JP2002534073A

JP2002534073A - 新規抗アポトーシスｂｃｌ−２−関連タンパク質のアンチセンスモジュレーション

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Publication number: JP2002534073A
Application number: JP2000592303A
Authority: JP
Inventors: アッカーマン，エリザベス・ジェイ; ベネット，シー・フランク; ディーン，ニコラス・エム; マーカッソン，エリック・ジー
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2002-10-15
Anticipated expiration: 2019-12-14
Also published as: EP1140971A4; EP1140971A1; AU2180700A; EP1806353A1; WO2000040595A1; US6001992A; JP3998089B2

Abstract

(57)【要約】新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートするための組成物および方法を提供する。ヒト新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質A1およびmcl-1をコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質発現のモジュレーションおよび新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現と関連する疾患の治療のためにこれらの化合物を使用する方法も提供する。アポトーシスの促進およびアポトーシスの促進が所望される疾患の治療のためにこれらの化合物を使用する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートする
ための組成物および方法を提供する。特に、本発明は抗アポトーシスヒトbcl-2-
関連タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス
化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、
新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートすることが示さ
れている。

【０００２】発明の背景プログラム細胞死、あるいはアポトーシスは、細胞数の調節が細胞増殖と細胞
死とのバランスにあるため、成長および発生の不可欠な特徴である。アポトーシ
スは受動的な過程というよりもむしろ活動的な過程であり、多くの外来性あるい
は内在性のシグナルのいくつかの結果として細胞自殺が起こる。アポトーシス細
胞死は核の凝集、ヌクレオソーム間隔でのDNAのエンドヌクレオリティック（end
onucleolytic）分断化（“ラダーリング（laddering）”）および原形質膜の泡
状化（blebbing）により特徴付けられる。プログラム細胞死は、例えば免疫系の
発生および神経系の発生に不可欠な役割をしている。前者では、自己反応性抗原
受容体を提示するT細胞がアポトーシスにより除去される。後者では、神経構造
の重要な再形成が一部アポトーシスを通して起こる。

【０００３】アポトーシスに関係している遺伝子および遺伝子産物は増えている。これらの
一つはbcl-2で、アポトーシスをブロックあるいは遅延することが示される細胞
内在膜タンパク質である。bcl-2の過剰発現は過形成、自己免疫および化学療法
により誘導されるアポトーシスも含む、アポトーシスに対する抵抗性、への関連
を示している（Fangら、J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398）。bcl-2-関連遺伝
子のファミリーは記載されている。全てのbcl-2ファミリーの構成員は、保存性
の高い二つのドメイン、BH1およびBH2を共有する。bcl-2ファミリーの構成員は
、A1、mcl-1、bcl-w、bax、bad、bakおよびbcl-xを含むが、これらには限定され
ない。A1、mcl-1、bcl-wおよびbcl-xl（bcl-xの長い型）は現在、アポトーシス
に対する保護を与えることが知られており、ここで“抗アポトーシスbcl-2-関連
タンパク質”として言及する。これらの中でA1およびmcl-1は、“新規抗アポト
ーシスbcl-2-関連タンパク質”として知られる。対して、bax、bad、bakおよびb
cl-xs（bcl-xの短い型）は現在、この保護的な効果を阻害することにより細胞死
を促進させることが知られている。本発明は新規抗アポトーシスヒトbcl-2-関連
タンパク質、特にヒトA1およびmcl-1、およびアンチセンス技術を使用したこれ
らのタンパク質の発現の阻害に関する。

【０００４】 A1をコードする遺伝子（また、胎児の肝臓で発現するbcl-2-関連遺伝子、ある
いはbfl-1、およびグラスゴー再配置配列（Glasgow Rearranged Sequence）、あ
るいはGRSとしても知られる）は、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子で処
理したマウスの造血細胞において、初期反応遺伝子として同定された。続いて、
そのヒトホモログはbcl-2、特にBH1およびBH2ドメインと広範な（extensive）相
同性を持つことが分かった。A1の発現レベルと臨床的試料における胃癌の発生と
の相関が注目された（Choiら、1995, Oncogene 11, 1693-1698；WO 96/30513）
。ヒトA1のコーディング配列がクローン化され（Karsanら、1996, Blood 87, 30
89-3096；Genbank寄託番号U29680）、造血細胞だけでなく、様々な非造血組織に
よる発現も発見された。A1は、ホルボールエステルおよび炎症性サイトカイン、
およびおそらく血管内皮成長因子により急速な誘導が可能である。A1は、胎児の
発生中の生理学的な細胞死を制御する役割があると信じられている（Carrioら、
1996, Am. J. Path., 149, 2133-2142）。A1配列の中にはわずかな変異が存在し
、当初“GRS”として同定されたヒトA1配列は、当初“bfl-1”として同定された
A1配列と二つのアミノ酸が異なっている。GRS配列は当初、慢性骨髄性白血病の
患者から得たDNAを使用したNIH3T3細胞増殖巣形成アッセイ（NIH3T3 focus form
ation assay）により分離された（Kennyら、Oncogene 14, 1997 997-1001）。こ
れらの研究者は、癌細胞株U-937（組織球性リンパ腫）、HL-60（前骨髄性白血病
）、およびRaji（バーキットリンパ腫）細胞において高レベルのA1発現を発見し
た。A1の発現はまた、THP-1（急性骨髄性白血病）、BJAB（バーキットリンパ腫
）、活性化Jurkat（急性T-細胞白血病）細胞およびK-562赤白血病（CML急性転化
（blast crisis））細胞においても発見された。

【０００５】 mcl-1は当初、分化途上のヒト骨髄性白血病細胞株ML-1から同定された。その
発現は、分化マーカーが現れる以前のML-1細胞の分化の誘導あるいは“プログラ
ム化”の初期に増加することが分かった。mcl-1のコーディング領域は配列が決
定され、カルボキシル末端領域においてbcl-2と配列相同性の明らかな領域を持
つことが分かった（Kozopasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1993, 90, 3516
-3520；Genbank寄託番号L08246）。bcl-2と異なり、mcl-1は、急速なターンオー
バーをうける様々なタンパク質に存在する強力なPEST配列（プロリン、グルタミ
ン酸、セリンおよびスレオニンに富む）を含む。

【０００６】外来的に導入されたmcl-1の過剰発現により、細胞傷害性の薬剤（化学療法的
薬剤エトポシド、カルシウムイオノフォアあるいはUV照射）の暴露、あるいは必
要な成長因子の添加停止などのように、通常はアポトーシス細胞死を起こす状況
下で、生存力の延長が起きることが示されている（Zhouら、Blood 89, 1997, 63
0-643）。

【０００７】アポトーシスが関係している疾患および状態は二つのカテゴリー、すなわち細
胞生存を増強するもの（すなわち、アポトーシスを減少させる）および細胞死を
過剰にするもの（すなわち、アポトーシスを増加させる）、に分類される。増強
された細胞の生存による細胞の過度の蓄積をともなう疾患は、癌、自己免疫障害
およびウイルス感染を含む。最近まで、直接的には細胞障害性薬物はある生命維
持機能を妨げることによって、標的細胞を殺すと考えられていた。しかし、最近
、異なる作用機構を持ついくつかの細胞障害性薬剤に暴露すると、悪性細胞およ
び正常細胞の両方において、アポトーシスが誘導されることが示されている。栄
養因子の損失によりアポトーシスを誘導できるため、栄養（trophic）因子のレ
ベルの操作（例えば、抗エストロゲン化合物、あるいは様々な成長ホルモンレベ
ルを減少させる化合物による）は、アポトーシスを促進させる一つの臨床的アプ
ローチである。アポトーシスはまた、発生中の潜在的に自己反応を起こすリンパ
球の除去、および免疫あるいは炎症反応の完成後の過剰細胞の除去にとって必要
不可欠である。最近の研究では、不適当なアポトーシスが、異常な自己反応リン
パ球を生き延びさせることによりおこる自己免疫疾患の病原性の根底にある可能
性があることが、明らかに示されている。不十分なアポトーシスが関係している
と信じられているこれらおよび他の症状にとって、アポトーシスの促進は所望さ
れる。本発明に従う新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の阻害は、アポト
ーシスの促進を起こすと信じられる。

【０００８】２番目のカテゴリーにおいて、AIDSおよびアルツハイマー病あるいはパーキン
ソン病などの神経変性障害は、アポトーシスの促進（あるいは好ましくないアポ
トーシス）による過剰な細胞死が関与している障害を象徴している。筋萎縮性側
索硬化、網膜色素変性、およびてんかんは、アポトーシスが関与する他の神経性
障害である。アポトーシスは、虚血、例えば心筋梗塞および卒中により特徴付け
られる症状において起こることが報告されている。アポトーシスはまた、毒素お
よび薬剤による閉塞性黄疸および肝臓傷害を含む多くの肝臓障害にも関係してい
る。アポトーシスはまた、いくつかの腎臓疾患、すなわち多発性嚢胞腎、ならび
に糖尿病を含む膵臓障害において鍵となる現象としても同定される（Thatteら、
Drugs, 1997, 54, 511-532）。好ましくないアポトーシスが関与していると信じ
られているこれら、および他の疾患および症状にとって、アポトーシスの阻害剤
が所望される。

【０００９】アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、いくつかのbcl-2ファミリーの
役割を解明した。bcl-2を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し
た広範な研究が行われており、ヒトbcl-2を標的とするアンチセンス化合物（G31
39, Genta Incorporated）は、リンパ腫および前立腺癌の臨床試験に入っている
。

【００１０】 Amarante-Mendesら（Oncogene, 1998, 16, 1383-1390）は、bcrおよびbcl-xを
標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。後者はbcl-xlの発現を
抑制制御し、スタウロスポリン（staurosporine）に対するHL-60 Bcr-Abl細胞の
感受性を増加させる。

【００１１】米国特許5,583,034（Greenら）は、抗アポトーシス遺伝子の核酸配列、好まし
くはbcr-ablの翻訳開始部位とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを開示する。

【００１２】 Wangらは、bcl-x翻訳開始部位を標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドを使用して、マウスWEHI-231リンパ腫細胞おいてCD40L-媒介性アポトーシ
ス救出（rescue）をブロックした（J. Immunol., 1995, 155, 3722-3725）。

【００１３】 Fujioらは、マウスおよびラットbcl-x mRNAを標的とするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを使用して、bcl-xlタンパク質発現を減少させた（J. Clin. Inves
t., 1997, 99, 2898-2905）。テストした化合物はWangらのものと同じであった
。オリゴヌクレオチド処理は、マウスおよびラットの心筋細胞において白血病阻
害因子の細胞保護効果を阻害した。

【００１４】 Pollmanらは、ホスホロチオエートバックボーンをもつアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを使用して、血管内膜細胞においてbcl-xl発現の抑制制御をした（Na
ture Med., 1998, 4, 222-227）。この結果、アポトーシスの誘導および血管病
変の緩解が起きた。アンチセンス配列はマウス／ヒトbcl-xの翻訳開始コドン（
保存配列）を標的とし、ウサギに使用した。Gibbonsらの米国特許5,776,905は、
好ましくは抗アポトーシス遺伝子に特異的なアンチセンス分子を用い、より好ま
しくはbcl-x、最も好ましくはbcl-xlを用いて、脈管疾患をともなう哺乳類の脈
管構造中の脈管内膜病変細胞の標的化欠損の方法を開示する。

【００１５】 Thompsonら、米国特許5,646,008およびWO 95/00642は、プログラム化された脊
椎動物細胞死を促進あるいは阻害するbcl-2以外のポリペプチドをコードする、
単離および精製されたポリヌクレオチドを記載する。好ましくは、ポリペプチド
はbcl-xl、bcl-xsあるいはbcl-x₁である。ポリペプチド、単離され精製されたポ
リヌクレオチドの一部と同一あるいは相補的なポリヌクレオチド、発現ベクター
、宿主細胞、抗体および治療的および診断的使用方法も提供する。

【００１６】 Yangら、WO 98/05777は、アンキリンドメインを含むbcl-xファミリーの新規ア
イソフォームであるbcl-xγ（ガンマ）を開示する。このアイソフォームに対す
るポリペプチドおよび核酸配列、ならびにとりわけアンチセンス方法を含む、bc
l-xγ活性をモジュレートする方法を記載する。

【００１７】 Chaoら（Molec. Cell. Biol., 1998, 18, 4883-4898）は、アンチセンス配向
（orientation）での全ヒトmcl-1 cDNAを含有するアンチセンス構造物を使用し
て、TF-1細胞における内因性mcl-1の抑制制御が、これらの細胞のアポトーシス
を誘導できることを示した。

【００１８】 Coryら（WO 97/35971）は、効果的な量のbcl-w発現のモジュレーターとbcl-w
遺伝子を接触させることにより、哺乳類においてbcl-wの発現をモジュレートす
る方法を開示する。bcl-wに対してアンチセンス配列を使用することを含むbcl-w
発現の亢進および減少の両方を開示する。

【００１９】 WO 96/30513（Shinら）は、Bcl-2関連遺伝子、Bfl-1の配列、および癌診断の
ためのBcl-2関連遺伝子の使用を開示する。 WO 94/29330は、とりわけ、mcl-1ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配
列、後者を含有する宿主細胞およびベクター、mcl-1ポリペプチドに結合する抗
体、およびこれらの化合物を使用した診断的および治療的方法を開示する。mcl-
1関連細胞増殖障害をもつ被験体を治療する方法は一般的に開示され、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドおよびリボゾームアプローチを含む。特異的な配列ある
いは標的とする情報は提供されない。

【００２０】発明の概要本発明はアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを示し、それらは新規
抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸を標的とするものであり
、これらのファミリーの構成員の発現をモジュレートするものである。より好ま
しい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトA1あるいはヒトmcl-
1を標的とする。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物も提供する。さ
らに、本発明の一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物あるいは組成物と、
細胞あるいは組織を接触させることを含む、前記の細胞あるいは組織において新
規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートする方法を提供す
る。細胞あるいは組織においてアポトーシスを促進させる方法も提供する。さら
に、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質に関連する疾患あるいは症状を有
するか、あるいはなりやすいという疑いのある動物、特にヒトを治療する方法を
提供し、あるいは本発明の一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物あるいは
組成物の、治療的あるいは予防的に効果的な量を投与することによってアポトー
シスの増加が所望される動物、特にヒトを治療する方法を提供する。

【００２１】発明の詳細な説明本発明は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質、特にヒトA1およびmcl-
1の発現をモジュレートできるアンチセンス化合物を包含する。A1およびmcl-1は
アポトーシスを阻害し、それゆえこれらの標的の阻害剤はアポトーシスの促進剤
として所望される。

【００２２】本発明は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸分子の
機能をモジュレートする際に、究極的には、産生したbcl-2-関連タンパク質の量
のモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合物、特に
オリゴヌクレオチドを用いる。これは、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク
質をコードする一つあるいはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズする、ア
ンチセンス化合物を提供することで達せられる。ここで使用されるように、“標
的核酸”および“新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸”
という用語は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードするDNA、そ
のDNAから転写される（プレmRNAおよびmRNAを含む）RNA、およびそのRNA由来のc
DNAも含む。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーシ
ョンは、核酸の正常機能を干渉する。標的核酸のこの機能をそれと特異的にハイ
ブリダイズする化合物によってモジュレートすることは、一般的に“アンチセン
ス”として言及される。干渉されるDNAの機能は複製および転写を含む。干渉さ
れるRNAの機能は、全ての生命の機能、例えばタンパク質翻訳部位へのRNAの移動
、RNAからのタンパク質の翻訳、一つあるいはそれ以上の種類のmRNAを産するた
めのRNAのスプライシング、およびRNAに関わりあるいはRNAにより容易にされう
る触媒活性などを含む。そのような標的核酸機能の干渉の全体的な効果は、新規
抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現のモジュレーションにある。本発明
の文脈において、“モジュレーション”は遺伝子発現の増加（刺激）あるいは減
少（阻害）のどちらかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現の
モジュレーションの好ましい形であり、mRNAは好ましい標的である。

【００２３】特異的核酸をアンチセンスの標的とすることは好ましい。本発明の文脈におい
て、特異的な核酸に対してアンチセンス化合物を“標的とする”ことは、複数段
階の過程である。過程は通常、機能がモジュレートされるべき核酸配列の同定か
ら始まる。例えば、これはその発現が特定の障害あるいは疾患状態と関連する細
胞性遺伝子（あるいは遺伝子から転写されたmRNA）、あるいは感染病原体由来の
核酸分子でありうる。本発明において、標的は新規抗アポトーシスbcl-2-関連タ
ンパク質をコードする核酸分子である。標的化の過程は、所望する効果、例えば
タンパク質発現の検出あるいはモジュレーションを得られるように、アンチセン
ス相互作用が起こるようにするための本遺伝子内の一つあるいは複数の部位の決
定を含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子のオープ
ンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始あるいは停止コドンを含む領域であ
る。当該技術分野で知られるように、翻訳開始コドンは典型的には5'-AUG（転写
されたmRNA分子において；対応するDNA分子では5'-ATG）であるため、翻訳開始
コドンは“AUGコドン”、“開始コドン”あるいは“AUG開始コドン”としても言
及される。少数の遺伝子はRNA配列5'-GUG、5'-UUGあるいは5'-CUGをもつ翻訳開
始コドンをもち、5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGはin vivoで機能することを示し
ている。従って、“翻訳開始コドン”および“開始コドン”という用語は、各々
の例において開始アミノ酸が典型的に（真核生物では）メチオニンあるいは（原
核生物では）ホルミルメチオニンであるにも関わらず、多くのコドン配列を含む
ことができる。真核生物あるいは原核生物の遺伝子が二つあるいはそれ以上の代
替の開始コドンをもち、そのうちのいずれの一つが特定の細胞型あるいは組織に
おいて、あるいは特定の一連の状態のもとで翻訳開始に優先的に利用しうること
も、当該技術分野で知られている。本発明の文脈において、“開始コドン”およ
び“翻訳開始コドン”は、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードす
る遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳を開始させるためにin vivoで使用され
る一つあるいは複数のコドンについて言及し、そのようなコドンの配列には関わ
らない。

【００２４】遺伝子の翻訳終了コドン（あるいは“停止コドン”）は三つの配列、すなわち
5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列はそれぞれ5'-TAA、5'-TAGおよ
び5'-TGA）の一つをもちうることも、当該技術分野で知られている。“開始コド
ン領域”および“翻訳開始コドン領域”という用語は、翻訳開始コドンからのど
ちらかの方向（すなわち、5'あるいは3'）において、約25から約50までの隣接す
るヌクレオチドを含むようなmRNAあるいは遺伝子の一部について言及する。同様
に、“停止コドン領域”および“翻訳終了コドン領域”という用語は、翻訳終了
コドンからのどちらかの方向（すなわち、5'あるいは3'）において、約25から約
50までの隣接するヌクレオチドを含むようなmRNAあるいは遺伝子の一部について
言及する。

【００２５】翻訳開始コドンと翻訳終了コドンの間の領域について言及することが当該技術
分野で知られる、オープンリーディングフレーム（ORF）あるいは“コーディン
グ領域”は、効果的に標的とされうる領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始
コドンから5'方向におけるmRNAの一部について言及すると当該技術分野で知られ
る5'非翻訳領域（5'UTR）を含み、従って、mRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コ
ドンの間のヌクレオチドあるいは遺伝子上で対応するヌクレオチドを含み、そし
て、翻訳終了コドンから3'方向におけるmRNAの一部について言及すると当該技術
分野で知られる3'非翻訳領域（3'UTR）を含み、従って、mRNAの翻訳終了コドン
と3'末端の間のヌクレオチドあるいは遺伝子上で対応するヌクレオチドを含む。
mRNAの5'キャップは、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの最も5'-側の基（5'-mos
t residue）に結合するN7-メチル化グアノシンを含む。mRNAの5'キャップ領域は
、5'キャップ構造そのものならびにキャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを
含むと考えられている。5'キャップ領域は好ましい標的領域でもありうる。

【００２６】いくつかの真核生物のmRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは“イントロン”
として知られる一つあるいはそれ以上の領域を含有し、翻訳前に転写物から除去
される。残存（およびそれ故翻訳される）領域は“エクソン”として知られ、一
緒にプライスされて連続的なmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわ
ちイントロン-エクソン結合部は好ましい標的領域でもあり、異常型スプライシ
ングが疾患と関係する場合、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾
患と関係する場合において特に利用される。再構成あるいは欠損による異常型の
融合結合も好ましい標的である。イントロンは効果的であり、それ故、例えばDN
AあるいはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物の好ましい標的領域でもあ
りうる、ということも分かっている。

【００２７】ひとたび一つあるいはそれ以上の標的部位が同定されれば、標的と十分に相補
的な、すなわち十分よく十分に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドが選択され、所望する効果を与える。

【００２８】本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”は、相補的なヌクレオシ
ド間あるいはヌクレオチドの塩基間での、ワトソン-クリック、フーグステン（H
oogsteen）あるいは逆転フーグステン（reversed Hoogsteen）水素結合でありう
る、水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは水素結合形成を介して対
になる相補的なヌクレオ塩基である。ここで使用する“相補的”は、二つのヌク
レオチド間の正確な対形成の能力について言及する。例えば、もしオリゴヌクレ
オチドのある部位のヌクレオチドが、DNAあるいはRNAの同部位にあるヌクレオチ
ドと水素結合が可能であると、その時オリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNA
はその部位で互いに対して相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよ
びDNAあるいはRNAは、各々の分子において十分に多くの対応する位置が互いに水
素結合可能であるヌクレオチドで占められている時には、互いに対して相補的で
ある。従って、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定的で
特異的な結合がオリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNA標的間で起こるような
、十分な程度の相補性あるいは正確な対形成を示すのに使用される用語である。
特異的にハイブリダイズするためには、アンチセンス化合物の配列がその標的の
配列と100％相補的である必要はない、ということは当該技術分野で理解されて
いる。アンチセンス化合物は、標的DNAあるいはRNA分子と化合物の結合が標的DN
AあるいはRNAの正常機能を干渉して有用性を失わせる時に、そして、特異的な結
合が望ましい状況下、すなわちin vivoアッセイあるいは治療的処置、およびin
vitroアッセイの場合における生理学的状況下、アッセイが行われる状況下で、
非標的配列とアンチセンス化合物の非特異的な結合を避けるために十分な程度の
相補性がある時に、特異的なハイブリダイズが可能である。

【００２９】アンチセンス化合物は一般に研究用試薬および診断試薬として使用される。例
えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、強い特異性により遺伝子発現を阻害
でき、しばしば当業者により特定の遺伝子の機能を解明するために使用される。
アンチセンス化合物は、例えば生物学的な経路の様々な構成員の機能の識別をす
るためにも使用される。それゆえ、アンチセンスモジュレーションは研究的使用
のために利用されている。

【００３０】アンチセンスの特異性および感受性は、当該技術者により治療的使用のために
も利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおけ
る疾患状態の治療において治療的部分として使用されている。アンチセンスオリ
ゴヌクレチドは安全かつ効果的にヒトに投与されており、多くの臨床試験が現在
進行中である。このように、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特
にヒトの治療計画において有用であるように形づくられうる有用な治療的モダリ
ティーでありうる、ということが確立されている。本発明の文脈において、“オ
リゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸（RNA）あるいはデオキシリボ核酸
（DNA）あるいはその模倣物のオリゴマーあるいはポリマーについて言及する。
この用語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バッ
クボーン）結合、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴ
ヌクレオチドを含む。そのような修飾されたあるいは置換されたオリゴヌクレオ
チドは、例えば、細胞性取り込みの亢進、核酸標的との親和性の亢進、およびヌ
クレアーゼ存在下での安定性の向上などの所望される特徴のため、しばしば本来
の形態以上に好ましい。

【００３１】アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態である
一方で、本発明は他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含し、以下に記載する
ようなオリゴヌクレオチド模倣物を含むが、これらには限定されない。本発明に
従ったアンチセンス化合物は、好ましくは約8から約30のヌクレオ塩基を含む。
約8から約30のヌクレオ塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ま
しい（すなわち、約8から約30の結合したヌクレオシド）。当該技術分野で知ら
れるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基
部分は通常は複素環式の塩基である。そのような複素環式の塩基の二つの最も一
般的な分類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖
部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシ
ル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、リン酸基は糖の2'、3'あるいは5'の
水酸基部分のいずれかと結合しうる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン
酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖のポリマー化合物を形成
する。この直鎖のポリマー構造の各々の末端は順次さらに結合して環状構造を形
成することができる。しかし、開環直鎖構造が一般的に好ましい。オリゴヌクレ
オチド構造内において、リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バック
ボーンを形成するとして一般に言及される。RNAおよびDNAの通常の結合あるいは
バックボーンは、3'から5'のホスホジエステル結合である。

【００３２】本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例は、修飾され
たバックボーンあるいは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチ
ドを含む。本明細書において定義されるように、修飾されたバックボーンを有す
るオリゴヌクレオチドは、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバ
ックボーン内にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のため、および
当該技術分野において時々言及されるように、ヌクレオシド間のバックボーンに
リン原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドである
と考えられる。

【００３３】好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは、例えば、通常3'-5
'結合を有する、ホスホロチオエート（phosphorothioate）,キラルのホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホスホトリエステル
（phosphotriester）、アミノアルキルホスホトリエステル（aminoalkylphospho
triester）、3'-アルキレンホスホネート（alkylene phosphonate）およびキラ
ルのホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネー
ト（phosphinate）、3'-アミノホスホールアミデート（phosphoramidate）およ
びアミノアルキルホスホールアミデート（aminoalkylphosphoramidate）、チオ
ノホスホールアミデート（thionophosphoramidate）チオノアルキルホスホネー
ト（thionophosphonate）、チオノアルキルリン酸トリエステル（thionoalkylph
osphotriester）およびボラノホスフェート（boranophosphate）、これらの2'-5
'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対合が5'-3'に対して3'-5'に
結合するか、または5'-2'に対して2'-5'を結合する反転した極性を持つもの、を
含む。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。

【００３４】上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.：3,687,808；4
,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,0
19；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,
455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,11
1；5,563,253；5,571,799；5,587,361；および5,625,050を含み、その各々は本
明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。

【００３５】その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバック
ボーンは、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテ
ロ原子およびアルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは一
つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子あるいはヘテロ環状ヌクレオシド間結合によ
り形成されるバックボーンを持つ。これらは、（一部はヌクレオシドの糖部分か
ら形成される）モルホリノ結合；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホ
キシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル
バックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン
；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノお
よびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバッ
クボーン；アミドバックボーン；および混合したN、O、SおよびCH₂構成部分を有
する他のもの、を持つものを含む。

【００３６】上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.：5,034,
506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5
,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,3
07；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,
610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；および5,
677,439を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これら
には限定されない。

【００３７】他の好ましいヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖とヌクレシ
チド間結合の両方、すなわちバックボーンは、新規基に置き換えられる。塩基単
位は、適した核酸標的化合物とハイブリダイゼーションするために維持される。
このような一つのオリゴマー化合物、優れた素晴らしいハイブリダイゼーション
特性を持つことを示しているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（PNA
）として言及される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖バックボー
ンはアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンに置き換
えられる。ヌクレオ塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子
に直接あるいは間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特
許は、U.S.：5,539,082；5,714,331；および5,719,262を含み、その各々は本明
細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。PNA化合物の
さらなる教示は、Nielsenら（Science, 1991, 254, 1497-1500）に見つけられる
。

【００３８】本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴ
ヌクレオチド、およびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオシドであり
、そして特に、上記で参照される米国特許5,489,677の-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N
（CH₃）-O-CH₂-〔メチレン（メチルイミノ）あるいはMMIバックボーンとして知
られている〕、-CH₂-O-N（CH₃）-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-N（CH₃）-CH₂-および-O-
N（CH₃）-CH₂-CH₂-〔ここで、本来のホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH ₂ -として示される〕、および上記で参照される米国特許 5,602,240のアミドバッ
クボーンである。また、上記で参照される米国特許5,034,506のモルホリノバッ
クボーン構造を持つオリゴヌクレオチドも好ましい。

【００３９】修飾オリゴヌクレオチドは一つあるいはそれ以上の置換糖部分も含有しうる。
好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位に以下のものの一つを含む：OH；F；O-、S
-、あるいはN-アルキル；O-、S-、あるいはN-アルケニル；O-、S-あるいはN-ア
ルキニル；あるいはO-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよ
びアルキニルは、置換あるいは非置換のC₁からC₁₀アルキル、あるいはC₂からC₁₀ アルケニルおよびアルキニルでありうる。O〔（CH₂）_nO〕_mCH₃、O（CH₂）_nOCH₃
、O（CH₂）_nNH₂、O（CH₂）_nCH₃、O（CH₂）_nONH₂、およびO（CH₂）_nON〔（CH₂）_n CH₃,〕〕₂は特に好ましく、ここでのnおよびmは1から約10までである。他の好ま
しいオリゴヌクレオチドは2'部位に以下のものの一つを含む：C₁からC₁₀の低級
アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルあるいは
O-アラルキル、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂
、NO₂、N₃、NH₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアル
キルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター基、イ
ンターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、あるいは
オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基および同様な特性を持つ置換基。
好ましい修飾は、アルコキシアルコキシ基、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH₂CH₂ OCH₃、2'-O-（2-メトキシエチル）あるいは2'-MOEとしても知られる）を含む（M
artinら、Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）。さらなる好ましい修飾は、
2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られるO（CH ₂ ）₂ON（CH₃）₂基を含む。

【００４０】他の好ましい修飾は、2'-メトキシ（2'-O-CH₃）、2'-アミノプロポキシ（2'-O
CH₂CH₂CH₂NH₂）、および2'-フルオロ（2'-F）を含む。同様な修飾はオリゴヌク
レオチドの他の部位、特に3'末端ヌクレオチド、あるいは2'-5'結合オリゴヌク
レオチドにおける糖の3'部位および5'末端ヌクレオチドの5'部位でもおこなわれ
うる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分
などの糖模倣物も持ちうる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米
国特許は、U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5
,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,7
22；5,597,909；5,610,300；5,627,053l 5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,
670,633；および5,700,920を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用
されるが、これらには限定されない。

【００４１】オリゴヌクレオチドはヌクレオ塩基（しばしば当該技術分野において簡単に“
塩基”として言及される）修飾あるいは置換も含みうる。ここで使用されるよう
に、“非修飾の”あるいは“天然の”ヌクレオ塩基は、プリン塩基のアデニン（
A）およびグアニン（G）、およびピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）
およびウラシル（U）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C
）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデ
ニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデ
ニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、
2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピ
ニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラ
シル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、
8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-
ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシ
トシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-ア
ザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニン
および3-デアザアデニン、などの他の合成および天然のヌクレオ塩基を含む。さ
らなるヌクレオ塩基は、米国特許No. 3,687,808にて開示されるもの、The Conci
se Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering（pp. 858-859, Kroschw
itz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990）にて開示されるもの、Englischら（
Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613）により開示され
るもの、およびSanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B.編、Antisense R
esearch and Applications（CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 289-302）にて
開示されるものを含む。これらのヌクレオ塩基のいくつかは、本発明のオリゴマ
ー化合物の結合親和力を高めるのに特に有用である。これらには、5-置換ピリミ
ジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンを含み、2-アミノ
プロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む。
5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6-1.2℃増加することを示し
（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research a
nd Applications, 1993, CRC Press, Boca Raton, pp. 276-278）、現在では好
ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾との組合せ時はより一層特
別に好ましい。

【００４２】上記記載の修飾ヌクレオ塩基の特定のものならびに他の修飾ヌクレオ塩基の調
製を教示する代表的な米国特許は、上記記載のU.S. 3,687,808、ならびにU.S.：
4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,
187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5
,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；および5,750,692を含み、その各
々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。

【００４３】本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性
、細胞性分布あるいは細胞性取り込みを亢進する一つあるいはそれ以上の部分あ
るいは結合部をオリゴヌクレオチドに対して化学的に結合することを含む。その
ような部分は、コレステロール部分（Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Lett
., 1994, 4, 1053-1059）、チオエステル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール
（Manoharanら、Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharanら、Bi
oorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhau
serら、Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジ
オールあるいはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら、EMBO J., 1991, 10, 111
1-1118；Kabanovら、FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchukら、Biochim
ie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール
あるいはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホ
スホネート（Manoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Sheaら
、Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンあるいはポリエチレ
ングリコール鎖（Manoharanら、Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-97
3）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36,
3651-3654）、パルミチル部分（Mishraら、Biochim. Biophys. Acta., 1995, 1
264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ-カルボ
ニル-オキシコレステロール部分（Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996,
277, 923-937）などの脂質部分を含むが、それらには限定されない。

【００４４】そのようなオリゴヌクレオチド結合物の調製を教示する代表的な米国特許は、
U.S.：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；
5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,
802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4
,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,2
63；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,
082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,53
6；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,4
51,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142
；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928および
5,688,941、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、こ
れらには限定されない。

【００４５】与えられた化合物の全ての部分にとって一様に修飾することは必ずしも必要で
はなく、実際に前記の修飾の一つ以上は単一の化合物中に、あるいはオリゴヌク
レオチド内の単一のオリゴヌクレオシドにおいてさえ取り込まれうる。本発明は
キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈において、“キメ
ラの”アンチセンス化合物あるいは“キメラ”は、二つあるいはそれ以上の化学
的に別個な領域を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にオリゴヌクレ
オチドであり、それらは各々少なくとも一つのモノマー単位、すなわちオリゴヌ
クレオチド化合物の場合はヌクレオチド、で構成されている。これらのオリゴヌ
クレオチドは典型的に少なくとも一つの領域を含み、ここで標的核酸についてヌ
クレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞性取り込み、および／あ
るいは増加した結合親和力をオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオ
チドが修飾される。オリゴヌクレオチドの追加的な領域は、RNA:DNAあるいはRNA
:RNAハイブリッドを開裂させうる酵素のための基質として機能しうる。例として
、RNase HはRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を開裂させる細胞性エンドヌクレアーゼであ
る。従って、RNase Hの活性化によりRNA標的が開裂し、それにより遺伝子発現の
オリゴヌクレオチド阻害の効率がより大きく亢進する。RNA標的の開裂は日常的
にゲル電気泳動により、もし必要ならば、当該技術分野で知られる関連する核酸
ハイブリダイゼーション技術により検出できる。

【００４６】本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記したように、二つあるいはそれ以
上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび
／あるいはオリゴヌクレオチド模倣物の合成構造物として形成されうる。そのよ
うな化合物は当該技術分野においてハイブリッドあるいはギャップマーとしても
言及されている。そのようなハイブリッド構造物の調製を教示する代表的な米国
特許は、U.S.：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,4
03,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；および5,7
00,922、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これら
には限定されない。

【００４７】本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、固相合成のよく知られる技
術を通して都合良く日常的に作製されうる。そのような合成の装置は、例えば、
アプライドバイオシステムズ（Foster City, CA）を含むいくつかの業者によっ
て販売されている。当該技術分野で知られるそのような合成のいくつかの他の手
段は、追加的にあるいは代替的に使用されうる。ホスホロチオエートおよびアル
キル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために、同様な技術を使用す
ることはよく知られている。

【００４８】本発明のアンチセンス化合物はin vitroで合成され、アンチセンス分子のin v
ivoでの合成を指向するために設計される生物学的起源、あるいは遺伝的ベクタ
ー構築物のアンチセンス組成物は含まない。

【００４９】本発明の化合物は、その他の分子、分子構造物あるいは化合物の混合物、例え
ば、取り込み、分散および／あるいは吸収を援助するためのリポソーム、レセプ
ター標的分子、経口用、直腸用、局所用あるいはその他の製剤、と混合され、カ
プセルに包まれ、あるいはそうでなければ結合されうる。そのような取り込み、
分散および／あるいは吸収を援助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許は
、U.S.：5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158
；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,10
8,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016
；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,54
3,152；5,556,948；5,580,575；および5,595,756、を含み、その各々は本明細書
中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。

【００５０】本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩類、エステ
ル、あるいはそのエステルの塩類、あるいはヒトを含めた動物に投与する際に、
生物学的に活性な代謝産物あるいはその残余を（直接的あるいは間接的に）提供
することができる他の化合物を含む。それゆえ、例えば、本開示は本発明の化合
物のプロドラッグおよび医薬的に許容可能な塩類、そのようなプロドラッグの医
薬的に許容可能な塩類、およびその他の生物学的等価物に対しても作成される。

【００５１】 “プロドラッグ”という用語は、体内あるいはその細胞内で、内在性酵素ある
いは他の化学物質および／あるいは条件によって活性型（すなわち、薬剤）に変
換される、不活性型で調製される治療的薬剤を示す。特に、本発明のオリゴヌク
レオチドのプロドラッグ版は、WO 93/24510あるいはWO 94/26764において開示さ
れる方法に従って、SATE〔（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸〕誘導体として
調製される。

【００５２】 “医薬的に許容可能な塩類”という用語は、本発明の化合物の生理学的および
医薬的に許容可能な塩類：すなわち、親化合物の所望する生物学的活性を保持し
、それに対する所望しない毒物学的な効果を与えない塩類である。

【００５３】医薬的に許容可能な塩基付加塩類は、アルカリおよびアルカリ土類金属あるい
は有機アミンなどの、金属あるいはアミンで形成される。陽イオンとして使用さ
れる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである
。適したアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン
、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、
N-メチルグルカミン、およびプロカイン（例えば、Bergeら、“Pharmaceutical
Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照）。前記酸性化合物の塩基
付加塩類は、十分な量の所望する塩基と遊離酸型を接触させることにより調製さ
れ、従来の様式で塩類を産生する。遊離酸型は、酸と塩類型を接触させ、従来の
様式で遊離酸を分離することにより再生されうる。遊離酸型は、極性溶媒中での
安定性などの特定の物理的特性において、それら各々の塩類型と多少は異なって
いるが、それ以外については、塩類はそれら各々の遊離酸と本発明の目的にとっ
て等価である。ここで使用されるように、“医薬的な付加塩類”は、本発明の組
成物の成分の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩類を含む。これらはアミンの有
機あるいは無機酸性塩類を含む。好ましい付加塩類は、塩酸、酢酸、サリチル酸
、硝酸およびリン酸などの酸性塩類である。その他の適した医薬的に許容可能な
塩類は当業者によく知られており、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸あるい
はリン酸などの無機酸を有するもの；例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸
、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸
、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸（glucaric aci
d）、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸（mandelic acid
）、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安
息香酸、エンボル酸（embolic acid）、ニコチン酸あるいはイソニコチン酸など
の有機物カルボン酸、スルホン酸、硫酸あるいはリン酸あるいはN-置換スルファ
ミン酸を有するもの；例えばグルタミン酸あるいはアスパラギン酸など、および
フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスル
ホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンス
ルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-あるい
は3-ホスホグリセレート、グルコース-6-ホスフェート、（シクラメートの形成
を伴う）N-シクロヘキシルスルファミン酸などの天然のタンパク質合成に関連す
る20のアルファ-アミノ酸などのアミノ酸を有するもの、あるいはアスコルビン
酸などのその他の有機化合物を有するもの、の様々な無機あるいは有機酸の塩基
性塩類を含む。化合物の医薬的に許容可能な塩類はまた、医薬的に許容可能な陽
イオンを用いて調製されうる。適した医薬的に許容可能な陽イオンは当業者によ
く知られており、アルカリ陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イ
オンおよび第四アンモニウム陽イオンを含む。炭酸塩あるいは炭酸水素塩も可能
である。

【００５４】オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩類の好ましい例は、（a
）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミ
ンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンで形成される塩類；（b
）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、その他の無機酸で形成され
る酸付加塩類；（c）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸
、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タ
ンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン
酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリ
ガラクツロン酸などの有機酸で形成される塩類；（d）塩素、臭素、およびヨウ
素などの元素状態での陰イオンで形成される塩類、を含むが、これらには限定さ
れない。

【００５５】本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防のためおよび研究用試薬お
よびキットとして使用できる。治療のために、一つあるいはそれ以上の新規抗ア
ポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現をモジュレートすることで治療できる疾
患あるいは障害を持つと疑われる動物、好ましくはヒトは、本発明に従ってアン
チセンス化合物を投与することで治療される。本発明の化合物は、適した医薬的
に許容可能な希釈剤あるいはキャリアーに効果的な量のアンチセンス化合物を加
えることにより、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス
化合物および方法の使用はまた、例えば予防的に、例えば炎症あるいは腫瘍形成
を阻止するためあるいは遅らせるために、有用でありうる。

【００５６】本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物が新規抗アポトーシスbcl-2-
関連タンパク質をコードする核酸とハイブリダイズし、サンドイッチおよびその
他のアッセイを本事実を利用するために容易に組み立てることが可能になるため
、研究および診断にとって有用である。新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク
質をコードする核酸と本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションは、当該技術分野で知られる手段により検出できる。そのような手段
は、オリゴヌクレオチドと酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射性標識あるい
はその他の適する検出手段を含みうる。試料中の新規抗アポトーシスbcl-2-関連
タンパク質のレベルを検出するためのそのような検出手段を使用するキットも調
製されうる。

【００５７】本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。
本発明の医薬組成物は、局所性あるいは全身性の治療のどちらが望ましいかに依
存し、および治療すべき部位に依存する多くの方法において投与されうる。投与
は、局所的投与（眼を含みおよび膣および直腸運搬を含む粘膜に対して）、例え
ばネブライザーを含む、粉末あるいはエアロゾルの吸入あるいは吹き付けによる
肺への投与；胸腔内、鼻腔内、表皮および経皮、経口あるいは非経口でありうる
。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内あるいは筋肉内注射あるいは注
入；あるいは例えば髄腔内あるいは脳室内などの頭蓋内投与を含む。少なくとも
一つの2'-O-メトキシエチル修飾をもつオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に
有用であると信じられている。

【００５８】局所的な投与のための医薬組成物および製剤は、経皮的パッチ、軟膏、ローシ
ョン、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体および粉末を含みうる。従
来の医薬的キャリア、水性、粉末あるいは油性基剤、濃縮剤などは必要であり、
あるいは望ましい場合がある。コートされたコンドーム、グローブおよびその他
も有用でありうる。

【００５９】経口投与のための組成物および製剤は、粉末あるいは顆粒、水あるいは非水性
の媒質における懸濁液あるいは溶液、カプセル、サシェあるいは錠剤、を含む。
濃縮剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤（dispersing aids）あるいは結
合剤は所望されうる。

【００６０】非経口、鞘内（intrathecal）あるいは脳室内投与のための組成物は、緩衝液
、希釈剤および浸透亢進剤、キャリアー化合物およびその他の医薬的に許容可能
なキャリアーあるいは補形薬など（これらには限定されない）のその他の適した
添加物も含みうる、滅菌した水性溶液を含みうる。

【００６１】本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および／あるいは製剤は、オリ
ゴヌクレオチドの食餌性運搬を亢進するための浸透亢進剤を含んでもよい。浸透
亢進剤は五つの広範なカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、
界面活性剤および非界面活性剤、の一つに属するように分類されうる（Leeら、C
ritical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192；Mu
ranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7,
1-33）。これらの広範なカテゴリーの一つあるいはそれ以上から、一つあるいは
それ以上の浸透亢進剤が含まれうる。

【００６２】浸透亢進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オ
レイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、リシンリエート
、モノオレイン（別名、1-モノオレオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、
カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシク
ロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセ
リド、およびそれらの生理学的に許容可能な塩類（すなわち、オレエート、ラウ
レート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエー
ト、など）を含む（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Sy
stems, 1991, 8:2, 91-192；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Dru
g Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33；El-Haririら、J. Pharm. Pharmacol., 1
992, 44, 651-654）。いくつかの現在の好ましい脂肪酸の例は、カプレートナト
リウムおよびラウレートナトリウムであり、0.5から5％の濃度で単独であるいは
組み合わせて使用される。

【００６３】胆汁の生理学的な役割は、脂質および脂溶性ビタミンの分散と吸収を容易にす
ることを含む（Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman's The Pharmacolog
ical Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardmanら、eds., McGraw-Hill, New Y
ork, NY, 1996,pages 934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成
誘導体は浸透亢進剤として作用する。従って、“胆汁酸塩”という用語は、天然
に生じる胆汁の構成要素のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを
含む。現在の好ましい胆汁酸塩は、ケノデオキシコール酸（CDCA）（Sigma Chem
ical Company, St. Louis, MO）であり、一般に0.5から2％の濃度で使用される
。

【００６４】一つあるいはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を使用することができる。
例えば、胆汁酸塩を脂肪酸と共に使用し、複合製剤を作りうる。好ましい組み合
わせは、CDCAをカプレートナトリウムあるいはラウレートナトリウム（一般に0.
5から5％）と組み合わせることを含む。

【００６５】キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サ
リチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよびホ
モバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9（
laureth-9）およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体（エナミン）を含む
が、これらには限定されない（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-192；Muranishi, Critical Reviews in Thera
peutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33；Buurら、J. Control Rel., 1
990, 14, 43-51）。キレート剤は、DNase阻害剤としても機能するというさらな
る利点を有する。

【００６６】界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラ
ウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Leeら、Critica
l Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191）；およ
びFC-43などのパーフルオロケミカルエマルジョン（perfluorochemical emulsio
ns）（Takahashら、J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252-257）、を含む。

【００６７】非界面活性剤は、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニル
アザシクロ-アルカノン誘導体（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191）；およびジクロフェナックナトリウム
（diclofenac sodium）、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステ
ロイド性抗炎症剤（Yamashitaら、J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）
、を含む。

【００６８】ここで使用されるように、“キャリア化合物”は核酸、あるいはその類似体に
言及し、それは不活性である（すなわち、それ自体が生物学的活性を持っていな
い）が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、あるいは循環系からそ
れを除去することを促進することによって、生物学的活性を持つ核酸の生物学的
利用能を減少させるin vivoでの過程により、核酸として認識される。核酸とキ
ャリア化合物を、典型的に過剰量の後者の物質とともに共投与（coadministrati
on）すると、おそらく共通のレセプターに対するキャリア化合物と核酸の間での
競合のため、肝臓、腎臓あるいは他の循環外貯蔵器において回収される核酸の量
の実質的な減少を引き起こすことができる。例えば、肝臓組織における部分的に
ホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの回収は、それがポリイノシン
酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸あるいは4-アセトアミド-4'-イソチオシ
アノ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸と共投与されるときに減少する（Miyaoら、
Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121；Takakuraら、Antisense & Nucl. Aci
d Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。

【００６９】キャリア化合物に対して、“医薬的に許容可能なキャリア”（補形薬）は、医
薬的に許容可能な溶剤、懸濁剤、あるいは動物に一つあるいはそれ以上の核酸を
運搬するための他のいずれかの医薬的に不活性なビヒクル、である。医薬的に許
容可能なキャリアは液体あるいは固体であってもよく、核酸と所定の医薬組成物
の他の要素を組み合わせるとき、望ましい量、濃度などを供給するために、考え
た計画された投与様式と共に選択される。典型的な医薬的に許容可能なキャリア
は、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンあるい
はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば、ラクトースお
よび他の糖、微結晶性のセルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エ
チルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例
えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化シリコン
、ステアリン酸、金属ステアレート、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレ
ングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；分解剤（例えば、
デンプン、グリコール酸デンプンナトリウムなど）；あるいは湿潤剤（例えば、
ラウリル硫酸ナトリウムなど）、を含むが、それらには限定されない。経口的に
投与された用量剤形のための、持続的放出経口運搬システムおよび／あるいは腸
コーティングは、米国特許No. 4,704,295；4,556,552；4,309,406；および4,309
,404に記載され、それらは参考文献として援用される。

【００７０】本発明の組成物は、医薬組成物において、その技術的に確立した使用レベルで
従来から見いだされる他の補助的要素を追加的に含みうる。従って、例えば、組
成物は、例えば、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤あるいは抗炎症剤などの、追加
的な互換性のある医薬的に活性をもつ物質を含んでもよく、あるいは色素、着香
料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、濃縮剤および安定剤などの、本発明の組成物の
様々な用量剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加的な物質を含有してもよい
。しかし、そのような物質は、追加するとき、本発明の組成物の要素の生物学的
活性を過度に妨害すべきではない。

【００７１】本発明のアンチセンス化合物が患者に導入される方法に関わらず、コロイド状
の分散システムは運搬ビヒクルとして使用され、in vivoでの化合物の安定性を
亢進し、および／あるいは特定の器官、組織あるいは細胞型を化合物の標的とし
うる。コロイド状の分散システムは、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフ
ェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム
および特徴付けられていない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質
ベースシステムを含むが、それらには限定されない。好ましいコロイド状の分散
システムは多数のリポソームである。リポソームは、二重層構造において配置さ
れる脂質で構成される、一つあるいはそれ以上の外層によって囲まれる水性コア
をもつ顕微鏡的球体である（一般的に、Chonnら、Current Op. Biotech., 1995,
6, 698-708参照）。

【００７２】本発明のある態様は、リポソームおよび（a）一つあるいはそれ以上のアンチ
センス化合物および（b）非アンチセンス機構により機能する一つあるいはそれ
以上の他の化学療法剤を含むその他の組成物を提供する。そのような化学療法剤
の例は、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン
、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン
、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA
）、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキサ
ート（MTX）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テ
ニポシド（teniposide）、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DE
S）、などのアンチセンサー薬剤を含むが、これらには限定されない。一般的に
、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkowら、eds., 1
987, Rahway, N.J., pp. 1206-1228を参照のこと。抗炎症薬剤は非ステロイド抗
炎症薬剤およびコルチコステロイドを含むが、これらには限定されず、抗ウイル
ス薬剤はリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むが
、これらには限定されず、本発明の組成物において組み合わせることもありうる
。一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow
ら、eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 2499-2506および46-49を各々参照のこと。
その他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内にある。二つあるいはそれ
以上を組み合わせた化合物は、一緒にあるいは連続して使用されうる。

【００７３】もう一つの関連する態様では、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする一
つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第
二の核酸標的を標的とする一つあるいはそれ以上の追加のアンチセンス化合物を
含みうる。二つあるいはそれ以上を組み合わせた化合物は、一緒にあるいは連続
して使用されうる。

【００７４】治療的組成物の製剤化およびそれらに続く投与は、当業者の技術内にあると信
じられている。投薬は、治療すべき疾患状態の深刻さおよび反応性に依存してお
り、数日間から数ヶ月、あるいは治療が効果を示すか、あるいは疾患状態の減少
が達せられるまで続く一連の治療をともなう。最適な投薬スケジュールは、患者
の体内の薬剤の蓄積を測定することから算出できる。当業者は、最適な投与量、
投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌ
クレオチドの比効力に依存して変化してもよく、in vitroおよびin vivo動物モ
デルにおいて効果的であると判断された EC₅₀を基準にして一般的に評価できる
。一般的に、投与量は体重1 kgあたり0.01μgから100 gであり、毎日、一週間、
一ヶ月間あるいは一年間に一回あるいはそれ以上、あるいは2年から20年ごとに
一回で与えうる。当業者は、体液あるいは組織内の薬剤の残留時間、および濃度
の測定に基づき、投薬のための反復頻度を容易に見積もることができる。成功し
た治療に続いて、患者は維持治療を受けて疾患状態の再発を防ぐことが望ましく
、そこではオリゴヌクレオチドは体重1 kgあたり0.01μgから100 gの範囲で、毎
日一回かあるいはそれ以上から20年ごとに一回の範囲で、維持用量を投与される
。

【００７５】本発明は、その好ましい態様に従って詳細に記載している一方で、以下の実施
例は本発明を説明するためにのみ提供するが、同じものに限定する意図はない。

【００７６】

【実施例】

実施例１：オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイ
トデオキシおよび2'-アルコキシアミダイト 2'-デオキシおよび2'-メトキシベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホー
ルアミダイトは、商業的な供給源（例えば、Chemgenes, Needham, MAあるいはGl
en Research, Inc. Sterling, VA）から購入した。その他の2'-O-アルコキシ置
換ヌクレオシドアミダイトは、米国特許5,506,351に記載されるように調製され
、本明細書中に参考文献として援用される。2'-アルコキシアミダイトを使用し
て合成されたオリゴヌクレオチドについては、テトラゾールおよび塩基のパルス
運搬後の待機ステップが360秒に増加することを除いて、非修飾オリゴヌクレオ
チドのための標準的なサイクルを利用した。

【００７７】 5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含有するオリゴヌク
レオチドは、商業的に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterl
ing, VA or ChemGenes, Needham, MA）を使用して刊行された方法（Sanghviら、
Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203）に従って合成した。

【００７８】 2'-フルオロアミダイト 2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用される
、Kawasakiら（J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841）およびU.S.特許5,670,633
により以前に記載されたように合成した。簡略すると、保護化されたヌクレオシ
ドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2’-フルオロアデノシンは、開始物質として商業
的に入手可能な9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンを使用して、文献の手
順を改良して、2'-アルファ-フルオロ原子を2'-ベータ-O-トリチル基のS_N2-置換
によって導入されるようにすることにより合成された。このように、 N6-ベンゾ
イル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラニ
ル（THP）中間体として中程度の収量において選択的に保護化された。THPおよび
N6-ベンゾイル基の脱保護は標準的な方法を使用して達せられ、標準的な方法を
使用して、5'-ジメトキシトリチル-（DMT）および5'-DMT-3'-ホスホールアミダ
イト中間体を得た。

【００７９】 2'-フルオロデオキシグアノシン 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、開始物質としてテトライソプ
ロピルジシロキサニル（TPDS）保護化9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニン
、および中間体ジイソブチリル-アラビノフラノシルグアノシンへの転化を使用
して達せられた。TPDS基の脱保護の後、THPによるヒドロキシ基の保護化を行い
、ジイソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO-
脱アシル化およびトリフラート化の後に、フッ化物をともなう粗精製物の処理を
行い、そしてTHP基の脱保護を行った。標準的な方法を使用して、5'-DMT-および
5'-DMT-3'-ホスホールアミダイトを得た。

【００８０】 2'-フルオロウリジン 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-無水-1-ベータ-D-アラビノ
フラノシルウラシルを70％フッ化水素-ピリジンで処理する文献の手順の改良に
より達せられた。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホー
ルアミダイトを得た。

【００８１】 2'-フルオロデオキシシチジン 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのア
ミノ化を経て合成され、その後選択的な保護化を行ってN4-ベンゾイル-2'-デオ
キシ-2'-フルオロシチジンを得た。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-
DMT-3'-ホスホールアミダイトを得た。

【００８２】 2'-O-（2-メトキシエチル）修飾アミダイト 2'-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは以下のように、あるいは
代替的に、Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法に
より調製する。

【００８３】 2,2'-無水〔1-（ベータ-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン〕 5-メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから商業的に入
手可能）（72.0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M）お
よび重炭酸ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に加えた。混合液を
撹拌しながら加熱して還流して、放出する二酸化炭素ガスを制御様式で放出させ
た。1時間後、わずかに暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップ
を撹拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産生物はガムを形成した
。エーテルをデカントし、残留物を最少量のメタノール（約400 mL）に溶解した
。溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、固いガムを得た。エーテルをデカン
トし、ガムを真空オーブンで乾燥させて（60℃、1 mmHgで24時間）固体を得、そ
れを粉砕して淡い黄褐色の粉末を得た（57 g、85％の粗収量）。NMRスペクトル
は構造物と一致し、そのナトリウム塩としてフェノール（約5％）で汚染されて
いた。その物質はさらなる反応のため現状のままで使用し、あるいはエチル酢酸
中のメタノール濃度勾配（10-25％）を使用したカラムクロマトグラフィーによ
りさらに精製して、白色固体、mp 222-4℃を得た。

【００８４】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン 2,2'-無水-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシエチル
）ホウ酸塩（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を2 Lステ
ンレススチール圧力容器に加え、160℃のあらかじめ加熱したオイルバスに置い
た。155-160℃で48時間の加熱後、容器を開け、溶液を蒸発させて乾燥させ、MeO
H（200 mL）を用いて研磨した。残留物を熱アセトン（1 L）に懸濁した。不溶性
の塩を濾過し、アセトン（150 mL）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残留物（280
g）をCH₃CN（600 mL）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（3 kg）を0.5
％ Et₃NHを含有するCH₂Cl₂/アセトン/MeOH（20:5:3）中にパックした。残留物を
CH₂Cl₂（250 mL）に溶解し、シリカ（150 g）に吸着させ、その後カラムにロー
ドした。産生物をパッキング溶媒で溶出し、160 g（63％）の産生物を得た。さ
らなる物質は不純画分を再精製することで得た。

【００８５】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
mL）と共蒸発し、乾燥した残留物をピリジン（1.3 L）に溶解した。ジメトキシ
トリチルクロリドの最初のアリコート（94.3 g、0.278 M）を加え、混合液を室
温で1時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート（94.3
g、0.278 M）を加え、反応液をさらに1時間撹拌した。そしてメタノール（170 m
L）を加え、反応を停止した。HPLCの結果、約70％の産生物が存在することが示
された。溶媒を蒸発させ、CH₃CN（200 mL）を用いて研磨した。残留物をCHCl₃（
1.5 L）に溶解し、2×500 mLの飽和NaHCO₃および2×500 mLの飽和NaClを用いて
抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥させて濾過し、蒸発させた。275 gの残留物を
得た。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、パックして0.5％ Et₃NHを
含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）で溶出した。純粋画分を蒸発させ、
164 gの産生物を得た。さらに約20 gを不純粋画分から得て、183 g（57％）の総
収量を得た。

【００８６】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF/ピリジン（562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した750
mL の3:1混合液）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を混合して、室温で24
時間撹拌した。MeOHを添加してtlc試料を最初に急冷することにより、tlcにより
反応をモニターした。tlcにより判断して反応の完了の際、MeOH（50 mL）を加え
、混合液を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl₃（800 mL）に溶解し、2×200 mLの
飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200 mLの飽和NaClを用いて抽出し直した。水層
をふたたび200 mLのCHCl₃で抽出した。混合した有機物を硫酸ナトリウムを用い
て乾燥させて蒸発させ、122 gの残留物を得た（約90％産物）。残留物を3.5 kg
のシリカゲルカラムで精製し、EtOAc/ヘキサン（4:1）を使用して溶出した。純
粋産物画分を蒸発させて96 g（84％）を産生した。後の画分からさらに1.5 gを
回収した。

【００８７】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン最初の溶液はCH₃CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジ
メトキシトリチル-5-メチルウリジン（96g、0.144 M）を溶解することにより調
製し、取っておいた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）をCH₃CN（1 L）中の
トリアゾール（90 g、1.3 M）溶液に加え、-5℃に冷却してオーバーヘッドスタ
ーラーを使用して0.5時間撹拌した。POCl₃を0-10℃に維持された撹拌溶液に一滴
ずつ30分間にわたり加え、得られた混合物をさらに2時間撹拌した。最初の溶液
を後の溶液に一滴ずつ45分間にわたり加えた。得られた反応混合液をコールドル
ームで一晩保存した。塩を反応混合液から濾過し、溶液を蒸発させた。残留物を
EtOAc（1 L）に溶解し、不溶性の固体を濾過により除去した。濾過物を1×300 m
LのNaHCO₃および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥さ
せて蒸発させた。残留物をEtAOcを用いて研磨し、表題化合物を得た。

【００８８】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジンジオキサン（500 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメト
キシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g、0.141 M）とNH₄OH（3
0 mL）の溶液を室温で2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をMeO
H（2×200 mL）と共沸した。残留物をMeOH（300 mL）に溶解し、2リットルのス
テンレススチール圧力容器に移した。NH₃ガスで飽和したMeOH（400 mL）を加え
、容器を100℃で2時間加熱した（tlcは完全な転化を示した）。容器内容物を蒸
発させて乾燥させ、残留物をEtOAc（500 mL）に溶解し、飽和NaCl（200 mL）で
一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸発させて、85 g（
95％）の表題化合物を得た。

【００８９】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）に溶解して、安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）を撹
拌しながら加えた。3時間の撹拌後、tlcは反応が約95％完了したことを示した。
溶媒を蒸発させ、残留物をMeOH（200 mL）と共沸した。残留物をCHCl₃（700 mL
）に溶解し、飽和NaHCO₃（2×300 mL）および飽和NaCl（2×300 mL）を用いて抽
出して、MgSO₄で乾燥させて蒸発させ、残留物（96 g）を得た。残留物を、溶出
溶媒として0.5％ Et₃NHを含有するEtOAc/ヘキサン（1:1）を使用して、1.5 kgの
シリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分を蒸発させて、90 g（
90％）の表題化合物を得た。

【００９０】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン-3'-アミダイト N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH₂Cl₂（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシテトラ（イソプロピル）亜リン酸塩
（40.5 mL、0.123 M）を、窒素雰囲気中で撹拌しながら加えた。得られた混合液
を、室温で20時間撹拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応混
合液を、飽和NaHCO₃（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）を用いて抽出し
た。水性洗浄液をCH₂Cl₂（300 mL）で再び抽出し、抽出物を混合してMgSO₄で乾
燥させて濃縮した。得られた残留物を、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン（3:1）
を使用して、1.5 kgのシリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分
を混合して、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。

【００９１】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分
野では、2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとして
も知られる〕を、次のパラグラフに記載するように調製する。アデノシン、シチ
ジンおよびグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシンお
よびシチジンの場合はベンゾイル部分を用いて、またグアノシンの場合はイソブ
チリルを用いて、保護されることを除き、チミジン（5-メチルウリジン）と同様
に調製される。

【００９２】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン O²-2'-無水-5-メチルウリジン（Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0 g、
0.416 mmol）、ジメチルアミノピリジン（0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol）を
、アルゴン雰囲気中で機械的に撹拌しながら、周囲の温度で乾燥ピリジン（500
mL）に溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8 g、119.0 mL、1.
1 eq、0.458 mmol）を一度に加えた。反応液を周囲の温度で16時間撹拌した。TL
C（Rf 0.22、エチル酢酸）は反応完了を示した。溶液を減圧下で濃縮し、濃厚な
オイル（thick oil）にした。これを、ジクロロメタン（1 L）および飽和重炭酸
ナトリウム（2×1 L）およびブライン（1 L）の間で分配した。有機層を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して濃厚なオイルにした。オイルを、エチル酢
酸とエチルエーテルの1:1混合液（600 mL）に溶解し、溶液を-10℃まで冷却した
。得られた結晶性産物を濾過して集め、エチルエーテル（3×200 mL）で洗浄し
て乾燥し（40℃、1 mmHg、24時間）、149 g（74.8％）の白色固体とした。TCLお
よびNMRは純粋産物と一致した。

【００９３】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン 2 Lのステンレススチール中で撹拌しない圧力反応器に、テトラヒドロフラン
中のボラン（1.0 M、2.0 eq、622 mL）を加えた。ドラフトチャンバー（fume ho
od）内において手動で撹拌しながら、エチレングリコール（350 mL,過剰量）を
、最初は水素ガスの放散が静まるまで注意深く加えた。5'-O-tert-ブチルジフェ
ニルシリル-O²-2'-無水-5-メチルウリジン（149 g、0.311 mol）および重炭酸ナ
トリウム（0.074 g、0.003 eq）を手動で撹拌しながら加えた。反応器を密閉し
、容器内の温度が160℃に達するまでオイルバスで加熱し、その後16時間維持し
た（圧力< 100 psig）。反応容器を周囲の温度まで冷却して開けた。TLC（所望
する産生物のRfは0.67およびara-T副産物のRfは0.82、エチル酢酸）は、約70％
が産生物に転化したことを示した。さらなる副産物の形成を避けるために、反応
を停止し、温水バス（40〜100℃）中にて、減圧下（10から1 mmHg）でエチレン
グリコールを除去するために使用されるより極度の条件により濃縮した。〔ある
いは、一度低温煮沸溶媒を除去して、残りの溶液をエチル酢酸と水の間で分配で
きる。産生物は有機層に存在しうる。〕残留物をカラムクロマトグラフィー（2
kgシリカゲル、1:1から4:1のエチル酢酸-ヘキサン勾配）にて精製した。適当な
画分を混合し、ストリッピングおよび乾燥させて、白色のパリパリした（crisp
）泡状物として産生物とし、汚染された（contaminated）開始物質（17.4 g）お
よび純粋な再利用可能な開始物質20 gを産生した。収率は、開始物質を基準とし
ており、より純度の低い回収された開始物質の収率は58％であった。TLCおよびN
MRは99％の純粋産生物と一致した。

【００９４】 2'-O-（〔2-フタルイミドオキシ）エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン（20 g、36.98 mmol）を、トリフェニルホスフィン（11.63 g、44.36 m
mol）およびN-ヒドロキシフタルイミド（7.24 g、44.36 mmol）と混合した。そ
して、それを40℃で2日間、高度真空のもとP₂O₅で乾燥させた。反応混合液をア
ルゴンでフラッシュし、乾燥THF（369.8 mL、Aldrich、確実に密閉するボトル）
を加えて、透明な溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキシレート（6.98 mL、44
.36 mmol）を反応混合液に一滴ずつ加えた。加える速度は、得られた濃赤色が次
の一滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が完了した後、反応液
を4時間撹拌した。その時までに、TLCは反応の完了を示した（エチル酢酸:ヘキ
サン、60:40）。溶媒を真空中で蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラ
ム上に置き、エチル酢酸:ヘキサン（60:40）を用いて溶出し、白色の泡状物とし
て2'-O-（〔2-フタルイミドオキシ）エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジンを得た（21.819、86％）。

【００９５】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル〕-5-メチルウリジン 2'-O-（〔2-フタルイミドオキシ）エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジン（3.1 g、4.5 mmol）を乾燥CH₂Cl₂（4.5 mL）に溶解し、メチル
ヒドラジン（300 mL、4.64 mmol）を-10℃から0℃で一滴ずつ加えた。1時間後、
混合液を濾過し、濾過物を氷冷CH₂Cl₂で洗浄して、混合有機層を水、ブラインで
洗浄して、無水Na₂SO₄で乾燥させた。溶液を濃縮して2'-O-（アミノオキシエチ
ル）チミジンを得て、次にそれをMeOH（67.5 mL）に溶解した。これに、ホルム
アルデヒド（20％水溶液、w/w、1.1eg.）を加え、1時間混合した。溶媒を真空下
で除去した；残留物をクロマトグラフィーにかけて、白色の泡状物として5'-O-t
ert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔（2-ホルムアドキシイミノオキシ）エチル
〕-5-メチルウリジンを得た（1.95、78％）。

【００９６】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジメチルアミノオキシエチル
〕-5-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル〕-5-メチルウリジン（1.77 g、3.12 mmol）を、乾燥MeOH（30.6 mL）
中の1 Mピリジニウムp-トルエンスルホネート（PPTS）溶液中に溶解した。シア
ノホウ化水素ナトリウム（0.39 g、6.13 mmol）をこの溶液に不活性雰囲気のも
と10℃で加えた。反応混合液を10℃で10分間撹拌した。反応容器を氷冷バスから
取り出して室温で2時間撹拌した後、反応をTLC（CH₂Cl₂中の5％ MeOH）にてモニ
ターした。水性NaHCO₃溶液（5％、10 mL）を加え、エチル酢酸（2×20 mL）を用
いて抽出した。エチル酢酸層を無水Na₂SO₄で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。
残留物を、MeOH（30.6 mL）中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（2
0％ w/w、30 mL、3.37 mmol）を加え、反応混合液を室温で10分間撹拌した。反
応混合液を氷冷バス中で10℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（0.39 g
、6.13 mmol）を加えて、反応混合液を10℃で10分間撹拌した。10分後、反応混
合液を氷冷バスから取り出して室温で2時間撹拌した。反応混合液に5％ NaHCO₃
（25 mL）溶液を加え、エチル酢酸（2×25 mL）を用いて抽出した。エチル酢酸
層を無水Na₂SO₄で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。得られた残留物をフラッシ
ュカラムクロマトグラフィーにより精製し、CH₂Cl₂中の5％ MeOHを用いて溶出し
て、白色の泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジメチ
ルアミノオキシエチル〕-5-メチルウリジンを得た（14.6 g、80％）。

【００９７】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジントリエチルアミントリヒドロフルオライド（triethylamine trihydrofluoride
）（3.91 mL、24.0 mmol）を乾燥THFおよびトリエチルアミン（1.67 mL、12 mmo
l、乾燥、KOHで保存）に溶解した。次に、このトリエチルアミン-2HF混合液を5'
-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジメチルアミノオキシエチル〕-5
-メチルウリジン（1.40 g、2.4 mmol）に加え、室温で24時間撹拌した。反応をT
LC（CH₂Cl₂中の5％ MeOH）にてモニターした。溶媒を真空中下で除去し、残留物
をフラッシュカラム上に置き、CH₂Cl₂中の10％MeOHを用いて溶出して、2'-O-（
ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジンを得た（766 mg、92.5％）。

【００９８】 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（750 mg、2.17 mmo
l）を40℃で一晩、高度真空のもとP₂O₅で乾燥させた。次に、それを無水ピリジ
ン（20 mL）を用いて共蒸発させた。得られた残留物をアルゴン雰囲気下でピリ
ジン（11 mL）に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5 mg、2.60 mmol）
、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド（880 mg、2.60 mmol）を混合液に加え、
反応混合液を全ての開始物質が消失するまで室温で撹拌した。ピリジンを真空中
下で除去し、残留物をクロマトグラフィーにかけて、CH₂Cl₂中の10％ MeOHを用
いて溶出して（数滴のピリジンを含有する）、5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノ
オキシエチル）-5-メチルウリジンを得た（1.13 g、80％）。

【００９９】 5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'
-〔（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト〕 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（1.08 g
、1.67 mmol）をトルエン（20 mL）と共蒸発させた。残留物にN,N-ジイソプロピ
ルアミンテトラゾニド（tetrazonide）（0.29 g、1.67 mmol）を加え、40℃で一
晩、高度真空のもとP₂O₅で乾燥させた。次に、反応混合液を無水アセトニトリル
（8.4 mL）に溶解し、2-シアノエチル-N,N,N¹,N¹-テトライソプロピルホスホー
ルアミダイト（2.12 mL、6.08 mmol）を加えた。反応混合液を不活化雰囲気のも
と室温で4時間撹拌した。反応の進行をTLC（ヘキサン:エチル酢酸 1:1）により
モニターした。溶媒を蒸発させ、そして残留物をエチル酢酸（70 mL）に溶解し
て、5％水性NaHCO₃（40 mL）で洗浄した。エチル酢酸層を無水Na₂SO₄で乾燥させ
て濃縮した。得られた残留物をクロマトグラフィーにかけて（溶出剤としてエチ
ル酢酸）、泡状物として5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）
-5-メチルウリジン-3'-〔（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールア
ミダイト〕を得た（1.04 g、74.9％）。

【０１００】実施例２オリゴヌクレオチド合成非置換および置換ホスホジエステル（P=O）オリゴヌクレオチドは、自動化DNA
シンセサイザー（Applied Biosystems model 380B）において、ヨウ素による酸
化をともなう標準的なホスホールアミダイト化学を使用して合成される。

【０１０１】ホスホロチオエート（P=S）は、標準的な酸化ボトルを、亜リン酸結合の段階
的なチア化のためにアセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-二
酸化物の0.2 M溶液に換えることを除いて、ホスホジエステルオリゴヌクレオチ
ドのように合成される。チア化待機ステップを68秒まで増加して、キャッピング
ステップを続けた。55℃（18時間）における濃縮水酸化アンモニウム中でのCPG
カラムからの開裂および脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl
溶液から2.5容量のエタノールを用いて二回沈殿して精製した。

【０１０２】亜リン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許5,508,270に記載されるように調製
され、本明細書中に参考文献として援用される。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許4,469,863に記載され
るように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。

【０１０３】 3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許5,610
,289あるいは5,625,050に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献と
して援用される。

【０１０４】ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許5,256,775あるいは米
国特許5,366,878に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援
用される。

【０１０５】アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、公開されたPCT出願PCT/U
S94/00902 およびPCT/US93/06976（各々WO 94/17093およびWO 94/02499として公
開される）に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用され
る。

【０１０６】 3'-デオキシ-3'-アミノホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特
許5,476,925に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用さ
れる。

【０１０７】ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許5,023,243に記載される
ように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。ボラノホスフェート（borano phosphate）オリゴヌクレオチドは、米国特許 5
,130,302および5,177,198に記載されるように調製され、いずれも本明細書中に
参考文献として援用される。

【０１０８】実施例３オリゴヌクレオシド合成 MMI結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オ
リゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンジ
メチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとし
ても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、アミド-4結
合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴ
ヌクレオシド、ならびに例えば、交互のMMIおよびP=OあるいはP=S結合を有する
混合バックボーン化合物は、米国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602
,240および5,610,289に記載されるように調製され、それらの全ては本明細書中
に参考文献として援用される。

【０１０９】ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米
国特許5,264,562および5,264,564に記載されるように調製され、本明細書中に参
考文献として援用される。

【０１１０】エチレンオキサイド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許5,223,618に記載さ
れるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。実施例４ PNA合成ペプチド核酸（PNA）は、Peptide Nucleic Acids（PNA）：Synthesis, Proper
ties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996,
4, 5-23で言及される様々な手順のいずれかに従って調製される。それらは、米
国特許5,539,082、5,700,922および5,719,262に従っても調製されることができ
、本明細書中に参考文献として援用される。

【０１１１】実施例５キメラオリゴヌクレオチドの合成本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドあるいは混合オリゴ
ヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型のものである可能性
がある。これらは、結合オリゴヌクレオシドの“ギャップ”部分が結合ヌクレオ
シドの5'および3'“ウイング”部分の間に位置している最初の型、および“ギャ
ップ”部分がオリゴマー化合物の3'あるいは5'末端のどちらかに配置している２
番目の“開放末端”型、を含む。最初の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分
野において“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知
られている。２番目の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において“ヘミ
マー”あるいは“ウィングマー”としても知られている。

【０１１２】〔2'-O-Me〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-Me〕キメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド 2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、前記のようにアプラ
イドバイオシステムズ自動化DNAシンセサイザーモデル380Bを使用して合成さ
れる。オリゴヌクレオチドは、自動化シンセサイザーおよびDNA部分には2'-デオ
キシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホールアミダイト、および5'および3'ウ
イングには5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトを
使用して合成される。標準的な合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基の運搬
後の待機ステップを600秒に増加し、RNAでは４回および2'-O-メチルでは２回繰
り返すことで修飾される。完全な保護化オリゴヌクレオチドは支持体から開裂し
、リン酸基を3:1アンモニア／エタノール中にて室温で一晩脱保護し、そして凍
結乾燥して乾燥させる。次に、メタノールアンモニア中にて室温で24時間処置を
行い、全ての塩基を脱保護し、試料を再び凍結乾燥して乾燥させる。ペレットを
THF中の1 M TBAFにて室温で24時間再懸濁して2'位を脱保護する。次に、反応物
を1 M TEAAで急冷（quench）して、そして試料をロトバック（rotovac）で1/2容
量まで減少させた後、G25サイズの排除カラム（exclusion column）で脱塩した
。次に、回収したオリゴを、収率について分光測光法的に、および純度をキャピ
ラリー電気泳動および質量分析法にて、解析する。

【０１１３】〔2'-O-（2-メトキシエチル）〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-（メトキシエチ
ル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド〔2'-O-（2-メトキシエチル）〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-（メトキシエチ
ル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイ
トの2'-O-（メトキシエチル）アミダイト置換をともなう、2'-O-メチルキメラオ
リゴヌクレオチドの前記手順のように調製した。

【０１１４】〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチ
オエート〕--〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌ
クレオチド〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチ
オエート〕--〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌ
クレオチドは、2'-O-メチルアミダイトの2'-O-（メトキシエチル）アミダイト置
換、キメラ構造物のウイング部分内でホスホジエステルヌクレオチド間結合を産
生するためのヨウ素を用いた酸化、およびセンターギャップのホスホロチオエー
トヌクレオチド間結合を産生するための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1二
酸化物（Beaucage Reagent）を利用した硫化をともなう、2'-O-メチルキメラオ
リゴヌクレオチドについての前記手順により調製される。

【０１１５】その他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キ
メラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許5,623,065に従って
調製され、本明細書中に参考文献として援用される。

【０１１６】実施例６オリゴヌクレオチドの単離制御孔ガラスカラム（Applied Biosystems）からの開裂、および55℃、18時間
の濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドあるい
はオリゴヌクレオシドを2.5容量のエタノールを用いて0.5 M NaClから2回の沈殿
を行うことにより精製した。合成したオリゴヌクレオチドを変性ゲル上でポリア
クリルアミドゲル電気泳動することにより解析し、少なくとも85％の完全長物質
であると判断した。合成において得られたホスホロチオエートおよびホスホジエ
ステルの相対的な量は、³¹P核磁気共鳴分光器により定期的に確認し、いくつか
の研究のためにオリゴヌクレオチドを、Chiangら（J. Biol. Chem., 1991, 266,
18162-18171）によって記載されるようにHPLCにより精製した。HPLC精製物質で
得られた結果は、非HPLC精製物質で得られたものと同様であった。

【０１１７】実施例７新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質発現のオリゴヌクレオチド阻害の解
析新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質発現のアンチセンスモジュレーショ
ンは、当該技術分野で知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば
、mRNAレベルは、ノーザンブロット解析、RNAse保護化アッセイ（RPA）、競合的
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、あるいはリアル-タイムPCR（RT-PCR）により定
量することができる。RNA解析は、総細胞性RNAあるいはポリ（A）+ mRNAで行う
ことができる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubelら（Current Protocols in M
olecular Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc., 1993, pp. 4.1.1-4.2
.9および4.5.1-4.5.3）に教示されている。ノーザンブロット解析は、当該技術
分野では日常的であり、例えば、Ausubelら（Current Protocols in Molecular
Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc., 1996, pp. 4.2.1-4.2.9.）に教
示されている。リアル-タイム定量的（PCR）は、PE-Applied Biosystems（Foste
r City, CA）から入手可能であり、製造業者の使用説明に従って使用する、商業
的に入手可能なABI PRISM^TM 7700 配列検出システム（ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System）を使用して都合良く成し遂げることができる。PCRのその他
の方法も当該技術分野において知られている。プローブおよびプライマーは、刊
行された配列情報を使用して、標的核酸配列とハイブリダイズするように設計さ
れる（例えば、ヒトA1にはGenbank寄託番号U29680およびヒトmcl-1にはGenbank
寄託番号L08246）。

【０１１８】新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質レベルは、免疫沈降法、ウエスタン
ブロット解析（イムノブロッティング）、ELISA、フローサイトメトリーあるい
は蛍光活性化細胞ソーティング（fluorescence-activated cell sorting）（FAC
S）などの当該技術分野でよく知られる様々な方法で定量することができる。bcl
-2-関連タンパク質に対する抗体は同定することができ、PharMingen Inc.（San
Diego CA）などの様々な供給源から得ることができ、あるいは従来の抗体産生方
法により調製することができる。ポリクローナル抗血清を調製するための方法は
、例えば、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, J
ohn Wiley & Sons, Inc., 1997, pp. 11.12.1-11.12.9）に教示される。モノク
ローナル抗体の調製は、例えば、Ausubelら（Current Protocols in Molecular
Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1997, pp. 11.4.1-11.11.5）に
教示される。

【０１１９】免疫沈降法は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら（Current P
rotocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1998,
pp. 10.16.1-10.16.11）に見出すことができる。ウエスタンブロット（イムノブ
ロット）解析は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら（Current P
rotocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1997,
pp. 10.8.1-10.8.21）に見出すことができる。酵素-結合イムノソルベントアッ
セイ（ELISA）は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら（Current
Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1991,
pp. 11.2.1-11.2.22）に見出すことができる。

【０１２０】実施例８ mRNAレベルの解析のためのRNAse保護化アッセイリボヌクレアーゼ（RNase）保護化アッセイは、発現レベルの定量にとって感
受性が高く特異的な方法である（Zinnら、Cell, 1983, 34:865-79）。方法は、D
NAテンプレート由来のin vitro転写³²P-標識アンチ-センスRNAプローブと標的RN
Aのハイブリダイゼーションに基づいている。RNA処理をした後、一本鎖RNAおよ
び過剰なプローブを分解した。プローブおよび標的RNAは、オートラジオグラフ
ィーあるいはベータイメージング装置を使用して視覚化された“保護化”プロー
ブを用いて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。そのそれぞ
れが別個の長さであり、そしてそのそれぞれが別個のmRNA種における配列を示す
一連の生物学的に関連するテンプレートを含有するテンプレートのセット（Phar
Mingen Inc., San Diego, CA ）を購入することができる。各々のテンプレート
セットは、内在性の対照として働く一つあるいはそれ以上のハウスキーピング遺
伝子、L32およびGAPDHに加えて、単一の反応混合中にて11種までの独自の遺伝子
メッセージを検出することができる。これらのテンプレートセットは、単一試料
から作成される多重決定を可能にする。マルチ-プローブRPAは、ポリ-A+ RNAを
さらに精製せずに、標準的な方法により得られる全RNA調製に対して行うことが
できる。

【０１２１】オリゴヌクレオチドは、RIBOQUANT^TM RNase保護化キット（Pharmingen, San D
iego, CA）を使用して、全bcl-x mRNAレベルに加えてmcl-1レベルに対するオリ
ゴヌクレオチド各々の効果について評価された。全てのアッセイは、製造業者の
プロトコルに従って行われた。簡略すると、マルチ-プローブDNAテンプレートセ
ットを使用して、dUTP-³²Pで放射性標識したアンチセンスRNA転写物を産生した
。アポトーシス遺伝子に使用したテンプレートセットはヒトhAPO-2セットであっ
た。これらの放射性標識したプローブを、典型的に10μgの全細胞性RNAと一晩ハ
イブリダイズした。次に、反応混合液を一本鎖RNaseで消化して保護化された断
片を産生し、それを5％アクリルアミド／尿素ゲルを通して電気泳動した。保護
化されたバンドをPhosphorImager（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を使
用して視覚化して、定量した。

【０１２２】実施例９ヒトA1発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオ
チド本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドは、刊行された配列（Karsanら、
1996, Blood 87, 3089-3096；Genbank寄託番号U29680、ここで SEQ ID NO: 1と
して援用される）を使用して、ヒトA1 RNAを標的とするように設計された。オリ
ゴヌクレオチドは表１に示す。

【０１２３】表１ヒトA1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド “Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列（Genb
ank寄託番号U29680；SEQ ID NO: 1）上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“P
S”＝ホスホロチオエート結合。“5meC”＝5-メチルシトシン。“デオキシ”＝2
'-H。

【０１２４】

【表１】

【０１２５】オリゴヌクレオチドは、100 nM濃度でヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）における
ノーザンブロット解析によりテストされた。HUVECを80％コンフルエントまで増
殖させ、あらかじめ加温した（37℃）Opti-MEM^TM（Life Technologies, Inc., G
aithersburg, MD）で三回洗浄した。オリゴヌクレオチドをOpti-MEM中の10μg/m
lのLipofectin^TM試薬（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）であらか
じめ混合し、洗浄済み細胞にアプライした。細胞をオリゴヌクレオチドとともに
37℃で4時間インキベーションし、その後、培地を除去して新鮮な培地に換えた
。全ての細胞性RNAをRNeasy^TMキット（Qiagen Inc., Valencia, CA）を使用して
単離した。単離したRNAを1％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分離し、Hybo
nd N+ ナイロン膜（Amersham, Arlington Heights, IL）に一晩転写して、Strat
alinker 2400（Stratagene, La Jolla, CA）でUV-架橋（UV-crosslink）した。
ブロットは、刊行された方法に従って、配列AGAAGTATGTGTTGGCAATCGT（SEQ ID N
O: 17）を有するプライマーで産生した一本鎖PCR³²P-標識プローブとともに数
時間ハイブリダイズさせた（Bednarczuk, T.A.ら、BioTechniques, 1991, 10, 4
78）。PCRを使用して、A1配列のヌクレオチド22から684を増幅した。ノーザンブ
ロットはストリッピングし、ランダム-プライム化（random-primed）³²P-標識ヒ
トG3PDH cDNAで再プローブ化してRNA試料の等価ローディングを確認した。

【０１２６】結果は表１に示す。表に見られるように、SEQ ID NO: 4、5、7、8、9、10、11
、12、13、14および15を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、本実
験において約50％あるいはそれ以上でA1 mRNA発現を抑制した。これらのうち、I
SIS 17494（SEQ ID NO: 13、停止コドンが標的）および ISIS 17495（SEQ ID NO
: 14、停止コドンのちょうど下流にある3' UTRが標的）は、75％以上のA1発現の
阻害を与えた。

【０１２７】実施例１０ A1発現のアンチセンス阻害-混合バックボーン2'-MOEギャップマーオリゴヌク
レオチドヒトA1を標的とする第二の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌク
レオチドは表２に示した。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給
源の参照中に与えられるように、ヌクレオチド番号によって示した。

【０１２８】表２の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（“
ギャップマー”）であり、十の2'-デオキシヌクレオチドから成る中央“ギャッ
プ”領域で構成されり、この両側（5'および3'方向）に五つのヌクレオチド“ウ
イング”が隣接する。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオシド
で構成される。ヌクレオチド間（バックボーン）結合は、デオキシギャップ内で
はホスホロチオエート（P=S）であり、ウイング内ではホスホジエステル（P=O）
である。分子中のシチジン残基は5-メチルシチジンである。オリゴヌクレオチド
は、先の実施例に記載されるようにノーザンブロット解析によってテストした。
結果は表２に示す。

【０１２９】表２ A1を標的とするギャップ化キメラオリゴヌクレオチド “Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列（Genb
ank寄託番号U29680；SEQ ID NO: 1）上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“N
.D.”は利用可能なデータがないことを示す。“PS”＝ホスホロチオエート結合
。“PO”＝ホスホジエステル結合。“デオキシ”＝2'-H；“2'MOE”＝2'-O-メト
キシエチル。“5meC”＝5-メチルシトシン。

【０１３０】

【表２】

【０１３１】

【０１３２】 2'-MOEギャップマーのように、SEQ ID NO: 3、5、7、8、9、10、11、12、13、
14、15および16は、A1 mRNAにおいて75％以上の減少を与えた。これらのうち、S
EQ ID NO: 11（ISIS 17507）、12（ISIS 17508）、13（ISIS 17509）および14（
ISIS 17510）は、A1 mRNAにおいて90％以上の減少を与えた。

【０１３３】 ISIS 17510（SEQ ID NO: 14、2' MOEギャップマー）を使用した用量反応実験
は、本化合物を使用したA1 mRNA減少について10 nMより少ないIC50を与えた。 ISIS 17510およびbcl-2ファミリー構成員bcl-Xに特異的なプローブを使用した
ノーザンブロット実験から、A1アンチセンス化合物はbcl-x mRNAレベルに影響を
与えないことが示された。

【０１３４】実施例１１ A1発現のアンチセンス阻害-混合バックボーン2'-MOEヘミマーオリゴヌクレオ
チドヒトA1を標的とする第三の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌク
レオチドは表３に示した。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給
源の参照中に与えられるように、ヌクレオチド番号によって示した。

【０１３５】表３の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラ“ヘミマー”オリゴヌク
レオチドであり、十の隣接する2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドに
結合する、十の隣接する2'-デオキシヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド
間（バックボーン）結合は、デオキシ領域内ではホスホロチオエート（P=S）で
あり、2'-MOE領域内ではホスホジエステル（P=O）である。分子中のシチジン残
基は5-メチルシチジンである。

【０１３６】オリゴヌクレオチドは、先の実施例に記載されるようにノーザンブロット解析
によってテストした。結果は表３に示す。表３ A1を標的とする“ヘミマー”キメラオリゴヌクレオチド “Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列（Genb
ank寄託番号U29680；SEQ ID NO: 1）上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“P
S”＝ホスホロチオエート結合。“PO”＝ホスホジエステル結合。“デオキシ”
＝2'-H；“2'MOE”＝2'-O-メトキシエチル。“5meC”＝5-メチルシトシン。

【０１３７】

【表３】

【０１３８】

【０１３９】 2' MOEヘミマーのように、SEQ ID NO: 11（ISIS 17522）、12（ISIS 17523）
、13（ISIS 17524）および14（ISIS 17525）は、A1 mRNAレベルにおいて少なく
とも75％以上の阻害を与えた。これらのうち、ISIS 17524（SEQ ID NO: 13）は
、90％以上の阻害を与えた。

【０１４０】実施例１２ヒトmcl-1発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-moeギャップマーオ
リゴヌクレオチド本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドは、刊行された配列（Kozopasら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1993, 90, 3516-3520；Genbank寄託番号 L082
46、ここで SEQ ID NO: 18として援用される）を使用して、ヒトmcl-1 RNAを標
的とするように設計された。オリゴヌクレオチドは表４に示す。表４の全ての化
合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）
であり、十の2'-デオキシヌクレオチドから成り、両側（5'および3'方向）が五
つのヌクレオチド“ウイング”に隣接する、中央“ギャップ”領域で構成される
。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドで構成される。ヌク
レオシド間（バックボーン）結合は、全てホスホロチオエート（P=S）である。
分子中のシチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１４１】オリゴヌクレオチドは、ヒト黒色腫細胞株C8161（Dr. Dan Welch, Hershey Me
dical Center, Hershey, PAから寄贈）を使用して、先の実施例にほぼ記載され
るように、ノーザンブロット解析によりテストされた。オリゴヌクレオチド（10
0 nM）およびLipofectin^TM（10μg/ml）を混合して、室温で30分間インキベーシ
ョンした。細胞をOpto-MEM^TMで二回洗浄して、オリゴヌクレオチド混合液を加え
て、そして細胞を37℃で4時間インキベーションした。オリゴヌクレオチドを新
鮮な培地（0％ FCS のRPMI）に換えた。24時間後、RNAをRneasy^TMキット（Qiage
n, Valencia, CA）を使用して単離した。RNAを電気泳動してニトロセルロース膜
に転写し、American Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手してSt
ripeasy^TMキット（Ambion, Austin, TX）で標識したランダム-プライム化mcl-1
ESTプローブ（ATCC 1064916 I.M.A.G.E. クローンID: 796506）でプローブ化し
た。

【０１４２】結果は表４に示す。表４ヒトmcl-1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド “Nucl. pos.”は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列（Genb
ank寄託番号L08246；SEQ ID NO:18）上の最初のヌクレオチドの位置を示す。“N
.D.”は利用可能なデータがないことを示す。“PS”＝ホスホロチオエート結合
。“PO”＝ホスホジエステル結合。“デオキシ”＝2'-H；“2'MOE”＝2'-O-メト
キシエチル。“5meC”＝5-メチルシトシン。

【０１４３】

【表４】

【０１４４】

【０１４５】 SEQ ID NO: 22（ISIS 20407）、23（ISIS 20408）、31（ISIS 20416）、35（I
SIS 20420）、および36（ISIS 20421）は、約50％あるいはそれ以上でmcl-1 mRN
Aレベルを阻害した。これらのうち、ISIS 20408および20416は、mcl-1発現の最
大の減少を示した。

【０１４６】用量反応実験は、ISIS 20407、20408および20416を使用して行った。RNAse保
護化アッセイを使用して、hApo2プローブセット（Pharmingen, San Diego, CA）
を使用することでmcl-1 mRNAレベルを検出した。ISIS 20407は、約100 nMのIC50
を示した。ISIS 20408および20416は、約25 nMのIC50を示した。

【０１４７】実施例１３ Scid-ヒト白血病異種移植モデルおよび異種移植片におけるアポトーシスの測
定対数増殖期の10⁷個のSEM-K2細胞を、（滅菌塩類溶液に懸濁した）ボーラスと
して8尾のSCID-NODマウスに皮下注射する。生着（engraftment）および腫瘍形成
は、2-3週間かけて起こる。Micro Alzetポンプ（Alza, Newark, DE）は、14日間
にわたり継続的な皮下注入物を運搬でき、これを使用することで、三尾の動物に
１日当たり100μgの用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド（5 mg/kgと等価）
を運搬する。残りの二尾の動物は、ビヒクル（滅菌塩類溶液）のみを与えた。

【０１４８】 SCID-hu異種移植片由来のSEM-K2細胞において測定される標的タンパク質の発
現は、定量的フローサイトメトリーを使用して測定される。異種移植片は犠死（sacrifice）の後取り出され、機械的に大量の培地中で分
散させる。白血球は濃度勾配遠心分離により精製して培地を用いて洗浄して、1-
5×10⁶細胞/mlで1 ml容量に再懸濁させる。細胞を95％湿空気/5％ CO₂中にて37
℃で2時間インキュベートして、その後24時間かけて20μg/ml VP16（エトポシド
）を用いてアポトーシスを誘導する。アポトーシスは、光拡散変化（light scat
ter changes）の定量を使用して非特異的に評価される；側方拡散における（ク
ロマチン凝縮のための）減少および前方拡散における（細胞収縮のための）減少
は、アポトーシスに関連する初期の変化である。アポトーシスおよび非アポトー
シス細胞を含む二項集団分布（bimodal population distributions）は、処理群
およびネガティブな対照についてのアポトーシスの指標をそれぞれ評価ができる
ことが測定可能である。アポトーシスの倍増加（fold increase）はその比率か
ら計算される。アポトーシスのより詳細な決定は、Apo-Alertカスパーゼ-3比色
アッセイキット（Clontech, Palo Alto, CA）を使用して達せられる。これは大
半の哺乳動物細胞型においてアポトーシスを媒介すると考えられているカスパー
ゼファミリー構成員である、カスパーゼ-3の活性についての定量的なアッセイで
ある、DEVD-特異的カスパーゼアッセイである。このアッセイは、基質として蛍
光分子、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン（AFC）あるいは比色分子、p-
ニトロアニリド（pNA）のいずれかで標識される合成テトラペプチド、Asp-Glu-V
al-Asp（DEVD）（SEQ ID NO: 39）を利用する。DEVD-依存性プロテアーゼ活性は
、基質から開裂する遊離AFCあるいはpNAの検出により評価される。細胞溶解物は
、パラニトロアニリド、CPP32（カスパーゼ-3）により開裂する発色基質、に結
合するDEVDとともにインキベーションして、405 nmで比色定量分光光度計を使用
して検出可能である。OD_{405 nm}での倍増加を使用して、正味のVP16-誘導アポト
ーシスを決定する。

【０１４９】実施例１４ C8161細胞におけるmcl-1タンパク質レベルのウエスタンブロット解析ウエスタンブロット解析（イムノブロット解析）は、標準的な方法で行った。
C8161細胞を、約8×10⁵ cells/10 cmプレートにて5 ml容量中でトランスフェク
ションした。200 nMのISIS 20408（SEQ ID NO: 23）あるいは8-塩基対ミスマッ
チ対照ISIS 105232；TGGGTCTGGTTTCTCTGTCG（SEQ ID NO: 40）を、陽イオン脂質
とともに細胞に加えた。処理後、細胞を固定した間隔で解析した。

【０１５０】ウエスタンブロット解析のために、細胞をリン酸緩衝塩類溶液で一度洗浄して
、1200 rpmで5分間遠心分離することでペレット化し、氷上で15分間細胞溶解緩
衝液（5M NaCl、0.1 M HEPES、500 mMスクロース、0.5M EDTA、100 mMスペルミ
ン、1 mg/mlアプロチニン、10％ Triton X-100）に再懸濁した。全タンパク質を
分光光度計（BioRad）的に定量して、100μgの溶解物を15％のポリアクリルアミ
ドゲルにロードし、200 Vで45分間泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜
に転写した後、ブロットを一次mcl-1抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., S
anta Cruz CA）で、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ-結合ヤギ抗マウ
ス二次抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA）で免疫染色し
た。タンパク質は、ECL（Amersham, Piscataway NJ）および写真のフィルムへの
露光により定性的に視覚化した。

【０１５１】 ISIS 20408は、C8161細胞においてmcl-1タンパク質レベルを減少させる能力に
ついてテストして、200 nMのオリゴヌクレオチド用量でmcl-1タンパク質レベル
を4時間後に90％減少させることが見出された。

【０１５２】実施例１５ C8161細胞の紫外線照射 C8161細胞を、それらが約70-80％コンフルエントである時あるいはオリゴヌク
レオチド処理の24時間後の時にUV-B光で照射した。UV-B処理の後すぐに、細胞を
PBSで二回洗浄し、5つの15-ワット312 nmバルブを含有するStratalinker UV Cro
sslinker 1800モデル（Stratagene, La Jolla CA）中でUV-B光に暴露した。細胞
は、0 mJ/m2、5 mJ/m2あるいは10 mJ/m2のUV-B放射に暴露した。UV-B放射の線量
は、UVX ラジオメーター（UVP）を使用して換算した。UV照射の後、細胞をさら
に24時間、標準的な培地でインキベーションした。UV-B処理の対照プレートは単
に、PBSで3回洗浄して、さらに24時間標準的な培地でインキベーションした。細
胞を、パラジウムヨウ素を用いてエタノール-固定細胞核を染色して、フローサ
イトメトリーによりDNA含量を調べることによりアポトーシスについて調べた。
アポトーシス細胞は、それらの二倍体以下のDNAであることにより同定された。
細胞を冷PBSで二回洗浄して、1 mlの70％エタノールに再懸濁した。室温で1時間
のインキベーションの後、細胞をPBSで洗浄して、1 mlのパラジウムヨウ素染色
溶液（50μg/mlのパラジウムヨウ素、0.5 U/ml RNAse A、2000 U/ml RNase T1）
に再懸濁した。室温で30分の後、細胞周期解析をBecton Dickinson Calibur FAC
Sアナライザーを使用してフローサイトメトリーにより行った。10,000の細胞の
個々の核の蛍光は、FACScanフローサイトメトリーを使用して測定した。結果は
パーセントアポトーシス細胞として表した。

【０１５３】実施例１６ UV-誘導細胞死に対するC8161細胞のアンチセンス感作 C8161細胞を200 nMのISIS 20408あるいは8-塩基対ミスマッチ対照（ISIS 1052
32；SEQ ID NO: 40）で処理して、先の実施例に記載されるように紫外線（UV）
照射に暴露した。パーセントアポトーシス細胞を、標準的な方法に従ってパラジ
ウムヨウ素染色により定量した。結果は表５に示す。

【０１５４】表５ ISIS 20408およびUV照射の組み合わせ

【０１５５】

【表５】

【０１５６】このように、アンチセンス処理によりアポトーシスの増加；すなわち、UV-誘
導アポトーシスの感作、が起きた。実施例１７ C8161細胞のシスプラチン（cisplatinum）処理シスプラチンは、DNAの損傷を引き起こすアルカリ化剤であり、アポトーシス
を誘導できる（GillおよびWindebank, 1998, J. Clin. Invest. 101:2842-2850
）。C8161細胞を、それらが約70-80％コンフルエントの時あるいはオリゴヌクレ
オチド処理の24時間後の時にシスプラチンで処理した。シス-ジアミンジクロロ
プラチンII（Cisplatinum, Sigma, St. Louis MO）を1 mg/mlの濃度で蒸留水に
溶解して、2.5から10μg/mlの用量範囲で標準的な培地に加え、24時間細胞とと
もにインキベーションした。

【０１５７】実施例１８シスプラチン誘導細胞死に対するC8161細胞のアンチセンス感作 C8161細胞を200 nMのISIS 20408あるいは8-塩基対ミスマッチ対照ISIS 105232
および様々な用量のシスプラチンで処理した。パーセントアポトーシス細胞を、
先の実施例に記載されるように標準的な方法に従ってパラジウムヨウ素染色によ
り定量した。結果は表６に示す。

【０１５８】表６ ISIS 20408およびシスプラチンの組み合わせ

【０１５９】

【表６】

【０１６０】このように、細胞はアンチセンス処理後のアポトーシス刺激（この場合は細胞
毒性化学療法薬剤シスプラチン）に対して感作されて、アポトーシスの増加を起
こした。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年７月２５日（２００１．７．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 33/24 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ベネット，シー・フランクアメリカ合衆国カリフォルニア州92008，カールズバッド，キャシンズ・ストリート 1347 (72)発明者ディーン，ニコラス・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州92024，オリベンハイン，ウィスパーウインド・レーン 2110 (72)発明者マーカッソン，エリック・ジーアメリカ合衆国カリフォルニア州92111，サンディエゴ，カミニート・デ・パステル 6369 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA05 HA12 4B065 AA93X BD35 CA44 4C084 AA13 MA02 NA14 ZB261 ZB262 4C086 AA02 AA03 EA16 HA12 HA24 MA01 MA02 MA04 MA05 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質をコードする核酸分
子を標的とし、長さ8から30のヌクレオチドであり、前記の新規抗アポトーシスb
cl-2-関連タンパク質をモジュレートする、アンチセンス化合物。
【請求項２】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１のアンチセ
ンス化合物。
【請求項３】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾され
たヌクレオシド間結合を含む、請求項２のアンチセンス化合物。
【請求項４】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオシド間
結合がホスホロチオエート結合である、請求項３のアンチセンス化合物。
【請求項５】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾され
た糖部分を含む、請求項２のアンチセンス化合物。
【請求項６】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾された糖部分が2'-O-
メトキシエチル糖部分である、請求項５のアンチセンス化合物。
【請求項７】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾され
たヌクレオ塩基を含む、請求項２のアンチセンス化合物。
【請求項８】修飾されたヌクレオ塩基が2'-O-メトキシエチル修飾シトシン
である、請求項７のアンチセンス化合物。
【請求項９】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾されたヌクレオ塩基が
5-メチルシトシンである、請求項８のアンチセンス化合物。
【請求項１０】キメラオリゴヌクレオチドである、請求項１のアンチセンス
化合物。
【請求項１１】ヒトA1をコードする核酸を標的とする、請求項１のアンチセ
ンス化合物。
【請求項１２】アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 3、4、5、6
、7、8、9、10、11、12、13、14、15あるいは16を含む、請求項１１のアンチセ
ンス化合物。
【請求項１３】ヒトmcl-1をコードする核酸を標的とする、請求項１のアン
チセンス化合物。
【請求項１４】アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 22、23、31
、35,あるいは36を含む、請求項１３のアンチセンス化合物。
【請求項１５】請求項１のアンチセンス化合物および医薬的に許容可能なキ
ャリアーあるいは希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１６】コロイド分散システムをさらに含む、請求項１５の医薬組成
物。
【請求項１７】癌の治療のための化学療法剤をさらに含む、請求項１５の医
薬組成物。
【請求項１８】請求項１のアンチセンス化合物と前記の細胞あるいは組織と
を接触させて、前記の新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害す
ることを含む、細胞あるいは組織において新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパ
ク質の発現を阻害する方法。
【請求項１９】アンチセンス化合物がヒトA1をコードする核酸分子を標的と
する、請求項１８の方法。
【請求項２０】アンチセンス化合物がヒトmcl-1をコードする核酸分子を標
的とする、請求項１８の方法。
【請求項２１】請求項１のアンチセンス化合物と前記の細胞あるいは組織と
を接触させて、前記の新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害す
ることを含む、ヒト細胞あるいは組織においてアポトーシスを促進する方法。
【請求項２２】アンチセンス化合物がヒトA1をコードする核酸分子を標的と
する、請求項２１の方法。
【請求項２３】アンチセンス化合物がヒトmcl-1をコードする核酸分子を標
的とする、請求項２１の方法。
【請求項２４】治療的あるいは予防的に効果的な量の請求項１のアンチセン
ス化合物を動物に投与することにより前記の新規抗アポトーシスbcl-2-関連タン
パク質の発現を阻害することを含む、新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質
と関連する疾患あるいは状態を有する前記のヒトを治療する方法。
【請求項２５】アンチセンス化合物がヒトA1をコードする核酸分子を標的と
する、請求項２４の方法。
【請求項２６】アンチセンス化合物がヒトmcl-1をコードする核酸分子を標
的とする、請求項２４の方法。
【請求項２７】予防的あるいは治療的に効果的な量の請求項１のアンチセン
ス化合物をヒトに投与することを含む、アポトーシスの減少により特徴付けられ
る疾患あるいは状態を有する前記のヒトを治療する方法。
【請求項２８】アンチセンス化合物がヒトA1をコードする核酸分子を標的と
する、請求項２７の方法。
【請求項２９】アンチセンス化合物がヒトmcl-1をコードする核酸分子を標
的とする、請求項２７の方法。
【請求項３０】予防的あるいは治療的に効果的な量の請求項１のアンチセン
ス化合物をヒトに投与することを含む、アポトーシスの促進が所望される疾患あ
るいは状態を有する前記のヒトを治療する方法。
【請求項３１】アンチセンス化合物がヒトA1をコードする核酸分子を標的と
する、請求項３０の方法。
【請求項３２】アンチセンス化合物がヒトmcl-1をコードする核酸分子を標
的とする、請求項３０の方法。
【請求項３３】（a）請求項１５の医薬組成物を患者に投与すること；およ
び（b）癌の治療のための化学療法剤を患者に投与すること、を含む、患者の癌を治療する方法。
【請求項３４】癌の治療のための化学療法剤がシスプラチン（cisplatinum
）である、請求項１７の医薬組成物。
【請求項３５】請求項１のアンチセンス化合物と前記の細胞あるいは組織と
を接触させて、前記の新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害す
ることを含む、アポトーシスに対してヒト細胞あるいは組織の感受性を高める方
法。
【請求項３６】アンチセンス化合物がアポト−シス刺激との組み合わせで投
与される、請求項３５の方法。
【請求項３７】アポトーシス刺激が放射線あるいは化学療法剤である、請求
項３６の方法。
【請求項３８】化学療法剤がシスプラチンである、請求項３７の方法。
【請求項３９】請求項１のアンチセンス化合物と前記の細胞あるいは組織と
を接触させて、前記の新規抗アポトーシスbcl-2-関連タンパク質の発現を阻害す
ることを含む、アポトーシス刺激に対するヒト細胞あるいは組織の感受性を高め
る方法。
【請求項４０】アポトーシス刺激が放射線あるいは化学療法剤である、請求
項３９の方法。
【請求項４１】化学療法剤がシスプラチンである、請求項４０の方法。