸濁液あるいは溶液、カプセル、サシェあるいは錠剤、を含む。濃縮剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤(dispersing aids)あるいは結合剤は所望されうる。
【0060】
非経口、鞘内(intrathecal)あるいは脳室内投与のための組成物は、緩衝液、希釈剤および浸透亢進剤、キャリアー化合物およびその他の医薬的に許容可能なキャリアーあるいは補形薬など(これらには限定されない)のその他の適した添加物も含みうる、滅菌した水性溶液を含みうる。
【0061】
本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および/あるいは製剤は、オリゴヌクレオチドの食餌性運搬を亢進するための浸透亢進剤を含んでもよい。浸透亢進剤は五つの広範なカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤および非界面活性剤、の一つに属するように分類されうる(Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33)。これらの広範なカテゴリーの一つあるいはそれ以上から、一つあるいはそれ以上の浸透亢進剤が含まれうる。
【0062】
浸透亢進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、リシンリエート、モノオレイン(別名、1-モノオレオイル-rac-グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセリド、およびそれらの生理学的に許容可能な塩類(すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート、など)を含む(Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 91-192;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33;El-Haririら、J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654)。いくつかの現在の好ましい脂肪酸の例は、カプレートナトリウムおよびラウレートナトリウムであり、0.5から5%の濃度で単独であるいは組み合わせて使用される。
【0063】
胆汁の生理学的な役割は、脂質および脂溶性ビタミンの分散と吸収を容易にすることを含む(Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardmanら、eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996,pages 934-935)。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体は浸透亢進剤として作用する。従って、“胆汁酸塩”という用語は、天然に生じる胆汁の構成要素のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。現在の好ましい胆汁酸塩は、ケノデオキシコール酸(CDCA)(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)であり、一般に0.5から2%の濃度で使用される。
【0064】
一つあるいはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を使用することができる。例えば、胆汁酸塩を脂肪酸と共に使用し、複合製剤を作りうる。好ましい組み合わせは、CDCAをカプレートナトリウムあるいはラウレートナトリウム(一般に0.5から5%)と組み合わせることを含む。
【0065】
キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチレート(例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよびホモバニレート(homovanilate))、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9(laureth-9)およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体(エナミン)を含むが、これらには限定されない(Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-192;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33;Buurら、J. Control Rel., 1990, 14, 43-51)。キレート剤は、DNase阻害剤としても機能するというさらなる利点を有する。
【0066】
界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル(Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191);およびFC-43などのパーフルオロケミカルエマルジョン(perfluorochemical emulsions)(Takahashら、J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252-257)、を含む。
【0067】
非界面活性剤は、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体(Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191);およびジクロフェナックナトリウム(diclofenac sodium)、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤(Yamashitaら、J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)、を含む。
【0068】
ここで使用されるように、“キャリア化合物”は核酸、あるいはその類似体に言及し、それは不活性である(すなわち、それ自体が生物学的活性を持っていない)が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、あるいは循環系からそれを除去することを促進することによって、生物学的活性を持つ核酸の生物学的利用能を減少させるin vivoでの過程により、核酸として認識される。核酸とキャリア化合物を、典型的に過剰量の後者の物質とともに共投与(coadministration)すると、おそらく共通のレセプターに対するキャリア化合物と核酸の間での競合のため、肝臓、腎臓あるいは他の循環外貯蔵器において回収される核酸の量の実質的な減少を引き起こすことができる。例えば、肝臓組織における部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸あるいは4-アセトアミド-4'-イソチオシアノ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸と共投与されるときに減少する(Miyaoら、Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121;Takakuraら、Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。
【0069】
キャリア化合物に対して、“医薬的に許容可能なキャリア”(補形薬)は、医薬的に許容可能な溶剤、懸濁剤、あるいは動物に一つあるいはそれ以上の核酸を運搬するための他のいずれかの医薬的に不活性なビヒクル、である。医薬的に許容可能なキャリアは液体あるいは固体であってもよく、核酸と所定の医薬組成物の他の要素を組み合わせるとき、望ましい量、濃度などを供給するために、考えた計画された投与様式と共に選択される。典型的な医薬的に許容可能なキャリアは、結合剤(例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンあるいはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);増量剤(例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性のセルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化シリコン、ステアリン酸、金属ステアレート、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);分解剤(例えば、デンプン、グリコール酸デンプンナトリウムなど);あるいは湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)、を含むが、それらには限定されない。経口的に投与された用量剤形のための、持続的放出経口運搬システムおよび/あるいは腸コーティングは、米国特許No. 4,704,295;4,556,552;4,309,406;および4,309,404に記載され、それらは参考文献として援用される。
【0070】
本発明の組成物は、医薬組成物において、その技術的に確立した使用レベルで従来から見いだされる他の補助的要素を追加的に含みうる。従って、例えば、組成物は、例えば、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤あるいは抗炎症剤などの、追加的な互換性のある医薬的に活性をもつ物質を含んでもよく、あるいは色素、着香料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、濃縮剤および安定剤などの、本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加的な物質を含有してもよい。しかし、そのような物質は、追加するとき、本発明の組成物の要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。
【0071】
本発明のアンチセンス化合物が患者に導入される方法に関わらず、コロイド状の分散システムは運搬ビヒクルとして使用され、in vivoでの化合物の安定性を亢進し、および/あるいは特定の器官、組織あるいは細胞型を化合物の標的としうる。コロイド状の分散システムは、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび特徴付けられていない構造の脂質:オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質ベースシステムを含むが、それらには限定されない。好ましいコロイド状の分散システムは多数のリポソームである。リポソームは、二重層構造において配置される脂質で構成される、一つあるいはそれ以上の外層によって囲まれる水性コアをもつ顕微鏡的球体である(一般的に、Chonnら、Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708参照)。
【0072】
本発明のある態様は、リポソームおよび(a)一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物および(b)非アンチセンス機構により機能する一つあるいはそれ以上の他の化学療法剤を含むその他の組成物を提供する。そのような化学療法剤の例は、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン(CA)、5-フルオロウラシル(5-FU)、フロキシウリジン(5-FUdR)、メトトレキサート(MTX)、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド(teniposide)、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール(DES)、などのアンチセンサー薬剤を含むが、これらには限定されない。一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkowら、eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 1206-1228を参照のこと。抗炎症薬剤は非ステロイド抗炎症薬剤およびコルチコステロイドを含むが、これらには限定されず、抗ウイルス薬剤はリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むが、これらには限定されず、本発明の組成物において組み合わせることもありうる。一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkowら、eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 2499-2506および46-49を各々参照のこと。その他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内にある。二つあるいはそれ以上を組み合わせた化合物は、一緒にあるいは連続して使用されうる。
【0073】
もう一つの関連する態様では、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする一つあるいはそれ以上の追加のアンチセンス化合物を含みうる。二つあるいはそれ以上を組み合わせた化合物は、一緒にあるいは連続して使用されうる。
【0074】
治療的組成物の製剤化およびそれらに続く投与は、当業者の技術内にあると信じられている。投薬は、治療すべき疾患状態の深刻さおよび反応性に依存しており、数日間から数ヶ月、あるいは治療が効果を示すか、あるいは疾患状態の減少が達せられるまで続く一連の治療をともなう。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬剤の蓄積を測定することから算出できる。当業者は、最適な投与量、投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変化してもよく、in vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であると判断された EC50を基準にして一般的に評価できる。一般的に、投与量は体重1 kgあたり0.01μgから100 gであり、毎日、一週間、一ヶ月間あるいは一年間に一回あるいはそれ以上、あるいは2年から20年ごとに一回で与えうる。当業者は、体液あるいは組織内の薬剤の残留時間、および濃度の測定に基づき、投薬のための反復頻度を容易に見積もることができる。成功した治療に続いて、患者は維持治療を受けて疾患状態の再発を防ぐことが望ましく、そこではオリゴヌクレオチドは体重1 kgあたり0.01μgから100 gの範囲で、毎日一回かあるいはそれ以上から20年ごとに一回の範囲で、維持用量を投与される。
【0075】
本発明は、その好ましい態様に従って詳細に記載している一方で、以下の実施例は本発明を説明するためにのみ提供するが、同じものに限定する意図はない。
【0076】
【実施例】
実施例1:オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシおよび2'-アルコキシアミダイト
2'-デオキシおよび2'-メトキシベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業的な供給源(例えば、Chemgenes, Needham, MAあるいはGlen Research, Inc. Sterling, VA)から購入した。その他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、米国特許5,506,351に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。2'-アルコキシアミダイトを使用して合成されたオリゴヌクレオチドについては、テトラゾールおよび塩基のパルス運搬後の待機ステップが360秒に増加することを除いて、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準的なサイクルを利用した。
【0077】
5-メチル-2'-デオキシシチジン(5-Me-C)ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なホスホールアミダイト(Glen Research, Sterling, VA or ChemGenes, Needham, MA)を使用して刊行された方法(Sanghviら、Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203)に従って合成した。
【0078】
2'-フルオロアミダイト
2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用される、Kawasakiら(J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841)およびU.S.特許5,670,633により以前に記載されたように合成した。簡略すると、保護化されたヌクレオシドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2’-フルオロアデノシンは、開始物質として商業的に入手可能な9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンを使用して、文献の手順を改良して、2'-アルファ-フルオロ原子を2'-ベータ-O-トリチル基のSN2-置換によって導入されるようにすることにより合成された。このように、 N6-ベンゾイル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として中程度の収量において選択的に保護化された。THPおよびN6-ベンゾイル基の脱保護は標準的な方法を使用して達せられ、標準的な方法を使用して、5'-ジメトキシトリチル-(DMT)および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイト中間体を得た。
【0079】
2'-フルオロデオキシグアノシン
2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、開始物質としてテトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)保護化9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニン、および中間体ジイソブチリル-アラビノフラノシルグアノシンへの転化を使用して達せられた。TPDS基の脱保護の後、THPによるヒドロキシ基の保護化を行い、ジイソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO-脱アシル化およびトリフラート化の後に、フッ化物をともなう粗精製物の処理を行い、そしてTHP基の脱保護を行った。標準的な方法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイトを得た。
【0080】
2'-フルオロウリジン
2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-無水-1-ベータ-D-アラビノフラノシルウラシルを70%フッ化水素-ピリジンで処理する文献の手順の改良により達せられた。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイトを得た。
【0081】
2'-フルオロデオキシシチジン
2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのアミノ化を経て合成され、その後選択的な保護化を行ってN4-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンを得た。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイトを得た。
【0082】
2'-O-(2-メトキシエチル)修飾アミダイト
2'-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは以下のように、あるいは代替的に、Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法により調製する。
【0083】
2,2'-無水〔1-(ベータ-D-アラビノフラノシル)-5-メチルウリジン〕
5-メチルウリジン(リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから商業的に入手可能)(72.0 g、0.279 M)、ジフェニルカーボネート(90.0 g、0.420 M)および重炭酸ナトリウム(2.0 g、0.024 M)をDMF(300 mL)に加えた。混合液を撹拌しながら加熱して還流して、放出する二酸化炭素ガスを制御様式で放出させた。1時間後、わずかに暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップを撹拌しながらジエチルエーテル(2.5 L)に注いだ。産生物はガムを形成した。エーテルをデカントし、残留物を最少量のメタノール(約400 mL)に溶解した。溶液を新鮮なエーテル(2.5 L)に注ぎ、固いガムを得た。エーテルをデカントし、ガムを真空オーブンで乾燥させて(60℃、1 mmHgで24時間)固体を得、それを粉砕して淡い黄褐色の粉末を得た(57 g、85%の粗収量)。NMRスペクトルは構造物と一致し、そのナトリウム塩としてフェノール(約5%)で汚染されていた。その物質はさらなる反応のため現状のままで使用し、あるいはエチル酢酸中のメタノール濃度勾配(10-25%)を使用したカラムクロマトグラフィーによりさらに精製して、白色固体、mp 222-4℃を得た。
【0084】
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン
2,2'-無水-5-メチルウリジン(195 g、0.81 M)、トリス(2-メトキシエチル)ホウ酸塩(231 g、0.98 M)および2-メトキシエタノール(1.2 L)を2 Lステンレススチール圧力容器に加え、160℃のあらかじめ加熱したオイルバスに置いた。155-160℃で48時間の加熱後、容器を開け、溶液を蒸発させて乾燥させ、MeOH(200 mL)を用いて研磨した。残留物を熱アセトン(1 L)に懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン(150 mL)で洗浄し、濾液を蒸発させた。残留物(280 g)をCH3CN(600 mL)に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム(3 kg)を0.5% Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)中にパックした。残留物をCH2Cl2(250 mL)に溶解し、シリカ(150 g)に吸着させ、その後カラムにロードした。産生物をパッキング溶媒で溶出し、160 g(63%)の産生物を得た。さらなる物質は不純画分を再精製することで得た。
【0085】
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(160 g、0.506 M)をピリジン(250 mL)と共蒸発し、乾燥した残留物をピリジン(1.3 L)に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの最初のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、混合液を室温で1時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、反応液をさらに1時間撹拌した。そしてメタノール(170 mL)を加え、反応を停止した。HPLCの結果、約70%の産生物が存在することが示された。溶媒を蒸発させ、CH3CN(200 mL)を用いて研磨した。残留物をCHCl3(1.5 L)に溶解し、2×500 mLの飽和NaHCO3および2×500 mLの飽和NaClを用いて抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させて濾過し、蒸発させた。275 gの残留物を得た。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、パックして0.5% Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で溶出した。純粋画分を蒸発させ、164 gの産生物を得た。さらに約20 gを不純粋画分から得て、183 g(57%)の総収量を得た。
【0086】
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(106 g、0.167 M)、DMF/ピリジン(562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した750 mL の3:1混合液)および無水酢酸(24.38 mL、0.258 M)を混合して、室温で24時間撹拌した。MeOHを添加してtlc試料を最初に急冷することにより、tlcにより反応をモニターした。tlcにより判断して反応の完了の際、MeOH(50 mL)を加え、混合液を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl3(800 mL)に溶解し、2×200 mLの飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200 mLの飽和NaClを用いて抽出し直した。水層をふたたび200 mLのCHCl3で抽出した。混合した有機物を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて蒸発させ、122 gの残留物を得た(約90%産物)。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、EtOAc/ヘキサン(4:1)を使用して溶出した。純粋産物画分を蒸発させて96 g(84%)を産生した。後の画分からさらに1.5 gを回収した。
【0087】
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン
最初の溶液はCH3CN(700 mL)に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(96g、0.144 M)を溶解することにより調製し、取っておいた。トリエチルアミン(189 mL、1.44 M)をCH3CN(1 L)中のトリアゾール(90 g、1.3 M)溶液に加え、-5℃に冷却してオーバーヘッドスターラーを使用して0.5時間撹拌した。POCl3を0-10℃に維持された撹拌溶液に一滴ずつ30分間にわたり加え、得られた混合物をさらに2時間撹拌した。最初の溶液を後の溶液に一滴ずつ45分間にわたり加えた。得られた反応混合液をコールドルームで一晩保存した。塩を反応混合液から濾過し、溶液を蒸発させた。残留物をEtOAc(1 L)に溶解し、不溶性の固体を濾過により除去した。濾過物を1×300 mLのNaHCO3および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて蒸発させた。残留物をEtAOcを用いて研磨し、表題化合物を得た。
【0088】
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
ジオキサン(500 mL)中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン(103 g、0.141 M)とNH4OH(30 mL)の溶液を室温で2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をMeOH(2×200 mL)と共沸した。残留物をMeOH(300 mL)に溶解し、2リットルのステンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH(400 mL)を加え、容器を100℃で2時間加熱した(tlcは完全な転化を示した)。容器内容物を蒸発させて乾燥させ、残留物をEtOAc(500 mL)に溶解し、飽和NaCl(200 mL)で一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸発させて、85 g(95%)の表題化合物を得た。
【0089】
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(85 g、0.134 M)をDMF(800 mL)に溶解して、安息香酸無水物(37.2 g、0.165 M)を撹拌しながら加えた。3時間の撹拌後、tlcは反応が約95%完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残留物をMeOH(200 mL)と共沸した。残留物をCHCl3(700 mL)に溶解し、飽和NaHCO3(2×300 mL)および飽和NaCl(2×300 mL)を用いて抽出して、MgSO4で乾燥させて蒸発させ、残留物(96 g)を得た。残留物を、溶出溶媒として0.5% Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン(1:1)を使用して、1.5 kgのシリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分を蒸発させて、90 g(90%)の表題化合物を得た。
【0090】
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン-3'-アミダイト
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(74 g、0.10 M)をCH2Cl2(1 L)に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1 g)および2-シアノエトキシテトラ(イソプロピル)亜リン酸塩(40.5 mL、0.123 M)を、窒素雰囲気中で撹拌しながら加えた。得られた混合液を、室温で20時間撹拌した(tlcは反応が95%完了したことを示した)。反応混合液を、飽和NaHCO3(1×300 mL)および飽和NaCl(3×300 mL)を用いて抽出した。水性洗浄液をCH2Cl2(300 mL)で再び抽出し、抽出物を混合してMgSO4で乾燥させて濃縮した。得られた残留物を、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン(3:1)を使用して、1.5 kgのシリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分を混合して、90.6 g(87%)の表題化合物を得た。
【0091】
2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト
2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野では、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られる〕を、次のパラグラフに記載するように調製する。アデノシン、シチジンおよびグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシンおよびシチジンの場合はベンゾイル部分を用いて、またグアノシンの場合はイソブチリルを用いて、保護されることを除き、チミジン(5-メチルウリジン)と同様に調製される。
【0092】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン
O2-2'-無水-5-メチルウリジン(Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0 g、0.416 mmol)、ジメチルアミノピリジン(0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol)を、アルゴン雰囲気中で機械的に撹拌しながら、周囲の温度で乾燥ピリジン(500 mL)に溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン(125.8 g、119.0 mL、1.1 eq、0.458 mmol)を一度に加えた。反応液を周囲の温度で16時間撹拌した。TLC(Rf 0.22、エチル酢酸)は反応完了を示した。溶液を減圧下で濃縮し、濃厚なオイル(thick oil)にした。これを、ジクロロメタン(1 L)および飽和重炭酸ナトリウム(2×1 L)およびブライン(1 L)の間で分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して濃厚なオイルにした。オイルを、エチル酢酸とエチルエーテルの1:1混合液(600 mL)に溶解し、溶液を-10℃まで冷却した。得られた結晶性産物を濾過して集め、エチルエーテル(3×200 mL)で洗浄して乾燥し(40℃、1 mmHg、24時間)、149 g(74.8%)の白色固体とした。TCLおよびNMRは純粋産物と一致した。
【0093】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン
2 Lのステンレススチール中で撹拌しない圧力反応器に、テトラヒドロフラン中のボラン(1.0 M、2.0 eq、622 mL)を加えた。ドラフトチャンバー(fume hood)内において手動で撹拌しながら、エチレングリコール(350 mL,過剰量)を、最初は水素ガスの放散が静まるまで注意深く加えた。5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン(149 g、0.311 mol)および重炭酸ナトリウム(0.074 g、0.003 eq)を手動で撹拌しながら加えた。反応器を密閉し、容器内の温度が160℃に達するまでオイルバスで加熱し、その後16時間維持した(圧力< 100 psig)。反応容器を周囲の温度まで冷却して開けた。TLC(所望する産生物のRfは0.67およびara-T副産物のRfは0.82、エチル酢酸)は、約70%が産生物に転化したことを示した。さらなる副産物の形成を避けるために、反応を停止し、温水バス(40〜100℃)中にて、減圧下(10から1 mmHg)でエチレングリコールを除去するために使用されるより極度の条件により濃縮した。〔あるいは、一度低温煮沸溶媒を除去して、残りの溶液をエチル酢酸と水の間で分配できる。産生物は有機層に存在しうる。〕残留物をカラムクロマトグラフィー(2 kgシリカゲル、1:1から4:1のエチル酢酸-ヘキサン勾配)にて精製した。適当な画分を混合し、ストリッピングおよび乾燥させて、白色のパリパリした(crisp)泡状物として産生物とし、汚染された(contaminated)開始物質(17.4 g)および純粋な再利用可能な開始物質20 gを産生した。収率は、開始物質を基準としており、より純度の低い回収された開始物質の収率は58%であった。TLCおよびNMRは99%の純粋産生物と一致した。
【0094】
2'-O-(〔2-フタルイミドオキシ)エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン(20 g、36.98 mmol)を、トリフェニルホスフィン(11.63 g、44.36 mmol)およびN-ヒドロキシフタルイミド(7.24 g、44.36 mmol)と混合した。そして、それを40℃で2日間、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。反応混合液をアルゴンでフラッシュし、乾燥THF(369.8 mL、Aldrich、確実に密閉するボトル)を加えて、透明な溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキシレート(6.98 mL、44.36 mmol)を反応混合液に一滴ずつ加えた。加える速度は、得られた濃赤色が次の一滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が完了した後、反応液を4時間撹拌した。その時までに、TLCは反応の完了を示した(エチル酢酸:ヘキサン、60:40)。溶媒を真空中で蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラム上に置き、エチル酢酸:ヘキサン(60:40)を用いて溶出し、白色の泡状物として2'-O-(〔2-フタルイミドオキシ)エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジンを得た(21.819、86%)。
【0095】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔(2-ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕-5-メチルウリジン
2'-O-(〔2-フタルイミドオキシ)エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン(3.1 g、4.5 mmol)を乾燥CH2Cl2(4.5 mL)に溶解し、メチルヒドラジン(300 mL、4.64 mmol)を-10℃から0℃で一滴ずつ加えた。1時間後、混合液を濾過し、濾過物を氷冷CH2Cl2で洗浄して、混合有機層を水、ブラインで洗浄して、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮して2'-O-(アミノオキシエチル)チミジンを得て、次にそれをMeOH(67.5 mL)に溶解した。これに、ホルムアルデヒド(20%水溶液、w/w、1.1eg.)を加え、1時間混合した。溶媒を真空下で除去した;残留物をクロマトグラフィーにかけて、白色の泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔(2-ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕-5-メチルウリジンを得た(1.95、78%)。
【0096】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジメチルアミノオキシエチル〕-5-メチルウリジン
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔(2-ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕-5-メチルウリジン(1.77 g、3.12 mmol)を、乾燥MeOH(30.6 mL)中の1 Mピリジニウムp-トルエンスルホネート(PPTS)溶液中に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム(0.39 g、6.13 mmol)をこの溶液に不活性雰囲気のもと10℃で加えた。反応混合液を10℃で10分間撹拌した。反応容器を氷冷バスから取り出して室温で2時間撹拌した後、反応をTLC(CH2Cl2中の5% MeOH)にてモニターした。水性NaHCO3溶液(5%、10 mL)を加え、エチル酢酸(2×20 mL)を用いて抽出した。エチル酢酸層を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。残留物を、MeOH(30.6 mL)中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド(20% w/w、30 mL、3.37 mmol)を加え、反応混合液を室温で10分間撹拌した。反応混合液を氷冷バス中で10℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム(0.39 g、6.13 mmol)を加えて、反応混合液を10℃で10分間撹拌した。10分後、反応混合液を氷冷バスから取り出して室温で2時間撹拌した。反応混合液に5% NaHCO3(25 mL)溶液を加え、エチル酢酸(2×25 mL)を用いて抽出した。エチル酢酸層を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、CH2Cl2中の5% MeOHを用いて溶出して、白色の泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジメチルアミノオキシエチル〕-5-メチルウリジンを得た(14.6 g、80%)。
【0097】
2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオライド(triethylamine trihydrofluoride)(3.91 mL、24.0 mmol)を乾燥THFおよびトリエチルアミン(1.67 mL、12 mmol、乾燥、KOHで保存)に溶解した。次に、このトリエチルアミン-2HF混合液を5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジメチルアミノオキシエチル〕-5-メチルウリジン(1.40 g、2.4 mmol)に加え、室温で24時間撹拌した。反応をTLC(CH2Cl2中の5% MeOH)にてモニターした。溶媒を真空中下で除去し、残留物をフラッシュカラム上に置き、CH2Cl2中の10%MeOHを用いて溶出して、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジンを得た(766 mg、92.5%)。
【0098】
5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン
2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン(750 mg、2.17 mmol)を40℃で一晩、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。次に、それを無水ピリジン(20 mL)を用いて共蒸発させた。得られた残留物をアルゴン雰囲気下でピリジン(11 mL)に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン(26.5 mg、2.60 mmol)、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(880 mg、2.60 mmol)を混合液に加え、反応混合液を全ての開始物質が消失するまで室温で撹拌した。ピリジンを真空中下で除去し、残留物をクロマトグラフィーにかけて、CH2Cl2中の10% MeOHを用いて溶出して(数滴のピリジンを含有する)、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジンを得た(1.13 g、80%)。
【0099】
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-〔(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン(1.08 g、1.67 mmol)をトルエン(20 mL)と共蒸発させた。残留物にN,N-ジイソプロピルアミンテトラゾニド(tetrazonide)(0.29 g、1.67 mmol)を加え、40℃で一晩、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。次に、反応混合液を無水アセトニトリル(8.4 mL)に溶解し、2-シアノエチル-N,N,N1,N1-テトライソプロピルホスホールアミダイト(2.12 mL、6.08 mmol)を加えた。反応混合液を不活化雰囲気のもと室温で4時間撹拌した。反応の進行をTLC(ヘキサン:エチル酢酸 1:1)によりモニターした。溶媒を蒸発させ、そして残留物をエチル酢酸(70 mL)に溶解して、5%水性NaHCO3(40 mL)で洗浄した。エチル酢酸層を無水Na2SO4で乾燥させて濃縮した。得られた残留物をクロマトグラフィーにかけて(溶出剤としてエチル酢酸)、泡状物として5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-〔(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト〕を得た(1.04 g、74.9%)。
【0100】
実施例2
オリゴヌクレオチド合成
非置換および置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドは、自動化DNAシンセサイザー(Applied Biosystems model 380B)において、ヨウ素による酸化をともなう標準的なホスホールアミダイト化学を使用して合成される。
【0101】
ホスホロチオエート(P=S)は、標準的な酸化ボトルを、亜リン酸結合の段階的なチア化のためにアセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-二酸化物の0.2 M溶液に換えることを除いて、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのように合成される。チア化待機ステップを68秒まで増加して、キャッピングステップを続けた。55℃(18時間)における濃縮水酸化アンモニウム中でのCPGカラムからの開裂および脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl溶液から2.5容量のエタノールを用いて二回沈殿して精製した。
【0102】
亜リン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許5,508,270に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許4,469,863に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
【0103】
3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許5,610,289あるいは5,625,050に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
【0104】
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許5,256,775あるいは米国特許5,366,878に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
【0105】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、公開されたPCT出願PCT/US94/00902 およびPCT/US93/06976(各々WO 94/17093およびWO 94/02499として公開される)に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
【0106】
3'-デオキシ-3'-アミノホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許5,476,925に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
【0107】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許5,023,243に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
ボラノホスフェート(borano phosphate)オリゴヌクレオチドは、米国特許 5,130,302および5,177,198に記載されるように調製され、いずれも本明細書中に参考文献として援用される。
【0108】
実施例3
オリゴヌクレオシド合成
MMI結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、アミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに例えば、交互のMMIおよびP=OあるいはP=S結合を有する混合バックボーン化合物は、米国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240および5,610,289に記載されるように調製され、それらの全ては本明細書中に参考文献として援用される。
【0109】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許5,264,562および5,264,564に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
【0110】
エチレンオキサイド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許5,223,618に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
実施例4
PNA合成
ペプチド核酸(PNA)は、Peptide Nucleic Acids(PNA):Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23で言及される様々な手順のいずれかに従って調製される。それらは、米国特許5,539,082、5,700,922および5,719,262に従っても調製されることができ、本明細書中に参考文献として援用される。
【0111】
実施例5
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドあるいは混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型のものである可能性がある。これらは、結合オリゴヌクレオシドの“ギャップ”部分が結合ヌクレオシドの5'および3'“ウイング”部分の間に位置している最初の型、および“ギャップ”部分がオリゴマー化合物の3'あるいは5'末端のどちらかに配置している2番目の“開放末端”型、を含む。最初の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られている。2番目の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られている。
【0112】
〔2'-O-Me〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-Me〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、前記のようにアプライドバイオシステムズ 自動化DNAシンセサイザー モデル380Bを使用して合成される。オリゴヌクレオチドは、自動化シンセサイザーおよびDNA部分には2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホールアミダイト、および5'および3'ウイングには5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトを使用して合成される。標準的な合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基の運搬後の待機ステップを600秒に増加し、RNAでは4回および2'-O-メチルでは2回繰り返すことで修飾される。完全な保護化オリゴヌクレオチドは支持体から開裂し、リン酸基を3:1アンモニア/エタノール中にて室温で一晩脱保護し、そして凍結乾燥して乾燥させる。次に、メタノールアンモニア中にて室温で24時間処置を行い、全ての塩基を脱保護し、試料を再び凍結乾燥して乾燥させる。ペレットをTHF中の1 M TBAFにて室温で24時間再懸濁して2'位を脱保護する。次に、反応物を1 M TEAAで急冷(quench)して、そして試料をロトバック(rotovac)で1/2容量まで減少させた後、G25サイズの排除カラム(exclusion column)で脱塩した。次に、回収したオリゴを、収率について分光測光法的に、および純度をキャピラリー電気泳動および質量分析法にて、解析する。
【0113】
〔2'-O-(2-メトキシエチル)〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
〔2'-O-(2-メトキシエチル)〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトの2'-O-(メトキシエチル)アミダイト置換をともなう、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドの前記手順のように調製した。
【0114】
〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチオエート〕--〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチド
〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチオエート〕--〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトの2'-O-(メトキシエチル)アミダイト置換、キメラ構造物のウイング部分内でホスホジエステルヌクレオチド間結合を産生するためのヨウ素を用いた酸化、およびセンターギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を産生するための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1二酸化物(Beaucage Reagent)を利用した硫化をともなう、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての前記手順により調製される。
【0115】
その他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、米国特許5,623,065に従って調製され、本明細書中に参考文献として援用される。
【0116】
実施例6
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム(Applied Biosystems)からの開裂、および55℃、18時間の濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオシドを2.5容量のエタノールを用いて0.5 M NaClから2回の沈殿を行うことにより精製した。合成したオリゴヌクレオチドを変性ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより解析し、少なくとも85%の完全長物質であると判断した。合成において得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステルの相対的な量は、31P核磁気共鳴分光器により定期的に確認し、いくつかの研究のためにオリゴヌクレオチドを、Chiangら(J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162-18171)によって記載されるようにHPLCにより精製した。HPLC精製物質で得られた結果は、非HPLC精製物質で得られたものと同様であった。
【0117】
実施例7
新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析
新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野で知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、mRNAレベルは、ノーザンブロット解析、RNAse保護化アッセイ(RPA)、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいはリアル-タイムPCR(RT-PCR)により定量することができる。RNA解析は、総細胞性RNAあるいはポリ(A)+ mRNAで行うことができる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc., 1993, pp. 4.1.1-4.2.9および4.5.1-4.5.3)に教示されている。ノーザンブロット解析は、当該技術分野では日常的であり、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc., 1996, pp. 4.2.1-4.2.9.)に教示されている。リアル-タイム定量的(PCR)は、PE-Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能であり、製造業者の使用説明に従って使用する、商業的に入手可能なABI PRISMTM 7700 配列検出システム(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System)を使用して都合良く成し遂げることができる。PCRのその他の方法も当該技術分野において知られている。プローブおよびプライマーは、刊行された配列情報を使用して、標的核酸配列とハイブリダイズするように設計される(例えば、ヒトA1にはGenbank寄託番号U29680およびヒトmcl-1にはGenbank寄託番号L08246)。
【0118】
新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質レベルは、免疫沈降法、ウエスタンブロット解析(イムノブロッティング)、ELISA、フローサイトメトリーあるいは蛍光活性化細胞ソーティング(fluorescence-activated cell sorting)(FACS)などの当該技術分野でよく知られる様々な方法で定量することができる。bcl-2-関連タンパク質に対する抗体は同定することができ、PharMingen Inc.(San Diego CA)などの様々な供給源から得ることができ、あるいは従来の抗体産生方法により調製することができる。ポリクローナル抗血清を調製するための方法は、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1997, pp. 11.12.1-11.12.9)に教示される。モノクローナル抗体の調製は、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1997, pp. 11.4.1-11.11.5)に教示される。
【0119】
免疫沈降法は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1998, pp. 10.16.1-10.16.11)に見出すことができる。ウエスタンブロット(イムノブロット)解析は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1997, pp. 10.8.1-10.8.21)に見出すことができる。酵素-結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1991, pp. 11.2.1-11.2.22)に見出すことができる。
【0120】
実施例8
mRNAレベルの解析のためのRNAse保護化アッセイ
リボヌクレアーゼ(RNase)保護化アッセイは、発現レベルの定量にとって感受性が高く特異的な方法である(Zinnら、Cell, 1983, 34:865-79)。方法は、DNAテンプレート由来のin vitro転写32P-標識アンチ-センスRNAプローブと標的RNAのハイブリダイゼーションに基づいている。RNA処理をした後、一本鎖RNAおよび過剰なプローブを分解した。プローブおよび標的RNAは、オートラジオグラフィーあるいはベータイメージング装置を使用して視覚化された“保護化”プローブを用いて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。そのそれぞれが別個の長さであり、そしてそのそれぞれが別個のmRNA種における配列を示す一連の生物学的に関連するテンプレートを含有するテンプレートのセット(PharMingen Inc., San Diego, CA )を購入することができる。各々のテンプレートセットは、内在性の対照として働く一つあるいはそれ以上のハウスキーピング遺伝子、L32およびGAPDHに加えて、単一の反応混合中にて11種までの独自の遺伝子メッセージを検出することができる。これらのテンプレートセットは、単一試料から作成される多重決定を可能にする。マルチ-プローブRPAは、ポリ-A+ RNAをさらに精製せずに、標準的な方法により得られる全RNA調製に対して行うことができる。
【0121】
オリゴヌクレオチドは、RIBOQUANTTM RNase保護化キット(Pharmingen, San Diego, CA)を使用して、全bcl-x mRNAレベルに加えてmcl-1レベルに対するオリゴヌクレオチド各々の効果について評価された。全てのアッセイは、製造業者のプロトコルに従って行われた。簡略すると、マルチ-プローブDNAテンプレートセットを使用して、dUTP-32Pで放射性標識したアンチセンスRNA転写物を産生した。アポトーシス遺伝子に使用したテンプレートセットはヒトhAPO-2セットであった。これらの放射性標識したプローブを、典型的に10μgの全細胞性RNAと一晩ハイブリダイズした。次に、反応混合液を一本鎖RNaseで消化して保護化された断片を産生し、それを5%アクリルアミド/尿素ゲルを通して電気泳動した。保護化されたバンドをPhosphorImager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を使用して視覚化して、定量した。
【0122】
実施例9
ヒトA1発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドは、刊行された配列(Karsanら、1996, Blood 87, 3089-3096;Genbank寄託番号U29680、ここで SEQ ID NO: 1として援用される)を使用して、ヒトA1 RNAを標的とするように設計された。オリゴヌクレオチドは表1に示す。
【0123】
表1
ヒトA1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
“Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列(Genbank寄託番号U29680;SEQ ID NO: 1)上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“PS”=ホスホロチオエート結合。“5meC”=5-メチルシトシン。“デオキシ”=2'-H。
【0124】
【表1】
【0125】
オリゴヌクレオチドは、100 nM濃度でヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)におけるノーザンブロット解析によりテストされた。HUVECを80%コンフルエントまで増殖させ、あらかじめ加温した(37℃)Opti-MEMTM(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)で三回洗浄した。オリゴヌクレオチドをOpti-MEM中の10μg/mlのLipofectinTM試薬(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)であらかじめ混合し、洗浄済み細胞にアプライした。細胞をオリゴヌクレオチドとともに37℃で4時間インキベーションし、その後、培地を除去して新鮮な培地に換えた。全ての細胞性RNAをRNeasyTMキット(Qiagen Inc., Valencia, CA)を使用して単離した。単離したRNAを1%アガロース/ホルムアルデヒドゲルで分離し、Hybond N+ ナイロン膜(Amersham, Arlington Heights, IL)に一晩転写して、Stratalinker 2400(Stratagene, La Jolla, CA)でUV-架橋(UV-crosslink)した。ブロットは、刊行された方法に従って、配列AGAAGTATGTGTTGGCAATCGT(SEQ ID NO: 17)を有するプライマーで産生した一本鎖PCR 32P-標識プローブとともに数時間ハイブリダイズさせた(Bednarczuk, T.A.ら、BioTechniques, 1991, 10, 478)。PCRを使用して、A1配列のヌクレオチド22から684を増幅した。ノーザンブロットはストリッピングし、ランダム-プライム化(random-primed)32P-標識ヒトG3PDH cDNAで再プローブ化してRNA試料の等価ローディングを確認した。
【0126】
結果は表1に示す。表に見られるように、SEQ ID NO: 4、5、7、8、9、10、11、12、13、14および15を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、本実験において約50%あるいはそれ以上でA1 mRNA発現を抑制した。これらのうち、ISIS 17494(SEQ ID NO: 13、停止コドンが標的)および ISIS 17495(SEQ ID NO: 14、停止コドンのちょうど下流にある3' UTRが標的)は、75%以上のA1発現の阻害を与えた。
【0127】
実施例10
A1発現のアンチセンス阻害-混合バックボーン2'-MOEギャップマーオリゴヌクレオチド
ヒトA1を標的とする第二の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドは表2に示した。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源の参照中に与えられるように、ヌクレオチド番号によって示した。
【0128】
表2の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、十の2'-デオキシヌクレオチドから成る中央“ギャップ”領域で構成されり、この両側(5'および3'方向)に五つのヌクレオチド“ウイング”が隣接する。ウイングは2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオシドで構成される。ヌクレオチド間(バックボーン)結合は、デオキシギャップ内ではホスホロチオエート(P=S)であり、ウイング内ではホスホジエステル(P=O)である。分子中のシチジン残基は5-メチルシチジンである。オリゴヌクレオチドは、先の実施例に記載されるようにノーザンブロット解析によってテストした。結果は表2に示す。
【0129】
表2
A1を標的とするギャップ化キメラオリゴヌクレオチド
“Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列(Genbank寄託番号U29680;SEQ ID NO: 1)上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“N.D.”は利用可能なデータがないことを示す。“PS”=ホスホロチオエート結合。“PO”=ホスホジエステル結合。“デオキシ”=2'-H;“2'MOE”=2'-O-メトキシエチル。“5meC”=5-メチルシトシン。
【0130】
【表2】
【0131】
【0132】
2'-MOEギャップマーのように、SEQ ID NO: 3、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15および16は、A1 mRNAにおいて75%以上の減少を与えた。これらのうち、SEQ ID NO: 11(ISIS 17507)、12(ISIS 17508)、13(ISIS 17509)および14(ISIS 17510)は、A1 mRNAにおいて90%以上の減少を与えた。
【0133】
ISIS 17510(SEQ ID NO: 14、2' MOEギャップマー)を使用した用量反応実験は、本化合物を使用したA1 mRNA減少について10 nMより少ないIC50を与えた。
ISIS 17510およびbcl-2ファミリー構成員bcl-Xに特異的なプローブを使用したノーザンブロット実験から、A1アンチセンス化合物はbcl-x mRNAレベルに影響を与えないことが示された。
【0134】
実施例11
A1発現のアンチセンス阻害-混合バックボーン2'-MOEヘミマーオリゴヌクレオチド
ヒトA1を標的とする第三の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドは表3に示した。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源の参照中に与えられるように、ヌクレオチド番号によって示した。
【0135】
表3の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラ“ヘミマー”オリゴヌクレオチドであり、十の隣接する2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドに結合する、十の隣接する2'-デオキシヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、デオキシ領域内ではホスホロチオエート(P=S)であり、2'-MOE領域内ではホスホジエステル(P=O)である。分子中のシチジン残基は5-メチルシチジンである。
【0136】
オリゴヌクレオチドは、先の実施例に記載されるようにノーザンブロット解析によってテストした。結果は表3に示す。
表3
A1を標的とする“ヘミマー”キメラオリゴヌクレオチド
“Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列(Genbank寄託番号U29680;SEQ ID NO: 1)上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“PS”=ホスホロチオエート結合。“PO”=ホスホジエステル結合。“デオキシ”=2'-H;“2'MOE”=2'-O-メトキシエチル。“5meC”=5-メチルシトシン。
【0137】
【表3】
【0138】
【0139】
2' MOEヘミマーのように、SEQ ID NO: 11(ISIS 17522)、12(ISIS 17523)、13(ISIS 17524)および14(ISIS 17525)は、A1 mRNAレベルにおいて少なくとも75%以上の阻害を与えた。これらのうち、ISIS 17524(SEQ ID NO: 13)は、90%以上の阻害を与えた。
【0140】
実施例12
ヒトmcl-1発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-moeギャップマーオリゴヌクレオチド
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドは、刊行された配列(Kozopasら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1993, 90, 3516-3520;Genbank寄託番号 L08246、ここで SEQ ID NO: 18として援用される)を使用して、ヒトmcl-1 RNAを標的とするように設計された。オリゴヌクレオチドは表4に示す。表4の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、十の2'-デオキシヌクレオチドから成り、両側(5'および3'方向)が五つのヌクレオチド“ウイング”に隣接する、中央“ギャップ”領域で構成される。ウイングは2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、全てホスホロチオエート(P=S)である。分子中のシチジン残基は5-メチルシチジンである。
【0141】
オリゴヌクレオチドは、ヒト黒色腫細胞株C8161(Dr. Dan Welch, Hershey Medical Center, Hershey, PAから寄贈)を使用して、先の実施例にほぼ記載されるように、ノーザンブロット解析によりテストされた。オリゴヌクレオチド(100 nM)およびLipofectinTM(10μg/ml)を混合して、室温で30分間インキベーションした。細胞をOpto-MEMTMで二回洗浄して、オリゴヌクレオチド混合液を加えて、そして細胞を37℃で4時間インキベーションした。オリゴヌクレオチドを新鮮な培地(0% FCS のRPMI)に換えた。24時間後、RNAをRneasyTMキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して単離した。RNAを電気泳動してニトロセルロース膜に転写し、American Type Culture Collection(Manassas, VA)から入手してStripeasyTMキット(Ambion, Austin, TX)で標識したランダム-プライム化mcl-1 ESTプローブ(ATCC 1064916 I.M.A.G.E. クローンID: 796506)でプローブ化した。
【0142】
結果は表4に示す。
表4
ヒトmcl-1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
“Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列(Genbank寄託番号L08246;SEQ ID NO:18)上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“N.D.”は利用可能なデータがないことを示す。“PS”=ホスホロチオエート結合。“PO”=ホスホジエステル結合。“デオキシ”=2'-H;“2'MOE”=2'-O-メトキシエチル。“5meC”=5-メチルシトシン。
【0143】
【表4】
【0144】
【0145】
SEQ ID NO: 22(ISIS 20407)、23(ISIS 20408)、31(ISIS 20416)、35(ISIS 20420)、および36(ISIS 20421)は、約50%あるいはそれ以上でmcl-1 mRNAレベルを阻害した。これらのうち、ISIS 20408および20416は、mcl-1発現の最大の減少を示した。
【0146】
用量反応実験は、ISIS 20407、20408および20416を使用して行った。RNAse保護化アッセイを使用して、hApo2プローブセット(Pharmingen, San Diego, CA)を使用することでmcl-1 mRNAレベルを検出した。ISIS 20407は、約100 nMのIC50を示した。ISIS 20408および20416は、約25 nMのIC50を示した。
【0147】
実施例13
Scid-ヒト白血病異種移植モデルおよび異種移植片におけるアポトーシスの測定
対数増殖期の107個のSEM-K2細胞を、(滅菌塩類溶液に懸濁した)ボーラスとして8尾のSCID-NODマウスに皮下注射する。生着(engraftment)および腫瘍形成は、2-3週間かけて起こる。Micro Alzetポンプ(Alza, Newark, DE)は、14日間にわたり継続的な皮下注入物を運搬でき、これを使用することで、三尾の動物に1日当たり100μgの用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド(5 mg/kgと等価)を運搬する。残りの二尾の動物は、ビヒクル(滅菌塩類溶液)のみを与えた。
【0148】
SCID-hu異種移植片由来のSEM-K2細胞において測定される標的タンパク質の発現は、定量的フローサイトメトリーを使用して測定される。
異種移植片は犠死(sacrifice)の後取り出され、機械的に大量の培地中で分散させる。白血球は濃度勾配遠心分離により精製して培地を用いて洗浄して、1-5×106細胞/mlで1 ml容量に再懸濁させる。細胞を95%湿空気/5% CO2中にて37℃で2時間インキュベートして、その後24時間かけて20μg/ml VP16(エトポシド)を用いてアポトーシスを誘導する。アポトーシスは、光拡散変化(light scatter changes)の定量を使用して非特異的に評価される;側方拡散における(クロマチン凝縮のための)減少および前方拡散における(細胞収縮のための)減少は、アポトーシスに関連する初期の変化である。アポトーシスおよび非アポトーシス細胞を含む二項集団分布(bimodal population distributions)は、処理群およびネガティブな対照についてのアポトーシスの指標をそれぞれ評価ができることが測定可能である。アポトーシスの倍増加(fold increase)はその比率から計算される。アポトーシスのより詳細な決定は、Apo-Alertカスパーゼ-3比色アッセイキット(Clontech, Palo Alto, CA)を使用して達せられる。これは大半の哺乳動物細胞型においてアポトーシスを媒介すると考えられているカスパーゼファミリー構成員である、カスパーゼ-3の活性についての定量的なアッセイである、DEVD-特異的カスパーゼアッセイである。このアッセイは、基質として蛍光分子、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(AFC)あるいは比色分子、p-ニトロアニリド(pNA)のいずれかで標識される合成テトラペプチド、Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)(SEQ ID NO: 39)を利用する。DEVD-依存性プロテアーゼ活性は、基質から開裂する遊離AFCあるいはpNAの検出により評価される。細胞溶解物は、パラニトロアニリド、CPP32(カスパーゼ-3)により開裂する発色基質、に結合するDEVDとともにインキベーションして、405 nmで比色定量分光光度計を使用して検出可能である。OD405 nmでの倍増加を使用して、正味のVP16-誘導アポトーシスを決定する。
【0149】
実施例14
C8161細胞におけるmcl-1タンパク質レベルのウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析(イムノブロット解析)は、標準的な方法で行った。C8161細胞を、約8×105 cells/10 cmプレートにて5 ml容量中でトランスフェクションした。200 nMのISIS 20408(SEQ ID NO: 23)あるいは8-塩基対ミスマッチ対照ISIS 105232;TGGGTCTGGTTTCTCTGTCG(SEQ ID NO: 40)を、陽イオン脂質とともに細胞に加えた。処理後、細胞を固定した間隔で解析した。
【0150】
ウエスタンブロット解析のために、細胞をリン酸緩衝塩類溶液で一度洗浄して、1200 rpmで5分間遠心分離することでペレット化し、氷上で15分間細胞溶解緩衝液(5M NaCl、0.1 M HEPES、500 mMスクロース、0.5M EDTA、100 mMスペルミン、1 mg/mlアプロチニン、10% Triton X-100)に再懸濁した。全タンパク質を分光光度計(BioRad)的に定量して、100μgの溶解物を15%のポリアクリルアミドゲルにロードし、200 Vで45分間泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写した後、ブロットを一次mcl-1抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA)で、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ-結合ヤギ抗マウス二次抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA)で免疫染色した。タンパク質は、ECL(Amersham, Piscataway NJ)および写真のフィルムへの露光により定性的に視覚化した。
【0151】
ISIS 20408は、C8161細胞においてmcl-1タンパク質レベルを減少させる能力についてテストして、200 nMのオリゴヌクレオチド用量でmcl-1タンパク質レベルを4時間後に90%減少させることが見出された。
【0152】
実施例15
C8161細胞の紫外線照射
C8161細胞を、それらが約70-80%コンフルエントである時あるいはオリゴヌクレオチド処理の24時間後の時にUV-B光で照射した。UV-B処理の後すぐに、細胞をPBSで二回洗浄し、5つの15-ワット312 nmバルブを含有するStratalinker UV Crosslinker 1800モデル(Stratagene, La Jolla CA)中でUV-B光に暴露した。細胞は、0 mJ/m2、5 mJ/m2あるいは10 mJ/m2のUV-B放射に暴露した。UV-B放射の線量は、UVX ラジオメーター(UVP)を使用して換算した。UV照射の後、細胞をさらに24時間、標準的な培地でインキベーションした。UV-B処理の対照プレートは単に、PBSで3回洗浄して、さらに24時間標準的な培地でインキベーションした。細胞を、パラジウムヨウ素を用いてエタノール-固定細胞核を染色して、フローサイトメトリーによりDNA含量を調べることによりアポトーシスについて調べた。アポトーシス細胞は、それらの二倍体以下のDNAであることにより同定された。細胞を冷PBSで二回洗浄して、1 mlの70%エタノールに再懸濁した。室温で1時間のインキベーションの後、細胞をPBSで洗浄して、1 mlのパラジウムヨウ素染色溶液(50μg/mlのパラジウムヨウ素、0.5 U/ml RNAse A、2000 U/ml RNase T1)に再懸濁した。室温で30分の後、細胞周期解析をBecton Dickinson Calibur FACSアナライザーを使用してフローサイトメトリーにより行った。10,000の細胞の個々の核の蛍光は、FACScanフローサイトメトリーを使用して測定した。結果はパーセントアポトーシス細胞として表した。
【0153】
実施例16
UV-誘導細胞死に対するC8161細胞のアンチセンス感作
C8161細胞を200 nMのISIS 20408あるいは8-塩基対ミスマッチ対照(ISIS 105232;SEQ ID NO: 40)で処理して、先の実施例に記載されるように紫外線(UV)照射に暴露した。パーセントアポトーシス細胞を、標準的な方法に従ってパラジウムヨウ素染色により定量した。結果は表5に示す。
【0154】
表5
ISIS 20408およびUV照射の組み合わせ
【0155】
【表5】
【0156】
このように、アンチセンス処理によりアポトーシスの増加;すなわち、UV-誘導アポトーシスの感作、が起きた。
実施例17
C8161細胞のシスプラチン(cisplatinum)処理
シスプラチンは、DNAの損傷を引き起こすアルカリ化剤であり、アポトーシスを誘導できる(GillおよびWindebank, 1998, J. Clin. Invest. 101:2842-2850)。C8161細胞を、それらが約70-80%コンフルエントの時あるいはオリゴヌクレオチド処理の24時間後の時にシスプラチンで処理した。シス-ジアミンジクロロプラチンII(Cisplatinum, Sigma, St. Louis MO)を1 mg/mlの濃度で蒸留水に溶解して、2.5から10μg/mlの用量範囲で標準的な培地に加え、24時間細胞とともにインキベーションした。
【0157】
実施例18
シスプラチン誘導細胞死に対するC8161細胞のアンチセンス感作
C8161細胞を200 nMのISIS 20408あるいは8-塩基対ミスマッチ対照ISIS 105232および様々な用量のシスプラチンで処理した。パーセントアポトーシス細胞を、先の実施例に記載されるように標準的な方法に従ってパラジウムヨウ素染色により定量した。結果は表6に示す。
【0158】
表6
ISIS 20408およびシスプラチンの組み合わせ
【0159】
【表6】
【0160】
このように、細胞はアンチセンス処理後のアポトーシス刺激(この場合は細胞毒性化学療法薬剤シスプラチン)に対して感作されて、アポトーシスの増加を起こした。
【配列表】
Claims (40)
- 新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸分子であるSEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 18のいずれかを標的とし、SEQ ID NO: 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、22、23、31、35、または36の少なくとも8ヌクレオ塩基を含み、そして前記新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害する、長さ30ヌクレオ塩基までのアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項3に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾された糖部分が2'-O-メトキシエチル糖部分である、請求項5に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- 修飾されたヌクレオ塩基が2'-O-メトキシエチル修飾されたシトシンである、請求項7に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオ塩基が5-メチルシトシンである、請求項8に記載のアンチセンス化合物。
- キメラオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載のアンチセンス化合物。
- ヒトA1をコードする核酸を標的とする、請求項1に記載のアンチセンス化合物。
- ヒトmcl-1をコードする核酸を標的とする、請求項1に記載のアンチセンス化合物。
- 請求項1に記載のアンチセンス化合物および担体または希釈剤を含む、組成物。
- コロイド分散システムをさらに含む、請求項13に記載の組成物。
- ヒト細胞または組織における新規ヒト抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織をin vitroにて請求項1に記載のアンチセンス化合物と接触させ、それにより前記新規ヒト抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害することを含む、前記方法。
- アンチセンス化合物がヒトA1をコードする核酸分子を標的とする、請求項15に記載の方法。
- アンチセンス化合物がヒトmcl-1をコードする核酸分子を標的とする、請求項15に記載の方法。
- ヒト細胞または組織におけるアポトーシスを促進する方法であって、前記細胞または組織をin vitroにて請求項1に記載のアンチセンス化合物と接触させ、それにより前記新規ヒト抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害することを含む、前記方法。
- アンチセンス化合物がヒトA1をコードする核酸分子を標的とする、請求項18に記載の方法。
- アンチセンス化合物がヒトmcl-1をコードする核酸分子を標的とする、請求項18に記載の方法。
- SEQ ID NO: 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16の少なくとも8ヌクレオ塩基を含み、そしてヒトA1の発現を阻害する、ヒトA1をコードする核酸を標的とする長さ30ヌクレオ塩基までのアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項21に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項22に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項23に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、請求項22に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾された糖部分が2'-O-メトキシエチル糖部分である、請求項25に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基を含む、請求項22に記載のアンチセンス化合物。
- 修飾されたヌクレオ塩基が2'-O-メトキシエチル修飾されたシトシンである、請求項27に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオ塩基が5'-メチルシトシンである、請求項28に記載のアンチセンス化合物。
- キメラオリゴヌクレオチドである、請求項21に記載のアンチセンス化合物。
- SEQ ID NO: 22、23、31、35、または36の少なくとも8ヌクレオ塩基を含み、そしてヒトmcl-1の発現を阻害する、ヒトmcl-1をコードする核酸を標的とする長さ30ヌクレオ塩基までのアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項31に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項32に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項33に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、請求項32に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾された糖部分が2'-O-メトキシエチル糖部分である、請求項35に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基を含む、請求項32に記載のアンチセンス化合物。
- 修飾されたヌクレオ塩基が2'-O-メトキシエチル修飾されたシトシンである、請求項37に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオ塩基が5'-メチルシトシンである、請求項38に記載のアンチセンス化合物。
- キメラオリゴヌクレオチドである、請求項31に記載のアンチセンス化合物。
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